JPH05506571A - 加水分解を触媒する抗体結合部位を有する分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、１９９０年１月２６日出願の継続中の特許出願第４７０，９２４号（ 参考としてここにその開示を導入する）の部分継続出願である。 関連分野 本発明は、抗体、抗原および免疫原に関し、特に、アミドまたはエステル加水分 解遷移状態の四面体炭素原子およびその周りの構造に結合し、加水分解されるア ミドまたはエステル結合の酸−塩基部位または親核的触媒部位を提供する抗体を 含む分子に関する。 背景技術 リガンドとレセプター間の結合現象は、生物学的システムにおいて多くの重要な 役割を果たしている。このような現象の例には、デオキシヘモグロビンへの酸素 分子の結合によるオキシヘモグロビンの生成、および蛋白質とトリプシンのよう なプロテアーゼ間に見られる酵素のその基質への結合がある。さらに、生物学的 結合現象の例には、抗原の抗体への結合や、補体要素Ｃ３の所謂ＣＲＩレセプタ ーへの結合が含まれる。 また、多（の薬剤およびその他の治療薬もこの結合現象に依存していると考えら れている。例えば、モルヒネ等の麻酔薬は、脳の特異的レセプターに結合するこ とが報告されている。麻酔薬のアゴニストおよびアンタゴニストは、その結合部 位に関してモルヒネ等の薬剤と競合することが報告されている。 モルヒネやその誘導体のような人工的薬剤としてのリガンド、およびエンドルフ ィンおよびホルモンなどの天然の生物システムに存在するリガンドは、天然の生 物システムに存在するレセプターに結合する。本明細書では、これらを−緒に取 り扱う。このような結合は、特にトリプシンおよびパパインなどの酵素による蛋 白質の構成ポリペプチドへの加水分解、または脂肪のグリセリンおよび３個のカ ルボン酸への分解等、アミドおよびエステル結合の加水分解を含む多くの生物学 的現象を誘導する。 スロビン（Ｓｌｏｂｉｎ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ　５ｔｒｙ、５　：　２８３６− ２８４４（１９６６）は、ウシ血清アルブミンのｐ−ニトロカルボベンゾキシ結 合体（ｃｏｎｊｕｇａ　ｔｅ）に対する抗体の調製を報告している。これらの抗 体を用いて、ｐ−ニトロフェニルアセテートおよびニブシロン−アミノカプロン 酸エステルを加水分解した。このアセテートエステルの反応は二次反応速度定数 で説明され、非特異的な反応であると考えられた。正規のガンマ−グロブリンを 用いて得られた二次速度定数は、この特別に調製された抗体の定数とほぼ等しい ことが示された。この特別に調製された抗体は、アミノカプロン酸エステルの加 水分解を阻害することが示された。 コーエン（Ｋｏｈｅｎ）および共同研究者も抗体を用いてエステル分解反応を触 媒する試みを報告している。このグループが採用した抗体は、加水分解される結 合を含まない、最終的に使用された基質の一部に対するものである。 彼らの初期の研究では（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、１００：１３７−１４０（ １９７９）およびＢｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、６２９　：３２ ８−３３７　（１９８０）Ｌ抗ステロイド抗体を用いてステロイドのカルボキシ エチルチオエーテルの７−ウンベリフェロン（７−ハイドロキシクマリン）エス テルを加水分解した。各々の場合において、バックグランドまたは正規のＩｇＧ で得られる速度と比較して加水分解速度の増加が見られた。両方の場合における ターンオーバー数は低く　（毎分抗体１モル当たり基質約１モル、またはそれ以 下）、反応速度は抗体の飽和により定常状態に到達するが時間とともに減少した 。この反応速度の低下は、ステイト酸生成物の抗体への不可逆的結合によるもの である。 コーエン等は、基質分子のジニトロフェニル部分に対するモノクローナル抗体を 用いた７−ＣＮ−（２，４−ジニトロフェニル）−６−アミノヘキサノイルコー クマリンの加水分解を報告した（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、ｉｌｌ：４２７− ４３１　（１９８０））。ここでは、バックグランドを越えた速度の増加も報告 されたが、この反応は、触媒的というよりもむしろ化学量論的なものであると考 えられた。抗体が飽和するにつれ、速度はゼロに到達すると報告された。抗体− 基質−生成物混合物のクロマトグラフィーにより、ある程度の初期加水分解活性 が回復する事から生成物の酸の抗体への結合による阻害に起因すると考えられる 。 強力な抗体の結合が基質分子の安定状態を生成するとき、この複合体の低い解離 速度は触媒活性を阻害するであろう。コーエン等によって報告された結果に関す る状況についても同様のことが考えられる。 これらは興味深いものであるが、上述の構築物は酵素に必要な結合エネルギーを 利用するメカニズムを説明できないことから非常に限定されたものになっている （Ｗ、Ｐ、ジエンクス（Ｊｅｎｃｋｓ）、Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、４３　： ２１９　（１９７５））。 これらの欠点は、ハブテン等の遷移状態アナログを用いて目的の抗体を生産する ことにより克服できる。このハブテンは触媒システムにおいてインヒビターの役 割を担いうる。 従って、免疫学的結合を用いて実験的に結合相互作用を触媒プロセスに転換でき る。例えば、所定の反応の遷移状態を似せたハプテン基に対する触媒性抗体を使 用し、その基質をその遷移状態に似せることにより基質反応を促進できることが 示された。ジエンクス、Ｗ、Ｐ、、Ｃａｔａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｐｐ、２８８　（７グローヒル、ニュー ヨーク　ｌ　９６９）。広範囲の提案がなされたにもかかわらず、特異的遷移状 態ハプテンおよびこの概念を試験する特定の反応は示されなかった。 アミドおよびエステル結合の加水分解は、最近受は入れられた化学理論により（ ａ）アミドまたはエステルの酸部分の炭素原子、（ｂ）一つがカルボニル基に由 来し、もう一つが媒体の水酸基または水に由来する二つの酸素原子、および（Ｃ ）エステルのアルコール部分の酸素分子またはアミドのアミン部分の窒素原子に 結合する四面体炭素原子を含む遷移状態を生成する、カルボニル炭素原子の反応 により、水性媒体中で進行すると考えられている。このような反応の遷移状態は 、定義により単離可能な中間体とは対照的に単離できない推定上の有用な構築物 である。上述の加水分解遷移状懸は単離できないけれども、多くの科学文献がそ の主題に向けられている。 先に述べたアミドおよびエステルの加水分解の遷移状態は良く理解されているが 、蛋白質などの特定のアミドまたは脂肪などのエステルがこれらの遷移状態を介 して反応するレセプター結合部位のトポロジーのパラメーター、例えばサイズ、 形状および荷電は、よく分かっていない。それゆえ、多くの結合部位のトポロジ ーが理解され、その部位で結合するリガンドの相互作用を研究することは有益で あろう。残念なことに、Ｘ線結晶構造が決定された少数の酵素以外は、一般に生 物的加水分解におけるレセプター結合部位のトポロン−は分かっていない。 この結合部位のトポロジーに関する知識の欠如は、部分的に細胞中の多くのレセ プターの結合部位の位置に関する知識の欠如に由来している。さらに、一般にそ の位置が分かっているレセプター結合部位に関しても、その結合部位の化学的特 徴、即ち蛋白質および炭水化物組成は分かっていない。従って、一般に研究者は レセプター結合部位のトポロジカルな条件を理解すること、即ちこれらの条件を 満たしうる治療薬の構築に手こずっている。 それゆえ、研究者は動物又は細胞培養実験で強力な治療薬をスクリーニングし、 その強力な治療薬が有効かどうか確かめなければならない。このようなシステム は有用だが、高価でしかも時間がかかる。 酵素のように加水分解性レセプターのトポロジーおよび化学的反応性が分かって いる場合でさえ、一般に加水分解性プロテアーゼ等の酵素は、その蛋白質のポリ ペプチド鎖に数度の割合で存在する特定のアミノ酸残基に隣接するそれらの基質 、即ちポリペプチド、を切断する。そのような比較的ランダムな切断が蛋白質の ポリペプチド地図を得るのに有効であるが、特定のアミノ酸残基配列を得ること が目的の場合には、そのような切断は有効ではない。 例えば、１ａｃＺ遺伝子などのベクター遺伝子の転写産物に融合する所望の蛋白 質またはポリペプチドを含む融合蛋白質を調製するには、最近の遺伝子工学技術 が有効である。しかし、このような融合蛋白質を使用すると、そのベクター遺伝 子産物のフラグメントの存在によって妨害が起こる。従って、必要とするポリペ プチドまたは蛋白質部分と不必要なものとの間でこのような融合産物を切断しつ る蛋白質分解性酵素様分子を開発できるかどうかが重要となる。 最近、ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）、トラセンタノ（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ）およ びジャンプ（Ｊａｎｄａ）　［５ｃｉｅｎｃｅ、２３４：１５６６　（１９８６ ））は、触媒的にエステルを加水分解するモノクローナル抗体を報告した。また 、トラセンタノおよびラーナーは、米国特許第４，６５６，５６７号でエステル を加水分解するためのモノクローナル抗体の使用について報告している。ボラッ ク（Ｐｏｌｌａｃｋ）、ヤコブ（Ｊａｃｏｂｓ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔ ｚ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３４：１５７０　（１９８６））は、カーボネートの 加水分解を触媒するＭＯＰＣ１６７と呼ばれるミエローマ蛋白質を報告した（レ オン（Ｌｅｏｎ）等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１０：１４２４　（１９７１））。 ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）およびトラセンタノ（Ｔｒａｍｏｎ　ｔａｎｏ）の２ 件の開示では、カルボン酸エステルまたはカーボネートエステルの四面体加水分 解遷移状態の安定なアナログを提示するために合成されたホスホネートに対する 抗体が調製された主に議論されているボラック（Ｐｏｌｌａｃｋ）等の抗体は、 加水分解されるカーボネートアナログに構造的に類似するホスホネートに結合す るミエローマ蛋白質である。 従って、ラーナーおよびトラセンタノ等の研究では、加水分解されるべぎ基質を 予め選択し、目的の産物に応じて免疫化アナログおよび加水分解抗体を合成して いる。ボラック等は、ミエローマ蛋白質の特異性を調べて、加水分解されるべき 基質を設計した。また、ボラック等は、概念的にラーナー等のものと同様のカー ボネートの加水分解に関する触媒抗体、基質およびアナログ基質システムについ て報告している。このシステムに関する研究は、ヤコブス（Ｊａｃｏｂｓ）等、 Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１０９：２１７４　（１９８７）。 公開された特許出願Ｗ０　８５１０２４１４は、触媒としての抗体使用の可能性 を議論しており、かつ０−ニトロフェニル−ベーターＤ−ガラクトシドの加水分 解におけるポリクローナル血清の使用に関するデータを示している。その用途に 有効な抗体が、反応体、反応中間体、または反応体、反応産物または反応中間体 のアナログによって誘導可能であると言われている。“アナ口ｒという言葉は、 そのアナログに対して生成した抗体がその反応体との免疫反応に参加できるが、 必ずしもそのアナログの反応を触媒しない化学構造的点てその反応体と十分類似 する異性体、同族体、その他の化合物を含むと定義される。 この明細書に提供されているデータは、基質（反応体）ガラクトシドの切断が比 較的濃い抗体調製物（１：１０および１：２０希釈物）を用いて１８時間に渡っ である程度起こることだけを示している。触媒反応が提唱されてはいるが、提唱 されている触媒抗体のターンオーバーが示されておらず、また切断された基質ガ ラクトシドの割合も示されていないことから、触媒活性は示されていなかった。 この出願は、実験した未記載基質濃度における吸光度の直線性を仮定すると、ベ ーターＤ−ガラクトシダーゼがポリクローナル抗体の約１０倍の基質を切断する ことを示していた。 この出願に示されているデータから、使用した抗体調製物のりジン残基の末端ア ミノ基により０−ニトロフェニル基の親核的置換が起きた可能性がある。従って 、観測される吸光度は、エブシロンーアミノリジニル　０−ニトロフェニルアニ リンの生成、またはエプシロンーアミノーリジニル　ガラクトシドおよび〇−ニ トロフェノールの生成（ターンオーバーよりもむしろ抗体が消費されることから 、いずれかの生成は触媒的に生じるものではないであろう）に由来するものであ ろう。 キム（Ｋｉｍ）等の米国特許第４，７９２，４４６号は、抗体触媒の生産を教示 している。これらの触媒は基質と反応し、かつハブテン分子によって誘導される 。この基質およびハブテン分子は、触媒反応が起こる原子又は基、即ち反応部位 以外の部分で構造に実質的な類似性を有している。反応部位に関して基質とノ＼ ブテンは、ハブテンの反応部位または触媒活性核がより高い価数を有し、基質の 類似構造よりも１以上の結合を有する点で異なっている。 さらに、ハブテンは、その分子の触媒的に活性な部分、即ち基質の反応部位の構 造的に類似する部分に結合する基を含む。この付加的基は、−ＣＯ２−基でのよ うにプラスイオン電荷またはアンモニウムイオンでのように、マイナスイオン電 荷を触媒抗体に導入するのに有用である。また、この付加的基は、基質の〜ＯＨ を置換し、極性環境を創造し、非極性環境を創造し、または水が入る孔を提供す ると言われている。 ラーナー等、ＢｉｏＡｓｓａｙｓ、９：１０７−１１２　（１９８８）は、免疫 用ハブテンのイオン電荷基を使用して抗体結合部位の反対電荷基を生じさせるこ とにより、非荷電基質を使用して、酸−塩基触媒作用を容易に生起させうろこと を教示している。触媒抗体を誘導するこの方法は、この触媒抗体が荷電されたノ ＼ブテンで誘導され、かつ誘導された抗体触媒の基質が中性分子に切り替わり、 その結果、抗体中にハブテンのイオン電荷と反対に誘導されるイオン電荷を利用 して中性基質の反応の酸−塩基触媒作用を提供しつることから“ベイト（Ｂａｉ ｔ）・アンド・スイッチ”と呼ばれる。しかし、この“ベイト・アンド・スイッ チ”法を行うための具体的なハブテン構造は教示されていない。 かかる分子の製造法および使用法、並びに該触媒分子を生成する細胞に関する。 この触媒活性分子は、モノクローナル抗体分子またはモノクローナル抗体結合部 位部分を含む分子であることが好ましい。これらの分子の抗体結合部位は、少な くとも二つのリガンド分子と免疫反応（結合）する。第一リガント分子は、加水 分解される結合のカルボン酸およびアミンまたはアルコール部分の各々に結合す る炭素含有化学残基とともに、加水分解される所定のカルボン酸アミドまたはエ ステル結合を含む反応体リガンドである。 第二リガンドは、触媒分子を誘導するために直接的または間接的に使用されるハ ブテン性リガンドである。このハブテン性リガンドは、反応体リガンドと構造的 に類似しており、加水分解される所定の反応体リガンドのカルボン酸アミドまた はエステルの水酸基と、カルボニル基の位置に対応するリガンド中の位置の飽和 炭素原子と、カルボニル結合へテロ原子との各々に結合する四面体炭素原子を含 む。このように、例えば反応体リガンドにおいてアミド−ＣＯＮＨ−またはエス テル−ＣＯＯ−結合が加水分解される場合、ハブテン性リガンドは、エステルま たはアミド結合金有基に類似する部位に−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ，基を含む。四面 体炭素原子と、ハブテンの飽和炭素原子とに結合する炭素含有化学残基は、反応 体リガンドのカルボニル部分と、アミンまたはアルコール部分との各々に結合す る化学残基と構造的に似ている。 また、ハブテン性リガンドは、生理学的ｐＨ値の水溶液中でイオン電荷を有する 基を含む。このイオン電荷含有基は反応体リガンドの対応する部位には無く、先 に述べた水酸基結合四面体炭素原子から半径約７、好ましくは約２乃至約５オン グストロームの範囲に限定される球状範囲内に存在する。イオン電荷含有基が生 理学的ｐＨの水溶液中にカルボキシレートまたはアンモニアイオンを提供するこ とが好ましい。 反応体リガンドは、構造式。 Ｒ’−Ｃｏ−Ｘ−Ｒ’ （式中、Ｒ１およびＲ２は、反応体の炭素原子含有化学残基を表し、また、−Ｘ −は、−〇−または−ＮＲ’−（Ｒ’は、水素原子または第三炭素含有化学残基 である。）である。）で表すことが出来る。ハブテン性リガンドは、構造式、Ｒ ”−ＣＨ（ＣＨ）−ＣＨＲ”−Ｒ” （式中、Ｒ＋’およびＲ２は、それぞれ構造的にＲ１およびＲ２に類似する炭素 原子含有残基を表し、Ｒ１’およびＲ２°のうちの少なくとも一つは、生理学的 ｐＨの水性溶液中でイオン電荷を有する基を含み、そのイオン荷電基は、前記構 造の−ＣＨ（ＯＨ）−基から半径約７、好ましくは約２乃至約５オングストロー ムに限定される球体容積内に存在する。Ｒ３°は、−Ｘ−が−Ｏ−である時はＨ であり、また−Ｘ−が−ＮＲ”−である時は構造的にＲ３に類似する。）で表す ことが出来る。 本発明は、適当なインビボまたはインビトロの媒体中で培養したとき、先に議論 した触媒分子を生産する細胞に関する。これらの細胞は触媒分子を生産するばか りでなく、培養培地にこれらの触媒分子を分泌することが好ましい。 また、本発明は、上述の細胞の製造法に関する。それには、動物中のノ１ブテン に対する抗体を誘導するのに十分な量の前述のハブテン性リガンドを含む免疫原 で動物を免疫する。その動物をハブテン性リガンドと免疫反応する抗体を分泌す るのに十分な時間維持する。 抗体分子または抗体結合部位部分を含む分子をコードする遺伝子を、その維持し た免疫動物の抗体産生細胞から宿主細胞に移してハイブリッド細胞を生成する。 これらのハイブリッド細胞は、少なくとも二つの起源に由来する遺伝子を有する 。 