JP5717138B2 - タンパク質固定化表面修飾材料 - Google Patents

Description

本発明は、単分子膜形成可能なタンパク質固定化表面修飾材料となる、ヒドロキシスクシンイミドエステルを導入したシラン化合物に関する。

バイオセンサー開発では、測定ターゲット化合物がタンパク質である場合が多く、検出法には抗原抗体反応が広く利用されている。検出法に抗原抗体反応を用いるためには、抗体をセンシング基板に固定化する必要がある。抗体固定化法として、疎水性相互作用などによる吸着を用いた物理固定化法と、自己集合膜構築やクリックケミストリーなどによる共有結合形成反応を用いた化学固定化法がある。どちらの手法を適用するかはセンシングシステムによるところが大きく、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーや導波モードセンサーなどの流路を用いたシステムで安定した応答を得るには、測定中に抗体が剥がれ落ちない化学固定化法が求められる。抗体化学固定化法として、活性エステルであるヒドロキシスクシンイミドエステルを用いた手法が知られている。この手法は穏和な条件で抗体を固定化できることから、抗体が失活する恐れの最も少ない手法の一つである。抗体のみならず、タンパク質やペプチド等、アミノ基を有する化合物ならば適用できる手法であることから、バイオチップ開発などにも応用されている（特許文献１）。
その一方で、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーや導波モードセンサーなどの高感度バイオセンサー開発では、センシング素子表面での分子認識をより感度よく検出するため、単分子膜を始めとするできるだけ薄い膜での表面修飾が求められる。この目的のために、センシング素子表面と反応する官能基であるチオールやシランなどを導入した薄膜表面修飾材料が開発されている。特にチオールを導入した表面修飾材料は、金表面に単分子膜修飾が容易にできることから、多方面で利用されている。その一方でシランを導入した化合物は、ガラス、布、プラスチック、カーボンなどの多様な材料表面を修飾でき、さらに単分子膜修飾も可能であることから、より汎用性のある薄膜表面修飾材料として知られている。
抗体をセンシング基板表面に化学固定化するための活性エステル基としてのヒドロキシスクシンイミドエステルをセンシング基板表面に導入する様々な手法が開発されている。センシング基板が金である場合、カルボキシル基を有するアルカンチオールを用いて単分子膜を構築し、続いて基板表面のカルボキシル基を縮合剤などを用いてヒドロキシスクシンイミドと反応させ、エステル化する手法が一般的である。シラン化合物と反応する基板の場合では、アミノ基を有するシラン化合物を用いて基板表面をアミノ化し、基板表面に導入されたアミノ基を足がかりとしてヒドロキシスクシンイミドエステルを導入するといった多段階手法が採られている（特許文献２、３）。これらの手法の問題点は、多段階であるが故の煩雑な手順に加え、基板表面の官能基を全て反応させることが不可能な固−液界面反応であることから、高感度化やハイスループット化を目指した、精緻な修飾表面構築ができないことである。
ヒドロキシスクシンイミドエステルを基板表面に一段階で導入可能な技術に関しては、アルキル鎖のω末端にヒドロキシスクシンイミドなどの活性エステル基を導入したシランカップリング剤が開発され、核酸、タンパク質など幅広いバイオマテリアルの固定化用基板に適用可能であることが報告されている（特許文献４）。しかしながら、当該文献中に記載されるヒドロキシスクシンイミドエステルを含有するシラン化合物は、精緻な単分子膜修飾表面を構築する必要のある高感度バイオセンサー用センシング素子の表面修飾には適さない。当該文献のシラン化合物は、その製造過程で分離しにくい副産物が混入することが避けられないので、減圧蒸留法など化合物にとって過酷な精製法を適用することになるが、当該精製法を適用できるのは、ヒドロキシスクシンイミドエステル基とシリル基とを繋ぐアルキル鎖長が短いものに限られる。そして、このような短いアルキル鎖長のシランカップリング剤では、単分子膜形成に必要な疎水性が得られない。特に、アルカンチオールによって構築される自己集合膜（ＳＡＭ）に匹敵するような高密度の単分子膜をシラン化合物で構築するためには、アルキル鎖の疎水性相互作用だけでは不十分であり、アミド基など水素結合形成性官能基に基づく分子間相互作用が必要であることが報告されている（非特許文献１）。
以上述べたように、バイオセンサーの高感度化・ハイスループット化を実現するために不可欠な技術として、センシング素子表面へのタンパク質を固定化するための精緻な修飾表面構築技術の確立が望まれており、具体的には、センシング素子表面の修飾材料として、一段階でヒドロキシスクシンイミドエステルを基板表面に導入でき、かつ自己集合膜に匹敵するような高密度単分子膜修飾が可能なシラン化合物の提供が望まれていた。

特許第３８８７６４７号 特開２００５−１２７７１４号公報 特開２００９−１５６８６４号公報 特開２００５−２２５７８９号公報

S. Song, J. Zhou, M. Qu, S. Yang, and J. Zhang, Langmuir, 2008, 24, 105-109.

本発明は、一段階でヒドロキシスクシンイミドエステルを基板表面に導入できるシラン表面修飾材料であって、バイオセンサーの高感度化・ハイスループット化を実現するセンシング素子表面の高密度単分子膜修飾が可能なタンパク質固定化用表面修飾材料を提供しようとするものである。

