NO311432B1

NO311432B1 - Molekyler med antistoffkombinerende seter som katalyserer hydrolysereaksjoner

Info

Publication number: NO311432B1
Application number: NO19922921A
Authority: NO
Inventors: Kim D Janda
Original assignee: Scripps Clinic Res
Priority date: 1990-01-26
Filing date: 1992-07-23
Publication date: 2001-11-26
Also published as: FI108437B; EP0512074A4; FI923367A0; NO922921D0; CA2034947C; JP3365769B2; WO1991011512A1; AU7339591A; DE69129845D1; JPH05506571A; US5187086A; FI923367A; IE910277A1; EP0512074A1; ATE168718T1; NO922921L; DK0512074T3; PT96584B; ES2120959T3; CA2034947A1

Abstract

Et antistoffmolekyl eller molekyl inneholdende antistoffkombinerende. setedeler (katalytisk molekyl) som. hydrolyserer en på forhånd valgt carboxylsyreamid- eller esterbinding av en. reaktantligand katalytisk, metoder for. fremstilling og anvendelse av det katalytiske molekyl, og celler som produserer disse molekyler, er beskrevet. De. katalytiske molekyler binder til en. reaktantligand inneholdende den binding. som skal hydrolyseres og også til en. haptenisk ligand. Den hapteniske ligand. er strukturelt analog med angitte reaktantligand og inneholder et tetraedrisk. carbonatom som er bundet til en hydroxylgruppe og til et mettet carbonatom ved en stilling i den hapteniske ligand som tilsvarer stillingen av carbonylgruppen og dens bundne heteroatom av reaktantliganden. Den hapteniske ligand inneholder også en gruppe som bærer en ionisk ladning i vandig oppløsning ved fysiologiske pH-verdier som ikke er til stede ved en tilsvarende stilling av reaktantliganden. Den ioniske, ladningsbærende gruppe er lokalisert i haptenet innen 7. Angstrøm av det tetraedriske carbonatom.

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår antistoffer, antigener og immunogener, og nærmere bestemt molekyler som inneholder et antistoffkombinerende sete som binder det tetraedriske carbonatom av en amid- eller esterhydrolyseomvandlingstilstand og omgivende strukturer, og tilveiebringer enn videre et sete for syre-base eller nukleofil katalyse av amid- eller esterbindin-gen som hydrolyseres.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Bindingsfenomener mellom ligander og reseptorer spiller mange avgjørende roller i biologiske systemer. Eksempler på slike fenomener er bindingen av oxygenmolekyler til deoxyhemoglobin under dannelse av oxyhemoglobin, og bindingen av et substrat til et enzym som virker på dette slik som mellom et protein og en protease slik som trypsin. Ytterligere eksempler på biologiske bindingsfenomener innbefatter bindingen av et antigen til et antistoff, og bindingen av komple-mentkomponent C3 til den såkalte CR1-reseptor.

Mange legemidler og andre terapeutiske midler er også antatt å være avhengige av bindingsfenomener. Eksempelvis er opiater slik som morfin, rapportert å bindes til spesifikke reseptorer i hjernen. Opiatagonister og -antagonister er angitt å konkurrere med legemidler slik som morfin, for disse bindingsseter.

Ligander slik som syntetiske legemidler, som morfin og dets derivater, og de som er naturlig forekommende i biologiske systemer slik som endorfiner og hormoner, binder til reseptorer som er naturlig til stede i biologiske systemer, og vil bli behandlet sammen her. Slik binding kan føre til ét utall fenomener innen biologien, innbefattende i særdeleshet hydrolyse av amid- og esterbindinger slik som der hvor proteiner hydrolyseres til konstituentpolypeptider av et enzym slik som trypsin eller papain, eller hvor et fett spaltes til glycerol og tre carboxylsyrer.

Slobin, Biochemistry, 5^:2836-2844 (1966) rapporterte fremstilling av antistoffer mot et p-nitrocarbobenzoxykonjugat av kvegserumalbumin. Disse antistoffer ble deretter anvendt for å hydrolysere p-nitrofenylacetat- og epsilon-aminocaproat-estere. Reaksjonen av acetatesteren ble beskrevet ved en annen-ordens hastighetskonstant og ble angitt å fremkomme som ikke-spesifikk. Den annen-ordens hastighetskonstant erholdt under anvendelse av normalt gammaglobulin, ble angitt å være tilnærmet lik den til de spesielt fremstilte antistoffer. Nærværet av de spesielt fremstilte antistoffer ble angitt å inhi-bere hydrolysen av aminocaproatesteren.

Kohen og medarbeidere rapporterte også forsøk ved anvendelse av antistoffer p<*>å å hydrolysere esterolyse. Antistoffene anvendt av denne gruppe, var i hvert tilfelle dannet mot en del av det sluttelig anvendte substratmolekyl som ikke inneholdt bindingen som skulle hydrolyseres.

I sitt første arbeide [FEBS Letters, 100:137-140

(1979) og Biochim. Biophys. Acta, 629:328-337 (1980)] ble anti-steroid-antistoffer anvendt for å hydrolysere 7-umbelli-feron- (7-hydroxykumarin) estere av en carboxyethylthioether av et steroid. I hvert tilfelle ble en økning i hydrolytisk hastighet observert sammenlignet med bakgrunnen eller en hastighet erholdt med normalt IgG. I begge tilfeller var omslags-tall lave (ca. ett mol substrat pr. mol antistoff pr. minutt, eller mindre), og reaksjonshastighetene avtok med tiden og nådde et nivå med metning av antistoffet. Denne nedsettelse i hastighet ble tilskrevet en irreversibel binding av det steroidale syreprodukt til antistoffet.

Kohen et al. rapporterte også hydrolyse av 7-[N-(2,4-dinitrofenyl)-6-aminohexanoyl]-kumarin under anvendelse av monoklonale antistoffer dannet mot dinitrofenyldelene av dette substratmolekyl [FEBS Letters, 111:427-431 (1980)]. Her ble også en hastighetsøkning over bakgrunnen rapportert, men reaksjonen ble angitt å være støkiometrisk snarere enn katalytisk. En nedsettelse i hastighet som nærmet seg null, ble rapportert ettersom metning av antistoffet var nådd. Igjen ble reduk-sjonen tilskrevet produktinhibering forårsaket av binding av produktsyren til antistoffet da noe av den opprinnelige hydro-lyseaktivitet kunne regenereres ved kromatografi av en antistoff -substrat -produktblanding .

Når sterk antistoffbinding rettes mot stabile til-stander av substratmolekyler, vil den langsomme dissosia-sjonshastighet av komplekset vanskeliggjøre katalyse. Dette er antatt å være situasjonen for resultatene rapportert av Kohen og medarbeidere.

De ovenfor angitte teorier er, selv om de er interes-sante, sterkt begrenset av mangelen på å rette oppmerksomheten mot mekanismen ved bindingsenergiutnyttelsen som er vesentlig for enzymer [W. P. Jencks, Adv. Enzymol. , 4<_>3, 219 (1975)].

Disse mangler kan avhjelpes ved anvendelse av en overgangstilstandsanalog som haptenet, for å fremkalle de ønskede antistoffer. Dette hapten kan anta rollen av en inhibitor i det katalytiske system.

Således kan immunologisk binding anvendes for eks-perimentelt å omlede bindingsinteraksjoner til katalytiske prosesser. Eksempelvis ble det foreslått at anvendelse av et antistoff mot en haptenisk gruppe som ligner overgangstilstanden av en gitt reaksjon, skulle forårsake en akselerasjon i substratreaksjon ved å tvinge substrater til å etterligne overgangstilstanden. Jencks, W.P., Catalysis in Chemistry and Enzymology, side 288 (McGraw-Hill, New York 1969). Til tross for denne brede antydning ble spesifikke overgangstilstands-haptener ikke foreslått, heller ikke ble spesifikke reaksjoner foreslått i hvilke dette begrepet kunne testes.

Hydrolyse av amid- og esterbindinger er antatt ved nyere akseptert kjemisk teori å forløpe i vandige medier ved en reaksjon ved carbonylcarbonatomet under dannelse av en overgangstilstand som inneholder et tetraedrisk carbonatom bundet til (a) et carbonatom av syredelen av amidet eller esteren, (b) to oxygenatomer hvor ett er fra carbonylgruppen og den andre fra et hydroxylion eller vannmolekyl av mediet, og (c) oxygenatomet av alkoholdelen av en ester eller nitro-genatomet av amindelen av et amid. Overgangstilstander av slike reaksjoner er anvendbare mentale konstruksjoner som ved definisjon ikke kan isoleres, sammenlignet med mellomprodukter som er isolerbare. Selv om de ovenfor angitte hydrolytiske overgangstilstander ikke kan isoleres, er en stor mengde vitenskapelig litteratur blitt viet dette.

Mens den ovenfor beskrevne overgangstilstand for amid- og esterhydrolyse er antatt å være vel forstått, er parametrene av topologien, f.eks. størrelse, form og ladning av reseptorbindingssetene i hvilke bestemte amider, slik som proteiner, eller estere slik som fett, reagerer gjennom disse overgangstilstander, ikke godt forstått. Det vil derfor være gunstig hvis topologien av et flertall av bindingsseter var kje nt slik at interaksjonene av ligandene som binder i disse seter, kunne studeres. Uheldigvis er topologien av reseptorbindingsseter i biologiske hydrolyser generelt ukjent, bortsett fra et relativt lite antall enzymer hvis røntgenkrystall-strukturer er blitt bestemt.

Denne mangel på kunnskap om bindingssetetopologi stammer delvis fra en mangel på kunnskap av selv lokaliseringen i celler av mange bindingsseter av reseptorer. I tillegg er for de reseptorbindingsseter hvis lokalisering er kjent, den kjemiske identitet, dvs. protein- og carbohydratsammenset-ningen av bindingssetet, generelt ukjent. Således er forskeren generelt hindret i å søke å forstå de topologiske krav av reseptorbindingsseter og derfor i å søke å konstruere terapeutiske midler som kan oppfylle disse krav.

Forskerne må derfor utprøve potensielle terapeutiske midler i dyre- eller cellekulturstudier for å fastslå hvorvidt et potensielt terapeutisk middel kan være anvendbart. Selv om slike systemer er anvendbare, er de kostbare og tidkrevende å anvende.

Selv hvor topologien og kjemisk reaktivitet av en hydrolytisk reseptor slik som et enzym, er kjent, spalter enzymer slik som hydrolytiske proteaser, typisk sine substrater, polypeptidkjeder, tilstøtende en bestemt aminosyrerest som kan oppstå flere ganger i polypeptidkjeden til proteinet. Selv om slik relativt vilkårlig spaltning kan være anvendbar når det gjelder å oppnå et polypeptidkart av proteinet, er denne relativt vilkårlige spaltning ikke anvendbar hvor det er ønskelig å fremstille bestemte aminosyrerestsekvenser.

Eksempelvis har moderne genetiske konstruksjonstek-nikker vært anvendbare ved fremstilling av fusjonsproteiner som inneholder et ønsket protein eller polypeptid fusjonert til transkripsjonsproduktet av et vektorgen slik som lac z-genet. Anvendelse av slike fusjonsproteiner hindres imidlertid av nærvær av fragmenter av vektorgenproduktet. Det vil derfor være gunstig hvis proteolytiske enzymlignende molekyler kunne utvikles som vil spalte slike fusjonsprodukter mellom de ønskede og uønskede fusjonspolypeptid- eller proteindeler.

Nylig rapporterte Lerner, Tramontano og Janda [Science, 234, 1566 (1986)] om monoklonale antistoffer som hydrolyserte en ester katalytisk. Tramontano og Lerner beskriver også anvendelse av monoklonale antistoffer for å hydrolysere estere i US patentskrift nr. 4 656 567. Pollack, Jacobs og Schultz [Science, 234, 1570 (1986)] rapporterte om et myelomprotein angitt som MOPC167 [Leon et al., Biochem., 10, 1424 (1971)] som katalyserer hydrolysen av et carbonat.

I de to Lerner og Tramontano-beskrivelser ble antistoffene dannet mot et fosfonat som ble syntetisert for å representere en stabil analog av den tetraedriske, hydrolytiske omvandlingstilstand av carboxylsyreesteren eller car-bonatesteren. Det prinsipielt diskuterte antistoff ifølge Pollack et al. var et myelomprotein som lyktes å binde til et fosfonat som var strukturelt analogt med carbonatanalogen som ble hydrolysert.

I Lerner og Tramontano et al.-arbeidet ble således det substrat som skulle hydrolyseres, utvalgt på forhånd, og den immuniserende analog og hydrolytiske antistoffer ble syntetisert i henhold til det ønskede produkt. Pollack et al. utformet det substrat som skulle hydrolyseres så snart de kjente spesifisiteten av myelomproteinet. Pollack et al. rapporterte også (ovenfor) eksistensen av et katalytisk antistoff, substrat og analogt substratsystem for carbonat-hydrolyse som er lik i begrep med det ifølge Lerner et al. Arbeide vedrørende dette system er rapportert i Jacobs et al. , J. Am. Chem. Soc. , 109, 2174 (1987).

Publisert patentsøknad WO 85/02414 diskuterer mulig

bruk av antistoffer som katalysatorer og presenterer data ved-rørende anvendelse av polyklonalt serum når det gjelder hydrolyse av o-nitrofenyl-beta-D-galactosid. De antistoffer som er anvendbare i denne søknad, er angitt å kunne fremkalles av en reaktant, et reaksjonsmellomprodukt eller en analog av reak-

tanten, produktet eller reaksjonsmellomproduktet. Uttrykket "analog" er her definert til å omfatte isomerer, homologer eller andre forbindelser som ligner reaktanten tilstrekkelig når det gjelder kjemisk struktur til at antistoff dannet mot en analog, kan delta i en immunologisk reaksjon med reaktanten, men som ikke nødvendigvis vil katalysere en reaksjon av analogen.

Dataene tilveiebrakt i denne beskrivelse, indikerer bare at en viss spaltning av substrat- (reaktant) galactosidet fant sted i løpet av en 18-timersperiode under anvendelse av et relativt konsentrert antistoffpreparat (1:10 og 1:20 for-tynninger) . Selv om katalyse ble påstått, ble katalytisk aktivitet ikke vist da ikke noe omslag av det påståtte, katalytiske antistoff ble vist, heller ikke var det noen indikasjon på nærvær av spaltet substratgalactosid. Denne søknad indikerer at beta-D-galactosidase spaltet ca. ti ganger så mye substrat som de polyklonale antistoffer, idet man antar linearitet av absorbans ved den ikke angitte konsentrasjon av det studerte substrat.

Fra dataene presentert i den søknad, er det mulig at en nukleofil erstatning av o-nitrofenylgruppen fant sted med en terminal aminogruppe av en lysinrest av det anvendte antistof f preparat . Således kan den observerte absorbans skyldes dannelse av epsilon-amino-lysinyl-o-nitrofenylanilin eller dannelse av et epsilon-amino-lysinyl-galactosid og o-nitrofenol, idet forekomster av det ene eller andre av disse ikke vil være katalytiske da antistoffet ble forbrukt snarere enn å slå over.

US patentskrift nr. 4 792 446 tilhørende Kim et al., beskriver produksjonen av antistoffkatalysatorer. Disse katalysatorer reagerer med et substrat og fremkalles av et hapten-molekyl hvor substratet og haptenmolekylene har hovedsakelig strukturell likhet i deler som er forskjellige fra atomet eller gruppen ved hvilken den katalytiske reaksjon finner sted, dvs. reaksjonssetet. Ved reaksjonssetet avviker substratet og haptenet ved at reaksjonssetet eller katalytisk aktive kjerner av haptenet inneholder en høyere valens og én eller flere bindinger enn den analoge struktur av substratet.

I tillegg innbefatter haptenet en gruppe som er bundet til den katalytisk aktive del av molekylet, dvs. til den strukturelt analoge del av det reaktive sete av substratet. Denne tilsatte gruppe er angitt å være anvendbar for innføring i katalysatorantistoffet av en pluss-ionisk ladning slik som med en -C02"-gruppe, eller en minus-ionisk ladning slik som med et ammoniumion. Denne adderte gruppe er også angitt å erstatte -OH-gruppen av substratet, for å skape polare omgivelser, for å skape ikke-polare omgivelser eller for å tilveiebringe et hulrom for vann.

Lerner et al., BioAssays, 9:107-112 (1988) beskriver også anvendelse av en ionisk ladet gruppe av et immuniserende hapten for å fremkalle nærvær av en motsatt ladet gruppe i det antistoffkombinerende sete slik at syre-basekatalyse kan let-tes under anvendelse av et uladet substrat. Denne strategi for fremkallelse av katalytiske antistoffer er her angitt som "lokke og dreie" ved at det katalytiske antistoff fremkalles eller lokkes med et ladet hapten og substratet for den fremkalte antistoffkatalysator dreies til et nøytralt molekyl slik at den komplementære, ioniske ladning fremkalt i antistoffet mot den ioniske ladning av haptenet, kan utnyttes til å tilveiebringe syre-basekatalyse av en reaksjon av det nøytrale substrat. Ikke noen spesifikke, hapteniske strukturer er imidlertid beskrevet for utførelse av "lokke og dreie"-strategien.

Kort sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler som hydrolyserer en på forhånd valgt carboxylsyreamid- eller esterbinding av en reaktantligand katalytisk, hvor det antistoffkombinerende sete av angitte molekyler binder til: (a) en reaktantligand inneholdende den på forhånd valgte carboxylsyreamid- eller esterbinding som skal hydrolyseres; og (b) en haptenisk ligand strukturelt analog med angitte reaktantligand som inneholder et tetraedrisk carbonatom bundet til en hydroxylgruppe så vel som til et mettet carbonatom ved en stilling i den hapteniske ligand svarende til stillingen av carbonylgruppen så vel som til det carbonylbundne heteroatom av den på forhånd valgte carboxylsyreamid-eller esterbinding som skal hydrolyseres, hvilken haptenisk ligand ytterligere innbefatter en gruppe som bærer en ionisk ladning i vandig oppløsning ved fysiologiske pH-verdier, og hvor den ioniske, ladningsbærende gruppe er fraværende fra en tilsvarende stilling på angitte reaktantligand og lokalisert innen et sfærisk volum definert ved en radius på ca. 7 Ång-strøm fra angitte, tetraedriske carbonatom.

Oppfinnelsen omfatter også monoklonale antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler som hydrolyserer en på forhånd valgt carboxylsyreamid- eller esterbinding av en reaktantligand katalytisk, hvor det antistoffkombinerende sete av angitte molekyler binder til: (a) en reaktantligand inneholdende den på forhånd valgte carboxylsyreamid- eller esterbinding som skal hydrolyseres, hvilken reaktantligand er representert ved strukturen hvori R<1> og R2 betegner carbonatomholdige, kjemiske rester av reaktanten, og -X- er -0- eller -NR<3->, hvori R3 er hydrogen eller en tredje carbonholdig, kjemisk rest; og (b) en haptenisk ligand som er strukturelt analog med angitte reaktantligand, hvilken haptenisk ligand er representert ved strukturen

hvori R<1>' og R<2>' betegner carbonatomholdige rester som er

strukturelt analoge med R<1> og R<2>, og hvor minst én av R<1>' og R<2>' inneholder en gruppe som bærer en ionisk ladning i vandig løs-ning ved fysiologiske pH-verdier, minst én av angitte grupper

som tilveiebringer ionisk ladning ved fysiologiske pH-verdier, er lokalisert innen et sfærisk volum definert ved en radius på

ca. 7 Ångstrøm fra angitte

av angitte struktur, og

hvor R er H når -X- er -0-, eller hvor R<3>' er strukturelt analog "med R<3> når -X- er -NR3 - .

Også omfattet av oppfinnelsen er celler som når de dyrkes i et medium, danner monoklonale antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende anti-stoffkombinerende setedeler som hydrolyserer en på forhånd valgt carboxylsyreamid- eller esterbinding av en reaktantligand katalytisk, hvor det antistoffkombinerende sete av angitte molekyler binder til: (a) en reaktantligand inneholdende den på forhånd valgte carboxylsyreamid- eller esterbinding som skal hydrolyseres; og (b) en haptenisk ligand strukturelt analog med angitte reaktantligand som inneholder et tetraedrisk carbonatom bundet til en hydroxylgruppe så vel som til et mettet carbonatom ved en stilling i den hapteniske ligand svarende til stillingen av carbonylgruppen, så vel som til det carbonylbundne heteroatom, av den på forhånd valgte carboxylsyreamid-eller esterbinding som skal hydrolyseres, hvilken haptenisk ligand ytterligere innbefatter en gruppe som bærer en ionisk ladning i vandig oppløsning ved fysiologiske pH-verdier, hvilken ionisk ladningsbærende gruppe er fraværende fra angitte reaktantligand og lokalisert innen et sfærisk volum definert ved en radius på ca. 7 Ångstrøm fra angitte, tetraedriske carbonatom.

