FI95928B - Molekyylit, joissa on vasta-ainetta liittävät kohdat ja joilla on stereospesifinen katalyysi - Google Patents
Molekyylit, joissa on vasta-ainetta liittävät kohdat ja joilla on stereospesifinen katalyysi Download PDFInfo
- Publication number
- FI95928B FI95928B FI913427A FI913427A FI95928B FI 95928 B FI95928 B FI 95928B FI 913427 A FI913427 A FI 913427A FI 913427 A FI913427 A FI 913427A FI 95928 B FI95928 B FI 95928B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- ligand
- reactant
- molecules
- receptor
- analog
- Prior art date
Links
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 title description 13
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 title description 11
- 238000005304 joining Methods 0.000 title description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 title 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 183
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 45
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 41
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 37
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 24
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 89
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 89
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 46
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 44
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 42
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 39
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 37
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 37
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 32
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 30
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 25
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 22
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- -1 p-nitro-carboxybenzoxy Chemical group 0.000 description 20
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 16
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 15
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 14
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 13
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 12
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 11
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 9
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 8
- FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N thionyl chloride Chemical compound ClS(Cl)=O FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical class OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 2-[2,4-di(pentan-2-yl)phenoxy]acetyl chloride Chemical compound CCCC(C)C1=CC=C(OCC(Cl)=O)C(C(C)CCC)=C1 NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BVMWIXWOIGJRGE-UHFFFAOYSA-N NP(O)=O Chemical compound NP(O)=O BVMWIXWOIGJRGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- VILAVOFMIJHSJA-UHFFFAOYSA-N dicarbon monoxide Chemical compound [C]=C=O VILAVOFMIJHSJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N morphine Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N 0.000 description 6
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 6
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical group [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 5
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- 102000027412 enzyme-linked receptors Human genes 0.000 description 4
- 108091008592 enzyme-linked receptors Proteins 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- QAEDZJGFFMLHHQ-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic anhydride Chemical compound FC(F)(F)C(=O)OC(=O)C(F)(F)F QAEDZJGFFMLHHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 3
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 102000005717 Myeloma Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010045503 Myeloma Proteins Proteins 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 3
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 3
- 150000001733 carboxylic acid esters Chemical class 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- JNGZXGGOCLZBFB-IVCQMTBJSA-N compound E Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@@H]1C(N(C)C2=CC=CC=C2C(C=2C=CC=CC=2)=N1)=O)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 JNGZXGGOCLZBFB-IVCQMTBJSA-N 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010931 ester hydrolysis Methods 0.000 description 3
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 150000008195 galaktosides Chemical class 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 229960005181 morphine Drugs 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N protoneodioscin Natural products O(C[C@@H](CC[C@]1(O)[C@H](C)[C@@H]2[C@]3(C)[C@H]([C@H]4[C@@H]([C@]5(C)C(=CC4)C[C@@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@H](CO)O4)CC5)CC3)C[C@@H]2O1)C)[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N 0.000 description 3
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WAPNOHKVXSQRPX-UHFFFAOYSA-N 1-phenylethanol Chemical compound CC(O)C1=CC=CC=C1 WAPNOHKVXSQRPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JWUFSYXQWPXFIL-UHFFFAOYSA-N 6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-6-oxohexanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O JWUFSYXQWPXFIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ILDXDBSWYJDHAL-UHFFFAOYSA-N 6-o-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 1-o-methyl hexanedioate Chemical compound COC(=O)CCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ILDXDBSWYJDHAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 2
- 239000008896 Opium Substances 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- RAHZWNYVWXNFOC-UHFFFAOYSA-N Sulphur dioxide Chemical compound O=S=O RAHZWNYVWXNFOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XPNGNIFUDRPBFJ-UHFFFAOYSA-N alpha-methylbenzylalcohol Natural products CC1=CC=CC=C1CO XPNGNIFUDRPBFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- IYYIVELXUANFED-UHFFFAOYSA-N bromo(trimethyl)silane Chemical compound C[Si](C)(C)Br IYYIVELXUANFED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007806 chemical reaction intermediate Substances 0.000 description 2
- IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N chlorotrimethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)Cl IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- VANNPISTIUFMLH-UHFFFAOYSA-N glutaric anhydride Chemical compound O=C1CCCC(=O)O1 VANNPISTIUFMLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 2
- 229960001027 opium Drugs 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- CXMXRPHRNRROMY-UHFFFAOYSA-N sebacic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCC(O)=O CXMXRPHRNRROMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 2
- LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoate Chemical compound C=1C=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YBADLXQNJCMBKR-UHFFFAOYSA-M (4-nitrophenyl)acetate Chemical compound [O-]C(=O)CC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 YBADLXQNJCMBKR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WAPNOHKVXSQRPX-ZETCQYMHSA-N (S)-1-phenylethanol Chemical compound C[C@H](O)C1=CC=CC=C1 WAPNOHKVXSQRPX-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 1-methylsulfonylpiperidin-4-one Chemical compound CS(=O)(=O)N1CCC(=O)CC1 RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001917 2,4-dinitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C(=C1*)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- GFHQKPORGZZMQS-UHFFFAOYSA-N 2-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)pentanedioyl dichloride Chemical compound ClC(=O)CCC(C(Cl)=O)N1C(=O)CCC1=O GFHQKPORGZZMQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CSEWAUGPAQPMDC-UHFFFAOYSA-N 2-(4-aminophenyl)acetic acid Chemical compound NC1=CC=C(CC(O)=O)C=C1 CSEWAUGPAQPMDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXOSUSANPOVCLP-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[(2,2,2-trifluoroacetyl)amino]phenyl]acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=C(NC(=O)C(F)(F)F)C=C1 PXOSUSANPOVCLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CSDQQAQKBAQLLE-UHFFFAOYSA-N 4-(4-chlorophenyl)-4,5,6,7-tetrahydrothieno[3,2-c]pyridine Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C1C(C=CS2)=C2CCN1 CSDQQAQKBAQLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZVAYUUUQOCPZCZ-UHFFFAOYSA-N 4-(diethoxyphosphorylmethyl)aniline Chemical compound CCOP(=O)(OCC)CC1=CC=C(N)C=C1 ZVAYUUUQOCPZCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical class NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000004092 Amidohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000531 Amidohydrolases Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000004308 Carboxylic Ester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000863 Carboxylic Ester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 238000003512 Claisen condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010024114 Complement 3b Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000015612 Complement 3b Receptors Human genes 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 229930182847 D-glutamic acid Natural products 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- YXHKONLOYHBTNS-UHFFFAOYSA-N Diazomethane Chemical compound C=[N+]=[N-] YXHKONLOYHBTNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 229920000305 Nylon 6,10 Polymers 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010064719 Oxyhemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 241001098054 Pollachius pollachius Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101100519432 Rattus norvegicus Pdzd2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001092391 Sorbus Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010640 amide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229940113721 aminocaproate Drugs 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N anhydrous glutaric acid Natural products OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N benzyl-alpha-carboxylic acid Natural products OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000012230 colorless oil Substances 0.000 description 1
- 229940125773 compound 10 Drugs 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229960000956 coumarin Drugs 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 239000002178 crystalline material Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 150000003950 cyclic amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001923 cyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 108010002255 deoxyhemoglobin Proteins 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 description 1
- BFUWRLFOXRAWGF-UHFFFAOYSA-N ethylsulfanylformic acid Chemical compound CCSC(O)=O BFUWRLFOXRAWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N jdtic Chemical compound C1([C@]2(C)CCN(C[C@@H]2C)C[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]2NCC3=CC(O)=CC=C3C2)=CC=CC(O)=C1 ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000001434 methanylylidene group Chemical group [H]C#[*] 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- UOBSVARXACCLLH-UHFFFAOYSA-N monomethyl adipate Chemical compound COC(=O)CCCCC(O)=O UOBSVARXACCLLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008345 mountainash Nutrition 0.000 description 1
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001209 o-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C(C([H])=C1[H])[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 150000002903 organophosphorus compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000004043 oxo group Chemical group O=* 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229960003424 phenylacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000003279 phenylacetic acid Substances 0.000 description 1
- RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N phosphamidon Chemical compound CCN(CC)C(=O)C(\Cl)=C(/C)OP(=O)(OC)OC RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000005541 phosphonamide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001476 phosphono group Chemical group [H]OP(*)(=O)O[H] 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012688 phosphorus precursor Substances 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Chemical group 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000012746 preparative thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012508 resin bead Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 1
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 150000003429 steroid acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- YBRBMKDOPFTVDT-UHFFFAOYSA-N tert-butylamine Chemical compound CC(C)(C)N YBRBMKDOPFTVDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 238000005924 transacylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 101150069452 z gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0002—Antibodies with enzymatic activity, e.g. abzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
- C07F9/38—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)]
- C07F9/40—Esters thereof
- C07F9/4071—Esters thereof the ester moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
- C07F9/4087—Esters with arylalkanols
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
- C07F9/38—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)]
- C07F9/42—Halides thereof
- C07F9/425—Acid or estermonohalides thereof, e.g. RP(=X)(YR)(Hal) (X, Y = O, S; R = H, or hydrocarbon group)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
. 95928
Molekyylit, joissa on vasta-ainetta liittävät kohdat ja joilla on stereospesifinen katalyysi - Molekyler med anti-kropp förenande ställen vilka uppvisar stereospecifik katalys 5 Tämä hakemus on osajatkoa yhteisesti haetulle hakemukselle sarjanr. 083681, jätetty elokuun 7. 1987, mikä on osajatkoa yhteisesti heatulle hakemukselle sarjanr. 055177, jätetty toukuun 28. 1987, mitkä esitykset on liitetty tähän viit-10 teeksi.
Tämä keksintö koskee vasta-aineita, antigeenejä ja immuno-geenejä ja tarkemmin molekyylejä, joissa on vasta-aineen liittävä kohta, joka sitoutuu stereospesifisesti ja stabi-15 loi amidin tetraedrisen hiiliatomin tai esterin hydrolyysin siirtymätilan ja katalysoi stereoselektiivisesti sellaisten sidosten hydrolyysin.
Sitoutumisilmiöllä ligandien ja reseptorien välillä on rat-20 kaiseva osuus biologissa systeemeissä. Tyypillisiä sellaisia ilmiöitä ovat happimolekyylien sitoutuminen deoksihemo-globiiniin oksihemoglobiinin muodostamiseksi ja substraatin sitoutuminen entsyymiin, joka vaikuttaa siihen, kuten proteiinin ja proteaasin kaltaisen trypsiinin välillä. Vielä 25 muita esimerkkejä biologisesta sitoutumisilmiöstä on anti-* - geenin sitoutuminen vasta-aineeseen ja täydellisen kompo nentti C3:n sitoutuminen niin kutsuttuun CRl-reseptoriin.
Monien lääkkeiden ja terapeuttisten aineiden uskotaan ole-30 van riippuvaisia sitoutumisilmiöstä. Esimerkiksi oopiumi- lääkkeiden, kuten morfiini, on raportoitu sitoutuvan spesi-*. fisiin reseptoreihin aivoissa. Opiumagonistien ja antago nistien on raportoitu kilpailevan lääkkeiden, kuten morfiinin, kanssa noista liittävistä kohdista.
Ligandit, kuten ihmisen tekemät lääkkeet, kuten morfiini ja sen johdannaiset ja sellaiset, joita on luonnostaan biolo- 35 - 95928 2 gisissa systeemeissä, kuten endofiinit ja hormonit, sitoutuvat reseptoreihin, joita on luonnostaan biologissa systeemeissä ja niitä käsitellään tässä yhdessä. Sellainen sitoutuminen saattaa johtaa lukuisiin ilmiöihin biologiassa, 5 erityisesti amidi- ja esterisidosten hydrolyysi, milloin proteiinit hydrolysoidaan polypeptidin ainesosiin entsyymin, kuten trypsiini tai papaiini, toimesta tai missä rasva pilkotaan glyseriiniksi ja kolmeksi karboksyylihapoksi, vastaavasti.
10
Slobin, Biochemistry, 5:2836-2844 (1966), raportoi valmistaneensa vasta-aineita naudan seerumin albumiinin p-nitro-karboksibensoksikonjugaatille. Noita vasta-aineita käytettiin sen jälkeen hydrolysoimaan p-nitrofenyyliasetaattia ja 15 epsilonaminokaproaattiestereitä. Asetaattiesterireaktio kuvattiin toisen kertaluvun nopeusvakiolla ja sanottiin olevan ei-spesifinen. Toisen kertaluvun nopeusvakion, joka saatiin käyttämällä normaalia gammaglobuliinia, sanottiin olevan melkein yhtäläinen spesifisesti valmistettujen vas-20 ta-aineiden nopeusvakion kanssa. Spesifisesti valmistettujen vasta-aineiden läsnäolon sanottiin inhiboivan aminokap-roaattiesterin hydrolyysiä.
Kohnen ja avustajat raportoivat myös yrityksistä käyttää 25 vasta-aineita katalysoimaan esterolyysiä. Tämän ryhmän : käyttämät vasta-aineet muodostuivat joka tapauksessa viime kädessä käytettyä substraattimolekyyliannosta, jossa ei ollut hydrolysoitavaa sidosta, vastaan.
30 Heidän ensimmäisessä työssään [FEBS Letters, 100:137-140 (1979) ja Biochim. Biophys. Acta, 629:328-337 (1980) käytettiin anti-steroidi vasta-aineita hydrolysoimaan steroidin karboksietyylitioeetterin 7-umbelliferoniestereitä (7-hydroksikumeriini). Jokaisessa tapauksessa havaittiin kas-35 vua hydrolyyttisessä nopeudessa verrattuna taustaan tai nopeuteen, joka saatiin normaalilla IgG:llä. Molemmissa tapauksissa olivat katalyysinopeudet alhaisia (noin yksi moo- li 3 95928 li substraattia moolia kohti vasta-ainetta minuutissa tai vähemmän) ja reaktionopeudet vähenivät ajan mukana saavuttaen tason vasta-aineen kyllästymisen kanssa. Tämä nopeuden hidastuminen luettiin johtuvaksi steroidihappotuotteen ir-5 reversiibelistä sitoutumisesta vasta-aineeseen.
Kohen et ai. raportoivat myös 7-[-N-(2,4-dinitrofenyyli)- 6-aminoheksanoyyli]-kumeriinin hydrolyyseistä käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka olivat substraattimo-10 lekyylin dinitrofenyyliosia vastaan [FEBS Letters, 111:427-431 (1980)]. Tässä raportoitiin myös nopeuden kasvusta yli taustan, mutta reaktion sanottiin olevan stokiometrinen mieluummin kuin katalyyttinen. Laskua nopeudessa, joka lähestyi nollaa, raportoitiin kun vasta-aineen kyllästyminen 15 saavutettiin. Jälleen lasku luettiin johtuvaksi tuoteinhi-biitiosta, jonka aiheutti tuotehapon sitoutuminen vasta-aineeseen, koska jonkin verran alkuperäisestä hydrolyysiak-tiivisuudesta voitiin regeneroida kromatografoimalla vasta-aine-substraatti-tuote-seos.
20
Kun kohdistetaan vahva vasta-aineen sitoutuminen substraat-timolekyylien stabiileihin tiloihin, kompleksin dissosiaa-tion hidas nopeus ehkäisee katalyysiä. Tilanteen on ajateltu olevan sellainen Kohnen ja avustajien raportoimille tu-25 loksille.
«
Edellä olleita rakenteita, vaikkakin mielenkiintoisia, rajoittaa äärimmäisesti kykenemättömyys kohdistaa sitoutumis-energian käytön mekanismia, mikä on olennaista entsyymeil-30 le [W.P. Jencks, Adv. Enzymol., 43, 219 (1975)].
Nuo puutteet voidaan korjata käyttämällä siirtymätila-analogia, kuten hapteenia, saamaan esiin halutut vasta-aineet. Tämä hapteeni (viitataan tässä myös "analogi-ligandina") 35 voi ottaa inhibiittorin osan katalyyttisessä systeemissä.