そのハイブリッド細胞を培養すると、転移した遺伝子から抗体分子または抗体結 合部位部分を含む分子が生産され、またこれらの細胞は遺伝子転移用抗体産生細 胞と比較して実質的に無限に培養することが出来る。 このハイブリッド細胞を抗体分子または抗体結合部位部分を含む分子が生産され るのに十分な時間適当な培地および適当な培養条件で培養し、それらの生産物を 回収したのち、スクリーニングして所定の反応体リガンドのカルボン酸アミドま たはエステル結合を触媒的に加水分解する抗体分子または抗体結合部位部分を含 む分子を生産するハイブリッド細胞を同定する。そして、その同定されたハイブ リッド細胞のクローンを増殖する。 また、本発明は、反応体リガンド中の所定のエステルまたはアミド結合を触媒的 に加水分解する方法に関する。ここでは、先ず触媒的に有効な量の前述の触媒分 子を水性媒体中反応体リガンド分子と混合する。この混合物を反応体リガンド分 子が触媒分子と結合し、かつその触媒分子が触媒的に所定の結合を加水分解し、 加水分解産物を生成するのに十分な時間維持する。その後、一つ以上の生成産物 が回収される。 図面の簡単な説明 以下の図面も本公開の一部を形成する。 第１図ＩＡおよび１８図は、特定のハブテン性リガンド（化合物１ａ、２．５ａ 、６および７）、インヒビター（化合物１ｂ）、基質または反応体リガンド（化 合物３）および本明細書で議論および使用する反応化合物４の構造式を示してい る。 第２図は、二つのｐＨ対ｌｏｇＫ値の関係を示すグラフである。上の部分憬２Ａ 図）は、反応体リガンド（化合物３）の反応を触媒するモノクローナル抗体３０ Ｃ６の反応に関するｌｏｇ値−３乃至−２の範囲の［Ｏｇｋｃｍ＋　”’対ｐＨ のプロットを示している（黒丸）。各点を通過する線は、以下の式：を用いて計 算した。 下の部分（第２Ｂ図）は、バッファ濃度ゼロに外挿した化合物３の反応に関する ｌｏｇ値−９，５乃至−７，０の範囲のＩ　ｏ　ｇ　ｋ　−ｈａ　’対ｐｕのプ ロットを示している（黒三角）。計算による線は、以下の式に、ｈ、’　＝Ｋａ 　＋　ＨｏＨ［：ＯＨ−］を用いて得た。 両プロットのｐＨ値は、５．５と８．５の間にある。ｋｅａいに、（ｐＫ、）、 ｋ。およびｋ。、Ｉ−の値は後の結果のセクションに示しである。 第３図は、第２図と同様に二つに分けたグラフである。上の部分（第３Ａ図）は 、反応体リガンド（化合物３）の反応を触媒するモノクローナル抗体の反応に関 するｌｏｇ値約−３乃至約−１に関するｌｏｇｋｃａｔ…対ｐＨのプロットを示 す（黒丸）。 第３図の下の部分（第３Ｂ図）は、モノクローナル抗体２７Ａ６によって触媒さ れる化合物３の加水分解反応に関する、ｌｏｇ値約−８乃至−６の範囲の１゜ｇ ｋ。２５．（観測された速度定数）対ｐＨのプロットを示す（黒三角）。黒四角 はバッファ濃度ゼロに外挿した同反応のｌ　ｏ　ｇ　ｋ−ｂ＝ａ対ｐＨに関する 。計算による線は、以下の式： ％式％） を用いて得た。 本発明は、反応体リガンドに構造的に類似するハブテン性リガンドによって誘導 される、レセプターまたは触媒性分子と集合的に呼ばれる抗体分子またはその抗 体結合部位部分を含む分子に関する。このハブテン性リガンドは、反応体リガン トのエステルまたはアミド結合の加水分解に関する反応配列における遷移状態の イオン電荷ではなく、その構造を真似る。触媒分子（抗体分子または抗体結合部 位（パラトープ）部分を含む分子）はハブテン性リガンドと、反応体リガンドと に結合する。この触媒分子は反応体リガンドの所定の部分の加水分解遷移状態を 安定化し、かつその触媒された加水分解反応に対する酸−塩基または親核的触媒 作用に寄与するイオン電荷アミノ酸残基を提供すると考えられている。これらの 分子は触媒的に反応体リガンドを加水分解する。 抗体および酵素はいずれもタンパク質であり、その機能は特定の目標分子と結合 する能力に依存する。酵素反応においてはその基質への酵素の結合が一般に化学 的触媒作用を誘導するが、抗体−抗原結合では通常非触媒的複合体が生成する点 で酵素反応と免疫反応とは異なる。 酵素は、タンパク質と結合し加水分解反応の遷移状態を安定化することでタンパ ク質の加水分解反応を触媒すると考えられる。酵素が反応の遷移状態を安定化し つる能力、即ち、遷移状態の自由エネルギーを減少し、したがって反応の活性化 エネルギーを減少する能力から、一般に、酵素反応の速度は非酵素的反応の速度 よりも大きいと考えられている。　〔ジエンクス（Ｊｅｎｃｋｓ）、Ｗ、Ｐ、。 Ａｄｖ、ＥｎｚｙｍｏｌｏｇＹ、４３　：２１９　（１９７５）およびポーリン グ（Ｐａｕｌｉｎｇ）、Ｌ、、Ａｍｅｒ、５ｃｉｅｎｔｉｓｅ、３６：５８（１ ９４８）　）。この理論は、仮定された遷移状態を真似る物質が競合インヒビタ ーとして酵素に強く結合することが多いという観察から支持される。レインハー ド（Ｌｅｉｎｈａｒｄ）、Ｇ、、５ｃｉｅｎｃｅ、１８０：１４９　（１９７３ ）およびウォルフエンデン（Ｗｏ　１　ｆｅｎｄｅｎ）、Ｒ，、Ａｃｃ、Ｃｈｅ ｍ。 Ｒｅｓ、、５：１０　（１９７２）。さらに、酵素は対応する基質または産物に 結合するよりも強く反応体の遷移状態構造に結合することによって、反応の自由 エネルギーを低下していると考えられている。 この事は、酵素の本質的な結合エネルギーが基質または産物の結合から測定され るものよりも遥かに大きいことを意味している。基本的に酵素の結合エネルギー は、化学反応を遂行するのに使用される。〔ジエンクス、　Ｗ、　Ｐ、　、　Ｘ ＶＩＩＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　５ｏｌｖａｙ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（１ ９８３年１１月）〕。 逆の言い方をすると、遷移状態の適当な類似物にうまく結合するよう調製された 抗体は触媒として機能する。この結果を確かめることは、酵素機能と抗体構造の 相互関係を明確にすることであり、人工的酵素を考案する有用な手段を提供する 。 ここで述べられている免疫学的加水分解の背景にある基本的概念は、（ａ）特定 の反応体リガンドに結合すると、アミドまたはエステル結合の加水分解の遷移状 態に優先的に結合して、安定化し、かつ（ｂ）おそらく誘導された結合部位にイ オン荷電した酸−塩基または親核的反応触媒アミノ酸残基を提供する所定の特異 性を有する抗体の誘導におけるハブテン性リガンドの使用に関する。有用なハブ テン性リガンドは、アミドまたはエステルの加水分解における高エネルギー遷移 状態のイオン電荷ではなく、その構造（コンフォメーション）に似ることにより 関連する基質（反応体リガンド）に結合し、かつその加水分解物を安定化する能 力を有する抗体の生産を誘導する。また、ハブテン性リガンドには、生理学的ｐ Ｈ値の水溶液中でイオン電荷を提供し、抗体結合部位中に反対に荷電したアミノ 酸残基を誘導する基が含まれる。その反対に荷電したアミノ酸残基が酸−塩基ま たは親核的反応触媒効果を提供すると考えられている。 このような優先的結合および安定化により、加水分解反応の活性化エネルギーが 低下する。このことは触媒の定義と一致する。結合部位中に荷電アミノ酸残基が 存在することによって、セリンプロテアーゼ等のタンパク質分解酵素の活性部位 にある荷電残基に似ることができる。この性質を示す抗体は、荷電残基を誘導し 、かつ加水分解を受ける基質反応体の結合特性を真似ねるよう化学的に修正した 合成ハプテンを用いて免疫すること、即ち、特定の反応の遷移状態類似物による 免疫により得ることが出来る。 モノクローナル抗体は、ハブテン性遷移状態モデルを用いて（ラーナー等、Ｂｉ ｏＡｓｓａｙｓ、９．：１０７−１２２　（１９８８））多（のアシル転移反応 を触媒することが示された［（ａ）トラセンタノ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａ ｃａｃｔ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、８３　：　６７３６　（１９８６）；　（ｂ）　 トラセンタノ等、５ｃｉｅｎｃｅ、２３４　：１５６６　（１９８６）；　（ｃ ）ヤコブス等、Ｊ、　Ａｍ。 Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１０９　：　２１７４　（１９８７）；　（ｄ）ナラパー （Ｎａｐｐｅｒ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２３７：１０４１　（１９８７）；　（ ｅ）ジャンプ（Ｊ　ａ　ｎ　ｄ　ａ）等、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、ｌ　１０ 　：４８３５　（１９８８）；ジャンプ等、５ｃｉｅｎｃｅ、２４１　：　１１ ９９　（１９８８）；　（ｇ）ジャンプ等、５ｃｉｅｎｃｅ、２４４：４３７　 （１９８９））。 アブザイム（ａ　ｂ　ｚ　ｙｍｅ）とも呼ばれるこれらの加水分解性抗体または レセプターの範囲および能力を拡大するために、抗体の結合部位における触媒活 性を誘導するための新しい方法が開発されなければならない。最近の報告は、半 合成法（（ａ）ボラック等、５ｃｉｅｎｃｅ、２４２：１０３８　（１９８８） （ｂ）ボラック等、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１１１：１９２９　（１９ ８９））または部位特異的突然変異誘発（ボールドウィン（Ｂａｌｄｗｉｎ）等 、５ｃｉｅｎｃｅ、２４５：１１０４　（１９８９））を用いた抗体結合ポケッ トまたは部位の修正に注目している。しかし、触媒抗体の使用可能な構造データ が少ないことから、これらの方法の一般性は低い。 ハプテン性抗原から触媒的に活性な基を初めから誘導しえる方法は、体細胞変異 プロセスを介して免疫応答の広い変化を利用して“インビボ”突然変異誘発を行 いうろことから、より有効であると思われる。ここで議論している結果は、誘導 した抗体分子の結合部位内にアミノ酸残基を誘導して、従来“ベイト・アンド・ スイッチ”と呼ばれている方法により全てのアシル転移反応を助ける方法を報告 している。 ここで示す計画は、加水分解されるアシル部分に近接して抗原または／’％ブテ ン性リガンド（化合物１ａ）（第１図）内にイオン電荷を置くことに関する。こ のハプテンに対する抗体は、このハプテンの電荷と逆の電荷を結合部位に有する アミノ酸を有すると考えられる〔（ａ）プレスマン（Ｐ　ｒ　ｅ　ｓ　ｓｍａｎ ）等、Ｊ。 Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、６８　：２５０　（１９４６）；　（ｂ）ブレスマ ン等、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、７５：６８６　（１９５３）；　（ｃ） グロスバーブ（Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇ）等、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、８２ ：５４７０（１９６０）；　（ｄ）ショカット（Ｓｈｏｋａｔ）等、Ｎａｔｕｒ ｅ（ｏンドン）。 ３’３８：２６９　（１９８９））。 さらに、化合物１ａは、アシル転移遷移状態の構造的類似物または表現物として 働（四面体構造を有する水酸基を抗体に提供する。この位置は電荷を持たないの で新たな静電効果はないであろう。 ハブテン化合物１ａに対応するベンゾエート基質または反応体リガンド（化合物 ３）（第１図）は、同様の立体的大きさを有しているが（ＭＭ２計算から決定し た）、正の電荷は無い。従って、誘導された触媒抗体結合部位に存在すると考え られるイオン電荷したアミノ酸残基はイオン対を形成せず、強力な一般的酸一塩 基または親核的触媒として働く。 ピリジンハブテンリガンド（化合物２）（第１図）は、構造的に化合物１ａと同 じであるが、メチル基および生理学的ｐＨ値における電荷を欠いていることから からコントロールとして働く。以前、電荷の相補性を用いて抗体触媒によるβ− 脱離反応における基質プロトンの引き抜きが行われたが、中性ハブテンとの比較 はなされなかった。ショカット（Ｓｈｏｋａｔ）等、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン） 。 ３３８・２６９（１９８９）。 “レセプター”という言葉は、反応体リガンド、インヒビターリガンド、または ハブテン性リガンドと結合する生物学的に活性な分子に対して使用される。本発 明のレセプター（触媒性）分子は、抗体、実質的な不変の抗体または抗体のイデ ィオタイプ含有ポリアミン（バラトープ含有）部分である。 レセプター分子の生物学的活性は、少なくとも生理学的ｐＨ値およびイオン強度 の水媒体中でレセプターをその抗原性反応体リガンド、インヒビターリガンドま たはハブテン性リガンドと混合すると、結合することから確認される。また、レ セプターは、約５から約９の範囲のｐＨ値範囲、かつ蒸留水から約１モル濃度の 塩化ナトリウムまでのイオン強度範囲の条件下で抗原性リガンドに結合すること が好ましい。 抗体のイディオタイプ含有ポリアミン部分（抗体結合部位またはパラトープ）は 、イディオタイプを含み、かつ反応体リガンドまたはハブテン性リガンドと結合 する抗体分子の一部分である。このような部分には、従来の方法で抗体から調製 されるＦａｂ、Ｆａｂ’　およびＦ（ａｂ’）、フラグメントが含まれる。例え ば、一般にはチオフィロボーロス（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ）およびディ クソン（Ｄｉｘｏｎ）の米国特許第４，３４２，５６６号参照。また、特に天然 Ｉｇと同程度の加水分解速度を示すＦａｂフラグメントに関して、ボラック等、 ５ｃｉｅｎｃｅ、２３４　：１５７０　（１９８７）参照。イディオタイプ含有 ポリアミンを提供する抗体は、免疫原に対して生成、誘導されるので、抗体から イディオタイプ含有ポリアミンを得るのに切断ステップが必要であることを理解 した上で、イディオタイプ含有ポリアミンレセプターが”生成”または”誘導” されると言われる。しかし、本来の抗体が好ましいので、本発明のレセプター分 子の例として採用している。 本発明で有用なレセプターは、モノクローナル抗体またはその一部であることが 好ましい。“モノクローナル抗体”は、一種のレセプターを生産、場合によって は分泌する単一細胞クローンから生成されるレセプターである。ハイブリドーマ 細胞はこのような細胞の例であり、抗体産生細胞とミエローマ細胞またはその他 の自己複製細胞系の融合で得られる。 ハイブリドーマ技術を用いて本発明のモノクローナル抗体を調製する方法はよく 知られている。最初にこのようなレセプターを報告したのは、コラ−（Ｋ。 ｈ　１　ｅ　ｒ）およびミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ、 ２５６：４９５　（１９７５）（参考としてここに導入する）である。一般に、 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ組織培養物またはハイブリドーマ組織を 導入した哺乳動物の腹水から得られる。いずれの方法も本明細書で説明する。 特定の免疫用ハブテン性リガンドおよび反応体リガンドなどの特定のエピトープ に結合する独特の特異性、およびポリクローナル抗体と比較して高い特異的触媒 活性を有することから、モノクローナル触媒抗体がより好ましい。また、ポリク ローナル抗体調製物も使用しつるが、一般に免疫化ハブテン性リガンドに結合す るフラクションと抗原キャリヤーのエピトープなどの外来のエピトープに結合す るフラクションに分けられる。 ハブテン性リガンドに結合するポリクローナル抗体は、アフィニティー吸着体と してハブテン性リガンドを用いたアフィニティー分離法により分離される。適当 な免疫反応が起こるのに十分な時間、抗体調製物とアフィニティー吸着体の混合 物を維持したのち、そのアフィニティー吸着体を抗体調製物の残りの部分から分 離する。 アフィニティー吸着体に結合した分離４残抗体部分はハブテン性リガンドに結合 する抗体を含むが、分離残存抗体調製物中の抗体はその他のエピトープに結合す る。その後、これらのアフィニティー結合抗体は、グリシン−塩酸（ｐＨ２）に よる吸着物の洗浄などのようにアフィニティー吸着体から結合物質を分離する技 術で単離できる。 “リガンド”とは、レセプター分子抗体結合部位と免疫反応または結合する分子 または複合体である。ここでは、基本的に二つのタイプのリガンドが関係する。 一つはハブテン性リガントであり、レセプター分子の合成を誘導する免疫原、レ セプター分子による触媒反応のインヒビター、およびＥＬＩＳＡまたはその他の 検定における抗原として使用される。もう一つは、反応体リガンドまたは基質と 呼ばれ、触媒反応を受ける分子である。実質的にハブテン性リガンドは、この触 媒反応には不活性である。 本明細書で述べられているように、形態（コンフォメーション）的に同じか、も しくは類似する反応体リガンドのアミドまたはエステル結合の加水分解における 遷移状態のイオン電荷ではなく、形態を真似ることにより特定の部位で水酸基に 直接結合し、かつ飽和炭素原子に直接結合する四面体炭素原子を有するハブテン としてアミドまたはエステル反応体リガンドの化学的アナログを合成した。 ポリペプチドまたはタンパク質のアミド結合の加水分解には、ハブテン性免疫原 として使用するとき実質的に加水分解のないハブテン性リガンドが必要である。 このように、四面体炭素、その水酸基および近接し直接結合した飽和炭素原子を 含むハブテン性リガンドはそのような加水分解を起こさない。 短いポリペプチド鎖は所定の特定部位で同族的タンパク質を確認し、結合するタ ンパク質の生産を誘導しつる。本発明は、初期のポリペプチドを用いた研究を太 き（前進させる。 抗体（レセプター）は、免疫用のイオン電荷含有ハブテン性第１分子（ハブテン 性リガンド）によって誘導され、第１分子ばかりではなく、類似した部位にイオ ン電荷を持たない第２の関連分子（反応体リガンド）を認識し、結合する。その 第２分子と結合することにより、そのレセプターは免疫用のハブテン性第１分子 のトポロジーに対応する所定のエステルまたはアミド結合の加水分解反応反応） を起こす。トポロジーの対応、即ちイオン電荷ではな（サイズや形の対応により 、リガンドの加水分解が起こる部位を予め選択する手段が得られる。