Oppfinnelsen omfatter også metode for katalytisk hydrolisering av en på forhånd valgt ester- eller amidbinding i et raktivt ligandmolekyl omfattende trinnene: (a) blanding av en katalytisk effektiv mengde av de monoklonale antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler ifølge krav 1 med angitte reaktantligandmolekyler i et vandig medium under dannelse av en reaksjonsblanding; og (b) opprettholdelse av angitte reaksjonsblanding i et tidsrom tilstrekkelig til at angitte reaktantligandmolekyler binder til angitte antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkominerende setedeler, og til at angitte antistoffmolekyler eller molekyler innehldende antistoff - kombinerende setedeler derav får hydrolysere angitte på forhånd valgte binding katalytisk og danne produkter.

Også omfattet av oppfinnelsen er en metode for fremstilling av celler som når de dyrkes i et medium, danner antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler som hydrolyserer en på forhånd valgt carboxylsyreamid- eller esterbinding av en reaktantligand katalytisk, omfattende trinnene: (a) immunisering av et dyr med et immunogen som innbefatter en haptenisk ligand som inneholder et tetraedrisk carbonatom bundet til en hydroxylgruppe så vel som til et mettet carbonatom ved en stilling i den hapteniske ligand svarende til stillingen av carbonylgruppen, så vel som til det carbonylbundne heteroatom, av den på forhånd valgte carboxylsyreamid- eller esterbinding som skal hydrolyseres, hvilken haptenisk ligand ytterligere innbefatter en gruppe som bærer en ionisk ladning i vandig oppløsning ved fysiologiske pH-verdier hvor den ioniske, ladningsbærende gruppe er fraværende fra en tilsvarende stilling av angitte reaktantligand og lokalisert innen et sfærisk volum definert ved en radius på ca. 7 Ångstrøm fra angitte tetraedriske carbonatom; (b) opprettholdelse av angitte dyr i et tidsrom tilstrekkelig til at det angitte dyr får utskille antistoffer som immunreagerer med angitte, hapteniske ligand; (c) overføring av gener som koder for antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler fra antistoffproduserende celler av angitte, opprettholdte, immuniserte dyr fra trinn (b) i vertceller under dannelse av hybridceller som inneholder gener fra minst to kilder, og hvilke dannede hybridceller (i) produserer antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler fra angitte, overførte gener når de dyrkes, og (ii) kan dyrkes hovedsakelig ubegrenset; (d) dyrkning av hybridcellene i et egnet dyrknings-medium i et tidsrom tilstrekkelig til at disse hybridceller får produsere antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler; (e) gjenvinning av antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler fra de dyrkede hybridceller; (f) screening av de erholdte antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler for å identifisere en hybridcelle som produserer antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler som hydrolyserer angitte på forhånd bestemte carboxylsyreamid-eller esterbinding katalytisk; og (g) dyrkning av kloner av angitte, identifiserte hybridcelle som produserer antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler som hydrolyserer angitte på forhånd bestemte carboxylsyreamid- eller esterbinding .

Foreliggende oppfinnelse tar i betraktning et antistoffmolekyl eller molekyl inneholdende antistoffkombinerende setedel (katalytisk molekyl) som katalytisk hydrolyserer en på forhånd valgt carboxylsyreamid- eller esterbinding av en reaktantligand, metoder for fremstilling og anvendelse av et slikt molekyl, og celler som fremstiller katalysatormolekylet.

De katalytisk aktive molekyler er fortrinnsvis monoklonale antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende monoklonale, antistoffkombinerende setedeler. Det antistoffkombinerende sete av disse molekyler immunreagerer (binder til) minst to ligandmolekyler. Et første ligandmolekyl er en reaktantligand som inneholder den på forhånd valgte carboxylsyreamid- eller esterbinding som hydrolyseres, så vel som en carbonholdig, kjemisk rest bundet til hver av carboxylsyre- og amin- eller alkoholdelene av bindingen som hydrolyseres.

En andre ligand er en haptenisk ligand anvendt direkte eller indirekte for å fremkalle de katalytiske molekyler. Den hapteniske ligand er strukturelt analog med reaktantliganden og inneholder et tetraedrisk carbonatom bundet til en hydroxylgruppe og til et mettet carbonatom ved en stilling i den hapteniske ligand svarende til stillingen av carbonylgruppen og til det carbonylbundne heteroatom av det på forhånd valgte reaktantligand-carboxylsyreamid eller -ester som skal

hydrolyseres. Når f.eks. en amid-

eller ester- -binding skal hydrolyseres i reaktantliganden, inneholder den hapteniske ligand en

-gruppe ved en stilling

som er analog med den ester- eller amidbinding-holdige gruppe. Carbonholdige, kjemiske rester bundet til det tetraedriske carbonatom og til det mettede carbonatom av haptenet, er strukturelt analoge (like) med de kjemiske rester bundet til carboxyldelen og amin- eller alkoholdelen av reaktantliganden.

En haptenisk ligand inneholder også en gruppe som bærer en ionisk ladning i vandig løsning ved fysiologiske pH-verdier. Denne ioniske, ladningsbærende gruppe er fraværende fra en tilsvarende stilling av reaktantliganden og er lokalisert innen et sfærisk volum definert ved en radius på ca. 7, og fortrinnsvis ca. 2 til ca. 5, Ångstrøm fra det ovenfor nevnte hydroxylgruppe-bundne, tetraedriske carbonatom. Den ioniske, ladningsbærende gruppe tilveiebringer fortrinnsvis et carboxylat eller ammoniumion i vandig løsning ved fysiologiske pH-verdier.

En reaktantligand kan være representert ved strukturen

hvori R<1> og R2 betegner carbonatomholdige, kjemiske rester av reaktanten, og -X- er -0- eller -NR<3->, hvori R3 er hydrogen eller en tredje carbonholdig, kjemisk rest. En haptenisk ligand kan være representert ved strukturen hvori R<1>' og R<2>' betegner carbonatomholdige rester som er strukturelt analoge med R<1> og R<2>. Minst én av R<1>' og R<2>' inneholder en gruppe som bærer en ionisk ladning i vandig løsning ved fysiologiske pH-verdier, og denne ionisk ladede gruppe er lokalisert innen et sfærisk volum definert ved en radius på ca. 7, og fortrinnsvis ca. 2 til 5 Ångstrøm fra

av an-

gitte struktur. R<3>' er H når -X- er -0-, eller R<3>' er strukturelt analog med R<3> når -X- er -NR<3->.

Celler som produserer de ovenfor diskuterte, katalytiske molekyler når de dyrkes i et egnet in vivo eller in vitro medium, tas også i betraktning. Disse celler produserer fortrinnsvis ikke bare de katalytiske molekyler, men utskiller også disse katalytiske molekyler i kulturmediet. Én slik foretrukket celletype er en hybridomcelle.

En metode for fremstilling av de ovenfor angitte celler tas også i betraktning. Her immuniseres et dyr med et immunogen som innbefatter en tidligere beskrevet haptenisk ligand som er til stede i en mengde tilstrekkelig til å fremkalle antistoffer mot haptenet i dyret. Dyret opprettholdes i et tidsrom tilstrekkelig til at dyret får utskille antistoffer som immunreagerer med den hapteniske ligand.

Gener som koder for antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler, overføres fra antistoffproduserende celler av det opprettholdte, immuniserte dyr i vertceller under dannelse av hybridceller. Disse hybridceller inneholder gener fra minst to kilder. Når de dyrkes, produserer hybridcellene antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler fra de overførte gener, og disse celler kan dyrkes hovedsakelig ubegrenset sammenlignet med det gen som overfører antistoffproduserende celler.

Hybridcellene dyrkes i et egnet medium og under egnede dyrkningsbetingelser i et tidsrom tilstrekkelig til at disse hybridceller får produsere antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler som gjenvinnes og deretter screenes for å identifisere en hybridcelle som produserer antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler som katalytisk hydrolyserer den på forhånd bestemte carboxylsyreamid- eller esterbinding av reaktantliganden. Kloner av den identifiserte hybridcelle dyrkes deretter.

En metode for katalytisk hydrolyse av en på forhånd valgt ester- eller amidbinding i en reaktiv ligand tas også i betraktning. Her blandes en katalytisk effektiv mengde av de ovenfor diskuterte katalytiske molekyler med reaktantligandmolekyler i et vandig medium under dannelse av en reaksjonsblanding. Reaksjonsblandingen opprettholdes i et tidsrom tilstrekkelig til at reaktantligandmolekylene får bindes til de katalytiske molekyler og for at de katalytiske molekyler får hydrolysere den på forhånd valgte binding katalytisk og danne hydrolyseprodukter. Ett eller flere av de dannede produkter kan deretter gjenvinnes.

Kort beskrivelse av tegningene

I tegningene som utgjør en del av foreliggende beskrivelse, illustrerer figur 1 i figurene IA og IB struktur-formlene av spesifikke, hapteniske ligander (forbindelse la, 2, 5a, 6 og 7), en inhibitor (forbindelse lb), substrat eller reaktantligand (forbindelse 3) og reaksjonsforbindelse 4 diskutert og anvendt her.

Figur 2 er en kurve som viser to pH- vs. log K-verdier. Den øvre del (fig. 2A) illustrerer en kurve av log kapp vs. pH for log-verdier mellom -3 og -2 (fylte sirkler) for

kat

reaksjonen av den monoklonalt antistoff 30C6-katalyserté reaksjon av reakt ant ligandf orbindelse 3_. Linjen gjennom punktene ble beregnet under anvendelse av ligningen

•pp

<+> aH

Den nedre del (figur 2B) viser en kurve av log k c

obs

. pH for log-verdier mellom -9,5 og -7,0 (fylte trekanter)

r reaksjonen av forbindelse 3_ ekstrapolert til nullbuffer-nsentrasjon. Den beregnede linje ble erholdt under anvend-se av ligningen

KoL- Ko <+><H>oh-C<OH->].

pH-verdier for begge kurver er mellom 5,5 og 8,5. rdier for k^at/ Ka (pKa) , kQ og k0H- er tilveiebrakt i avsnit-t Resultater i det etterfølgende.

Figur 3 er en kurve i to deler lik den i figur 2. Den re del (figur 3A) illustrerer en kurve av log kapp vs. pH for

kat

g-verdier mellom ca. -3 og ca. -1 (fylte sirkler) for reak-onen av den monoklonalt antistoff 27A6-katalyserte reaksjon reaktantligandforbindelse 3_.

Den nedre del av figur 3 (figur 3B) viser kurver av g k0bsd (den observerte hastighetskonstant) vs. pH for log-rdier på ca. -8 til ca. -6 (fylte trekanter) for hydrolyse-aksjonen for forbindelse 3_ katalysert av monoklonalt anti-off 27A6. De fylte kvadrater vedrører log kobSd vs. pH for' .mme reaksjon ekstrapolert til nullbufferkonsentrasjon. Den iregnede linje ble erholdt under anvendelse av ligningen

<k>obsd = k0H- [<0H>~] .

italjert beskrivelse av oppfinnelsen

I. Introduksj on

Foreliggende oppfinnelse angår antistoffmolekyler

.ler molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler ;rav som angis kollektivt som reseptorer eller katalytiske

>lekyler som fremkalles av en haptenisk ligandanalog i struk-ir med en reaktantligand. Den hapteniske ligand etterligner

:rukturen sterisk, men ikke den ioniske ladning av en omvand-.ngstilstand i reaksjonssekvensen for hydrolysen av en ester-.ler en amidbinding av reaktantliganden. De katalytiske mole-

kyler [antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistof f kombinerende sete- (paratopiske) deler] binder til den hapteniske ligand og til reaktantliganden. De katalytiske molekyler er antatt å stabilisere den hydrolytiske omvandlingstilstand til en på forhånd valgt del av reaktantliganden, så vel som å tilveiebringe en ionisk ladet aminosyrerest som bid rar med syre-base- eller nukleofil katalyse til den katalyserte hydrolysereaksjon. Disse molekyler hydrolyserer reaktantliganden katalytisk.

Antistoffer og enzymer er begge proteiner hvis funksjon avhenger av deres evne til å binde spesifikke målmole-kyler. Enzymatiske reaksjoner avviker fra immunologiske reaksjoner ved at i en enzymatisk reaksjon fører bindingen av enzymet til dets substrat typisk til kjemisk katalyse, mens et ikke-katalytisk kompleks vanligvis er resultatet av antistoff-antigenbinding.

Enzymer er antatt å katalysere hydrolysen av proteiner ved kombinering med proteinet for å stabilisere omvandlingstilstanden av hydrolysereaksjonen. Det er generelt antatt at hastigheten av en enzymatisk reaksjon økes i forhold til hastigheten til en ikke-enzymatisk reaksjon på grunn av enzymets evne til å stabilisere omvandlingstUstanden av reaksjonen, dvs. å redusere den frie energi av omvandlingstilstanden, og således den frie aktiveringsenergi av reaksjonen

[Jencks, W.P., Adv. Enzymology, 43_, 219 (1975) og Pauling, L. , Amer. Scientist, 3_6, 58 '(1948)]. Støtte for denne teori kommer fra den observasjon at substanser som er antatt å utforme de antatte omvandlingstUstander, ofte er sterkt bundet til enzymene som konkurrerende inhibitorer. Leinhard, G., Science, 180, 149 (1973) og Wolfenden, R., Acc. Chem. Res., 5, 10

(1972). Det er videre antatt at enzymet bevirker denne nedsettelse av den frie reaksjonsenergi ved binding av omvandlings-tilstandsgeometrien av reaktanten sterkere enn det binder til de(t) tilsvarende substrat(er) eller produkt(er).

Dette betyr at den indre bindingsenergi av enzymet er meget større enn hva som kan måles fra bindingen av substrater eller produkter. Hovedsakelig utnyttes bindingsenergien av enzymet for å utføre den kjemiske reaksjon [Jencks, W.P., XVII

International Solvay Conference (november 1983)].

Det motsatte prinsipp er at et antistoff som fremstilles for optimalt å binde en egnet etterligning av en omvandlingstilstand, vil virke som en katalysator. Demonstra-sjonen av dette resultat avslutter korrelasjonen mellom enzym-funksjon og antistoffstruktur og tilveiebringer en anvendbar løsning på å konstruere kunstige enzymer.

Hovedidéen bak immunologisk hydrolyse beskrevet her, tar i betraktning anvendelse av en haptenisk ligand ved fremkallelse av antistoffer med på forhånd bestemt spesifisitet som (a) preferensielt binder til og derved stabiliserer om-vandl in<g>stUstanden av amid- eller esterbindingshydrolyse ved binding til den spesifiserte reaktantligand, og (b) sannsynligvis tilveiebringer en ionisk ladet syre-base eller nukleofil reaksjons-katalyserende aminosyrerest i det fremkalte, kombinerende sete. En haptenisk ligand som er anvendbar her, simulerer strukturen, men ikke den ioniske ladning av en høyenergi-omvandlingstilstand i amid- eller esterhydrolysen for å fremkalle produksjonen av antistoffer som har evne til å binde beslektede substrater (reaktantligander) og stabilisere deres hydrolyse. Den hapteniske ligand innbefatter også en gruppe som tilveiebringer en ionisk ladning i vandig løsning ved fysiologiske pH-verdier for å fremkalle en motsatt ladet aminosyrerest i det antistoffkombinerende sete. Denne motsatt ladede aminosyrerest er antatt å tilveiebringe den katalytiske effekt til syre-base- eller nukleofilreaksjonen.

Slik preferensiell binding og stabilisering resulterer i en reduksjon i aktiveringsenergien for hydrolysereaksjonen og oppfyller således et kriterium for katalyse. Nærvær av en ladet aminosyrerest i det kombinerende sete kan etterligne de ladede rester som er til stede ved de aktive seter av proteolytiske enzymer slik som serinproteasene. Antistoffer som utviser denne egenskap, kan erholdes ved immunisering med syntetiske haptener som er kjemisk modifisert for å fremkalle en ladet rest så vel som å etterligne bindingskarakteris-tikaene av en substrat-reaktantligand som gjennomgår bindings-hydrolyse; dvs. ved immunisering med en sterisk etterligning av omvandlingstilstanden av den bestemte reaksjon.

Monoklonale antistoffer er blitt vist å katalysere et utall acyloverføringsreaksjoner [(a) Tramontano et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83_:6736 (1986); (b) Tramontano et al., Science, 234:1566 (1986); (c) Jacobs et al., J. Am. Chem. Soc, 109:2174 (1987); (d) Napper et al., Science, 237:1041

(1987); (e) Janda et al., Am. Chem. Soc, 110:4835 (1988); (f) Janda et al., Science, 241:1199 (1988); (g) Janda et.al., Science, 244:437 (1989)], ved anvendelse av hapteniske omvandlingstilstandsmodeller [(Lerner et al., BioAssays, 9:107-122 (1988)]. For å utvide rammen og anleggene til disse hydrolytiske antistoffer eller reseptorer, også angitt som abzymer, må nye strategier utvikles for å fremkalle katalytisk aktivitet i de kombinerende seter av antistoffene. Nylige rapporter har rettet oppmerksomheten mot modifikasjonen av et antistoffs bindende lomme eller sete via enten semi-syntetiske metoder [(a) Pollack et al., Science, 242:1038 (1988), (b) Pollack et al., J. Am. Chem. Soc, 111:1929 (1989)] eller seterettet mutagenese [Baldwin et al., Science, 245:1104 (1989)]. Imidlertid kan generaliteten av slike strategier være redusert på grunn av mangel på tilgjengelige strukturelle data for katalytiske antistoffer. Det ble antatt at en fremgangsmåte som kan fremkalle katalytisk aktive grupper de novo fra et haptenisk antigen, kunne vise seg å være mer fordelaktig fordi man kan utnytte den enorme variasjon av immunresponsen via den somatiske muta-sjonsprosess, for å utføre "in vivo" mutagenese. Resultatene diskutert i det etterfølgende, gjengir en taktikk som frem-kaller en aminosyrerest innen bindingssetet av det fremkalte antistoffmolekyl for å hjelpe til i enhver acyloverførings-reaksjon ved en metodologi som tidligere ble angitt som "lokke og dreie"-katalyse.

Planen her innbefattet anbringelse av en ionisk ladning innen antigenet eller den hapteniske ligandforbindelse

la, (figur 1) i umiddelbar nærhet av den acylgruppe som skulle hydrolyseres. Antistoffene dannet mot dette hapten, er antatt å utvise aminosyrerester ved det kombinerende sete som har en ladning komplementær til denne hapteniske ladning [(a) Press-

man et al., J. Am. Chem. Soc, £8:250 (1946); (b) Pressman et al., J. Am. Chem. Soc, 75_:686 (1953); (c) Grossberg et al., J. Am. Chem. Soc, £2:5470 (1960); (d) Shokat et al., Nature (London), 338:269 (1989)].

I tillegg tilveiebringer forbindelse la til antistoffet en hydroxylisk gruppe som har en tetraedrisk geometri som tjener som en sterisk etterligning eller representasjon av acyloverførings-omvandlingstilstanden. Denne stilling ble holdt uladet slik at det ikke ville være noen ytterligere elektrostatiske effekter.

Benzoatsubstratet eller reaktantligandforbindelsen 3_

(figur 1) svarende til haptenforbindelse la, har lignende steriske dimensjoner (bestemt fra MM2-beregninger), men mangler den positive ladning. Således er den ionisk ladede aminosyrerest som er antatt å være ved det fremkalte, katalytiske antistoffkombinerende sete, fri for ionepardannelse og tjener som en potensiell, generell syre-base- eller nukleofil katalysator .

Den pyridin-hapteniske ligandforbindelse 2_ (figur 1) virker som en kontroll da den er strukturelt identisk med forbindelse la, men mangler methylgruppen og en ladning ved fysiologiske pH-verdier. Ladningskomplementaritet er tidligere blitt anvendt for å fjerne et substratproton i en antistoff-katalysert {3-elimineringsreaksjon, selv om ingen sammenligning ble foretatt med et nøytralt hapten. Shokat et al., Nature (London), 3_38:269 (1989).