本発明者らは、タンパク質固定化のためのヒドロキシスクシンイミドエステル基を一段階で基板表面に導入できるシラン化合物であって、かつ高感度なバイオセンサー用センシング素子表面に対しても適用できるような、高密度単分子膜修飾構築が可能な修飾材料を目指し、鋭意研究した結果、ヒドロキシスクシンイミドエステルを有する酸ハロゲン化物とアミノ基を有するシラン化合物を反応させることによって、新規な下記一般式（１）の、アミド基を含有するヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物を提供することができた。当該シラン化合物は、一段階でヒドロキシスクシンイミドエステルを基板表面に導入可能な表面修飾材料として用いることができる。しかも、当該化合物の合成過程での副生成物はカラム精製法により除去可能で簡便に高純度に精製でき、自己集合膜に匹敵するような高密度単分子膜修飾が可能であるため、高感度バイオセンサー用センシング素子表面修飾に対しても適用できる。
このように、本発明のヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物（化合物１）は、アミド基を含有した新規化合物である点に特徴を有するものであるが、その合成方法の特徴も大きい。すなわち、本合成方法によると、ヒドロキシスクシンイミドエステルと酸ハロゲン化物の反応性差が大きいため、当該反応性の差を利用して酸クロライド部位のみを選択的にシラン化合物のアミノ基と反応させることが可能であり、その結果として目的とする化合物を慣用の精製操作によって高純度で単離できることができ、さらには、多様な分子設計が可能である。本手法によって提供される高純度なヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物を用いることによって、いろいろな材質のセンシング基板において精緻な修飾表面構築が可能になり、抗体を始めとする種々のタンパク質をセンシング基板に化学固定化することが可能になった。即ち、本発明は、高感度バイオセンサー開発に資する、抗体を初めとするタンパク質をセンシング基板に化学固定化する表面修飾材料として有望なヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物を提供するものである。
本願発明の新規化合物（化合物１）は、下記化学式（１）の一般式で記載することができ、下記化学式（２）及び化学式（３）を反応させて合成することができる（反応式１）。
化学式（１）
（式中、Ｘ_１〜Ｘ_３はそれぞれ独立してハロゲン、炭素数１〜３のアルコキシ基、又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。Ｒ_１は炭素数１〜１０の直鎖アルキル鎖を表し、Ｒ_２は−（ＣＨ_２）_ｍ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ−、又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−（ＣＨ_２）_ｍ−を表す。ｍは３〜３０の整数であり、ｎは０〜２０の整数であり、ｍ＋ｎ≧３である。）
化学式（２）
（式中、Ｒ_２は化学式（１）における定義と同じである。）
（化学式３）
（式中Ｘ_１〜Ｘ_３、Ｒ_１は、化学式（１）における定義と同じである。）

即ち、本発明は以下の通りのものである。
〔１〕 下記の化学式（１）で表される、ヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物（化合物１）；
化学式（１）
（式中、Ｘ_１〜Ｘ_３はそれぞれ独立してハロゲン、炭素数１〜３のアルコキシ基、又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。Ｒ_１は炭素数１〜１０の直鎖アルキル鎖を表し、Ｒ_２は−（ＣＨ_２）_ｍ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ−、又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−（ＣＨ_２）_ｍ−を表す。ｍは３〜３０の整数であり、ｎは０〜２０の整数であり、ｍ＋ｎ≧３である。）
〔２〕 前記〔１〕に記載のヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物（化合物１）の製造方法であって、
下記化学式（２）で表される
化学式（２）
（式中、Ｒ_２は化学式（１）の定義と同じである。）
と、下記化学式（３）で表される
化学式（３）
（式中、Ｘ_１〜Ｘ_３、Ｒ１は、化学式（１）の定義と同じである。）
とを反応させることを特徴とする、方法。
〔３〕 前記〔１〕に記載のヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物からなる単分子膜であって、基板表面の少なくとも１部を修飾している単分子膜。
〔４〕 前記〔３〕に記載の単分子膜により、少なくとも表面の１部が修飾されている基板。
〔５〕 前記基板が導波モードセンサーで用いるバイオセンシング素子である、前記〔４〕に記載の基板。
〔６〕 前記〔４〕又は〔５〕に記載の基板表面に抗体又は他のタンパク質若しくはペプチドが固定化された基板であって、当該基板表面で単分子膜を構成するシラン化合物中の少なくとも１部のヒドロキシスクシンイミド基が、抗体又は他のタンパク質若しくはペプチドのアミノ基と置換されている、固定化基板。

本発明のヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物を用いることで、一段階でヒドロキシスクシンイミドエステルを基板表面に導入でき、かつ自己集合膜に匹敵するような高密度単分子膜修飾が可能となったため、高感度バイオセンサー用のセンシング素子表面構築に向けて、抗体など種々のタンパク質を精密に構造制御しつつセンシング基板に化学固定化することが可能になった。

レプチン抗体を用いた抗原抗体反応 縦軸は反射率ピーク波長シフト値（単位ｎｍ）を表し、図中、Ｃ１２Ｅｓはヒドロキシスクシンイミドエステル−ドデカン二酸−トリエトキシシラン化合物を、Ｃ１６Ｅｓはヒドロキシスクシンイミドエステル−ヘキサデカン二酸−トリエトキシシラン化合物を、Ｃ２０Ｅｓはヒドロキシスクシンイミドエステル−エイコサン二酸−トリエトキシシラン化合物を表す。 Ｃ１２Ｅｓ：Ｍ３ＥＧの混合比を変化させた場合の抗原抗体反応 Ｃ１２Ｅｓ：Ｍ３ＥＧのモル比を１：１０００、１：１００、１：１０、及び１：０に変化させて図１と同様に反射率ピーク波長シフト値を測定した。