ハブテン性 リガンドまたは反応体リガンドの構造に似たインヒビターリガンドもこのレセプ ター分子と結合する。 結果的に、比較的小さな免疫用のハブテン性リガンドを合成することにより、複 数のアミドまたはエステル結合を有する別の分子を認識し、結合し、および触媒 的に切断するレセプター分子の生産を誘導する事が出来る。このように、遺伝子 工学による融合タンパク質などのタンパク質またはポリペプチドの所定のアミド 結合またはポリエステル中の所定のエステルのエステル結合を触媒的に切断する レセプター分子が調製できる。 この結果は、未知のプロテアーゼおよびエステラーゼ活性を免疫グロブリンに付 与できることを意味している。 ■、エステル分解の遷移状態およびハブテン性リガンドの設計ハブテン性リガン ドの設計は、生成する加水分解産物の構造から、切断する結合を真似られる結合 破壊のための遷移状態を経て、およびハブテン性リガンドへと逆行する。エステ ルまたはアミドの加水分解を含む反応は一般的概念の代表例を提供し、ここでは エステルまたはアミドの加水分解反応の例としてこれらを使用する。 トランスアシレーション反応はカルボニル付加−脱離メカニズムに特徴を持つ。 従って、アシル基はこの遷移状態において種々の程度の四面体性を有している。 ｗ、　ｐ、ジエンクス（Ｊｅｎｃｋｓ）、Ｃａｔａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｃｈ、１０．　（７グロ一ヒル版 、ニューヨーク、１９６９）。トランスアシレーション反応を触媒する酵素は、 アシル中心の回りに四面体形態を有する反応体リガンドのアナログと良く結合す ることが期待できる。この事は、一時的にリガンド（基質）と酵素との間に共有 結合が生成するセリンプロテアーゼ〔ウニステリフ（Ｗｅｓｔｅｒｉｋ）等、Ｊ 。 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４７．８１９５　（１９７２）；Ｒ，Ｃ，トンプソン （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１２．４７　（１９７ ３）およびインベラリ　（Ｉｍｐｅ　ｒａ　Ｉ　ｉ）等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ、２５゜３７６０　（１９８６））およびアミドまたはエステルの直接的水 和を触媒する酵素に関しては正しい。後者のカテゴリーは、切断可能なアミドユ ニットの代わりにリン酸、ホスホネート、またはホスホンアミデート基を含む四 面体構造を有する化合物によって阻害される〔ウェーバ−（Ｗｅ　ｓ　ｖ　ｅ　 ｒ）等、Ｊ、Ｍｏｌ。 Ｂｉｏｌ、１１４：１１９　（１９７７）およびヤコブセン（ｊａｃｏｂｓｅｎ ）等、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１０３：６５４　（１９８１）］。 カルボン酸エステルの加水分解は、遷移状態のハブテン性立体類似物に近いトラ ンスアシレーションの簡単な例である。一般に、エステル加水分解反応は、抗体 に適した周囲の条件下で簡便な速度で進行する。従って、いかなる小さな速度の 増加も容易に検出できる。 有用なハブテン性リガンドは、水酸基に結合しおよび飽和炭素原子にも直接結合 した四面体炭素原子を含む。これらの原子は、立体的にカルボン酸エステルまた はアミド結合の加水分解遷移状態の四面体炭素原子、結合酸素原子または窒素原 子（ヘテロ原子）に立体的に似ている。しかし、遷移状態のイオン電荷には似な い。従って、この四面体炭素原子、その水酸基、および直接結合した飽和炭素原 子は、反応体リガンド中の加水分解される所定のカルボン酸アミドまたはエステ ル結合のカルボニル基の位置、およびカルボニルが結合したヘテロ原子（酸素ま たは窒素）の各々に対応するハブテン性リガンド中の位置に存在する。加水分解 が起こる原子以外は、ハブテン性リガンドと反応体リガンドは構造的に類似する ように、反応体リガンドの炭素原子含有残基に構造的に類似する炭素原子含有化 学残基は四面体炭素原子および飽和炭素原子に結合する。 この反応性カルボニルおよび酸素または窒素原子の立体構造的類似性は、加水分 解遷移状態に類似する従来の研究者に用いられてきたホスホネートまたはホスホ ンアミデート基またはカルボネート基とは異なる。また、本発明の立体類似体は 、本ハブテン中の構造が基質の類似構造よりもより少ない価数を含みかつ同数（ １以上ではない）の結合を含む点でキム（Ｋｉｍ）等の特許で議論されているも のとは異なる。 さらに、本発明で有用なハブテンには、生理学的ｐＨ値の水性媒体中でイオン電 荷を有するものが含まれる。イオン電荷含有基は、上述の四面体炭素原子に直接 結合しうる。しかし、このイオン電荷含有基は、四面体炭素原子に間接的に結合 し、四面体炭素原子から半径約７オングストローム（人）に限定される球体容積 内に存在することが望ましい。また、その半径は約２乃至約５人であることがよ り望ましい。 このイオン電荷含有基は反応体リガンドまたは基質中の対応する部位にはない。 また、これらは多くの既知の基から選択することができる。 例えば、抗体結合部位に相補的な正の電荷を誘導する生理学的ｐＨ値で負の電荷 を有する基には、カルボキシル基（−Ｃｏ、Ｈ）、ホスホノ基（−Ｐ　（ＯＨ） ｔｏ）。 スルホ基（５ＯｓＨ）、　ホスｔｏ基（−ＯＰ　（ＯＨ）Ｏ）、　スル７７ト基 （−〇Ｓｏ！Ｈ）等が含まれる。抗体結合部位中に相補的な負の電荷を誘導する 生理学的ｐＨ値で正のイオン電荷を有する代表的官能基には、アミノ基（ＮＨｌ ）。 グアニジン基（−ＨＮＣ（Ｎ）ＮＨｌ１　、各置換基がＣｒ　Ｃｓ低級アルキル 基、ベンジル基およびナフチル基等の約１０個迄の炭素原子を含むモノ−および ジー置換アミノ基、または二つの置換基がモルホリン、ピペリジン、ピロリジン 、上述の置換基を有する置換グアニジン化合物、およびトリエチルアンモニウム 基のような三置換アンモニウムまたは置換キノリニウムまたはピリジニウム環等 の第四化芳香族環などの第４窒素含有基が含まれる。上記天然に荷電している各 基は、生理学的ｐＨ値の水性媒体中で負または正電荷のイオン基として存在する 。 カルボキシレートおよびアンモニウムイオンを提供するヘテロ芳香族環に存在す るようなカルボキシル基および第四アミンが好ましい。イオン電荷含有基を議論 する場合、四個の置換基又はプロトン化により四級化しているか、または非環状 型またはＮ−メチルピリジニウム残基におけるように環の一部として環状型で存 在しているかどうかにかかわらず、四級アミンは全てアンモニウム基の分類に含 まれると考える。 生理学的ｐＨ値でイオン電荷を有する基が化合物１ａで例示的に使用されている Ｎ−メチルピリジニウム化合物の四級窒素原子の場合と同様に、先に述べた四面 体炭素原子に結合する他の基の一部である場合、そのイオン電荷含有基は、ピリ ジニウム環の四級窒素原子であると考えられる。このような構造のイオン電荷含 有基は、四面体炭素原子に間接的に結合し、またイオン電荷、即ち四級窒素原子 を含むイオン電荷含有基の原子は、少なくともｌ原子、好ましくは炭素原子によ って四面体炭素原子から分離されている。グリコール酸誘導体などの分子は、四 面体炭素原子およびその水酸基に直接結合するイオン基を含んでいる。 この反応体リガンドは、ハブテン性リガンドと構造的に類似しているが、反応体 リガンドはハブテン性リガンド中の官能基の位置と構造的に類似する位置に存在 する、生理学的ｐＨ値の水性媒体中でイオン電荷を有する前述の官能基を含んで いない。従って、代表的ハブテン性リガンド化合物１ａは、Ｎ−メチルピリジニ ウム四級窒素を含んでいるが、代表的基質リガンド化合物３はその対応する部位 に中性のフェニル基およびその炭素および水素原子を含んでいる。 また、ハブテン性リガンドおよび／または反応体リガンド（基質）は、生理学的 ［）Ｈ値の水性媒体中でイオン電荷を有する一つ以上の基を含みうる。これらの イオン電荷含有基は、二つのタイプのリガンド分子間でその位置が対応してもし なくても良い。さらに、このような付加的イオン電荷基は、前述のイオン電荷含 有基に関して定義した球状容積内に存在することも可能である。／Ｘブテン性リ ガンドおよび反応体リガンドのいずれか、または両方に先に述べた少な（とも一 つのイオン電荷基に加えて一つ以上のイオン電荷基が存在することは、触媒分子 の結合部位へのハブテンの結合を容易にすることから有用である。特に、この事 は本明細書で例示的に用いているような比較的小さいハブテンを使用する場合に 有用である。 例えば、デキストランを用いた研究で、抗デキストラン抗体の結合が６乃至７個 のグルコース残基を含むデキストランで最高となることが示された。ポリアラニ ンオリゴマーを用いた実験では、４乃至６個のアミノ酸残基で最高の結合が示さ れた。チャツプマン（Ｃｈａｐｍａｎ）等、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版 、１６章、Ｉ）ｐ、４４４−４４７゜より小さいオリゴマーは結合が小さく、グ ルコースは結合が見られなかった。 従って、一つ以上の付加的イオン電荷を含むいずれか、または両リガンドを提供 することは、電荷相補性を持つ触媒抗体結合部位およびリガンドが結合部位から 推奨されるフルサイズよりも小さい場合の構造的適合によりその結合を助けるつ る。 このように、ハブテン性リガンドには、それぞれアンモニウム基またはカルボキ シレート基を提供するアミン、四級窒素原子またはカルボキシル基等の生理学的 ｐＨ値の水性媒体中でイオン電荷を提供する少な（とも１個の基が含まれる。 この電荷基は先に定義した球状容積内に存在するが、反応体リガンドの対応する 位置にはない。 既に述べたように、少なくとも１個のイオン電荷含有基が）１ブテン性リガンド 中に存在する球状容積は、四面体炭素原子から半径約７人、より好ましくは約２ 乃至約５人以内の範囲に限定される。これらの球状容積および半径は、当分野で よく知られているコンピュータプログラムまたは分子モデルを用いて計算できる 。 ハブテン性リガンド中の少な（とも一つのイオン電荷含有基の存在が、抗体結合 部位に推定的に誘導される相補的電荷のアミノ酸残基を、加水分解されるエステ ルまたはアミドのカルボニル基および結合した酸素または窒素原子に接近させる と理解できる。別のいい方をすると、／％ジブテンリガンドのイオン電荷含有官 能基は、四面体炭素原子、その水酸基、および隣接する飽和炭素原子から立体障 害を受けていない。 有用な反応体リガンドは、構造式： ％式％ （式中、Ｒ＋およびＲ２は、炭素原子含有化学残基を表し、また、−Ｘ−は、− 〇−または−ＮＲ”−（Ｒ”は、水素原子または第三炭素含有化学残基である。 ）である。）で表すことが出来る。 Ｒ１およびＲ２は、同一でも異なっていてもよい。各残基はアミノ酸、ポリペプ チド、またはタンパク質、並びに環状または値上ヘテロ原子含有残基を含む脂肪 族、又は置換脂肪族の直鎖、分岐または環状残基などの有機残基であり、また芳 香族、置換芳香族、ヘテロ芳香族または置換へテロ芳香族である。反応体リガン ドが触媒分子の作用を実質的に妨害しない水性媒体に溶解し、触媒が結合するの に十分な大きさであるかぎり、Ｒ１とＲ２の構造は実質的にどのような炭素含有 化学残基でもよい。 Ｒ１とＲ２の場合と同様に、水素（Ｈ）以外ならＲ１もどのような炭素含有化学 残基でもよい。 ハブテン性リガンドは反応体リガンドと構造が似ている。ノ１ブテン性リガンド は、構造式： ％式％ （式中、Ｒ＋’およびＲ２°は、それぞれ構造的にＲ１およびＲ２に類似する炭 素原子含有残基を表している。Ｒ３は、−Ｘ−が−〇−である時はＨであり、ま た−Ｘ−が−ＮＲ’−である時は構造的にＲ３に類似するものである。Ｒ１’お よびＲ２のうちの少な（とも一つは、生理学的ｐＨの水溶液中でイオン電荷を有 する基で、反応体リガンドには存在しない官能基を含み、また、そのイオン電荷 基は、先に議論した球体容積内に存在する。） で表すことが出来る。 好ましい態様において、Ｒ基のペアＲ１とＲ１’、Ｒ１とＲ２°、Ｒ３とＲ”は 構造的に類似しており、−Ｘ−が−〇−であること以外は、実質的にＲ１とＲｌ ｏ　Ｒ２とＲ”、Ｒ”とＲ”は同じものである。この好ましい状態でのＲ残基の 同様のペア間の相違は、ハプテン性リガンドが反応体リガンド中には存在しない イオン電荷含有基を含み、カリ後に議論するようにハブテン性リガンドを抗原性 Ｏυ１性）キャリヤー分子と結合し、免疫結合体を生成するのに使用する原子ま たは残基を含んでいることである。 従って、先に述べた相違以外は同じ番号の付いた残基ペアのサイズ、形、電荷お よび不飽和度が同じであることが望ましい。同じ番号のＲ残基ペアのサイズが異 なる場合、ハブテン性リガンドは反応体リガンドよりも大きく、より小さい反応 体リガンドが誘導された触媒結合部位内に適合しうろことが望ましい。 本研究で使用した代表的ハプテン性リガンドと反応体リガンドの構造は特定の基 準にしたがって選択した。これには、四面体炭素原子含有前駆体の有効性および 安定性、対応するカルボン酸アミドまたはエステル基質、その製造に関する化学 的合成の簡便性、および免疫学的表示の関する多様な機構への適合性が含まれる 。芳香族環にアミン置換基を含めることにより、例えば、ベンジル基またはフェ ノール基のいずれかは、ハプテンの表示のために免疫原キャリヤータンパク質に カップリングする機能的付加物が提供される。 ■　触媒抗体産生細胞および方法 本発明は、適当な培地で培養すると反応体リガンドの所定のカルボン酸アミドま たはエステル結合を触媒的に加水分解する触媒モノクローナル抗体（抗体分子ま たは抗体結合部位を含む分子）を産生ずる細胞に関する。また、これらの抗体は 、インビトロまたはインビボの培養媒体環境に上記分子を分泌することが望まし い。好ましい態様では、これらの細胞は／ゾブリドーマ３０Ｃ６等のハイブリド ーマ細胞である。 一般に、このような触媒分子産生細胞は、抗体誘導量の先に述べたハプテン性リ ガンドを含む免疫原で、マウス、ラット、ヤギまたはウマ等の実験動物を免疫化 することにより製造する。後に述べるように、一般にこの免疫原はハプテン性リ ガンドと抗原挽疫原）キャリヤーとの結合体である。 免疫化した動物がハプテン性リガンドと免疫反応する抗体を分泌するのに十分な 時間この動物を維持する。後に述べるＥＬＩＳＡ検定が必要とされる免疫反応の 存在を確認するのに有効である。 牌細胞など上述の動物の抗体産生細胞由来の抗体分子またはその抗体結合部位部 分をコードする遺伝子を宿主細胞に移行する。この遺伝子転移で少なくとも二つ の起源に由来する遺伝子を含むハイブリッド細胞が生成する。このハイブリッド 細胞は適当に培養すると移行した遺伝子由来の抗体分子または抗体結合部位部分 を生産し、またその遺伝子が由来する抗体産生細胞と比較して実質的に無限に培 養することが可能である。その遺伝子が由来する細胞と比較して実質的に無限に 培養しつる細胞には、ハイブリドーマ細胞、大腸菌細胞、Ｓ、セレビシェ（ｃｅ ｒｅｖｉｓｉａｅ）等のイースト細胞、ＣＨＯ細胞などの哺乳類の形質転換細胞 がある。 このように生産されたハイブリッド細胞をそれらが抗体分子またはその抗体結合 部位部分を生産するのに十分な時間、インビトロまたはインビボの適当な培養培 地中で培養し、その生産物を回収する。ハイブリドーマ細胞のためのインビボま たはインビトロ培養条件は、大腸菌、Ｓ、セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓ　１ａｅ ）。 ＣＨＯ等の細胞に関する条件と同様に本明細書で議論しており、また一般的にも 良く知られているものである。 その後、回収した分子をスクリーニングし、反応体リガンドの所定のカルボン酸 アミドまたはエステル結合を触媒的に加水分解する分子を生産するノゾブリッド 細胞を同定する。このようなハイブリッド細胞が一度同定されれば、そのハイブ リッド細胞クローンがたくさん増殖できる。 上述の方法には、当分野でよく知られ、また本明細書でも詳しく述べられている ハイブリトーマ調製法か含まれる。また、実質的に抗体分子の抗体結合部位部分 のみをコードする遺伝子を−っの哺乳細胞がら別の細胞に移すことが出来ること は良（知られており、上述の方法にはこのような方法も含まれている。また、上 述の方法には、抗体結合部位部分を含む分子を遺伝子工学技術を用いて大腸菌な どの非晴乳類細胞で生産するジャスドリー（Ｓｈａｓｔｒｙ）等、Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、８６：５７２８　（１９８９）および ヒユーズ（Ｈｕｓｅ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５　（１９８９）（ 参考として引用する）の方法か含まれる。これらの文献の転移遺伝子は、各々大 腸菌で発現させるＶＨまたはＦａｂ抗体部分をコードする遺伝子を調製するため にハイブリドーマまたは免疫した動物の肺臓からのｍＲＮＡから調製した。 本発明の別の方法の特徴として、このような細胞によって産生されたモノクロー ナル抗体分子または抗体結合部位部分を含む分子部課分子）を水性媒体中反応体 リガンド分子と混合し反応混合物を作る。この反応混合物を反応体リガンド分子 が触媒分子に結合するのに十分な時間、および触媒分子が所定の結合を触媒的に 加水分解するのに十分な時間維持する。必要ならば、この加水分解反応産物は回 収できる。 本発明の加水分解法は、反応混合物の一部として水性媒体を使用している。一般 にこの媒体には水およびバッファ塩が含まれている。さらに、この媒体には、塩 化ナトリウムなどの塩ならびにタンパク質含有媒体中にしばしば見られる水溶性 カルシウムおよびマグネシウム塩も含めうる。メタノール、エタノール、アセト ニトリル、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、ヘキサメチルホスホラミド、お よびＮ、　Ｎ’　−ジメチルホルムアミドなどの有機溶媒も存在しうる。また、 反応体リガンドおよびレセプター分子をエマルジョン化する界面活性剤も存在し ろる。水性媒体中に存在する重要な成分の基準は、これらの成分が触媒分子の変 性などにより触媒反応を実質的に妨害しないことである。さらに、この水性媒体 には触媒分子によって触媒される結合切断反応を阻害する塩、タンパク質、特に 酵素が実質的に含まれない。 水性媒体は、一般にｐＨ約５−９、好ましくは約６．　０−８．　０である。