Uttrykket "reseptor" er anvendt her for å angi et biologisk aktivt molekyl som binder til en reaktantligand, inhibitorligand eller haptenisk ligand. Reseptor- (katalytiske) molekylene ifølge oppfinnelsen er antistoffer, hovedsakelig intakte antistoffer eller idiotypeholdige polyamid-(paratopholdige) deler av et antistoff.

Biologisk aktivitet av et reseptormolekyl vises ved bindingen av reseptoren til dens antigeniske reaktantligand,

inhibitorligand eller hapteniske ligand etter deres blanding i et vandig medium, ved i det minste fysiologiske pH-verdier og ionestyrker. Fortrinnsvis binder reseptorene også til en antigenisk ligand innen et pH-verdiområde på ca. 5 til ca. 9, og

ved ionestyrker slik som den til destillert vann til den til ca. én molar natriumklorid.

Idiotypeholdige polyamiddeler (antistoffkombinerende seter eller paratoper) av antistoffer er de deler av antistoffmolekyler som innbefatter idiotypen, og binder til reaktantliganden eller den hapteniske ligand. Slike deler innbefatter Fab-, Fab'- og F (ab ')2-fragmentene fremstilt fra antistoffer ved velkjente, enzymatiske spaltningsteknikker. Se f.eks. US patentskrift 4 342 566 tilhørende Theofilopoulos og Dixon, generelt, og spesifikt, Pollack et al. [Science, 234, 1570 (1987)] som har angitt at akselererte, hydrolytiske hastigheter for Fab-fragmenter var de samme som de til nativ lg. Ettersom antistoffene som idiotypeholdige polyamider erholdes fra er beskrevet som å være dannet mot eller fremkalt av immunogener, er idiotypeholdige polyamidreseptorer angitt å være "dannet" eller "fremkalt" med den forståelse at et spalt-ningstrinn typisk er nødvendig for å oppnå et idiotypeholdig polyamid fra et antistoff. Intakte antistoffer foretrekkes imidlertid og anvendes som eksempler på reseptormolekylene ifølge oppfinnelsen.

Reseptorene (katalytiske molekyler) som er anvendbare ved foreliggende oppfinnelse, er fortrinnsvis monoklonale antistoffer eller deler derav. Et "monoklonalt antistoff" er en reseptor fremstilt av kloner av en enkel celle som produserer, og ofte utskiller, bare én type reseptormolekyl. Hybri-domcellen er et eksempel på en slik celle og fusjoneres fra en antistoffproduserende celle og en myelomcelle eller annen selvbevarende cellelinje.

Teknikker for fremstilling av de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen under anvendelse av hybridom-teknikk, er velkjent. Slike reseptorer ble først beskrevet av Kohler og Milstein, Nature, 256, 495 (1975), som er inkorporert her ved referanse. Monoklonale antistoffer erholdes typisk fra hybridomvevkulturer eller fra ascitesvæske erholdt fra pattedyr i hvilke hybridomvevet ble innført. Begge metoder er beskrevet her.

Monoklonale, katalytiske molekyler er foretrukne her på grunn av deres unike spesifisitet til å bindes til en bestemt epitop slik som en bestemt immuniserende, haptenisk ligand og en reaktantligand, så vel som deres relativt høyere spesifikke, katalytiske aktivitet sammenlignet med polyklonale antistoffer. Polyklonale antistoffpreparater kan også anvendes her, men må typisk separeres i fraksjoner som binder til den immuniserende, hapteniske ligand og de som binder til fremmede epitoper slik som de av den antigeniske bærer.

Polyklonale antistoffer som binder til den hapteniske ligand, kan separeres ved affinitetsseparasjon under anvendelse av en haptenisk ligand som affinitetssorbant. Etter blanding og opprettholdelse av et antistoffpreparat med affinitetssorbanten i et tidsrom tilstrekkelig til at egnet immunreaksjon kan finne sted, separeres affinitetssorbanten fra den gjenværende del av antistoffpreparatet.

Den separerte, gjenværende antistoffdel bundet til affinitetssorbanten, inneholder antistoffene som binder til den hapteniske ligand, mens antistoffer i den separerte, gjenværende del av antistoffpreparatet binder til fremmede epitoper. Disse affinitetsbundne antistoffer kan deretter isoleres ved vanlige teknikker for separering av bundne enheter fra affinitetssorbanter, slik som vasking av sorbanten med glycin-hydroklorid ved pH 2.

En "ligand" er her definert som et molekyl eller kompleks som immunreagerer med eller binder til et reseptormolekyl-antistoffkombinerende sete. To prinsipale typer ligand tas her i betraktning. Et første er angitt som en haptenisk ligand og anvendes som et immunogen for å fremkalle fremstilling av reseptormolekyler, som en inhibitor av den reseptormolekyl-katalyserte reaksjon og som et antigen i ELISA eller andre bestemmelser. Den andre er angitt som reaktantligand eller substrat og er det molekyl som gjennomgår den katalyserte reaksjon. Den hapteniske ligand er hovedsakelig inert når det gjelder å gjennomgå den katalyserte reaksjon.

Som beskrevet her, er kjemiske analoger av amid-eller esterreaktantligander blitt syntetisert som haptener som inkorporerer et tetraedrisk carbonatom bundet direkte til en hydroxylgruppe og også direkte til et mettet carbonatom ved et spesifikt, på forhånd bestemt sete for å etterligne strukturen, men ikke den ioniske ladning av omvandlingstilstanden ved hydrolysen av en amid- eller esterbinding av en strukturelt lik eller analog reaktantligand.

Hydrolyse av amidbindingen av polypeptider eller proteiner krever hapteniske ligander som er hovedsakelig frie for hydrolyse når de anvendes som et haptenisk immunogen. Således er en haptenisk ligand som innbefatter det tetraedriske carbon, dets hydroxylgruppe og tilstøtende, direkte bundne, mettede carbonatom, frie for slik mulig hydrolyse.

Korte polypeptidkjeder kan fremkalle produksjon av antistoffer som gjenkjenner og binder til et homologt protein ved et på forhånd bestemt, spesifikt sete. Foreliggende oppfinnelse bringer det tidligere arbeide med polypeptider et vesentlig skritt fremover.

Her er antistoffene (reseptorer) fremkalt av et immuniserende, ioneladningsbærende, haptenisk første molekyl (den hapteniske ligand) og gjenkjenner og binder ikke bare til dette første molekyl, men også til et andre, beslektet molekyl (reaktantliganden) som er fritt for en ionisk ladning ved en analog stilling. Ved binding av dette andre molekyl forårsaker reseptoren hydrolyse (som her er vist å være katalytisk) av en på forhånd valgt ester eller amidbinding som tilsvarer i topologi topologien av det immuniserende, hapteniske første molekyl. Overensstemmelsen i topologi, dvs. størrelse og form, men ikke ionisk ladning, tilveiebringer et middel for forhåndsut-velgelse av setet ved hvilket hydrolyse av liganden finner sted. Inhibitorligander som etterligner strukturen av en haptenisk ligand eller en reaktantligand, bindes også av reseptormolekyler.

Ved syntese av en relativt liten, immuniserende, haptenisk ligand kan man følgelig fremkalle produksjon av reseptormolekyler som gjenkjenner, binder til og katalytisk spalter en ester- eller amidbinding i et annet molekyl som inneholder et flertall av amid- eller esterbindinger. Således kan reseptormolekyler fremstilles som katalytisk hydrolyserer en valgt, på forhånd bestemt amidbinding av et protein eller polypeptid slik som et genetisk konstruert fusjonsprotein, eller en esterbinding av en på forhånd valgt ester i en polyester.

Implikasjonen av dette resultat er at man kan skjekke aktiviteten av hittil ukjente proteaser og esteraser til immunoglobuliner.

II, Omvandlingstilstand av esterolyse og haptenisk ligand-konstruksj on

Konstruksjon av den haptenisk ligand går bakover fra strukturen av de hydrolyseprodukter som skal dannes, gjennom omvandlingstUstanden for bindingsbrytningen som skal etter-lignes, og deretter til den hapteniske ligand. Reaksjoner som innbefatter amid- eller esterhydrolyse, tilveiebringer illustrative eksempler på det generelle konsept og anvendes her som eksempler på en ester- eller amidhydrolysereaksjon.

Transacyleringsprosesser er karakterisert ved carbonyladdisjons-elimineringsmekanismer. Acylgruppen kan derfor utvise varierende grader av tetraedrisk karakter i denne omvandlingstilstand. W.P. Jencks, Catalysis in Chemistry and Enzymology, kapittel 10, (McGraw-Hill, New York, 1969). Enzymene som katalyserer transacyleringsreaksjoner, kan for-ventes å binde godt de analoger av reaktantliganden som har en tetraedrisk konfigurasjon rundt acylsenteret. Dette er tilfelle for serinproteaser hvor en kovalent binding mellom liganden (substrat) og enzymet dannes temporært [Westerik et al., J. Biol. Chem., 247, 8195 (1972); R.C. Thompson, Biochemistry, 12_, 47 (1973) og Imperali et al., Biochemistry, 25, 3760 (1986)], så vel som for enzymer som katalyserer den direkte hydrering av amider eller estere. Den sistnevnte kategori inhiberes av forbindelser med en tetraedrisk konfigurasjon innbefattende en fosfat-, fosfonat- eller fosfonamidatgruppe istedenfor den spaltbare amidenhet [Weaver et al., J. Mol. Biol, 114, 119 (1977) og Jacobsen et al., J. Am. Chem. Soc, 103, 654 (1981)].

Hydrolysen av carboxylsyreestere er et enklere eksempel på transacylering som kommer nær opp til den hapteniske, steriske etterligning av omvandlingstilstanden. Esterhydro-lysereaksjoner forløper generelt ved egnede, spontane hastigheter under omgivende betingelser som er egnet for antistoffer. Derfor kan enhver liten hastighetsakselerering lett på-

vises.

En anvendbar haptenisk ligand inneholder et tetraedrisk carbonatom som er bundet til en hydroxylgruppe, så vel som også er bundet direkte til et mettet carbonatom. Disse atomer etterligner sterisk det tetraedriske carbonatom og bundne oxygenatom eller nitrogenatom (heteroatom) av den hydrolytiske omvandlingstilstand av en carboxylsyreester eller amidbinding, men etterligner ikke den ioniske ladning av omvandlingstilstanden. Således er det tetraedriske carbonatom, dets hydroxylgruppe og direkte bundne, mettede carbonatom ved en stilling i den hapteniske ligand svarende til stillingen til carbonylgruppen så vel som det carbonylbundne heteroatom (oxygen eller nitrogen) av den på forhånd valgte carboxylsyreamid- eller esterbinding som skal hydrolyseres i reaktantliganden. Carbonatomholdige, kjemiske rester som er strukturelt analoge med carbonatomholdige rester av reaktantliganden, bindes til det tetraedriske carbonatom og til det mettede carbonatom slik at de hapteniske ligander og reaktantligandene er strukturelt like eller analoge bortsett fra ved atomene ved hvilke hydrolysen finner sted.

Denne strukturelle, steriske etterligning av det reaktive carbonyl- og oxygen- eller nitrogenatom avviker således fra fosfonat- eller fosfonamidatgruppene eller carbonat-gruppen anvendt av tidligere forskere som analog med den hydrolytiske omvandlingstilstand. Foreliggende steriske etterligning avviker også fra gruppene diskutert i Kim et al.-patentet ved at strukturen i et foreliggende hapten inneholder en lavere valens enn den analoge struktur i substratet og inneholder samme antall bindinger, ikke én eller flere, som den analoge struktur av substratet.

Et hapten som er anvendbart her, innbefatter enn videre en gruppe som bærer en ionisk ladning i vandig løsning ved fysiologiske pH-verdier. Denne ioniske, ladningsbærende gruppe kan være bundet direkte til det ovenfor angitte, tetraedriske carbonatom. Fortrinnsvis er imidlertid den ioniske, ladningsbærende gruppe indirekte bundet til det tetraedriske carbonatom og er lokalisert innen et sfærisk volum definert ved en radius på ca. 7 Ångstrøm (Å) fra det tetraedriske car-

bonatom. Fortrinnsvis er denne radius ca. 2 til ca. 5 Å.

Den ioniske, ladningsbærende gruppe er fraværende fra en tilsvarende stilling i reaktantliganden eller substratet og kan være valgt fra et utall velkjente grupper.

F.eks. innbefatter grupper som bærer en negativ ladning ved fysiologiske pH-verdier, for fremkallelse av en komplementær, positiv ladning i det antistoffkombinerende sete, carboxyl (-COH2), fosfono [-P(OH)20], sulfo (-S03H), fosforo [-OP(OH)0], sulfato (-OSO3H) og lignende. Eksempelvise grupper som bærer en positiv ionisk ladning ved fysiologiske pH-verdier, for fremkallelse av en komplementær negativ ladning i det antistoffkombinerende sete, innbefatter amino (-NH2) , guanidin [-HNC(N)NH2] , mono- og disubstituert amino hvor hver substituent inneholder opp til 10 carbonatomer slik som Ci-C6 lavere alkyl, benzyl, fenyl og nafthyl, eller hvor to substituenter danner en 5- eller 6-leddet ring slik som i morfolin-, piperidin-, pyrrolidin-, substituerte guanidinforbindelser med de ovenfor angitte substituenter, og kvaternære, nitrogen-holdige grupper slik som trisubstituerte ammoniumforbindelser slik som triethylammoniumgruppen eller en kvaternisert, aromatisk ring slik som en substituert kinolinium- eller pyri-diniumring. Hver av de ovenfor nøytralt ladede grupper eksis-terer som en negativt eller positivt ladet, ionisk gruppe i vandig oppløsning ved fysiologiske pH-verdier.

Carboxylgrupper og kvaternære aminer som finnes i heteroaromatiske ringer som tilveiebringer carboxylat- og ammoniumioner, er foretrukne. Kvaternære aminer, enten kvaternisert med fire substituentgrupper eller ved protonering, og enten tilstedeværende i acyklisk form eller i cyklisk form som en del av en ring slik som i en N-methylpyridiniumrest, betraktes alle å høre til klassen av ammoniumgrupper når ioniske, ladningsbærende grupper diskuteres.

Der gruppen som bærer en ionisk ladning ved fysiologiske pH-verdier er en del av en annen gruppe som er bundet til det ovenfor angitte, tetraedriske carbonatom, slik som i tilfelle av det kvaternære nitrogenatom av N-methylpyridiniumfor-bindelsen anvendt illustrativt her i forbindelse la, anses den ioniske, ladningsbærende gruppe å være det kvaternære nitrogenatom av pyridiniumringen. Den ioniske, ladningsbærende gruppe i en slik struktur er således bundet indirekte til det tetraedriske carbonatom, og atomet av denne ioniske, ladningsbærende gruppe som bærer den ioniske ladning, dvs. et kvaternært nitrogenatom, er separert fra dette tetraedriske carbonatom med minst ett atom, fortrinnsvis et carbonatom. Et molekyl slik som et glycolsyrederivat, inneholder den ioniske gruppe bundet direkte til det tetraedriske carbonatom og dets hydroxylgruppe.

Reaktantliganden er strukturelt analog (lik) den hapteniske ligand og vice versa, men en reaktantligand er fri for den ovenfor diskuterte gruppe som bærer en ionisk ladning i vandig oppløsning ved fysiologiske pH-verdier som er lokalisert i en stilling strukturelt analog med lokaliseringen av denne gruppe i den hapteniske ligand. Således inneholder den illustrative, hapteniske ligandforbindelse la N-methylpyri-dinium-kvaternært nitrogen, mens den illustrative substrat-ligandforbindelse 3_ inneholder en nøytralt ladet fenylring og dens carbon- og hydrogenatomer ved den tilsvarende stilling.

Den hapteniske ligand og/eller reaktantliganden (substrat) kan også innbefatte én eller flere ytterligere grupper som bærer en ionisk ladning i vandig oppløsning ved fysiologiske pH-verdier. Disse ioniske, ladningsbærende grupper kan være i tilsvarende eller ikke-tilsvarende lokaliseringer i de to typer ligandmolekyler. I tillegg kan en slik ytterligere ionisk ladet gruppe eksistere innen det samme sfæriske volum definert for den ovenfor beskrevne, ioniske, ladningsbærende gruppe.

Nærvær i den ene eller andre eller både den hapteniske ligand og reaktantliganden av én eller flere ionisk ladede grupper i tillegg til minst én slik ionisk ladet gruppe diskutert tidligere, kan også være anvendbar for å lette binding av et hapten til det kombinerende sete av katalysatormolekylet. Dette er særlig tilfelle hvor et relativt lite hapten slik som de som er illustrert her, anvendes.

Eksempelvis har studier med dextraner vist at maksimal binding av anti-dextran-antistoffer oppstår med dextraner inneholdende 6 eller 7 glucoserester. Studier med polyalanin-oligomerer har vist maksimal binding ved en størrelse på 4 til 6 aminosyrerester. Chapman et al., Microbiology, 2. utg. kapittel 16, s. 444-447. Mindre oligomerer binder mindre godt, og hvor glucose ikke utviser noen binding.

Ved således å tilveiebringe den ene eller begge ligander med én eller flere adderte, ioniske ladninger, kan dette medhjelpe til binding av det katalytiske antistoffkombinerende sete i en ladningskomplementering så vel som ved strukturell tilpasning hvor en ligand er mindre enn den fulle størrelse som kan rommes av bindingssetet.

Således inneholder den hapteniske ligand minst én gruppe som tilveiebringer en ionisk ladning i vandig oppløs-ning ved fysiologiske pH-verdier slik som et amin, kvaternært nitrogenatom eller carboxylgruppe som tilveiebringer en ammon-iumgruppe eller en carboxylatgruppe. Denne ladede gruppe er innen det definerte, sfæriske volum og er fraværende fra en tilsvarende stilling i reaktantliganden.

Som allerede angitt, er det sfæriske volum innen hvilket minst den ene ioniske, ladningsbærende gruppe er lokalisert i den hapteniske ligand, definert ved en radius på ca. 7 Å fra det tetraedriske carbonatom, og er mer fordelaktig innen et volum definert ved en radius på ca. 2 til 5 Å fra dette tetraedriske carbonatom. Slike sfæriske volumer og radier kan beregnes under anvendelse av dataprogrammer som er velkjente innen faget eller ved anvendelse av molekylær-modeller.

Det skal forstås at anbringelse av den i det minste ene ioniske, ladningsbærende gruppe i den hapteniske ligand er slik at den presumptivt fremkalte komplementære, ladede aminosyrerest av det antistoffkombinerende sete, har adgang til carbonylgruppen og dens bundne oxygen- eller nitrogenatomer av esteren eller amidet som skal hydrolyseres. Sagt på en annen måte, er den ioniske, ladningsbærende gruppe av den hapteniske ligand ikke sterisk hindret fra det tetraedriske carbonatom, dets hydroxylgruppe og tilstøtende, mettede carbonatom.

En anvendbar reaktantligand er representert ved strukturen hvori R<1> og R2 representerer carbonatomholdige, kjemiske rester, og -X- er -0- eller -NR<3>, hvori R<3> er hydrogen eller en tredje carbonholdig, kjemisk rest.

R<1> og R<2> kan være like eller forskjellige. Hver gruppe kan være en aminosyrerest, et polypeptid eller protein, så vel som et organisk radikal slik som en alifatisk eller substituert alifatisk, rettkjedet eller forgrenet, åpenkjedet eller cyklisk rest, innbefattende en cyklisk eller åpenkjedet heteroatomholdig rest, og kan også være en aromatisk, substituert aromatisk, heteroaromatisk eller substituert heteroaromatisk rest. Så lenge som reaktantliganden kan oppløses i et vandig medium som ikke vesentlig inhiberer virkningen av katalysatormolekylet og er stort nok til å bindes av katalysa-toren, kan de spesifikke strukturer av R<1> og R<2> være hovedsakelig hvilke som helst carbonholdige, kjemiske rester.

Når den er forskjellig fra hydrogen (H), kan R<3> også være hovedsakelig en hvilken som helst carbonholdig, kjemisk rest, slik som tilfellet med R<1> og R<2>.

En haptenisk ligand er strukturelt analog (lik) med reaktantliganden. En haptenisk ligand er representert ved strukturen

hvori R<1>' og R<2>' betegner carbonatomholdige rester som er strukturelt analoge (like) med henholdsvis R<1> og R2, og R<3>' er strukturelt analog (lik) med R<3> når -X- er -NR<3->. Når -X- er - 0-, er R<3>' hydrogen. Minst én av R<1>' og R2' tilveiebringer også den gruppe som bærer en ionisk ladning i vandig oppløsning ved fysiologiske pH-verdier som er fraværende i reaktantliganden, og denne gruppe er innen det tidligere diskuterte, sfæriske volum.