Täten immunologista sitoutumista voidaan käyttää kokeelli- 4 95928 sesti suuntaamaan sitoutumisvuorovaikutukset katalyyttisiin prosesseihin. Esimerkiksi on ehdotettu, että vasta-aineen käytön hapteeniryhmälle, joka muistuttaa annetun reaktion siirtymätilaa, pitäisi aiheuttaa kiihtymistä substraattire-5 aktiossa pakottamalla substraatit muistuttamaan siirtymätilaa. Jencks, W.P., Catalytic in Chemistry and Enzymology, sivu 288 (McGraw-Hill, New York 1969). Huolimatta selvästä ehdotuksesta, spesifisiä siirtymätilan hapteeneita ei ehdotettu eikä spesifisiä reaktioita ehdotettu, joissa käsitys-10 tä saatettaisiin testata.
Amidi-ja esterisidosten hydrolyysin on ajateltu nykyisin hyväksyttävän kemiallisen teorian mukaan etenevän vesipitoisissa alustoissa reaktiolla muodostakseen karbonyylin 15 hiiliatomiin siirtymätilan, jossa on tetraedrinen hiiliatomi sitoutuneena (a) amidin tai esterin happo-osan hiiliatomiin, (b) kahteen happiatomiin, toisen ollessa karbonyyli-ryhmästä ja toisen hydroksyyli-ionista tai alustan vesimo-lekyylistä ja (c) esterin alkoholiosan happiatomiin tai a-20 midin amiiniosan typpiatomiin. Sellaisten reaktioiden siirtymätilat ovat hyödyllisiä älyllisiä rakenteita, joita ei voida kuvauksen perusteella eristää, kun verrataan välituotteisiin, joita voidaan eristää.
25 Vaikka edellä olleita hydrolyyttisiä siirtymätiloja ei voida eristää, on aiheelle pyhitetty runsaasti tieteellistä kirjallisuutta. Jostakin tästä kirjallisuudesta keskustellaan tämän jälkeen.
30 Kun taas edellä kuvatun amidin ja esterin hydrolyysin siirtymätilan uskotaan olevan hyvin ymmärretty, topologian pa-• rametrit, esim. reseptorin liittävien kohtien koko, muoto ja varaus, joissa tietyt amidit, kuten proteiinit tai esterit, kuten rasvat, reagoivat noiden siirtymätilojen kaut-35 ta, ei ole yhtä hyvin ymmärrettyä. Olisi sen vuoksi edullista, jos lukuisten sitovien kohtien topologia olisi tunnettua, niin että sellaisten ligandien, jotka sitovat nois- 5 95928 sa kohdissa, vuorovaikutuksia voitaisiin tutkia. Valitettavasti reseptoria sitovien kohtien topologia on yleisesti tuntematonta biologisissa hydrolyyseissa, paitsi suhteellisen harvoille entsyymeille, joiden röntgensädekristalli-5 rakenteet on määritetty.
Tämä tiedon puute sitovan kohdan topologiasta on peräisin osittain jopa monien reseptoria sitovien kohtien sijainnin puutteesta soluissa. Lisäksi sellaisille reseptoria sito-10 ville kohdille, joiden sijainti tunnetaan, sitovan kohdan kemiallinen identiteetti; s.o. proteiini- ja hiilihydraat-tikoostumus, on yleisesti tuntematonta. Täten tutkija on yleisesti hankalassa tilanteessa etsiessään ymmärtämystä reseptorin sitomiskohtien topologisissa vaatimuksissa ja 15 siksi tavoitellessaan rakentaa terapeuttisia aineita, jotka voivat täyttää nuo vaatimukset.
Keksijöiden täytyy siksi seuloa mahdolliset terapeuttiset aineet eläin- tai soluviljelmätutkimuksissa varmistaakseen, 20 voiko mahdollinen potentiaalinen aine olla hyödyllinen.
Sellaiset systeemit, koska hyödyllisiä, ovat kalliita ja aikaa kuluttavia käyttää.
Jopa milloin hydrolyyttisen reseptorin, kuten entsyymi, to-25 pologia ja reaktiivisyys tunnetaan, entsyymit kuten prote-aasit pilkkovat tyypillisesti substraattinsa, polypeptidi-ketjut, tietyn aminohappojäännöksen vieressä, joka voi e-siintyä useita kertoja proteiinin polypeptidiketjussa.
Koska sellainen suhteellinen satunnainen pilkkominen voi 30 olla hyödyllistä saataessa proteiinin polypeptidikartta, tuo suhteellinen satunnainen pilkkominen ei ole yhtä hyö-: dyllinen, missä toivotaan tiettyjä aminohappojäännössek- venssejä tuotettavaksi.
35 Esimerkiksi modernit geneettisen manipulaation tekniikat ovat olleet hyödyllisiä valmistettaessa fuusioproteiineja, joissa on haluttu proteiini tai polypeptidi fuusioituneena 6 95928 vektorigeenin, kuten lac z-geeni, transkriptiotuotteeseen. Sellaisen fuusioproteiinin käyttöä estää kuitenkin vektori-geeni tuotteen fragmenttien läsnäolo. Olisi myös siksi edullista, jos voitaisiin kehittää proteolyyttisiä entsyymin 5 kaltaisia molekyylejä, jotka pilkkosivat sellaisia fuusio-tuotteita halutun ja ei-halutun fuusio-polypeptidin tai -proteiinin osien välillä.
Äskettäin Lerner, Tramontano ja Janda [Science, 234, 1566 10 (1986)] raportoivat monoklonaalisistä vasta-aineista, jotka hydrolysoivat esterin katalyyttisesti. Tramontano ja Lerner kuvaavat myös estereiden hydrolyysin käyttämällä monoklo-naalisia vasta-aineita U.S. patentissa nr. 4659567. Pollack, Jacobs ja Schultz [Science, 234, 1570 (1986)] rapor-15 toivat myeloomaproteiinista, joka on nimitetty MOPC167:ksi [Leon et ai., Biochem., 10, 1424 (1971)], joka katalysoi karbonaatin hydrolyysin.
Kahdessa Lerner ja Tramontano esityksessä saatiin vasta-20 aineita fosfonaattia vastaan, joka syntetisoitiin edustamaan karboksyylihappoesterin tai karbonaattiesterin tetra-edrisen hydrolyyttisen siirtymätilan stabiilia analogia. Pollack et ai. vasta-aine, josta periaatteessa keskusteltiin, oli myeloomaproteiini, joka sattui sitoutumaan fosfo-25 naattiin, joka oli rakenteellisesti analoginen hydrolysoidun karbonaattianalogin kanssa. Täten Lerner ja Tramontano et ai. työssä hydrolysoitava substraatti valittiin edeltä immunisoitavan analogin ja hydrolyyttisten vasta-aineiden ollessa syntetisoidut halutun tuotteen mukaisesti. Pollack 30 et ai. suunnittelivat hydrolysoitavan substraatin, kun he kerran tiesivät myeloomaproteiinin spesifisyyden. Pollack et ai. raportoivat myös (edellä) katalyyttisen vasta-aineen olemassaolosta, pohjautuen tosiasioihin ja analogisubst-raattisysteemi karbonaattihydrolyysille, joka on samankal-35 täinen käsitteenä Lerner et ai. systeemin kanssa. Työstä, joka viittaa tähän systeemiin, on raportoitu Jacobs et ai., J. Am. Chem. Soc., 109, 2174 (1987).
95928 7
Julkaistu patenttihakemus WO 85/02414 keskustelee vasta-aineiden mahdollisesta käytöstä katalyyttinä ja esittää tietoja koskien polyklonaaliseerumin käyttöä hydrolysoimaan 5 o-nitrofenyyli-beta-D-galaktosidiä. Vasta-aineiden, jotka ovat hyödyllisiä tuossa hakemuksessa, sanotaan olevan indusoituvia reaktantin, reaktion välituotteen tai reaktan-tin, tuotteen tai reaktiovälituotteen analogin toimesta. Termi "analogi" on siinä kuvattu käsittävän isomeerit, 10 homologit tai muut yhdisteet, jotka muistuttavat riittävästi reaktanttia kemiallisen rakenteen nimissä, että vasta-aine, joka on analogia vastaan, voi ottaa osaa immunologiseen reaktioon reaktantin kanssa, mutta ei välttämättä katalysoi analogin reaktiota.
15
Tuossa yksityiskohtaisessa selityksessä annetut tiedot vain osoittavat, että tapahtui jonkin verran substraatin (reaktantin) galaktosidin pilkkomista yli 18 h aikajaksolla käyttämällä suhteellisen konsentroitua vasta-ainevalmistet-20 ta (1:10 ja 1:20 laimennukset). Vaikka väitettiin katalyysin tapahtuvan, katalyyttistä aktiivisuutta ei osoitettu, koska väitetyn katalyyttisen vasta-aineen katalyysinopeutta ei osoitettu eikä ollut osoitusta substraatti galaktosidin pilkkomisen prosenttiosuudesta. Hakemus ei osoittanut, että 25 beta-D-galaktosidaasi pilkkoi noin 10 kertaa yhtä paljon : substraattia kuin tekivät polyklonaaliset vasta-aineet, o- lettaen absorbanssin lineaarisuutta tutkitun substraatin nimeämättömässä pitoisuudessa.
30 Tuossa hakemuksessa esitetyistä tiedoista on mahdollista, että tapahtui o-nitrofenyyliryhmän nukleofiilinen korvautuminen käytetyn vasta-aineen lysiinijäännöksen terminaalisella aminoryhmällä. Täten havaittu absorbanssi olisi voinut johtua epsilonaminolysinyyli-o-nitrofenyylianiliinin 35 muodostuksesta tai epsilonaminolysinyyligalaktosidin ja o-nitrofenolin muodostumisesta, joista kumpikaan tapahtuma ei olisi katalyyttinen, koska vasta-aine kulutettiin mieluum- 8 95928 min kuin muunnettiin.
Eräässä vielä äskettäisemmässä työssä on esitetty vasta-ainemolekyylien katalysoima bimolekulaarinen amidin muodos-5 tus [Benkovic et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:5355 (1981)], kuten on esitetty vasta-aineen katalysoima Claisen uudelleenjärjestäytyminen [Jackson et ai., J. Am. Chem.
Soc., 110:4841 (1988)]. Mikään töistä, samoin kuin ei mikään aikaisemmin keskusteltu työ, ole tutkiskellut vasta-10 aineiden käyttöä katalysoimaan mitä tahansa reaktiota ste-reospesifisellä tavalla.
Vasta-aineen katalysoimassa laktonin muodostusreaktiossa o-soitettiin stereospesifisyyttä [Napper et ai., Science, 15 237:1041 (1987)] ja vasta-aineen katalysoimassa Claisen re aktiossa [Hilvert et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85: 4953 (1988)]. Vasta-aineen liittävän kohdan sisältävän molekyylin käyttöä katalysoimaan stereospesifisesti hydrolyy-sireaktio, kuten tämän jälkeen kuvataan, ei kuitenkaan tut-20 kittu kummassakaan edellä olleissa julkaisuissa.
Tämä keksintö tarkastelee reseptorimolekyyliä, jossa on vasta-aineen liittävä kohta tai idiotyypin sisältävää polyamidia, joka kykenee katalyyttisesti hydrolysoimaan e-25 deltä valitun, reaktantti-ligandin yhden stereoisomeerin halkaistavan karboksyylihappoamidin tai esterin sidoksen eikä toisen stereoisomeerin. Tuo vasta-ainetta liittävä kohta sitoutuu (immunoreagoi): (a) reaktantti-ligandin, jossa on tuo edeltä valittu halkaistava karboksyylihappoa-30 midi- tai esterisidos, yhden stereoisomeerin kanssa ja (b) analogi-ligandin yhden stereoisomeerin kanssa, joka on • stereokemiallisesti analoginen reaktantti-ligandin kanssa ja jossa on tetraedrisesti sitoutunut fosforiatomi asemaan, joka on analoginen reaktantti-ligandin edeltä valitun kar-35 boksyylihappoamidi- tai esterisidoksen halkaistavan karbo-nyylihiilen kanssa. Siten sidotun reaktantti-ligandin hyd-rolyyttisessä siirtymätilassa on tetraedrinen hiiliatomi
II
• 95928 9 sitoutuneena (i) hiiliatomiin, esterin tai amidin happaman osan alfa-hiileen, (ii) kahteen happiatomiin ja (iii) esterin happiatomiin tai amidin typpiatomiin.
5 Molekyylejä, joissa on vasta-ainetta liittävä kohta, joka on muodostunut vasteena reaktantti-ligandin hydrolyyttistä siirtymätilaa vastaan, muodostuvat vasteena tai indusoituvat immunisoitaessa analogi-ligandimolekyylin (edullisesti sitoutunut proteiinikantajaan muodostaakseen konjugaatin) 10 yhdellä stereoisomeerillä, jossa on ligandin hydrolyyttisen siirtymätilan analogi. Analogi-ligandin hydrolyyttisen siirtymätilan molekyylin immunisoivalla stereoisomeerillä on tetraedrisesti sitoutunut fosforiatomi, sitoutunut suoraan (i) analogisen ligandin amidin tai esterin happaman 15 osan hiiliatimiin, (happaman osan alfa-hiili), (ii) kahteen happiatomiin, (iii) kolmanteen happiatomiin tai typpiatomiin, kolmannen happiatomin tai typpiatomin ollessa sitoutunut ligandin analogisen esterin tai amidin alfa-hiiliatomiin .
20
Happaman osan alfa-hiiliatomi (i) edellä, sitoutunut suoraan analogi-ligandin teraedriseen keskusfosforiatomiin, kuuluu ketjuun, jossa on ainakin 5 atomia ja edullisemmin ainakin 15 atomia ja edullisesti ainakin 15 atomia substi-25 tuoitu fenyyliryhmä mukaanluettuna, kuten on kolmas happi-, tai typpiatomi, (iii) edellä. Kahdesta happiatomista (ii) edellä, sitoutunut suoraan keskusatomiin, yksi happiatomi (a) on sitoutunut kahdesti (kaksoissidos) oksoryhmään kes-kusatomissa, (b) on osa hydroksyyliryhmästä tai (c) on al-30 koksiryhmän, jossa on C^-C, alempi alkyyliryhmä, happi.
Toinen noista happiatomeista, joka on sitoutunut keskusato-* miin, on sitoutunut yksinään keskusatomiin ja on -OR,- ryhmä, missä R, on valittu ryhmästä, joka koostuu vedystä (H) ja Cl-C< alemmasta alkyylistä. Neljäs atomi, (iii) e-35 dellä, sitoutunut analogi-ligandimolekyylin keskusatomiin, on esterin alkoholin happiatomi tai ligandin analogisen esterin tai amidiosan amidin aminityppiatomi (imino). Tuo - 95928
------ I
10 neljäs atomi on osa ketjusta, jossa on ainakin 5, edullisemmin ainakin 15 atomia ja loppu ketjusta koostuu R,:sta.
On painotettu, että sekä reaktantti-ligandi että analogi-5 ligandi sisältävät ainakin yhden hiiliatomin, joka voi olla kahdessa stereoisomeerisessä muodossa ja täten antaa stere-oisomeerisen keskuksen. Tuo stereoisomeerinen keskus sijaitsee jokaisessa ligandi- ja analogi-ligandimolekyylissä samassa suhteellisessa asemassa jokaisessa molekyylissä.
10 Stereoisomeerinen keskus sijaitsee myös tarpeeksi lähellä sidosta, joka on tarkoitus hydrolysoida niin, että katalyyttisen vasta-aineen liittävän kohdan sisältävä molekyyli sitoo stereoisomeerisen keskuksen.
15 Tetraedrisesti sidottu keskusatomi on fosfori niin, että a-nalogi-ligandi on orgaaninen fosforiyhdiste, jolla on subs-tituentit järjestyneet fosforin, joka vastaa tetraedristä hiilen siirtymätilaa, ympärille. Fosfonaatti- tai fosfona-midaatti monohappo sen ionisoidussa muodossaan simuloi myös 20 kehittyvää varausta nukleofiilisessä hyökkäyksessä karbo-nyylikeskukseen.