１．本発明のヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物について
本発明のヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物は文献未記載の化合物であり、いろいろな材質のセンシング基板を単分子膜修飾することが可能である。修飾した表面は優れたタンパク質化学固定化効果を示し、高感度バイオセンシング基板の構築材料として有望である。本発明では、合成したヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物のタンパク質化学固定化効果を評価するために、導波モードセンサーチップを表面修飾し、レプチン抗体を用いた抗原抗体反応応答性を検討した。
本発明のヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物（化合物１）は下記の一般式化学式（１）で表される。
化学式（１）

上記式中、Ｘ_１〜Ｘ_３はそれぞれ独立してハロゲン、炭素数１〜３のアルコキシ基、又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。ただし、Ｘ_１〜Ｘ_３のうちの少なくとも１つはハロゲン、又は炭素数１〜３のアルコキシ基である。ここで、アルコキシ基としては、メトキシ基又はエトキシ基が好ましい。
Ｒ_１は炭素数１〜１０、好ましくは炭素数２〜５の直鎖アルキル鎖を表し、Ｒ_２は−（ＣＨ_２）_ｍ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ−、又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−（ＣＨ_２）_ｍ−を表す。ｍは３〜３０、好ましくは８〜２０の整数であり、ｎは０〜２０、好ましくは０〜１０の整数であり、ｍ＋ｎ≧３、好ましくはｍ＋ｎ≧８である。
なお、本明細書中の化学式、反応式内で用いている記号、符号は、同一記号、符号であればそれぞれ全て同じ意味を表す。

２．本発明のヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物の製造法
以下、本発明のヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物の製造法を説明する。
（２−１）ヒドロキシスクシンイミドエステルを有する酸クロライドの合成
まず下記反応式に示すように、ジカルボン酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドを、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）やベンゾトリアゾールイルテトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ）などの縮合剤を用いて反応させることによって、ヒドロキシスクシンイミドモノエステルカルボン酸を合成することができる。ここで用いる原料化合物は、いずれも市販品として入手可能である。
得られたヒドロキシスクシンイミドモノエステルカルボン酸は、定法に従ってシュウ酸クロライドや塩化チオニルで処理することによって、対応する酸クロライドへと変換される。
なお、上記式中、Ｒ_２は化学式（１）の定義と同じである。

（２−２）ヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物の合成
本発明の最終目的物であるヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物を得るためには、上記（反応式３）により合成されたヒドロキシスクシンイミドエステルを有する酸クロライドと共に、下記化学式（３）で表されるアミノ基を有するシラン誘導体が必要であるが、当該シラン誘導体は、ほとんど市販化合物として入手可能である。例えば、３−アミノプロピルトリハロゲン化シラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシランなどが東京化成社などにより市販されている。本実施例では、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（東京化成社製）を用いている。
化学式（３）
なお、上記式中、Ｘ_１〜Ｘ_３、Ｒ_１は、化学式（１）の定義と同じである。
そして、当該化学式（３）のシラン誘導体を、上記（反応式３）に従って合成した下記化学式（２）のヒドロキシスクシンイミドエステルを有する酸クロライドと、下記（反応式１）に従ってアミド化反応させることによって、目的とするヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物を得ることができる。この反応自体は古くから知られている反応であるが、本反応では、同じカルボン酸活性基であるヒドロキシスクシンイミドエステルと酸ハロゲン化物では、そのカルボン酸活性が大きく違うために精製の妨げになる副産物の産生がほぼ無視できることを見いだしたことに特徴がある。
化学式（２）
なお、上記式中、Ｒ_２は化学式（１）の定義と同じである。
この反応は、触媒としてトリエチルアミン、ピリジン、ジメチルアミノピリジンなどの塩基性触媒を用いて行うことができる。触媒として、好ましくはトリエチルアミンが使用される。
使用される溶媒としては、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ベンゼン、アセトニトリル等の有機溶媒であるが、好ましくはテトラヒドロフランを用いて行われる。
酸クロライドとシラン化合物の反応割合は、前者１モルに対して後者を０．８〜１．２モル程度、好ましくは等モル程度とすればよい。触媒の使用量は、オレフィン誘導体１モルに対して１〜１０モル、好ましくは２モル程度とすればよい。反応温度は０〜５０℃程度、好ましくは室温とし、反応時間は１２時間程度とすればよい。メトキシオリゴエチレングリコールを導入したカルボン酸誘導体とシラン誘導体の反応割合は、前者１モルに対して後者を０．５〜２モル程度、好ましくは等モル程度とすればよい。
このようにして得られるヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物は、慣用されている精製法、例えばＨＰＬＣ法、カラムクロマトグラフィー法、薄層クロマトグラフィー法などにより、又はこれら手法を組み合わせることによって容易に単離精製できる。
また、本発明の目的物が合成できたことは、ＮＭＲや質量分析等により確認できる。

