FI95928B - Molekyylit, joissa on vasta-ainetta liittävät kohdat ja joilla on stereospesifinen katalyysi - Google Patents

Description

. 95928

Molekyylit, joissa on vasta-ainetta liittävät kohdat ja joilla on stereospesifinen katalyysi - Molekyler med anti-kropp förenande ställen vilka uppvisar stereospecifik katalys 5 Tämä hakemus on osajatkoa yhteisesti haetulle hakemukselle sarjanr. 083681, jätetty elokuun 7. 1987, mikä on osajatkoa yhteisesti heatulle hakemukselle sarjanr. 055177, jätetty toukuun 28. 1987, mitkä esitykset on liitetty tähän viit-10 teeksi.

Tämä keksintö koskee vasta-aineita, antigeenejä ja immuno-geenejä ja tarkemmin molekyylejä, joissa on vasta-aineen liittävä kohta, joka sitoutuu stereospesifisesti ja stabi-15 loi amidin tetraedrisen hiiliatomin tai esterin hydrolyysin siirtymätilan ja katalysoi stereoselektiivisesti sellaisten sidosten hydrolyysin.

Sitoutumisilmiöllä ligandien ja reseptorien välillä on rat-20 kaiseva osuus biologissa systeemeissä. Tyypillisiä sellaisia ilmiöitä ovat happimolekyylien sitoutuminen deoksihemo-globiiniin oksihemoglobiinin muodostamiseksi ja substraatin sitoutuminen entsyymiin, joka vaikuttaa siihen, kuten proteiinin ja proteaasin kaltaisen trypsiinin välillä. Vielä 25 muita esimerkkejä biologisesta sitoutumisilmiöstä on anti-* - geenin sitoutuminen vasta-aineeseen ja täydellisen kompo nentti C3:n sitoutuminen niin kutsuttuun CRl-reseptoriin.

Monien lääkkeiden ja terapeuttisten aineiden uskotaan ole-30 van riippuvaisia sitoutumisilmiöstä. Esimerkiksi oopiumi- lääkkeiden, kuten morfiini, on raportoitu sitoutuvan spesi-*. fisiin reseptoreihin aivoissa. Opiumagonistien ja antago nistien on raportoitu kilpailevan lääkkeiden, kuten morfiinin, kanssa noista liittävistä kohdista.

Ligandit, kuten ihmisen tekemät lääkkeet, kuten morfiini ja sen johdannaiset ja sellaiset, joita on luonnostaan biolo- 35 - 95928 2 gisissa systeemeissä, kuten endofiinit ja hormonit, sitoutuvat reseptoreihin, joita on luonnostaan biologissa systeemeissä ja niitä käsitellään tässä yhdessä. Sellainen sitoutuminen saattaa johtaa lukuisiin ilmiöihin biologiassa, 5 erityisesti amidi- ja esterisidosten hydrolyysi, milloin proteiinit hydrolysoidaan polypeptidin ainesosiin entsyymin, kuten trypsiini tai papaiini, toimesta tai missä rasva pilkotaan glyseriiniksi ja kolmeksi karboksyylihapoksi, vastaavasti.

10

Slobin, Biochemistry, 5:2836-2844 (1966), raportoi valmistaneensa vasta-aineita naudan seerumin albumiinin p-nitro-karboksibensoksikonjugaatille. Noita vasta-aineita käytettiin sen jälkeen hydrolysoimaan p-nitrofenyyliasetaattia ja 15 epsilonaminokaproaattiestereitä. Asetaattiesterireaktio kuvattiin toisen kertaluvun nopeusvakiolla ja sanottiin olevan ei-spesifinen. Toisen kertaluvun nopeusvakion, joka saatiin käyttämällä normaalia gammaglobuliinia, sanottiin olevan melkein yhtäläinen spesifisesti valmistettujen vas-20 ta-aineiden nopeusvakion kanssa. Spesifisesti valmistettujen vasta-aineiden läsnäolon sanottiin inhiboivan aminokap-roaattiesterin hydrolyysiä.

Kohnen ja avustajat raportoivat myös yrityksistä käyttää 25 vasta-aineita katalysoimaan esterolyysiä. Tämän ryhmän : käyttämät vasta-aineet muodostuivat joka tapauksessa viime kädessä käytettyä substraattimolekyyliannosta, jossa ei ollut hydrolysoitavaa sidosta, vastaan.

30 Heidän ensimmäisessä työssään [FEBS Letters, 100:137-140 (1979) ja Biochim. Biophys. Acta, 629:328-337 (1980) käytettiin anti-steroidi vasta-aineita hydrolysoimaan steroidin karboksietyylitioeetterin 7-umbelliferoniestereitä (7-hydroksikumeriini). Jokaisessa tapauksessa havaittiin kas-35 vua hydrolyyttisessä nopeudessa verrattuna taustaan tai nopeuteen, joka saatiin normaalilla IgG:llä. Molemmissa tapauksissa olivat katalyysinopeudet alhaisia (noin yksi moo- li 3 95928 li substraattia moolia kohti vasta-ainetta minuutissa tai vähemmän) ja reaktionopeudet vähenivät ajan mukana saavuttaen tason vasta-aineen kyllästymisen kanssa. Tämä nopeuden hidastuminen luettiin johtuvaksi steroidihappotuotteen ir-5 reversiibelistä sitoutumisesta vasta-aineeseen.

Kohen et ai. raportoivat myös 7-[-N-(2,4-dinitrofenyyli)- 6-aminoheksanoyyli]-kumeriinin hydrolyyseistä käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka olivat substraattimo-10 lekyylin dinitrofenyyliosia vastaan [FEBS Letters, 111:427-431 (1980)]. Tässä raportoitiin myös nopeuden kasvusta yli taustan, mutta reaktion sanottiin olevan stokiometrinen mieluummin kuin katalyyttinen. Laskua nopeudessa, joka lähestyi nollaa, raportoitiin kun vasta-aineen kyllästyminen 15 saavutettiin. Jälleen lasku luettiin johtuvaksi tuoteinhi-biitiosta, jonka aiheutti tuotehapon sitoutuminen vasta-aineeseen, koska jonkin verran alkuperäisestä hydrolyysiak-tiivisuudesta voitiin regeneroida kromatografoimalla vasta-aine-substraatti-tuote-seos.

20

Kun kohdistetaan vahva vasta-aineen sitoutuminen substraat-timolekyylien stabiileihin tiloihin, kompleksin dissosiaa-tion hidas nopeus ehkäisee katalyysiä. Tilanteen on ajateltu olevan sellainen Kohnen ja avustajien raportoimille tu-25 loksille.

«

Edellä olleita rakenteita, vaikkakin mielenkiintoisia, rajoittaa äärimmäisesti kykenemättömyys kohdistaa sitoutumis-energian käytön mekanismia, mikä on olennaista entsyymeil-30 le [W.P. Jencks, Adv. Enzymol., 43, 219 (1975)].

Nuo puutteet voidaan korjata käyttämällä siirtymätila-analogia, kuten hapteenia, saamaan esiin halutut vasta-aineet. Tämä hapteeni (viitataan tässä myös "analogi-ligandina") 35 voi ottaa inhibiittorin osan katalyyttisessä systeemissä.

Täten immunologista sitoutumista voidaan käyttää kokeelli- 4 95928 sesti suuntaamaan sitoutumisvuorovaikutukset katalyyttisiin prosesseihin. Esimerkiksi on ehdotettu, että vasta-aineen käytön hapteeniryhmälle, joka muistuttaa annetun reaktion siirtymätilaa, pitäisi aiheuttaa kiihtymistä substraattire-5 aktiossa pakottamalla substraatit muistuttamaan siirtymätilaa. Jencks, W.P., Catalytic in Chemistry and Enzymology, sivu 288 (McGraw-Hill, New York 1969). Huolimatta selvästä ehdotuksesta, spesifisiä siirtymätilan hapteeneita ei ehdotettu eikä spesifisiä reaktioita ehdotettu, joissa käsitys-10 tä saatettaisiin testata.

Amidi-ja esterisidosten hydrolyysin on ajateltu nykyisin hyväksyttävän kemiallisen teorian mukaan etenevän vesipitoisissa alustoissa reaktiolla muodostakseen karbonyylin 15 hiiliatomiin siirtymätilan, jossa on tetraedrinen hiiliatomi sitoutuneena (a) amidin tai esterin happo-osan hiiliatomiin, (b) kahteen happiatomiin, toisen ollessa karbonyyli-ryhmästä ja toisen hydroksyyli-ionista tai alustan vesimo-lekyylistä ja (c) esterin alkoholiosan happiatomiin tai a-20 midin amiiniosan typpiatomiin. Sellaisten reaktioiden siirtymätilat ovat hyödyllisiä älyllisiä rakenteita, joita ei voida kuvauksen perusteella eristää, kun verrataan välituotteisiin, joita voidaan eristää.

25 Vaikka edellä olleita hydrolyyttisiä siirtymätiloja ei voida eristää, on aiheelle pyhitetty runsaasti tieteellistä kirjallisuutta. Jostakin tästä kirjallisuudesta keskustellaan tämän jälkeen.

30 Kun taas edellä kuvatun amidin ja esterin hydrolyysin siirtymätilan uskotaan olevan hyvin ymmärretty, topologian pa-• rametrit, esim. reseptorin liittävien kohtien koko, muoto ja varaus, joissa tietyt amidit, kuten proteiinit tai esterit, kuten rasvat, reagoivat noiden siirtymätilojen kaut-35 ta, ei ole yhtä hyvin ymmärrettyä. Olisi sen vuoksi edullista, jos lukuisten sitovien kohtien topologia olisi tunnettua, niin että sellaisten ligandien, jotka sitovat nois- 5 95928 sa kohdissa, vuorovaikutuksia voitaisiin tutkia. Valitettavasti reseptoria sitovien kohtien topologia on yleisesti tuntematonta biologisissa hydrolyyseissa, paitsi suhteellisen harvoille entsyymeille, joiden röntgensädekristalli-5 rakenteet on määritetty.

Tämä tiedon puute sitovan kohdan topologiasta on peräisin osittain jopa monien reseptoria sitovien kohtien sijainnin puutteesta soluissa. Lisäksi sellaisille reseptoria sito-10 ville kohdille, joiden sijainti tunnetaan, sitovan kohdan kemiallinen identiteetti; s.o. proteiini- ja hiilihydraat-tikoostumus, on yleisesti tuntematonta. Täten tutkija on yleisesti hankalassa tilanteessa etsiessään ymmärtämystä reseptorin sitomiskohtien topologisissa vaatimuksissa ja 15 siksi tavoitellessaan rakentaa terapeuttisia aineita, jotka voivat täyttää nuo vaatimukset.

Keksijöiden täytyy siksi seuloa mahdolliset terapeuttiset aineet eläin- tai soluviljelmätutkimuksissa varmistaakseen, 20 voiko mahdollinen potentiaalinen aine olla hyödyllinen.

Sellaiset systeemit, koska hyödyllisiä, ovat kalliita ja aikaa kuluttavia käyttää.

Jopa milloin hydrolyyttisen reseptorin, kuten entsyymi, to-25 pologia ja reaktiivisyys tunnetaan, entsyymit kuten prote-aasit pilkkovat tyypillisesti substraattinsa, polypeptidi-ketjut, tietyn aminohappojäännöksen vieressä, joka voi e-siintyä useita kertoja proteiinin polypeptidiketjussa.

Koska sellainen suhteellinen satunnainen pilkkominen voi 30 olla hyödyllistä saataessa proteiinin polypeptidikartta, tuo suhteellinen satunnainen pilkkominen ei ole yhtä hyö-: dyllinen, missä toivotaan tiettyjä aminohappojäännössek- venssejä tuotettavaksi.

35 Esimerkiksi modernit geneettisen manipulaation tekniikat ovat olleet hyödyllisiä valmistettaessa fuusioproteiineja, joissa on haluttu proteiini tai polypeptidi fuusioituneena 6 95928 vektorigeenin, kuten lac z-geeni, transkriptiotuotteeseen. Sellaisen fuusioproteiinin käyttöä estää kuitenkin vektori-geeni tuotteen fragmenttien läsnäolo. Olisi myös siksi edullista, jos voitaisiin kehittää proteolyyttisiä entsyymin 5 kaltaisia molekyylejä, jotka pilkkosivat sellaisia fuusio-tuotteita halutun ja ei-halutun fuusio-polypeptidin tai -proteiinin osien välillä.

Äskettäin Lerner, Tramontano ja Janda [Science, 234, 1566 10 (1986)] raportoivat monoklonaalisistä vasta-aineista, jotka hydrolysoivat esterin katalyyttisesti. Tramontano ja Lerner kuvaavat myös estereiden hydrolyysin käyttämällä monoklo-naalisia vasta-aineita U.S. patentissa nr. 4659567. Pollack, Jacobs ja Schultz [Science, 234, 1570 (1986)] rapor-15 toivat myeloomaproteiinista, joka on nimitetty MOPC167:ksi [Leon et ai., Biochem., 10, 1424 (1971)], joka katalysoi karbonaatin hydrolyysin.