こ れよりも高いまたは低いｐＨは、触媒反応が実質的に妨害又は阻害されない限り 使用できる。 一般に、この触媒反応は周囲室温、即ち約２０°Ｃから約２５℃または３７℃、 および周囲大気圧、即ち約１気圧で行われる。しかし、周囲大気圧下、水性媒体 の凝固点以下および沸点以上の温度も使用しうる。良く知られているように、本 発明の触媒分子などのタンパク質は、水性媒体が沸騰する高温、例えば約１００ ℃では変性してしまうので、約４０℃以下の温度で反応させるのが好ましい。 反応混合物中の反応体リガンドは、その水性媒体中の溶解度までの量で存在する 。不溶性の反応体リガンドを含む２相系も使用しうるが、通常は用いない。通常 用いられる反応体リガンドの濃度は、その水性媒体中の反応体リガンドの溶解度 に対応する約０．１マイクロモル濃度（μＭ）から約１０ミリモル濃度（ｍＭ） の範囲である。産物が必要な場合は、反応メカニズムや反応速度を研究する場合 の濃度よりも高い濃度で行われる。 また、触媒効果量の触媒分子が使われることもある。従って、一般に触媒分子は 反応体リガンドに対して約１＝２から約１：１０，０００、好ましくは約１：１ ０から約１：１００のモル比で使用される。 一般に、反応体リガンドに対する触媒分子の比は、反応体リガンドに対する触媒 分子の特異的活性および反応を行う使用者の目的に依存する。従って、産物を必 要とする場合は、比較的高濃度の触媒分子と高い反応体リガンドに対する触媒分 子の比が用いられる。反応メカニズムや反応速度を調べる場合には、一般により 低い濃度および比が使われる。化学量論的量までの触媒分子が使われることもあ るが、触媒分子を使用するのであるから化学量論的量を使用することは無駄であ る。 反応維持時間は、選択する触媒分子と反応体リガンド、それらの濃度、Ｉ）Ｈ値 および温度などのパラメーター、並びに反応の目的に依存する。速度論の研究に は、しばしば分から時間のオーダーが採用され、反応産物がほしい場合には、時 間から日のオーダーが採用されることが多い。 ■、結果 ハブテン性リガンド化合物１ａおよび２は、後に述べるように４−ニトロ−フェ ネチルブロマイドを原料として各々５および４ステツプで合成された。（全ての 新規化合物は、満足のいくスペクトルＣＮ’ＭＲ，ＩＲ）および燃焼分析（±０ ．３％）結果を示した）。両ハブテン性リガンド化合物１ａおよび２をキャリヤ ータンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびキーホール・リンペット・ヘ モシアニン（ＫＬＨ）と結合しくＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルを介し て）、免疫原結合体を生成した。化合物１ａおよび２のＫＬＨ結合体で１２９Ｇ ＩＸ＋マウスを免疫化し、抗体を生成させてスクリーニングを行った。〔（ａ） コラ−等、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）、２５６：４９５　（１９７５）；　（ｂ ）エンガル（Ｅｎｇｕａｌｌ）、Ｍｅｔｈｏｃｌ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、７０　二 　４１９（１９８０））　。 ハブテン性リガンド化合物１ａによる免疫化により２３個のハイブリドーマを生 成し、一方ハブテン性リガンド化合物２は各ハブテンに結合した２１個のハイブ リドーマを生じた。すべてのモノクローナル抗体はＩｇＧクラスであり、アニオ ン交換クロマトグラフィーと、それに続くプロティンＧカラムによるアフィニテ ィークロマトグラフィーで精製した。これらの抗体はドデシル硫酸ナトリウムポ リアクリルアミドゲル電気泳動により均一であることが確かめられた。 まず、濃度２０μＭのモノクローナル抗体を、５−［（４−（ヒドロキシ）フェ ニル〕アミノ〕−５−オクソーペンクン酸、化合物４を生成するために、ベンゾ エートエステル反応体リガンド化合物３（５００μＭ）に対してスクリーニング した（５０ｍＭリン酸バー／７７、ｐＨ７，５、ｌ　００ｍＭ　ＮａＣ１）。　 扮折は、カラム：ＲＰ−Ｃ１８；流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２５４ｎｍ；溶 出液：水／アセトニトリル（Ｏｐ：　Ｉ　Ｏ）のＨＰＬＣで行った。　加水分解 産物、化合物４　（第１図、保持時間７分）を回収し、基準試料を用いたＲＰ− ＨＰＬＣおよびマススペクトル分析で同定した。）ハブテン性リガンドに対して 得られた２３個のモノクローナル抗体のうち、７個に触媒活性が見られた。ハブ テン性リガンド化合物２に対する抗体には、反応体リガンドエステル化合物３の 加水分解速度を速めるものはながった。 触媒活性が認められた７個の抗体は、遊離したハブテン化合物１ｂの添加により 完全に阻害された。この結果は、触媒作用が基質の抗体結合ポケットまたは結合 部位への結合に基づくものであることを示している。 ハブテン性リガンド化合物２対化合物１ａによって誘導される触媒性抗体の数が 膨大であることは重要である。これら７個の触媒性抗体のうちの１個がハイブリ ドーマに対して支配的であり、モノクローナル抗体３０Ｃ６を詳細に調べた。 モノクローナル抗体３０Ｃ６（２０μＭ）によって触媒される基質である反応体 リガンド化合物３（５０ｍＭ　リン酸、１００ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ７，２，３ ７℃）の加水分解の初期速度はミカエリス・メンテンの速度式に従った伽水分解 産物化合物４の濃度は、ｌ−２時間に渡り内部標準とピーク高さを比較するＨＰ ＬＣで測定した。）　標準曲線は、加水分解産物化合物４の濃度０．５ｍＭまで 直線性を示し、ｋｔａｌ”’値およびに一、値は各々５±０．２Ｘ１０−’ｍ１ ｎ−’および１．１２±０．０５ｍＭであった。ベンゾエート反応体リガンド化 合物３の抗体触媒加水分解は、ピリジニウム塩、化合物ｉｂにより完全に阻害さ れた（Ｋ＝８３±５μＭ）。 基質化合物３の加水分解のｐＨ依存性を、モノクローナル抗体３０Ｃ６（２０ｔ ｔＭ）の存在下ｐＨ６，０−７，２（ビス−トリス）および７．　２−８．　０ 　（リン酸）の範囲で検定した（いずれも５０ｍＭバッファおよび１００ｍＭ　 ＮａＣ１，３７℃（第２図））。Ｌ　ａ　＋　”　”値のｐＨ依存性は、解離基 の塩基型の関与を明らかにした。そのｐＫ、値は、６．２６±０．０５であった （第２Ａ図）。 バッファイオンの濃度変化（１２，５−５０ｍＭ）は、ｋ。１、のバッファ種存 在に関する依存性を示さなかった。 直接比較するために、バッファ濃度ゼロに外挿した同一のｐＨ領域に関する反応 体リガンドの加水分解速度（ｋ、、、’　）も測定した。ｐＨ−速度プロフィー ルは、切断に関係する化学種がｐＨ６，０−６，５の領域では水（ｋ、＝ｏ、６ Ｘ１０””ｍ１ｎ−〇であり、またｐＨ６，６以上では水酸化基（ｋｏＨ−＝　 ４　、　２　Ｘ１０”ｍｉｎ一つであることを示した。 水中での加水分解に対する基質、化合物３のｐＨ非依存的抗体触媒性加水分解の 速度の比、ｋｃ、ｌ／ｋｏ・比は、１００万倍以上の抗体による速度増加に対応 している。抗体触媒反応の至適ｐＨが、まだ未同定の（おそらく、負の電荷のも の）アミノ酸により中性ｐＨ＠域に移動することは重要である。 後に述べるように、４−ニトロフェネチルブロマイドを原料としてハブテン化合 物５ａおよび６を合成した。同様に、ジメチルアニリニウム抗原化合物７は、４ −アミノベンジルアルコールから合成した。化合物５ａ、６および７は、それぞ れ１８．２２および２６個のハイブリドーマを生成した。これら全てのモノクロ ーナルレセプター分子はＩｇＧクラスに属する。 まず、５−（（４−ヒドロキシフェニル）アミノコ−５−オクトペンタン酸、化 合物４の生成に関するベンゾエートエステル化合物３（５００μＭ）のＨＰＬＣ 検定により２０μＭの濃度の抗体をスクリーニングした（リン酸バッファ、５０ ｍＭ、ｐＨ７，５，１００ｍＭ　ＮａＣｌ、３７°ｃ）。化合物５ａに対して得 られた１８個のモノクローナル抗体のうち３個が触媒活性を有することが分かっ た。また、各々ハブテン化合物６および７による免疫化で得られた２２および２ ６個の抗体は、化合物３の加水分解速度にほとんど効果を示さないか、または阻 害効果を示した。触媒活性が認められた３個の抗体は、５０μＭのカルボン酸化 合物５ｂの存在により完全に阻害された。 最も有効な触媒性抗体、即ちハブテン化合物５ａによる免疫化で得られるバイブ リドドーマ２７Ａ６から分泌されるモノクローナルレセプターの速度論を詳細に 調べた。また、このモノクローナルレセプターはレセプターまたは抗体２７Ａ６ と呼ばれる。レセプター２７Ａ６により触媒される化合物３の加水分解の初速度 は、ミカエリス−メンテンの速度論に従い、Ｋｃ、、＊Ｐ９およびに、値は各々 ０．０１±０．００２ｍ１ｎ−’および（２４３±１５）　ｘ　ｌ　Ｏ−’Ｍで あった（５０ｍＭ４−（２−ヒドロキシエチル）−１〜ピペラジンプロパンスル ホン酸（ＥＰＰＳ）。 １００ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ８，５，３７℃）。ベンゾエート化合物３の抗体触 媒による加水分解は、カルボン酸化合物５ｂにより競合的に阻害された（Ｋ１＝ ６±２μＭ）。 化合物３の加水分解のｐＨ依存性をｐＨ７，２乃至８．４　（ＥＰＰＳ）および ｐＨ８，４乃至１０．０（２−（シクロへキシルアミノ）エタンスルホン酸（Ｃ ＨＥＳ））（いずれも５０ｍＭ　バッファおよび１００μＭ　ＮａＣｌ、３７° Ｃ）の範囲に関しモノクローナルレセプター２７Ａ６　（２０μＭ）の存在下で 検定した（第３図）。この領域におけるｌ　ｏ　ｇＫ−＋”２１のｐＨ依存性（ 第３Ａ図）は線型で、パックグランド加水分解速度（１ｏｇＫ。１．６．第３Ｂ 図、黒三角）およびバッファ濃度ゼロに外挿した化合物３の加水分解速度（ＫＯ １＋＝　２　、　３　Ｘ　１０−２ｍ１ｎ−’）　（第３Ｂ図、黒四角）も同様 に線型であった。モノクローナル抗体２７Ａ６存在下におけるバッファ濃度変化 （１２，５−５０ｍＭ）は、バッファ濃度に関するに６□°−の依存性を示さな かった。ＥＰＰＳおよびＣＨＥＳ（５０ｍＭバッファ、１００ｍＭ　ＮａＣ１， ｐＨ８，６）中での検定では、モノクローナルレセプター２７Ａ６に関する速度 に差は見られなかった。 モノクローナルレセプター２７八６のエステル分解活性は、蛋白質の５０倍モル 過剰量のジエチルピロカーボネートまたはマレイン酸無水物による影響を受けな かった。フェニルグリオキサルによる同様の処理では、触媒活性の７５％が失わ れた。また、この抗体調製物は、ＥＬＩＳＡで見られるように４倍量のタイター 値（ハブテン、化合物５ｂに対する結合）の減少を示した。この蛋白質のインヒ ビター化合物５ｂ（蛋白質の５倍モル過剰量）存在下での同様の処理は、触媒活 性が僅か３５％減少しただけでタイター値の変化はなかった。 これらの知見から、ハブテン化合物５ａ、６および７に対する他の触媒性または 非触媒性抗体を先に示した様にフェニルグリオキサルを用いて化学的に修飾した 。化合物６　（２Ｇ４，４Ｅ３．６Ｈ４，６Ａｌｌ）および７（５２Ｄ１１゜５ ７Ｇ１２．７０Ｆ３．５Ｇ３．６０Ａ４）に対する抗体は影響を受けなかった（ ＥＬＩＳＡ）、対照的に、化合物５ａ　（５７Ｇ１１．６０Ａ４．５２Ｄ１１お よび５Ｇ３）を用いて誘導された５個全ての抗体の結合は、いくらか減少した（ 、ＥＬＩＳＡ）。触媒性抗体５７Ｇ１１および７０Ｆ３は、タイター値が４倍減 少し、また抗体６０Ａ４．５２Ｄｌｌおよび５Ｇ３は、それぞれ３．２および１ 倍のタイター値の減少を示した。 各基質に転移させる化学残基（エステルまたはアミド）の近傍、または直接置換 により点電荷を有する同族的ハブテンシリーズ（第１図）から誘導した抗体を使 用することに基づく前述の方法が効果的であることが示されてきた。これらのハ ブテンに対する抗体は、抗体結合部位にハブテン電荷と反対の電荷を有するアミ ノ酸残基を有していると考えた。基質エステル化合物３はこの電荷を欠いている が、全体的には同様の構造を保持している。故に、化合物３の結合に当たっては 結合部位のアミノ酸残基は本来の電荷安定化の役割を持たず、強力な一部的酸／ 塩基または遷移状態安定化要素として働きうる。 抗体−ハブテンの電荷相補性がこの目的の達成に本質的であると思われるが、ハ ブテン設計の別の２つの面も重要であると考えられる。第１は加水分解を受ける アシル基の置換であり、もう一方は非電荷ハブテンの使用の必要性である。 第１のポイントは適当なアシル部分アイソステア（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）を用いて 行われる。発生する遷移状態の適当な表示として使われている四面体幾何構造を 有する水酸基を採用した。この部位を意識的に非電荷のままで置き、付加的静電 効果を無くした。しかし、米国特許第４，６２９，５６７号およびヨーロッパ特 許出願第０　２６０　４３９Ａ２号に公開されているように“第二世代ハブテグ には、この部位に荷電を有するリン酸基が含まれることが予想される。非電荷ハ ブテン〔即ち、化合物２および６　（第１図）〕は、電荷は無いが化合物ｌおよ び５と実質的に構造が一致することから、この仮説の正当性を検証するのに必要 である。 上記の結果は、抗体誘導にＮ−メチルピリジニウム塩、化合物１ａを使用した場 合有用であるアシル転移反応を触媒する“ベイト・アンド・スイッチ”法を示し ている。このハブテンを用いて得られるモノクコ−ナル抗体の３０％が触媒性で あった。この数は印象的であるが、これらのレセプターの一つが触媒反応におい てイオン化可能な基（ｐＫ、−６，２６±０．０５）の塩基型が関与していると いう知見のほうがより興味深い。さらに、抗体触媒反応の至適ｐＨはほぼ中性で あり、また中性ハブテン化合物２の使用は触媒性抗体を誘導する傾向を示さなか った。 ハブテン化合物７を後述するように合成した。この分子のもっとも顕著な性質は 、基質のアシル炭素を直接置換する四面体カチオン電荷にある。このハブテンは この分野の典型的なリン酸ハブテン代用物からの極端な逸脱と考えられるが、“ ベイト・アンド・スイッチ”法に関する多くの未回答の問題に適応される。二つ の関連事項、基質の切断を受ける結合との位置関係を含むカチオン電荷およびこ のアシル炭素の水酸基アイソステアによる置換の関連性は重要である。 ハブテン化合物７に対する２６個の抗体からは、バックグランド速度を越えた加 水分解速度を促進するものは見つからなかった。この結果は、シュルツ（Ｓｃｈ ｕｌｔｚ）研究グループによって設計された同様の抗原が脱離反応を起こす触媒 抗体を誘導する高い傾向（６６％）を示したことから非常に興味深い（ショカッ ト（Ｓｈｏｋａｔ）等、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）、３３ｇ＋２６９　（１９８ ９））。ここでの反応は全く異なるものであるが、シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ） のグループは、エステル分解反応に対する抗体を誘導するのにメチルピリジニウ ムハブテン化合物１を用いたときに見られるように、触媒反応にカルボキシレー トが関係するという確かな証拠を発見した。これらの結果は、ハブテン化合物ｌ ａおよび２に対して得られた抗体に関する知見と合わせて以下のことを示してい る。（１）ハブテン化合物１ａから誘導されたモノクローナルレセプターに見ら れる速度の増加は、単に触媒塩基として作用するカルボキシレートの存在による ものではない。（２）遷移状態を表すのに使用するハブテン中の官能性は重要で はない。（３）遷移状態の一つのカチオン電荷および少な（とも一つの中性的表 現の組み合わせが加水分解レセプター分子の誘導に必要である。 カチオン性ハブテン化合物１ａを用いて行われる場合と同様に、全体の過程を構 造的に類似するアニオン性ハブテンを用いて考えてみた。安息香酸ハブテン化合 物５ａは必要条件を満たしている。化合物５ａのバックボーンはハブテン１ａお よび２と相同的であるが、加水分解を企てているアシル部分に近いアニオン点電 荷を有している。カルボキシレート基の選択は、ハブテン分子内のこのタイプの 官能性が抗体結合ポケット内に正電荷のアミノ酸（即ち、リジンまたはアルギニ ン）を誘導する強い傾向を有するというプレスマン（Ｐｒｅｓｓｍａｎ）の知見 に基づいている〔（ａ）プレスマン（Ｐｒｅｓｓｍａｎ）等、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃ ｈｅｍ、Ｓｏｃ、、６８：２５０　（１９４６）；　（ｂ）プレスマン（Ｐｒｅ ｓｓｍａｎ）等、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、７５　：６８６　（１９５３ ）；　（ｃ）グロスバーブ（Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇ）等、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ 、　Ｓｏｃ、　、８２　：５４７０　（１９６０））。いずれのアミノ酸残基側 鎖も遷移状態の一般酸または静電的安定化による触媒反応を助けていると考えら れる。アルギニン残基を含む後者の過程も酵素触媒作用と考えられている〔（ａ ）ローダン（Ｒｉｃ）ｒｄａｎ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、（ワシントン、Ｄ、Ｃ， ）１９５：８８４　（１９７７）。 （ｂ）コツトン（Ｃｏｔｔｏｎ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 。 ＵＳＡ、７６：２５５１　（＋９７９）；　（Ｃ）スプリングス（Ｓｐｒｉｎｇ ｓ）等、Ｔｅｔ、Ｌｅｔｔ、、３２：３２２３　（１９７７））。 ヒドロキシエチル安息香酸化合物５ｂを合成した。この化合物にタンパク質キャ リヤーとのカップリングが容易なようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル を与えて化合物５ａとした。化合物５ａ−ＫＬＨ結合体による免疫化でモノクロ ーナル抗体１８種が生成し、その内３個は触媒性であり、またその活性は遊離ハ ブテン化合物５ｂにより阻害を受けた。化合物５ａより誘導される触媒性レセプ ターの数は化合物１ａの場合よりも多（ないが、化合物１ａおよび５ａの中性同 族体（化合物６）により誘導されるモノクローナル抗体はいずれも触媒性では無 いことは興味深い。