３．本発明のヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物を用いた基材表面の単分子膜など薄膜形成方法
本発明のヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物は、ペプチドアレイ、抗体アレイ、ＤＮＡチップなどのようなタンパク質などの特異的結合を厳密に測定するための高感度の各種バイオセンシング素子、チップに用いられる種々の材料表面、例えばシリカ、窒化ケイ素、酸化処理プラスチック、酸化処理カーボンのチップ表面に抗体などタンパク質を単分子膜状に固定化できる表面を形成することができる。そして、このように精緻なタンパク質固定化単分子膜を形成できることから、広範なバイオセンシング素子表面修飾材料として有効に利用できる。そして、これらのセンシング素子の他、ヒドロキシスクシンイミドエステル基という活性エステル基を有するシランカップリング剤として用いることもできるので、両反応基の特質を生かして、基板表面に核酸、各種ペプチド、糖類、脂質などを固定化するバイオチップ用基板表面の修飾材料としても用いることができ、またその際の基板の材質もガラスなどのシリル基を有するものに限られず、紙、繊維、ステンレスなど幅広く対象とすることもできる。本発明において「基板」というとき、センシング素子として用いるチップなどを含め、本発明の修飾対象となる表面を有する基材一般を指すものとする。
本発明において、基板の表面が本発明のヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物のシリル基と共有結合を形成した単分子膜などの薄膜により被覆されることを「表面修飾」という。
本発明のヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物を用いて基板表面を薄膜修飾するための手法として、単分子膜を形成させるためには、浸積法を用いることが好ましい。典型的な浸積手法としては、修飾したい基材、チップなどを完全に洗浄し乾燥した後、本発明のヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物の溶液中に当該基材、チップなどを浸積し、洗浄、乾燥する方法を適用できる。一般には、浸積法の他、塗布、噴霧方法を用いることができ、スポット状に修飾する場合は、インクジェットなど印刷機技術が転用できる。また、抗体、ペプチドなどの固定化対象物質を配置しようとする一部表面のみを修飾することも可能である。対象となる基板、基材の形状、大きさはどのようなものでもよいが、単分子膜形成を要するセンシング素子の場合は、取り外し可能で浸積工程に供しやすいチップ状が好ましい。
ヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物の溶剤としてはシラン化合物を分解しない有機溶媒であれば何でも使用することができるが、典型的なものとしては、トルエン、エタノール、ＴＨＦがある。ただし、基材の材質がプラスチックの場合は、プラスチック溶解性のあるトルエン、ＴＨＦなどは用いることができないので、エタノールなどのアルコール系溶媒が好ましい。
導波モードセンサーなど高感度バイオセンサー用のセンシング素子のように、自己組織化膜のような高密度の単分子膜形成が求められる場合の基板表面修飾及び抗体固定化の手順は、例えば、以下の様な手順で行うことができる。
(1)アセトン中で１０分間超音波洗浄
(2)エタノール中で５分間超音波洗浄
(3)１時間減圧乾燥
(4)合成した化合物の１ｍＭトルエン溶液に浸積
(5)アセトン中で１分間超音波洗浄後、エタノールで洗浄
(6)抗体溶液に浸積２４時間、抗体濃度：２０μｇ／ｍｌ
(7)ＰＢＳ洗浄
ここで、上記(4)のチップの合成化合物溶液中への浸積時間と温度は、用いるヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物により左右され、Ｃ１２Ｅｓの場合、０℃〜８０℃で３〜４８時間、好ましくは室温〜５０℃で５〜２４時間、Ｃ１６Ｅｓの場合、室温〜８０℃で５〜４８時間、好ましくは５０℃で１２〜２４時間、Ｃ２０Ｅｓの場合、室温〜８０℃で１０〜７２時間、好ましくは５０℃で１２〜４８時間である。
抗体、他のタンパク質、ペプチド類の固定化方法では、活性エステル固定化法が有効であることが知られている。ヒドロキシスクシンイミドエステルはきわめて活性なエステル基であり、固定化したい化合物がアミノ基を有する場合、混合するだけでアミノ基と反応してアミド基を形成し、抗体、他のタンパク質、ペプチド類を基板上に固定化できる。

４．ヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物の単分子膜形成性の評価方法
本実施例で用いた手法は、上記３．の基板表面修飾手法の適用により単分子膜を形成し、タンパク質の非特異吸着抑制という機能を発揮していることをすでに確認済みの化合物（Ｍ３ＥＧ）に、本発明化合物を加えることによる修飾表面の機能変化を観察するという定性的手法である。Ｍ３ＥＧに本発明化合物を加えることによって修飾表面に抗体を固定できるようになり、抗原抗体反応による波長シフト値を測定することで固定された抗体量を推定できる。よってＭ３ＥＧと本発明化合物の混合比と表面に固定された抗体量の相関、及びＭ３ＥＧと本発明化合物が単分子膜を形成したと仮定したときの各分子の専有面積を用いて計算により推定される抗体固定量を比較検討することにより、本発明化合物はＭ３ＥＧと混合したときはもちろんのこと、単独でも単分子膜形成能があることを確かめることができる。
なお、単分子膜が形成されたことを物理的（定量的）手法で確認する場合には、上記３．基板表面修飾及び抗体固定化手順(５)の後、ＸＰＳ（Ｘ線光電子分光法）やエリプソメトリー（偏光解析法）などの膜組成や膜厚測定法により確認することができる。