Kahdessa Lerner ja Tramontano esityksessä saatiin vasta-20 aineita fosfonaattia vastaan, joka syntetisoitiin edustamaan karboksyylihappoesterin tai karbonaattiesterin tetra-edrisen hydrolyyttisen siirtymätilan stabiilia analogia. Pollack et ai. vasta-aine, josta periaatteessa keskusteltiin, oli myeloomaproteiini, joka sattui sitoutumaan fosfo-25 naattiin, joka oli rakenteellisesti analoginen hydrolysoidun karbonaattianalogin kanssa. Täten Lerner ja Tramontano et ai. työssä hydrolysoitava substraatti valittiin edeltä immunisoitavan analogin ja hydrolyyttisten vasta-aineiden ollessa syntetisoidut halutun tuotteen mukaisesti. Pollack 30 et ai. suunnittelivat hydrolysoitavan substraatin, kun he kerran tiesivät myeloomaproteiinin spesifisyyden. Pollack et ai. raportoivat myös (edellä) katalyyttisen vasta-aineen olemassaolosta, pohjautuen tosiasioihin ja analogisubst-raattisysteemi karbonaattihydrolyysille, joka on samankal-35 täinen käsitteenä Lerner et ai. systeemin kanssa. Työstä, joka viittaa tähän systeemiin, on raportoitu Jacobs et ai., J. Am. Chem. Soc., 109, 2174 (1987).

95928 7

Julkaistu patenttihakemus WO 85/02414 keskustelee vasta-aineiden mahdollisesta käytöstä katalyyttinä ja esittää tietoja koskien polyklonaaliseerumin käyttöä hydrolysoimaan 5 o-nitrofenyyli-beta-D-galaktosidiä. Vasta-aineiden, jotka ovat hyödyllisiä tuossa hakemuksessa, sanotaan olevan indusoituvia reaktantin, reaktion välituotteen tai reaktan-tin, tuotteen tai reaktiovälituotteen analogin toimesta. Termi "analogi" on siinä kuvattu käsittävän isomeerit, 10 homologit tai muut yhdisteet, jotka muistuttavat riittävästi reaktanttia kemiallisen rakenteen nimissä, että vasta-aine, joka on analogia vastaan, voi ottaa osaa immunologiseen reaktioon reaktantin kanssa, mutta ei välttämättä katalysoi analogin reaktiota.

15

Tuossa yksityiskohtaisessa selityksessä annetut tiedot vain osoittavat, että tapahtui jonkin verran substraatin (reaktantin) galaktosidin pilkkomista yli 18 h aikajaksolla käyttämällä suhteellisen konsentroitua vasta-ainevalmistet-20 ta (1:10 ja 1:20 laimennukset). Vaikka väitettiin katalyysin tapahtuvan, katalyyttistä aktiivisuutta ei osoitettu, koska väitetyn katalyyttisen vasta-aineen katalyysinopeutta ei osoitettu eikä ollut osoitusta substraatti galaktosidin pilkkomisen prosenttiosuudesta. Hakemus ei osoittanut, että 25 beta-D-galaktosidaasi pilkkoi noin 10 kertaa yhtä paljon : substraattia kuin tekivät polyklonaaliset vasta-aineet, o- lettaen absorbanssin lineaarisuutta tutkitun substraatin nimeämättömässä pitoisuudessa.

30 Tuossa hakemuksessa esitetyistä tiedoista on mahdollista, että tapahtui o-nitrofenyyliryhmän nukleofiilinen korvautuminen käytetyn vasta-aineen lysiinijäännöksen terminaalisella aminoryhmällä. Täten havaittu absorbanssi olisi voinut johtua epsilonaminolysinyyli-o-nitrofenyylianiliinin 35 muodostuksesta tai epsilonaminolysinyyligalaktosidin ja o-nitrofenolin muodostumisesta, joista kumpikaan tapahtuma ei olisi katalyyttinen, koska vasta-aine kulutettiin mieluum- 8 95928 min kuin muunnettiin.

Eräässä vielä äskettäisemmässä työssä on esitetty vasta-ainemolekyylien katalysoima bimolekulaarinen amidin muodos-5 tus [Benkovic et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:5355 (1981)], kuten on esitetty vasta-aineen katalysoima Claisen uudelleenjärjestäytyminen [Jackson et ai., J. Am. Chem.

Soc., 110:4841 (1988)]. Mikään töistä, samoin kuin ei mikään aikaisemmin keskusteltu työ, ole tutkiskellut vasta-10 aineiden käyttöä katalysoimaan mitä tahansa reaktiota ste-reospesifisellä tavalla.

Vasta-aineen katalysoimassa laktonin muodostusreaktiossa o-soitettiin stereospesifisyyttä [Napper et ai., Science, 15 237:1041 (1987)] ja vasta-aineen katalysoimassa Claisen re aktiossa [Hilvert et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85: 4953 (1988)]. Vasta-aineen liittävän kohdan sisältävän molekyylin käyttöä katalysoimaan stereospesifisesti hydrolyy-sireaktio, kuten tämän jälkeen kuvataan, ei kuitenkaan tut-20 kittu kummassakaan edellä olleissa julkaisuissa.

Tämä keksintö tarkastelee reseptorimolekyyliä, jossa on vasta-aineen liittävä kohta tai idiotyypin sisältävää polyamidia, joka kykenee katalyyttisesti hydrolysoimaan e-25 deltä valitun, reaktantti-ligandin yhden stereoisomeerin halkaistavan karboksyylihappoamidin tai esterin sidoksen eikä toisen stereoisomeerin. Tuo vasta-ainetta liittävä kohta sitoutuu (immunoreagoi): (a) reaktantti-ligandin, jossa on tuo edeltä valittu halkaistava karboksyylihappoa-30 midi- tai esterisidos, yhden stereoisomeerin kanssa ja (b) analogi-ligandin yhden stereoisomeerin kanssa, joka on • stereokemiallisesti analoginen reaktantti-ligandin kanssa ja jossa on tetraedrisesti sitoutunut fosforiatomi asemaan, joka on analoginen reaktantti-ligandin edeltä valitun kar-35 boksyylihappoamidi- tai esterisidoksen halkaistavan karbo-nyylihiilen kanssa. Siten sidotun reaktantti-ligandin hyd-rolyyttisessä siirtymätilassa on tetraedrinen hiiliatomi

II

• 95928 9 sitoutuneena (i) hiiliatomiin, esterin tai amidin happaman osan alfa-hiileen, (ii) kahteen happiatomiin ja (iii) esterin happiatomiin tai amidin typpiatomiin.

5 Molekyylejä, joissa on vasta-ainetta liittävä kohta, joka on muodostunut vasteena reaktantti-ligandin hydrolyyttistä siirtymätilaa vastaan, muodostuvat vasteena tai indusoituvat immunisoitaessa analogi-ligandimolekyylin (edullisesti sitoutunut proteiinikantajaan muodostaakseen konjugaatin) 10 yhdellä stereoisomeerillä, jossa on ligandin hydrolyyttisen siirtymätilan analogi. Analogi-ligandin hydrolyyttisen siirtymätilan molekyylin immunisoivalla stereoisomeerillä on tetraedrisesti sitoutunut fosforiatomi, sitoutunut suoraan (i) analogisen ligandin amidin tai esterin happaman 15 osan hiiliatimiin, (happaman osan alfa-hiili), (ii) kahteen happiatomiin, (iii) kolmanteen happiatomiin tai typpiatomiin, kolmannen happiatomin tai typpiatomin ollessa sitoutunut ligandin analogisen esterin tai amidin alfa-hiiliatomiin .

20

Happaman osan alfa-hiiliatomi (i) edellä, sitoutunut suoraan analogi-ligandin teraedriseen keskusfosforiatomiin, kuuluu ketjuun, jossa on ainakin 5 atomia ja edullisemmin ainakin 15 atomia ja edullisesti ainakin 15 atomia substi-25 tuoitu fenyyliryhmä mukaanluettuna, kuten on kolmas happi-, tai typpiatomi, (iii) edellä. Kahdesta happiatomista (ii) edellä, sitoutunut suoraan keskusatomiin, yksi happiatomi (a) on sitoutunut kahdesti (kaksoissidos) oksoryhmään kes-kusatomissa, (b) on osa hydroksyyliryhmästä tai (c) on al-30 koksiryhmän, jossa on C^-C, alempi alkyyliryhmä, happi.

Toinen noista happiatomeista, joka on sitoutunut keskusato-* miin, on sitoutunut yksinään keskusatomiin ja on -OR,- ryhmä, missä R, on valittu ryhmästä, joka koostuu vedystä (H) ja Cl-C< alemmasta alkyylistä. Neljäs atomi, (iii) e-35 dellä, sitoutunut analogi-ligandimolekyylin keskusatomiin, on esterin alkoholin happiatomi tai ligandin analogisen esterin tai amidiosan amidin aminityppiatomi (imino). Tuo - 95928

------ I

10 neljäs atomi on osa ketjusta, jossa on ainakin 5, edullisemmin ainakin 15 atomia ja loppu ketjusta koostuu R,:sta.

On painotettu, että sekä reaktantti-ligandi että analogi-5 ligandi sisältävät ainakin yhden hiiliatomin, joka voi olla kahdessa stereoisomeerisessä muodossa ja täten antaa stere-oisomeerisen keskuksen. Tuo stereoisomeerinen keskus sijaitsee jokaisessa ligandi- ja analogi-ligandimolekyylissä samassa suhteellisessa asemassa jokaisessa molekyylissä.

10 Stereoisomeerinen keskus sijaitsee myös tarpeeksi lähellä sidosta, joka on tarkoitus hydrolysoida niin, että katalyyttisen vasta-aineen liittävän kohdan sisältävä molekyyli sitoo stereoisomeerisen keskuksen.

15 Tetraedrisesti sidottu keskusatomi on fosfori niin, että a-nalogi-ligandi on orgaaninen fosforiyhdiste, jolla on subs-tituentit järjestyneet fosforin, joka vastaa tetraedristä hiilen siirtymätilaa, ympärille. Fosfonaatti- tai fosfona-midaatti monohappo sen ionisoidussa muodossaan simuloi myös 20 kehittyvää varausta nukleofiilisessä hyökkäyksessä karbo-nyylikeskukseen.

Lisäksi on kuvattu entsymaattisen peptidihydrolyysin fos-fonamidaatti- ja fosforamidaatti-inhibiittorit siirtymäti-25 laa jäljittelevinä. Galardy et ai., Biochemistry, 22, 1990 : ((1983); Bartlett et ai., Biochemistry, 22, 4618 (9183);

Thorsett et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, 2176 (1982); Jacobsen et ai., J. Am. Chem. Soc., 103, 654 (1981); Kam et ai., Biochemistry, 18, 3032 (1979) ja Weaver 30 et ai., J. Mol. Biol., 114, 119 (1977). 1 Tässä kuvatuissa tutkimuksissa toimivat fosfonaattiesterit ja fosfonamidaattiamidit siirtymätila-analogeina tuottamaan vasta-aineita, jotka ovat monoklonaalisia ja jotka ovat 35 stereospesifisiä karboksyyliesteraaseja ja -amidaaseja. Itse asiassa nämä vasta-aineet osoittavat niiden synnynnäisen sitomisenergian toiminnallisesti, kuten todelliset entsyy- • 95928 11 mit, katalyyttisesti hydrolysoiden esterit ja amidit ja klassillisesti, kuten vasta-aineet, sitoutuvat antigee-neihin.

5 Tyypillisiä immunisoivia analogi-ligandimolekyylejä, joissa on hydrolyyttisen siirtymätilan analogi, esitetään kaavalla : /? R, - P - XR.

10 k missä, X = 0 tai NH;

Rt = CH;-^ ^-NHCOR, missä R4 = (CHj),C02R, 0

. -N

ja R, = H tai Nv I

20 tr

O

R; = H tai C(-C4 alempi alkyyli; ja 25 R,- = ί. Λ—CH-

... \_r V

missä aaltoviiva osoittaa sekä stereokemiallisia isomeerejä; että 30 n on kokonaisluku 1-8, mukaanluettuina.

Analogi-ligandi hydrolyyttiset siirtymätilamolekyylit ovat itsessään ligandeja, vaikkakaan eivät reaktiivisiä ligande-ja niitä tarkastellaan myös tässä keksinnössä. Näillä 35 ligandimolekyyleillä on suhteellisen pieni molekyylikoko ja ovat siksi tyypillisesti liittyneet suureksi, kantajamole-kyyliksi, kun käytetään immunogeeneinä indusoimaan resep- 12 95928 torimolekyylien tuottoa tai käytetään yksin inhibiittorimo-lekyyleinä. Sellaisiin suhteellisen pieniin molekyyleihin viitataan yleisesti hapteeneina. Näillä analogi-ligandimo-lekyyleillä on myös tyypillisesti liittävä atomi tai ryhmä, 5 kuten reaktiivinen merkaptaani, sukkinimidi tai muu ryhmä, joka antaa keinot kiinnittää hapteeniset analogi-ligandimo-lekyylit kantajiin käytettäviksi immunogeeneinä.

Tyypillisiä reaktantti-ligandimolekyylejä, jotka vastaavat 10 rakenteellisesti edellä olleita analogi-ligandimolekyylejä, edustaa kaava:

O

Rt - C - XR, missä X, Rl ja R, ovat kuten edellä on kuvattu.

15 Tämän keksinnön vasta-aineen liittävän kohdan sisältävät molekyylit ovat itsessään reseptoreja ja antavat tietoa vasta-aine-hapteeni vuorovaikutusten konformationaalisista etuisuuksista tutkittaessa reseptori-ligandi-kompleksien, 20 jotka muodostuvat vasta-aineen liittävän kohdan sisältävien molekyylien (reseptorit) ja erilaisia rakenteita sisältävien ligandien, joissa on samanlaiset tai identtiset epi-tooppiset alueet, välille, intramolekulaarisia reaktiivi-syyskuvioita.