Lisäksi on kuvattu entsymaattisen peptidihydrolyysin fos-fonamidaatti- ja fosforamidaatti-inhibiittorit siirtymäti-25 laa jäljittelevinä. Galardy et ai., Biochemistry, 22, 1990 : ((1983); Bartlett et ai., Biochemistry, 22, 4618 (9183);
Thorsett et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, 2176 (1982); Jacobsen et ai., J. Am. Chem. Soc., 103, 654 (1981); Kam et ai., Biochemistry, 18, 3032 (1979) ja Weaver 30 et ai., J. Mol. Biol., 114, 119 (1977). 1 Tässä kuvatuissa tutkimuksissa toimivat fosfonaattiesterit ja fosfonamidaattiamidit siirtymätila-analogeina tuottamaan vasta-aineita, jotka ovat monoklonaalisia ja jotka ovat 35 stereospesifisiä karboksyyliesteraaseja ja -amidaaseja. Itse asiassa nämä vasta-aineet osoittavat niiden synnynnäisen sitomisenergian toiminnallisesti, kuten todelliset entsyy- • 95928 11 mit, katalyyttisesti hydrolysoiden esterit ja amidit ja klassillisesti, kuten vasta-aineet, sitoutuvat antigee-neihin.
5 Tyypillisiä immunisoivia analogi-ligandimolekyylejä, joissa on hydrolyyttisen siirtymätilan analogi, esitetään kaavalla : /? R, - P - XR.
10 k missä, X = 0 tai NH;
Rt = CH;-^ ^-NHCOR, missä R4 = (CHj),C02R, 0
. -N
ja R, = H tai Nv I
20 tr
O
R; = H tai C(-C4 alempi alkyyli; ja 25 R,- = ί. Λ—CH-
... \_r V
missä aaltoviiva osoittaa sekä stereokemiallisia isomeerejä; että 30 n on kokonaisluku 1-8, mukaanluettuina.
Analogi-ligandi hydrolyyttiset siirtymätilamolekyylit ovat itsessään ligandeja, vaikkakaan eivät reaktiivisiä ligande-ja niitä tarkastellaan myös tässä keksinnössä. Näillä 35 ligandimolekyyleillä on suhteellisen pieni molekyylikoko ja ovat siksi tyypillisesti liittyneet suureksi, kantajamole-kyyliksi, kun käytetään immunogeeneinä indusoimaan resep- 12 95928 torimolekyylien tuottoa tai käytetään yksin inhibiittorimo-lekyyleinä. Sellaisiin suhteellisen pieniin molekyyleihin viitataan yleisesti hapteeneina. Näillä analogi-ligandimo-lekyyleillä on myös tyypillisesti liittävä atomi tai ryhmä, 5 kuten reaktiivinen merkaptaani, sukkinimidi tai muu ryhmä, joka antaa keinot kiinnittää hapteeniset analogi-ligandimo-lekyylit kantajiin käytettäviksi immunogeeneinä.
Tyypillisiä reaktantti-ligandimolekyylejä, jotka vastaavat 10 rakenteellisesti edellä olleita analogi-ligandimolekyylejä, edustaa kaava:
O
Rt - C - XR, missä X, Rl ja R, ovat kuten edellä on kuvattu.
15 Tämän keksinnön vasta-aineen liittävän kohdan sisältävät molekyylit ovat itsessään reseptoreja ja antavat tietoa vasta-aine-hapteeni vuorovaikutusten konformationaalisista etuisuuksista tutkittaessa reseptori-ligandi-kompleksien, 20 jotka muodostuvat vasta-aineen liittävän kohdan sisältävien molekyylien (reseptorit) ja erilaisia rakenteita sisältävien ligandien, joissa on samanlaiset tai identtiset epi-tooppiset alueet, välille, intramolekulaarisia reaktiivi-syyskuvioita.
25
Menetelmää valmistaa monoklonaalisia reseptorimolekyylejä, jotka sitoutuvat erityisen amidin tai esterin hydrolyytti-seen siirtymätilaan, tarkastellaan myös. Tässä edellä kuvattu hapteeninen analogi-ligandimolekyyli, jossa on hydro-30 lyyttinen siirtymätila-analogi, saadaan liittyneenä kantajaan immunogeenisenä konjugaattina. Täten saatu konjugaatti « hajotetaan tai dispergoidaan fysiologisesti siedettävässä laimentimessa ympin muodostamiseksi. Ymppi viedään injektiolla sopivaan, ei-ihmis nisäkäseläimeen riittävänä määränä 35 indusoimaan vasta-aineita hapteeniselle analogi-ligandille.
Siten indusoidut vasta-aineet kerätään. Kerätyistä vasta- «
It 13 95928 aineista määritetään niiden kyky sitoutua (immunoreagoida) immunisoivaan, hapteeniseen ligandi-analogiin. Immunoglobu-liinia tuottavat solut, kuten solut eläimen pernasta, joiden vasta-aineet sitoutuvat immunisoivaan hapteeniseen a-5 nalogi-ligandiin, kerätään ja fuusioidaan myeloomasolujen kanssa muodostamaan hybridomasoluja. Hybridomasoluja kasvatetaan viljelyalustassa ja kasvavien hybridomasolujen su-pernatanttialustasta määritetään vasta-aineiden, jotka sitoutuvat immunisoivaan hapteeniseen analogi-ligandiin, läs-10 näolo.
Hybridomasolut, joiden supernatantissa on sellaisia sitovia vasta-aineita, seulotaan, jotta määritetään mitkä noista soluista erittävät vasta-aineita, jotka myös hydrolysoivat 15 substraatti-ligandin stereospesifisellä tavalla. Hybridomasolut, joiden eritetyt vasta-aineet sitoutuvat immunogee-niin, sitoutuvat reaktantti-ligandiin ja hydrolysoivat re-aktantti-ligandin, kloonataan sitten, jotta saadaan halutut monoklonaaliset vasta-aineet viljelyalustan supernatan-20 tista tai isäntä-nisäkkään vesivatsoista, joihin hybridoma on viety.
Kuvattuja monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää tämän keksinnön reseptoreina. Vaihtoehtoisesti niin kutsutut 25 vasta-aineiden Fc- tai Fc'-osat voidaan poistaa entsymaat-t ’ tisella pilkkomisella, jotta saadaan vasta-aineen liittävä kohta (idiotyypin sisältävä polyamidi), joka sitoutuu immunisoivaan, hapteeniseen analogi-ligandiin, kuten Fab- tai F (ab ' ) j-vasta-aineosa, vastaavasti.
30 Tällä keksinnöllä on lukuisia hyötyjä ja etuja. Eräs hyöty on reseptorien, joiden sitomiskohdan topologiset vaatimukset räätälöidään erityiselle reaktantti-ligandille, jota on tarkoitus tutkia ja hydrolysoida edeltä valittu sidos vain 35 yhdessä tuon ligandin isomeerissä.
Tämän keksinnön toinen hyöty on valmistaa reseptoreita, 14 95928 jotka hydrolysoivat ligandin vain yhden stereoisomeerin amidi- tai esteriligandin edeltä määritetyssä kohdassa ja joilla on katalyyttisiä ominaisuuksia.
5 Keksinnön etu on reseptorien, joita voidaan tuottaa, stere-ospesifisyyden takia, että ligandia, jossa on lukuisia e-rilaisia hydrolysoitavia sidoksia, kuten polypeptidi tai proteiini, jossa molemmissa on sekä D- että L-aminohappo-jäännökset, voidaan hydrolysoida edeltä valitusta, erityi-10 sesta hydrolysoitavasta sidoksesta.
Tämän keksinnön vielä eräs etu on sellaisten reseptorien toimittaminen, jotka voivat selektiivisesti poistaa blok-kaavan ryhmän vain yhdestä stereoisomeeristä isomeerien 15 seoksessa synteesin aikana tai sen jälkeen, täten helpottaen halutun stereoisomeerin takaisin saantia tai käyttöä, vastaavasti.
Tämän keksinnön vielä lisähyödyt ja -edut tulevat ilmeisik-20 si ammattimiehille seuraavasta keskustelusta.
Tämä keksintö koskee molekyylejä, joihin viitataan yhdessä reseptoreina, jotka ovat vasta-aine- ja idiotyypin sisältävän polyamidiosia (vasta-aineen liittävä kohta tai para-25 tooppinen), joita indusoi reaktantti-ligandin karboksyyli-happoamidin tai esterin analogi, joka matkii siirtymätilan reaktantti-ligandin esterin tai amidin hydrolyysin stereo-spesifisyyttä ja konformaatiota reaktiosekvenssissä. Resep-torimolekyylit (vasta-aineet ja vasta-aineen sisältävät 30 kohdat), jotka sitoutuvat analogi-ligandin yhteen stereoi-someeriin ja reaktantti-ligandin yhteen stereoisomeeriin, on ajateltu stabilisoivan reaktantti-ligandin edeltä valitun osan hydrolyyttistä siirtymätilaa ja siten osoittavan katalyyttisiä ominaisuuksia reaktantti-ligandin vain yhdel-35 le stereoisomeerille.
Vasta-aineet ja entsyymit ovat molemmat proteiineja, joiden 15 95928 toiminta riippuu niiden kyvystä sitoa spesifisiä kohdemole-kyylejä. Entsymaattiset reaktiot eroavat immunologisista reaktioista siinä, että entsymaattisessa reaktiossa entsyymin sitominen sen substraattiin tyypillisesti johtaa kemi-5 alliseen katalyysiin, kun taas ei-katalyyttinen kompleksi on tavallinen seuraus vasta-aine-antigeenisidoksesta.
Entsyymien uskotaan katalysoivan proteiinien hydrolyysiä liittymällä proteiiniin hydrolyysireaktion siirtymätilan 10 stabiloimiseksi. Yleisesti uskotaan, että entsymaattisen reaktion nopeus kasvaa suhteessa ei-entsymaattisen reaktion nopeuteen, koska entsyymillä on kyky stabilisoida reaktion siirymätila; s.o. vähentää reaktion siirtymätilan vapaata energiaa ja täten reaktion aktivaation vapaata energiaa 15 [Jencks, W.P., Adv.Enzymology, 43, 219 (1975) ja Pauling, L., Amer. Scientist, 36, 58 (1948)]. Kannatus tälle teorialle tulee havainnosta, että aineet, joiden on ajateltu o-levan mallina oletetulle siirtymätilalle, ovat usein vahvasti sitoutuneet entsyymeihin kilpaileviksi inhibiitto-20 reiksi. Leinhard, G., Science, 180, 149 (1973) ja Wolfen-den, R., Acc. Chem. Res., 5, 10 (1972). Lisäksi on ajateltu, että entsyymi suorittaa tämän reaktion vapaan energian alenemisen sitomalla reaktantin siirtymätilan geometrian vahvemmin kuin se sitoutuu vastaavaan (vastaaviin) subst-25 raattiin (substraatteihin) tai tuotteeseen (tuotteisiin).
Tämä tarkoitaa, että entsyymin sisäinen sitova energia on paljon suurempi kuin voidaan mitata substraattien tai tuotteiden sitomisesta. Olennaisesti entsyymin sitomisenergiaa 30 käytetään esittämään kemiallista reaktiota [Jencks, W.P., XVII International Solvay Conference (November 1983)].
Vastakkainen ehdotus on, että vasta-aine, joka valmistetaan optimaalisesti sitomaan sopiva siirtymätilan analogi, toi-35 misi katalyyttinä. Lernerin ja apulaisten ja Schultz ja a-pulaisten tämän tuloksen osoittaminen aikaisemmin viitatuissa julkaisuissa ja alla olevissa julkaisuissa täydentää 16 95928 entsyymitoiminnan ja vasta-ainerakenteen vertailun ja antaa hyödyllisen keinon suunnitella keinotekoisia entsyymejä.
Perusidea tässä kuvatun immunologisen hydrolyysin takana 5 tutkiskelee analogi-ligandien käyttöä edeltä määritetyn spesifisyyden omaavien vasta-aineiden, jotka valikoiden sitoutuvat ja täten stabiloivat amidi- tai esterisidoksen hydrolyysin sen jälkeen, kun sitoutunut spesifiseen reak-tantti-ligandiin, valmistuksessa. Analogi-ligandi simuloi 10 korkea-energisen siirtymätilan konformaatiota hydrolyysissä vasta-aineiden, jotka kykenevät sitoutumaan samankaltaisiin substraatteihin ja stabiloimaan niiden hydrolyysit, tuoton indusoimiseksi.
15 Sellainen valikoiva sitoutuminen ja stabilisointi johtaa hydrolyysin aktivaatioenergian vähenemiseen, täten täyttäen katalyysin kriteerin. Vasta-aineita, joilla on tämä ominaisuus, voidaan saada immunisoimalla synteettisillä analogeilla, joita on kemiallisesti modifioitu muistuttamaan si-20 doshydrolyysin läpikäyvän substraattireaktantti-ligandin sitoutumisominaisuuksia; s.o. immunisoimalla erityisen reaktion siirtymätilan analogeilla.
Lisäksi tämän keksinnön reseptorimolekyyli sitoutuu myös ja 25 hydrolysoi muuten identtisten reaktantti-ligandimolekyylien vain yhden stereoisomeerisen parin. Täten, milloin reak-tanttiligandi on enantiomeerinen, vain yksi enantiomeeri hydrolysoidaan. Samalla lailla, milloin reaktantti-ligandi esiintyy sekä cis- että trans-muodoissa, vain yksi noista 30 isomeereistä hydrolysoidaan.
Koska tämän keksinnön sekä analogi-ligandi että reaktantti-ligandi reseptorimolekyylinä esittävät stereospesifisyyttä, sisältävät ne ainakin yhden hiiliatomin, joka voi olla kah-35 dessa stereoisomeerisessä muodossa; s.o. stereosiomeerinen keskus. Stereoisomeerinen keskus sijaitsee jokaisessa analogi-ligandi- ja reaktanttiligandimolekyylissä samassa ase- 17 95928 massa suhteessa muihin atomeihin vastaavissa molekyyleissä. Täten, jos stereoisomeerinen keskus sijaitsee ketjussa 4 atomia pois fosforiatomista analogi-ligandin happo-osassa, sijaitsee stereoisomeerinen keskus 4 atomia pois reak-5 tantti-ligandin halkaistavasta karbonyylihiilestä.
On pantu merkille, että analogi-ligandimolekyyli ja/tai reaktantti-ligandimolekyyli sisältävät enemmän kuin yhden stereoisomeerisen keskuksen. Kun toinen, kolmas tai muu 10 sellainen keskus sijoitetaan sellaiselle etäisyydelle halkaistavasta karbonyylihiilestä (tai fosforiatomista), jota reseptorimolekyyli ei ole sitotunut, ei sillä ole tässä väliä. Kuitenkin kun on tarpeeksi lähellä, jotta reseptorimolekyyli voi sitoa, mikä tahansa stereoisomeerinen keskus 15 tuottaa lisää stereoisomeerejä. Sellaisten isomeerien lukumäärä määritetään yhtälöllä: lukumäärä = 2', missä n on stereoisomeeristen keskusten lukumäärä.
Ainakin yksi stereoisomeerinen keskus voi olla esteri- tai 20 amiini-reaktantti-ligandin ja analogi-ligandin joko karbok-syylihappo- tai alkoholi- tai amiiniosissa. Jos reaktantti-ja analogi-ligandimolekyyleissä on läsnä enemmän kuin yksi sellainen keskus, voi stereoisomeeristen keskusten lukuisuus olla jakautunut halutulla tavalla halkaistavam karbo-25 nyylihiilen ympärillä (tai keskus-fosforiatomin). Tässä ei käsitellä mitään tetraedrisen keskusfosforiatomin antamaa stereoisomerismia.
Tämän keksinnön reseptorimolekyylille on ominaista ja ka-30 talysoi stereoselektiivisesti ainakin yhden parin stereoisomeerisen reaktantti-ligandimolekyylien, joita on stereoisomeeristen parien seoksessa tai reaktantti-ligandimolekyylien erillisenä parina, hydrolyysin. Edullisemmin reseptorimolekyylille on ominaista ja stereoselektiivisesti ka-35 talysoi reaktantti-ligandimolekyylin vain yhden stereoiso-meerin hydrolyysin.