以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はそれに限られるものではない。

（実施例１）ヒドロキシスクシンイミドエステル−ドデカン二酸−トリエトキシシラン（Ｃ１２Ｅｓ）の合成
（１−１）ドデカン二酸モノスクシンイミドエステルの合成
三口フラスコ（３００ｍＬ）にドデカン二酸９２０ｍｇ（４ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド５５０ｍｇ（４．４ｍｍｏｌ）、ジオキサン１００ｍＬ、酢酸エチル１００ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）９０８ｍｇ（４．４ｍｍｏｌ）の酢酸エチル溶液６０ｍＬを滴下し、０℃で１時間、室温で１２時間撹拌した。反応液に酢酸０．５ｍＬを加え、３０分撹拌し、過剰のＤＣＣを分解した。生成したジシクロヘキシルアミドをろ別し、ジオキサン、酢酸エチルを留去した。得られた固体に酢酸エチル１００ｍＬとクロロホルム１０ｍＬを加え、不溶物をろ別した。酢酸エチル、クロロホルムを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１００：０→１）にて目的物を精製した。
無色固体
収率４０％

（１−２）ドデカン二酸クロライドスクシンイミドエステルの合成
ナスフラスコ（２００ｍＬ）にドデカン二酸モノスクシンイミドエステル３２７ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、オキザリルクロライド２５４ｍｇ（２ｍｍｏｌ）、ベンゼン４０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。ＤＭＦ３滴を加え、室温で６時間撹拌した。ベンゼン、オキザリルクロライドを留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
褐色液体
粗収率１００％

（１−３）スクシンイミドエステルドデカン酸−シランの合成
ナスフラスコ（２００ｍＬ）に窒素雰囲気下モノスクシンイミドエステルドデカン二酸モノクロライド３４６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）と脱水ＴＨＦ５０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。アミノプロピルトリエトキシシラン２２１ｍｇ（１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン２０２ｍｇ（２ｍｍｏｌ）の脱水ＴＨＦ１０ｍＬを激しく撹拌しながら加え、窒素雰囲気下室温で１２時間撹拌した。ＴＨＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：エタノール＝１００：０→２）にて目的物を精製した。
無色液体
収率６９％
^１Ｈ−ＮＭＲ；（ＣＤＣｌ_３、５００ＭＨｚ）δ：０．６３（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝８．２５Ｈｚ)、１．２２（９Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．１０Ｈｚ）、１．２５〜１．４３（１２Ｈ、ｍ）、１．５７〜１．６５（４Ｈ、ｍ）、１．６９〜１．７７（２Ｈ、ｍ）、２．１４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．８０Ｈｚ）、２．５９（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．５５Ｈｚ）、２．８３（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．６０Ｈｚ）、３．２４（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．５７Ｈｚ）、３．８１（６Ｈ、ｑ、Ｊ＝７．０２Ｈｚ）、５．６９（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝５．２８Ｈｚ）

（実施例２）ヒドロキシスクシンイミドエステル−ヘキサデカン二酸−トリエトキシシラン（Ｃ１６Ｅｓ）の合成
（２−１）ヘキサデカン二酸モノスクシンイミドエステルの合成
三口フラスコ（３００ｍＬ）にヘキサデカン二酸１．１５ｇ（４ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド５５０ｍｇ（４．４ｍｍｏｌ）、ジオキサン２００ｍＬ、酢酸エチル２００ｍＬ、ＤＭＦ５０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）９０８ｍｇ（４．４ｍｍｏｌ）の酢酸エチル溶液６０ｍＬを滴下し、室温で１２時間撹拌した。反応液に酢酸０．５ｍＬを加え、３０分撹拌し、過剰のＤＣＣを分解した。生成したジシクロヘキシルアミドをろ別し、ジオキサン、酢酸エチルを留去した。得られた固体に酢酸エチル１５０ｍＬとクロロホルム１５ｍＬを加え、不溶物をろ別した。酢酸エチル、クロロホルムを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１００：０→１）にて目的物を精製した。
無色固体
収率４５％

（２−２）ヘキサデカン二酸クロライドスクシンイミドエステルの合成
ナスフラスコ（２００ｍＬ）にヘキサデカン二酸モノスクシンイミドエステル３８３ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、オキザリルクロライド２５４ｍｇ（２ｍｍｏｌ）、ベンゼン４０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。ＤＭＦ３滴を加え、室温で６時間撹拌した。ベンゼン、オキザリルクロライドを留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
褐色液体
粗収率１００％

（２−３）スクシンイミドエステルヘキサデカン酸−シランの合成
ナスフラスコ（２００ｍＬ）に窒素雰囲気下モノスクシンイミドエステルヘキサデカン二酸モノクロライド４０２ｍｇ（１ｍｍｏｌ）と脱水ＴＨＦ５０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。アミノプロピルトリエトキシシラン２２１ｍｇ（１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン２０２ｍｇ（２ｍｍｏｌ）の脱水ＴＨＦ１０ｍＬを激しく撹拌しながら加え、窒素雰囲気下室温で１２時間撹拌した。ＴＨＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：エタノール＝１００：０→２）にて目的物を精製した。
無色固体
収率４９％
^１Ｈ−ＮＭＲ；（ＣＤＣｌ_３、５００ＭＨｚ）δ：０．６３（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝８．２５Ｈｚ)、１．２２（９Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．１０Ｈｚ）、１．２３〜１．４４（２０Ｈ、ｍ）、１．５７〜１．６６（４Ｈ、ｍ）、１．６９〜１．７８（２Ｈ、ｍ）、２．１４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．８０Ｈｚ）、２．５９（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．５５Ｈｚ）、２．８３（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．５０Ｈｚ）、３．２５（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．５７Ｈｚ）、３．８１（６Ｈ、ｑ、Ｊ＝７．０２Ｈｚ）、５．６９（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝５．７３Ｈｚ）