25

Menetelmää valmistaa monoklonaalisia reseptorimolekyylejä, jotka sitoutuvat erityisen amidin tai esterin hydrolyytti-seen siirtymätilaan, tarkastellaan myös. Tässä edellä kuvattu hapteeninen analogi-ligandimolekyyli, jossa on hydro-30 lyyttinen siirtymätila-analogi, saadaan liittyneenä kantajaan immunogeenisenä konjugaattina. Täten saatu konjugaatti « hajotetaan tai dispergoidaan fysiologisesti siedettävässä laimentimessa ympin muodostamiseksi. Ymppi viedään injektiolla sopivaan, ei-ihmis nisäkäseläimeen riittävänä määränä 35 indusoimaan vasta-aineita hapteeniselle analogi-ligandille.

Siten indusoidut vasta-aineet kerätään. Kerätyistä vasta- «

It 13 95928 aineista määritetään niiden kyky sitoutua (immunoreagoida) immunisoivaan, hapteeniseen ligandi-analogiin. Immunoglobu-liinia tuottavat solut, kuten solut eläimen pernasta, joiden vasta-aineet sitoutuvat immunisoivaan hapteeniseen a-5 nalogi-ligandiin, kerätään ja fuusioidaan myeloomasolujen kanssa muodostamaan hybridomasoluja. Hybridomasoluja kasvatetaan viljelyalustassa ja kasvavien hybridomasolujen su-pernatanttialustasta määritetään vasta-aineiden, jotka sitoutuvat immunisoivaan hapteeniseen analogi-ligandiin, läs-10 näolo.

Hybridomasolut, joiden supernatantissa on sellaisia sitovia vasta-aineita, seulotaan, jotta määritetään mitkä noista soluista erittävät vasta-aineita, jotka myös hydrolysoivat 15 substraatti-ligandin stereospesifisellä tavalla. Hybridomasolut, joiden eritetyt vasta-aineet sitoutuvat immunogee-niin, sitoutuvat reaktantti-ligandiin ja hydrolysoivat re-aktantti-ligandin, kloonataan sitten, jotta saadaan halutut monoklonaaliset vasta-aineet viljelyalustan supernatan-20 tista tai isäntä-nisäkkään vesivatsoista, joihin hybridoma on viety.

Kuvattuja monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää tämän keksinnön reseptoreina. Vaihtoehtoisesti niin kutsutut 25 vasta-aineiden Fc- tai Fc'-osat voidaan poistaa entsymaat-t ’ tisella pilkkomisella, jotta saadaan vasta-aineen liittävä kohta (idiotyypin sisältävä polyamidi), joka sitoutuu immunisoivaan, hapteeniseen analogi-ligandiin, kuten Fab- tai F (ab ' ) j-vasta-aineosa, vastaavasti.

30 Tällä keksinnöllä on lukuisia hyötyjä ja etuja. Eräs hyöty on reseptorien, joiden sitomiskohdan topologiset vaatimukset räätälöidään erityiselle reaktantti-ligandille, jota on tarkoitus tutkia ja hydrolysoida edeltä valittu sidos vain 35 yhdessä tuon ligandin isomeerissä.

Tämän keksinnön toinen hyöty on valmistaa reseptoreita, 14 95928 jotka hydrolysoivat ligandin vain yhden stereoisomeerin amidi- tai esteriligandin edeltä määritetyssä kohdassa ja joilla on katalyyttisiä ominaisuuksia.

5 Keksinnön etu on reseptorien, joita voidaan tuottaa, stere-ospesifisyyden takia, että ligandia, jossa on lukuisia e-rilaisia hydrolysoitavia sidoksia, kuten polypeptidi tai proteiini, jossa molemmissa on sekä D- että L-aminohappo-jäännökset, voidaan hydrolysoida edeltä valitusta, erityi-10 sesta hydrolysoitavasta sidoksesta.

Tämän keksinnön vielä eräs etu on sellaisten reseptorien toimittaminen, jotka voivat selektiivisesti poistaa blok-kaavan ryhmän vain yhdestä stereoisomeeristä isomeerien 15 seoksessa synteesin aikana tai sen jälkeen, täten helpottaen halutun stereoisomeerin takaisin saantia tai käyttöä, vastaavasti.

Tämän keksinnön vielä lisähyödyt ja -edut tulevat ilmeisik-20 si ammattimiehille seuraavasta keskustelusta.

Tämä keksintö koskee molekyylejä, joihin viitataan yhdessä reseptoreina, jotka ovat vasta-aine- ja idiotyypin sisältävän polyamidiosia (vasta-aineen liittävä kohta tai para-25 tooppinen), joita indusoi reaktantti-ligandin karboksyyli-happoamidin tai esterin analogi, joka matkii siirtymätilan reaktantti-ligandin esterin tai amidin hydrolyysin stereo-spesifisyyttä ja konformaatiota reaktiosekvenssissä. Resep-torimolekyylit (vasta-aineet ja vasta-aineen sisältävät 30 kohdat), jotka sitoutuvat analogi-ligandin yhteen stereoi-someeriin ja reaktantti-ligandin yhteen stereoisomeeriin, on ajateltu stabilisoivan reaktantti-ligandin edeltä valitun osan hydrolyyttistä siirtymätilaa ja siten osoittavan katalyyttisiä ominaisuuksia reaktantti-ligandin vain yhdel-35 le stereoisomeerille.

Vasta-aineet ja entsyymit ovat molemmat proteiineja, joiden 15 95928 toiminta riippuu niiden kyvystä sitoa spesifisiä kohdemole-kyylejä. Entsymaattiset reaktiot eroavat immunologisista reaktioista siinä, että entsymaattisessa reaktiossa entsyymin sitominen sen substraattiin tyypillisesti johtaa kemi-5 alliseen katalyysiin, kun taas ei-katalyyttinen kompleksi on tavallinen seuraus vasta-aine-antigeenisidoksesta.

Entsyymien uskotaan katalysoivan proteiinien hydrolyysiä liittymällä proteiiniin hydrolyysireaktion siirtymätilan 10 stabiloimiseksi. Yleisesti uskotaan, että entsymaattisen reaktion nopeus kasvaa suhteessa ei-entsymaattisen reaktion nopeuteen, koska entsyymillä on kyky stabilisoida reaktion siirymätila; s.o. vähentää reaktion siirtymätilan vapaata energiaa ja täten reaktion aktivaation vapaata energiaa 15 [Jencks, W.P., Adv.Enzymology, 43, 219 (1975) ja Pauling, L., Amer. Scientist, 36, 58 (1948)]. Kannatus tälle teorialle tulee havainnosta, että aineet, joiden on ajateltu o-levan mallina oletetulle siirtymätilalle, ovat usein vahvasti sitoutuneet entsyymeihin kilpaileviksi inhibiitto-20 reiksi. Leinhard, G., Science, 180, 149 (1973) ja Wolfen-den, R., Acc. Chem. Res., 5, 10 (1972). Lisäksi on ajateltu, että entsyymi suorittaa tämän reaktion vapaan energian alenemisen sitomalla reaktantin siirtymätilan geometrian vahvemmin kuin se sitoutuu vastaavaan (vastaaviin) subst-25 raattiin (substraatteihin) tai tuotteeseen (tuotteisiin).

Tämä tarkoitaa, että entsyymin sisäinen sitova energia on paljon suurempi kuin voidaan mitata substraattien tai tuotteiden sitomisesta. Olennaisesti entsyymin sitomisenergiaa 30 käytetään esittämään kemiallista reaktiota [Jencks, W.P., XVII International Solvay Conference (November 1983)].

Vastakkainen ehdotus on, että vasta-aine, joka valmistetaan optimaalisesti sitomaan sopiva siirtymätilan analogi, toi-35 misi katalyyttinä. Lernerin ja apulaisten ja Schultz ja a-pulaisten tämän tuloksen osoittaminen aikaisemmin viitatuissa julkaisuissa ja alla olevissa julkaisuissa täydentää 16 95928 entsyymitoiminnan ja vasta-ainerakenteen vertailun ja antaa hyödyllisen keinon suunnitella keinotekoisia entsyymejä.

Perusidea tässä kuvatun immunologisen hydrolyysin takana 5 tutkiskelee analogi-ligandien käyttöä edeltä määritetyn spesifisyyden omaavien vasta-aineiden, jotka valikoiden sitoutuvat ja täten stabiloivat amidi- tai esterisidoksen hydrolyysin sen jälkeen, kun sitoutunut spesifiseen reak-tantti-ligandiin, valmistuksessa. Analogi-ligandi simuloi 10 korkea-energisen siirtymätilan konformaatiota hydrolyysissä vasta-aineiden, jotka kykenevät sitoutumaan samankaltaisiin substraatteihin ja stabiloimaan niiden hydrolyysit, tuoton indusoimiseksi.

15 Sellainen valikoiva sitoutuminen ja stabilisointi johtaa hydrolyysin aktivaatioenergian vähenemiseen, täten täyttäen katalyysin kriteerin. Vasta-aineita, joilla on tämä ominaisuus, voidaan saada immunisoimalla synteettisillä analogeilla, joita on kemiallisesti modifioitu muistuttamaan si-20 doshydrolyysin läpikäyvän substraattireaktantti-ligandin sitoutumisominaisuuksia; s.o. immunisoimalla erityisen reaktion siirtymätilan analogeilla.

Lisäksi tämän keksinnön reseptorimolekyyli sitoutuu myös ja 25 hydrolysoi muuten identtisten reaktantti-ligandimolekyylien vain yhden stereoisomeerisen parin. Täten, milloin reak-tanttiligandi on enantiomeerinen, vain yksi enantiomeeri hydrolysoidaan. Samalla lailla, milloin reaktantti-ligandi esiintyy sekä cis- että trans-muodoissa, vain yksi noista 30 isomeereistä hydrolysoidaan.

Koska tämän keksinnön sekä analogi-ligandi että reaktantti-ligandi reseptorimolekyylinä esittävät stereospesifisyyttä, sisältävät ne ainakin yhden hiiliatomin, joka voi olla kah-35 dessa stereoisomeerisessä muodossa; s.o. stereosiomeerinen keskus. Stereoisomeerinen keskus sijaitsee jokaisessa analogi-ligandi- ja reaktanttiligandimolekyylissä samassa ase- 17 95928 massa suhteessa muihin atomeihin vastaavissa molekyyleissä. Täten, jos stereoisomeerinen keskus sijaitsee ketjussa 4 atomia pois fosforiatomista analogi-ligandin happo-osassa, sijaitsee stereoisomeerinen keskus 4 atomia pois reak-5 tantti-ligandin halkaistavasta karbonyylihiilestä.

On pantu merkille, että analogi-ligandimolekyyli ja/tai reaktantti-ligandimolekyyli sisältävät enemmän kuin yhden stereoisomeerisen keskuksen. Kun toinen, kolmas tai muu 10 sellainen keskus sijoitetaan sellaiselle etäisyydelle halkaistavasta karbonyylihiilestä (tai fosforiatomista), jota reseptorimolekyyli ei ole sitotunut, ei sillä ole tässä väliä. Kuitenkin kun on tarpeeksi lähellä, jotta reseptorimolekyyli voi sitoa, mikä tahansa stereoisomeerinen keskus 15 tuottaa lisää stereoisomeerejä. Sellaisten isomeerien lukumäärä määritetään yhtälöllä: lukumäärä = 2', missä n on stereoisomeeristen keskusten lukumäärä.

Ainakin yksi stereoisomeerinen keskus voi olla esteri- tai 20 amiini-reaktantti-ligandin ja analogi-ligandin joko karbok-syylihappo- tai alkoholi- tai amiiniosissa. Jos reaktantti-ja analogi-ligandimolekyyleissä on läsnä enemmän kuin yksi sellainen keskus, voi stereoisomeeristen keskusten lukuisuus olla jakautunut halutulla tavalla halkaistavam karbo-25 nyylihiilen ympärillä (tai keskus-fosforiatomin). Tässä ei käsitellä mitään tetraedrisen keskusfosforiatomin antamaa stereoisomerismia.

Tämän keksinnön reseptorimolekyylille on ominaista ja ka-30 talysoi stereoselektiivisesti ainakin yhden parin stereoisomeerisen reaktantti-ligandimolekyylien, joita on stereoisomeeristen parien seoksessa tai reaktantti-ligandimolekyylien erillisenä parina, hydrolyysin. Edullisemmin reseptorimolekyylille on ominaista ja stereoselektiivisesti ka-35 talysoi reaktantti-ligandimolekyylin vain yhden stereoiso-meerin hydrolyysin.

18 95928

Edellä olleen katalyyttisen hydrolyysin stereoselektiivi-syys olettaa, että stereoisomeerisyyden lokus, stereoisomeerinen keskus, on läsnä reaktantti-ligandissa tarpeeksi lähellä hydrolysoitavaa sidosta (halkaistava karbonyylihii-5 li), niin että katalyyttinen vasta-aineen liittävän kohdan sisältävä molekyyli sitoo stereoisomeerisen keskuksen ja täten reseptorimolekyyli sitoutuu vain yhteen stereoisomee-riin ja sekä reaktantti-ligandin että analogi-ligandin samaan stereoisomeeriin (R tai S). Hydrolysoitavan sidoksen 10 kohta määritetään analogi-ligandin fosforiatomin sijainnilla (ja reaktantti-ligandin analogisella halkaistavalla kar-bonyylihiilellä) ja vasta-ainetta liittävän kohdan koolla. Vasta-ainetta liittävää kohtaa pidetään tavallisesti kykenevänä sijoittamaan noin 5 - noin 7 aminohappojäännöstä.

15

Stereosiomeerinen keskus on tilavuudessa, jossa on 1 - noin 4 aminohappojäännöstä (ketjun pituus noin 12 atomia) ja e-dullisemmin 1 - noin 2 aminohappojäännöstä (ketjun pituus noin 6 atomia) analogi-ligandin fosforiatomin molemmin puo-20 Iin (reaktantti-ligandin halkaistava karbonyylihiili). Täten stereoisomeerinen keskus voi olla karboksyylihappoami-din tai esteri-reaktanttiligandin halkaistavan karbonyyli-hiilen karboksyylihappo-osassa tai amiini- tai alkoholio-sassa. Tässä käytetyssä tyypillisessä stereoisomeerisessä 25 esterissä stereoisomeerinen keskus sijaitsee molekyylin al-koholiosassa.