I foretrukket praksis er medlemmene av R-gruppeparene R<1> og R<1>', R2 og R<2>', R3 og R3' så strukturelt analoge at R<1> og

R<1>' er hovedsakelig identiske, R2 og R<2>' er hovedsakelig identiske og R<3> og R<3>' er hovedsakelig identiske, bortsett fra når -X- er -0-. I denne foretrukne situasjon er forskjellene mellom de likt nummererte par av R-grupper slik at den hapteniske ligand inneholder den ioniske, ladningsbærende gruppe som ikke er til stede i reaktantliganden, og den hapteniske ligand innbefatter også et atom eller gruppe som anvendes for å kjede den hapteniske ligand til et antigenisk (immunogenisk) bærermolekyl under dannelse av et immunogenisk konjugat som diskutert i det etterfølgende.

Bortsett fra de ovenfor angitte forskjeller er således de likt nummererte, parede grupper fortrinnsvis av samme størrelse, form, ladning og grad av umettethet. Hvor størrel-sen av de likt nummererte, parede R-grupper avviker, foretrekkes det at den hapteniske ligand har større størrelse enn reaktantliganden slik at den mindre reaktantligand kan rommes innen det fremkalte, katalytiske bindingssete.

Strukturene av de illustrative, hapteniske ligander og reaktantligander anvendt for denne undersøkelse, ble valgt i henhold til visse kriterier. Disse innbefattet tilgjengelig-het og stabilitet av de tetraedriske, carbonatomholdige for-løpere, det tilsvarende carboxylsyreamid- eller estersubstrat, egnetheten av den kjemiske syntese for dens fremstilling og tilpasningsevnen til forskjellige skjemaer for immunologisk presentasjon. Ved innbefattelse av aminosubstituenter i de aromatiske ringer kan f.eks. enten den benzyliske eller fenoliske gruppe tilveiebringes med et funksjonelt vedheng for kobling til immunogeniske bærerproteiner for haptenisk presentasjon. III. Katalytiske, antistoffproduserende celler og metoder

Celler som når de dyrkes i et egnet medium produserer monoklonale katalysatormolekyler (antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler) som katalytisk hydrolyserer en på forhånd valgt carboxylsyreamid-eller esterbinding av en reaktantligand, tas også i betraktning her. Disse celler utskiller fortrinnsvis også de ovenfor angitte molekyler i deres kulturmediummiljø, enten dette kulturmediummiljø er in vitro eller in vivo. I en foretrukket utførelsesform er disse celler hybridomceller slik som hybridom 30C6.

Generelt fremstilles slike katalysatormolekyl-produserende celler ved immunisering av et laboratoriedyr slik som en mus, rotte, geit eller hest med et immunogen som inne-holderen antistoffremkallende mengde av en tidligere beskrevet, haptenisk ligand. Typisk er immunogenet et konjugat av den hapteniske ligand og en antigenisk (immunogenisk) bærer, som diskutert i det etterfølgende.

Det således immuniserte dyr bevares i et tidsrom tilstrekkelig til at dyret får utskille antistoffer som immunreagerer med den hapteniske ligand. ELISA-bestemmelsen diskutert i det etterfølgende, er anvendbar for å bestemme nærvær av en krevet immunreaksjon.

Gener som koder for antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler derav fra antistoffproduserende celler av det ovenfor bevarte dyr, slik som splenocytter, overføres til vertceller. Denne genover-føring danner hybridceller som inneholder gener fra minst to kilder. Hybridcellene produserer antistoffmolekylene eller antistoffkombinerende setedeler fra de overførte gener når de dyrkes på riktig måte, og kan dyrkes hovedsakelig ubegrenset, i forhold til de antistoffproduserende celler fra hvilke genet er blitt overført. Eksempelvise celler som kan dyrkes hovedsakelig ubegrenset i forhold til de genoverførende celler, innbefatter hybridomceller, E. coli-celler, gjærceller slik som S. cerevisiae, transformerte pattedyrceller slik som CHO-celler og lignende.

De således fremstilte hybridceller dyrkes i et egnet kulturmedium, f.eks. in vivo eller in vitro, i et tidsrom tilstrekkelig til at disse dyrkede hybridceller får produsere antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler derav, hvilke molekyler deretter gjenvinnes. Eksempler på in vivo og in vitro kulturbetingelser for hybridomceller er diskutert her og er velkjente, slik som dyrkningsbetingelser for celler slik som E. coli, S. cerevisiae, CHO og lignende.

De gjenvundne molekyler screenes deretter for å identifisere en hybridcelle som produserer molekyler som katalytisk hydrolyserer den på forhånd bestemte carboxylsyreamid-eller esterbinding av reaktantliganden. Så snart en slik hybridcelle er blitt identifisert, dyrkes flere kloner av denne hybridcelle.

Den ovenfor angitte fremgangsmåte omfatter hybridom-fremstilling, en metode velkjent innen faget, og denne er diskutert i detalj her. Det er også kjent innen faget at gener som koder hovedsakelig bare for den antistoffkombinerende setedel av et antistoffmolekyl, kan overføres fra en pattedyr-celle til en annen, og den ovenfor beskrevne prosess er også beregnet på å innbefatte slike prosesser. Den ovenfor beskrevne prosess er også beregnet på å omfatte metoden ifølge Shastry et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 86:5728 (1989) og Huse et al., Science, 246:1275 (1989), hvis beskrivelser er inkorporert her ved referanse, hvori molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler, produseres i ikke-pattedyr-organismer slik som E. coli ved anvendelse av genetiske kon-struksjonsteknikker. De overførte gener i disse publikasjoner var et resultat av anvendelse av mRNA fra hybridomer eller miltene til immuniserte dyr for å fremstille gener som koder for VH- eller Fab-antistoffdeler som ble uttrykt i E. coli-celler.

I et annet metodeaspekt ved foreliggende oppfinnelse blandes en katalytisk mengde av de monoklonale antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler derav (katalytiske molekyler) produsert av slike celler, med reaktantligandmolekyler i et vandig medium under dannelse av en reaksjonsblanding. Den således dannede reaksjonsblanding opprettholdes i et tidsrom tilstrekkelig til at reaktantligandmolekylene får binde til de katalytiske molekyler, og til at de katalytiske molekyler får hydrolysere den på forhånd valgte binding katalytisk. Et produkt av hydrolysereaksjonen kan, om ønsket, gjenvinnes.

Denne hydrolytiske metode ifølge oppfinnelsen an-vender et vandig medium som en del av reaksjonsblandingen. Dette medium inneholder typisk vann og buffersalter. I tillegg kan mediet inneholde andre salter slik som natriumklorid, så vel som vannløselige kalsium- og magnesiumsalter som hyppig finnes i proteinholdige medier. Organiske løsningsmidler slik som methanol, ethanol, acetonitril, dimethylsulfoxyd, dioxan, hexamethylfosforamid og N,N-dimethylformamid, kan også være til stede. Overflateaktive midler som emulgerer reaktantliganden og reseptormolekylet, kan også være til stede. Det krit-iske trekk ved bestanddelene som er til stede i det vandige medium, er at disse bestanddeler ikke interfererer vesentlig med eller inhiberer den katalytiske reaksjon slik som ved de-naturering av det katalytiske molekyl. I tillegg er det vandige medium hovedsakelig fritt for salt, proteiner generelt og enzymer spesifikt, som inhiberer den bindingsoppbrytende reaksjon katalysert av det katalytiske molekyl.

Det vandige medium har typisk en pH-verdi på ca. 5 til ca. 9, og fortrinnsvis ca. pH 6,0 til 8,0. pH-verdier større og mindre enn disse angitte verdier kan også anvendes så lenge som den katalyserte reaksjon igjen ikke interfereres eller inhiberes vesentlig.

De katalytiske reaksjoner utføres typisk ved omgivende romtemperatur, dvs. ved ca. 20 til ca. 25°C, eller ved 3 7°C, og ved omgivende atmosfæretrykk, dvs. ved ca. én atmos-fære. Imidlertid kan temperaturer ned til ca. frysepunktet for det vandige medium og opp til ca. kokepunktet for mediet ved atmosfæretrykk også anvendes. Som kjent, er proteiner slik som de foreliggende, katalytiske molekyler, tilbøyelige til å denaturere ved forhøyede temperaturer slik som de ved hvilke et vandig medium koker, f.eks. ved ca. 100°C, og temperaturer under ca. 40°C er således foretrukne.

Reaktantliganden er til stede i en reaksjonsblanding i en mengde opp til dens løselighet i det vandige medium. Et tofasesystem som innbefatter uløselig reaktantligand, kan også anvendes, men anvendes normalt ikke. Normalt anvendte konsentrasjoner av reaktantliganden er ca. 0,1 mikromolar (uM) til ca. 10 millimolar (mM), og hvor denne mengde også er en funksjon av løseligheten av reaktantliganden i det vandige medium. Hvor produktet er ønsket per se, anvendes relativt høyere konsentrasjoner sammenlignet med lavere konsentrasjoner hvor en

reaksjonsmekanisme eller reaksjonskinetikk skal studeres.

En katalytisk effektiv mengde av de katalytiske molekyler er også til stede. Således anvendes de katalytiske molekyler typisk i et molarforhold til reaktantliganden på ca. 1:2 til ca. 1:10.000, hvor et molarforhold på ca. 1:10 til ca. 1:100 er foretrukket.

Forholdet mellom katalytiske molekyler og reaktantligand avhenger typisk av den spesifikke aktivitet av de katalytiske molekyler mot reaktantliganden og formålet for brukeren ved utførelse av reaksjonen. Hvor således produktet er ønsket, anvendes en relativt høyere konsentrasjon av katalytiske molekyler, og et høyere forhold mellom katalytiske molekyler og reaktantligand. Hvor reaksjonsmekanismen eller kinetikken ved reaksjonen skal studeres, anvendes typisk en lavere konsentrasjon og forhold. En støkiometrisk mengde av katalytiske molekyler eller mindre kan også anvendes, men da katalytiske molekyler anvendes, kan anvendelse av til og med en støkiometrisk mengde være uøkonomisk.

Varigheten av reaksjonsoppholdstidsperioden er en funksjon av flere parametere innbefattende de katalytiske molekyler og valgte reaktantligand, deres konsentrasjons-pH-verdi og -temperatur, så vel som hva som etterstrebes fra reaksjonen. Hvor kinetikkstudier skal utføres, støter man ofte på oppholdstider på minutter til timer. Hvor reaksjonsproduk-ter er ønsket, er oppholdstider på timer til dager mer vanlig.

IV. Resultater

Hapteniske ligandforbindelser la og 2 ble syntetisert i henholdsvis fem og fire trinn ved å starte fra 4-nitrofenethylbromid som beskrevet i det etterfølgende. [Alle nye forbindelser utviste tilfredsstillende spektroskopisk (NMR, IR) og forbrenningsanalyse (± 0,3%)]. Begge hapteniske ligandforbindelser la og 2 ble koblet (via N-hydroxysuccinimid-esteren) til bærerproteinene kvegserumalbumin (BSA) og albuskjellhemocyanin (KLH) under dannelse av immunogene konjugater. 12 9GlX+-mus ble immunisert med KLH-konjugatet av forbindelse la og 2, og antistoffer ble dannet og screenet som beskrevet her. [(a) Kohler et al., Nature (London), 256:495

(1975); (b) Enguall, Method Enzymol., 70:419 (1980)].

Immunisering med haptenisk ligand la produserte 23 hybridomer, mens haptenisk ligandforbindelse 2 ga 21 hybridomer som bandt til de respektive haptener. Alle monoklonale antistoffer var av IgG-klassen og ble renset fra ascitesvæske ved anionbytterkromatografi etterfulgt av affinitetskromatografi på en protein G-kolonne. Antistoffer ble bedømt til å være homogene med natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelek-trof orese .

Monoklonale antistoffer ved en konsentrasjon på 20 uM ble først screenet (fosfatbuffer 50 mM, pH 7,5, 100 mM NaCl, 37°C) mot benzoatesterreaktantligandforbindelse 3, (500 uM) for produksjon av 5-[[4-(hydroxy)fenyl]amino]-5-oxopentansyre, forbindelse 4. [Analyse ble utført via HPLC på en RP-Cl8-kolonne eluert med vann: acetonitril (op:10) til en strømning på 1 ml/min. med UV-detektor innstilt på 254 nm. Hydrolyseproduk-tet, forbindelse 4 (figur 1; retensjonstid 7 minutter) ble oppsamlet (gjenvunnet) og funnet å være identisk ved RP-HPLC-koinjeksjon og massespektralanalyse med en autentisk prøve].

Fra de tjuetre monoklonale antistoffer erholdt mot

haptenisk ligandf orbindelse la^, ble syv funnet å være katalytiske. Ingen av antistoffene mot haptenisk ligandforbindelse 2 utviste noen tendens til å akselerere hydrolysehastigheten av reaktantligandesteren, forbindelse 3_.

De syv antistoffer som ble funnet å være katalytiske, ble fullstendig inhibert ved tilsetning av fri haptenforbindelse Ib. Slike resultater antyder at katalyse etterfølger binding av substratet i den antistoffbindende lomme eller kombinerende sete.

Mest signifikant var det overveldende antall katalytiske antistoffer fremkalt av haptenisk ligandforbindelse la vs. forbindelse 2. Ett av disse syv katalytiske antistoffer betegnet hybridom og monoklonalt antistoff 30C6, ble karakterisert i detalj.

Den første hydrolysehastighet av substrat- eller reaktantligandforbindelse 3 (50 mM fosfat, 100 mM NaCl, pH 7,2, 37°C) katalysert av monoklonalt antistoff 30C6 (20 uM), fulgte Michaelis-Menten-kinetikken [konsentrasjoner av hydro-lyseproduktforbindelse 4 ble bestemt ved HPLC-målinger av dets topphøyde i forhold til den til en indre standard i løpet av 1-2 timer (3 eller flere bestemmelser)]. En standardkurve viste linearitet med konsentrasjoner av hydrolyseproduktfor-bindelse 4 opp til 0,5 mM) med verdier for kapp og Kj, på 5

kat

0,2 x 10"<3> min"<1> og 1,12 + 0,05 mM. Den antistof f katalyserte hydrolyse av benzoatreaktantligandforbindelse 3 ble konkurrerende inhibert ved tilsetning av

pyridiniumsaltforbindelse lb.

pH-avhengigheten av hydrolysen av substratforbindelse 3 ble undersøkt i nærvær av monoklonale antistoffer 30C6 (20 uM) mellom pH 6,0 og 7,2 (Bis-tris) og 7,2-8,0 (fosfat), begge til 50 mM buffer og 100 mM NaCl, 37°C (figur 2). pH-avhengig-heten av kapp røper deltagelse av den basiske form av en dis-kat

sosierbar gruppe hvis pKa ble bestemt å være 6,2 6 ± 0,05 (figur

2A). Variasjon av bufferionkonsentrasjonen (12,5-50 mM) viste ingen avhengighet av kkat av nærvær av bufferarter.

For direkte sammenligning ble hydrolysehastighetene (k c ) av reaktantligandforbindelse 3_ over den identiske

obs

pH-region ekstrapolert til null-bufferkonsentrasjon (figur 2B)

også målt. pH versus hastighetsprofilen innebar at artene (Bruice et al., Bioorganic Chemistry; Benjamin: New York, 1965; vol. 1) involvert i spaltningen, var vann i pH-regionen på 6,0 til 6,5 (k0 = 0,6 x 10"<9> min"<1>) og hydroxyd fra pH 6,6 og oppover (k0H- = 4,2 x 10"<2>min"<1>) .

Forholdet kkat/k0/ en sammenligning mellom den pH-uav-hengige, antistoffkatalyserte hydrolysehastighet av substratforbindelse 3_ og denne hydrolyse i vann, svarer til en hastig-hetsakselerasjon av antistoffet på over en million ganger. Signifikant var pH-optimumet av den antistoffkatalyserte reaksjon blitt beveget inn i den nøytrale pH-region ved deltagelse av en hittil ikke identifisert aminosyrerest som sannsynligvis er negativt ladet.

Haptenforbindelser 5a og 6 ble syntetisert ved å starte med 4-nitrofenethylbromid som diskutert i det etterføl-gende. Dimethylaniliniumantigenforbindelse 7 ble fremstilt ved å starte med 4-aminobenzylalkohol som også diskutert senere. Konjugat av forbindelse 5a, 6 og 7 produserte henholdsvis 18, 22 og 26 hybridomer hvor alle disse monoklonale reseptormolekyler var av IgG-klassen.

Antistoffer ved en konsentrasjon på 20 uM ble først screenet (fosfatbuffer, 50 mM, pH 7,5, 100 mM NaCl, 37°C) via en HPLC-bestemmelse mot benzoatesterforbindelse 3_, (500 uM) for produksjon av 5-[(4-hydroxyfenyl)amino]-5-oxopentansyre, forbindelse £. Fra de 18 monoklonale antistoffer erholdt mot forbindelse 5a, ble tre funnet å være katalytiske. De 22 og 26 antistoffer erholdt fra immuniseringer med haptenforbindelser 6 og 1_, utviste en neglisjerbar eller en inhiberende effekt på den spontane hydrolysehastighet av forbindelse 3_. De tre antistoffer som ble funnet å være katalytiske, ble fullstendig inhibert av nærværet av 50 uM av carboxylatforbindelse 5b.

Kinetikken for det mest effektive katalytiske antistoff, den monoklonale reseptor utskilt av hybridom 27A6 erholdt fra immuniseringer med haptenforbindelse 5a, ble karakterisert i detalj. Denne monoklonale reseptor er også angitt som reseptor eller antistoff 27A6. Den opprinnelige hydrolysehastighet av forbindelse 3_ [50 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-pipera-zinpropansulfonsyre (EPPS), 100 mM NaCl, pH 8,5, 37°C] katalysert av reseptor 27A6, fulgte Michaelis-Menten-kinetikken med verdier for Kapp og Kn, på 0,01 ± 0,002 min"<1> og (243

kat

15) X10"<6> M. Den antistoffkatalyserte hydrolyse av benzoatfor-bindelse _3 ble konkurrerende inhibert (Kj. = 6 ± 2 uM) ved tilsetning av carboxylatforbindelse 5b.

pH-avhengigheten av hydrolysen av forbindelse 3_ ble undersøkt i nærvær av monoklonal reseptor 27A6 (20 uM) mellom pH 7,2-8,4 (EPPS) og pH-verdier 8,4 og 10,0 [2 -(cyclohexyl-amino)ethansulfonsyre (CHES)], både 50 mM buffer og 100 uM NaCl, ved 37°C (figur 3). pH-avhengigheten av log Kapp (figur

kat

3A) var lineær i denne region, slik som bakgrunnshastigheten av hydrolysen (log Kobsa; figur 3B, fylte trekanter) og hydro-

lysehastigheten for forbindelse 3_ ekstrapolert til null-buf-f erkonsentrasjon (Kqh- = 2, 3X10"2 min"<1>) (figur 3B, fylte kvadrater) . Variasjonen av bufferkonsentrasjonen (12,5-50 mM) i nærvær av monoklonal reseptor 2 7A6 indikerte ingen avhengighet av Kapp på konsentrasjonen av bufferarter. Det var ingen for-kat

skjell i de observerte hastigheter med monoklonal reseptor 27A6 når de ble utprøvet ved pH 8,6 i EPPS og CHES (50 mM buffer, 100 mM NaCl).

Den esterolytiske aktivitet av monoklonal reseptor 2 7A6 var upåvirket ved behandling med diethylpyrocarbonat eller maleinsyreanhydrid i 50-dobbelt molart overskudd til protein. Lignende behandling med fenylglyoxal resulterte i 75% tap av katalytisk aktivitet. Dette samme antistoffpreparat utviste også et firedobbelt fall i titer (binding til haptenforbindelse 5b) som observert ved ELISA. Identisk behandling av proteinet i nærvær av inhibitorforbindelse 5b (femdobbelt molart overskudd til protein) resulterte i bare 3 5% tap av katalytisk aktivitet og ingen merkbar forandring i titer.