（実施例３）ヒドロキシスクシンイミドエステル−エイコサン二酸−トリエトキシシラン（Ｃ２０Ｅｓ）の合成
（３−１）エイコサン二酸モノスクシンイミドエステルの合成
三口フラスコ（３００ｍＬ）にエイコサン二酸１．３７ｇ（４ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド５５０ｍｇ（４．４ｍｍｏｌ）、ジオキサン２００ｍＬ、酢酸エチル２００ｍＬ、ＤＭＦ５０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）９０８ｍｇ（４．４ｍｍｏｌ）の酢酸エチル溶液６０ｍＬを滴下し、室温で１２時間撹拌した。反応液に酢酸０．５ｍＬを加え、３０分撹拌し、過剰のＤＣＣを分解した。生成したジシクロヘキシルアミドをろ別し、ジオキサン、酢酸エチルを留去した。得られた固体に酢酸エチル２００ｍＬとクロロホルム２０ｍＬを加え、不溶物をろ別した。酢酸エチル、クロロホルムを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝１００：０→１）にて目的物を精製した。
無色固体
収率４５％

（３−２）エイコサン二酸クロライドスクシンイミドエステルの合成
ナスフラスコ（２００ｍＬ）にエイコサン二酸モノスクシンイミドエステル４４０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、オキザリルクロライド２５４ｍｇ（２ｍｍｏｌ）、ベンゼン４０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。ＤＭＦ３滴を加え、室温で６時間撹拌した。ベンゼン、オキザリルクロライドを留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
褐色液体
粗収率１００％

（３−３）スクシンイミドエステルエイコサン酸−シランの合成
ナスフラスコ（２００ｍＬ）に窒素雰囲気下モノスクシンイミドエステルエイコサン二酸モノクロライド４５８ｍｇ（１ｍｍｏｌ）と脱水ＴＨＦ５０ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。アミノプロピルトリエトキシシラン２２１ｍｇ（１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン２０２ｍｇ（２ｍｍｏｌ）の脱水ＴＨＦ１０ｍＬを激しく撹拌しながら加え、窒素雰囲気下室温で１２時間撹拌した。ＴＨＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：エタノール＝１００：０→２）にて目的物を精製した。
無色固体
収率２１％
^１Ｈ−ＮＭＲ；（ＣＤＣｌ_３、５００ＭＨｚ）δ：０．６３（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝８．０３Ｈｚ)、１．２２（９Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．１０Ｈｚ）、１．２３〜１．４４（２８Ｈ、ｍ）、１．５８〜１．６６（４Ｈ、ｍ）、１．６９〜１．７８（２Ｈ、ｍ）、２．１４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．７８Ｈｚ）、２．６０（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．５８Ｈｚ）、２．８３（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．９５Ｈｚ）、３．２５（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．７２Ｈｚ）、３．８２（６Ｈ、ｑ、Ｊ＝７．０３Ｈｚ）、５．６８（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝５．２８Ｈｚ）

（実施例４）ヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物のタンパク質固定化機能評価
合成したＣ１２Ｅｓ、Ｃ１６Ｅｓ、Ｃ２０Ｅｓを用いて導波モードセンサーシリカチップの表面修飾を行い、修飾表面のタンパク質固定化効果を、糖尿病の疾病マーカーの一つとして知られているタンパク質、レプチン（ヒト由来、（株）免疫生物研究所製）およびレプチンに結合する抗体（抗ヒトレプチンモノクロナール抗体、ＩｇＧ１κ型、ミクリ免疫研究所（株）製）を用いて抗原抗体反応を行い評価した。チップの表面修飾及び抗体固定化は、
(1)アセトン中で１０分間超音波洗浄
(2)エタノール中で５分間超音波洗浄
(3)１時間減圧乾燥
(4)合成した化合物の１ｍＭトルエン溶液に浸積
(5)アセトン中で１分間超音波洗浄後、エタノールで洗浄
(6)抗体溶液に浸積２４時間、抗体濃度：２０μｇ／ｍｌ
(7)ＰＢＳ洗浄
という手順で行った。浸積条件は、Ｃ１２Ｅｓは室温で浸積１５時間、Ｃ１６Ｅｓは５０℃で浸積１５時間、Ｃ２０Ｅｓは５０℃で２４時間である。
導波モードセンサーにおける反射率ピークの波長シフト測定は、まずＰＢＳ中でピーク波長を測定し、１μｇ／ｍＬのレプチン溶液に１０分間浸積した後ＰＢＳ溶液で洗浄し、再びピーク波長の測定を行い、その波長シフト値を求め、抗原抗体反応の有無を判定した。
図１に、それぞれの化合物で表面修飾した場合の反射率ピーク波長シフト値を示した。抗体を固定化したチップは、いずれも１μｇ／ｍＬレプチン溶液に浸積、ＰＢＳ洗浄後においてピーク波長シフトが観測された。このピーク波長シフトが抗原抗体反応に由来することを証明するために、手順(6)で抗体溶液の代わりに緩衝液に２４時間浸したチップのピーク波長シフトを測定したところ、これらのチップではいずれも有意なピーク波長シフトは観測されなかったことより、観測されたピーク波長シフトは抗原抗体反応に由来するものであることが確認された（図１）。