Tämä etäisyys voidaan helposti määrittää käyttämällä tilaa-täyttäviä malleja tai, milloin on epäilystä, yksinkertai-30 sesti määrittämällä voiko katalyyttinen reseptori hajottaa tai erottaa analogi-ligandin stereoisomeerit. Äärimmäinen analyysi on tietenkin, hydrolysoiko katalyyttinen reseptorimolekyyli yhden isomeerin mutta ei toista.

35 Ei ole tarkoitus käsittää, että milloin on kyse geometrisistä isomeereistä, ei stereoisomeerinen keskus ole yksi ainoa atomi, kuten on tapaus enantiomeereillä. Mieluummin, 19 95928 tuo keskus on läsnä enemmän kuin atomien ryhmä, jonka lukumäärää hallitsee atomien, joita vaaditaan kuvaamaan cis/ trans-isomeerit, lukumäärä. Kuitenkin ilmaisutapauksessa stereoisomeeriseen keskukseen viitataan tässä ikään kuin se 5 olisi yksi ainoa atomi, kuten kiraalinen atomi, mihin enan-tiomeerit sisältyvät.

Kuten jo pantiin merkille, ovat analogi-ligandi ja reak-tantti-ligandi yksi stereoisomeerien pari. Nämä stereoiso-10 meerit voivat olla geometrisiä isomeerejä tai optisia isomeerejä; s.o. enantiomeerejä. Geometriset isomeerit ovat cis/trans-isomeerejä, kuten on havaittu syklisissä molekyyleissä tai milloin läsnä on kaksoissidoksia. Optiset isomeerit ovat d,l tai R,S enantiomeeripareja, joissa stereoi-15 someeriseen keskukseen viitataan kiraalisena keskuksena, koska tuon keskuksen hiiliatomi on kiraalinen hiiliatomi.

Tyypillisessä katalyyttisessä reaktiossa, josta tämän jälkeen keskustellaan, reaktantti-ligandi stereoisomeerit ovat 20 enantiomeerisiä, R,S, pari. Vaikka tässä tutkimuksessa käytetty analogi-ligandi sisälsi sekä enantiomeerejä että indusoi reseptorimolekyylien tuoton, jotka stereoselektiivi-sesti hydrolysoivat reaktantti-ligandin joko R- tai S-muo-dot, pitäisi ymmärtää, että vain yhtä enantiomeeristä ana-25 logi-ligandia voitiin käyttää indusoimaan vain yhden enan-tiomeerisen reaktantti-ligandin tuotto.

Mekanismia, jolla vasta-aine hydrolysoi sidotun reaktantti-ligandin esteri- tai amidisidoksen, voidaan ajatella "indu-30 sed fit"-mallin muodossa. Kun löysästi sidottu substraatti vääntyy tai järjestyy uudelleen mukautuakseen vasta-aineen sitoutumisgeometriaan, painetta voidaan vapauttaa yksittäisen, edeltä määritetyn amidi- tai esterisidoksen kemiallisella uudelleenjärjestelyllä niin, että tämä uudelleenjär-35 jestely johtaa sidoksen hydrolyysiin.

Termiä "reseptori" käytetään tässä tarkoittamaan biologi- 20 95928 sesti aktiivista molekyyliä, joka sitoutuu reaktantti-ligandiin, inhibiittori-ligandiin tai analogi-ligandiin. Tämän keksinnön reseptorimolekyylit ovat vasta-aineita, olennaisesti koskemattomia vasta-aineita tai vasta-aineen 5 idiotyypin sisältäviä polyamidiosia.

Reseptorimolekyylin biologinen aktiivisuus on todistettu sitomalla reseptori sen antigeeniseen reaktantti-ligandiin, inhibiittori-ligandiin tai analogi-ligandiin sen jälkeen, 10 kun ne on sekoitettu vesipitoiseen alustaan, vähintään fysiologisissa pH-arvoissa ja ionisissa vahvuuksissa. Reseptorit sitoutuvat edullisesti myös antigeeniseen ligandiin pH-arvoalueella noin 5 - noin 9 ja ionisissa vahvuuksissa, kuten tislatulla vedellä on, noin sellaiseen kuin yhdellä 15 moolilla natriumkloridia on.

Vasta-aineiden idiotyypin sisältävät polyamidiosat (vasta-aineen sisältävät kohdat) ovat sellaisia vasta-ainemolekyy-lien osia, joissa on idiotyyppi ja sitoutuvat ligandiin tai 20 analogi-ligandiin. Sellaisiin osiin kuuuluvat Fab-, Fab’-ja F (ab ' ) .-fragmentit, jotka on valmistettu vasta-aineista hyvin tunnetuilla entsymaattisilla pilkkomistekniikoilla. Katso esimerkiksi U.S. patentti nr. 4342566, Theofilopoulos ja Dixon, yleisesti ja spesifisesti Pollack et ai. [Scien-25 ce, 234, 1570 (1987)], jotka raportoivat kiihtyneitä hydro-• lyyttisiä nopeuksia Fab-fragmenteille, olivat samat kuin luonnon Igrlle. Kuten kun vasta-aineita, josta saadaan idiot YYPPiä sisältäviä polyamideja, kuvataan syntyneen immuno-geenejä vastaan tai niiden indusoimana, idiotyypin sisältä-30 viä polyamidi- (vasta-aineen liittävän kohdan sisältävä) reseptorien keskustellaan olevan "syntyneen" tai "indusoituneen" ymmärtäväisesti, että pilkkomisvaihe vaaditaan tyypillisesti, jotta saadaan idiotyypin sisältävä polyamidi vasta-aineesta. Koskemattomat vasta-aineet ovat kuitenkin 35 edullisia ja niitä käytetään tämän keksinnön reseptorimole-kyylien tyyppiesimerkkeinä.

li 21 95928 Tässä keksin «Qcc? r«1 0TT£ ^ Vcd^l 2. d. S Θ ^ 0V··1' ^ (^\τρ f V CU O ~ klor*?.3lisi? vas13“9ΐπθϊtci - ”Moncklonanlinen vasta*·ai.n6w on reseptori, jonka on tuottanut yksittäisen solun, nimeltään klooni, inVa erittää vain yhdenlaista reseptorirrolehvvliä ^ v yv* *- Uyv, vasta-ainetta t n o t— tavasta solusta ja myeloomasolusta tai muusta itsestään jatkuvasta solulinjasta.

Tämän keksinnön m.onoklonaalisten vasta-aineiden valmistus— 10 tekniikat ovat hyvin tunnettuja. Kohler ja Milstein, Nature, 256, 495 81975), mikä on liitetty tähän viitteeksi, kuvasivat ensimmäisinä sellaisia reseptoreita. Monoklonaali-sia vasta-aineita saadaan tyypillisesti hybridomakudosvil-jelmistä tai vesivatsanesteistä, jotka on saatu nisäkkäis-15 tä, joihin hybridomakudos on viety. Molemmat menetelmät on huvettu tässä.

-1M '"O s s? s ä ** o 1 ahyvl joka ^ tsa cj 2. t c u t u u resepte^^vdsk^ylvesta^sanet**^ i m-ϊ ^^ 20 koht?,sr.. Tässä tarkastellaan kahdenlaisia ligandeja. En s i m— mäistä nimitetään analogi-ligandiksi ja käytetään imm.uno-geenir.ä indusoimaan reseptorimolekyylien valmistamista ja reseptorimolekyylin katalysoiman reaktion inhibiittorina.

An a 1 ogi — 1 igandi on olennaisesti inertti läpikävmään ka*'a"'v— o c soitua rea^t^cta. Toisp^n v*esktant^*’-'^^fTc?n^*’,",:? tai reaktantti-ligandisubstraattina ja on molekyyli, joka läpikäy katalysoidun reaktion.

Kuten tässä on kuvattu, sellaisia amidi- tai esterili~andi-*3o ker?is"' lisiä enslove^a sv^tetisoidasn, j^^vp i ^ -s *- 4- |j T? 5 +.

fosfonamidaatti- tai fosfonaattiosia spesifisiin, edeltä määritettyihin kohtiin matkimaan siirtymätilan kenformaati-ota amidi- tai esterisidoksen hydrolyysissä. Sellaiset analogit ovat sopivia ehdokkaita tähän tutkimukseen, koska 35 tiedetään, että fosfonamidaatteja on käytetty siirtymätila-analogeina proteolyyttisten entsyymien inhibiitiossa [Bartlett, et ai., Biochemistry, 22, 4618 (1983)].

22 95928

Lyhyet polypeptidiketjut voivat indusoida vasta-aineiden, jotka tunnistavat ja sitoutuvat homologiseen proteiiniin edeltä määritettyyn spesifiseen kohtaan, tuoton. Tämä kek-5 sintö vie aikaisempaa työtä polypeptideillä merkityksellisen vaiheen eteenpäin. Tässä vasta-aineet (reseptorit) indusoidaan immunisoivan hapteenisen ensimmäisen molekyylin (analogi-ligandi) yhden stereoisomeerin toimesta ja tunnistavat ja eivät sitoudu vain tuohon yhteen ensimmäi-10 seen molekyyliin, vaan myös yhteen, toisen stereoisomeerin samankaltaiseen molekyyliin (reaktantti-ligandi). Siteessään tätä toista molekyyliä reseptori aiheuttaa edeltä valitun esteri- tai amidisidoksen, joka vastaa topologiassa immunisoivaa, hapteenista ensimmäistä molekyyliä, hydrolyy-15 sin (mikä on osoitettu tässä, on katalyyttinen). Vastaavuus topologiassa; s.o. koko, muoto, stereokemia ja varaus antaa keinot valita edeltä kohta, missä tapahtuu ligandin hydro-lyysi. Reseptorimolekyylit sitovat myös inhibiittoriligan-deja, jotka muistuttavat analogi-ligandin tai reaktantti-20 ligandin rakennetta.

Sen mukaisesti suhteellisen pienen, immunisoivan hapteenisen analogi-ligandin synteesillä voidaan indusoida resepto-rimolekyylien, jotka tunnistavat, sitoutuvat ja katalyytti-25 sesti pilkkovat esteri- tai amidisidosta toisessa molekyy-. Iissä, jossa on useita amidi- ja esterisidoksia, tuottoa.

Täten sellainen reseptori voidaan valmistaa, joka aiheuttaa stereoselektiivisesti proteiinin tai polypeptidin kuten e-dellä keskusteltu geneettisesti manipuloitu fuusioproteii-30 ni, valitun, edeltä määritetyn amidisidoksen hydrolyysin.

Samallalailla voidaan valmistaa reseptori, joka stereospe-sifisesti ja katalyyttisesti hydrolysoi valitun, edeltä määritetyn malliyhdisteen tai rasvamolekyylin esterisidok-sen.

Tämän tuloksen seuraamus on, että voidaan antaa aktiivisuus immunoglobuliinien proteaaseille ja lipaaseille, mikä on 35 2.2 95928 tähän asti ollut tuntematonta. Lisäksi vasta-aineen aktiivisuus voidaan ohjata mihin tahansa edeltä määritettyyn kohtaan mielin määrin suunnittelemalla pilkottava amidi-tai esterisidos fosfonamidaatti- tai fosfonaatti-konfigu-5 raatiolla hapteenisessa analogi-ligandissa, jota käytetään immunisaatioon.

Täten hapteeninen esteri tai amidi analogi-ligandin hydro-lyyttinen siirtymätilan molekyyli indusoi vasta-aineet ja 10 vasta-aineiden idiotyyppiä sisältävät polyam.idiosat. Hapteenisessa molekyylissä on tetraedrisesti sitoutunut kes-kusfosfori tai silikoniatomi sitoutunut suoraan (a) analogisen esterin tai amidin karboksyylihappo-osan hiiliatomiin, (b) kahteen happiatomiin ja (c) kolmanteen happiato-15 miin tai typpiatomiin, kolmannen happiatomin tai typpiato-min ollessa sitoutunut ligandin analogisen esterin tai a-midin alkoholi- tai amiiniosan hiiliatomiin (alfa-hiili).

Analogi-ligandin suunnittelu kulkee takaisinpäin tuotteen, 20 joka on tarkoitus muodostaa siirtymätilan kautta matkittavaa sidoksen muodostusta varten, ja sitten analogi-ligan-diin, rakenteesta. Reaktiot, joihin kuuluu amidi- tai es-terihydrolyysi, antavat valaisevia esimerkkejä yleisestä käsityksestä ja niitä käytetään tässä tyyppiesimerkkeinä 25 esteri- ja amidi-hydrolyysireaktioille.

Transasetylaatioprosesseille on tyypillistä karbonyyli additio-eliminaaticmekanismif. Asyyliryhmällä voi siksi olla vaihtelevissä määrin tetraedristä luonnetta tässä 30 siirtymätilassa. W.P Jencks, Catalysis in Chemistry and

Enzymology, ch. 10, (McGraw-Hill, New York, 1969). Entsyy-. mien, jotka katalysoivat transasetylaatioreaktioita, saa tettaisiin odottaa sitovan hyvin niitä reaktantti-ligandin analogeja, joilla on tetraedriner. konfiguraatio asyylikes-35 kuksen ympärillä. Tämä pätee seriiniproteaaseille, jossa muodostuu väliaikaisesti kovalenttinen sidos ligandin (substraatti) ja entsyymin välille [Westerik et ai., J.