På grunn av disse observasjoner ble andre katalytiske og ikke-katalytiske antistoffer mot haptenforbindelser 5a, 6 °9 2. kjemisk modifisert med fenylglyoxal på nøyaktig samme måte som beskrevet ovenfor. Antistoffer mot forbindelse 6 (2G4, 4E3, 6H4, 6A11) og 7 (52D11, 57G12, 70F3, 5G3, 60A4) var upåvirket (ELISA). Derimot utviste fem antistoffer fremkalt under anvendelse av forbindelse 5a (57G11, 60A4, 52D11 og 5G3), alle samme tap av binding (ELISA). De katalytiske antistoffer 57G11 og 70F3 utviste en firedobbelt reduksjon i titer, og antistoffene 60A4, 52D11 og 5G3 utviste en tre-, to-og en-ganger reduksjon i titer.

Den tidligere diskuterte strategi basert på anvendelse av antistoffer som ble fremkalt fra en homolog serie av

haptener (figur 1) som hver utviste en punktladning i umiddelbar nærhet med, eller i direkte substitusjon for, den kjemiske gruppe (ester eller amid) som skulle omdannes i det respektive substrat (figur 1), har vist seg å være effektiv. Det ble antatt at antistoffer dannet mot disse haptener, skulle utvise aminosyrerester ved det antistoffkombinerende eller bindende

sete med en ladning komplementær til den hapteniske ladning. Substratesterforbindelse 3_ mangler denne ladning, men bibe-holder en helt lik struktur. Etter binding av forbindelse 3_ er således aminosyreresten(e) ved bindingssetet fri for sin opprinnelige ladningsstabiliserende rolle og kan nå tjene som et potensielt, generelt syre/base- eller et omvandlingstil-standsstabiliserende element.

Selv om antistoff-haptenladningskomplementaritet ble antatt å være essensiell for den fulle vellykkethet av pro-sjektet, ble to andre områder vedrørende haptenutforming antatt å være viktige. Den første var erstatning av acylfunk-sjonaliteten som skulle hydrolyseres, mens den andre nødven-diggjorde anvendelse av uladede haptener.

Det første punkt ble tatt fatt på ved anvendelse av en egnet acylgruppeisoster. En hydroxylisk gruppe som har en tetraedrisk geometri som tjente som en adekvat representasjon på den utviklende omvandlingstilstand, ble anvendt. Denne stilling ble med hensikt gjort uladet slik at det ikke ville være noen ytterligere elektrostatiske effekter. Imidlertid kan det forutses at "andre generasjons haptener" kan innbefatte en ladet fosforgruppe ved denne stilling som beskrevet i US patentskrift nr. 4 629 567 og publisert Europapatentsøknad nr. 0 260 439A2. De uladede haptener [dvs. forbindelsene 2 og 6 (figur 1)] var nødvendige som kontroller for å sikre riktig-heten av hypotesen da disse virkelig er strukturelt identiske med forbindelsene 1 og 5_, men uten ladning.

De ovenfor angitte resultater viste at "lokke og dreie"-strategien som katalyserer acyloverføringsreaksjoner, er anvendbare når N-methylpyridiniumsaltforbindelsen la ble anvendt for antistoffremkalling. Med dette hapten var 30% av de erholdte, monoklonale antistoffer katalytiske. Selv om dette antall var imponerende, var den observasjon mer interessant at én av disse reseptorer anvendte deltagelse av en bas-isk form av en ioniserbar gruppe (pKa = 6,26 + 0,05) i den katalytiske prosess. I tillegg var pH-optimumet for den antistof f katalyserte reaksjon nær nøytralitet, og anvendelse av nøytral haptenf orbindelse 2_ utviste ingen tilbøyelighet til å fremkalle katalytiske antistoffer.

Haptenforbindelse 7 ble fremstilt som diskutert i det etterfølgende. Det mest merkbare trekk ved dette molekyl er den tetraedriske, kationiske ladning som direkte erstatter acylcarbonet av substratet. Selv om dette hapten kan betraktes som et mer radikalt avvik fra de typiske fosfonathapten-surrogater ifølge faget, kan det rette oppmerksomheten mot et uta ll tidligere ubesvarte spørsmål angående "lokke og dreie"-strategien. To av betydning er viktigheten av den kationiske ladning innbefattende dens plassering i forhold til den spaltbare binding av substratet og relevansen av foreliggende acyl-carbonerstatning med hydroxyisosteren.

Fra de 26 antistoffer dannet mot haptenf orbindelse 1_ > ble ingen funnet å akselerere hydrolysehastigheten i merkbar grad over bakgrunnshastigheten. Dette resultat var ganske interessant i lys av det faktum at et lignende antigen utformet av Schultz-forskergruppen utviste en stor tilbøyelighet (66%) til å fremkalle katalytiske antistoffer for en elimineringsreaksjon [Shokat et al., Nature (London), 338:269 (1989)]. Selv om reaksjonene her er fullstendig forskjellige, fant Schultz-gruppen overbevisende bevis for at et carboxylat var involvert i den katalytiske prosess slik som det ble funnet under anvendelse av methylpyridiniumhaptenforbindelsen 1 for å fremkalle antistoffer for en esterolytisk reaksjon. Disse resultater forbundet med observasjonene for antistoffer erholdt mot haptenforbindelser la og 2, antyder følgende: (1) hastig-hetsøkningene som ses med monoklonale reseptorer fremkalt fra haptenf orbindelse la., skyldes ikke bare nærvær av et carboxylat som virker som en katalytisk base. (2) Funksjonaliteten i haptenet som anvendes for å representere omvandlingstilstanden, er kritisk. (3) Kombinasjonen av en kationisk ladning og minst en nøytral representasjon av omvandlingstUstanden, er nødvendig for å fremkalle hydrolytiske reseptormolekyler.

En total prosess lik den oppnådd under anvendelse av kationisk haptenforbindelse la, ble frembrakt under anvendelse av et strukturelt lignende anionisk hapten. Benzosyrehapten-forbindelse 5a oppfylte de nødvendige krav. Ryggraden av forbindelse 5a var homolog med haptenf orbindelser la og 2, mens den utviste et anionisk ladningspunkt i umiddelbar nærhet til den acylgruppe man planla å hydrolysere. Valget av en carboxylatgruppe var basert på observasjonene foretatt av Pressman som indikerte at denne type funksjonalitet innen et haptenisk molekyl har en sterk tilbøyelighet til å fremkalle en positivt ladet aminosyre (dvs. lysin eller arginin) innen den antistof f bindende lomme [(a) Pressman et al., J. Am. Chem. Soc, £8:250 (1946); (b) Pressman et al., J. Am. Chem. Soc, 75:686

(1953); (c) Grossberg et al., J. Am. Chem. Soc, 82:5470

(1960)]. Det ble antatt at enhver aminosyrerestsidekjede kunne hjelpe til i den katalytiske prosess via generell syre- eller elektrostatisk stabilisering av en omvandlingstilstand. Den sistnevnte prosess innbefattende argininrester, er blitt involvert i enzymkatalyse [(a) Riordan et al., Science, (Washington, D.C.) 195:884 (1977); (b) Cotton et al., Proe Nati. Acad. Sei., USA, 7£:2551 (1979); (c) Springs et al., Tet. Lett., £2:3223 (1977).

Hydroxyethylbenzosyreforbindelsen 5b ble syntetisert. Forbindelsen ble utstyrt med N-hydroxysuccinimidester slik som forbindelse 5a for enkel kobling til proteinbæreren. Immuniseringer til forbindelse 5a-KLH-konjugatet frembrakte atten monoklonale antistoffer hvor tre av disse var katalytiske, og hvis katalyse ble inhibert av fri haptenforbindelse 5b. Selv om antallet katalytiske reseptorer fremkalt av forbindelse 5a ikke var så stort som med forbindelse la, var det gledelig å finne at ingen av de tjueto monoklonale antistoffer fremkalt av den nøytrale homolog (forbindelse £) av forbindelse la. og 5a, var katalytiske. Igjen kan betydningen av den ladede funksjonalitet inneholdt innen antigenkonstruksjonen, ses.

Observasjoner av pH-hastighetsprofilen av monoklonal reseptor 30C6 (fremkalt fra forbindelse la.) indikerte at den basiske form av en dissosierbar gruppe var involvert i kata-lysen. Også observert var uavhengigheten av Kapp av konsen-

kat

trasjonen av disse prøvene, slik som de ble funnet med monoklonal reseptor 2 7A6 som var fremkalt av forbindelse 5a (figur 1). I motsetning til adferden til reseptor 30C6 var observasjonene av en pH-avhengighet av Kapp med reseptor 2 7A6 (figur kat

3A). Selv om denne observasjon synes å være i strid med kjer-nen av "lokke og dreie"-teorien, er det antatt at pKa av de kombinerende sete-aminosyrerestsidekjeder kan ligge utenfor det undersøkte pH-område, eller at protein-substratelektro-statiske interaksjoner (elektrostatisk katalyse) er det essen-sielle trekk ved denne reseptors evne til å akselerere reaksjonen [Fersht, Enzyme Structure and Mechanism, Freeman, red., New York (1985)].

Selv om man ikke var i stand til å påvise noen amino-syreinnbefattelse i den reseptor 27A6-hydrolytiske reaksjon via pH-effekter, ble en spesifikk inaktivering av alle tre (27A6, 57G12, 70F3) katalytiske antistoffer observert ved anvendelse av det argininmodifiserende reagens fenylglyoxal [Takahashi, J. Biol. Chem., 243 -. 6171 (1968)]. Tapet av aktivitet (katalytisk/bindende) kan fortolkes som å skyldes reaksjon av reagenset med en aminosyrerestsidekjede i det bindende sete; og dette kan reduseres signifikant ved nærvær av haptenforbindelse 5b.

En strukturforandring etter reaksjonen av reagenset ved et forskjellig sete vil imidlertid føre til en lignende konklusjon. Således er det mulig at en argininrest et eller annet sted enn i det bindende sete er kjemisk forandret, noe som fører til stabilisering av strukturer av proteinet hvori det bindende sete er forandret slik at det ikke lenger binder substratforbindelse 3 eller haptenforbindelse 5. Denne kompli-kasjon synes ikke å gjelde her.

Katalytiske og ELISA-utprøvninger viser, og tidligere bindingsstudier observert av Freedman et al., Immunochem., 9:169 (1972) og Mayers et al., Immunochem., 9:169 (1972), at glyoxylering av guanidiniumgrupper ødelegger katalytisk og/eller bindingsaktivitet bare av antistoffer mot negativt ladede haptener, og ikke av antistoffer mot nøytral haptenforbindelse 6 eller positivt ladet haptenforbindelse 7. Hvis glyoxylering utviste en effekt ved forandring av et guanidinium fjernt fra bindingssetet ved den ovenfor angitte mekanisme, er det vanskelig å se hvorfor antistoffer mot forbindelse 6 eller 7-haptenene ikke ville bli påvirket på lignende måte. Det er således antatt at et arginin hvis guanidiniumsidegruppe har en pKa-verdi over det her studerte område, er i bindingssetet og er involvert med den observerte katalyse.

Et samspill av multiple ladninger som kan fremkalle et utall katalytiske grupper, forutses, noe som gir en additiv hastighetseffekt. Denne effekt kombinert med adgang til et meget større repertoar av potensielle, katalytiske antistoffer

[Shastr<y> et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 86:5728 (1989)]

forbedrer sannsynligheten for å utvikle glimrende katalysatorer .

V. Ligandfremstilling

Med mindre annet er angitt, ble reaksjonene utført i flammetørket glassvare under en nitrogenatmosfære. Reagens- og løsningsmiddeloverføringer ble foretatt med ovnstørkede sprøyter og nåler. Diklormethan og acetonitril ble kontinuer-lig destillert fra kalsiumhydrid. Tetrahydrofuran a (THF) ble destillert fra natriummetall/benzofenonketyl. Alle reagenser ble levert fra Aldrich Chemical Company. Alle kromatografiløs-ningsmidler ble erholdt kommersielt og anvendt som de ble mot-tatt. Reaksjonene ble overvåket ved analytiske tynnsjikts-kromatografiske metoder (TLC) ved anvendelse av E. Merck silicagel 60F glassplater (0,25 mm). Flashkromatografi ble utført ved anvendelse av E. Merck silicagel 60 (230-400 mesh) som beskrevet av Still et al., J. Org. Chem., 43_:2923 (1978).

Smeltepunkter ble bestemt på en Fisher-Johns smelte-punktapparatur og er ukorrigert. Alle proton-NMR-spektra (300 MHz) ble erholdt i CDC13-, CD3CN- eller DMSO-løsninger ved omgivende temperatur på et "Bruker AM-300" spektrometer, kjemiske skiftninger (a) er angitt i deler pr. million i forhold til internt tetramethylsilan (0,00 ppm). Elementæranalyser (C, H, N) ble utført av Galbraith Laboratories, Knoxville, TN.

Eksempel 1: p- nitrofenylacetaldehyd

p-nitrofenylacetaldehyd ble fremstilt ved metoden beskrevet i Lethbridge et al., J. Chem. Soc. Perkin I, 3 5

(1973) fra p-nitrofenylethylen. p-nitrofenylethylen ble fremstilt ved metoden beskrevet i Strassburg et al., J. Am. Chem. Soc. 69:2142 (1947) fra 1-brom-2-(p-nitrofenyl)ethan (kommersielt tilgjengelig fra Aldrich Chemical Co., Milwaukee,

WI) .

Eksempel 2: Forbindelse I

n-butyllithium (3,33 x IO"<2> mol) ble tilsatt til tetrahydrofuran (THF; 100 ml) opprettholdt ved -100°C i et ether/nitrogenbad. 2-brompyridin (3,64 x IO"<2> mol) ble tilsatt til denne blanding under omrøring i 15 minutter. Reaksjonsblandingen ble hevet til -78°C ved overføring av reaksjonskaret til et aceton/C02-bad, og blandingen ble omrørt i 1 time. p-nitrof enylacetaldehyd (5 g, 3,03 x IO"<2> mol) erholdt fra eksempel 1 oppløst i 30 ml THF, ble langsomt tilsatt til reaksjonsblandingen, og blandingen ble omrørt i 3 timer ved -78°C.

Etter omrøring ble blandingen helt over i en mettet løsning av 500 rnl ammoniumklorid og diethylether. Blandingen ble ekstrahert to ganger med diethylether, de kombinerte etherlag ble tørket over natriumsulfat og ble kjørt på en kolonne i 15% CH3CN i CH2C12. Produktet, forbindelse I (1-hydroxy-1-(2-pyridinyl)-2-(p-nitrofenyl)-ethan), ble oppsamlet til et utbytte på 648 mg (2,7 x IO"<3> mol, 9% utbytte).

<X>H NMR 58,55 (d, 1H); 8,10 (d, 2H); 7,65 (m, 1H);

7,3 (d, 2H); 7,2 (m, 2H); 5,05 (dd, 1H); 3,20 (m, 2H).

Eksempel 3: Forbindelse II

12 ml tørr methanol ble tilsatt til et tørt 25 ml reaksjonskar spylt med nitrogen.

100 mg forbindelse I erholdt i eksempel 2, ble opp-løst i methanol under dannelse av en orangefarget løsning.

Løsningen ble spylt med nitrogen, og 10% palladium på carbon (Pd/C, 75 mg) ble tilsatt til løsningen. Sidene av reaksjonskaret ble vasket med en liten mengde methanol, og løsningen ble spylt med nitrogen og deretter spylt med hydrogen. Reaksjonsblandingen ble omrørt i ca. 1 time og ble deretter filtrert gjennom et sjikt av celitt. Filteret ble skyllet fire ganger med diklormethan (CH2C12) og ble deretter skyllet tre ganger med methanol inntil ikke noe tynnsjiktskromatografisk (TLC) flekkmateriale ble erholdt fra filteret. Filtratskylle-væskene ble tørket med natriumsulfat og fordampet til tørrhet under dannelse av 85,6 mg (97,6% utbytte) av gult, krystal-linsk, fast materiale, forbindelse I_I (1-hydroxy-l-(2-pyri-dinyl)-2-(p-aminofenyl)ethan).

Eksempel 4: Forbindelse 2

Forbindelse I<_>I (155 mg, 7,24 x IO"<4> mol) fra eksempel 3, ble blandet med 1,5 ml tørt CH2C12 og triethylamin [(Et3N) (1,45 x IO"<3> mol)]. N-hydroxysuccinimidoylglutaroylklorid (359 mg, 1,45 x IO"<3> mol) ble tilsatt, og den resulterende reaksjonsblanding ble omrørt ved 2 5°C i ca. 40 minutter. Reaksjonsproduktet ble fordampet til tørrhet ved rotasjonsfor-dampning under dannelse av 61,5 mg (20% utbytte) av 5-[(2,5-dioxo)-1-pyrrolidinyl)oxy]-N-[4-[2-hydroxy-2-(2-pyridinyl)-ethyl]fenyl]-5-oxo-pentanamid, (forbindelse 2).

<1>H NMR (DMS0-d6) 5 9,82 (s, 1H) ; 8,48 (d, 1H, J=4,3 Hz);

7,75 (dd, 1H, J=2 x 7,6 Hz); 7,42 (d, 2H, J=7,9 Hz);

7,22 (m, 2H); 7,05 (d, 2H, J=7,9 Hz); 5,38 (d, 1H, J=5,l Hz); 4,76 (dd, 1H, J=4,0, 3,5 Hz); 3,05 (dd, 2H,

J=13,7, 4,0 Hz); 2,80 (s, 4H); 2,76 (t, 2H, J=8,2 Hz);

2,42 (t, 2H, J=8,2 Hz); 1,90 (m, 2H).

Anal. beregnet for C22H23N3O6: C 62,12 H 5,41 N 9,8 8 Funnet: C 62,19 H 5,37 N 9,92%

Eksempel 5: Forbindelse la

Forbindelse 2 (30 mg, 7,06 x 10"<5> mol) fra eksempel 4 ble blandet med methyljodid (7,06 x IO"<4> mol) i 0,5 ml aceton og kokt under tilbakeløpskjøling i ca. 17 timer. Reaksjonsblandingen ble skyllet tre ganger med kloroform og deretter skyllet tre ganger med varmt ethylacetat under dannelse av 20 mg (50% utbytte) av haptenisk ligand 2-[2-[5-[ (2,5-dioxo-l-pyrrolidinyl)oxy]-1,5-dioxopentyl]-4-aminofenyl]-1-hydroxyethyl]-1-methylpyridiniumjodid, (forbindelse la).

<X>H NMR (DMS0-d6) 5 9,86 (s, 1H) ; 8,92 (d, 1H, J=6,l Hz);

8,55 (d, 1H, J=8,0 Hz); 8,08 (t, 1H, J=6,8 Hz); 8,00 (t,

1H, J=7,9 Hz); 7,48 (d, 2H, J=7,9 Hz); 7,12 (d, 2H,

J=7,9 Hz); 6,30 (d, 1H, J=5,l Hz); 5,34 (dd, 1H,

J=4,0, 3,5 Hz); 4,35 (s, 3H); 3,02 (dd, 2H, J=13,6, 4,0

Hz); 2,80 (s, 4H); 2,72 (t, 2H, J=8,2 Hz); 2,45 (t, 2H, J=8,2 Hz); 1,90 (m, 2H).

Anal. beregnet for C^^sNaOsI: C 48,67 H 4,59 N 7,41 Funnet: C 48,11 H 4,51 N 7,37%

Eksempel 6: 2-[(4-nitrofenyl)methyl]-1,3-dioxolan

( forbindelse III)

p-nitrofenylacetaldehyd (500 mg, 3,0 x 10"<3> mol) ble oppløst i ca. 1,5 ml CH2C1. 383 mg CaS04 ble tilsatt til blandingen etterfulgt av "Rexyn 101" harpiks (protonform, Fisher Scientific; 128 mg) og ethylenglycol (13,8 x IO"<3> mol). Blandingen ble omrørt under nitrogen i ca. 4 timer. Før anvendelse ble "Rexyn 101" og CaS04 opprettholdt i 20 timer ved ca. 120°C i en tørkeovn og ble deretter avkjølt i en eksikkator.

En prøve ble fjernet og anbrakt på en TLC i ren CH2C12. Ytterligere "Rexyn 101" og CaS04 ble tilsatt, og blandingen ble omrørt over natten (ca. 16-18 timer). 10 ml CH2C12 ble tilsatt til den omrørte blanding. En prøve ble anbrakt på TLC og utviste ikke noe flekkdannende materiale.

10 ml vann ble tilsatt, blandingen ble omrørt, og det organiske lag ble fraskilt, tørket med natriumsulfat og renset ved flashkromatografi under anvendelse av hexan:ethylacetat (2:1) under dannelse av 435,8 mg (70% utbytte) av forbindelse

III.