抗原設計に含まれる電荷基の重要性がここでも見られる。 モノクローナルレセプター３０Ｃ６（化合物１ａ由来）のｐＨ−速度プロフィー ルは、解離基の塩基型が触媒活性に関係することを示した。また、化合物５ａか ら誘導されるモノクローナルレセプター２７Ａ６に見られるように、Ｋｅｅｌ” ’がバッファ濃度に依存しないことも重要である（第１図）。レセプター３００ ６の挙動とは反対に、レセプター２７八６に関するに一♂ｐνのｐＨ依存性の知 見もある（第３Ａ図）。この知見は“ベイト・アンド・スイッチ”理論の本質に 矛盾するように思われるが、結合部位のアミノ酸残基側鎖のｐＫ、値が検定した ｐＨ範囲の外にあり、またタンパク質−基質の静電的相互作用（静電的触媒作用 ）がこのレセプターの反応を促進する本質的特性であると考えられる〔ファース ト（Ｆｅｒｓｈｔ）、Ｅｎｚｙｍｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｅｃｈａ ｎｉｓｍ、フリーマン編、ニューヨーク（１９８５）　）。 ｐＨ効果によりレセプター２７Ａ６の加水分解反応におけるアミノ酸の関与を検 出する事は出来ないが、アルギニン修飾試薬フェニルグリオキサルによる３個全 ての触媒性抗体（２７Ａ６．５７Ｇ１２．７０Ｆ３）の特異的失活が観測された （タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４３：６１ ７１　（１９６８））。この活性の減少ＣＭ／結合）は結合部位における試薬と アミノ酸残基側鎖との反応によるものと説明しうる。即ち、その活性は７％ブテ ン化合物５ｂの存在により有意に減少する。 しかし、構造変化とそれに続く別の部位における試薬の反応も同じ結果を招くで あろう。従って、結合部位が変化し、もはや基質化合物３またはハブテン化合物 ５ｂを結合しなくなるタンパク質の構造の安定化に続いて結合部位以外のアルギ ニン残基が化学的に修飾されつる。この事はここでは適用されないように思われ る。 触媒的およびＥＬＩＳＡ検定およびフリートマン（Ｆｒｅｅｄｍａｎ）等、ｒｍ ｍｕｎｏｃｈｅｍ、　、９　：　Ｉ　６９　（１９７２）およびメイヤーズ（Ｍ ａｙｅｒＳ）等、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、、９　：　１６９　（１９７２）に示 されている先の結合研究は、グアニジウム結合部位のグリオキシル化が、負の電 荷のハブテンに対する抗体のみの触媒および／または結合活性を破壊するが、中 性ハブテン化合物６または正電荷のハブテン化合物７に対する抗体のものは破壊 しないことを示している。もし、グリコジル化を上述のメカニズムにより結合部 位から離れたグアニジウムを変化させることで行ったならば、化合物６または化 合物７のハブテンに対する抗体が同じような影響を受けるとは考えにくい。従っ て、ここで調べられた範囲を越えたｐＫ、値のグアニジウム側鎖を有するアルギ ニンが結合部位に存在し、観測される触媒活性に関連していると考えられる。 多くの触媒グループを生成しうる多重荷電の付加的速度効果が予想される。より 膨大な潜在的触媒抗体へのアプローチと共に〔ジャスドリー（Ｓｈａｓｔｒｙ） 等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８６　：５７２８　（１ ９８９）〕、この効果はよりすぐれた触媒の開発の可能性を開いた。 ■、リガンド調製 特筆しないかぎり、反応は窒素雰囲気下、火炎乾燥ガラス器具中で行った。試薬 および溶媒はオーブン乾燥した注射器および針を用いた。ジクロロメタンおよび アセトニトリルは水素化カルシウム存在下で連続的に蒸留した。テトラヒドロフ ラン（ＴＨＦ）は金属ナトリウム／ベンゾフェノフケチル存在下で蒸留した。 試薬は全てアルドリッチ　ケミカルから購入した。クロマトグラフィー用溶媒は 市販のものを購入しそのまま使用した。反応はＥ、メルク　シリカゲル６０Ｆガ ラスプレート（０，２５ｍｍ）を用いた分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ ）でモニターした。フラッシュクロマトグラフィーは、スチル（Ｓｔｉｌｌ）等 、Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、、４３：２９２３　（１９７８）の方法に従ってＥ、 メルク　シリカゲル６０　（２３０−４００メツシユ）ガラスプレートを用いて 行った。 融点測定はフィッシャー・ジョンズ（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｊｏｈｎｓ）Ｍ点測定器で 測定し、補正は行わなかった。全てのプロトンＮＭＲスペルトル（３００ＭＨｚ ）は、ブルカＡＭ−３００スペ／ｙ　トロン−９−をＭい、室温、ＣＤＣ１，、 ＣＤ３ＯＮ、またはＤＭＳＯ溶液中で測定した。化学シフト（α）は、内部標準 テトラメチルシラン（０，ＯＯｐｐｍ）に対するｐｐｍ値で表されている。元素 分析（Ｃ，Ｈ，Ｎ）は、ガルブレイスラボラトリ−（ノックスビル、ＴＮ）で行 っ・た。 実施例１：ｐ−ニトロフェニルアセトアルデヒドローニトロフェニルアセトアル デヒドは、ｐ−ニトロフェニルエチレンからレスブリッジ（Ｌｅｔｈｂｒｉｄｇ ｅ）等、Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、ＰｅｒｋｉｎＩ、３５　（１９７３）の方法で 合成した。ｐ−ニトロフェニルエチレンは、ｌ−ブロモ−２−（ｐ−二トロフェ ニル）エタン（アルドリッチ（メルクォーキー、ＷＩ）から市販されている。） からストラスバーブ（Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ）等、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ 、６９　：２１４２　（１９４７）の方法で合成した。 実施例２　化合物■ ｎ−ブチルリチウム（３，３３Ｘ　Ｉ　Ｏ−２ｍｏ　ｌ　ｅ）をエーテル／窒素 浴中−１０００Ｃに保持したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ　；　１００ｍ１）に 添加した。この混合物を攪拌しつつ１５分間かけて２−ブロモピリジン（３，６ ４Ｘ１０−”ｍ０１ｅ）を添加した。反応容器をアセトン／ＣＯ２浴に移すこと により一７８°Ｃまで昇温し、この混合物を１時間攪拌した。 実施例Ｉで得られＴＨＦ　（３０ｍ１）に溶解したｐ−ニトロフェニルアセトア ルデヒド（５グラム、３．０３ｘｌＣ１−！ｍｏｌｅ）をゆっくりこの混合物に 添加し、−７８℃で３時間攪拌した。 攪拌後、この混合物を塩化アンモニウムの飽和溶液（５００ｍ１）およびジエチ ルエーテルの中に注いだ。この混合物を２回ジエチルエーテルで抽出し、合わせ たエーテル層を硫酸ナトリウムで乾燥後、ＣＨ，ＣＩ、中１５％ＣＨ，ＣＮを用 いたカラムにかけた。生成物、化合物Ｉ（１−ヒドロキシ−１−（２−ビルジニ ル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）エタン）を６４８ｍｇ回収した（２．　７ｘ １０−”ｍｏ　１　ｅ、収率９％）。 ’ＨＮＭＲδ８．　５５　（ｄ、ＩＨ）　；８．　１０　（ｄ、２Ｈ）　；７． 　６５　（ｍ、ＩＨ）；７．３（ｄ、２Ｈ）；７．２（ｍ、２Ｈ）；５．０５（ ｄｄ、ＩＨ）：３．２０　（ｍ、２Ｈ）。 実施例３：化合物■ 乾燥メタノール（１２ｍｌ）を窒素を吹きつけて乾燥した２５ｍ１反応容器に入 れた。 実施例２で得た化合物Ｉ　（１００ｍｇ）をこのメタノールに溶かしオレンジ色 の溶液を作った。この溶液に窒素を吹き込み、１０％パラジウム／カーボン（Ｐ ｄ／Ｃ，７５ｍｇ）を添加した。反応容器の縁を少量のメタノールで洗浄した後 、溶液に窒素を吹き込み、ついで水素を吹き込んだ。この反応混合物を約１時間 攪拌した後、セライトで濾過した。このフィルターをジクロロメタン（ＣＨｔＣ ＩＪで４回洗浄し、ついでこのフィルターから薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ ）の原点物質が無くなるまでメタノールで３回洗浄した。この濾液を硫酸ナトリ ウムで乾燥し、溶媒を除去して８５．６ｍｇの黄色結晶物、化合物］Ｉ（１−ヒ ドロキシ−Ｉ−（２−ピリジニル）−２−（ｐ−アミノフェニル）エタン）を得 た（収率９７．６％）。 化合物■ 実施例４：化合物２ 実施例３からの化合物ＩＦ　（１５５ｍｇ、？、２４ＸＩＯ−’ｍｏｌｅ）を乾 燥ＣＨｔＣＩｔ　（１，５ｍ１）およびトリエチルアミン（（Ｅ　ｔｓＮ）　（ １，４ｓＸｌ　０”ｍｏ　ｌ　ｅ）　）と混合した。さらに、Ｎ−ヒドロキシス クシンイミドビルジオキシ）−Ｎ−Ｃ４−（２−ヒドロキシ−２−（２−ピリジ ニル）エチル）フェニルツー５−オクソーペンタアミド（化合物２）（収率２０ ％）を得た。 ’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄａ）　δ９．　８２　（ｓ、１Ｂ）　；８．　４８　 （ｄ、ＩＨ。 Ｈｚ）；２．８０　（ｓ、４Ｈ）；２．７６　（ｔ、２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）； ２．４２　（ｔ、２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；　１．９０　（ｍ、２Ｈ）。 Ｃｔ　ｔ　Ｈｔ　ｓ　Ｎ　ｓ○、に対する理論値・Ｃ，６２，１２；Ｈ，５，４ １，Ｎ、　９．８８％。 実験値：Ｃ，６２，１９，Ｈ，５，３７；Ｎ、９．９２％。 実施例５：化合物１ａ 実施例４の化合物２　（３０ｍｇ、？、０６ｘｌＯ″ｓｍｏｌｅ）をアセトン中 沃化メチル（７，０６ｘｌＯ”ｍｏｌｅ）と混合し、約１７時間還流した。この 反応混合物をクロロホルムで３回洗浄した後、熱い酢酸エチルで３回洗浄して２ ０ｍｇのハブテン性リガンド２−　［２−（５−（（２，５−ジオキソ−１−ピ リジニル）オキシ）−１，５−ジオキソペンチル］−４−アミノフェニル（−１ −ヒドロキシエチル）−１−メチル−ピリジニウムヨーダイト（化合物１ａ）を 得た。 ＩＨＮＭＲ（ＤＭＯ８−ｄａ）　δ９．８Ｂ　（ｓ、ＩＨ）　；８．　９２　（ ｄ、ＩＨ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）；８．５５　（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）：Ｂ、 ０８　（ｔ。 ＩＨ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；　８．００　（ｔ、ＩＨ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）；７．４ ｇ（ｄ、２Ｈ，Ｊ＝７．　９Ｈｚ）　；　７．　Ｉ　２　（ｄ、２Ｈ，Ｊ＝７． 　９Ｈｚ）　；　６゜３０　（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝５．　１Ｈｚ）　；　５．　３４ 　（ｄｄ、ＩＨ，Ｊ＝４．　０．　３゜５Ｈｚ）；４．３５　（ｓ、３Ｈ）；３ ．０２　（ｄｃｉ、２８．Ｊ＝１３．６，４゜０Ｈｚ）；２．８０　（ｓ、４Ｈ ）；２．７２　（ｔ、２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；２、．４５　（ｔ、２Ｈ，Ｊ＝ ８．２Ｈｚ）：　１．９０　（ｍ、２Ｈ）。 Ｃ２１Ｈｔ　ｓ　Ｎ　ｓ　Ｏ＃　Ｉに対する理論値：Ｃ，４８，６７；Ｈ，４， ５９，Ｎ、７゜化合物１ａ 実施例６・２−（（４−ニトロフェニル）メチル）−１，３−ジオキソラン（化 合物■） ｐ−＝ドロア　工：−ルアセトアルデヒド（５００ｍｇ、３．０ＸＩＯ−’ｍｏ ｌｅ）を約１．５ｍｇのＣＨＩＣＬに溶解した。この混合物にＣａ５Ｏｓ　（３ ８３ｍｇ）、続いてレキシン（Ｒｅｘｙｎ）ｌ　０１樹脂（プロトン型、フィッ シャ・サイエンティフィック、１２８ｍｇ）およびエチレンゲルコール（１３， ８ＸｌＯ−”ｍｏ］　ｅ）を添加した。この混合物を窒素雰囲気下で約４時間攪 拌した。使用する前に、このレキシン１０１およびＣａ５Ｏ，を乾燥機で約１２ ０℃に２０時間維持し、その後デシケータ−で冷却した。 サンプルを取り出し、ＣＨｔＣｌ、による薄層クロマトグラフィーで分析した。 さらに、レキシン１０１およびＣａ５Ｏ，を加え、この混合物を一晩攪拌した（ 約１６−１８時間）。この攪拌混合物にＣＨｔＣｌｔ　（１０ｍ１）を加えた。 このサンプルを薄層クロマトグラフィーで分離して原点に物質がないことが確認 された。 水（ｌ　０ｍ１）を添加して混合物を攪拌し、その有機層を分離して硫酸ナトリ ウムにより乾燥した後、ヘキサン：酢酸エチル（２：　１）を用いたフラッシュ クロマトグラフィーで精製して化合物■を４３５．８ｍｇ得た（収率７０％）。 １ＨＮＭＲδ８．　１０　（ｄ、２Ｈ）　；７．　４　（ｄ、２Ｈ）　；５．　 １０（ｔ、ＩＨ）；３．８　（ｓ、４Ｈ）；３．０　（ｄ、２Ｈ）。 二回目の合成では、塩化メチレン１０．Ｏｍｌ中ｐ−二トロフェニルアルデヒド （３，０ｇ、１８．２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液にエチレングリコール（５，４ｍ１ ．９７ｍｍｏｌ）を添加した。これに１．Ｏｇのレキシン１０１　（Ｈ）　（フ ィッシャーサイエンティフィック）カチオン交換樹脂および一晩オーブンで乾燥 した（１２０℃）３．０ｇの粉末硫酸カルシウムを添加した。この混合物を室温 で２４時間攪拌し、つづいて１００ｍ１の水に注ぎ塩化メチレン５０ｍ１部でミ ロ抽出した。有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥し、ヘキサン：酢酸エチル （２：１）を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製して２．２８ｇの生成 物を得た（理論値の６０％）。 ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１ｓ）　δ８．　１８　（ｄ、　Ｊ＝８．　６Ｈｚ、２Ｈ） 、７゜４２　（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、２Ｈ）、５．０８　（ｔ、Ｊ＝４．３Ｈｚ 、ＬＨ）。 ３、　８−４．　０　（ｍ、４Ｈ）　、３．　０６　（ｄ、　Ｊ＝４．　３Ｈｚ 、２Ｈ）。 ＣＩ−ＨＩ＋　Ｎ　Ｏ４に対する理論値：Ｃ，５７，４２，Ｈ，５，２６，Ｎ、 ６．７０゜実験値：Ｃ，５７，５１，Ｈ，５，１９，Ｎ、６．６５゜実施例７： ４−（１，３−ジオキソラン−２−イルメチル）−ベンゼンアミン（化合物■） 実施例６の化合物ｍ　（２３１ｍｇ）をメタノール（約３ｍ１）に溶かし、窒素 を吹き込んだ。Ｐｃｔ／Ｃ（１２０ｍｇ）をこの混合物に加え、反応容器の縁を エタノールで濯いだ（約２ｍ１）。この混合物に窒素、つづいて水素を吹き込ん だ。 この反応混合物を４５分間攪拌し、セライトで濾過した。このセライトをメタノ ールで数回濯ぎ、濾液と濯ぎ液をエバボレートして化合物■を１８４．４ｍｇ得 た（収率９０．６％）。 別の合成法では、化合物ｍ　（２，０ｇ、９．６ｍｍｏｌ）を２０ｍ１のメタノ ールに添加し、これに１０％パラジウム／活性炭（２００ｍｇ）を加えた後、こ のフラスコに水素風船を付け、室温で６時間激しく攪拌した。この反応混合物を セライトで濾過し、濃縮して１．６３ｇの生成物を得た（理論値の９５％）。こ の物質は、これ以上精製すること無しに以下の実施例で繰り返し使用した。 ＴＬＣＲ，＝０．　３．　１：ｌ　酢酸エチル：ヘキサン。 実施例８　：Ｎ−［４−（１，３−ジオキソラン−２−イルメチル）フェニル− Ｎ−（フェニルメチル）−ベンゼンメタンアミン（化合物■）実施例７の化合物 ＩＶ（１，９１ｇ、１．０７ＸｌＯ−’ｍｏｌｅ）をＣＨｚＣＩｔ（Ｉ　０ｍ１ ）およびＥｔ！Ｎ　（４，４５ｍ１，３．２ｘｌＯ−”ｍｏｌｅ）と混合攪拌し た。化合物の約半分が溶けた後に、この攪拌混合物にベンジルブロマイド（１， ０７ｘｌＯ−’ｍｏｌｅ）を滴下した。それからアミン全部が溶ける。約１時間 後反応を停止する。この溶液をＣＨ，ＣＩｔ：ＨＣＩ　（９・ｌ）を用いたカラ ムにかけ目的産物３．０４８ｍｇを回収した（化合物■）。 ’ＨＮＭＲδ７．　２５　（ｓ、ｌ０Ｈ）　；７．　０５　（ｄ、２Ｈ）　；６ ．　８５（ｄ、２Ｈ）；５．００（ｔ、ＩＨ）；４．６０（ｓ、４Ｈ）；３．９ （ｍ、４Ｈ）　；　２．　８　（ｄ、２Ｈ）。 上述の合成を繰り返して、ＣＨｔＣＬＩ　０ｍｌ中の化合物■（２ｇ、１１．２ ｍｍｏｌ）のサスペンションに攪拌しながらトリエチルアミン（４，５ｍｇ。 ３２ｍｍｏｌ）を添加した。ベンジルブロマイド（６，４ｍｇ、１０７ｍｍｏｌ ）の添加は、激しく攪拌しながら３０分間に渡って滴下し、その混合物を更に１ 時間攪拌した。この反応混合物をＣＨｔＣｌｔ（５０ｍｌ）で希釈し、０．５Ｍ ＨＣｌ　（２ｘ２５ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ硫酸ナトリウムで乾燥後 塩化メチレン・ヘキサン（４：　１）を用いたフラッシュクロマトグラフィーで 精製して目的物３．２ｇを得た（理論値の８０％）。 ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩり６７．　３５−７．　２３　（ｍ、ｌ０Ｈ）、７．　０ ６（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、６．６６　（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、２Ｈ）、５．５ ０（５，Ｊ＝４．３Ｈｚ、ＩＨ）、４．６２　（ｓ、４Ｈ）、３．８−４．００ 　（ｍ。 ４Ｈ）、２．８２　（ｄ、Ｊ＝４．３Ｈｚ、２Ｈ）。 Ｃｒ　４ＨｔｓＮＯｔに対する理論値：Ｃ，８０，２２，Ｈ，６，９６，Ｎ、３ ．　９０実験値　Ｃ，８０，３５，Ｈ，７，１１，Ｎ、３．　８６゜実施例９： ４−（ビス（フェニルメチル）アミノ−ベンゼンアセトアルデヒド（化合物■） 実施例８の化合物Ｖ（２ｇ、５．６Ｘ１０−’ｍｏｌｅ）をアセトン（６ｍｇ） に溶解し、窒素雰囲気下で攪拌した。４Ｍ　ＨＣＩ　（６ｍｇ）をこの混合物に 添加し僅かに黄色味を帯びてくるまで攪拌を続ける。この反応混合物をＣＨ２Ｃ ｌ。 