24 95928

Biol. Chem. 247, 8195 (1972); R.C. Thompson, Biochemistry, 12, 47 (1973) ja Imperali et al., Biochemistry, 25, 3760 (1986)], samoin kuin entsyymeille, jotka katlysoivat amidien tai estereiden suoran hydrauksen. Jälkimmäistä kategori-5 aa inhiboivat yhdisteet, joilla on tetraedrinen konfiguraatio fosfaatti-, fosfonaatti- tai fosfonamidaattiryhmä mukaanluettuina halkaistavan amidi-yksikön asemasta [Weaver et ai., J. Mol. Biol., 114, 119 (1977) ja Jacobsen et ai., J. Am. Chem. Soc., 103, 654 (1981)].

10

Luonnostaan esiintyviä ja synteettisiä aineita, joissa on fosforia, on tutkittu metallopeptidaasien inhibiittoreina. Näissä entsyymeissä näyttäisi siirtymätilalla olevan hyd-rattu amidi metalli-ionin koordinaatiopiirissä [W. N.

15 Lipscomb, Acc. Chem. Res., 15, 232 (1982)]. Siirtymätilan analogilla täydellisessä kuvassa saattaisi sitten olla inhibiittorin fosfonoryhmä ligandina metalli-ioniin tai muuhun polarisoivaan kohtaan Weaver et ai., J. Mol. Biol., 114, 119 (1977) ja Christianson et ai., J. Am. Chem. Soc., 20 108, 545 (1986)]. Metalli-ionien osuutta metallopeptidaa- seissa ei kuitenkin selvästi ymmärretä. Sillä saattaa olla moninainen toiminta amidihydrolyysissä, missä protonin siirtovaiheet tetraedristen välituotteiden joukossa saattavat olla nopeutta rajoittavia [L.M. Sayre, J. Am. Chem.

25 Soc., 108, 1632 (1986)].

Karboksyylihappoestereiden hydrolyysi on yksinkertaisempi esimerkki transasylaatiosta, jota siirtymätilan fosfonaat-tia sisältävän analogin pitäisi myös lähestyä. Varautuneen 30 fosfonaattiryhmän sitominen saattaa kuvata stabiloivaa vuo rovaikutusta siirtymätilassa, joka johtaisi katalyysiin. Esterihydrolyysireaktiot etenevät yleensä sopivilla spontaaneilla nopeuksilla ympäröivissä olosuhteissa, jotka ovat sopivia vasta-aineille. Siksi mikä tahansa pieni nopeuden 35 kiihtyminen voidaan havaita helposti.

Analogi-ligandien ja reaktantti-ligandien rakenteet tätä 25 95928 tutkimusta varten valittiin tietyn kriteerin mukaan. Näihin kuului orgaanisen fosforin prekursorien, vastaava karbok-syylihapposubstraatti, saatavuus ja stabiilisuus, kemiallisen synteesin soveliaisuus sen valmistamiseksi ja sopeutu-5 miskyky erilaisiin immunologisen esityksen kaavoihin.

Perus molekulaarinen yksikkö, josta saadaan tarpeelliset piirteet stereoselektiivistä katalyyttistä hydrolyysiä varten, on substituoitu fenyylietikkahappoesterianalogi (yh-10 diste F), jota kaava I alla, esittää.

HOOCCHj CH, CH, -<^-NH —O * 15 -CH» J^° f*\_/ CH,-0 CH,

Kaavan I yhdiste, yhdiste F, on tässä käytetty analogi-li-20 gandi synnyttämään tämän keksinnön reseptoreja. Yhdiste F on näytetty sen muodossaan ennen kytkemistä antigeeniseen kantajaan immunisaatiota varten. Pitäisi huomata, että yhdiste F on raseemisena modifikaationa, jonka stereoisomee-rinen keskus on tunnistettu tähdellä (*) metiinihiilen ylä-25 puolella osoittaen, että kaksi stereoisomeeristä rakennetta (R ja S) ovat mahdollisia.

Liittämällä mukaan aminosubstituentin analogi-ligandin joko happo- tai amiini- tai alkoholi-osaan, kuten yhdisteen F 30 happo-osassa, saadaan analogi-ligandi, jossa on toiminnallinen lisäke antigeeniseen (immunogeeninen) kantajaproteiiniin kytkemistä varten. Sellainen lisätty lisäke on hyödyllinen, milloin analogi-ligandi on hapteeni. Lisäke ja muka-na seuraavat linkkeriatomit voivat myös olla läsnä reak-35 tantti-ligandissa, erityisesti milloin reaktantti-ligandi on suhteellisen pieni, niin että vasta-aineen liittävä kohta voi olla suhteellisen täytetty ligandilla.

Täten tämä keksintö koskee yleisesti monoklonaalisia resep- 26 95928 toreja, jotka kykenevät katalyyttisesti hydrolysoimaan re-aktantti-ligandin yhden stereoisomeerin edeltä valitun amidi- tai esterisidoksen.

5 Reseptorit, joissa on vasta-aineen liittävä kohta, joka sitoutuu: (a) reaktantti-ligandin yhteen stereoisomeeriin, joka voi muodostaa reaktantin edeltä valitun esteri- tai amidisidoksen tetraedrisen hydrolyyttisen siirtymätilan; s.o., sisältää edeltä valitun karboksyylihappoamidi- tai 10 esterisidoksen ja (b) analogi-ligandin yhteen stereoisomeeriin, joka on stereokemiallisesti analoginen reaktantti-ligandin kanssa ja sillä on tetraedrisesti sidottu fosfori-atomi sijoitettuna asemaan, jossa on reaktantti-ligandin edeltä valitun esteri- tai amidisidoksen halkaistavan kar- 15 bonyyliryhmän hiiliatomi. Tetraedrisesti sidottu fosforia-tomi on sitoutunut suoraan: (i) analogisen reaktantti-ligandin esterin tai amidin happo-osan hiiliatomiin (alfa-hiili), joka on ketjussa, jossa on vähintään 5 atomia ja edullisemmin vähintään 15 atomia 20 ja edullisimmin vähintään 15 atomia ja siinä on substituoi-tu fenyyliryhmä; (ii) kahteen happiatomiin, joista yksi on sitoutunut fosfo-riatomiin kaksoissidoksella, jolloin happi on okso-radikaa-li ja toinen kahdesta happi-atomista on sitoutunut yksin- 25 kertaisesti fosforiin ja yksinkertaisesti radikaaliin, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu vedystä ja C,-C« alemmasta alkyylistä; ja (iii) kolmanteen happi- tai typpiatomiin, joka on sitoutunut analogisen esterin tai amidin hiiliatomiin; s.o. este- 30 rin tai amidin alkoholi- tai amiiniosan alfa-hiileen, joka on osa ketjua, jossa on vähintään 5 atomia ja edullisemmin vähintään 15 atomia ja edullisimmin vähintään 15 atomia ja siinä on substituoitu fenyyliryhmä.

35 Milloin syklinen amidi tai esteri on reaktanttiligandi, ei ole selvästi erotettavaa molekyylin happo- ja amiini- tai alkoholi-osia. Orgaanisen kemian ammattimies ymmärtää kui- 27 95928 tenkin, että amidien ja estereiden täytyy määritelmän mukaan sisältää happo- ja amiini- tai alkoholiosia. Täten voidaan piirtää mielikuvituksellinen rajaviiva sellaisille molekyyleille, joissa on ainakin karbonyylihiili ja sen 5 suoraan sidottu alfa-hiili molekyylin happo-osassa ja mukana on amino- tai hydroksyyliryhmä ja sen suoraan sidottu alfa-hiili molekyylin amiini- tai hydroksyyliosassa. Sellaisissa syklisissä yhdisteissä on myös tietenkin stereoi-someerinen keskus, joka on reaktantti-ligandi-osassa, jonka 10 katalyyttinen reseptorimolekyyli on sitonut.

Eräässä toisessa suoritusmuodossa tämä keksintö koskee stereoselektiivistä menetelmää, jossa katalyyttisesti hydrolysoidaan edeltä valittu esteri- tai amidisidos reak-15 tantti-ligandimolekyylissä. Menetelmä koostuu vaiheista: (a) sekoitetaan katalyyttisesti tehokas määrä yhtä edellä ollutta reseptoria reaktantti-ligandimiolekyylien kanssa, joissa on stereoisomeerinen keskus, vesipitoisessa alustassa; ja (b) pidetään seosta riittävä aikajakso ligandimole-20 kyylien sitoutua reseptoreihin ja reseptorimolekyylien hydrolysoida reaktantti-ligandin yhden mahdollisen stereoiso-meerin edeltä valittu sidos. Hydrolyysin tuotteet voidaan sen jälkeen saada takaisin, jos halutaan. On ymmärrettävää, että käytetään reaktantti-ligandia, jolla on sama stereo-25 konfiguraatio kuin analogi-ligandilla, jota käytetään indusoimaan reseptorimolekyylejä. Reaktantti-ligandien stere-oisomeeristä paria voidaan käyttää, vaikka yksi stereoiso-meeri reagoi.

30 Tämän keksinnön hydrolyyttinen menetelmä käyttää vesipitoista alustaa reaktioseoksen osana. Tuossa alustassa on tyypillisesti vettä ja puskurisuoloja. Lisäksi alusta voi sisältää muita suoloja, kuten natriumkloridia, samoin kuin veteen liukoista kalsium- ja magnesiumsuoloja, kuten usein 35 proteiinia sisältävissä alustoissa on. Läsnä on myös orgaanisia liuottimia, kuten metanolia, etanolia, asetonitriili-ä, dimetyylisulfoksidia, dioksaania, heksametyylifosforami- 28 95928 dia ja Ν,Ν-dimetyyliforamidia. Pinta-aktiivisia aineita, jotka emulgoivat reagenssiligandin ja reseptorimolekyylin, voi myös olla läsnä. Vesipitoisessa alustassa läsnäolevien ainesosien kriittinen piirre on, että nuo ainesosat eivät 5 olennaisesti sekaannu tai inhiboi katalyyttistä reaktiota, kuten reseptorimolekyylin denaturoinnilla. Lisäksi vesipitoisessa alustassa ei olennaisesti ole suolaa, yleisesti proteiineja ja spesifisesti entsyymejä, jotka inhiboivat reseptorimolekyylin katalysoimaa sidoksen rikkovaa reaktio-10 ta.

Vesipitoisen alustan pH-arvo on tyypillisesti noin 5 - noin 9, ja edullisesti noin pH 6,0 - noin 8,0. pH-arvoja, jotka ovat suurempia ja vähemmän kuin nuo viitaut arvot, voidaan 15 myös käyttää niin kauan kuin katalysoitavaan reaktioon ei jälleen olennaisesti sekaannuta tai inhiboida.

Katalyyttiset reaktiot suoritetaan tyypillisesti ympäröivässä huoneenlämpötilassa; s.o. noin 20 - noin 25*C tai 20 37’C:ssa ja ympäröivän ilmakehän paineessa; s.o. noin 1 atm. Kuitenkin voidaan käyttää lämpötiloja alas noin vesiliuoksen jäätymispisteeseen ja ylös noin alustan kiehumispisteeseen ilmakehän paineessa. Kuten tiedetään, proteiinit, kuten reseptorimolekyyli, ovat taipuvaisia denaturoitumaan 25 kohotetuissa lämpötiloissa, kuten sellaisissa joissa vesipitoinen alusta kiehuu, esim. noin 100'C ja täten lämpötilat alle noin 40*C ovat edullisia. Kuten myös hyvin tiedetään, reaktioiden, jotka noudattavat multimolekulaarisia kineettisiä lausekkeita, nopeudet laskevat lämpötilan laskiessa.

30 Täten noin 15'C:een minimilämpötila on edullinen.

: Reaktantti-ligandia on reaktioseoksessa sellaisena määränä, että se liukenee vesipitoiseen alustaan. Kaksifaasisystee-miä, jossa on liukenematonta reaktantti-ligandia, voidaan 35 myös käyttää, mutta tavallisesti ei käytetä. Tavallisesti käytetyt reaktantti-ligandikonsentraatiot ovat noin 0,1 μΜ - noin lOmM, tämän määrän ollessa myös reaktantti-ligan- 29 95928 din liukoisuuden funktio liuotinalustaan. Milloin tuotetta itsessään toivotaan, käytetään suhteellisesti suurempia konsentraatioita verrattuna alhaisempiin konsentraatioihin, kun reaktiomekanismia tai reaktiokinettiikkaa on tarkoitus 5 tutkia.

Läsnä on myös tehokas määrä reseptorimolekyyliä. Tuo tehokas määrä on tyypillisesti katalyyttinen määrä; s.o. reseptoria käytetään moolisessa suhteessa reaktantti-ligandiin 10 noin 1:2 - noin 1:1000 ollessa edullinen. Reseptorimolekyy-lin suhde reaktantti-ligandiin riippuu tyypillisesti resep-torimolekyylin spesifisestä aktiivisuudesta reaktantti-li-gandia vastaan ja reaktion käyttäjän tarkoituksesta. Täten, milloin toivotaan tuotetta, käytetään suhteellisesti korke-15 ampaa reseptorikonsentraatiota ja korkeampaa reseptori-re-aktantti-ligandisuhdetta. Milloin tutkitaan reaktion reaktiomekanismia tai kinetiikkaa, käytetään tyypillisesti alhaisempaa konsentraatiota ja suhdetta. Reseptoria voidaan käyttää stokiometrinen määrä tai myös vähemmän, mutta koska 20 reseptori on katalyyttinen molekyyli, jopa stokiometrisen määrän käyttö voi olla tuhlausta. Täten reseptoria käytetään ainakin katalyyttinen määrä.