XH NMR: 58,10 (d, 2H); 7,4 (d, 2H); 5,10 (t, 1H);

3,8 (s, 4H); 3,0 (d, 2H).

I en andre fremstilling ble ethylenglycol (5,4 ml, 97 mmol) tilsatt til en omrørt løsning av p-nitrofenylacetaldehyd (3,0 g, 18,2 mmol) i 10,0 ml methylenklorid. Til dette ble det tilsatt 1,0 g "Rexyn 101" (H) (Fisher Scientific) kationbyt-terharpiks og 3,0 g pulverformet kalsiumsulfat som var blitt ovnstørket (120°C) over natten. Blandingen ble omrørt i 24 timer ved romtemperatur, og reaksjonsblandingen ble deretter helt over i 100 ml H20 og ekstrahert tre ganger med 50 ml porsjoner methylenklorid. Kombinerte, organiske lag ble tørket med natriumsulfat og renset ved flashkromatografi, 2:1 hexan:ethylacetat, under dannelse av 2,2 8 g, 60% av den teoretiske mengde.

<X>H NMR (CDC13) 5 8,18 (d, J=8,6 Hz, 2H), 7,42 (d, J=8,6

Hz, 2H), 5,08 (t, J=4,3 Hz, 1H), 3,8-4,0 (m, 4H), 3,06

(d, J=4,3 Hz, 2H).

Anal. beregnet for Ci0HnN04: C 57,42 H 5,26 N 6,70

Funnet: C 57,51 H 5,19 N 6,65

Eksempel 7: 4-(1,3-dioxolan-2-ylmethyl)-benzenamin

( forbindelse IV)

231 mg av forbindelse III fra eksempel 6 ble oppløst i ca. 3 ml methanol, og blandingen ble spylt med nitrogen. 120 mg Pd/C ble tilsatt til blandingen, og sidene av reaksjonskol-ben ble skyllet med ca. 2 ml methanol. Blandingen ble spylt med nitrogen og ble deretter spylt med hydrogen. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 45 minutter og ble deretter filtrert gjennom celitt. Celitten ble skyllet flere ganger med methanol, og filtratet og skyllevæskene ble rotasjonsfordampet under dannelse av 184,4 mg (90,6% utbytte) av forbindelse IV.

I en annen fremstilling ble forbindelse III (2,0 g, 9,6 mmol) tilsatt til 20 ml methanol. Til denne suspensjon ble det tilsatt 10% palladium på aktivert carbon (200 mg), og kolben ble utstyrt med en ballong av hydrogen og ble hurtig om-rørt ved romtemperatur i 6 timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom celitt og konsentrert under dannelse av 1,63 g, 95% av teoretisk mengde. Dette materiale ble anvendt uten ytterligere rensing i gjentagelsen av det etterfølgende eksempel. TLC Rf=0,3, 1:1 ethyl.

Eksempel 8: N-[4-(1,3-dioxolan-2-ylmethyl)fenyl-N-(fenylmethyl)-benzenmethanamin

( forbindelse V)

Forbindelse IV (1,91 g, 1,07 x 10~<2> mol) fra eksempel 7 ble blandet med 10 ml CH2C12 og Et3N (4,45 ml, 3,2 x IO"<2> mol) og omrørt. Benzylbromid (1,07 x IO"<1> mol) ble dråpevis tilsatt til den omrørte blanding etter at ca. halvparten av forbindelse IV var oppløst i løsningen. Alt av aminet ble deretter oppløst. Reaksjonen ble stanset etter ca. én time. Løsningen ble kjørt på en kolonne i CH2C12:HC1 (9:1), og 3,048 mg (79% utbytte) av det ønskede produkt ble oppsamlet (forbindelse V): <X>H NMR: 57,25 (s, 10H); 7,05 (d, 2H); 6,85 (d, 2H);

5,00 (t, 1H); 4,60 (s, 4H); 3,9 (m, 4H);

2,8 (d, 2H).

Ved gjentagelse av den ovenfor angitte syntese ble det til en omrørt suspensjon av forbindelse IV (2 g, 11,2 mmol) i 10 ml methylenklorid tilsatt triethylamin (4,5 ml, 32 mmol). Tilsetning av benzylbromid (6,4 ml, 107 mmol) ble foretatt dråpevis i løpet av 30 minutter under hurtig omrøring, og hvor den resulterende blanding ble omrørt i ytterligere 60 minutter. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med 50 ml methylenklorid og ekstrahert med (2x25 ml) 0,5M HCl. De kombinerte, organiske ekstrakter ble tørket med natriumsulfat og renset ved flashkromatografi i 4:1 methylenklorid:hexan, under dannelse av 3,2 g, 80% av den teoretiske mengde. <X>U NMR (CDC13) 5 7,35-7,23 (m, 10H), 7,06 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,66 (d,

J=8,6 Hz, 2H) , 5,50 (5, J=4, 3 Hz, 1H) , 4,62 (s, 4H) ,

3,8-4,00 (m, 4H), 2,82 (d, J=4,3 Hz, 2H).

Anal. beregnet for C24H25NO2: C 80,22 N 6,96 N 3,90

Funnet: C 80,3 5 H 7,11 N 3,86

Eksempel 9: 4-[bis(fenylmethyl)amino-benzenacetaldehyd

( forbindelse VI)

Forbindelse V (2 g, 5,6 x 10~<3> mol) fra eksempel 8 ble oppløst i 6 ml aceton og omrørt under nitrogen. 6 ml 4M HCl ble tilsatt til blandingen, og omrøringen ble fortsatt inntil reaksjonsblandingen var svakt gul. Reaksjonsblandingen ble overført til en skilletrakt inneholdende CH2C12 og vasket med vandig NaCl. Det organiske lag ble tørket med natriumsulfat og lagret under vakuum over natten (16-18 timer).

En prøve ble kjørt på TLC, og beising med ninhydrin utviste 5 flekker i CH2Cl2:hexan (4:1). Reaksjonsproduktet ble anbrakt på en 50 mm preabsorbert silicakolonne, og 500 mg (29% utbytte) av flekken svarende til det ønskede produkt (forbindelse VI) ble oppsamlet.

XH NMR: 59,5 (t, 1H); 7,1 (s, 10H); 6,8 (d, 2H);

4,5 (s, 4H); 3,4 (d, 2H).

I en annen fremstilling ble det til en løsning av

2,0 g (5,6 mmol) av forbindelse V i 15 ml aceton tilsatt 2 ml 4M HCl. Denne løsning ble omrørt i 24 timer ved romtemperatur.

10 g silica ble tilsatt til reaksjonsblandingen, og blandingen ble konsentrert til tørrhet. Flashkromatografi ble kjørt i 4:1 methylenklorid:hexan med det preabsorberte, urene reaksjonsprodukt under dannelse av 0,7 g, 40% av den teoretiske mengde. <X>H NMR (CDC13) 5 9,7 (t, J=2, 9 Hz, 1H) , 7,40-720 (m, 10H), 7,00 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,7 (d, J=8,6 Hz, 2H), 4,66 (s, 4H), 3,54 (d, J=2,9 Hz, 2H).

Anal. beregn. C22H2iNO: C, 83,81; H, 6,67; N, 4,44.

Funnet: C, 84,06; H, 6,58; N, 4,50. ■

Eksempel 10: 2-[2-(4-aminofenyl-1-hydroxyethyl]-benzosyre

( forbindelse VII)

2-brombenzosyre (88 mg, 4,33 x 10"<4> mol) ble oppløst i 2 ml THF og avkjølt til -78°C. n-butyllithium (n-buLi) (8,38 x IO"<4> mol) ble tilsatt, og blandingen ble omrørt i 2 timer.

Forbindelse VI (91 mg, 2,89 x IO"<4> mol) erholdt i eksempel 9, oppløst i 1 ml THF, ble tilsatt til blandingen, og blandingen ble omrørt i 4 timer ved -78°C. Reaksjonsblandingen ble fortynnet i ethylacetat og vasket to ganger med mettet NH4C1, etterfulgt av én vasking med IM HCl. Den organiske fraksjon ble fraskilt, tørket med natriumsulfat og rotasjonsfordampet over natten (ca. 16-18 timer).

TLC av produktet i CH2C12:hexan (4:1) viste to flekker. Begge flekker ble oppsamlet fra en kolonne. Det ønskede produkt ble erholdt under dannelse av 32 mg (25% utbytte) som forbindelse VII.

<X>H NMR: 7,1-7,8 (m, 14H); 6,9 (d, 2H); 6,6 (d, 2H);

5,6 (t, 1H); 4,6 (s, 4H); 3,0 (m, 2H)

I en annen fremstilling ble 2-brombenzosyre (957 mg, 4,8 mmol) oppløst i 20 ml tetrahydrofuran og avkjølt til -78°C (C02/aceton), n-butyllithium (n-BuLi; 5,8 mM, 1,6M i hexan, 9,2 mmol) ble tilsatt, og blandingen ble omrørt i én time. Aldehydforbindelse VI (1,9 g, 3,2 mmol) oppløst i 10 ml tetrahydrofuran avkjølt til -78°C, ble tilsatt via en kanyle og ble deretter omrørt i 4 timer ved -78°C. Reaksjonsblandingen ble helt over i mettet ammoniumklorid etterfulgt av ekstraksjon med 2 x 50 ml ethylacetat. De kombinerte, organiske ekstrakter ble tørket med natriumsulfat og renset ved flashkromatografi under anvendelse av rent methylenklorid under dannelse av

860 mg, 62% av den teoretiske mengde.

<1>H NMR (CDCI3) 5 7,90-7,80 (m, 1H), 7,68-7,40 (m, 2H), 7,40-7,05 (m, 11H), 7,0 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,64 (d,

J=8,6 Hz, 2H), 5,62 (t, J=7,l Hz, 2H), 3,64 (br s, 2H), 3,4-2,8 (m, 2H).

Anal. beregnet for C29H27NO3: C 80,37 H 6,24 N 3,23

Funnet: C 80,44 H 6,29 N 3,19

Eksempel 11: 2-[2-[4-[bis(fenylmethyl)amino]fenyl]-1-hydroxyethyl]- benzosyre ( forbindelse 5b) 32 mg av forbindelse VII erholdt i eksempel 10, ble oppløst i 2 ml methanol. 10 mg Pd/C ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble spylt med hydrogen og omrørt i ca. 1,5 time inntil alt flekkdannende materiale var borte, som bestemt ved TLC i CH2C12:ethylacetat (1:1) under dannelse av 16,2 mg (86% utbytte) av forbindelse 5b.

I en gjentatt syntese ble carboxylatforbindelse VII (320 mg, 7,3 x 10"<4> mol) oppløst i 20 ml methanol. Dette ble etterfulgt av tilsetning av 10% palladium på aktivert carbon (32 mg), fylling av kolben med hydrogen og hurtig omrøring i 90 minutter. Filtrering gjennom celitt etterfulgt av konsen-trering ga 179 mg, 95% av teoretisk mengde. Dette materiale ble anvendt uten ytterligere rensing ved gjentagelsen av det følgende eksempel. TLC Rf=0,6, 1:1 methylenklorid:ethylacetat.

Eksempel 12: 2-[2-[4-[[5-[(2,5-dioxo-l-pyrrolidinyl)oxy]-1,5-dioxopentyl]amino]fenyl]-1-hydroxyethyl-benzosyre ( forbindelse 5a)

Forbindelse 5b (16,2 mg, 6,3 x IO"<5> mol) erholdt i eksempel 11, ble oppløst i 70 ul CH2C12, og Et3N (1,26 x IO"<4 >mol) ble tilsatt under omrøring.

N-hydroxysuccinimidoylglutaroylklorid (19,1 mg,

8,19 x IO"<5> mol) ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble omrørt under nitrogen. Reaksjonsblandingen ble deretter anbrakt direkte på en preparativ TLC-plate og eluert med CH2C12:ethylacetat (1:1) under dannelse av 14,3 mg (50% utbytte) av den ønskede hapteniske ligandforbindelse 5a.

■""H NMR: 59,2 (s, 1H) ; 7,2-6,8 (m, 6H) ; 6,6 (d, 2H) ;

5,2 (t, 1H); 2,6 (m, 2H); 2,1 (s, 4H);

2,0 (t, 2H); 1,8 (t, 2H); 1,4 (m, 2H).

I en gjentatt syntese ble carboxylat VIII (100 mg, 3,9 x IO"<4> mol) oppløst i 800 ul methylenklorid og triethylamin (109 ul, 7,8 x IO"<4> mol). Denne oppløsning ble etterfulgt av tilsetning av (5-[(2,5-dioxo-l-pyrrolidinyl)oxy]-5-oxo-pentan-oylklorid (118 mg, 5,1 x IO"<4> mol) og omrøring i 20 minutter. Ren sing ble utført ved å fylle den urene reaksjonsblanding på en flashkromatografikolonne og eluering med 1:1 methylenklorid :ethylacetat under dannelse av 159 mg, 90% av den teoretiske mengde.

<1>H NMR (CDC13) 5 9,24 (s, 1H), 7,36-6,8 (m, 6H), 6,42

(d, J=8,6 Hz, 2H), 5,20 (t, J=7,l Hz, 1H), 2,66-2,36 (m,

2H), 2,15 (5, 4H), 2,1-1,96 (m, 2H), 1,96-1,7 (m, 2H), 1,5-1,16 (m, 2H).

Anal. beregnet for C24H24N208: C 61,54 H 5,13 N 5,98

Funnet: C 61,62 H 5,10 N 5,8 9

Eksempel 13: Forbindelse IX

Forbindelse I_I, fra eksempel 3 (262 mg, 1,22 x IO"<3 >mol), og 140 mg glutarsyreanhydrid ble oppløst i 10 ml CH2C12 og omrørt i 16 til 18 timer. Ytterligere 40 mg glutarsyreanhydrid ble tilsatt til løsningen, og reaksjonsblandingen ble omrørt i 3 timer og deretter helt over i en vandig løsning av Et3N (1,47 x IO"<3> mol) . Løsningen ble deretter fortynnet med ethylacetat, og det vandige lag ble fjernet og surgjort med trifluoreddiksyre (TFA). Det vandige lag ble ekstrahert med ethylacetat, renset ved HPLC under anvendelse av en standard 10:90 til 90:10 CH3CN:H20-gradient, og 240 mg (60% utbytte) av den ønskede forbindelse (forbindelse IX) ble erholdt.

<X>H NMR: 58,3 (m, 3H); 7,6 (t, 2H); 6,9 (d, 2H);

6,7 (d, 2H); 5,1 (t, 1H); 2,8 (m, 2H);

2,0 (m, 4H); 1,5 (m, 2H).

Eksempel 14: Forbindelse lb

Forbindelse IX (58 mg, 1,77 x IO"<4> mol) fra eksempel 13 ble blandet med methyljodid (8,84 x IO"<4> mol) og oppløst i et forseglet rør i aceton (ca. 5 ml) og oppvarmet i ca. 16 til

18 timer ved 80°C. Bunnfallet ble filtrert og skyllet med CHC13 under dannelse av 56 mg (67% utbytte) av forbindelse lb. ^ NMR: 58,5-7,5 (m, 4H); 7,2-6,8 (m, 4H); 5,2 (t, 1H); 3,2 (m, 2H); 2,2 (t, 2H); 1,8 (t, 2H); 1,2 (m, 2H).

Eksempel 15: Forbindelse X

p-nitrofenol (lg, 7,19 x IO"<3> mol) ble oppløst i 3 ml CH2C12, og Et3N (7,19 x IO"<3> mol) ble tilsatt under dannelse av en gulfarget løsning.

Benzylklorid (8,63 x IO"<3> mol) ble tilsatt dråpevis til løsningen, noe som resulterte i noe kokning. Den gule farge forsvant etter ca. 5 minutter, og et bunnfall ble dannet. 2 ml CH2C12 ble tilsatt til den bunnfallsholdige løsning etterfulgt av tilsetning av 3 ml ethylacetat som oppløste bunnfallet. Løsningen ble omrørt i én time.

Løsningen ble blandet med vann og omrørt i ca. 45 minutter etterfulgt av vasking i IM HCl og deretter to vaskinger med 10% NaHC03, to vaskinger med IM HCl og to vaskinger med mettet NaCl. Det organiske lag ble tørket med natriumsulfat, ble rotasjonsfordampet, lagret under vakuum og separert på en kolonne i CH2C12: hexan (2:1) . Den lavere Rf-flekk på TLC ble oppsamlet under dannelse av 1,2613 g (72% utbytte) av forbindelse X (p-nitro-fenylbenzoat) .

<X>H NMR: 58,4-8,0 (m, 4H); 7,7-7,3 (m, 5H).

Eksempel 16: Forbindelse XI

Forbindelse X (530 mg, 2,18 x 10"<3> mol) fra eksempel 15, 200 ul 12M HCl, 275 mg Pd/C og hydrogengass ble blandet i ca. 15 ml methanol og omrørt i 2,5 timer under nitrogen inntil alt flekkdannende materiale, som bestemt ved TLC i CH2Cl2:MeOH (9:1), var borte. Løsningen ble filtrert og tørket under dannelse av 518 mg (95% utbytte) av forbindelse XI.

Eksempel 17: Forbindelse 3

Forbindelse XI (518 mg, 2,08 x IO"<3> mol) fra eksempel 16 ble blandet med 10 ml CH2C12 og glutarsyreanhydrid (260 mg, 2,28 x IO"<3> mol). Et3N (4,58 x IO"<3> mol) ble oppløst i løsnin-gen, og reaksjonsblandingen ble omrørt i 16 til 18 timer.

TLC viste flekkdannende materiale i CH2C12:ethylacetat (9:1). Mer glutarsyreanhydrid (0,25 mg) ble tilsatt til løsningen, og reaksjonsblandingen ble omrørt i ytterligere 3 timer inntil alt flekkdannende materiale var borte. Løsnin-qen ble fortynnet med ethylacetat, vasket to ganger med IM HCl. Den organiske fase ble tørket med natriumsulfat og fordampet under dannelse av 655 mg urent produkt. Det urene produkt ble renset ved FPLC i CH3CN:CH30H:H20 (4:1:4) under dannelse av 397 mg av forbindelse 3_.

<X>H NMR: 59,9 (s, 1H) ; 8,1 (d, 2H) ; 7,7-7,4 (m, 5H) ;

7,1 (d, 2H); 2,3 (t, 4H); 1,8 (rn, 2H).

Eksempel 18: Forbindelse 4

Glutarsyreanhydrid (1,34 g, 1,17 x IO"<2> mol) og p-aminofenol (1,6 g, 1,47 x IO"<2> mol) ble oppløst i 5 ml CH2C12 og omrørt ved 3 5°C i 1 time. Blandingen ble fortynnet i ethylacetat og vasket to ganger med IM HCl. Det organiske lag ble tørket med natriumsulfat og rotasjonsfordampet. HPLC viste produktet oppløst i det vandige lag som ble lyofilisert under dannelse av 214 mg urent produkt.

Det urene produkt ble oppløst i 16 ml H20, 5 ml methanol og 5 ml CH3CN og renset ved FPLC under dannelse av 89 mg av forbindelse 4.

<X>H NMR: 59,6 (s, 1H); 7,3 (d, 2H); 6,6 (d, 2H) ;

2,2 (m, 4H); 1,7 (m, 2H).

Eksempel 19: 2-[2-(4-aminofenyl)-1-hydroxyethyl]-1-methylbenzen ( forbindelse XII)

n-BuLi (2,8 ml, 2,6M i hexan, 4,4 mmol) ble tilsatt til 30 ml THF og avkjølt til -78°C. Til denne løsning ble det tilsatt 2-bromtoluen (0,573 ml, 4,8 mmol), og blandingen ble omrørt i 30 minutter. Aldehydforbindelse VI (1,9 g, 3,2 mmol) oppløst i 15 ml THF og avkjølt til -78°C, ble deretter tilsatt, og den resulterende blanding ble omrørt i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble helt over i en mettet ammoniumklorid-løsning og ekstrahert med 2 x 25 ml methylenklorid. De kombinerte, organiske lag ble tørket med natriumsulfat og renset ved flashkromatografi i 6:1:1,5 hexan:methylenklorid:ethylacetat under dannelse av 900 mg av forbindelse XII, 69% av den teoretiske mengde. <X>H NMR (CDC13) 5 7,9-7,8 (m, 1H), 7,68-7,40 (m, 2H), 7,40-7,15 (m, 12H), 7,05 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,70 (d, J=8,6 Hz, 2H), 5,3 (t, J=7,l Hz, 1H), 4,62 (s, 4H), 3,0-2,7

(m, 2H), 2,3 (s, 3H).