を入れた分液ロートに移し、ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウ ムで乾燥し、減圧下で一晩乾燥した（１６−１８時間）。 このサンプルをＴＬＣ（ＣＨ，ＣＩｔ：ヘキサン＝４　：　Ｉ）で展開し、ニン ヒドリンで染色すると５個のスポットが出現した。この反応産物を５０ｍｍプレ 吸着シリカカラムで分離し、目的産物（化合物■）に対応する５００ｍｇのスポ ットを回収した（収率２９％）。 ’ＨＮＭＲＧδ９．　５　（ｔ、ＩＨ）　；７．　１　（ｓ、ｌ０Ｈ）　；６． 　８　（ｄ、２Ｈ）　；　４．　５　（ｓ、４Ｈ）　；　３．　４　（ｄ、２Ｈ ）。 別の調製法では、１５ｍ１アセトン中２．０ｇの化合物Ｖ　（５，６ｍｍｏｌ） 溶液に２ｍｇの４Ｍ　ＨＣＩを添加した。この溶液を室温で２４時間攪拌した。 これにシリカ（１０ｇ）を添加し乾燥するまで濃縮した。予め吸着させた粗反応 産物を含むフラッシュクロマトグラフィーを塩化メチレン：ヘキサン（４：　１ ）で展開し、目的産物０．７ｇを得た（理論値の４０％）。 ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１ｓ）　６９．　７　（ｔ、Ｊ＝２．　９Ｈｚ、ＩＨ）、７ ．　４０−７２０　（ｍ、ｌ０Ｈ）、７．００　（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、２Ｈ） 、６．７（ｄ、Ｊ＝８．　６Ｈｚ、２Ｈ）　、４．　６６　（ｓ、４Ｈ）　、３ ．　５４　（ｄ、Ｊ＝２゜９Ｈｚ、２Ｈ）。 ＣｚｔＨ−＋ＮＯに対する理論値：Ｃ，８３，８１，Ｈ，６，６７、Ｎ、４．． ４４゜実験値：Ｃ，８４，０６，Ｈ，６，５８，Ｎ、４．５０゜実施例１０：２ −（２−（４−アミノフェニル−１−ヒドロキシエチル〕−安息香酸（化合物■ ） ２−ブロモ安息香酸（８８ｍｇ、４．３３ｘｌＯ−’ｍｏｌｅ）をＴＨＦ　（２ ｍｇ）に溶かし、−７８℃まで冷却する。ｎ−ブチルリチウム（ｎ−ｂｕＬｉ） （８，３８Ｘ　１０−’ｍｏ　１　ｅ）を添加し、この混合物を２時間攪拌した 。 実施例９で得た化合物ＶＩ（９１ｍｇ、２．８９Ｘ１０−’ｍｏｌｅ）のＴＨＦ （１ｍｇ）溶液をこの混合物に加え、−７８℃で４時間攪拌した。この反応混合 物を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮＨ，ＣＩで２回洗浄した後ＩＭ　ＨＣＩで１回 洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥後、−晩（約１６−１８時間 ）かけてエバポレーションした。 生成物のＣＨｚＣｌｔ　ヘキサン（４：　１）を用いた薄層クロマトグラフィー では、二つのスポットが出現した。カラムから両スポットを回収した。目的産物 の化合物■が３２ｍｇ得られた（収率２５％）。 ’ＨＮＭＲニア、１−７．８（ｍ、１４Ｈ）；６．９（ｄ、２Ｈ）：６．６（ｄ 、２Ｈ）　；　５．　６　（ｔ、ＩＨ）　；　４．　６　（ｓ、４Ｈ）　；　３ ．　０　（ｍ、２Ｈ）別の調製法では、２−ブロモ安息香酸（９５７ｍｇ、４． ８ｍｏｌｅ）を２０ｍ１のテトラヒドロフランに溶解し、−７８℃に冷却したの ち（Ｃｏｔ／アセトン）、ｎ−ブチルリチウム（ｎ−ＢｕＬ　ｉ　；　５．　８ ｍＭ、１．　６Ｍ　（ヘキサン中）、９．２ｍｏ　ｌ　ｅ）を添加し１時間攪拌 した。カニュールを用いて一７８℃に冷却した１０ｍ１ＴＨＦ中のアルデヒド化 合物Ｖｌ（１，９ｇ、３．２ｍｏｌｅ）を添加し、−７８℃で４時間攪拌した。 この反応混合物を飽和塩化アンモニウム溶液に注ぎ、続いて酢酸エチル（２ｘ５ ０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ硫酸ナトリウムで乾燥した後、塩化メチレ ンを用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製して８６０ｍｇの精製物を得た （収率６２％）。 ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）　δ７．　９０−７．　８０　（ｍ、ＬＨ）、７．　 ６８−７．４０（ｍ、２Ｈ）、７．４０−７．０５（ｍ、ＩＩＨ）、７．０（ｄ 、Ｊ＝８、　６Ｈｚ、２Ｈ）　、６．　６４　（ｄ、Ｊ＝８．　６Ｈｚ、２Ｈ） 　、５．　６２　（ｔ。 Ｊ−７，１Ｈｚ、２Ｈ）、３．　６４　（ｂｒ　ｓ、２Ｈ）、３．　４−２．　 ８　（ｍ。 ２Ｈ）。 ＣｔｅＨｙｔＮＯｓに対する理論値　Ｃ，８０，３７、Ｈ，６，２４；Ｎ、３． 　２３実験値　Ｃ，８０，４４；Ｈ，６，２９；Ｎ、３．　１９゜実施例１１： ２−（２−［：ビス（フェニルメチル）アミノコフェニル）−１−ヒドロキシエ チル安息香酸（化合物５ｂ）実施例１０で得た化合物■（３２ｍｇ）をメタノー ル（２ｍｌ）に溶解した。 Ｐｄ／Ｃ（１０ｍｇ）を添加後この反応混合物に水素を吹き込み、ＣＨ，ＣＩ　 ２：酢酸エチル（Ｉ　二Ｉ）による薄層クロマトグラフィーで全ての原料が無く なるまで約１．５時間攪拌して１６．２ｍｇの化合物５ｂを得た（収率８６％） 。 再度合成するときには、カルボン酸塩、化合物■（３２０ｍｇ、７．ａｘｔｏ− ’ｍｏ　ｌ　ｅ）を２０ｍ１のメタノールに溶解した。続いて１０％パラジウム ／活性炭（３２ｍｇ）を添加し、フラスコに水素を吹き込んだ後９ｏ分間激しく 攪拌した。セライトによる濾過および濃縮により生成物１７９ｍｇを得た（収率 ９５％）。 この物質は精製すること無しに以下の実施例に使用した。ＴＬＣＲ，＝０．　６ ゜１＝１　塩化メチレン・酢酸エチル。 実施例１２：２−（２〜〔４−ＣＣ５−Ｃ（２，ｓ−ジオキソ−１−ピロリジニ ル）オキシ］−１．５−ジオキソペンチル〕アミノ〕フェニル〕−１−ヒドロキ シエチル安息香酸く化合物５ａ） 実施例１１で得た化合物５ｂ　（１６，２ｍｇ、６．３ｘｌＯ−５ｍｏｌｅ）を ＣＨ，Ｃｌ！　（７０μｍ）に溶解し、Ｅ　ｔｓＮ　（１，２６Ｘ　１０−’ｍ ｏ　１　ｅ）を攪拌しながら添加した。 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドイル　グルタロイル　クロライド（１９，１ｍｇ 、８．１９ｘ１．０−ｓｍｏｌｅ）を添加し、この混合物を窒素雰囲気下で攪拌 した。この混合物を直接分取用ＴＬＣに乗せ、ＣＨｔＣＬ：酢酸エチル（１：１ ．）で展開して目的のハブテン性リガンド化合物５ａを１４．３ｍｇ得た（収率 ５゜％）。 ’ＨＮＭＲ：δ９．　２　（ｓ、ＩＨ）　；７．　２−６．　８　（ｍ、６Ｈ） 　；６．　６（ｄ、２Ｈ）　；５．　２　（ｔ、ＩＨ）　；２．　６　（ｍ、２ Ｈ）　；２．１　（ｓ、４Ｈ）；　２．　Ｏ（ｔ、ＩＨ）　；　１．　８　（ｔ 、２Ｈ）　；　１．　４　（ｍ、２Ｈ）。 別の合成では、カルボン酸塩■（ｌｏＯｍｇ、３．９ｘｌＯ−’ｍｏｌｅ）を８ ００μｌの塩化メチレンおよびトリエチルアミン（１０９μｌ、７．８Ｘ１０− ’ｍｏ　１　ｅ）に溶解した。この混合物に（５−［（２，５−ジオキソ−１− ビロリジニノリオキシ〕−５−オキソ−ペンタノイルクロライド（１８８ｍｇ、 ５．ＩＸ　１０−’ｍｏ　Ｉ　ｅ）を添加し２０分間攪拌した。この粗反忘物を 塩化メチレン：酢酸エチル（１：　１）を用いたフラッシュクロマトグラフィー カラムで精製し、１５９ｍｇの目的産物を得た（収率９０％）。 ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩ、）　６９．　２４　（ｓ、ＩＨ）　、７．　３６−６、 　８　（ｍ。 ６Ｈ）、６．　４２　（ｄ、　Ｊ＝８．　６Ｈｚ、２Ｈ）、５．　２０　（ｔ、 　Ｊ＝７．　１Ｈｚ、ＩＨ）、２．　６６−２．３６（ｍ、２Ｈ）、２．　１５ （５，４Ｈ）、　２．　１−１．　９６　（ｍ、２Ｈ）、１．９６−１．７　（ ｍ、２Ｈ）、１．　５−１．　１６（ｍ、２Ｈ）。 Ｃ，、Ｈ，、Ｎ、Ｏ，に対する理論値ＩＣ，６１，５４；Ｈ，ｓ、１３．Ｎ。 実施例１３　化合物■ 実施例３の化合物ＩＩ　（２６２ｍｇ、１．ＭｘｌＯ−”ｍｏｌｅ）およびグル タル酸無水物（１４０ｍｇ）をＣＨｚＣｌｔ　（ｌ　０ｍ１）に溶解し、１６− １８時間攪拌した。さらにグルタル酸無水物を加え、ＥｔｓＮ（１，４７ｘｌＯ −ｓｍｏｌｅ）の水溶液に注いだ。この溶液を酢酸エチルで希釈し、その水層を 取り出してトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で抽出した。この水層を酢酸エチルで抽 出し、標準的な１０：９０から９０：１０のＣＨ，Ｃ１，：Ｈ，Ｏ勾配を用いた ＨＰＬＣで精製して２４０ｍｇの目的化合物（化合物■）を得た（収率６０％） 。 ’ＨＮＭＲ：６８．　３　（ｍ、３Ｈ）　；　７．　６．　（ｔ、２Ｈ）　；　 ６．　９　（ｄ、２Ｈ）；６．７（ｄ、２Ｈ）；５．１（ｔ、ＩＨ）；２．８（ ｍ、２Ｈ）；２．０（ｍ、４Ｈ）　；　１．　５　（ｍ、２Ｈ）。 化合物■ 実施例１４・化合物１ｂ 実施例１３で得た化合物ＩＸ（５８ｍｇ、１．７７ＸｌＯ−’ｍｏｌｅ）を沃化 メチル（８，８４ｘ　ｌ　Ｏ−４ｍｏ　ｌ　ｅ）と混合し、封入管中でアセトン （約５ｍ１）に溶かした後、８０°Ｃで約１６−１８時間加熱した。沈殿を濾過 した後、ＣＨＣｌ、で濯いで化合物１ｂを５６ｍｇ得た（収率６７％）。 ’ＨＮＭＲ：δ８．　５−７．　５　（ｍ、４Ｈ）　；　７．　２−６．　８　 （ｍ、４Ｈ）　；５、　２　（ｔ、ＩＨ）　；　３．　２　（ｍ、２Ｈ）　；　 ２．　２　（ｔ、２Ｈ）　；　１．　８　（ｔ。 ２Ｈ）；　１．２　（ｍ、２Ｈ）。 実施例Ｘ ｐ−−−トロフェノール（Ｉｇ、？、ｌ０ＸＩＯ−”ｍｏｌｅ）をＣＨ２ＣＨ２ Ｃ１ｔ（３に溶解し、Ｅ　ｔｓＮ　（７，ｌ　９　Ｘ　１０−ｓｍｏ　Ｉ　ｅ） を添加して黄色の溶液とした。 この溶液にベンジルクロライド（８，６３Ｘ　１０−ｓｍｏ　１　ｅ）を添加し 、いくらか沸騰させた。約５分後に黄色が消失し沈殿が生成した。この沈殿溶液 にＣＨｚＣｌｔ（２ｍｌ）を添加し、ついで酢酸エチル（３ｍｌ）を加えて沈殿 を溶解した。この溶液を１時間攪拌した。 この溶液に水を加え、約４５分間攪拌した後ＩＭＨｃ＋で１回、１０％ＮａＨＣ Ｏ，で２回、ＩＭ　ＨＣＩで２回および飽和ＮａＣ１で２回洗浄した。この有機 層を硫酸ナトリウムで乾燥後、エバポレーションし、減圧下で保存したのちにＣ ＨｌＣｌ、：ヘキサン（２：　１）を用いたカラムで分離した。ＴＬＣで小さい ほうのＲ，値を持つスポットを回収し、化合物Ｘ（ｐ−ニトロフェニルベンゾエ ート）１．２６１３ｇを得た（収率７２％）。 ’ＨＮＭＲ：δ８．　４−８．　０　（ｍ、４Ｈ）　；　７．　７−７、　３　 （ｍ、５Ｈ）。 実施例１６・化合物ＸＩ 実施例１５の化合物Ｘ　（５３０ｍｇ、２．１８ｘ１０−ｓｍｏ　ｌｅ）、１２ ＭＨＣ１（２００，ｃｚ　Ｉ）　、　Ｐｄ／Ｃ（２７５ｍｇ）および水素ガスを メタノール（約１５ｍ１）中で混合し、Ｃ１Ｈ，Ｃｌ！：メタノール（９：　ｌ ）の薄層クロ７トグラフイーで原料が無くなるまで窒素雰囲気下で２．５時間攪 拌した。この溶液を濾過し、乾燥して化合物ＸＩを５１８ｍｇ得た（収率９５％ ）。 実施例１７・化合物３ 実施例】６の化合物ＸＩ（５１８ｍｇ、２．０８Ｘ１０−３ｍｏｌｅ）をＣＨ。 Ｃ１ｚ　（１０ｍ１）およびグルタル酸無水物（２６０ｍｇ、２．２８ｘｌＯ− ３ｍ０１ｅ）と混合した。ＥｔｓＮ　（４，５８ｘｌ　Ｏ−３ｍｏｌｅ）をこの 溶液に溶かし、１６−１８時間攪拌した。 ＣＨｚＣ１２・酢酸エチルによる薄層クロマトグラフィーで原料を確認した。さ らに、グルタル酸無水物を０．２５ｍｇ添加し、原料がなくなるまで更に３時間 攪拌した。この溶液を酢酸エチルで希釈し、ＩＭ　ＨＣＩで２回洗浄した。有機 層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮後粗生成物６５５ｍｇを得た。この生成物を ＣＨ３ＣＮ：　ＣＨ，ＯＨ：Ｈ，Ｏ（４：　ｌ　：　４）を用いたＦＰＬＣで精 製し３９７ｍｇの化合物３を得た。 ’ＨＮＭＲ：δ９．　９　（ｓ、ＩＨ）　；８．　１　（ｄ、２Ｈ）　；７．　 ７−７、　４（ｍ、５Ｈ）　；　７．　ｌ　（ｄ、２Ｈ）　；　２．　３　（ｔ 、４Ｈ）　；　１．８　（ｍ、２Ｈ）。 実施例１８・化合物４ グルタル酸無水物（１，３４ｇ、１．１７ＸｌＯ−’ｍｏｌｅ）およびｐ−アミ ノフェノール（１，６ｇ、１．４７ｘｌＯ−’ｍｏｌｅ）をＣＨｔＣｌｔ　（５ ｍｌ）に溶解し、３５℃で１時間攪拌した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、 ＩＭＨＣＩで２回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒をエバレー トした。ＨＰＬＣで水層に生成物があることが確認され、これを凍結乾燥して粗 生成物２１４ｍｇを得た。 この粗生成物をＨｚＯ（１６ｍｌ）　、メタノール（５ｍｌ）およびＣＨ，ＣＮ （５ｍｌ）に溶かし、ＦＰＬＣで精製して化合物４を８９ｍｇ得た。 ’ＨＮＭＲ：δ９．　６　（ｓ、ＩＨ）　；　７．　３　（ｄ、２Ｈ）　：　６ ．　６　（ｄ、２Ｈ）；　２．　２　（ｍ、４Ｈ）　；　１．　７　（ｍ、２Ｈ ）。 化合物４ 実施例１９：２−［２−（４−アミノフェニル）−１−ヒドロキシエチル〕−１ −メチルベンゼン（化合物ＸＵ） ｎ−ＢｕＬｉ　（２，８ｍｌ、　ヘキサン中２．６Ｍ、４．４ｍｍｏｌｅ）を３ ０ｍ１のＴＨＦに添加し、−７８℃に冷却した（Ｃｏ！／アセトン）。この溶液 に２−ブロモトルエン（０，５７３ｍ１，４．’　８ｍｍｏｌｅ）を加え、３０ 分間攪拌した。次に１５ｍ１のＴＨＥに溶解し、−７８℃に冷却したアルデヒド 化合物ＶＩ（１，９ｇ、３．２ｍｍｏｌｅ）を加え２時間攪拌した。この反応混 合物を塩化アンモニウム飽和溶液に注ぎ、塩化メチレンで抽出した（２Ｘ２５ｍ ｌ）。有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥し、ヘキサン：塩化メチレン：酢 酸エチル（６：１：１．５）を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製して ９００ｍｇの化合物Ｘ■を得た（収率６９％）。 ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩり：６７．　９−７．　８　（ｍ、ＩＨ）　、７．　６８ −７．４０（ｍ、２Ｈ）、７．　４０−７．　１５　（ｍ、１２Ｈ）、７．　０ ５　（ｄ、　Ｊ＝８．’６Ｈｚ、２Ｈ）、６．　７０　（ｄ、Ｊ＝８．　６Ｈｚ 、２Ｈ）　、５．　３　（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、ＩＨ）、４．６２（ｓ、４Ｈ） 、３．０−２．７（ｍ、２Ｈ）、２．３（ｓ、３Ｈ）。 Ｃｔ　＊　Ｈｔ　＊　Ｎ　Ｏに対する理論値：Ｃ，８５，５０；Ｈ，７，１３； Ｎ、３．４４゜゛実験値・Ｃ，８５，５８；Ｈ，７，０８，Ｎ、３．４１゜実施 例２０　：２−　Ｃ２−Ｃ４−（ビス（フェニルメチル）アミノ〕フェニル〕− １−ヒドロキシエチル）−１−メチルベンゼン（化合物ＸＩ［［）５０ｍｌ酢酸 エチル中の化合物ＸＩＩ　（９００ｍｇ、２．２ｍｍｏｌｅ）溶液に１０％パラ ジウム／活性炭（１００ｍｇ）を添加した。反応容器は、ＰＡＲＲ水素化装置を 用い５０ｐｓｉの水素で加圧した。反応は４時間後に完了し、反応物をセライト で濾過したのち減圧下で濃縮して化合物Ｘ■を４７６ｍｇ得た（収率９５％）。 この物質は、これ以上精製すること無しに次の実施例で使用した。ＴＬＣＲ，＝ ０．０５，４・１　塩化メチレン：ヘキサン。 実施例２１　：２−　Ｃ２−（４−カルボキシ−１−オキソブチル）アミノ〕フ ェニル］−１−ヒドロキシエチル〕−１−メチルベンゼンぐ化合物６）トリエチ ルアミン（３５１μｌ、２．５ｍｍｏｌｅ）を含む塩化メチレン１０ｍ１中の化 合物Ｖ（４７６ｍｇ、２．１ｍｍｏｌｅ）溶液に（５（（２，５−ジオキソ−１ −ピロリジニル）オキシル〕　５−オキソ−ペンタノイルクロライド（５７２ｍ ｇ、２．３ｒｎｍｏｌｅ）を加えた。この溶液を３０分間攪拌し、酢酸エチル（ ２，５ｍ１）で希釈した後、ＩＭ　ＨＣＩ　（２ｘ１５ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナ トリウムで乾燥した。この粗生成物を塩化メチレン：酢酸エチル（１：　１）を 用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製して７８０ｍｇの化合物６を得た（ 収率８５％）。 ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１，）δ９．　２４　（ｓ、ＩＨ）、７．　４−６．　８５ 　（ｍ、６Ｈ）、６．　４５　（ｄ、Ｊ＝８．　６Ｈｚ、２Ｈ）　、５．　２０ 　（ｔ、　Ｊ＝７１．ＩＨｚ。 ＩＨ）、２．６５−２．４（ｍ、２Ｈ）、２．３（ｓ、３Ｈ）、２．１５（ｓ。 ４Ｈ）、２．１−１．９６　（ｍ、２Ｈ）、１．９６−１．７２　（ｍ、２Ｈ） 。 １、　５−１．　２０　（ｍ、２Ｈ）。 Ｃｔ　４Ｈ□Ｎ−０６に対する理論値：Ｃ，６５，７５，Ｈ，５，９４；Ｎ、６ ．　４９゜ 実験値：Ｃ，６５，７９，Ｈ，５，９１；Ｎ、ａ、４１゜実施例２２：５−（（ ２，５−ジオキソ−１−ピロリジニノリオキシ〕−Ｎ−〔４−（ヒドロキシメチ ル）フェニルツー５−オキソ−ペンタンアミド（化合物ＸＩＶ） ｌθｍｌ塩化メチレン中のトリエチルアミン（１，１３ｍ１，８．２ｍｍｏｌｅ ）溶液にｐ−アミノベンジルアルコール（１，９ｇ、８．１ｍｍｏｌｅ）を溶か した。この溶液に（５−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ〕− ５−ペンタノイルクロライド（２，２１ｇ、８．９ｍｍ１ｏｌｅ）を添加し１時 間攪拌した。この反応混合物を塩化メチレン（２５ｍｌ）で希釈し、２Ｍ　ＨＣ ｌで抽出した（２Ｘ２６ｍｌ）。この有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ＣＨｔ Ｃｌ、：メタノール（９：　ｌ）を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製 して２．４３ｇの化合物ＸＩＶを得た（収率９０％）。 ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣｔｓ）δ８．　Ｑ　（ｂｒ　ｘ、２Ｈ）、７．　５２　（ｄ 、Ｊ＝８．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．