Seosta, joka muodostui, kun sekoitettiin reseptorimolekyy-25 lejä ja reaktantti-ligandia vesipitoisessa alustassa, ylläpidetään riittävä aikajakso stereospesifisen sitoutumisen ja reaktion tapahtua. Tuon ylläpitämisjakson kesto on useiden parametrien funktio, valitut reseptorit ja reaktantti-ligandit mukaanluettuina, niiden konsentraatiot, pH-arvot 30 ja lämpötila, samoin kuin se, mitä reaktiosta etsitään.

Täten, milloin suoritetaan kineettisiä tutkimuksia, tavataan usein ylläpitoaikoja minuuteista tunteihin. Milloin toivotaan reaktiotuotteita, ovat ylläpitoajät tunneista 35 päiviin tavallisia.

Enantiomeeristä yhdistettä F, joka on kovalenttisesti liit- 30 95928 tynyt RLHrhon, käytettiin immunogeenisenä konjugaattina immunisoimaan hiiriä. Hybridomat valmistettiin käyttämällä immunisoitujen eläinten pernaa.

5 Valmistettiin 12 hybridomaa, joiden eritetyt monoklonaaliset vasta-aineet (reseptorit), jotka olivat sitoutuneet yhdisteeseen F, kytkeytyivät BSArhan ELISA-analyysissä. Jokaista noista sitoutumisvuorovaikutuksista inhiboi reseptorin esi-inkubointi liuoksessa, jossa ei ollut yhdistettä 10 F, tällöin osoittaen, että havaitut ELISA-sitoutumiset olivat spesifisiä sidotulle hapteeniselle analogi-ligandille.

Noista 12 monoklonaalista 8 tämän jälkeen luetelluista o-livat kykeneviä katalyyttisesti hydrolysoimaan tyypillisen 15 enantiomeerisen esteri-reaktantti-ligandin yhdiste H:n (R,S). Kaksi noista 8:sta katalyyttisestä reseptorista katalysoi vain S(-)-reaktantti-ligandin hydrolyysin, yhdiste H [S (-)], kun taas muut 6 katalysoivat vain R( + )-reaktantti-ligandin hydrolyysin, yhdiste H [R(+)]. Tämän jäl-20 keen keskustellaan spesifisistä olosuhteista, joita käytetään noihin stereoselektiivisiin hydrolyyseihin.

On painotettava, että reseptorimolekyylit, jotka hydrolysoivat yhden enantiomeerin, eivät katalysoineet toisen 25 enantiomeerin hydrolyysiä. On myös painotettava, että ei havaittu reseptoria, joka katalysoi yhdisteen H sekä R(+)-että S(-)-enantiomeerejä.

Yhdisteiden F ja H rakenteet, samoin kuin niiden synteesien 30 välituotteet näytetään tämän jälkeen yhdessä tähän liittyvien erilaisten synteesien keskustelun kanssa.

Uskotaan, että edellä kuvatut stereoselektiiviset katalyyttiset hydrolyysit ovat ensimmäiset sellaiset koskaan rapor-35 toidut hydrolyysit. Lisäksi uskotaan, että tämä on ensimmäinen raportti erillisten vasta-ainetta liittävän kohdan sisältävien reseptorimolekyylien, jotka voivat stereoselek- 31 95928 tiivisesti katalysoida stereoisomeeriparin jokaisen erillisen jäsenen reaktion, valmistamisesta; tässä enantiomeerit. Täten aikaisemmin mainitut Napper et ai.. Science, 237:1041 (1987) ja Hilvert et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85: 5 4953 (1988) paperit molemmat raportoivat reseptorimolekyy- lien, jotka katalysoivat kahden stereoisomeerisen subst-raattimolekyylin vain yhden reaktion, valmistamisesta.

Tässä raportoidut tulokset täten täydentävät kahden aiemman 10 emähakemuksen tuloksia ja Napper et ai. paperia, edellä.

Tuota täydennystä nähdään stereoselektiivisessä hydrolyy-sissä verrattuna aiemmin raportoituihin synteeseihin ja myös saataessa yksittäisiä reseptorimolekyylejä, jotka kykenevät katalysoimaan reaktantti-ligandin jokaisen stereo-15 isomeerin reaktion.

Hydrolyyttisten reaktioiden kinetiikan tutkiminen on alkanut. Ensimmäiset tulokset osoittavat, että hydrolyysi on suhteellisen nopeata ja että on jonkin verran tuoteinhibii-20 tiota, jonka on aiheuttanut reaktantti-ligandimolekyylin tuotehappo.

On pantu merkille, että tämän jälkeen keskustellut synteesit koskevat vain yhtä karboksyyliesteriä reaktantti-ligan-25 dina ja yhtä fosfonaattia analogi-ligandina. Noita synteesejä voidaan kuitenkin helposti soveltaa erilaisten esteri-ja fosfonaattiyhdisteiden valmistukseen reaktanttien yksinkertaisilla substituutioilla. Karboksyylihappoamidi-reak-tantti-ligandeja ja fosfonamidi-analogi-ligandeja voidaan 30 myös valmistaa helposti menetelmillä, jotka ovat vastaavia kuin ne, jotka kuvattiin käyttämällä sopivia reaktantteja tässä käytettyjen tilalla.

- 95928 32

Yhdiste A

5 F.cÄ-NH-fj^5^ O

UU-Ic:o-ch'ch' 10 Sekoitettuun dietyyli-4-aminobensyylifosfonaattiliukoseen (0,74 g, 3,04 mM) 5 ml:ssa metyleenikloridia (juuri tislattua kalsiumhydridin päällä) lisättiin (0,32 ml, 4 mM) py-ridiiniä. Seos jäähdytettiin 4*C:een ja lisättiin trifluo-rietikka-anhydridiä (0,5 ml, 3,54 mM) tipoittain yli 5 min 15 jakson ajan sekoittaen liuosta. Sekoitusta jatkettiin 15 min samalla antaen liuoksen lämmetä huoneenlämpötilaan (noin 23'C) . Reaktion päättyminen osoitettiin ohutlevykroma-tografiällä käyttämällä 1:1 metyleenikloridia (CH,Clj) ja etyyliasetaattia (ETOAc) eluanttina (R, 0,2).

20

Sen jälkeen liuos laimennettiin 50 ml :11a etyyliasetaattia. Orgaaninen liuos pestiin kahdesti perättäisillä 25 ml annoksilla 0,5 M HClrää ja sitten kuivattiin vedettömän magnesiumsulfaatin päällä. Haihdutus tuotti keltaisen öljyn, 25 joka puhdistettiin flashkromatografiällä silikageelin päällä käyttämällä 1:1 seosta metyleenikloridia ja etyyliasetaattia eluanttina. Fosfonaatti (yhdiste A) (0,877 g, 85 % saanto) saatiin värittömänä kiteisenä materiaalina.

30 Protoni NMR CDCl,:ssa 100 MHZ:ssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): delta 10,61 (leveä singletti, 1H), 7,53 (dupletti, J=8,22 Hz, 2H), 7,17 (kaksoisdupletti, J=8,67 Hz ja 2,5 Hz, H), 4,02 (P, J=7,18 Hz, 2(2H)), 3,10 (dupletti, J-21,62, Hz, 2H) ja 1,26 (tripletti, J=7,05 Hz, 2(3H).

35 33 95928

Yhdiste B

5 O

UUv™' 10

Pyöreäpohjäiseen pulloon, jossa oli 0,2 g (5,88xl0'4 mol) yhdistettä A 2 ml:ssa kuivaa, juuri tislattua dikloorime-taania (CH,C1,), lisättiin 0,8 ml trimetyylisilyylibromidia (TMSBr; 5,9x10'’ mol). Saatua seosta sekoitettiin 40’C:een 15 lämpötilassa 3 h jakson ajan.

Liuotin poistettiin sen jälkeen, jolloin saatiin valkoinen kiinteä. Tätä kiinteätä käsiteltiin liuoksella, jossa oli 5 % vettä dietyylieetterissä (v/v), mikä liuotti kiinteän.

20 Seisottamisen jälkeen lisää valkoista kiinteätä tunnistettiin, kun ilmestyi fosfonihappoa, joka kerättiin, kuivattiin ja punnittiin 0,1274 g:ksi. Analyysi ohutlevykromato-grafialla (tie) silikageelin päällä CHjClj/ETOAc (1:1, v:v) osoitti, että fosfonihappo oli puhdasta.

25

Fosfonihappo (0,1221 g) liuotettiin metanoliin, johon oli lisätty diatsometaania. Sen jälkeen, kun oli odotettu, että reaktio oli tapahtunut, lisättiin kationinvaihtohartsia (protonimuoto) pieninä määrinä, kunnes liuoksen keltainen 30 väri katosi. Liuotin poistettiin, lisättiin CH,C1Z liuottamaan yhdistettä B ja saatu liuos suodatettiin hartsihelmien poistamiseksi. Sen jälkeen liuotin poistettiin, jolloin saatiin 0,1284 g yhdistettä B (95 % saanto).

35 Ohutlevykromatografia, kuten edellä, osoitti singlettituo- tetta.

Protoni NMR CDC1, :ssa 100 MHZrssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): delta 8,78 (leveä singletti, 1H) , 7,42 34 95928 (multipletti, 4H), 3,7 (dupletti, J=ll, Hz, 6H), 3,17 (dup-letti, J=20 Hz, 2H).

Yhdiste C

UU<ci ^O-CH, 10

Yhdiste B (0,50 g; l,6xl0'4 nol) laitettiin pyöreäpohjäiseen pulloon, jossa oli 4 ml kuivaa kloroformia, johon oli lisätty 1 ekvivalentti PCls:tä (0,034 g). Saatua liuosta kuumennettiin 45"C:een lämpötilassa sekoittaen. 1 h kuluttua 15 osoitti tie (kuten edellä) reaktion olevan noin 95 % täydellinen. Lisättiin toinen puoli-ekvivalenttia PCl,:tä ja reaktiota ylläpidettiin toinen h, jona aikana tie osoitti reaktion olevan täydellisen.

20 Sen jälkeen pulputettiin rikkidioksidia liuokseen. Sitten poistettiin liuotin ja haihtuvat ja jäännös pestiin dietyy-lieetterillä ja kuivattiin alennetussa paineessa. Yhdiste C kerättiin 0,0255 g määränä.

25 Protoni NMR CDC1, :ssa 100 MHZ:ssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): delta 8,5 (leveä singletti, 1H), 7,42 (multipletti, 4H), 3,86 (dupletti, J=14, Hz, 3H), 3,55 (dupletti, J=20 Hz, 2H).

• 30 Yhdiste D

0 ___ CH, CH,-<j

Raseeminen sec-fenetyylialkoholin (alfa-metyylibensyylial-koholi) modifikaatio (0,152 ml; 12,66xl0'4 mol) liuotettiin 40 kuivaan tetrahydrofuraaniin (THF). Lisättiin natriumhydri-diä (0,038 g; 15,83xl0'4 mol) liuokseen ja saatua seosta kuumennettiin palautusjäähdytyksessä 2 h jakso. Sen jäi- 35 95928 keen, kun seos oli jäähdytetty huoneenlämpöiseksi, lisättiin 0,10 g (3,165x1ο'4 mol) yhdistettä C jäähdytettyyn seokseen ja saatua seosta sekoiotettiin 5 min.

5 THF poistettiin ja jäännös laimennettiin ETOAc:hen. Tuo liuos pestiin 0,5 H vesipitoisella HClrllä ja kyllästetyllä natriumkloridilla ja kuivattiin sitten natriumsulfaatin päällä. ETOAczn poisto tuotti keltaisen öljyn. Tuo öljy puhdistettiin flashkromatografiällä käyttämällä CHjCl,/ 10 ETOAc:ta liuottimena 10/1, 5/1 ja 3/1 (v/v), ja saatiin 0,083 g yhdistettä D (65 % saanto).

Protoni NMR CDCl,:ssa 100 MHZrssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): delta 9,72 (leveä dupletti, J=10 Hz), 7,28 15 (multipletti, 9H), 5,45 (multipletti, 1H), diastereomeeri-set parit: [3,65 (dupletti, J=ll Hz) 3,32 (dupletti, J=ll Hz), 3H], diastereommeriset parit: [3,1 (dupletti, J=21

Hz), 2,95 (kaksoisdupletti, J=21 Hz) 2H], diastereomeeri-set parit [1,6 (dupletti, J=7 Hz) 1,45 (dupletti, J=7 Hz), 20 3H].

Yhdiste E

O CH, 25 J—\ Il Λ=/ 30 Yhdiste D (0,0250 g; 6,22x10'’ mol) liuotettiin 1 ml:aan etanolia sekoittaen. Etanoliliuokseen lisättiin natriumboo-rihydraattia (0,0161 g; 7 ekvivalentti) ja saatua liuosta sekoitettiin 1 h aikajakso huoneenlämpötilassa.

35 Sitten lisättiin 10 % vesipitoista ammoniumhydroksidiliuos-ta edellä olleeseen liuokseen. Saatu liuos uutettiin ETO-Ac:llä ja saatu ETOAc-uute kuivattiin natriumsulfaatin päällä. Liuotin poistettiin, jolloin saatiin 0,015 g yhdistettä E (noin 80 % saanto).

40 36 95928

Protoni NMR CDCl,:ssa 100 MHZ:ssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): delta 6,95 (multipletti, 9H), 5,48 (mul-tipletti, 1H), diastereomeeriset parit: [3,62 (dupletti, J=ll Hz) 3,33 (dupletti, J=ll Hz), 3H], diastereommeriset 5 parit: [3,08 (dupletti, J=21 Hz), 2,88 (dupletti, J=21 Hz) 2H], diastereomeeriset parit [1,58 (dupletti, J=7 Hz) 1,45 (dupletti, J=7 Hz), 3H].