（実施例５）ヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物の単分子膜形成性評価
実施例４と同様な手順で、Ｃ１２Ｅｓとタンパク質の非特異吸着を抑制するシラン化合物、Ｍ３ＥＧ（下記分子式）の混合溶液を種々のモル比で調整し、導波モードセンサーシリカチップの表面修飾を行った。レプチン抗原抗体反応を行い、Ｃ１２ＥｓとＭ３ＥＧの混合モル比による抗体固定量変化を検討し、Ｃ１２Ｅｓの単分子膜形成性を評価した。浸積条件は室温で浸積１５時間、溶液の濃度はいずれもＣ１２ＥｓとＭ３ＥＧの和が１ｍＭである。ここで用いるＭ３ＥＧ（メトキシトリエチレングリコール−トリエトキシシラン化合物）は、本発明者らが開発したメトキシオリゴエチレングリコール−シラン化合物の１つであり、この浸積条件下で高密度な単分子膜を形成することによってタンパク質の非特異吸着抑制効果を発揮していることが確認されている表面修飾材料である（特願２０１１−１００３１３号）。なお、Ｍ３ＥＧの合成方法は、下記（参考例１）に示す。
（Ｍ３ＥＧの構造）
ここでＭ３ＥＧと抗体の直径はおおよそ０．４ｎｍ及び１５ｎｍと見積もれることから、単分子膜中におけるそれぞれの専有面積比は約１：１０００であり、Ｍ３ＥＧ１０００分子に対してＣ１２Ｅｓは１分子あれば、単分子膜表面に固定化される抗体量は飽和に達することになる。実際にはＰＢＳ中では加水分解も起こるため、ヒドロキシスクシンイミドエステルがＢＳＡなどのタンパク質と反応する割合は約１０モル％であることがコントロール実験より明らかになっているので、Ｃ１２Ｅｓ：Ｍ３ＥＧのモル比が１：１００で抗体固定化量は飽和に達すると推定される。
図２に、種々の混合比のシラン化合物溶液で表面修飾した場合の反射率ピーク波長シフト値を示した。Ｃ１２Ｅｓ：Ｍ３ＥＧのモル比を１：１０００から１：１００というようにＣ１２Ｅｓの割合を増加させた場合、波長シフト値は大幅に増加した。しかしさらにＣ１２Ｅｓの割合を増した場合のＣ１２Ｅｓ：Ｍ３ＥＧモル比１：１０の溶液では、得られた波長シフト値はほぼ同じであった。以上の結果は、単分子膜が形成される場合にはＣ１２Ｅｓ：Ｍ３ＥＧモル比が１：１００において固定化される抗体量は飽和に達するという推定と一致している。さらにＣ１２Ｅｓ分子単独で修飾しても波長シフト値は同じであるという結果は、Ｍ３ＥＧとの混合単分子膜と同じ量の抗体が表面に固定化されていることを意味することから、Ｃ１２Ｅｓ分子単独でも単分子膜形成することを強く支持している。
以上の結果より、本発明で合成された新規化合物、Ｃ１２Ｅｓ、Ｃ１６Ｅｓ、Ｃ２０Ｅｓは、いずれもタンパク質を化学固定化する表面修飾材料として有用であり、アミド基を有することによって高密度な単分子膜を構築できることが明らかになった。

（参考例１）メトキシトリエチレングリコール−トリエトキシシラン化合物（Ｍ３ＥＧ）の合成
（参１−１）ジアゾ酢酸エチルの合成
三口フラスコ（１Ｌ）に亜硝酸ナトリウム３８．１ｇ（０．５５ｍｏｌ）、グリシンエチルエステル塩酸塩６８．４ｇ（０．４９ｍｏｌ）、酢酸ナトリウム１．３６ｇ、水２５０ｍｌを入れ、溶かした後に０℃に冷却する一方で、１０ｗｔ％硫酸水溶液２００ｍｌ、１０ｗｔ％炭酸ナトリウム水溶液５００ｍｌを調製し、同様に０℃に冷却した。冷却したジクロロメタン８０ｍｌと１０ｗｔ％硫酸水溶液３ｍｌを加え、０℃で５分間撹拌した後に分液ロートにてジクロロメタン層を分離し、水溶液は三口フラスコに、ジクロロメタン層は直ちに冷却した炭酸ナトリウム水溶液５０ｍｌで洗浄した後０℃で保存した。再び冷却したジクロロメタン８０ｍｌを加え、１０ｗｔ％硫酸水溶液１５ｍｌを３分かけて滴下し、０℃で３分間撹拌した後に分液ロートにてジクロロメタン層を分離し、水溶液は三口フラスコに、ジクロロメタン層は直ちに冷却した炭酸ナトリウム水溶液５０ｍｌで洗浄した後０℃で保存した。この操作をジクロロメタン層に黄色い着色がなくなるまで繰り返した（７〜８回）。集めたジクロロメタン層をまとめて等量の水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて一晩脱水し、溶液のまま次の反応に用いた。
黄色液体
粗収率８０％