Anal. beregn, for C29H29NO: C, 85,50; H, 7,13; N, 3,44.

Funnet: C, 85,58; H, 7,08; N, 3,41.

Eksempel 20: 2-[2-[4-[bis(fenylmethyl)amino]fenyl]-1-hydroxyethyl]- 1- methylbenzen ( forbindelse XIII) Til en løsning av forbindelse XII (900 mg, 2,2 mmol) i 50 ml ethylacetat ble det tilsatt 10% palladium på aktivert carbon (100 mg). Reaksjonskaret ble komprimert til 3,5 kg/cm<2 >med hydrogen på en Parr-hydrogeneringsapparatur. Reaksjonen var fullført etter 4 timer og ble deretter filtrert gjennom celitt og konsentrert i vakuum under dannelse av 476 mg av forbindelse XIII, 95% av den teoretiske mengde. Dette materiale ble anvendt uten ytterligere rensing i det neste eksempel. TLC Rf=0,05, 4:1 methylenklorid:hexan.

Eksempel 21: 2-[2-[4-carboxy-l-oxobutyl)amino]fenyl]-1-hydroxyethyl]-1-methylbenzen

( forbindelse 6)

Til en løsning av forbindelse V (476 mg, 2,1 mmol)

1 10 ml methylenklorid inneholdende triethylamin (351 ul,

2,5 mmol), ble det tilsatt (5-[(2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)-oxyl]-5-oxo-pentanoylklorid (572 mg, 2,3 mmol). Løsningen ble omrørt i 30 minutter hvoretter den ble fortynnet med 2 5 ml ethylacetat, vasket med IM HCl (2 x 15 ml) og tørket med natriumsulfat. Det urene materiale ble renset ved flash-kromatograf i , 1:1 methylenklorid:ethylacetat under dannelse av 780 mg av forbindelse 6, 85% av teoretisk mengde. <X>H

NMR (CDC13) 5 9,24 (s, 1H), 7,4-6,85 (m, 6H), 6,45 (d,

J=8,6 Hz, 2H), 5,20 (t, J=7,l Hz, 1H), 2,65-2,4 (m, 2H)

2,3 (s, 3H), 2,15 (s, 4H), 2,1-1,96 (m, 2H), 1,96-1,72

(m, 2H), 1,5-1,20 (m, 2H).

Anal. beregnet for C24H26N2O6: C 65,75 H 5,94 N 6,39

Funnet: C 65,79 H 5,91 N 6,41

Eksempel 22: 5-[(2,5-dioxo-l-pyrrolidinyl)-ox]-N-[4-(hydroxymethyl)fenyl]-5-oxo-pentanamid

( forbindelse XIV)

Til en løsning av triethylamin (1,13 ml, 8,2 mmol) i 10 ml methylenklorid ble det oppløst p-aminobenzylalkohol

(1,9 g, 8,1 mmol). Til denne løsning ble det tilsatt (5-[(2,5-dioxo-l-pyrrolidinyl)oxy]-5-pentanoylklorid (2,21 g, 8,9 mmol), og blandingen ble omrørt i 1 time. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med 25 ml methylenklorid og ekstrahert med 2 x 2 6 ml av en 2M HCl-løsning. Det resulterende, organiske lag ble tørket med natriumsulfat og renset ved flashkromatografi i 9:1 methylenklorid:methanol under dannelse av 2,43 g av forbindelse XIV, 90% av det teoretiske mengde.

<X>H NMR (CDCI3) 5 8,0 (br x, 2H), 7,52 (d, J=8,6 Hz, 2H),

7,30 (d, J=8,6 Hz, 2H), 4,62 (s, 2H), 3,45 (s,2H), 2,9

(s, 4H), 2,75 (t, J=10 Hz, 2H), 2,5 (t, J=10 Hz, 2H), 2,38-2, 10 (m, 2H) .

Anal. beregn, for Ci6Hi8N2Os: C, 57,49; H, 5,39; N, 8,38. Funnet: C, 57,42; H, 5,44; N, 8,29.

Eksempel 23: N-[4-(brommethyl)fenyl]-5-[(2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)oxyl- 5-oxo-pentanamid

( forbindelse XV)

Til en løsning av forbindelse XIV (2,9 g, 6 mmol) i 20 ml dimethylformamid ble det tilsatt dibromtrifenylfosforan (3,04 g, 7,2 mmol). Reaksjonsblandingen ble deretter oppvarmet til 50°C og ble omrørt i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med 1 liter ethylacetat, ekstrahert med 4 x 200 ml saltvann og tørket over natriumsulfat. Rensing ved flashkromatografi, 1:1 ethylacetat:methylenklorid ga 1,20 g av forbindelse XV, 50% av den teoretiske mengde.

<X>H NMR (CDC13) o" 8,0 (br s, 1H) , 7,50 (d, J=8,6 Hz, 2H) ,

7,39 (d, J=8,6 Hz, 2H), 4,5 (s, 2H), 2,9 (s, 4H), 2,75

(t, J=10 Hz, 2H), 2,5 (t, J=20 Hz, 2H), 2,38-2,10 (m, 2H). Anal. beregnet for C16H17N2O5: C 58,72 H 5,20 N 8,56

Funnet: C 58,66 H 5,24 N 8,50

Eksempel 24: 4-[[5-[(2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)oxyl]-1,5-dioxo-pentyl]amino]-N,N-dimethyl-N-bromidbenzenmethan-aminiumbromid ( forbindelse 7)

Bromidforbindelse XV (1,9-g, 2,5 mmol) ble oppløst i 60 ml methylenklorid etterfulgt av tilsetning av dimethyl-anilin (1,6 ml, 12,5 mmol). Løsningen ble omrørt i 30 minutter hvorpå et bunnfall ble dannet, og omrøringen ble fortsatt i 4 timer. Den dannede suspensjon ble overført til en skilletrakt og ble ekstrahert med 3 x 30 ml destillert vann. De kombinerte, vandige vaskeløsninger ble lyofilisert under dannelse av 1,17 g av produktforbindelse 1_, 90% av den teoretiske mengde <X>H NMR (D20) 5 7,60 (s, 5H) , 7,38 (d, J=8,6 Hz, 2H), 7,9 (d, J=8,6 Hz, 2H), 4,95 (s, 2H), 3,62 (s, 6H),

2,9 (s, 4H), 2,75 (t, J=10 Hz, 2H), 2,5 (t, J=10 Hz,

2H), 2,38-2,10 (m, 2H).

Anal. beregnet for C24H28N305Br: C 55,60 H 5,41 N 8,11 Funnet: C 55,67 H 5,39 N 8,07

Eksempel 25: Fremstilling av succinimidyladipoyl- og glutaroylklorider ( koblingsmidler)

En løsning av adipinsyremonomethylester (5,4 g, 33,3 mmol) i 15 ml thionylklorid ble oppvarmet til 40°C i 2 timer. Blandingen ble deretter konsentrert og destillert i vakuum (kokepunkt 119°C ved 20 mm Hg) under dannelse av 3,58 g (60% utbytte på vektbasis) av syrekloridmethylesteren. Denne ble oppløst i 20 ml diklormethan, og N-hydroxysuccinimid (2,75 g, 24,0 mmol) ble tilsatt etterfulgt av triethylamin (4,2 ml, 30 mmol). Blandingen ble omrørt i 10 minutter og ble deretter fortynnet med ethylacetat og vasket med 0,5M HCl og saltvann. Løsningen ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat, filtrert og konsentrert under dannelse av 4,5 g (87,5% utbytte på vektbasis) av methylsuccinimidyladipat som en fargeløs olje.

Proton-NMR i CDC13 ved 100 MHz (i forhold til TMS som indre standard): delta 3,73 (singlett, 3H), delta 2,90 (singlett, 4H), 2,70 (multiplett, 2H), 2,37 (multiplett, 2H) og 1,79 (multiplett, 4H).

En løsning av methylsuccinimidyladipat (4,5 g, 17,5 mmol), klortrimethylsilan (11,1 ml, 87,5 mmol) og natriumjodid (13,1 g, 87,5 mmol) i 10 ml acetonitril ble oppvarmet til til-bakeløpskokning i 12 timer. Blandingen ble deretter avkjølt til romtemperatur og ble fortynnet med ethylacetat. Reaksjonsblandingen ble vasket gjentatte ganger med 5% vandig natrium-bisulfitt inntil den organiske løsning var fargeløs. Den ble deretter vasket med saltvann, tørket over vannfritt magnesium-sulf at, filtrert og konsentrert under dannelse av 3,2 g (71% utbytte på vektbasis) av adipinsyremonosuccinimidylester som et hvitt, fast materiale.

Proton-NMR i CDC13 ved 100 MHz (i forhold til TMS som indre standard): delta 3,90 (singlett, 4H), 2,70 (multiplett, 2H), 2,4 (multiplett, 2H), 1,80 (multiplett, 4H).

En blanding av adipinsyresuccinimidylester (1,00 g, 3,80 mmol) og thionylklorid (5 ml) ble oppvarmet til 40°C i 3 timer, ble deretter avkjølt til romtemperatur og konsentrert i vakuum. Residuet ble omrørt flere ganger med tørr hexan, oljen ble fraskilt og tørket i vakuum under dannelse av 0,97 g (90% utbytte på vektbasis) av succinimidyladipoylklorid. Dette ble oppløst i tørt tetrahydrofuran til en 5 molar løsning som ble anvendt som sådan ved fremstilling av forbindelser egnet for kobling til proteinbærere.

Proton-NMR i CDC13 ved 100 MHz (i forhold til TMS som indre standard): 3,00 (multiplett, 2H), 2,90 (singlett, 4H), 2,70 (multiplett, 2H), 1,80 (multiplett, 4H).

Succinimidylglutaroylklorid [5-[(2,5-dioxo-l-pyrro-lidinyl)oxy]-5-oxo-pentanoylklorid] ble på lignende måte fremstilt og anvendt som diskutert i det etterfølgende.

VI. Fremstilling av konjugater og inokula

Konjugater av hapteniske ligandmolekyler med proteinbærere slik som albuskjellhemocyanin (KLH) eller kvegserumalbumin (BSA), kan f.eks. fremstilles ved aktivering av bæreren med et koblingsmiddel slik som MBS (m-maleimido-benzoyl-N-hydroxysuccinimidester), og kobling til thiolgruppen av den hapteniske ligand. Se f.eks. Liu et al., Biochem., 80, 690 (1979). Som det også er velkjent innen faget, er det ofte gunstig å binde en forbindelse til dens bærer ved hjelp av en intermediær, kjedende gruppe.

Anvendbare bærere er velkjente innen faget og er generelt proteiner i seg selv. Eksempler på slike bærere er albuskjellhemocyanin (KLH), edestin, tyroglobulin, albuminer slik som kvegserumalbumin eller humanserunralbumin (BSA eller HSA), røde blodceller slik som saueerythrocytter (SRBC), tetanus-toxoid, kolera-toxoid så vel som polyaminosyrer slik som poly(D-lysin:D-glutaminsyre), og lignende.

Valget av bærer er mer avhengig av den sluttelige beregnede anvendelse av antigenet enn på determinantdelen av antigenet og er basert på kriterier som ikke spesielt er involvert i foreliggende oppfinnelse. Hvis f.eks. konjugatet skal anvendes i laboratoriedyr, skal en bærer som ikke utvik-ler en uønsket reaksjon i dette bestemte dyr, velges.

Bærer-haptenkonjugatet oppløses eller dispergeres i en vandig sammensetning av et fysiologisk tolererbart fortynningsmiddel slik som normalt saltvann, PBS eller sterilt vann under dannelse av et inokulum. En adjuvans slik som Freunds fullstendige eller ufullstendige adjuvans eller alun, kan også innbefattes i inokulumet. Inokulumet innføres slik som ved injeksjon i dyret anvendt for å danne antistoffene i en mengde tilstrekkelig til å fremkalle antistoffer, noe som er vel-kj ent.

Eksempelvise, immunogene konjugater ble fremstilt fra en haptenisk ligand ved tilpasning av deres syntese til å inkorporere en rett kjede av carbonatomer på den hapteniske ligandbenzylgruppe (svarende til den fenoliske del av reaktantligandesteren) som et skillende element som angitt tidligere. Andre eksempelvise, immunogene konjugater kan fremstilles som et skillende/kjedende element fra en haptenisk ligand ved tilpasning av disse synteser for å inkorporere den rette kjede av carbonatomer på delen til den hapteniske ligand svarende til syredelen av reaktantliganden.

Det ble konkludert med at den fleksible carbonkjede av et adipat- eller glutaratvedheng vil redusere enhver til-bøyelighet til immunreaktivitet på grunn av den strukturmes-sige bundethet pålagt ved kovalent binding til bærerproteinet. Det bifunksjonelle reagens fremstilt for dette formål, av-leverer også den preaktiverte carboxylgruppe for binding via amidbindingsdannelse med lysinrestene av bæreren. Den bestemte koblingsmetode som ble anvendt i denne studie, er ytterligere beskrevet her. De hapteniske ligander ble koblet til albu-skj ellhemocyanin (KLH) gjennom en aminogruppe av den fenoliske del av strukturen.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det intermediære bindingsmiddel fortrinnsvis succinimidyladipoyl- eller glutar-oylklorid som ble fremstilt som diskutert tidligere. Et antigent (immunogent) konjugat ble fremstilt som følger.

I en eksempelvis prosedyre ble 2,5 mg av et ovenfor angitt reaksjonsprodukt av hapten og succinimidyladipoylklorid eller succinimidylglutaroylklorid i 250 ul dimethylformamid langsomt tilsatt under omrøring til 2 mg KLH i 750 ul av 0,0lM natriumfosfatbuffer ved en pH-verdi på 7,2. En temperatur på 4°C anvendes, og den resulterende blanding omrøres i ca. 1 time under dannelse av det haptenkjedede KLH-konjugat. Det således dannede konjugatreaksjonsprodukt renses deretter på vanlig måte.

VII. Fremstilling av monoklonale reseptorer

De foregående KLH-konjugater (ca. 100 ug) ble anvendt for å immunisere grupper av fire 8 uker gamle mus (12 9G1X+-stamme) ved intraperitoneal (IP) injeksjon i Freunds fullstendige adjuvans. En ytterligere IP-injeksjon av 50 ug konjugat i alun ble gitt to uker deretter. Én måned deretter ble musen med den høyeste antistofftiter mot haptenet injisert intraven-øst med 50 ug av KLH-konjugatet. Miltene ble tatt ut tre dager deretter for fremstilling av hybridomer of monoklonale antistoffer .

Monoklonale antistoffer ble erholdt som beskrevet av Niman et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 77, 4524 (1980) og Niman et al., i Monoclonal Antibodies and T-Cell Products, red., Katz, D.H., 23-51 (CRC Press, Boca Raton, FL 1982). Kort angitt, ble miltceller (1 x IO<8>) fusjonert med 2,0 x IO<7> Sp2/0 myelomceller. Celler ble anbrakt i 45 96-brønns plater idet hver brønn inneholdt 150 ul HAT-DMEM-medium ytterligere inneholdende 1% nutridoma og 2% BSA. Lymfocyttene anvendt for å danne hybridomene ifølge oppfinnelsen, kan være avledet fra et hvilket som helst pattedyr slik som en primat, gnager (f.eks. mus eller rotte), kanin, marsvin, ku, hund, sau, gris eller lignende. Hvis hensiktsmessig, kan verten sensibiliseres ved injeksjon med immunogenet, i dette tilfelle en haptenisk ligand, etterfulgt av en booster-injeksjon, og deretter iso-lering av milten.

Det foretrekkes at myelomcellelinjen er fra den samme art som lymfocyttene. Derfor anvendes typisk fusjonerte hybrider slik som muse-musehybrider [Shulman et al., Nature, 276, 269 (1978)] eller rotte-rottehybrider [Galfre et al., Nature, 277, 131 (1979)]. Imidlertid har enkelte rotte-musehybrider også med hell vært anvendt ved dannelse av hybridomer [Goding, "Production of Monoclonal Antibodies by Cell Fusion", i Antibody as a Tool, Marchalonis et al., red., John Wiley & Sons Ltd., s. 273 (1982)]. Egnede myelomlinjer for anvendelse i foreliggende oppfinnelse innbefatter MPC-11 (ATCC CRL 167), P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580), Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581), P3 X 63 Ag8U.l (ATCC CRL 1597), Y3-Agl.2.3. (deponert ved Collec-tion Nationale de Cultures de Microorganisms, Paris, Frankrike, nr. 1-078) og P3X63Ag8 (ATCC TIB 9). Den ikke-utskillende, murine myelomlinje Sp2/0 eller Sp2/0-Agl4 er foretrukket for anvendelse i foreliggende oppfinnelse.

De hybridomceller som sluttelig fremstilles, kan dyrkes ved å følge vanlige in vitro vevdyrkningsteknikker for slike celler, noe som er velkjent. Mer fordelaktig dyrkes hybridomcellene i dyr under anvendelse av lignende velkjente teknikker hvor de monoklonale reseptorer erholdes fra den ascitesvæske som således dannes. Dyrene anvendt for dannelse av ascitesvæsken, var Balb/c x 129GlX<+->mus avlet i musekolonien til Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, California, men når dyr som er forskjellige fra mus anvendes for fremstilling av hybridomene, kan mus eller denne dyretype anvendes for fremstilling av ascitesvæske.

I særdeleshet ble en eksempelvis monoklonal reseptor fremstilt ved standard hybridomteknologien ifølge Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975). Spesifikt ble 129GlX<+->mus immunisert ved intraperitoneal injeksjon med et inokulum på 100 ug konjugat (f.eks. forbindelse la, 2 eller 5a bundet til KLH) i 300 ul av en 1:1 blanding av fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4, og Freunds fullstendige adjuvans. To uker senere ble musene igjen injisert på lignende måte med 50 ug av det foregående konjugat i 300 ul av en 1:1 blanding av PBS (pH 7,4) og 10 mg/ml alun. Etter ytterligere 8 uker ble musene immunisert intravenøst med 50 ug av konjugatet i 200 ul PBS (pH 7,4). Miltene ble fjernet fra musene 4 dager senere, og miltcellene ble fusjonert til myelomceller.

Miltcellene ble ansamlet, og en enkel cellesuspensjon ble fremstilt. Kjernedannede miltceller (1,4 x IO<8>) ble deretter fusjonert med 3 x IO<7> Sp2/0 ikke-utskillende myelomceller i nærvær av en cellefusjonsaktivator (polyethylenglycol 2000). Det hybridom som produserer et bestemt monoklonalt antistoff, ble utvalgt ved såing av hybridomcellene i 96-brønns plater og ved dyrkning i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) inneholdende 4500 mg/l glucose (10%), 10% kalvefosterserum (FCS), hypoxanthin, aminopterin og thymidin (dvs. HAT-medium) som ikke understøtter vekst av ufusjonerte myelomceller.

Etter to til tre uker ble supernatanten over celle-klonen i hver brønn samlet og testet ved en ELISA-bestemmelse (enzymkjedet immunosorbentbestemmelse som beskrevet i det et-terfølgende) med hensyn til nærvær av antistoffer mot forbindelse la, 2_ eller 5 som antigener. Hver haptenisk ligand ble konjugert til BSA for ELISA-bestemmelsene. Positive brønner ble klonet to ganger ved begrensende fortynning. De kloner som fortsatte å produsere forbindelse la- eller ^-spesifikt antistoff etter to kloninger, ble utvidet til å produsere større volumer av supernatantvæske. 7 av de 23 monoklonale reseptorer (ca. 30%) som immunreagerte med forbindelse la, hydrolyserte reaktant-ligandesterforbindelse 3 katalytisk. Hver av disse katalyser kunne inhiberes av en egnet haptenisk ligand slik som forbindelse lb. Således var en relativt høy prosent av fremkalte, monoklonale reseptorer i stand til å katalysere en esterolytisk reaksjon. Ingen av de 21 antistoffer fremkalt av haptenforbindelse 2, utviste katalytisk aktivitet mot reaktantligandforbindelse 3_. På lignende måte ble kolonier som opprin-nelig produserte antistoffer som bandt forbindelser 5a, 6 eller 7, subklonet to ganger, hvoretter atten for forbindelse 5a, tjueto for forbindelse 6 og tjueseks for forbindelse 7 forble aktive. Disse antistoffer var av IgG-klassen.