Yhdiste F (analogi-ligandi) 10 9 CH, HOOCCH.CH.CH.-C-NH-rfO % /==s\

XX*y~\J

CH,-Ö 15

Yhdiste E (0,032 g; l,046xl0'4 mol) liuotettiin 3 ml: aan kuivaa CH,Cl2:ta, johon lisättiin trietyyliamiinia (0,0145 ml; 1 ekvivalentti) ja saatua liuosta sekoitettiin 10 min huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen lisättiin glutaarianhydri-20 diä (0,0110 g; 1 ekvivalentti) sekoitusta jatkamalla. Reaktiota seurattiin tlc:llä silikageelin päällä CHjClj/me-tanoli (5/1, v/v) liuottimena.

Reaktioseos laimennettiin ETOAc:llä, johon lisättiin 0,5 25 vesipitoista HCl:ää. Sen jälkeen lisättiin 4 M vesipitoista HCl:ää, kunnes vesipitoinen osa oli hapanta. Orgaaninen liuotinkerros erotettiin, kuivattiin natriumsulfaatin päällä ja sitten liuotin poistettiin alennetussa paineessa. Tuloksena oleva tuote saatiin preparatiivisellä tlc:llä sili-30 kageelissä käyttämällä edellä ollutta liuotinta eluaatti-na.

Yhdiste F valmistettiin antamalla edellä valmistetun yhdisteen (32 mg) reagoida 2 ml:n kanssa t-butyyliamiinia sulje-35 tussa putkessa 60*C:ssa 10 d jakson ajan. Liuottimet poistettiin, tuote puhdistettiin nopealla proteiininestekroma-tografilla ja raseeminen yhdiste F saatiin lyofilisaatiol-la. Saatiin yhteensä 26,3 mg yhdistettä F (85 % saanto).

37 95928

Protoni NMR DMSO-d,:ssa 100 MHZrssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): delta 9,8 (singletti, 1H) , 7,3 (multip-letti, 9H), 5,39 (multipletti, 1H), 2,98 (dupletti, J=21 Hz), 2,30 (multipletti, 4H), 1,82 (multipletti, 2H), 1,45 5 (dupletti, J=7 Hz, 3H).

Yhdiste G

10 FjC-^-NH—CH, _ ϋ-μ-Ο 15 Lisättiin trifluorietikkaanhydridiä (2,8 ml) 4-aminofenyy-lietikkahappoliuokseen (1,5 g) ja natriumkarbonaattiin (1,5 g) 10 % vesipitoisessa asetonitriilissä -10'C:ssa. Liuos tehtiin happamaksi 6 N HCl:llä (0,2 ml) ja konsentroitiin tyhjiössä. Suodatus silikan läpi 9:1 dikloorimetaanin ja 20 metanolin seoksen kanssa tuotti 1,4 g (57 paino-% saanto) p-trifluoriasetamidofenyylietikkahappoa. Ohutlevykromato-grafia silikageelissä käyttämällä 5/1 seosta kloroformia ja metanolia (v/v) eluanttina tuotti R,-arvon 0,35.

25 Protoni NMR DMSO-ds:ssa 100 MHZ:ssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): 7,37 (dupletti, J=8,7, Hz, 2H), 7,02 (dupletti, J=8,7 Hz, 2H), 3,3 (singletti, 2H).

Edellä ollut happo (0,6 g) liuotettiin tionyylikloridiin ja 30 liuosta kuumennettiin 40^:333 2 h. Tionyylikloridi poistettiin tyhjiössä, jolloin saatiin vastaava happokloridi.

Valmistettiin liuos, jossa oli 0,0461 g (3,773x10'* mol) S(-)-sec-fenetyylialkoholia ja 0,0525 ml trietyyliamiinia 35 (1 ekvivalentti) liuotettuna CH,Cl,:een. Liuosta sekoitet tiin huoneenlämpötilassa 0,5 h. Edellä valmistettua happo-kloridia (0,10 g; 3,774x10"* mol) lisättiin sitten ja sen jälkeen toinen ekvivalentti trietyyliamiinia. Happokloridin lisäys aiheutti liuoksen muuttumisen ruskeaksi ja amiinin 38 95928 lisäys aiheutti kiinteän alkamisen saostua. Reaktioseosta sekoitettiin 0,5 h.

Reaktioseosta laimennettiin sen jälkeen ETOAcrlla, pestiin 5 0,5 M vesipitoisella Helillä, orgaaninen liuotin kuivattiin natriumsulfaatin päällä ja orgaaninen liuotin poistettiin. Tuote puhdistettiin silikageelipylväässä käyttämällä CH,-Clj/ETOAc:ta (5/1, v/v) eluaattina. Kuivaamisen jälkeen saatiin 0,0158 g yhdistettä G [S(—)]- 10 R(+)-isomeeri valmistettiin yleisesti samalla tavalla ja saanto oli 48 %.

Valmistettiin myös raseeminen modifikaatio, jossa oli yh-15 täläiset määrät kumpaakin R(+)- ja S(-)-enantiomeeri-iso-meerejä. Materiaaliin viitataan yhdisteenä G (R,S).

Protoni NMR CDC1, :ssa 100 MHZrssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): delta 8,1 (leveä singletti, 1H), 7,3 20 (multipletti, 9H), 5,9 (multipletti, 1H), 3,62 (singletti, 2H), 1,55 (dupletti, J=6 Hz, 3H).

Yhdiste H (reaktantti-ligandi) HOOCCHjCH,CHj-(?-NH—CH, /-\ 30

Yhdiste G [R( + )] (0,6447 g; 1,84x10'“ mol) liuotettiin 5 ml:aan etanolia pyöreäpohjaisessa pullossa ja lisättiin 5 ekvivalenttia natriumboorihydridiä. Saatua seosta sekoitettiin 2,5 h ja kaadettiin 20 ml:aan 10 paino-% vesipitoiseen 35 ammoniumhydroksidiin. Vesipitoinen liuos uutettiin ETOAc: llä ja ETOAc-liuos kuivattiin natriumsulfaatin päällä. Liuotin poistettiin alennetussa paineessa ja jäännös liuotettiin 5 ml:aan juuri tislattua CH?Clj:a.

39 95928

Lisättiin 2 ekvivalenttia trietyyliamiinia (0,51 ml) edellä olleeseen CH,Cl,-liuokseen ja saatua liuosta sekoitettiin lyhyesti. Lisättiin sitten 1 ekvivalentti glutaarianhydri-diä (0,2095 g) ja saatua reaktioseosta sekoitettiin huo-5 neenlämpötilssa 18 h.

Haihtuvat poistettiin alennetussa paineessa ja jäännös liuotettiin uudelleen ET0Ac:hen. Tuo liuos pestiin vesipitoisella 0,5 M HCl:llä, natriumbikarbonaatilla (10 paino-10 %) ja sitten kyllästetyllä vesipitoisella natriumkloridil- la. Orgaaninen faasi kuivattiin natriumsulfaatin päällä ja poistettiin sitten alennetussa paineessa. Jäännös liuotettiin minimaaliseen määrään metanolia ja lisättiin heksaani-seokset tuotteen saostamiseksi. Tuote pestiin lisämäärillä 15 heksaaniseosta ja kuivattiin, jolloin saatiin 0,300 g (noin 43 % saanto).

Tuote, yhdiste H [R{+)] osoitti +30,6' optista kiertoa natrium-D-linjalla polarimetrissä.

20

Toinen enantiomeeri, yhdiste H [S(—)] valmistettiin yleisesti samallatavalla ja se osoitti -30,3' optista kiertoa, kuten edellä.

25 Raseeminen modifikaatio valmistettiin samalla lailla käyt-, tämällä yhdistettä G (R,S) lähtömateriaalina. Tätä tuotetta käytettiin ensimmäiseen seulontaan ja siihen viitataan yhdisteenä H (R,S) .

30 Protoni NMR DMSO-djissa 100 MHZissa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): delta 9,9 (singletti, 1H), 7,35 (multip-letti, 9H), 5,78 (multipletti, 1H), 3,6 (singletti, 2H), 2,25 (multipletti, 4H), 1,75 (multipletti, 2H), 1,45 (dup-letti, J=6 Hz, 3H).

Analogi-ligandilla (yhdiste F) oli glutaryyli puoliamidi-ryhmä, jota käytettiin liittämään hapteeninen analogi-li- 35 40 95928 gandi antigeeniseen (immunogeeninen) kantajaan vasta-aineiden induktiota varten. Muut liittävät ryhmät, joissa on yhteensä 1-8 metyleeni- (CH2) ryhmää karboksyyliryhmien välillä, ovat myös hyödyllisiä.

5 Täten kahden arvoiset hapot, kuten malonihappo, glutaari-happo, adipiinihappo, läpi dekaanidioichapon ovat hyödyllisiä. Nuo materiaalit voidaan liittää analogi-ligandiin käyttämällä sopivaa anhydridiä, happokloridia tai muuta 10 sopivaa aktivoitua sidosta happoryhmiin.

Erityisen hyödyllinen dikarboksyylihappo-johdannaisen liittävä ryhmä sisältää O-sukkini-imidyyliryhmän yhdessä kar-boksyylihappopäässä ja happokloridin toisessa päässä. Alla 15 olevissa menetelmissä keskustellaan sukkini-imidyyliadipo-yylikloridin spesifisestä valmistuksesta tyyppiesimerkkinä muiden samanlaisten liittävien ryhmien synteeseistä.

Adipiinihappomonometyyliesterin (5,4 g, 33,3 mol) liuosta 20 tionyylikloridissa (15 ml) kuumennettiin 40'C:ssa 2 h. Sitten seos konsentroitiin ja tislattiin tyhjiössä (kiehumispiste 119‘C 20 mmHgrssä), jolloin saatiin 3,58 g (60 paino-% saanto) happokloridimetyyliesteriä. Tämä liuotettiin 20 ml:aan dikloorimetaania ja lisättiin N-hydroksisukkini-25 imidiä (2,75 g, 24,0 mmol), jonka jälkeen lisättiin trie- tyyliamiinia (4,2 ml, 30 mmol). Seosta sekoitettiin 10 min, sitten laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin 0,5 M HCl:llä ja suolavedellä. Liuos kuivattiin vedettömän magnesiumsulfaatin päällä, suodatettiin ja konsentroitiin, jol-30 loin saatiin 4,5 g (87,5 paino-% saanto) metyylisukkini-imidyyliadipaattia värittömänä öljynä.

«

Protoni NMR CDC1, :ssa 100 MHZrssa (TMSrään liittyvä sisäisenä standardina): delta 3,73 (singletti, 3H), delta 2,90 35 (singletti 4H), 2,70 (multipletti, 2H), 2,37 (multipletti, 2H) ja 1,79 (multipletti 4H).

41 95928

Metyylisukkini-imidyyliadipaatti- (4,5 g, 17,5 mmol), kloo-ritrimetyylisilaani- (11,1 ml, 87,5 mmol) ja natriumjodidi-(13,1 g, 87,5 mmol) liuosta 10 mlrssa asetonitriiliä kuumennettiin palautusjäähdytyksessä 12 h. Sitten seos jäähdy-5 tettiin huoneenlämpötilaan ja laimennettiin etyyliasetaatilla. Reaktioseos pestiin uudestaan 5 % vesipitoisella natriumbisulfiitilla, kunnes orgaaninen liuos oli väritön. Sitten se pestiin suolavedellä, kuivattiin vedettömän magnesiumsulfaatin päällä, suodatettiin ja konsentroitiin, 10 jolloin saatiin 3,2 g (71 paino-% saanto) adipiinihappomo-nosukkini-imidyyliesteriä valkoisena kiinteänä.

Protoni NMR CDC1, :ssa 100 MHZissa (TMSrään liittyvä sisäisenä standardina): delta 3,90 (singletti, 4H), 2,70 (multip-15 letti, 2H), 2,4 (multipletti, 2H) ja 1,80 (multipletti 4H).

Adipiinihappomonosukkini-imidyyliesterin (1,00 g, 3,80 mmol) ja tionyylikloridin (5 ml) seosta kuumennettiin 40’C:ssa 3 h, sitten jäähdytettiin huoneenlämpötilaan ja 20 konsentroitiin tyhjiössä. Jäännöstä sekoitettiin useita kertoja kuivan heksaanin kanssa, öljy erotettiin ja kuivattiin tyhjiössä, jolloin saatiin 0,97 g (90 paino-% saanto) sukkini-imidyyliadipoyylikloridia. Tämä liuotettiin kuivaan tetrahydrofuraaniin 5 M liuoksen tekemiseksi, jota käytet-25 tiin sellaisenaan valmistettaessa yhdisteitä, jotka olivat sopivia kytkeytymään proteiinikantajiin.

Protoni NMR CDCl,:ssa 100 MHZrssa (TMS:ään liittyvä sisäisenä standardina): 3,00 (multipletti, 2H), 2,90 (singletti, 30 4H), 2,70 (multipletti, 2H), 1,80 (multipletti 4H).

: Sukkini-imidyylihappokloridin reaktio hapteenisen analogi- ligandin kanssa suoritetaan tavalla, joka on pääpiirteittäin samanlainen kuin edellä keskusteltu yhdisteen F val-35 mistukselle. Tuo reaktio sitoo sukkini-imidyylihappokloridin happokloridin sisältävän osan hapteenin amiiniin ja jättää sukkini-imidyyliryhmän vapaaksi reagoimaan myöhemmin 1...

42 95928 kantajan kanssa.