（参１−２）メトキシトリエチレングリコールカルボン酸エチルエステルの合成
三口フラスコ（２Ｌ）にトリエチレングリコールモノメチルエーテル１６４ｇ（１．１８ｍｏｌ）、粗ジアゾ酢酸４５．１ｇ（３９２ｍｍｏｌ、ジクロロメタン溶液）、ジクロロメタン合計１．２Ｌを入れ、加熱還流した。三フッ化ホウ素エチルエーテル錯体エーテル溶液１．５ｍＬ（４７ｗｔ％）のジクロロメタン溶液４０ｍＬを還流が維持できる速度で３０分かけて滴下し、さらに３時間加熱還流した。放冷後反応液を水１Ｌに注ぎ、ジクロロメタン層を分離し、ジクロロメタン層はもう一度水１Ｌで洗浄した。ジクロロメタンを留去し、減圧蒸留にて目的物を精製した。
無色液体、ｂ．ｐ．１１５〜１２０℃／０．２ｍｍＨｇ
収率６５％

（参１−３）メトキシトリエチレングリコールカルボン酸の合成
三口フラスコ（３００ｍＬ）にメトキシトリエチレングリコールグリコールカルボン酸エチルエステル１２．５ｇ（５０ｍｍｏｌ）とＴＨＦ１００ｍＬを入れ、室温で撹拌した。水酸化ナトリウム１０．０ｇ（２５０ｍｍｏｌ）の水溶液１００ｍＬを加え、１２時間加熱還流した。放冷後反応液に濃塩酸を加えて酸性にし、ＴＨＦ、水を留去し、残渣にベンゼン１００ｍＬを加えて不溶物を除去した。ベンゼンを留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
無色液体
粗収率９７％

（参１−４）メトキシトリエチレングリコールカルボン酸クロライドの合成
ナスフラスコ（２００ｍＬ）に粗メトキシトリエチレングリコールカルボン酸１．１１ｇ（５ｍｍｏｌ）、オキザリルクロライド１．２７ｇ（１０ｍｍｏｌ）、ベンゼン８０ｍＬを入れ、室温で撹拌した。ＤＭＦ４滴を加え、室温で６時間撹拌した。ベンゼン、オキザリルクロライドを留去し、減圧乾燥してそのまま次の反応に用いた。
淡褐色液体
粗収率１００％

（参１−５）メトキシトリエチレングリコール−トリエトキシシラン化合物の合成
ナスフラスコ（３００ｍＬ）に窒素雰囲気下アミノプロピルトリエトキシシラン１．０８ｇ（６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン１．２１ｇ（１２ｍｍｏｌ）、脱水ＴＨＦ１００ｍＬを入れ、０℃で撹拌した。粗メトキシトリエチレングリコールカルボン酸クロライド１．２０ｇ（５ｍｍｏｌ）の脱水ＴＨＦ溶液３０ｍＬを滴下し、室温で１２時間撹拌した。ＴＨＦを留去し、シリカゲルカラム（クロロホルム：エタノール ＝１００：０→０．５）にて目的物を精製した。
無色液体
収率７９％
^１Ｈ−ＮＭＲ；（ＣＤＣｌ_３、５００ＭＨｚ）δ：０．６０（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝８．４８Ｈｚ)、１．１８（９Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．１０Ｈｚ）、１．５５〜１．６５（２Ｈ、ｍ）、３．２４（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．８８Ｈｚ）、３．３４（３Ｈ、ｓ）、３．４８〜３．５４（２Ｈ、ｍ）、３．５８〜３．６８（１０Ｈ、ｍ）、３．７８（６Ｈ、ｑ、Ｊ＝７．０２Ｈｚ）、３．９５（２Ｈ、ｓ）、３．９９（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝５．７０Ｈｚ）

Claims (6)

1. 下記の化学式（１）で表される、ヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物（化合物１）；
   化学式（１）
   （式中、Ｘ_１〜Ｘ_３はそれぞれ独立してハロゲン又は炭素数１〜３のアルコキシ基を表す。Ｒ_１は炭素数１〜１０の直鎖アルキル鎖を表し、Ｒ_２は−（ＣＨ_２）_ｍ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ−、又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−（ＣＨ_２）_ｍ−を表す。ｍは３〜３０の整数であり、ｎは０〜２０の整数であり、ｍ＋ｎ≧３である。）
2. 請求項１に記載のヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物（化合物１）の製造方法であって、
   下記化学式（２）で表される
   化学式（２）
   （式中、Ｒ_２は化学式（１）の定義と同じである。）
   と、下記化学式（３）で表される
   化学式（３）
   （式中、Ｘ_１〜Ｘ_３、Ｒ１は、化学式（１）の定義と同じである。）
   とを反応させることを特徴とする、方法。
3. 請求項１に記載のヒドロキシスクシンイミドエステル−シラン化合物からなる単分子膜であって、基板表面の少なくとも一部を修飾している単分子膜。
4. 請求項３に記載の単分子膜により、少なくとも表面の一部が修飾されている基板。
5. 前記基板が導波モードセンサーで用いるバイオセンシング素子である、請求項４に記載の基板。
6. 請求項４又は５に記載の基板表面に抗体又は他のタンパク質若しくはペプチドが固定化された基板であって、当該基板表面で単分子膜を構成するシラン化合物中の少なくとも一部のヒドロキシスクシンイミド基が、抗体又は他のタンパク質若しくはペプチドのアミノ基と置換されている、固定化基板。