Monoklonale, katalytiske molekyler ble utfelt fra ascitesvæskene dyrket i pristanbehandlede Balb/c x 12 9GlX+-mus med salt, ble renset ved anionbytterkromatografi (DEAE) etterfulgt av affinitetskromatografi (protein G) og dialysert i 50 mM fosfat (100 mM NaCl, pH 7,5). Antistoffer ble bedømt å være homogene (95%) ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektroforese.

Ett av hybridomene, betegnet 30C6, ble studert ytterligere og er blitt deponert ved American Type Culture Collec-tion (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD. Dette hybridom ble deponert 24. januar 1990 og mottok deponeringsnr. HB 10341. To andre hybridomer 27A6 og 57G11 ble på lignende måte deponert ved ATCC 11. desember 1990 og mottok deponeringsnr. HB 10621 og HB 10622.

Foreliggende deponeringer ble foretatt i overensstem-meise med Budapesttraktatens krav om at varigheten av depon-eringen skal være 30 år fra deponeringsdatoen eller 5 år etter den siste henvendelse for deponering ved deponeringsstedet eller for levetiden av et US-patent som utgår fra denne søk-nad, som er den lengste. Hybridomene vil bli erstattet hvis de skulle bli ikke-levedyktige ved deponeringsstedet.

En monoklonal reseptor ifølge oppfinnelsen kan også fremstilles ved innføring, slik som ved injeksjon, av hybridomet inn i det peritoneale hulrom av et pattedyr slik som en mus. Fortrinnsvis anvendes som allerede angitt, syngeniske eller semi-syngeniske pattedyr slik som i US patentskrift 4 361 549, hvis beskrivelse er inkorporert her ved referanse. Innføringen av hybridomet forårsaker dannelse av antistoffproduserende hybridomer etter en egnet vekstperiode, f.eks. 1-2 uker, og resulterer i en høy konsentrasjon av den reseptor som fremstilles, slik at den kan gjenvinnes fra blodstrømmen og peritonealt eksudat (ascites) fra vertmusen. Selv om vertmusen også har normale reseptorer i sitt blod og ascites, er konsentrasjonen av normale reseptorer typisk bare ca. 5% av den av den monoklonale reseptorkonsentrasjon.

Den monoklonale reseptor som er til stede i hybridom-supernatanten, kan anvendes uten rensing, eller reseptoren kan gjenvinnes fra ascites eller serum fra musen under anvendelse av standardteknikker slik som affinitetskromatografi under anvendelse av AD 169-infiserte celler bundet til en immunosor-bant slik som "Sepharose" 6B eller 4B (Pharmacia Fine Chemi-cals, Piscataway, NJ), etterfulgt av eluering fra immunosor-banten under anvendelse av en syrebuffer slik som glycin-hydroklorid ved en pH-verdi på ca. 2,5.

I foreliggende studier ble IgG-fraksjoner typisk erholdt fra museascites ved utfelling med 45% mettet ammonium-sulfat etterfulgt av kromatografi på DEAE-"Sephacel" med natriumklorideluering som angitt tidligere. Fraksjonen som ble eluert med 100 mM salt, ble dialysert og konsentrert.

VIII. Enzymkjedet immunosorbentbestemmelse ( ELISA)

Bindingen av ligander og effekten av kjemisk modifisering ble undersøkt ved ELISA med antistoff ved en fastsatt konsentrasjon i området for dets titer og varierende reagens eller ligandkonsentrasjon. Inhibering er rapportert hvis titeren reduseres med 50% ved mindre enn et 1000:1 forhold mellom reagens og hapten.

Bestemmelser ble utført i flatbunnede polyvinylmik-rotiterplater (Dynatech, Alexandria, VA). Illustrativt ble veggene belagt med en løsning omfattende forbindelse la bundet til BSA som antigenliganden i fosfatbufret saltvann (PBS) under anvendelse av 50 ul løsning pr. brønn. Ligander ble belagt til 1 ug pr. ml. Platene ble deretter inkubert over natten ved 3 7°C i en tørr ovn. De tørrede plater ble lagret ved 4°C inntil bruk. Før ELISA-bestemmelsen ble tørrede plater rehydratisert ved to vaskinger på 2 minutter hver med 10 millimolar (mM) PBS, pH 7,4, inneholdende 0,1% polyoxyalkylen (20) sorbitanmonolaurat ("Tween 20") og 0,02% "Thimerosal"

(natriumethylkvikksølvthiosalicylat), (Sigma, St. Louis, MO).

For å redusere ikke-spesifikk binding ble hydridom-supernatantene fortynnet 1:2 i vaskebuffer inneholdende 0,1% BSA som fortynningsmiddel. 50 ul av fortynnede hybridomsuper-natanter ble deretter tilsatt til hver brønn og inkubert i 1 time ved 4°C på en gyrorister for å bringe den monoklonale, antistoffholdige supernatant i kontakt med bundet forbindelse 4. Etter to vaskinger hver på 2 minutter ble 50 ul peroxydase-merket geite-anti-muse-IgG + IgM (Tago, Burlingame, CA), fortynnet 1:1000, tilsatt til hver brønn, og reaksjonsblandingen ble inkubert ved 4°C i 1 time for å binde det merkede antistoff til bundet, monoklonalt antistoff.

Substratet anvendt for å bestemme bundet peroxydase-aktivitet, ble fremstilt like før bruk og besto av 400 ug/ml o-fenylendiamin (Sigma, St. Louis, MO) i 80 mM citrat-fosfatbuffer, pH 6,0, inneholdende 0,12% H202. Etter to sluttelige vaskinger ble 50 ul substratløsning tilsatt til hver brønn, og fargen fikk utvikles i 15 minutter i mørket. Fargeutviklingen ble stanset ved tilsetning av 25 ul 4 molar (M) H2S04 til hver brønn, og den optiske densitet ved 4 92 nanometer (nm) ble målt med en "Multiskan" ELISA-plateleser.

IX. Kinetiske målinger

Rensede, monoklonale antistoffer ble dialysert mot EPPS-buffer (1 mM, pH 8,0, 100 mM NaCl) eller CHES-buffer

(1 mM, pH 8,0, 100 mM NaCl). Dens proteinkonsentrasjon ble bestemt ved BCA-metoden (Pierce). Bestemmelser ble utført ved HPLC (revers-fasekolonne, C18, "Vydac 201TP54") med CH3CN/H20 (0, 1% TFA) på et isokratisk program på 10/90. En indre standard av o-acetamidofenol ble anvendt for å beregne mengden av dannet produkt [4-(carboxybutyramido)fenol] .

Antistofflagerløsninger ble fortynnet i 1 ml av den egnede buffer [50 mM, EPPS (pH 7,2-8,6); CHES (pH 8,6-10,0), 100 mM NaCl] under dannelse av en sluttelig proteinkonsentrasjon på 20 uM. Reaksjoner inneholdt 5% koløsningsmiddeldioxan, og temperaturen ble opprettholdt ved 37 + 0,1°C. De opprinnelige, lineære hastigheter ble målt ved <5% hydrolyse av det totale substrat. Antistoffer som ble testet, ble funnet å være stabile i minst 48 timer under reaksjonsbetingelsene som bestemt ved ELISA-bindingsbestemmelser. De observerte hastigheter ble korrigert for den ukatalyserte hydrolysehastighet i fravær av antistoff. Kinetiske parametere Vmaks. Km ble bestemt ved ikke-lineær minste kvadraters tilpasning av den opprinnelige hastighet versus substratkonsentrasjon til en hyperbolisk kurve beskrevet av Michaelis-Menten-ligningen.

Variasjonen av opprinnelige hastigheter som en funksjon av pH ble målt i CHES (50 mM) (100 mM NaCl) ved en pH-verdi over 8,6 og i EPPS (50 mM) (100 mM NaCl) ellers. Det var ingen forskjell i de observerte hastigheter med antistoff 27A6 når det ble testet ved pH 8,6 i EPPS og CHES (50 mM) (100 mM NaCl). Variasjon av bufferionkonsentrasjonen (12,5-50 mM) viste ingen avhengighet av Kkat/ (antistoff 27A6) av nærvær av bufferarter.

Ligning 1 beskriver pH-hastighetsprofilen erholdt for hydrolysehastigheten (KobSd) av forbindelse 3_ ekstrapolert til null-bufferkonsentrasjon. Bruice et al. Bioorganic Chemistry, vol. 1; Benjamin: New York (1965).

Kobsd = Koh tom

Kurven for fylte kvadrater (figur 3b) ble utviklet ved å vari-ere konsentrasjonen av buffer (12,5 mM-50 mM) ved en fastsatt konsentrasjon av forbindelse 3_ (400 uM) over pH-området 7,2-10,0. De anvendte buffere og deres pH-område som ble testet, var nøyaktig det samme som beskrevet ovenfor. Verdien for Koh-kan beregnes fra helningen av en kurve av Kobs versus Kw/aH.

X. Kjemisk modifisering av antistoffer

(a) Fenylglyoxal; en 50 ul aliquot av en fenylgly-oxalløsning (6 mM) , (125 mM NaHC03, pH 7,5) ble tilsatt til 195 ul buffer, (125 mM, pH 7,5 NaHC03) , inneholdende 20 uM antistoff. Blandingen ble ristet og fikk stå i 1 time ved romtemperatur. Denne reaksjonsblanding ble deretter overført til en mikrodialysator (Pierce) og dialysert med 125 mM, pH 7,5 NaHC03 med en gjennomstrømning på ca. 150 ml/time i 2 timer. Mikrodialysatoren ble deretter spylt med 4 x 60 ml porsjoner av pH 8,4, 50 mM CHES, 100 mM NaCl og fikk stå i denne buffer over natten (ca. 15-18 timer). Mikrodialysatoren ble igjen spylt med 3 x 50 ml porsjoner av pH 8,4, 50 M CHES, 100 mM NaCl neste morgen. Prøvene ble fjernet, proteinkonsentrasjoner ble beregnet på nytt (BCA), og bestemmelser ble utført med hensyn til katalytisk aktivitet (HPLC) eller binding (ELISA). En lignende prosedyre ble anvendt med tilstedeværende hapten (200 uM). (b) Maleinsyreanhydrid; en 5 ml aliquot av en malein-syreanhydridløsning (0,06 M, dioxan) ble tilsatt til 299 ul 20 mM, pH 8,9 borat, 100 mM NaCl inneholdende 20 uM antistoff. Løsningen ble ristet og fikk stå ved romtemperatur i 1 time. Denne reaksjonsblanding ble deretter overført til en mikrodialysator og ble dialysert som beskrevet ovenfor med 50 mM CHES, pH 8,4, 100 mM NaCl. Prøver ble fjernet, proteinkonsentrasjoner ble beregnet (BCA), og bestemmelser ble utført med hensyn til katalytisk aktivitet eller binding. (c) Diethylpyrocarbonat; 10 ul av en 0,6 M diethyl-pyrocarbonatløsning i ethanol ble fortynnet i 1 ml natrium-acetat (NaOAc) (150 mM, pH 6, 100 mM NaCl). 5 ul av denne løs-ning ble tilsatt til 299 ul NaOAc (150 mM, pH 6,0, 100 mM NaCl) inneholdende 20 uM antistoff. Blandingen ble ristet og fikk stå ved 4°C over natten (ca. 15-18 timer). Denne reaksjonsblanding ble deretter overført til en mikrodialysator og dialysert som beskrevet ovenfor med CHES (50 mM, pH 8,4, 100

mM NaCl). Prøver ble fjernet, proteinkonsentrasjoner ble bestemt (BCA), og bestemmelser ble utført med hensyn på katalytisk aktivitet og binding.

Claims

1. Antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler som hydrolyserer en på forhånd valgt carboxylsyreamid- eller esterbinding av en reaktantligand katalytisk, hvor det antistoffkombinerende sete av angitte molekyler binder til:

(a) en reaktantligand inneholdende den på forhånd valgte carboxylsyreamid- eller esterbinding som skal hydrolyseres; og (b) en haptenisk ligand strukturelt analog med angitte reaktantligand som inneholder et tetraedrisk carbonatom bundet til en hydroxylgruppe så vel som til et mettet carbonatom ved en stilling i den hapteniske ligand svarende til stillingen av carbonylgruppen så vel som til det carbonylbundne heteroatom av den på forhånd valgte carboxylsyreamid-eller esterbinding som skal hydrolyseres, hvilken haptenisk ligand ytterligere innbefatter en gruppe som bærer en ionisk ladning i vandig oppløsning ved fysiologiske pH-verdier, og hvor den ioniske, ladningsbærende gruppe er fraværende fra en tilsvarende stilling på angitte reaktantligand og lokalisert innen et sfærisk volum definert ved en radius på ca. 7 Ång-strøm fra angitte, tetraedriske carbonatom.

2. Molekyler ifølge krav 1 hvori angitte, ioniske, ladningsbærende gruppe er bundet indirekte til angitte, tetraedriske carbonatom med minst ett atom som separerer angitte, tetraedriske carbonatom fra atomet av angitte, ladningsbærende gruppe som bærer den ioniske ladning.

3. Molekyler ifølge krav 1 som er monoklonale .antistoffer .

4. Molekyler ifølge krav 1 hvori angitte, hapteniske ligand inneholder et ammoniumion eller et carboxylation ved fysiologiske pH-verdier som angitte, ioniske, ladningsbærende gruppe. 5. Monoklonale antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler som hydrolyserer en på forhånd valgt carboxylsyreamid- eller esterbinding av en reaktantligand katalytisk, hvor det antistoffkombinerende sete av angitte molekyler binder til: (a) en reaktantligand inneholdende den på forhånd valgte carboxylsyreamid- eller esterbinding som skal hydrolyseres, hvilken reaktantligand er representert ved strukturen hvori R<1> og R2 betegner carbonatomholdige, kjemiske rester av reaktanten, og -X- er -0- eller -NR<3->, hvori R3 er hydrogen eller en tredje carbonholdig, kjemisk rest; og (b) en haptenisk ligand som er strukturelt analog med angitte reaktantligand, hvilken haptenisk ligand er representert ved strukturen hvori R<1>' og R<2>' betegner carbonatomholdige rester som er strukturelt analoge med R<1> og R<2>, og hvor minst én av R<1>' og R<2>' inneholder en gruppe som bærer en ionisk ladning i vandig løs-ning ved fysiologiske pH-verdier, minst én av angitte grupper som tilveiebringer ionisk ladning ved fysiologiske pH-verdier, er lokalisert innen et sfærisk volum definert ved en radius på i ca. 7 Ångstrøm fra angitte -CH-gruppe av angitte struktur, og hvor R<3>' er H når -X- er -0-, eller hvor R<3>' er strukturelt analog med R<3> når -X- er -NR<3->. 6. Molekyler ifølge krav 5, hvori -X- er -0-. 7. Molekyler ifølge krav 6, hvori angitte gruppe som bærer en ionisk ladning ved fysiologiske pH-verdier, er et ammoniumion eller et carboxylation. 8. Molekyler ifølge krav 7 som utskilles av hybridom 30C6 med ATCC deponeringsnr. HB 10341. 9. Molekyler ifølge krav 7 som utskilles av hybridom 27A6 med ATCC deponeringsnr. HB 10621. 10. Molekyler ifølge krav 5 hvori angitte, ioniske, ladningsbærende gruppe er bundet indirekte til angitte, tetraedriske carbonatom med minst ett atom som separerer angitte, tetraedriske carbonatom fra atomet til angitte, ladningsbærende gruppe som bærer den ioniske ladning, og hvori angitte, ioniske, ladningsbærende gruppe er lokalisert innen et sfærisk volum definert ved en radius på ca. 2 til ca.

5 Ång-strøm fra angitte, tetraedriske carbonatom. 11. Celler som når de dyrkes i et medium, danner monoklonale antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistof f kombinerende setedeler som hydrolyserer en på forhånd valgt carboxylsyreamid- eller esterbinding av en reaktantligand katalytisk, hvor det antistoffkombinerende sete av angitte molekyler binder til: (a) en reaktantligand inneholdende den på forhånd valgte carboxylsyreamid- eller esterbinding som skal hydrolyseres; og (b) en haptenisk ligand strukturelt analog med angitte reaktantligand som inneholder et tetraedrisk carbonatom bundet til en hydroxylgruppe så vel som til et mettet carbonatom ved en stilling i den hapteniske ligand svarende til stillingen av carbonylgruppen, så vel som til det carbonylbundne heteroatom, av den på forhånd valgte carboxylsyreamid-eller esterbinding som skal hydrolyseres, hvilken haptenisk ligand ytterligere innbefatter en gruppe som bærer en ionisk ladning i vandig oppløsning ved fysiologiske pH-verdier, hvilken ionisk ladningsbærende gruppe er fraværende fra angitte reaktantligand og lokalisert innen et sfærisk volum definert ved en radius på ca. 7 Ångstrøm fra angitte, tetraedriske carbonatom. 12. Celler ifølge krav 11 som er hybridomceller som ytterligere utskiller i dyrkningsmediet angitte, monoklonale antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoff omfattende setedeler som hydrolyserer angitte, på forhånd valgte carboxylsyreamid eller esterbinding katalytisk. 13 . Hybridomceller ifølge krav 12 som er de av hybridom 30C6 med ATCC deponeringsnr. HB 10341. 14. Hybridomceller ifølge krav 12 som er de av hybridom 27A6 med ATCC deponeringsnr. HB 10621. 15. Metode for katalytisk hydrolisering av en på forhånd valgt ester- eller amidbinding i et raktivt ligandmolekyl omfattende trinnene: (a) blanding av en katalytisk effektiv mengde av de monoklonale antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler ifølge krav 1 med angitte reaktantligandmolekyler i et vandig medium under dannelse av en reaksjonsblanding; og (b) opprettholdelse av angitte reaksjonsblanding i et tidsrom tilstrekkelig til at angitte reaktantligandmolekyler binder til angitte antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkominerende setedeler, og til at angitte antistoffmolekyler eller molekyler innehldende antistoffkombinerende setedeler derav får hydrolysere angitte på forhånd valgte binding katalytisk og danne produkter. 16. Metode ifølge krav 15 hvori angitte antistoffmolekyl er eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler derav, er utskilt av hybridom 30C6 med ATCC deponeringsnr. HB 10341 eller hybridom 27A6 med ATCC deponeringsnr. HB 10621. 17. Metode for fremstilling av celler som når de dyrkes i et medium, danner antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler som hydrolyserer en på forhånd valgt carboxylsyreamid- eller esterbinding av en reaktantligand katalytisk, omfattende trinnene: (a) immunisering av et dyr med et immunogen som innbefatter en haptenisk ligand som inneholder et tetraedrisk carbonatom bundet til en hydroxylgruppe så vel som til et mettet carbonatom ved en stilling i den hapteniske ligand svarende til stillingen av carbonylgruppen, så vel som til det carbonylbundne heteroatom, av den på forhånd valgte carboxylsyreamid- eller esterbinding som skal hydrolyseres, hvilken haptenisk ligand ytterligere innbefatter en gruppe som bærer en ionisk ladning i vandig oppløsning ved fysiologiske pH-verdier hvor den ioniske, ladningsbærende gruppe er fraværende fra en tilsvarende stilling av angitte reaktantligand og lokalisert innen et sfærisk volum definert ved en radius på ca. 7 Ångstrøm fra angitte tetraedriske carbonatom; (b) opprettholdelse av angitte dyr i et tidsrom tilstrekkelig til at det angitte dyr får utskille antistoffer som immunreagerer med angitte, hapteniske ligand; (c) overføring av gener som koder for antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler fra antistoffproduserende celler av angitte, opprettholdte, immuniserte dyr fra trinn (b) i vertceller under dannelse av hybridceller som inneholder gener fra minst to kilder, og hvilke dannede hybridceller (i) produserer antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler fra angitte, overførte gener når de dyrkes, og (ii) kan dyrkes hovedsakelig ubegrenset; (d) dyrkning av hybridcellene i et egnet dyrknings-medium i et tidsrom tilstrekkelig til at disse hybridceller får produsere antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler; (e) gjenvinning av antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler fra de dyrkede hybridceller; (f) screening av de erholdte antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler for å identifisere en hybridcelle som produserer antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler som hydrolyserer angitte på forhånd bestemte carboxylsyreamid-eller esterbinding katalytisk; og (g) dyrkning av kloner av angitte, identifiserte hybridcelle som produserer antistoffmolekyler eller molekyler inneholdende antistoffkombinerende setedeler som hydrolyserer angitte på forhånd bestemte carboxylsyreamid- eller esterbinding . 18. Metode ifølge krav 17 hvori cellene dannet i trinn (c), er hybridomceller.