18 95928
Edellä olleen katalyyttisen hydrolyysin stereoselektiivi-syys olettaa, että stereoisomeerisyyden lokus, stereoisomeerinen keskus, on läsnä reaktantti-ligandissa tarpeeksi lähellä hydrolysoitavaa sidosta (halkaistava karbonyylihii-5 li), niin että katalyyttinen vasta-aineen liittävän kohdan sisältävä molekyyli sitoo stereoisomeerisen keskuksen ja täten reseptorimolekyyli sitoutuu vain yhteen stereoisomee-riin ja sekä reaktantti-ligandin että analogi-ligandin samaan stereoisomeeriin (R tai S). Hydrolysoitavan sidoksen 10 kohta määritetään analogi-ligandin fosforiatomin sijainnilla (ja reaktantti-ligandin analogisella halkaistavalla kar-bonyylihiilellä) ja vasta-ainetta liittävän kohdan koolla. Vasta-ainetta liittävää kohtaa pidetään tavallisesti kykenevänä sijoittamaan noin 5 - noin 7 aminohappojäännöstä.
15
Stereosiomeerinen keskus on tilavuudessa, jossa on 1 - noin 4 aminohappojäännöstä (ketjun pituus noin 12 atomia) ja e-dullisemmin 1 - noin 2 aminohappojäännöstä (ketjun pituus noin 6 atomia) analogi-ligandin fosforiatomin molemmin puo-20 Iin (reaktantti-ligandin halkaistava karbonyylihiili). Täten stereoisomeerinen keskus voi olla karboksyylihappoami-din tai esteri-reaktanttiligandin halkaistavan karbonyyli-hiilen karboksyylihappo-osassa tai amiini- tai alkoholio-sassa. Tässä käytetyssä tyypillisessä stereoisomeerisessä 25 esterissä stereoisomeerinen keskus sijaitsee molekyylin al-koholiosassa.
Tämä etäisyys voidaan helposti määrittää käyttämällä tilaa-täyttäviä malleja tai, milloin on epäilystä, yksinkertai-30 sesti määrittämällä voiko katalyyttinen reseptori hajottaa tai erottaa analogi-ligandin stereoisomeerit. Äärimmäinen analyysi on tietenkin, hydrolysoiko katalyyttinen reseptorimolekyyli yhden isomeerin mutta ei toista.
35 Ei ole tarkoitus käsittää, että milloin on kyse geometrisistä isomeereistä, ei stereoisomeerinen keskus ole yksi ainoa atomi, kuten on tapaus enantiomeereillä. Mieluummin, 19 95928 tuo keskus on läsnä enemmän kuin atomien ryhmä, jonka lukumäärää hallitsee atomien, joita vaaditaan kuvaamaan cis/ trans-isomeerit, lukumäärä. Kuitenkin ilmaisutapauksessa stereoisomeeriseen keskukseen viitataan tässä ikään kuin se 5 olisi yksi ainoa atomi, kuten kiraalinen atomi, mihin enan-tiomeerit sisältyvät.
Kuten jo pantiin merkille, ovat analogi-ligandi ja reak-tantti-ligandi yksi stereoisomeerien pari. Nämä stereoiso-10 meerit voivat olla geometrisiä isomeerejä tai optisia isomeerejä; s.o. enantiomeerejä. Geometriset isomeerit ovat cis/trans-isomeerejä, kuten on havaittu syklisissä molekyyleissä tai milloin läsnä on kaksoissidoksia. Optiset isomeerit ovat d,l tai R,S enantiomeeripareja, joissa stereoi-15 someeriseen keskukseen viitataan kiraalisena keskuksena, koska tuon keskuksen hiiliatomi on kiraalinen hiiliatomi.
Tyypillisessä katalyyttisessä reaktiossa, josta tämän jälkeen keskustellaan, reaktantti-ligandi stereoisomeerit ovat 20 enantiomeerisiä, R,S, pari. Vaikka tässä tutkimuksessa käytetty analogi-ligandi sisälsi sekä enantiomeerejä että indusoi reseptorimolekyylien tuoton, jotka stereoselektiivi-sesti hydrolysoivat reaktantti-ligandin joko R- tai S-muo-dot, pitäisi ymmärtää, että vain yhtä enantiomeeristä ana-25 logi-ligandia voitiin käyttää indusoimaan vain yhden enan-tiomeerisen reaktantti-ligandin tuotto.
Mekanismia, jolla vasta-aine hydrolysoi sidotun reaktantti-ligandin esteri- tai amidisidoksen, voidaan ajatella "indu-30 sed fit"-mallin muodossa. Kun löysästi sidottu substraatti vääntyy tai järjestyy uudelleen mukautuakseen vasta-aineen sitoutumisgeometriaan, painetta voidaan vapauttaa yksittäisen, edeltä määritetyn amidi- tai esterisidoksen kemiallisella uudelleenjärjestelyllä niin, että tämä uudelleenjär-35 jestely johtaa sidoksen hydrolyysiin.
Termiä "reseptori" käytetään tässä tarkoittamaan biologi- 20 95928 sesti aktiivista molekyyliä, joka sitoutuu reaktantti-ligandiin, inhibiittori-ligandiin tai analogi-ligandiin. Tämän keksinnön reseptorimolekyylit ovat vasta-aineita, olennaisesti koskemattomia vasta-aineita tai vasta-aineen 5 idiotyypin sisältäviä polyamidiosia.
Reseptorimolekyylin biologinen aktiivisuus on todistettu sitomalla reseptori sen antigeeniseen reaktantti-ligandiin, inhibiittori-ligandiin tai analogi-ligandiin sen jälkeen, 10 kun ne on sekoitettu vesipitoiseen alustaan, vähintään fysiologisissa pH-arvoissa ja ionisissa vahvuuksissa. Reseptorit sitoutuvat edullisesti myös antigeeniseen ligandiin pH-arvoalueella noin 5 - noin 9 ja ionisissa vahvuuksissa, kuten tislatulla vedellä on, noin sellaiseen kuin yhdellä 15 moolilla natriumkloridia on.
Vasta-aineiden idiotyypin sisältävät polyamidiosat (vasta-aineen sisältävät kohdat) ovat sellaisia vasta-ainemolekyy-lien osia, joissa on idiotyyppi ja sitoutuvat ligandiin tai 20 analogi-ligandiin. Sellaisiin osiin kuuuluvat Fab-, Fab’-ja F (ab ' ) .-fragmentit, jotka on valmistettu vasta-aineista hyvin tunnetuilla entsymaattisilla pilkkomistekniikoilla. Katso esimerkiksi U.S. patentti nr. 4342566, Theofilopoulos ja Dixon, yleisesti ja spesifisesti Pollack et ai. [Scien-25 ce, 234, 1570 (1987)], jotka raportoivat kiihtyneitä hydro-• lyyttisiä nopeuksia Fab-fragmenteille, olivat samat kuin luonnon Igrlle. Kuten kun vasta-aineita, josta saadaan idiot YYPPiä sisältäviä polyamideja, kuvataan syntyneen immuno-geenejä vastaan tai niiden indusoimana, idiotyypin sisältä-30 viä polyamidi- (vasta-aineen liittävän kohdan sisältävä) reseptorien keskustellaan olevan "syntyneen" tai "indusoituneen" ymmärtäväisesti, että pilkkomisvaihe vaaditaan tyypillisesti, jotta saadaan idiotyypin sisältävä polyamidi vasta-aineesta. Koskemattomat vasta-aineet ovat kuitenkin 35 edullisia ja niitä käytetään tämän keksinnön reseptorimole-kyylien tyyppiesimerkkeinä.
li 21 95928 Tässä keksin «Qcc? r«1 0TT£ ^ Vcd^l 2. d. S Θ ^ 0V··1' ^ (^\τρ f V CU O ~ klor*?.3lisi? vas13“9ΐπθϊtci - ”Moncklonanlinen vasta*·ai.n6w on reseptori, jonka on tuottanut yksittäisen solun, nimeltään klooni, inVa erittää vain yhdenlaista reseptorirrolehvvliä ^ v yv* *- Uyv, vasta-ainetta t n o t— tavasta solusta ja myeloomasolusta tai muusta itsestään jatkuvasta solulinjasta.
Tämän keksinnön m.onoklonaalisten vasta-aineiden valmistus— 10 tekniikat ovat hyvin tunnettuja. Kohler ja Milstein, Nature, 256, 495 81975), mikä on liitetty tähän viitteeksi, kuvasivat ensimmäisinä sellaisia reseptoreita. Monoklonaali-sia vasta-aineita saadaan tyypillisesti hybridomakudosvil-jelmistä tai vesivatsanesteistä, jotka on saatu nisäkkäis-15 tä, joihin hybridomakudos on viety. Molemmat menetelmät on huvettu tässä.
-1M '"O s s? s ä ** o 1 ahyvl joka ^ tsa cj 2. t c u t u u resepte^^vdsk^ylvesta^sanet**^ i m-ϊ ^^ 20 koht?,sr.. Tässä tarkastellaan kahdenlaisia ligandeja. En s i m— mäistä nimitetään analogi-ligandiksi ja käytetään imm.uno-geenir.ä indusoimaan reseptorimolekyylien valmistamista ja reseptorimolekyylin katalysoiman reaktion inhibiittorina.
An a 1 ogi — 1 igandi on olennaisesti inertti läpikävmään ka*'a"'v— o c soitua rea^t^cta. Toisp^n v*esktant^*’-'^^fTc?n^*’,",:? tai reaktantti-ligandisubstraattina ja on molekyyli, joka läpikäy katalysoidun reaktion.
Kuten tässä on kuvattu, sellaisia amidi- tai esterili~andi-*3o ker?is"' lisiä enslove^a sv^tetisoidasn, j^^vp i ^ -s *- 4- |j T? 5 +.
fosfonamidaatti- tai fosfonaattiosia spesifisiin, edeltä määritettyihin kohtiin matkimaan siirtymätilan kenformaati-ota amidi- tai esterisidoksen hydrolyysissä. Sellaiset analogit ovat sopivia ehdokkaita tähän tutkimukseen, koska 35 tiedetään, että fosfonamidaatteja on käytetty siirtymätila-analogeina proteolyyttisten entsyymien inhibiitiossa [Bartlett, et ai., Biochemistry, 22, 4618 (1983)].
22 95928
Lyhyet polypeptidiketjut voivat indusoida vasta-aineiden, jotka tunnistavat ja sitoutuvat homologiseen proteiiniin edeltä määritettyyn spesifiseen kohtaan, tuoton. Tämä kek-5 sintö vie aikaisempaa työtä polypeptideillä merkityksellisen vaiheen eteenpäin. Tässä vasta-aineet (reseptorit) indusoidaan immunisoivan hapteenisen ensimmäisen molekyylin (analogi-ligandi) yhden stereoisomeerin toimesta ja tunnistavat ja eivät sitoudu vain tuohon yhteen ensimmäi-10 seen molekyyliin, vaan myös yhteen, toisen stereoisomeerin samankaltaiseen molekyyliin (reaktantti-ligandi). Siteessään tätä toista molekyyliä reseptori aiheuttaa edeltä valitun esteri- tai amidisidoksen, joka vastaa topologiassa immunisoivaa, hapteenista ensimmäistä molekyyliä, hydrolyy-15 sin (mikä on osoitettu tässä, on katalyyttinen). Vastaavuus topologiassa; s.o. koko, muoto, stereokemia ja varaus antaa keinot valita edeltä kohta, missä tapahtuu ligandin hydro-lyysi. Reseptorimolekyylit sitovat myös inhibiittoriligan-deja, jotka muistuttavat analogi-ligandin tai reaktantti-20 ligandin rakennetta.
Sen mukaisesti suhteellisen pienen, immunisoivan hapteenisen analogi-ligandin synteesillä voidaan indusoida resepto-rimolekyylien, jotka tunnistavat, sitoutuvat ja katalyytti-25 sesti pilkkovat esteri- tai amidisidosta toisessa molekyy-. Iissä, jossa on useita amidi- ja esterisidoksia, tuottoa.
Täten sellainen reseptori voidaan valmistaa, joka aiheuttaa stereoselektiivisesti proteiinin tai polypeptidin kuten e-dellä keskusteltu geneettisesti manipuloitu fuusioproteii-30 ni, valitun, edeltä määritetyn amidisidoksen hydrolyysin.
Samallalailla voidaan valmistaa reseptori, joka stereospe-sifisesti ja katalyyttisesti hydrolysoi valitun, edeltä määritetyn malliyhdisteen tai rasvamolekyylin esterisidok-sen.
Tämän tuloksen seuraamus on, että voidaan antaa aktiivisuus immunoglobuliinien proteaaseille ja lipaaseille, mikä on 35 2.2 95928 tähän asti ollut tuntematonta. Lisäksi vasta-aineen aktiivisuus voidaan ohjata mihin tahansa edeltä määritettyyn kohtaan mielin määrin suunnittelemalla pilkottava amidi-tai esterisidos fosfonamidaatti- tai fosfonaatti-konfigu-5 raatiolla hapteenisessa analogi-ligandissa, jota käytetään immunisaatioon.
Täten hapteeninen esteri tai amidi analogi-ligandin hydro-lyyttinen siirtymätilan molekyyli indusoi vasta-aineet ja 10 vasta-aineiden idiotyyppiä sisältävät polyam.idiosat. Hapteenisessa molekyylissä on tetraedrisesti sitoutunut kes-kusfosfori tai silikoniatomi sitoutunut suoraan (a) analogisen esterin tai amidin karboksyylihappo-osan hiiliatomiin, (b) kahteen happiatomiin ja (c) kolmanteen happiato-15 miin tai typpiatomiin, kolmannen happiatomin tai typpiato-min ollessa sitoutunut ligandin analogisen esterin tai a-midin alkoholi- tai amiiniosan hiiliatomiin (alfa-hiili).
Analogi-ligandin suunnittelu kulkee takaisinpäin tuotteen, 20 joka on tarkoitus muodostaa siirtymätilan kautta matkittavaa sidoksen muodostusta varten, ja sitten analogi-ligan-diin, rakenteesta. Reaktiot, joihin kuuluu amidi- tai es-terihydrolyysi, antavat valaisevia esimerkkejä yleisestä käsityksestä ja niitä käytetään tässä tyyppiesimerkkeinä 25 esteri- ja amidi-hydrolyysireaktioille.
Transasetylaatioprosesseille on tyypillistä karbonyyli additio-eliminaaticmekanismif. Asyyliryhmällä voi siksi olla vaihtelevissä määrin tetraedristä luonnetta tässä 30 siirtymätilassa. W.P Jencks, Catalysis in Chemistry and
Enzymology, ch. 10, (McGraw-Hill, New York, 1969). Entsyy-. mien, jotka katalysoivat transasetylaatioreaktioita, saa tettaisiin odottaa sitovan hyvin niitä reaktantti-ligandin analogeja, joilla on tetraedriner. konfiguraatio asyylikes-35 kuksen ympärillä. Tämä pätee seriiniproteaaseille, jossa muodostuu väliaikaisesti kovalenttinen sidos ligandin (substraatti) ja entsyymin välille [Westerik et ai., J.
24 95928
Biol. Chem. 247, 8195 (1972); R.C. Thompson, Biochemistry, 12, 47 (1973) ja Imperali et al., Biochemistry, 25, 3760 (1986)], samoin kuin entsyymeille, jotka katlysoivat amidien tai estereiden suoran hydrauksen. Jälkimmäistä kategori-5 aa inhiboivat yhdisteet, joilla on tetraedrinen konfiguraatio fosfaatti-, fosfonaatti- tai fosfonamidaattiryhmä mukaanluettuina halkaistavan amidi-yksikön asemasta [Weaver et ai., J. Mol. Biol., 114, 119 (1977) ja Jacobsen et ai., J. Am. Chem. Soc., 103, 654 (1981)].
10
Luonnostaan esiintyviä ja synteettisiä aineita, joissa on fosforia, on tutkittu metallopeptidaasien inhibiittoreina. Näissä entsyymeissä näyttäisi siirtymätilalla olevan hyd-rattu amidi metalli-ionin koordinaatiopiirissä [W. N.
15 Lipscomb, Acc. Chem. Res., 15, 232 (1982)]. Siirtymätilan analogilla täydellisessä kuvassa saattaisi sitten olla inhibiittorin fosfonoryhmä ligandina metalli-ioniin tai muuhun polarisoivaan kohtaan Weaver et ai., J. Mol. Biol., 114, 119 (1977) ja Christianson et ai., J. Am. Chem. Soc., 20 108, 545 (1986)]. Metalli-ionien osuutta metallopeptidaa- seissa ei kuitenkin selvästi ymmärretä. Sillä saattaa olla moninainen toiminta amidihydrolyysissä, missä protonin siirtovaiheet tetraedristen välituotteiden joukossa saattavat olla nopeutta rajoittavia [L.M. Sayre, J. Am. Chem.