３０　（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、２Ｈ）、４．６ ２　（ｓ。 ２Ｈ）、３．４５（ｓ、２Ｈ）、２．９（ｓ、４Ｈ）、２．７５（ｔ、Ｊ＝１０ Ｈｚ、２Ｈ）、２．５　（ｔ、Ｊ＝１０Ｈｚ、２Ｈ）、２．３８−２．１０　（ ｍ。 ２Ｈ）。 Ｃ，、Ｈ，、Ｎ、Ｏ＠に対する理論値：Ｃ，，５７，４９、Ｈ，５，３９、Ｎ、 ８．　３８゜ 実験値・Ｃ，５７，４２，Ｈ，５，４４；Ｎ、ｓ、２９゜実施例２３・Ｎ〜〔４ −（ブロモメチル）フェニル］　−５−（（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニ ル）オキシル−５−オキソ−ペンタンアミド（化合物ＸＶ）２０ｍｌのジメチル ホルムアミド中の化合物ＸＩＶ　（２，９ｇ、６ｍｍｏｌｅ）溶液にジブロモト リフェニルホスホラン（３，０４ｇ、７．２ｍｍｏｌｅ）を添加した。この反応 混合物を５０℃に温め、４時間攪拌した。ついで、酢酸エチル１リツトルで希釈 し、ブライン（４ｘ２００ｍｌ）で抽出して硫酸ナトリウムで乾燥した。酢酸エ チル：ＣＨｔＣ］ｚ　（１：　ｌ）を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精 製してＬ　２０ｇの化合物ＸＶを得た（収率５０％）。 ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１，）６８．　０　（ｂｒ　ｓ、ＩＨ）、７．　５０　（ｄ 、　Ｊ＝８、　６Ｈｚ、２Ｈ）　、７．　３９　（ｄ、Ｊ＝８．　６Ｈｚ、２Ｈ ）　、４．　５　（ｓ、２Ｈ）、２．９　（ｓ、４Ｈ）、２．７５　（ｔ、Ｊ＝ ＩＯＨｚ、２Ｈ）、２゜５（ｔ。 Ｊ＝２０Ｈｚ、２Ｈ）、２．３８−２．Ｉ　Ｑ　（ｍ、２Ｈ）。 Ｃ，、Ｈ，フＮｘＯｓに対する理論値：Ｃ，５Ｂ、７２；Ｈ，ｔ、２（１；Ｎ、 ８．　５６゜ 実験値：Ｃ，５８，６６、Ｈ，５，２４，Ｎ、８．５０゜実施例２４　：４−　 ［５−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシル］−１，５−ジオキ ソペンチル）アミノ）ｒＮ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−プロミドベンゼンメタンアミラ ム−ブロマイド（化合物７）ブロマイド化合物ＸＶ　（１，９ｇ、２．５ｍｍｏ ｌｅ）を６０ｍ１ＣＨｔＣＩｔに溶解し、ジメチルアニリン（１，６ｍｌ、１２ ．５ｍｍｏｌｅ）を添加した。 この溶液を沈殿で生じるまで３０分間攪拌し、さらに１時間攪拌した。このサス ペンションを分液ロートに移し、蒸留水で抽出した（３Ｘ３０ｍｌ）。洗浄液を 集めて凍結乾燥し、１．１７ｇの化合物７を得た（収率９ｏ％）。 ’ＨＮＭＲ（Ｄ、０）６７、　６０　（ｓ、５Ｈ）、７．　３８　（ｄ、Ｊ＝８ ．　６Ｈ２，２Ｈ）、７．９　（ｄ、Ｊ−８，６Ｈｚ、２Ｈ）、４．９５　（ｓ 、２Ｈ）。 ３．６２　（ｓ、６Ｈ）、２．９　（ｓ、４Ｈ）、２．７５　（ｔ、Ｊ＝１０Ｈ ｚ、２Ｈ）、２．　５　（ｔ、１０Ｈｚ、２Ｈ）、２．　３８−２．　１０　（ ｍ、２Ｈ）。 ＣｔａＨｔｓＮｓＯｓＢｒに対する理論値：Ｃ，ｓｓ、６０．Ｈ，５，４１，Ｎ 。 実施例２５：スクシンイミジルアジポイルクロライドおよびグルタロイルクロラ イド（結合試薬）の合成 チオニルクロライド（１５ｍ１）中のアジピン酸モノメチルエステル（５，４ｇ 、３３．３ｍｍｏｌｅ）溶液を４０’Ｃに２時間加熱する。この混合物を濃縮し 、減圧下で蒸留して（沸点：　２０ｍｍＨｇで１１９℃）酸クロライドメチルエ ステルを３．５８ｇ得た（収率６ｏ％）。これを２０ｍ１のジクロロメタンに溶 解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２，７５ｇ、２４．０ｍｍｏｌｅ）一つ ぃでトリエチルアミン（４，２ｍｌ、３０ｒｎｍｏｌｅ）を添加した。この混合 物を１０分間攪拌し、酢酸エチルで希釈してから０．５Ｍ　ＨＣＩおよびブライ ンで洗浄した。この溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後濃縮して無色油状の メチルスクシンイミジルアジペート４．５ｇを得た（収率８７．５％）。 １００　ＭＨｚ　（７）ＣＤ　Ｃｌ　ｓ中ノプロトンＮＭＲ（内部標準ＴＭＳ） ：６３．７３（ｓ、　３Ｈ）、　２．９０（ｓ、　４Ｈ）、　２．７０（ｍ、　 ２Ｈ）、　２．３７（ｍ。 ２Ｈ）　、１．　７９　（ｍ、４Ｈ）。 １０ｍ１アセトニトリル中メチルスクシンイミジルアジペート（４，５ｇ。 １７、　５ｍｍｏ　ｌ　ｅ）　、クロロトリメチルシラン（目、１ｍｌ、８７． ５ｍｍｏ　ｌ　ｅ）および沃化ナトリウム（１３，１ｇ、８７．５ｍｍｏｌｅ） を１２時間還流した。この混合物を室温に冷却した後、酢酸エチルで希釈した。 この反応混合物を有機層が無色になるまで５％重炭酸ナトリウム水溶液で繰り返 し洗浄した。 さらに、ブラインで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過してから濃縮す ることにより白色固体のアジピン酸モノスクシンイミジルエステル３．２ｇを得 た（収率７１％）。 １００ＭＨｚのＣＤＣｌ５中でのプロトンＮＭＲ（内部標準ＴＭＳ）：６３，９ ゜（ｓ、４Ｈ）、２．　７０＜ｍ、２Ｈ）、２．　４　（ｍ、２Ｈ）、１．　８ ０Ｃｍ、４Ｈ）。 アジピン酸スクシンイミジルエステル（１，ＯＯｇ、３．８０ｍｍｏｌｅ）およ びチオニルクロライド（５ｍｌ）の混合物を４（１℃で３時間加熱し、室温に冷 却してから減圧下で濃縮した。残音を乾燥ヘキサンと共に数回攪拌し、油状物質 を分取後、減圧下で乾燥してスクシンイミジノげシボイルクロライド０．９７ｇ を得た（収率９０％）。これを乾燥テトラハイドロフランに溶解し、５モル濃度 溶液を調製してタンパク質キャリヤーへのカップリングに適した化合物の合成に 使用した。 １００ＭＨ２（７）ＣＤＣＩｓ中テノプロト：／ＮＭＲ（内部標準ＴＭＳ）　： ３．００（ｍ、　２Ｈ）、　２．９０（ｓ、　４Ｈ）、　２．７０（ｍ、　２Ｈ ）、　１．８０（ｍ。 ４Ｈ）。 同様にスクシンイミジルグルタロイルクロライド（５−（（２，５−ジオキソ− １−ピロリジニル）オキシ〕−５−オキソ−ペンタノイルクロライド〕を合成し 、後に述べるように使用した。 ■、結合体および接種物の調製 ハブテン性リガンド分子とキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）等のタンパク質キャリヤーとの結合体は、例 えば、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス テル）等の結合剤によるキャリヤーの活性化、およびハブテン性リガンドのチオ ール基へのカップリングにより調製しうる。例えば、リュー（Ｌ　ｉ　ｕ）等、 Ｂｉ。 ｃｈｅｍ、、８０，６９０　（１９７９）参照。また、当分野でよく知られテイ ルように、中間の連結基によって化合物をキャリヤーに結合することが有利なこ とがよくある。 有用なキャリヤーはよく知られており、一般にはタンパク質そのものである。 代表的キャリヤーには、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）　、エデ スチン、チログロブリン、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン等（各 々ＢＳＡまたはＨ３Ａ）のアルブミン、ヒツジ赤血球などの赤血球、破傷風トキ ソイド、コレラトキソイドおよびポリ　（Ｄ−リジン＝Ｄ−グルタミン酸）等の ポリアミノ酸等がある。 キャリヤーの選択は、抗原の決定部分よりも抗原の最終的使用目的に依存し、本 発明とは特に関連しない基準に基づく。例えば、結合体を実験動物に使用する場 合、特定の動物内で不都合な反応を起こさないキャリヤーを選択するべきである 。 キャリヤー−ハブテン結合体を生理食塩水、ＰＢＳまたは滅菌水などの生理学的 に許容可能な希釈剤の水性組成物に溶解または分散し、接種物を調製する。完全 または不完全フロインドアジュバントまたはミョウバン等のアジュバントもこの 接種物に含ませつる。良く知られているように、この接種物は、抗体を誘導する のに充分な量を注射によって動物に導入し、抗体を生成させるというように使用 される。 代表的免疫原性結合体は、先に示したようにスペーシング要素としてハブテン性 リガンドのベンジル基（反応体リガンドエステルのフェノール部分に相当する） 上に直鎖の炭素原子を導入する方法を適用してハブテン性リガンドから合成され る。別の代表的免疫原性結合体は、反応体リガンドの酸部分に対応するハブテン 性リガンドの部分にスペーシング／連結要素として直鎖状の炭素原子を導入する 方法を適用することによりハブテン性リガンドから合成しつる。 アノベートまたはグルタレート付加物の柔軟な炭素鎖は、キャリヤータンパク質 への共有結合による構造的束縛に基づく免疫反応性に対するいがなるバイアスも 減少すると結論した。また、この目的のために合成された二官能性試薬は、キャ リヤーのリジン残基とアミド結合を形成するための活性化したカルボキシル基を 提供する。ここで本実験で使用する特定のカップリング法をより詳細に説明する 。ハブテン性リガンドは、その構造のフェノール部分のアミン基を介してシーホ ールリンペットヘモシアニンに結合した。 本発明によれば中間連結剤は、先に述べたように合成したスクシンイミジルアジ ポイルまたはグルタロイルクロライドであることが望ましい。抗原性（免疫原性 ）結合体は以下のように合成する。 代表的操作では、２５０μｌのジメチルホルムアミド中ハブテンとスクシンイミ ジルアジポイルクロライドまたはスクシンイミジルグルタロイルクロライドの反 応生成物２．５ｍｇを攪拌しながらゆっくりと７５０μｌの０．０１Ｍ　リン酸 ナトリウムバッファー（ｐＨ７，２）中２ｍｇのＫＬＨ溶液に加えた。温度は４ ℃で、混合物を約１時間攪拌してハプテン結合ＫＬＨ結合体を形成させた。この 結合体反応生成物は、通常の手段で精製した。 ■、モノクローナルレセプターの調製 光のＫＬＨ結合体（約１００μｇ）を使用し、完全フロインドアジュバントを用 いた腹腔内注射（ＩＰ）で４匹の週令８才のマウス（１２９ＧＩＸ＋株）を免疫 化した。さらに、２週間後ミョウバン中の５０Ｍｇの結合体をＩＰ注射した。 １力月後、ハブテンに対する抗体値がもっとも高いマウスに５０ＭｇのＫＬＨ− 結合体を静脈注射した。３日後、ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体調製 のためにその肺臓を取り出した。 モノクローナル抗体は、ナイマン（Ｎｉｍａｎ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７：４５２４　（１９８０）およびナイマン等、” モノクローナル抗体およびＴ−細胞産物”カッツ（Ｋａｔｚ）　、Ｄ、Ｈ，編、 ２３−５１（ＣＲＣプレス、ボカレートン、ＦＬ　１９８２）に報告されている 方法で調製した。簡単に言うと、牌細胞（ＩＸＩＯ”）を２．０ＸＩＯ’個の５ ｐ２１０ミエローマ細胞と融合した。１％ニュートリドーマおよび２％ＢＳＡを 含む１５０μｍのＨＡＴ−ＤＭＥＭ培地を入れた４５枚の９６穴プレートにブレ ーティングした。本発明のハイブリドーマを生成するのに使用したリンパ球には 、霊長類、醤歯動物（例えば、マウスまたはラット）、ウサギ、モルモット、ウ シ、イヌ、ヒツジ、ブタ等の哺乳類由来のものを使用しつる。一般には、その宿 主を免疫原、この場合はハブテン性リガンドの注射、つづいて二次免疫注射で感 作し、その肺臓を摘出する。 ミエローマ細胞系列は、リンパ球と同系列であることが好ましい。従って、一般 にマウス−マウスハイブリッド（シャルマン（Ｓｈｕｌｍａｎ）等、Ｎａｔｕｒ ｅ。 ２７６．２６９　（１９７８））またはラットーラットノゾブリッド（ガルフレ （Ｇａｌｆｒｅ）等、Ｎａｔｕｒｅ、２７７．１３１　（１９７９））等の融合 ハイブリッドが使用される。しかし、ハイブリドーマの生成にラット−マウスハ イブリッドが成功した例もある（ゴーディング（Ｇｏｄｉ　ｎｇ）、“細胞融合 によるモノクローナル抗体の生成”、　“道具としての抗体”マカロニス（Ｍａ ｒｃｈａｌｏｎｉｓ）等線、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ版、ｐ、２７３ （１９８２）　）。本発明に使用するのに適当なミエローマ系列には、ＭＰＣ− ＩＩ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６７）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６ｓ３　（ＡＴＣＣ ＣＲＬ　１５８（１）、Ｓｐ２／○−Ａｇ１４　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８１） 。 Ｐ３Ｘ８３Ａｇ８Ｕ、ｌ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５９７）、Ｙ３−Ａｇ１．２゜ ３、（フランス、パリ、コレクション・ナショナル・デ・カルチャー・デ・マイ クロオーガニズム、番号１−０７８）およびＰ３Ｘ６３Ａｇ８　（ＡＴＣＣＴＩ Ｂ　９）等が含まれる。本発明には、非分泌性マウスミエローマ系列５ｐ２１０ またはＳ　ｐ　２１０−Ａ　ｇ　ｌ　４が好ましい。 最終的に生成されたハイブリドーマ細胞は、当分野でよく知られているこれらの 細胞に関する通常のインビトロ組織培養技術にしたがって培養しうる。さらに、 ハイブリドーマ細胞は生成した腹水液から得られるモノクローナルレセプターを 用いる同様に良く知られた方法を用いて動物中で培養することがより好ましい。 腹水液の生成に使用する動物には、カリフォルニア、う・ホラ、スクリプス・ク リニック・アンド・リサーチ・ファンデーションのマウスコロニーで飼育された Ｂａ１ｂ／ｃ　ｘ　１２９ＧＩＸ”マウスがあるが、ハイブリドーマの調製にマ ウス以外の動物を使用するときには、腹水液の生産にマウスまたはその他の動物 が使用される。 特に、代表的モノクローナルレセプターはコラ−等、Ｎａｔｕｒｅ、２５６゜４ ９５（１９７５）の標準的ハイブリドーマ技術で生成した。特に、１２９ＧＩＸ ゛マウスは、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ７，４）および完全フロインドアジ ュバントのｌ−１混合物３００μｍ中結合体（例えば、ＫＬＨに結合した化合物 １ａ、２または５ａ）ｔｏｏμｇを含む接種物を用いた腹腔内注射で免疫化した 。２週間後、このマウスにＰＢＳ　（１）Ｈ７，４）および１０ｍｇ／ｍｌミョ ウバンの１．ｌ混合物中先の結合体５０μｇを含む溶液を同様の方法で注射した 。 さらに８週間後、ＰＢＳ　（Ｉ）Ｈ７，４）２００μ■中５０μｇの結合体を含 む溶液を静脈注射した。４日後、このマウスから肺臓を取り出し、その牌細胞を ミエローマ細胞と融合した。 この牌細胞を集め、単一細胞サスペンジョンとした。核のある牌細胞（ｌ、４Ｘ ＩＯ”）を細胞融合促進剤（ポリエチレングリコール２０００）の存在下、非分 泌性ミエローマ細胞Ｓｐ　２１０　（３Ｘ　Ｉ　Ｏ’）ど融合した。９６穴プレ ートへのハイブリドーマ細胞のブレーティング、および未融合のミエローマ細胞 は増殖できない、４５００ｍｇ／ｌグルコース（１０％）、１０％ウシ胎児血清 （Ｆｅ２）、ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むダルベツコ 修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）（即ち、ＨＡＴ培地）中での増殖により、特定の モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを選択した。 ２−３週間後、各ウェルの細胞クローン上の上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法で抗原 としての化合物１ａ、２または５ａに対する抗体の存在を確かめた。ポジティブ のウェルを限界希釈２回でクローン化した。２回のクローニング後化合物１ａま たは２特異的抗体を生産しつづけるクローンを増殖させて大量の上溝液を得た。 化合物１ａと免疫反応する２３個のモノクローナルレセプターの内の７個（約３ ０％）は、反応体リガンドエステル化合物３を触媒的に分解した。これらの触媒 作用は、いずれも化合物１ｂ等の適当なハブテン性リガンドによって阻害しうる 。比較的高い割合の誘導モノクローナルレセプターがエステル分解反応を触媒し えた。ハブテン化合物３によって誘導された２１個の抗体はいずれも反応体リガ ンド化合物３に対する触媒活性は示さなかった。同様に、最初に化合物５ａ。 ６または７と結合する抗体を生産したコロニーを２度サブクローン化した。その 後も化合物５ａでは１８個、化合物６では２２個、および化合物７では２６個が 活性を保持していた。これらの抗体はＥｇＧクラスであった。 塩を用いてブリスタン感作Ｂａ１ｂ／ｃ　ｘ　１２９ＧＩＸ”マウス中で生成し た腹水液からモノクローナル触媒分子を沈殿させ、アニオン交換クロマトグラフ ィー（ＤＥＡＥ）　、ついでアフィニティークロマトグラフィー（プロティンＧ ）で精製した後、５０ｍＭリン酸塩（１００ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ７，５）に対 して透析した。抗体はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動 で均一であると判定された。 ３０Ｃ６と命名されたハイブリドーマの一つをさらに研究し、アメリカン・タイ プ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークローンドライブ 、ロックビル、ＭＤ）に寄託した。このハイブリドーマは１９９０年１月２４日 寄託し、受理番号ＨＢ１０３４１を得た。その他の２個のハイブリドーマ、２７ Ａ６および５７Ｇ１１も同様に１９９０年１２月１１田こＡＴＣＣに寄託し、各 々受理番号ＨＢ　１０６２１およびＨＢ　１０６２２を得た。 この寄託は、寄託期間が寄託日から３０年間、または寄託機関における寄託に対 する最後の請求から５年間、またはこの出願から成立する米国特許の有効期間の 内のいずれか長い期間である、というブタペスト条約に従う。寄託機関のハイブ リドーマが生育不能になった場合はそのハイブリドーマは補充される。 