25 Soc., 108, 1632 (1986)].
Karboksyylihappoestereiden hydrolyysi on yksinkertaisempi esimerkki transasylaatiosta, jota siirtymätilan fosfonaat-tia sisältävän analogin pitäisi myös lähestyä. Varautuneen 30 fosfonaattiryhmän sitominen saattaa kuvata stabiloivaa vuo rovaikutusta siirtymätilassa, joka johtaisi katalyysiin. Esterihydrolyysireaktiot etenevät yleensä sopivilla spontaaneilla nopeuksilla ympäröivissä olosuhteissa, jotka ovat sopivia vasta-aineille. Siksi mikä tahansa pieni nopeuden 35 kiihtyminen voidaan havaita helposti.
Analogi-ligandien ja reaktantti-ligandien rakenteet tätä 25 95928 tutkimusta varten valittiin tietyn kriteerin mukaan. Näihin kuului orgaanisen fosforin prekursorien, vastaava karbok-syylihapposubstraatti, saatavuus ja stabiilisuus, kemiallisen synteesin soveliaisuus sen valmistamiseksi ja sopeutu-5 miskyky erilaisiin immunologisen esityksen kaavoihin.
Perus molekulaarinen yksikkö, josta saadaan tarpeelliset piirteet stereoselektiivistä katalyyttistä hydrolyysiä varten, on substituoitu fenyylietikkahappoesterianalogi (yh-10 diste F), jota kaava I alla, esittää.
HOOCCHj CH, CH, -<^-NH —O * 15 -CH» J^° f*\_/ CH,-0 CH,
Kaavan I yhdiste, yhdiste F, on tässä käytetty analogi-li-20 gandi synnyttämään tämän keksinnön reseptoreja. Yhdiste F on näytetty sen muodossaan ennen kytkemistä antigeeniseen kantajaan immunisaatiota varten. Pitäisi huomata, että yhdiste F on raseemisena modifikaationa, jonka stereoisomee-rinen keskus on tunnistettu tähdellä (*) metiinihiilen ylä-25 puolella osoittaen, että kaksi stereoisomeeristä rakennetta (R ja S) ovat mahdollisia.
Liittämällä mukaan aminosubstituentin analogi-ligandin joko happo- tai amiini- tai alkoholi-osaan, kuten yhdisteen F 30 happo-osassa, saadaan analogi-ligandi, jossa on toiminnallinen lisäke antigeeniseen (immunogeeninen) kantajaproteiiniin kytkemistä varten. Sellainen lisätty lisäke on hyödyllinen, milloin analogi-ligandi on hapteeni. Lisäke ja muka-na seuraavat linkkeriatomit voivat myös olla läsnä reak-35 tantti-ligandissa, erityisesti milloin reaktantti-ligandi on suhteellisen pieni, niin että vasta-aineen liittävä kohta voi olla suhteellisen täytetty ligandilla.
Täten tämä keksintö koskee yleisesti monoklonaalisia resep- 26 95928 toreja, jotka kykenevät katalyyttisesti hydrolysoimaan re-aktantti-ligandin yhden stereoisomeerin edeltä valitun amidi- tai esterisidoksen.
5 Reseptorit, joissa on vasta-aineen liittävä kohta, joka sitoutuu: (a) reaktantti-ligandin yhteen stereoisomeeriin, joka voi muodostaa reaktantin edeltä valitun esteri- tai amidisidoksen tetraedrisen hydrolyyttisen siirtymätilan; s.o., sisältää edeltä valitun karboksyylihappoamidi- tai 10 esterisidoksen ja (b) analogi-ligandin yhteen stereoisomeeriin, joka on stereokemiallisesti analoginen reaktantti-ligandin kanssa ja sillä on tetraedrisesti sidottu fosfori-atomi sijoitettuna asemaan, jossa on reaktantti-ligandin edeltä valitun esteri- tai amidisidoksen halkaistavan kar- 15 bonyyliryhmän hiiliatomi. Tetraedrisesti sidottu fosforia-tomi on sitoutunut suoraan: (i) analogisen reaktantti-ligandin esterin tai amidin happo-osan hiiliatomiin (alfa-hiili), joka on ketjussa, jossa on vähintään 5 atomia ja edullisemmin vähintään 15 atomia 20 ja edullisimmin vähintään 15 atomia ja siinä on substituoi-tu fenyyliryhmä; (ii) kahteen happiatomiin, joista yksi on sitoutunut fosfo-riatomiin kaksoissidoksella, jolloin happi on okso-radikaa-li ja toinen kahdesta happi-atomista on sitoutunut yksin- 25 kertaisesti fosforiin ja yksinkertaisesti radikaaliin, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu vedystä ja C,-C« alemmasta alkyylistä; ja (iii) kolmanteen happi- tai typpiatomiin, joka on sitoutunut analogisen esterin tai amidin hiiliatomiin; s.o. este- 30 rin tai amidin alkoholi- tai amiiniosan alfa-hiileen, joka on osa ketjua, jossa on vähintään 5 atomia ja edullisemmin vähintään 15 atomia ja edullisimmin vähintään 15 atomia ja siinä on substituoitu fenyyliryhmä.
35 Milloin syklinen amidi tai esteri on reaktanttiligandi, ei ole selvästi erotettavaa molekyylin happo- ja amiini- tai alkoholi-osia. Orgaanisen kemian ammattimies ymmärtää kui- 27 95928 tenkin, että amidien ja estereiden täytyy määritelmän mukaan sisältää happo- ja amiini- tai alkoholiosia. Täten voidaan piirtää mielikuvituksellinen rajaviiva sellaisille molekyyleille, joissa on ainakin karbonyylihiili ja sen 5 suoraan sidottu alfa-hiili molekyylin happo-osassa ja mukana on amino- tai hydroksyyliryhmä ja sen suoraan sidottu alfa-hiili molekyylin amiini- tai hydroksyyliosassa. Sellaisissa syklisissä yhdisteissä on myös tietenkin stereoi-someerinen keskus, joka on reaktantti-ligandi-osassa, jonka 10 katalyyttinen reseptorimolekyyli on sitonut.
Eräässä toisessa suoritusmuodossa tämä keksintö koskee stereoselektiivistä menetelmää, jossa katalyyttisesti hydrolysoidaan edeltä valittu esteri- tai amidisidos reak-15 tantti-ligandimolekyylissä. Menetelmä koostuu vaiheista: (a) sekoitetaan katalyyttisesti tehokas määrä yhtä edellä ollutta reseptoria reaktantti-ligandimiolekyylien kanssa, joissa on stereoisomeerinen keskus, vesipitoisessa alustassa; ja (b) pidetään seosta riittävä aikajakso ligandimole-20 kyylien sitoutua reseptoreihin ja reseptorimolekyylien hydrolysoida reaktantti-ligandin yhden mahdollisen stereoiso-meerin edeltä valittu sidos. Hydrolyysin tuotteet voidaan sen jälkeen saada takaisin, jos halutaan. On ymmärrettävää, että käytetään reaktantti-ligandia, jolla on sama stereo-25 konfiguraatio kuin analogi-ligandilla, jota käytetään indusoimaan reseptorimolekyylejä. Reaktantti-ligandien stere-oisomeeristä paria voidaan käyttää, vaikka yksi stereoiso-meeri reagoi.
30 Tämän keksinnön hydrolyyttinen menetelmä käyttää vesipitoista alustaa reaktioseoksen osana. Tuossa alustassa on tyypillisesti vettä ja puskurisuoloja. Lisäksi alusta voi sisältää muita suoloja, kuten natriumkloridia, samoin kuin veteen liukoista kalsium- ja magnesiumsuoloja, kuten usein 35 proteiinia sisältävissä alustoissa on. Läsnä on myös orgaanisia liuottimia, kuten metanolia, etanolia, asetonitriili-ä, dimetyylisulfoksidia, dioksaania, heksametyylifosforami- 28 95928 dia ja Ν,Ν-dimetyyliforamidia. Pinta-aktiivisia aineita, jotka emulgoivat reagenssiligandin ja reseptorimolekyylin, voi myös olla läsnä. Vesipitoisessa alustassa läsnäolevien ainesosien kriittinen piirre on, että nuo ainesosat eivät 5 olennaisesti sekaannu tai inhiboi katalyyttistä reaktiota, kuten reseptorimolekyylin denaturoinnilla. Lisäksi vesipitoisessa alustassa ei olennaisesti ole suolaa, yleisesti proteiineja ja spesifisesti entsyymejä, jotka inhiboivat reseptorimolekyylin katalysoimaa sidoksen rikkovaa reaktio-10 ta.
Vesipitoisen alustan pH-arvo on tyypillisesti noin 5 - noin 9, ja edullisesti noin pH 6,0 - noin 8,0. pH-arvoja, jotka ovat suurempia ja vähemmän kuin nuo viitaut arvot, voidaan 15 myös käyttää niin kauan kuin katalysoitavaan reaktioon ei jälleen olennaisesti sekaannuta tai inhiboida.
Katalyyttiset reaktiot suoritetaan tyypillisesti ympäröivässä huoneenlämpötilassa; s.o. noin 20 - noin 25*C tai 20 37’C:ssa ja ympäröivän ilmakehän paineessa; s.o. noin 1 atm. Kuitenkin voidaan käyttää lämpötiloja alas noin vesiliuoksen jäätymispisteeseen ja ylös noin alustan kiehumispisteeseen ilmakehän paineessa. Kuten tiedetään, proteiinit, kuten reseptorimolekyyli, ovat taipuvaisia denaturoitumaan 25 kohotetuissa lämpötiloissa, kuten sellaisissa joissa vesipitoinen alusta kiehuu, esim. noin 100'C ja täten lämpötilat alle noin 40*C ovat edullisia. Kuten myös hyvin tiedetään, reaktioiden, jotka noudattavat multimolekulaarisia kineettisiä lausekkeita, nopeudet laskevat lämpötilan laskiessa.
30 Täten noin 15'C:een minimilämpötila on edullinen.
: Reaktantti-ligandia on reaktioseoksessa sellaisena määränä, että se liukenee vesipitoiseen alustaan. Kaksifaasisystee-miä, jossa on liukenematonta reaktantti-ligandia, voidaan 35 myös käyttää, mutta tavallisesti ei käytetä. Tavallisesti käytetyt reaktantti-ligandikonsentraatiot ovat noin 0,1 μΜ - noin lOmM, tämän määrän ollessa myös reaktantti-ligan- 29 95928 din liukoisuuden funktio liuotinalustaan. Milloin tuotetta itsessään toivotaan, käytetään suhteellisesti suurempia konsentraatioita verrattuna alhaisempiin konsentraatioihin, kun reaktiomekanismia tai reaktiokinettiikkaa on tarkoitus 5 tutkia.
Läsnä on myös tehokas määrä reseptorimolekyyliä. Tuo tehokas määrä on tyypillisesti katalyyttinen määrä; s.o. reseptoria käytetään moolisessa suhteessa reaktantti-ligandiin 10 noin 1:2 - noin 1:1000 ollessa edullinen. Reseptorimolekyy-lin suhde reaktantti-ligandiin riippuu tyypillisesti resep-torimolekyylin spesifisestä aktiivisuudesta reaktantti-li-gandia vastaan ja reaktion käyttäjän tarkoituksesta. Täten, milloin toivotaan tuotetta, käytetään suhteellisesti korke-15 ampaa reseptorikonsentraatiota ja korkeampaa reseptori-re-aktantti-ligandisuhdetta. Milloin tutkitaan reaktion reaktiomekanismia tai kinetiikkaa, käytetään tyypillisesti alhaisempaa konsentraatiota ja suhdetta. Reseptoria voidaan käyttää stokiometrinen määrä tai myös vähemmän, mutta koska 20 reseptori on katalyyttinen molekyyli, jopa stokiometrisen määrän käyttö voi olla tuhlausta. Täten reseptoria käytetään ainakin katalyyttinen määrä.
Seosta, joka muodostui, kun sekoitettiin reseptorimolekyy-25 lejä ja reaktantti-ligandia vesipitoisessa alustassa, ylläpidetään riittävä aikajakso stereospesifisen sitoutumisen ja reaktion tapahtua. Tuon ylläpitämisjakson kesto on useiden parametrien funktio, valitut reseptorit ja reaktantti-ligandit mukaanluettuina, niiden konsentraatiot, pH-arvot 30 ja lämpötila, samoin kuin se, mitä reaktiosta etsitään.
Täten, milloin suoritetaan kineettisiä tutkimuksia, tavataan usein ylläpitoaikoja minuuteista tunteihin. Milloin toivotaan reaktiotuotteita, ovat ylläpitoajät tunneista 35 päiviin tavallisia.
Enantiomeeristä yhdistettä F, joka on kovalenttisesti liit- 30 95928 tynyt RLHrhon, käytettiin immunogeenisenä konjugaattina immunisoimaan hiiriä. Hybridomat valmistettiin käyttämällä immunisoitujen eläinten pernaa.
5 Valmistettiin 12 hybridomaa, joiden eritetyt monoklonaaliset vasta-aineet (reseptorit), jotka olivat sitoutuneet yhdisteeseen F, kytkeytyivät BSArhan ELISA-analyysissä. Jokaista noista sitoutumisvuorovaikutuksista inhiboi reseptorin esi-inkubointi liuoksessa, jossa ei ollut yhdistettä 10 F, tällöin osoittaen, että havaitut ELISA-sitoutumiset olivat spesifisiä sidotulle hapteeniselle analogi-ligandille.
Noista 12 monoklonaalista 8 tämän jälkeen luetelluista o-livat kykeneviä katalyyttisesti hydrolysoimaan tyypillisen 15 enantiomeerisen esteri-reaktantti-ligandin yhdiste H:n (R,S). Kaksi noista 8:sta katalyyttisestä reseptorista katalysoi vain S(-)-reaktantti-ligandin hydrolyysin, yhdiste H [S (-)], kun taas muut 6 katalysoivat vain R( + )-reaktantti-ligandin hydrolyysin, yhdiste H [R(+)]. Tämän jäl-20 keen keskustellaan spesifisistä olosuhteista, joita käytetään noihin stereoselektiivisiin hydrolyyseihin.
On painotettava, että reseptorimolekyylit, jotka hydrolysoivat yhden enantiomeerin, eivät katalysoineet toisen 25 enantiomeerin hydrolyysiä. On myös painotettava, että ei havaittu reseptoria, joka katalysoi yhdisteen H sekä R(+)-että S(-)-enantiomeerejä.
Yhdisteiden F ja H rakenteet, samoin kuin niiden synteesien 30 välituotteet näytetään tämän jälkeen yhdessä tähän liittyvien erilaisten synteesien keskustelun kanssa.
Uskotaan, että edellä kuvatut stereoselektiiviset katalyyttiset hydrolyysit ovat ensimmäiset sellaiset koskaan rapor-35 toidut hydrolyysit. Lisäksi uskotaan, että tämä on ensimmäinen raportti erillisten vasta-ainetta liittävän kohdan sisältävien reseptorimolekyylien, jotka voivat stereoselek- 31 95928 tiivisesti katalysoida stereoisomeeriparin jokaisen erillisen jäsenen reaktion, valmistamisesta; tässä enantiomeerit. Täten aikaisemmin mainitut Napper et ai.. Science, 237:1041 (1987) ja Hilvert et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85: 5 4953 (1988) paperit molemmat raportoivat reseptorimolekyy- lien, jotka katalysoivat kahden stereoisomeerisen subst-raattimolekyylin vain yhden reaktion, valmistamisesta.
Tässä raportoidut tulokset täten täydentävät kahden aiemman 10 emähakemuksen tuloksia ja Napper et ai. paperia, edellä.
Tuota täydennystä nähdään stereoselektiivisessä hydrolyy-sissä verrattuna aiemmin raportoituihin synteeseihin ja myös saataessa yksittäisiä reseptorimolekyylejä, jotka kykenevät katalysoimaan reaktantti-ligandin jokaisen stereo-15 isomeerin reaktion.
Hydrolyyttisten reaktioiden kinetiikan tutkiminen on alkanut. Ensimmäiset tulokset osoittavat, että hydrolyysi on suhteellisen nopeata ja että on jonkin verran tuoteinhibii-20 tiota, jonka on aiheuttanut reaktantti-ligandimolekyylin tuotehappo.
On pantu merkille, että tämän jälkeen keskustellut synteesit koskevat vain yhtä karboksyyliesteriä reaktantti-ligan-25 dina ja yhtä fosfonaattia analogi-ligandina. Noita synteesejä voidaan kuitenkin helposti soveltaa erilaisten esteri-ja fosfonaattiyhdisteiden valmistukseen reaktanttien yksinkertaisilla substituutioilla. Karboksyylihappoamidi-reak-tantti-ligandeja ja fosfonamidi-analogi-ligandeja voidaan 30 myös valmistaa helposti menetelmillä, jotka ovat vastaavia kuin ne, jotka kuvattiin käyttämällä sopivia reaktantteja tässä käytettyjen tilalla.
- 95928 32
Yhdiste A
5 F.cÄ-NH-fj^5^ O
UU-Ic:o-ch'ch' 10 Sekoitettuun dietyyli-4-aminobensyylifosfonaattiliukoseen (0,74 g, 3,04 mM) 5 ml:ssa metyleenikloridia (juuri tislattua kalsiumhydridin päällä) lisättiin (0,32 ml, 4 mM) py-ridiiniä. Seos jäähdytettiin 4*C:een ja lisättiin trifluo-rietikka-anhydridiä (0,5 ml, 3,54 mM) tipoittain yli 5 min 15 jakson ajan sekoittaen liuosta. Sekoitusta jatkettiin 15 min samalla antaen liuoksen lämmetä huoneenlämpötilaan (noin 23'C) . Reaktion päättyminen osoitettiin ohutlevykroma-tografiällä käyttämällä 1:1 metyleenikloridia (CH,Clj) ja etyyliasetaattia (ETOAc) eluanttina (R, 0,2).
20
Sen jälkeen liuos laimennettiin 50 ml :11a etyyliasetaattia. Orgaaninen liuos pestiin kahdesti perättäisillä 25 ml annoksilla 0,5 M HClrää ja sitten kuivattiin vedettömän magnesiumsulfaatin päällä. Haihdutus tuotti keltaisen öljyn, 25 joka puhdistettiin flashkromatografiällä silikageelin päällä käyttämällä 1:1 seosta metyleenikloridia ja etyyliasetaattia eluanttina. Fosfonaatti (yhdiste A) (0,877 g, 85 % saanto) saatiin värittömänä kiteisenä materiaalina.
30 Protoni NMR CDCl,:ssa 100 MHZ:ssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): delta 10,61 (leveä singletti, 1H), 7,53 (dupletti, J=8,22 Hz, 2H), 7,17 (kaksoisdupletti, J=8,67 Hz ja 2,5 Hz, H), 4,02 (P, J=7,18 Hz, 2(2H)), 3,10 (dupletti, J-21,62, Hz, 2H) ja 1,26 (tripletti, J=7,05 Hz, 2(3H).
35 33 95928
Yhdiste B
5 O
UUv™' 10
Pyöreäpohjäiseen pulloon, jossa oli 0,2 g (5,88xl0'4 mol) yhdistettä A 2 ml:ssa kuivaa, juuri tislattua dikloorime-taania (CH,C1,), lisättiin 0,8 ml trimetyylisilyylibromidia (TMSBr; 5,9x10'’ mol). Saatua seosta sekoitettiin 40’C:een 15 lämpötilassa 3 h jakson ajan.
Liuotin poistettiin sen jälkeen, jolloin saatiin valkoinen kiinteä. Tätä kiinteätä käsiteltiin liuoksella, jossa oli 5 % vettä dietyylieetterissä (v/v), mikä liuotti kiinteän.
20 Seisottamisen jälkeen lisää valkoista kiinteätä tunnistettiin, kun ilmestyi fosfonihappoa, joka kerättiin, kuivattiin ja punnittiin 0,1274 g:ksi. Analyysi ohutlevykromato-grafialla (tie) silikageelin päällä CHjClj/ETOAc (1:1, v:v) osoitti, että fosfonihappo oli puhdasta.
25
Fosfonihappo (0,1221 g) liuotettiin metanoliin, johon oli lisätty diatsometaania. Sen jälkeen, kun oli odotettu, että reaktio oli tapahtunut, lisättiin kationinvaihtohartsia (protonimuoto) pieninä määrinä, kunnes liuoksen keltainen 30 väri katosi. Liuotin poistettiin, lisättiin CH,C1Z liuottamaan yhdistettä B ja saatu liuos suodatettiin hartsihelmien poistamiseksi. Sen jälkeen liuotin poistettiin, jolloin saatiin 0,1284 g yhdistettä B (95 % saanto).
35 Ohutlevykromatografia, kuten edellä, osoitti singlettituo- tetta.
Protoni NMR CDC1, :ssa 100 MHZrssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): delta 8,78 (leveä singletti, 1H) , 7,42 34 95928 (multipletti, 4H), 3,7 (dupletti, J=ll, Hz, 6H), 3,17 (dup-letti, J=20 Hz, 2H).
Yhdiste C
UU<ci ^O-CH, 10
Yhdiste B (0,50 g; l,6xl0'4 nol) laitettiin pyöreäpohjäiseen pulloon, jossa oli 4 ml kuivaa kloroformia, johon oli lisätty 1 ekvivalentti PCls:tä (0,034 g). Saatua liuosta kuumennettiin 45"C:een lämpötilassa sekoittaen. 1 h kuluttua 15 osoitti tie (kuten edellä) reaktion olevan noin 95 % täydellinen. Lisättiin toinen puoli-ekvivalenttia PCl,:tä ja reaktiota ylläpidettiin toinen h, jona aikana tie osoitti reaktion olevan täydellisen.
20 Sen jälkeen pulputettiin rikkidioksidia liuokseen. Sitten poistettiin liuotin ja haihtuvat ja jäännös pestiin dietyy-lieetterillä ja kuivattiin alennetussa paineessa. Yhdiste C kerättiin 0,0255 g määränä.
25 Protoni NMR CDC1, :ssa 100 MHZ:ssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): delta 8,5 (leveä singletti, 1H), 7,42 (multipletti, 4H), 3,86 (dupletti, J=14, Hz, 3H), 3,55 (dupletti, J=20 Hz, 2H).
• 30 Yhdiste D
0 ___ CH, CH,-<j
Raseeminen sec-fenetyylialkoholin (alfa-metyylibensyylial-koholi) modifikaatio (0,152 ml; 12,66xl0'4 mol) liuotettiin 40 kuivaan tetrahydrofuraaniin (THF). Lisättiin natriumhydri-diä (0,038 g; 15,83xl0'4 mol) liuokseen ja saatua seosta kuumennettiin palautusjäähdytyksessä 2 h jakso. Sen jäi- 35 95928 keen, kun seos oli jäähdytetty huoneenlämpöiseksi, lisättiin 0,10 g (3,165x1ο'4 mol) yhdistettä C jäähdytettyyn seokseen ja saatua seosta sekoiotettiin 5 min.
5 THF poistettiin ja jäännös laimennettiin ETOAc:hen. Tuo liuos pestiin 0,5 H vesipitoisella HClrllä ja kyllästetyllä natriumkloridilla ja kuivattiin sitten natriumsulfaatin päällä. ETOAczn poisto tuotti keltaisen öljyn. Tuo öljy puhdistettiin flashkromatografiällä käyttämällä CHjCl,/ 10 ETOAc:ta liuottimena 10/1, 5/1 ja 3/1 (v/v), ja saatiin 0,083 g yhdistettä D (65 % saanto).
Protoni NMR CDCl,:ssa 100 MHZrssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): delta 9,72 (leveä dupletti, J=10 Hz), 7,28 15 (multipletti, 9H), 5,45 (multipletti, 1H), diastereomeeri-set parit: [3,65 (dupletti, J=ll Hz) 3,32 (dupletti, J=ll Hz), 3H], diastereommeriset parit: [3,1 (dupletti, J=21
Hz), 2,95 (kaksoisdupletti, J=21 Hz) 2H], diastereomeeri-set parit [1,6 (dupletti, J=7 Hz) 1,45 (dupletti, J=7 Hz), 20 3H].
Yhdiste E
O CH, 25 J—\ Il Λ=/ 30 Yhdiste D (0,0250 g; 6,22x10'’ mol) liuotettiin 1 ml:aan etanolia sekoittaen. Etanoliliuokseen lisättiin natriumboo-rihydraattia (0,0161 g; 7 ekvivalentti) ja saatua liuosta sekoitettiin 1 h aikajakso huoneenlämpötilassa.
35 Sitten lisättiin 10 % vesipitoista ammoniumhydroksidiliuos-ta edellä olleeseen liuokseen. Saatu liuos uutettiin ETO-Ac:llä ja saatu ETOAc-uute kuivattiin natriumsulfaatin päällä. Liuotin poistettiin, jolloin saatiin 0,015 g yhdistettä E (noin 80 % saanto).
40 36 95928
Protoni NMR CDCl,:ssa 100 MHZ:ssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): delta 6,95 (multipletti, 9H), 5,48 (mul-tipletti, 1H), diastereomeeriset parit: [3,62 (dupletti, J=ll Hz) 3,33 (dupletti, J=ll Hz), 3H], diastereommeriset 5 parit: [3,08 (dupletti, J=21 Hz), 2,88 (dupletti, J=21 Hz) 2H], diastereomeeriset parit [1,58 (dupletti, J=7 Hz) 1,45 (dupletti, J=7 Hz), 3H].
Yhdiste F (analogi-ligandi) 10 9 CH, HOOCCH.CH.CH.-C-NH-rfO % /==s\
XX*y~\J
CH,-Ö 15
Yhdiste E (0,032 g; l,046xl0'4 mol) liuotettiin 3 ml: aan kuivaa CH,Cl2:ta, johon lisättiin trietyyliamiinia (0,0145 ml; 1 ekvivalentti) ja saatua liuosta sekoitettiin 10 min huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen lisättiin glutaarianhydri-20 diä (0,0110 g; 1 ekvivalentti) sekoitusta jatkamalla. Reaktiota seurattiin tlc:llä silikageelin päällä CHjClj/me-tanoli (5/1, v/v) liuottimena.
Reaktioseos laimennettiin ETOAc:llä, johon lisättiin 0,5 25 vesipitoista HCl:ää. Sen jälkeen lisättiin 4 M vesipitoista HCl:ää, kunnes vesipitoinen osa oli hapanta. Orgaaninen liuotinkerros erotettiin, kuivattiin natriumsulfaatin päällä ja sitten liuotin poistettiin alennetussa paineessa. Tuloksena oleva tuote saatiin preparatiivisellä tlc:llä sili-30 kageelissä käyttämällä edellä ollutta liuotinta eluaatti-na.
Yhdiste F valmistettiin antamalla edellä valmistetun yhdisteen (32 mg) reagoida 2 ml:n kanssa t-butyyliamiinia sulje-35 tussa putkessa 60*C:ssa 10 d jakson ajan. Liuottimet poistettiin, tuote puhdistettiin nopealla proteiininestekroma-tografilla ja raseeminen yhdiste F saatiin lyofilisaatiol-la. Saatiin yhteensä 26,3 mg yhdistettä F (85 % saanto).
37 95928
Protoni NMR DMSO-d,:ssa 100 MHZrssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): delta 9,8 (singletti, 1H) , 7,3 (multip-letti, 9H), 5,39 (multipletti, 1H), 2,98 (dupletti, J=21 Hz), 2,30 (multipletti, 4H), 1,82 (multipletti, 2H), 1,45 5 (dupletti, J=7 Hz, 3H).
Yhdiste G
10 FjC-^-NH—CH, _ ϋ-μ-Ο 15 Lisättiin trifluorietikkaanhydridiä (2,8 ml) 4-aminofenyy-lietikkahappoliuokseen (1,5 g) ja natriumkarbonaattiin (1,5 g) 10 % vesipitoisessa asetonitriilissä -10'C:ssa. Liuos tehtiin happamaksi 6 N HCl:llä (0,2 ml) ja konsentroitiin tyhjiössä. Suodatus silikan läpi 9:1 dikloorimetaanin ja 20 metanolin seoksen kanssa tuotti 1,4 g (57 paino-% saanto) p-trifluoriasetamidofenyylietikkahappoa. Ohutlevykromato-grafia silikageelissä käyttämällä 5/1 seosta kloroformia ja metanolia (v/v) eluanttina tuotti R,-arvon 0,35.
25 Protoni NMR DMSO-ds:ssa 100 MHZ:ssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): 7,37 (dupletti, J=8,7, Hz, 2H), 7,02 (dupletti, J=8,7 Hz, 2H), 3,3 (singletti, 2H).
Edellä ollut happo (0,6 g) liuotettiin tionyylikloridiin ja 30 liuosta kuumennettiin 40^:333 2 h. Tionyylikloridi poistettiin tyhjiössä, jolloin saatiin vastaava happokloridi.
Valmistettiin liuos, jossa oli 0,0461 g (3,773x10'* mol) S(-)-sec-fenetyylialkoholia ja 0,0525 ml trietyyliamiinia 35 (1 ekvivalentti) liuotettuna CH,Cl,:een. Liuosta sekoitet tiin huoneenlämpötilassa 0,5 h. Edellä valmistettua happo-kloridia (0,10 g; 3,774x10"* mol) lisättiin sitten ja sen jälkeen toinen ekvivalentti trietyyliamiinia. Happokloridin lisäys aiheutti liuoksen muuttumisen ruskeaksi ja amiinin 38 95928 lisäys aiheutti kiinteän alkamisen saostua. Reaktioseosta sekoitettiin 0,5 h.
Reaktioseosta laimennettiin sen jälkeen ETOAcrlla, pestiin 5 0,5 M vesipitoisella Helillä, orgaaninen liuotin kuivattiin natriumsulfaatin päällä ja orgaaninen liuotin poistettiin. Tuote puhdistettiin silikageelipylväässä käyttämällä CH,-Clj/ETOAc:ta (5/1, v/v) eluaattina. Kuivaamisen jälkeen saatiin 0,0158 g yhdistettä G [S(—)]- 10 R(+)-isomeeri valmistettiin yleisesti samalla tavalla ja saanto oli 48 %.
Valmistettiin myös raseeminen modifikaatio, jossa oli yh-15 täläiset määrät kumpaakin R(+)- ja S(-)-enantiomeeri-iso-meerejä. Materiaaliin viitataan yhdisteenä G (R,S).
Protoni NMR CDC1, :ssa 100 MHZrssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): delta 8,1 (leveä singletti, 1H), 7,3 20 (multipletti, 9H), 5,9 (multipletti, 1H), 3,62 (singletti, 2H), 1,55 (dupletti, J=6 Hz, 3H).
Yhdiste H (reaktantti-ligandi) HOOCCHjCH,CHj-(?-NH—CH, /-\ 30
Yhdiste G [R( + )] (0,6447 g; 1,84x10'“ mol) liuotettiin 5 ml:aan etanolia pyöreäpohjaisessa pullossa ja lisättiin 5 ekvivalenttia natriumboorihydridiä. Saatua seosta sekoitettiin 2,5 h ja kaadettiin 20 ml:aan 10 paino-% vesipitoiseen 35 ammoniumhydroksidiin. Vesipitoinen liuos uutettiin ETOAc: llä ja ETOAc-liuos kuivattiin natriumsulfaatin päällä. Liuotin poistettiin alennetussa paineessa ja jäännös liuotettiin 5 ml:aan juuri tislattua CH?Clj:a.
39 95928
Lisättiin 2 ekvivalenttia trietyyliamiinia (0,51 ml) edellä olleeseen CH,Cl,-liuokseen ja saatua liuosta sekoitettiin lyhyesti. Lisättiin sitten 1 ekvivalentti glutaarianhydri-diä (0,2095 g) ja saatua reaktioseosta sekoitettiin huo-5 neenlämpötilssa 18 h.