また、本発明のモノクローナルレセプターは、マウスなどの哺乳動物の腹腔内に 注射などで導入することにより生産しつる。既に述べたように、米国特許第４． ３６１，５４９号（参考としてここに導入する）に見られるように同系列または 単量系列の哺乳類を用いることが望ましい。このハイブリドーマの導入は、適当 な増殖期間、例えば１−２週間の後に抗体産生ハイブリドーマの生成を誘導し、 宿主の血液および末梢浸出液（腹水）から回収しうる高濃度のレセプターを提供 する。また、宿主マウスはその血液または腹水中に通常のレセプターを有してい るが、一般に通常のレセプターの濃度はこのモノクローナルレセプター濃度のわ ずか約５パーセントである。 ハイブリドーマの上清中に存在するモノクローナルレセプターは、精製すること なしに使用しうるし、またこのレセプターはセファロース６Ｂまたは４Ｂ（ファ ルマシア、ビス力タウエイ、ＮＪ）等のイムノソーバントに結合したＡＤ１６９ 感染細胞を用いたアフィニティークロマトグラフィーおよび約ｐＨ２，５の塩酸 グリシン等の酸性バッファによるイムノソーバントからの溶出等の標準的技術を 使用してマウスの血清または腹水から回収しつる。 本実験では一般にＩｇＧフラクションは４５％飽和硫酸アンモニウムによる沈殿 化および先に述べたような塩化ナトリウムによる溶出を用いるＤＥＡＥ−セファ セルでのクロマトグラフィーによってマウス腹水から回収した。１００ｍＭの塩 で溶出するフラクションを透析した後、濃縮した。 ■、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）リガンドの結合および化学 修飾の効果は、タイター範囲内の固定濃度の抗体と種々の濃度の試薬またはリガ ンドを用いたＥＬＩＳＡで検定した。ハブテンに対する試薬の比が１０００：１ 以下の時にそのタイターが５０％減少した場合に阻害が起きたと定義した。 検定は、平底ポリビニルマイクロプレート（ダイナチク、アレキサンドリア、Ｖ Ａ）で行った。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中抗原としてＢＳＡに結合した化合物ｌ ａを含む溶液（各ウェル当たり５０μＩ）でウェルをコーティングした。リガン ドはミリリットル当たり１Ｈｇの濃度でコーティングした。それからプレートを ドライオーブン中３７℃で一晩インキユベートした。乾燥したプレートは使用す るまで４°Ｃで保存した。ＥＬＩＳＡ検定の前に乾燥したプレートをそれぞれ０ 、　１％ポリオキシアルキレン（２０）ソルビタンモノラウレート（’ｌ”ｗｅ ｅｎ２０）および０．０２％シメローサル（エチルマーキュリチオサルチル酸ナ トリウム（シグマ、セントルイス、ＭＯ）を含むｌ　ＯｍＭＰＢＳ　（ｐＨ７， ４）で２分間２回洗浄し再水和した。 非特異的結合を減らすために、ハイブリドーマ上清を希釈剤として０．１％ＢＳ Ａを含む洗浄バッファでｌ：２に希釈した。希釈したハイブリドーマ上清５０μ ｌを各ウェルに入れ、シャイロンニーカー上４℃で１時間インキュベートして、 モノクローナル抗体含有上清と、結合した化合物４とを接触させた。各２分間２ 回の洗浄後、ｌ：１０００希釈のパーオキシダーゼラベルしたヤギ抗マウスＩｇ Ｇ＋ＩｇＭ　（タボ、バーリンガム、ＣＡ）を各ウェルに加え、この反応混合物 を４℃で１時間インキュベートしてラベル化抗体を、結合モノクローナル抗体に 結合させた。 結合したパーオキシダーゼ活性を検定するのに使用する基質は、使用直前に調製 した。これは０．１２％Ｈ１０，を含む８０ｍＭクエン酸−リン酸バッファ（ｐ Ｈ６，０）中４００μｇ／ｍｌの０−フエニレレンジアミン（シグマ、セントル イス、ＭＯ）である。２回の最終的洗浄の後、基質溶液５０μｌを各ウェルに加 え、暗所で１５分間発色させた。各ウェルに４Ｍ硫酸２５μｌを添加して発色を 停止し、マルチスカン（Ｍｕｌｔ、１ｓｋａｎ）ＥＬＩＳＡプレートリーダーを 用いて４９２ナノメ一ター釦ｍ）の光学密度を測定した。 ■、速度測定 精製したモノクローナル抗体をＥＰＰＳバッフｙ　（１ｍＭ、　ｐＨ８，０，１ ００ｍＭ　ＮａＣ１）またはＣＨＥＳバッファ　（１ｍＭ、ｐＨ８，０，１００ ｍＭＮａＣ１）に対して透析した。そのタンパク質濃度は、ＢＣＡ法（ピアス） で測定した。検定はＣＨ，ＣＮ／Ｈ，Ｏ（０，１％ＴＦＡ）（１／Ｉ）の非勾配 溶出液によるＨＰＬＣ（逆相カラム、Ｃ＋ａ、ＶＹＤＡＣ２０１ＴＰ５４）で行 ツタ。 内部標準として０−アセトアミドフェノールを用いて生成物〔４−（カルボキシ ブチルアミド）フェノール〕の量を算出した。 １ｍｌの適当なバッフｙ　Ｃ３０ｍＭ　ＥＰＰＳ　（ｐＨ７，２−８，６）；Ｃ ＨＥＳ　（ｐＨ８，６−１０，０）、１００ｍＭ　ＮａＣＩ）で抗体ストック溶 液を希釈し、タンパク質濃度を２０ＭＭとした。反応液には共溶媒として５パー セントのジオキサンを添加した。反応温度は３７±０．１℃であった。初期線型 速度は、全基質の５％加水分解までの領域で測定した。テストした抗体はＥＬＩ ＳＡ結合検定で決定された反応条件下で少なくとも４８時間安定であることが分 かった。観測された速度は、抗体非存在化での非触媒的加水分解速度に対して補 正した。速度パラメーターＶＩＩＩＸＫｆｉは、ミカエリス・メンテン式に従う 双曲線に初期速度と基質濃度の値を非線型最小二乗法で当てはめることにより決 定した。 ｐＨの関数としての初期速度の変化はｐＨ８，６以上ではＣＨＥＳ　（５０ｍＭ ）（１００ｍＭ　ＮａＣ１）において、他の、ｐＨ領域ではＥＰＰＳ　（５０ｍ Ｍ）（１００ｍＭ　ＮａＣ１）において測定した。ｐＨ８，６のＥＰＰＳおよび ＣＨＥＳ　（５０ｍＭ）（ｌｏＯｍＭ　ＮａＣ１）で測定した場合、抗体２７Ａ ６の速度に差は無かった。バッファイオン濃度の変化（１２，５−５５−５Ｏは 、バッファ種の存在に関するＫｅｅｌ・　（抗体２７Ａ６）の依存性を示さなか った。 等式１は、バッファ濃度ゼロに外挿した化合物３の加水分解速度（Ｋ、、、、） に関するｐＨ／速度関係を示している。ブルース（Ｂｒｕｉｃｅ）等、Ｂｉｏｏ ｒｇａｎｉｃ　ＣｈｅｍｉｓｔｒＬ　１；ベンジャミン版、ニューヨーク（１９ ６５）。 Ｋ、＝ｙ＝ＫｏＨ［０Ｈ−） 黒画角の線（第３ｂ図）は、ｐＨ７，２−１０，０の範囲で固定濃度の化合物３ （４００μＭ）に対しバッファ濃度を変化させたときに得られたものである（１ ２．　５−５０ｍＭ）。使用したバッファおよびｐＨ範囲は上述のものと同様で ある。ＫＯｊ＋−値はに、□とＫｗ／ａＨのプロットの傾斜から算出した。 Ｘ、抗体の化学修飾 （ａ）フェニルグリオキサール、フェニルグリオキサール溶液（６ｍＭ）（１２ ５ｍＭ　ＮａＨＣＯ，、ｐＨ７，５）５０μｌアリコートを抗体を含む（２０Ｍ Ｍ）バッフｙ　（１２５ｍＭ　ＮａＨＣＯｓ、ｐＨ７，５）１９５μｌに添加し た。この混合物を攪拌後室温に１時間放置した。ついで、この反応混合物をマイ クロダイアライザー（ピアス）に移し、１時間当たり約１５０ｍＭの速度で２時 間１２５ｍＭ　ＮａＨＣＯｓ　（ｐＨ７，５）に対して透析した。このマイクロ ダイアライザーを５０ｍＭ　ＣＨＥＳ、１００ｍＭ　ＮａＣ１（ｐＨ８，４）で 濯ぎ（４Ｘ６０ｍ１）　、このバッファ中で一晩（１５−１８時間）放置した。 翌朝、再びこのマイクロダイアライザーを５０ｍＭ　ＣＨＥＳ、１００ｍＭ　Ｎ ａＣ１（ｐＨ８，４）で濯いだ（３Ｘ５０ｍｌ）、サンプルを取り出し、タンパ ク質濃度を再計算（ＢＣＡ）してから触媒活性（ＨＰＬＣ）または結合（ＥＬＩ ＳＡ）検定を行った。同様の操作をハプテン（２００μＭ）についても行った。 （ｂ）マレイン酸無水物；マレイン酸無水物溶液（０，０６Ｍ、ジオキサン）５ ｍｌアリコートを２０ＭＭの抗体を含む２０ｍＭはう酸（ｐＨ８，９）　、１０ ０ｍＭ　ＮａＣ１溶液２９９μｌに添加した。この溶液を攪拌し、室温に１時間 放置した。ついで、この反応混合物をマイクロダイアライザーに移し、上述した ように５０ｍＭ　ＣＨＥＳ　（ｐＨ８，４）、１００ｍＭ　ＮａＣ１溶液に対し て透析した。サンプルを取り出し、タンパク質濃度を計算（ＢＣＡ）してがら触 媒活性又は結合を検定した。 （Ｃ）ジエチルピロカーボネート；０．６Ｍのジエチルピロカーボネートのエタ ノール溶液１０μｌを１ｍｌの酢酸ナトリウム溶液（ＮａＯＡｃ）（１５０ｍＭ 、ｐＨ６，ｌ（１（１ｍＭ　ＮａＣＩ）で希釈した。この溶液５μｍを抗体２０ μＭを含むＮａ０Ａｃ　（１５０ｍＭ、ｐＨ６，０，１００ｍＭ　ＮａＣ１）２ ９９μＪに添加した。この混合物を攪拌後−晩（約１５−１８時間）４℃で放置 した。 この反応混合物をマイクロダイアライザーに移し、上述のようにＣＨＥＳ（５０ ｍＭ、ｐＨ８，４，１００ｍＭ　ＮａＣ１）に対して透析した。サンプルを取り 出し、タンパク質濃度を計算（ＢＣＡ）した後、触媒活性および結合の検定を行 った。 以上の事項は本発明を説明するものであり、これを制限するものではない。本発 明の精神および範囲を逸脱すること無しに多くの変化および修正が可能である。 ＦＩＧ、ＩＡ ＦＩＧＵＲＥ　２ ＦＩＧＵＲＥ　３ 要約書 反応体リガンドの所定のカルボン酸アミドまたはエステル結合を触媒的に加水分 解する抗体分子または抗体結合部位部分を含有する分子１媒分子）、その触媒分 子を製造および使用する方法、並びにその分子を産生ずる細胞が開示される。 触媒分子は、加水分解される結合を含む反応体リガンドおよびハブテン性リガン ドと結合する。ハブテン性リガンドは、反応体リガンドと構造的に類似し、その 反応体リガンドの、それぞれ、水酸基、そのカルボニル基に対応するハブテン性 リガンド内の位置にある飽和炭素原子およびその結合へテロ原子に結合する四面 体炭素原子を含む。ハブテン性リガンドは、反応体リガンドの対応する位置に存 在しない、生理学的ｐＨ値の水溶液でイオン電荷を有する基をさらに含む。イオ ン電荷を有する基は、四面体炭素原子の７人内のハブテンに位置する。 国際調査報告

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．反応体リガンドの所定のカルボン酸アミドまたはエステルを触媒的に加水分 解する抗体分子または抗体結合部位部分を含む分子であって、該分子の抗体結合 部位か、以下の部分： （ａ）加水分解される所定のカルボン酸アミドまたはエステル結合を含む反応体 リガンド、および （ｂ）前記反応体リガンドに構造的に類似するハプテン性リガンドであって、該 ハプテン性リガンドが、加水分解される所定のカルボン酸アミドまたはエステル 結合の水酸基、そのカルボニル基の位置に対応する前記ハプテン性リガンド中の 位置に存在する飽和炭素原子、およびそのカルボニル結合ヘテロ原子の各々に結 合する四面体炭素原子を含み、さらに前記ハプテン性リガンドが、生理学的ｐＨ の水溶液中でイオン電荷を有するイオン電荷含有基を含み、該イオン電荷含有基 が、前記反応体リガンドの対応する位置には存在せず、かつ前記四面体炭素原子 から半径約７オングストローム以内に規定される球状容積内に存在する前記ハプ テン性リガンド、 に結合する分子。
2. ２．前記イオン電荷含有基が、前記イオン電荷を有する該イオン電荷含有基の原 子と、前記四面体炭素原子との間で、少なくとも１原子によって間接的に該四面 体炭素原子に結合する請求の範囲第１項記載の分子。
3. ３．前記分子がモノクローナル抗体である請求の範囲第１項記載の分子。
4. ４．前記ハプテン性リガンドが、前記イオン電荷含有基として、生理学的ｐＨで アンモニウムイオンまたはカルボキシレートイオンを含む請求の範囲第１項記載 の分子。
5. ５．反応体リガンドの所定のカルボン酸アミドまたはエステル結合を触媒的に加 水分解するモノクローナル抗体分子または抗体結合部位を含む分子であって、該 分子の抗体結合部位か、 （ａ）加水分解される所定のカルボン酸アミドまたはエステル結合を含む反応体 リガンドであって、以下の構造式：▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ１およびＲ２は反応体の炭素原子含有化学残基を示し、また、−Ｘ− は−Ｏ−または−ＮＲ３−（Ｒ３は水素または第３炭素含有化学残基である）で ある。） で表される反応体リガンド、および （ｂ）前記反応体リガンドに構造的に類似するハプテン性リガンドであって、以 下の構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ１′およびＲ２′は各々Ｒ１およびＲ２に構造的に類似する炭素原子 含有残基を表し、かつＲ１′およびＲ２′の内の少なくとも一つは生理学的ｐＨ 値の水溶液においてイオン電荷を有する基を含み、かつ生理学的ｐＨ値の水溶液 においてイオン電荷を提供する前記少なくとも一つ基が、前記構造式中の−ＣＨ （ＯＨ）−基から半径約７オングストロームで規定される球状容積内に存在する 。また、−Ｘ−が−Ｏ−である時Ｒ３′はＨであり、−Ｘ−が−ＮＲ３−である 時Ｒ３′はＲ３に構造的に類似する。）で表されるハプテン性リガンド、 に結合する分子。
6. ６．前記−Ｘ−が−Ｏ−である請求の範囲第５項記載の分子。
7. ７．前記生理学的ｐＨ値でイオン電荷を有する前記基がアンモニウムイオンまた はカルボキシレートイオンである請求の範囲第６項記載の分子。
8. ８．ＡＴＣＣ受理番号ＨＢ１０３４１のハイブリドーマ３０Ｃ６によって分泌さ れる請求の範囲第７項記載の分子。
9. ９．ＡＴＣＣ受理番号ＨＢ１０６２１のハイブリドーマ２７Ａ６によって分泌さ れる請求の範囲第７項記載の分子。
10. １０．前記イオン電荷含有基が、イオン電荷を有する該イオン電荷含有基の原子 と前記四面体炭素原子とを少なくとも１原子隔てて該四面体炭素原子に間接的に 結合し、かつ前記イオン電荷含有基が前記四面体炭素原子から半径約２乃至約５ オングストロームで規定される球状容積内に存在する請求の範囲第５項記載の分 子。
11. １１．培地中での培養で、反応体リガンドの所定のカルボン酸アミドまたはエス テルを触媒的に加水分解するモノクローナル抗体分子または抗体結合部位部分を 含む分子を産生する細胞であって、前記分子の抗体結合部位か、（ａ）加水分解 される所定のカルボン酸アミドまたはエステル結合を含む反応体リガンド、およ び （ｂ）前記反応体リガンドに構造的に類似するハプテン性リガンドであって、前 記ハプテン性リガンドが、加水分解される所定のカルボン酸アミドまたはエステ ル結合の水酸基、そのカルボニル基の位置に対応するハプテン性リガンド中の位 置に存在する飽和炭素原子、およびそのカルボニル結合ヘテロ原子の各々に結合 する四面体炭素原子を含み、前記ハプテン性リガンドが、さらに生理学的ｐＨの 水溶液中でイオン電荷を有するイオン電荷含有基を含み、該イオン電荷含有基が 、前記反応体リガンドの対応する位置には存在せず、かつ前記四面体炭素原子か ら半径約７オングストローム以内に規定される球状容積内に存在する、ハプテン 性リガンド、 に結合する、細胞。
12. １２．ハイブリドーマ細胞であって、さらに前記カルボン酸アミドまたはエステ ル結合を触媒的に加水分解する前記モノクローナル抗体または抗体結合部位部分 を含む分子を培養培地中に分泌する請求の範囲第１１項記載の細胞。
13. １３．ＡＴＣＣ受理番号ＨＢ１０３４１のハイブリドーマ３０Ｃ６の細胞である 請求の範囲第１２項記載のハイブリドーマ細胞。
14. １４．ＡＴＣＣ受理番号ＨＢ１０６２１のハイブリドーマ２７Ａ６の細胞である 請求の範囲第１２項記載のハイブリドーマ細胞。
15. １５．反応性リガンド中の所定のエステルまたはアミド結合を触媒的に加水分解 する方法であって、以下の工程： （ａ）触媒的有効量の請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体分子または抗 体結合部位部分を含む分子を水性媒体中で前記反応体リガンド分子と混合し、反 応混合物を調製する、および （ｂ）前記反応体リガンド分子が前記抗体分子または抗体結合部位部分を含む分 子に結合し、かつ該抗体分子または抗体結合部位部分を含む分子が前記所定の結 合を触媒的に加水分解し、かつ生成物を提供するのに十分な時間、前記反応混合 物を維持する、 工程を含む方法。
16. １６．前記抗体分子またはその抗体結合部位部分を含む分子が、ＡＴＣＣ受理番 号ＨＢ１０３４１のハイブリドーマ３０Ｃ６またはＡＴＣＣ受理番号ＨＢ１０６ ２１のハイブリドーマ２７Ａ６により分泌される請求の範囲第１５項記載の方法 。
17. １７．培地中での培養で、反応体リガンドの所定のカルボン酸アミドまたはエス テル結合を触媒的に加水分解する抗体分子または抗体結合部位部分を含む分子を 産生する細胞を調製する方法であって、以下の工程：（ａ）加水分解される所定 のカルボン酸アミドまたはエステル結合の水酸基、そのカルボニル基の位置に対 応するハプテン性リガンド中の位置に存在する飽和炭素原子、およびそのカルボ ニル結合ヘテロ原子の各々に結合する四面体炭素原子を含むハプテン性リガンド を含む免疫原で動物を免疫し、この場合、前記ハプテン性リガンドが、さらに前 記反応体リガンドの対応する位置には存在せず、かつ前記四面体炭素原子から半 径約７オングストローム以内に規定される球状容積内に存在する、生理学的ｐＨ の水溶液中でイオン電荷を有するイオン電荷含有基を含み、 （ｂ）前記動物が、前記ハプテン性リガンドと免疫反応する抗体を分泌するのに 十分な時間、該動物を維持し、 （ｃ）抗体分子または抗体結合部位部分を含む分子をコードする遺伝子を、前記 工程（ｂ）の前記免疫化動物の抗体産生細胞から宿主細胞に転移して、少なくと も二つの起源に由来する遺伝子を含むハイブリッド細胞を生成し、該ハンブリッ ド細胞は、（ｉ）培養したときに該転移遺伝子から、抗体分子または抗体結合部 位部分を含む分子を生産し、かつ（ｉｉ）実質的に永久に培養することができ、 （ｄ）前記ハンブリッド細胞が抗体分子または抗体結合部位部分を生産するのに 十分な時間、適当な培地中で該ハイブリドーマ細胞を培養し、（ｅ）培養した前 記ハンブリッド細胞から抗体分子または抗体綜合部位部分を含む分子を回収し、 （ｆ）得られた抗体分子または抗体結合部位部分を含む分子をスクリーニングし 、前記所定のカルボン酸アミドまたはエステル結合を触媒的に加水分解する抗体 分子または抗体結合部位部分を含む分子を生産するハンブリッド細胞を同定し、 そして （ｇ）前記所定のカルボン酸アミドまたはエステル結合を触媒的に加水分解する 抗体分子または抗体結合部位部分を含む分子を生産する前記同定されたハンブリ ッド細胞のクローンを増殖する、工程を含む方法。
18. １８．前記工程（ｃ）で生成した細胞がハイブリドーマ細胞である請求の範囲第 １７項記載の方法。