Haihtuvat poistettiin alennetussa paineessa ja jäännös liuotettiin uudelleen ET0Ac:hen. Tuo liuos pestiin vesipitoisella 0,5 M HCl:llä, natriumbikarbonaatilla (10 paino-10 %) ja sitten kyllästetyllä vesipitoisella natriumkloridil- la. Orgaaninen faasi kuivattiin natriumsulfaatin päällä ja poistettiin sitten alennetussa paineessa. Jäännös liuotettiin minimaaliseen määrään metanolia ja lisättiin heksaani-seokset tuotteen saostamiseksi. Tuote pestiin lisämäärillä 15 heksaaniseosta ja kuivattiin, jolloin saatiin 0,300 g (noin 43 % saanto).
Tuote, yhdiste H [R{+)] osoitti +30,6' optista kiertoa natrium-D-linjalla polarimetrissä.
20
Toinen enantiomeeri, yhdiste H [S(—)] valmistettiin yleisesti samallatavalla ja se osoitti -30,3' optista kiertoa, kuten edellä.
25 Raseeminen modifikaatio valmistettiin samalla lailla käyt-, tämällä yhdistettä G (R,S) lähtömateriaalina. Tätä tuotetta käytettiin ensimmäiseen seulontaan ja siihen viitataan yhdisteenä H (R,S) .
30 Protoni NMR DMSO-djissa 100 MHZissa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): delta 9,9 (singletti, 1H), 7,35 (multip-letti, 9H), 5,78 (multipletti, 1H), 3,6 (singletti, 2H), 2,25 (multipletti, 4H), 1,75 (multipletti, 2H), 1,45 (dup-letti, J=6 Hz, 3H).
Analogi-ligandilla (yhdiste F) oli glutaryyli puoliamidi-ryhmä, jota käytettiin liittämään hapteeninen analogi-li- 35 40 95928 gandi antigeeniseen (immunogeeninen) kantajaan vasta-aineiden induktiota varten. Muut liittävät ryhmät, joissa on yhteensä 1-8 metyleeni- (CH2) ryhmää karboksyyliryhmien välillä, ovat myös hyödyllisiä.
5 Täten kahden arvoiset hapot, kuten malonihappo, glutaari-happo, adipiinihappo, läpi dekaanidioichapon ovat hyödyllisiä. Nuo materiaalit voidaan liittää analogi-ligandiin käyttämällä sopivaa anhydridiä, happokloridia tai muuta 10 sopivaa aktivoitua sidosta happoryhmiin.
Erityisen hyödyllinen dikarboksyylihappo-johdannaisen liittävä ryhmä sisältää O-sukkini-imidyyliryhmän yhdessä kar-boksyylihappopäässä ja happokloridin toisessa päässä. Alla 15 olevissa menetelmissä keskustellaan sukkini-imidyyliadipo-yylikloridin spesifisestä valmistuksesta tyyppiesimerkkinä muiden samanlaisten liittävien ryhmien synteeseistä.
Adipiinihappomonometyyliesterin (5,4 g, 33,3 mol) liuosta 20 tionyylikloridissa (15 ml) kuumennettiin 40'C:ssa 2 h. Sitten seos konsentroitiin ja tislattiin tyhjiössä (kiehumispiste 119‘C 20 mmHgrssä), jolloin saatiin 3,58 g (60 paino-% saanto) happokloridimetyyliesteriä. Tämä liuotettiin 20 ml:aan dikloorimetaania ja lisättiin N-hydroksisukkini-25 imidiä (2,75 g, 24,0 mmol), jonka jälkeen lisättiin trie- tyyliamiinia (4,2 ml, 30 mmol). Seosta sekoitettiin 10 min, sitten laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin 0,5 M HCl:llä ja suolavedellä. Liuos kuivattiin vedettömän magnesiumsulfaatin päällä, suodatettiin ja konsentroitiin, jol-30 loin saatiin 4,5 g (87,5 paino-% saanto) metyylisukkini-imidyyliadipaattia värittömänä öljynä.
«
Protoni NMR CDC1, :ssa 100 MHZrssa (TMSrään liittyvä sisäisenä standardina): delta 3,73 (singletti, 3H), delta 2,90 35 (singletti 4H), 2,70 (multipletti, 2H), 2,37 (multipletti, 2H) ja 1,79 (multipletti 4H).
41 95928
Metyylisukkini-imidyyliadipaatti- (4,5 g, 17,5 mmol), kloo-ritrimetyylisilaani- (11,1 ml, 87,5 mmol) ja natriumjodidi-(13,1 g, 87,5 mmol) liuosta 10 mlrssa asetonitriiliä kuumennettiin palautusjäähdytyksessä 12 h. Sitten seos jäähdy-5 tettiin huoneenlämpötilaan ja laimennettiin etyyliasetaatilla. Reaktioseos pestiin uudestaan 5 % vesipitoisella natriumbisulfiitilla, kunnes orgaaninen liuos oli väritön. Sitten se pestiin suolavedellä, kuivattiin vedettömän magnesiumsulfaatin päällä, suodatettiin ja konsentroitiin, 10 jolloin saatiin 3,2 g (71 paino-% saanto) adipiinihappomo-nosukkini-imidyyliesteriä valkoisena kiinteänä.
Protoni NMR CDC1, :ssa 100 MHZissa (TMSrään liittyvä sisäisenä standardina): delta 3,90 (singletti, 4H), 2,70 (multip-15 letti, 2H), 2,4 (multipletti, 2H) ja 1,80 (multipletti 4H).
Adipiinihappomonosukkini-imidyyliesterin (1,00 g, 3,80 mmol) ja tionyylikloridin (5 ml) seosta kuumennettiin 40’C:ssa 3 h, sitten jäähdytettiin huoneenlämpötilaan ja 20 konsentroitiin tyhjiössä. Jäännöstä sekoitettiin useita kertoja kuivan heksaanin kanssa, öljy erotettiin ja kuivattiin tyhjiössä, jolloin saatiin 0,97 g (90 paino-% saanto) sukkini-imidyyliadipoyylikloridia. Tämä liuotettiin kuivaan tetrahydrofuraaniin 5 M liuoksen tekemiseksi, jota käytet-25 tiin sellaisenaan valmistettaessa yhdisteitä, jotka olivat sopivia kytkeytymään proteiinikantajiin.
Protoni NMR CDCl,:ssa 100 MHZrssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): 3,00 (multipletti, 2H), 2,90 (singletti, 30 4H), 2,70 (multipletti, 2H), 1,80 (multipletti 4H).
: Sukkini-imidyylihappokloridin reaktio hapteenisen analogi- ligandin kanssa suoritetaan tavalla, joka on pääpiirteittäin samanlainen kuin edellä keskusteltu yhdisteen F val-35 mistukselle. Tuo reaktio sitoo sukkini-imidyylihappokloridin happokloridin sisältävän osan hapteenin amiiniin ja jättää sukkini-imidyyliryhmän vapaaksi reagoimaan myöhemmin 1...
42 95928 kantajan kanssa.
Hapteenisen analogi-ligandin konjugaatteja antigeenisen (immunogeeninen) proteiinikantajien kanssa, kuten tuli-5 vuorikotilon hemosyaani (KLH), voidaan valmistaa, esimerkiksi aktivoimalla kantajan kytkemisaineen kanssa, kuten MBS (m-maleimidobensoyyli-N-hydroksisukkini-imidiesteri) ja kytkemällä analogi-ligandin tioliryhmään. Katso esimerkiksi Liu et ai., Biochem., 80, 690 (1979). Kuten alalla myös hy-10 vin tiedetään, on usein hyödyllistä sitoa yhdiste sen kantajaan välituotteen, liittävä ryhmä, avulla.
Hyödylliset kantajat tunnetaan ällällä hyvin ja ovat yleensä itse proteiineja. Esimerkkejä sellaisista kantajista 15 ovat tulivuorikotilon hemosyaani (KLH), edestiini, tyroglo-buliini, albumiinit, kuten naudan seerumin albumiini tai ihmisen seerumin albumiini (BSA tai HSA, vastaavasti), punaiset verisolut, kuten lampaan erytrosyytit (SRBC), teta-nustoksoidit, koleratoksoidi, samoin kuin polyaminohapot, 20 kuten poly-(D-lysiini:D-glutamiinihappo) ja sen kaltaiset.
Kantajan valinta riippuu enemmän antigeenin äärimmäisestä aiotusta käytöstä kuin antigeenin determinanttiosasta ja perustuu kriteeriin, joka ei erityisesti liity tähän kek-25 sintöön. Esimerkiksi, jos konjugantti aiotaan käyttää la-boratorioeläimissä, pitäisi valita kantaja, joka ei tuota epäsuotuisaa reaktiota erityisessä eläimessä.
Kantaja-hapteeni-konjugaatti liuotetaan tai dispergoidaan 30 fysiologisesti siedettävän laimentimen vesipitoiseen koostumukseen, kuten tavallinen suolaliuos, PBS tai steriili ’ vesi ympin muodostamiseksi. Ymppiin voidaan liittää mukaan myös adjuvantti, kuten Freundin täydellinen tai ei-täydellinen adjuvantti tai aluna. Ymppi viedään injektiolla eläi-35 meen, jota käytetään muodostamaan vasta-aineita, kuten hyvin tiedetään.
43 95928
Tyypillisessä menetelmässä lisätään 2,5 mg hapteenisen ana-logi-ligandin reaktiotuotetta ja sukkini-imidyyliadipoyyli-kloridia tai sukkini-imidyyliglutaroyylikloridia 250 pl:ssa dimetyyliformamidia hitaasti 2 mgraan KLHrta 750 pl:ssa 5 0,01 M natriumfosfaattipuskuria pH-arvossa 7,2. Käytetään 4'Creen lämpötilaa ja saatua seosta sekoitetaan noin 1 h hapteeni-liittyneen KLH-konjugaatin muodostamiseksi. Kon-jugaattireaktiotuote, joka on siten muodostunut, puhdistetaan sen jälkeen tavallisin keinoin.
10 Tässä työssä yhdiste F (5 mg) sekoitettiin KLH:n (2 mg) kanssa veteen (2 ml). pH säädettiin 4,5:ksi HClrllä ja lisättiin sitten 10 ekvivalenttia l-etyyli-3-(3-dimetyylia-minopropyyli)-karbodi-imidiä. Seosta sekoitettiin noin 12 15 h. Saatu raakatuote ruiskutettiin hiiriin.
Edellä olleita KLH-konjugaatteja (noin 100 pg) käytettiin immunisoimaan hiiriä (129GlX*-kanta) ja monoklonaaliset vasta-aineet saatiin, kuten Niman et ai. kuvaavat, Proc.
20 Natl. Acad. Sei. USA, 77, 4524 (1980) ja Niman et ai., teoksessa Monoclonal Antibodies and T-Cell Products, toim., Katz, D.H., 23-51 (CRC Press, Boca Raton, F1 1982). Lymfosyytit, joita käytettiin muodostamaan tämän keksinnön hyb-ridomia, voidaan johtaa mistä tahansa nisäkkäästä, kuten 25 kädelliset, jyrsijät (esim. hiiri tai rotta), kani, marsu, lehmä, koira, lammas, sika tai sen kaltaiset. Kuten sopivaa, voidaan isäntä tehdä herkäksi immunogeenin ruiskutuksella, tässä tapauksessa hapteeninen analogi-ligandi, jonka jälkeen seuraa vahvennusruiske ja sitten pernan eristys.
30
On edullista, että myeloomasolulinja on samasta lajista kuin lymfosyytit. Sen vuoksi käytetään tyypillisesti fuu- ·. · sioituja hybridejä, kuten hiiri-hiiri-hybridit [Schulman et ai., Nature, 276, 269 (1978)] tai rotta-rotta-hybridejä 35 [Galfre et ai., Nature, 277, 131 (1979)]. Kuitenkin joitakin rotta-hiiri-hybridejä on myös käytetty menestyksellisesti muodostamaan hybridomeja [Golding, "Production of 44 95928
Monoclonal Antibodies by Cell Fusio", teoksessa Antibody as a Tool, Marchalonis et al., toim. John Wiley & Sons Ltd., s. 273 (1982)]. Sopiviin myeloomalinjoihin käytettäväksi tässä keksinnössä kuuluvat MPC-11 (ATCC CRL 167), P3X63-5 Ag8.653 (ATCC CRL 1580), Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581), P3X63-Ag8U.1 (ATCC CRL 1597), Y3-Agl.2.3. (tallennettu Collection Nationale de Cultures de Microorganismsm, Pariisi, Ranska, numero 1-078) ja P3X63Ag8 (ATCC TIB 9). Ei-erittävä hiiren myeloomalinja Sp2/0 tai Sp2/0-Agl4 on edullinen käytettä-10 väksi tässä keksinnössä.
Hybridomasoluja, joita viime kädessä tuotetaan, voidaan viljellä seuraamalla tavallisia in vitro kudosviljelmätek-niikoita sellaisille soluille, jotka ovat hyvin tunnettuja. 15 Edullisemmin hybridomasoluja viljellään eläimissä käyttämällä samanlaisia hyvin tunnettuja tekniikoita, jolloin saadaan monoklonaalisia reseptoreita siten tuotetuista ve-sivatsanesteistä. Vesivatsanesteiden tuottoon käytetyt e-läimet olivat naaras-129GlX*-hiiret, kasvatettu Scripps 20 Clinic and Research Foundation hiiriyhdyskunnassa, La Jolla, Kalifornia, kuitenkin kun käytetään muita eläimiä kuin hiiriä hybridomien valmistamiseen, voidaan hiiriä tai tuon tyyppisiä eläimiä käyttää vesivatsanesteiden tuottamiseen.
25 Erityisesti, tuotettiin tyypillinen monoklonaalinen reseptori Kohler et ai., standardihybridomatekniikalla, Nature, 256, 495 (1975). Naaras-129GlX*-hiiret immunisoitiin nimenomaan vatsaontelon sisäisellä ruiskeella 100 pg konjugaat-ti-ympillä (esim. yhdiste F sitoutunut KLH:hon) 300 pl:ssa 30 1:1 fosfaattipuskuroitua suolaliusota (PBS) pH 7,4 ja
Freundin täydellistä adjuvanttia. 2 viikkoa myöhemmin hii-: ret ruiskutettiin uudestaan samalla lailla 50 pg:lla edellä ollutta konjugaattia 300 pl:ssa 1:1 seosta PBS:ää pH 7,4 ja 10 mg/ml alunaa. 8 lisäviikon jälkeen hiiret immunisoitiin 35 laskimonsisäisesti 50 pg:lla konjugaattia 200 pl:ssa PBS:ää (pH 7,4). Hiiristä poistettiin pernat 4 d myöhemmin ja pernasolut fuusioitiin myeloomasoluihin.
45 95928
Pernasolut kerättiin ja tehtiin yksittäinen solususpensio. Tumalliset pernasolut (1,4x10') fuusioitiin sitten 3xl07 Sp2/0-Agl4 ei-erittävien myeloomasolujen kanssa solufuusio-5 promoottorin läsnäollessa (polyetyleeniglykoli 2000) . Hyb-ridoma, joka tuottaa erityistä monoklonaalista vasta-ainetta, valittiin jakamalla pernasolut 96-kaivon maljoille ja kasvattamalla Dulbecco's modifioidulla Eagle-alustalla (DMEM), jossa oli 4500 mg/1 glukoosia (10 %), 10 % vasikan 10 sikiön seerumia (FCS), hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä (s.o. HAT-alusta), joka ei tue ei-fuusoitujen myeloomasolujen kasvua.
2-3 viikon kuluttua jokaisesta kaivosta kerättiin solukloo-15 nin yläpuolelta supernatantti ja testattiin ELISA-analyy-sillä (enzyme linked immunosorbent assay, kuten tämän jälkeen kuvataan) yhdistettä F olevien vasta-aineiden läsnäo lo. Positiiviset kloonit kloonattiin kahdesti rajoitetulla laimennuksella. Niitä klooneja, jotka jatkoivat yhdiste F-20 spesifisen vasta-aineen tuottamista kahden kloonaamisen jälkeen, laajennettiin tuottamaan suurempia tilavuuksia su-pernatanttinestettä. Siitä tuotetut ja tässä kuvatut hybri-domat ja monoklonaaliset reseptorit on tunnistettu labora-toriomerkinnöin, kuten alla olevassa taulukossa nähdään.
25 Tämän keksinnön monoklonaalinen reseptori voidaan myös tuottaa viemällä, kuten ruiskeella, hybridoma nisäkkään, kuten hiiren, vatsakalvoon. Kuten jo on tähdennetty, käytetään edullisesti syngeenisiä tai semi-syngeenisiä nisäkkäi-30 tä, kuten U.S. patentissa 4361549, mikä esitys on liitetty tähän viitteeksi. Hybridoman vieminen aiheuttaa vasta-ai-: netta tuottavien hybridomien muodostuksen sopivan kasvu- jakson kuluttua ja johtaa tuotetun reseptorin korkeaan konsentraatioon, joka voidaan saada takaisin isäntähiiren 35 verenkierrosta ja vatsakalvon tulehdusnesteestä (vesivat-sat) .
46 95928
Vaikka isäntähiirillä on myös normaalit reseptorit niiden veressä ja vesivatsoissa, normaalien reseptorien konsen-traatio on tyypillisesti vain noin 5 % monoklonaalisen reseptorin konsentraatiosta.
5
Monoklonaaliset reseptorit saostetaan vesivatsanesteistä, puhdistetaan anioninvaihtokromatografilla ja dialysoidaan kolmea erilaista puskuria vastaan.
10 Näissä tutkimuksissa saatiin Ig-fraktiot tyypillisesti hiiren vesivatsoista saostamalla 45 % kyllästetyllä ammoniumsulfaatilla, ja sen jälkeen kromatografoimalla DEAE-Sepha-celrssä natriumkloridi-eluaatiolla. Fraktio, joka eluoitiin 100 mM:lla suolalla, dialysoitiin ja konsentroitiin. Prote-15 iinikonsentraatiot määritettiin Lowryn menetelmällä [J.
Biol. Chem., 193:265 (1951)]. Saadut konsentroidut liuokset, joissa oli eristetyt IgG-fraktiot, valmistettiin tyypillisesti reseptorin kantaliuoksiksi 1-20 mg/ml käyttämällä sopivaa puskuria, kuten 50 mM Tris-HCl tai natriumfos-20 faattia, jossa oli 0,01 M natriumatsidia.
Niistä 12 monoklonaalisesta reseptorista, jotka sitoutuivat antigeeniin ELISA:ssa, 8 katalysoi raseemisen yhdiste H (R,S) substraatin hydrolyysiä. Kaksi noista kahdeksasta ka-25 talyyttiä erittävästä hybridomasta, yksi joka katalysoi jokaisen stereoisomeerin reaktion, tallennettiin keksinnön e-simerkkeinä. Hybridomat tallennettiin American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, kuten nähdään hybridoma-tallennus taulukosta alla.
30 47 95928
Hybridoma-tallennus taulukko Hybridoman nimitys Reagoi 5 R( + )/S (-) ;n
Laboratorio kanssa ATCC Tallennuspäivä 2H6 R(+) HB 9969 Tammikuu 13, 1989 21H3 S(-) HB 9970 Tammikuu 13, 1989 10 1F5 R (+) ND* ND* 9C7 S(-) ND* ND* 18E9 R(+) ND* ND* 11D9 R(+) ND* ND* 20C10 R(+) ND* ND* 15 26D3 E ( +) ND* ND* * ND = ei tallennettu.
Nämä tallennukset tehtiin Budapestin sopimuksen vaatimus-20 ten mukaan niin, että tallennusten kesto olisi 30 vuotta tallennuspäivästä tai 5 vuotta säilytyspaikassa olevan tallennuksen viimeisen kysynnän jälkeen tai U.S. patentin pakollinen elinikä, joka kypsyy tästä hakemuksesta, mikä tahansa on pisin. Hybridomat täydennetään, jos niistä tulee 25 ei-elinkelpoisia tallennuksessa.
Monoklonaalisen reseptorin Fab-fragmentti valmistettiin puhdistetusta reseptorista käyttämällä esipilkottua papii-nia 0,1 M natriumasetaattipuskurissa, pH-arvossa 5,5, 30 37’C:ssa, jonka jälkeen seurasi reaktio jodiasetamidilla.
Fab-fragmenttia puhdistetaan tyypillisesti lisää anionin-; vaihtokromatografiällä, dialyysillä ja DEAE-anioninvaihto- kromatografiällä ja sen homogeenisyys päätellään geelie-lektroforeesilla.
35
Analogi-ligandin sitominen indusoidulla monoklonaalisella reseptorimolekyylillä analysoitiin ELISA:11a vasta-aineella 95928 _ ... τζ 48 sidotulla konsentraatiolla sen tiitterin alueella ja muuttuvalla inhibiittori- (vapaa yhdiste F) konsentraatiolla. yhdisteen F käyttö inhibiittorina auttaa varmistamaan, että havaittu sitomis-vuorovaikutus on antigeeni-spesifinen.
5
Analyysit suoritettiin litteäpohjäisillä polyvinyylimikro-tiitterimaljoilla (Dynatech, Alexandria, VA). Kaivot peitettiin tyypillisesti liuoksella, jossa oli yhdistettä F sitoutuneena BSA:han, kuten antigeeniligandi fosfaattipus-10 kuroidussa suolaliuoksessa (PBS) käyttämällä 50 μΐ liuosta maljaa kohti. BSA:ta käytettiin kantajana sitomaan hapteeni soluseinään ja analogi-ligandi/BSA-konjugaattia käytettiin immunisoivan KLHrta sisältävän sijasta seulomaan pois mahdolliset anti-KLH-vasta-aineet.
15
Sidotut ligandit peitettiin 1 pg/ml. Sitten maljoja inku-boitiin yön yli 37’C:ssa kuivassa uunissa. Kuivatut maljat säilytettiin 4'C:ssa, kunnes käytettiin. Ennen ELISA-analyy-siä maljat rehydrattiin kahdella 2 minuutin pesulla, jokai-20 nen 10 mM PBS, pH 7,4, jossa oli 0,1 % polyoksialkyleeni- (20) sorbitaanimonolauraattia (Tween 29) ja 0,02 % Thimero-salia (natriumetyylielohopeatiosalisylaatti), (Sigma, St. Louis, MO).
25 Jotta vähennettäisiin ei-spesifistä sitoutumista, hybrido-( . ma-supernatantit laimennettiin 1:2 pesupuskuriin, jossa oli 0,1 % BSArta laimentimena. Jokaiseen kaivoon lisättiin sen jälkeen 50 μΐ laimennettuja hybridoma-supernatantteja ja inkuboitiin 1 h 4‘C:ssa gyroravistelijassa, jotta saataisiin 30 monoklonaalista vasta-ainetta sisältävä supernatantti kosketuksiin sidotun yhdisteen F kanssa. Kahden, jokainen 2 ; min, pesun jälkeen lisättiin jokaiseen kaivoon 50 μΐ perok- sidaasi-leimattua vuohen anti-hiiri IgG + IgM (Tago, Bur-linngame, CA), laimennettu 1:1000 ja reaktioseosta inkuboi-35 tiin 4‘C:ssa 1 h, jotta leimattu vasta-aine sitoutuu mono-klonaaliseen vasta-aineeseen.
49 95928
Substraatti, jota käytettiin analysoimaan sidottu peroksi-daasiaktiivisuus, valmistettiin juuri ennen käyttöä ja koostui 400 pg/ml o-fenyleenidiamiinia (Sigma, St. Louis, MO) 80 mM sitraattifosfaattipuskurissa, pH 6,0, jossa oli 5 0,12 % H,02. Kahden lopullisen pesun jälkeen lisättiin jo kaiseen kaivoon 50 μΐ substraattiliuosta ja värin annettiin kehittyä 15 min pimeässä. Värin kehitys lopetettiin lisäämällä 25 μΐ 4 M H}SO,:ää jokaiseen kaivoon ja optinen tiheys 492nm:ssä mitattiin Multiskan ELISA-maljalukijalla.
10
Reseptorimolekyylien toista valmistamista varten voidaan geeni, joka koodaa vasta-ainetta liittävää kohtaa muodostavaa fragmenttia, saada mistä tahansa solusta, joka tuottaa vasta-ainemolekyylin, joka immunoreagoi, kuten tässä on 15 keskusteltu. Edullinen solu on hybridomasolu.
Esimerkkejä yleisistä rekombinantti-DNA-kloonaustekniikois-ta katso Molecular Cloning, Maniatis et ai., Cold Spring Harbor Lab., N.Y., 1982; DNA Cloning, Glover, ed., IRL 20 Press, McLean VA (1985). Immunoglobuliinigeenien genomista kloonausta ja ilmenemistä lymfasoluissa, katso Neuberger et ai., Nature, 312:604-8 (1984); Ochi et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:6351-55 (1977); ja Oi et ai., Proc.
Natl. Acad. Sei. USA, 80:825-29 (1983). Immunoglobuliini-25 geenien kloonaamiseksi hybridomasoluista ja ilmentämiseksi \ Xenopus-varhaismunasoluissa, katso Roberts et ai., protein
Engineering, 1:59-65 (1986) ja katso Wood et ai. ilmeneminen hiivassa. Nature, 314:446-9 (1985).
30 Edellä ollut on tarkoitettu valaisemaan tätä keksintöä eikä rajoittamaan. Lukuisia muita muunnelmia ja modifikaatioita voidaan toteuttaa luopumatta tämän keksinnön todellisesta hengestä ja alasta.
35
Claims (3)
1. Reseptorimolekyyli, tunnettu siitä, että siinä on vasta-aineen liittävä kohta, joka kykenee katalyyttisesti hydrolysoimaan edeltä valitun, reaktantti-ligandin yhden 5 stereoisomeerin halkaistavan karboksyylihappoamidin tai esterin sidoksen, ja siitä, että reseptorin erittää hybri-dooma 2H6, jonka ATCC-talletusnumero on HB 9969 tai hybri-dooma 21H3, jonka ATCC-talletusnumero on HB 9970.
2. Hybridooma, tunnettu siitä, että se erittää mono- klonaalista reseptorimolekyyliä, jossa on vasta-aineen liittävä kohta, joka kykenee katalyyttisesti hydrolysoimaan edeltä valitun, reaktantti-ligandin yhden stereoisomeerin halkaistavan karboksyylihappoamidin tai esterin 15 sidoksen, ja että hybridooman ATCC-talletusnumero on HB 9969 tai HB 9970.
3. Menetelmä, jolla katalysoidaan yhden parin stereoiso-meeristen karboksyylihappoamidi- tai esterimolekyylien '· 20 hydrolyysireaktiota, tunnettu siitä, että se käsittää seu- raavat vaiheet: sekoitetaan katalyyttisesti tehokas määrä reseptorimole-kyylejä, jotka on erittänyt hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 9969 tai HB 9970, stereoisomeeristen reak-25 tantti-ligandimolekyylien kanssa vesipitoisessa alustassa * seoksen muodostamiseksi, ja pidetään seosta riittävä ajanjakso mainitun reaktantti-ligandimolekyylien sitoutua mainittuihin reseptorimolekyy-leihin ja mainittujen reseptorimolekyylien hydrolysoida 30 mainittu edeltä valittu halkaistava sidos. Il 51 95928
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US29779889A | 1989-01-17 | 1989-01-17 | |
US29779889 | 1989-01-17 | ||
US9000269 | 1990-01-12 | ||
PCT/US1990/000269 WO1990008185A1 (en) | 1989-01-17 | 1990-01-12 | Molecules with antibody combining sites that exhibit stereospecific catalysis |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI913427A0 FI913427A0 (fi) | 1991-07-16 |
FI95928B true FI95928B (fi) | 1995-12-29 |
FI95928C FI95928C (fi) | 1996-04-10 |
Family
ID=23147792
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI913427A FI95928C (fi) | 1989-01-17 | 1991-07-16 | Molekyylit, joissa on vasta-ainetta liittävät kohdat ja joilla on stereospesifinen katalyysi |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0454778A4 (fi) |
JP (1) | JPH04502708A (fi) |
KR (1) | KR910700334A (fi) |
AU (1) | AU650846B2 (fi) |
CA (1) | CA2007816A1 (fi) |
FI (1) | FI95928C (fi) |
GR (1) | GR900100025A (fi) |
IE (1) | IE63274B1 (fi) |
PT (1) | PT92884B (fi) |
WO (1) | WO1990008185A1 (fi) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5229272A (en) * | 1989-04-25 | 1993-07-20 | Igen, Inc. | Catalytic antibody components |
US5236825A (en) * | 1989-01-17 | 1993-08-17 | Scripps Clinic And Research Foundation | Polyvalent metal ion-containing antibody combining site catalysts |
KR20100054884A (ko) * | 2001-10-22 | 2010-05-25 | 더 스크립스 리서치 인스티튜트 | 항체 표적화 화합물 |
CN110950960B (zh) * | 2019-11-26 | 2021-05-14 | 中国农业大学 | 基于高通量测序和杂合杂交瘤技术的小分子化合物抗体的制备方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4659567A (en) * | 1984-09-07 | 1987-04-21 | Scripps Clinic & Research Foundation | Molecules with antibody combining sites that bind to hydrolytic transition states |
US4792446A (en) * | 1986-06-23 | 1988-12-20 | Igen, Inc. | Production of antibody catalysts |
US4963355A (en) * | 1986-06-23 | 1990-10-16 | Igen, Inc. | Production of antibody catalysts |
US5079152A (en) * | 1987-05-28 | 1992-01-07 | Scripps Clinic And Research Foundation | Antibody combining sites that exhibit stereoselective synthase activity, and methods using the same |
-
1990
- 1990-01-12 JP JP2503094A patent/JPH04502708A/ja active Pending
- 1990-01-12 EP EP19900902870 patent/EP0454778A4/en not_active Withdrawn
- 1990-01-12 WO PCT/US1990/000269 patent/WO1990008185A1/en not_active Application Discontinuation
- 1990-01-12 AU AU50382/90A patent/AU650846B2/en not_active Ceased
- 1990-01-12 KR KR1019900702060A patent/KR910700334A/ko not_active Application Discontinuation
- 1990-01-16 IE IE17490A patent/IE63274B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-01-16 CA CA002007816A patent/CA2007816A1/en not_active Abandoned
- 1990-01-17 GR GR900100025A patent/GR900100025A/el unknown
- 1990-01-17 PT PT92884A patent/PT92884B/pt not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-07-16 FI FI913427A patent/FI95928C/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI95928C (fi) | 1996-04-10 |
FI913427A0 (fi) | 1991-07-16 |
PT92884A (pt) | 1990-07-31 |
EP0454778A4 (en) | 1993-10-06 |
EP0454778A1 (en) | 1991-11-06 |
PT92884B (pt) | 1995-12-29 |
IE900174L (en) | 1990-07-17 |
IE63274B1 (en) | 1995-04-05 |
KR910700334A (ko) | 1991-03-14 |
WO1990008185A1 (en) | 1990-07-26 |
AU650846B2 (en) | 1994-07-07 |
JPH04502708A (ja) | 1992-05-21 |
AU5038290A (en) | 1990-08-13 |
GR900100025A (el) | 1991-06-07 |
CA2007816A1 (en) | 1990-07-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4659567A (en) | Molecules with antibody combining sites that bind to hydrolytic transition states | |
FI94026B (fi) | Monoklonaalisia vasta-ainemolekyylejä, joilla on katalyyttisiä ominaisuuksia omaavia vasta-aineen sitovia kohtia | |
US4900674A (en) | Antibody combining sites that exhibit amide or ester synthase activity | |
US5079152A (en) | Antibody combining sites that exhibit stereoselective synthase activity, and methods using the same | |
FI108437B (fi) | Molekyylit, jotka sisõltõvõt vasta-aineenyhdistõmiskohtaosia, jotka katalysoivat hydrolyysireaktioita | |
EP0642507B1 (en) | Transition state analogues of cocaine, their use for producing catalytic antibodies against cocaine and use of the same in diagnosis and therapy | |
FI95928B (fi) | Molekyylit, joissa on vasta-ainetta liittävät kohdat ja joilla on stereospesifinen katalyysi | |
US5248611A (en) | Stereoisomer separation method using antibody combing site-containing molecules | |
US5444155A (en) | Molecules with antibody combining sites that induce asymmetry | |
US5250426A (en) | Molecules with antibody combining sites that induce asymmetry |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
BB | Publication of examined application | ||
MM | Patent lapsed |