Hapteenisen analogi-ligandin konjugaatteja antigeenisen (immunogeeninen) proteiinikantajien kanssa, kuten tuli-5 vuorikotilon hemosyaani (KLH), voidaan valmistaa, esimerkiksi aktivoimalla kantajan kytkemisaineen kanssa, kuten MBS (m-maleimidobensoyyli-N-hydroksisukkini-imidiesteri) ja kytkemällä analogi-ligandin tioliryhmään. Katso esimerkiksi Liu et ai., Biochem., 80, 690 (1979). Kuten alalla myös hy-10 vin tiedetään, on usein hyödyllistä sitoa yhdiste sen kantajaan välituotteen, liittävä ryhmä, avulla.

Hyödylliset kantajat tunnetaan ällällä hyvin ja ovat yleensä itse proteiineja. Esimerkkejä sellaisista kantajista 15 ovat tulivuorikotilon hemosyaani (KLH), edestiini, tyroglo-buliini, albumiinit, kuten naudan seerumin albumiini tai ihmisen seerumin albumiini (BSA tai HSA, vastaavasti), punaiset verisolut, kuten lampaan erytrosyytit (SRBC), teta-nustoksoidit, koleratoksoidi, samoin kuin polyaminohapot, 20 kuten poly-(D-lysiini:D-glutamiinihappo) ja sen kaltaiset.

Kantajan valinta riippuu enemmän antigeenin äärimmäisestä aiotusta käytöstä kuin antigeenin determinanttiosasta ja perustuu kriteeriin, joka ei erityisesti liity tähän kek-25 sintöön. Esimerkiksi, jos konjugantti aiotaan käyttää la-boratorioeläimissä, pitäisi valita kantaja, joka ei tuota epäsuotuisaa reaktiota erityisessä eläimessä.

Kantaja-hapteeni-konjugaatti liuotetaan tai dispergoidaan 30 fysiologisesti siedettävän laimentimen vesipitoiseen koostumukseen, kuten tavallinen suolaliuos, PBS tai steriili ’ vesi ympin muodostamiseksi. Ymppiin voidaan liittää mukaan myös adjuvantti, kuten Freundin täydellinen tai ei-täydellinen adjuvantti tai aluna. Ymppi viedään injektiolla eläi-35 meen, jota käytetään muodostamaan vasta-aineita, kuten hyvin tiedetään.

43 95928

Tyypillisessä menetelmässä lisätään 2,5 mg hapteenisen ana-logi-ligandin reaktiotuotetta ja sukkini-imidyyliadipoyyli-kloridia tai sukkini-imidyyliglutaroyylikloridia 250 pl:ssa dimetyyliformamidia hitaasti 2 mgraan KLHrta 750 pl:ssa 5 0,01 M natriumfosfaattipuskuria pH-arvossa 7,2. Käytetään 4'Creen lämpötilaa ja saatua seosta sekoitetaan noin 1 h hapteeni-liittyneen KLH-konjugaatin muodostamiseksi. Kon-jugaattireaktiotuote, joka on siten muodostunut, puhdistetaan sen jälkeen tavallisin keinoin.

10 Tässä työssä yhdiste F (5 mg) sekoitettiin KLH:n (2 mg) kanssa veteen (2 ml). pH säädettiin 4,5:ksi HClrllä ja lisättiin sitten 10 ekvivalenttia l-etyyli-3-(3-dimetyylia-minopropyyli)-karbodi-imidiä. Seosta sekoitettiin noin 12 15 h. Saatu raakatuote ruiskutettiin hiiriin.

Edellä olleita KLH-konjugaatteja (noin 100 pg) käytettiin immunisoimaan hiiriä (129GlX*-kanta) ja monoklonaaliset vasta-aineet saatiin, kuten Niman et ai. kuvaavat, Proc.

20 Natl. Acad. Sei. USA, 77, 4524 (1980) ja Niman et ai., teoksessa Monoclonal Antibodies and T-Cell Products, toim., Katz, D.H., 23-51 (CRC Press, Boca Raton, F1 1982). Lymfosyytit, joita käytettiin muodostamaan tämän keksinnön hyb-ridomia, voidaan johtaa mistä tahansa nisäkkäästä, kuten 25 kädelliset, jyrsijät (esim. hiiri tai rotta), kani, marsu, lehmä, koira, lammas, sika tai sen kaltaiset. Kuten sopivaa, voidaan isäntä tehdä herkäksi immunogeenin ruiskutuksella, tässä tapauksessa hapteeninen analogi-ligandi, jonka jälkeen seuraa vahvennusruiske ja sitten pernan eristys.

30

On edullista, että myeloomasolulinja on samasta lajista kuin lymfosyytit. Sen vuoksi käytetään tyypillisesti fuu- ·. · sioituja hybridejä, kuten hiiri-hiiri-hybridit [Schulman et ai., Nature, 276, 269 (1978)] tai rotta-rotta-hybridejä 35 [Galfre et ai., Nature, 277, 131 (1979)]. Kuitenkin joitakin rotta-hiiri-hybridejä on myös käytetty menestyksellisesti muodostamaan hybridomeja [Golding, "Production of 44 95928

Monoclonal Antibodies by Cell Fusio", teoksessa Antibody as a Tool, Marchalonis et al., toim. John Wiley & Sons Ltd., s. 273 (1982)]. Sopiviin myeloomalinjoihin käytettäväksi tässä keksinnössä kuuluvat MPC-11 (ATCC CRL 167), P3X63-5 Ag8.653 (ATCC CRL 1580), Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581), P3X63-Ag8U.1 (ATCC CRL 1597), Y3-Agl.2.3. (tallennettu Collection Nationale de Cultures de Microorganismsm, Pariisi, Ranska, numero 1-078) ja P3X63Ag8 (ATCC TIB 9). Ei-erittävä hiiren myeloomalinja Sp2/0 tai Sp2/0-Agl4 on edullinen käytettä-10 väksi tässä keksinnössä.

Hybridomasoluja, joita viime kädessä tuotetaan, voidaan viljellä seuraamalla tavallisia in vitro kudosviljelmätek-niikoita sellaisille soluille, jotka ovat hyvin tunnettuja. 15 Edullisemmin hybridomasoluja viljellään eläimissä käyttämällä samanlaisia hyvin tunnettuja tekniikoita, jolloin saadaan monoklonaalisia reseptoreita siten tuotetuista ve-sivatsanesteistä. Vesivatsanesteiden tuottoon käytetyt e-läimet olivat naaras-129GlX*-hiiret, kasvatettu Scripps 20 Clinic and Research Foundation hiiriyhdyskunnassa, La Jolla, Kalifornia, kuitenkin kun käytetään muita eläimiä kuin hiiriä hybridomien valmistamiseen, voidaan hiiriä tai tuon tyyppisiä eläimiä käyttää vesivatsanesteiden tuottamiseen.

25 Erityisesti, tuotettiin tyypillinen monoklonaalinen reseptori Kohler et ai., standardihybridomatekniikalla, Nature, 256, 495 (1975). Naaras-129GlX*-hiiret immunisoitiin nimenomaan vatsaontelon sisäisellä ruiskeella 100 pg konjugaat-ti-ympillä (esim. yhdiste F sitoutunut KLH:hon) 300 pl:ssa 30 1:1 fosfaattipuskuroitua suolaliusota (PBS) pH 7,4 ja

Freundin täydellistä adjuvanttia. 2 viikkoa myöhemmin hii-: ret ruiskutettiin uudestaan samalla lailla 50 pg:lla edellä ollutta konjugaattia 300 pl:ssa 1:1 seosta PBS:ää pH 7,4 ja 10 mg/ml alunaa. 8 lisäviikon jälkeen hiiret immunisoitiin 35 laskimonsisäisesti 50 pg:lla konjugaattia 200 pl:ssa PBS:ää (pH 7,4). Hiiristä poistettiin pernat 4 d myöhemmin ja pernasolut fuusioitiin myeloomasoluihin.

45 95928

Pernasolut kerättiin ja tehtiin yksittäinen solususpensio. Tumalliset pernasolut (1,4x10') fuusioitiin sitten 3xl07 Sp2/0-Agl4 ei-erittävien myeloomasolujen kanssa solufuusio-5 promoottorin läsnäollessa (polyetyleeniglykoli 2000) . Hyb-ridoma, joka tuottaa erityistä monoklonaalista vasta-ainetta, valittiin jakamalla pernasolut 96-kaivon maljoille ja kasvattamalla Dulbecco's modifioidulla Eagle-alustalla (DMEM), jossa oli 4500 mg/1 glukoosia (10 %), 10 % vasikan 10 sikiön seerumia (FCS), hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä (s.o. HAT-alusta), joka ei tue ei-fuusoitujen myeloomasolujen kasvua.

2-3 viikon kuluttua jokaisesta kaivosta kerättiin solukloo-15 nin yläpuolelta supernatantti ja testattiin ELISA-analyy-sillä (enzyme linked immunosorbent assay, kuten tämän jälkeen kuvataan) yhdistettä F olevien vasta-aineiden läsnäo lo. Positiiviset kloonit kloonattiin kahdesti rajoitetulla laimennuksella. Niitä klooneja, jotka jatkoivat yhdiste F-20 spesifisen vasta-aineen tuottamista kahden kloonaamisen jälkeen, laajennettiin tuottamaan suurempia tilavuuksia su-pernatanttinestettä. Siitä tuotetut ja tässä kuvatut hybri-domat ja monoklonaaliset reseptorit on tunnistettu labora-toriomerkinnöin, kuten alla olevassa taulukossa nähdään.

25 Tämän keksinnön monoklonaalinen reseptori voidaan myös tuottaa viemällä, kuten ruiskeella, hybridoma nisäkkään, kuten hiiren, vatsakalvoon. Kuten jo on tähdennetty, käytetään edullisesti syngeenisiä tai semi-syngeenisiä nisäkkäi-30 tä, kuten U.S. patentissa 4361549, mikä esitys on liitetty tähän viitteeksi. Hybridoman vieminen aiheuttaa vasta-ai-: netta tuottavien hybridomien muodostuksen sopivan kasvu- jakson kuluttua ja johtaa tuotetun reseptorin korkeaan konsentraatioon, joka voidaan saada takaisin isäntähiiren 35 verenkierrosta ja vatsakalvon tulehdusnesteestä (vesivat-sat) .

46 95928

Vaikka isäntähiirillä on myös normaalit reseptorit niiden veressä ja vesivatsoissa, normaalien reseptorien konsen-traatio on tyypillisesti vain noin 5 % monoklonaalisen reseptorin konsentraatiosta.

5

Monoklonaaliset reseptorit saostetaan vesivatsanesteistä, puhdistetaan anioninvaihtokromatografilla ja dialysoidaan kolmea erilaista puskuria vastaan.

10 Näissä tutkimuksissa saatiin Ig-fraktiot tyypillisesti hiiren vesivatsoista saostamalla 45 % kyllästetyllä ammoniumsulfaatilla, ja sen jälkeen kromatografoimalla DEAE-Sepha-celrssä natriumkloridi-eluaatiolla. Fraktio, joka eluoitiin 100 mM:lla suolalla, dialysoitiin ja konsentroitiin. Prote-15 iinikonsentraatiot määritettiin Lowryn menetelmällä [J.

Biol. Chem., 193:265 (1951)]. Saadut konsentroidut liuokset, joissa oli eristetyt IgG-fraktiot, valmistettiin tyypillisesti reseptorin kantaliuoksiksi 1-20 mg/ml käyttämällä sopivaa puskuria, kuten 50 mM Tris-HCl tai natriumfos-20 faattia, jossa oli 0,01 M natriumatsidia.

Niistä 12 monoklonaalisesta reseptorista, jotka sitoutuivat antigeeniin ELISA:ssa, 8 katalysoi raseemisen yhdiste H (R,S) substraatin hydrolyysiä. Kaksi noista kahdeksasta ka-25 talyyttiä erittävästä hybridomasta, yksi joka katalysoi jokaisen stereoisomeerin reaktion, tallennettiin keksinnön e-simerkkeinä. Hybridomat tallennettiin American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, kuten nähdään hybridoma-tallennus taulukosta alla.

30 47 95928

Hybridoma-tallennus taulukko Hybridoman nimitys Reagoi 5 R( + )/S (-) ;n

Laboratorio kanssa ATCC Tallennuspäivä 2H6 R(+) HB 9969 Tammikuu 13, 1989 21H3 S(-) HB 9970 Tammikuu 13, 1989 10 1F5 R (+) ND* ND* 9C7 S(-) ND* ND* 18E9 R(+) ND* ND* 11D9 R(+) ND* ND* 20C10 R(+) ND* ND* 15 26D3 E ( +) ND* ND* * ND = ei tallennettu.

Nämä tallennukset tehtiin Budapestin sopimuksen vaatimus-20 ten mukaan niin, että tallennusten kesto olisi 30 vuotta tallennuspäivästä tai 5 vuotta säilytyspaikassa olevan tallennuksen viimeisen kysynnän jälkeen tai U.S. patentin pakollinen elinikä, joka kypsyy tästä hakemuksesta, mikä tahansa on pisin. Hybridomat täydennetään, jos niistä tulee 25 ei-elinkelpoisia tallennuksessa.

Monoklonaalisen reseptorin Fab-fragmentti valmistettiin puhdistetusta reseptorista käyttämällä esipilkottua papii-nia 0,1 M natriumasetaattipuskurissa, pH-arvossa 5,5, 30 37’C:ssa, jonka jälkeen seurasi reaktio jodiasetamidilla.

Fab-fragmenttia puhdistetaan tyypillisesti lisää anionin-; vaihtokromatografiällä, dialyysillä ja DEAE-anioninvaihto- kromatografiällä ja sen homogeenisyys päätellään geelie-lektroforeesilla.

35

Analogi-ligandin sitominen indusoidulla monoklonaalisella reseptorimolekyylillä analysoitiin ELISA:11a vasta-aineella 95928 _ ... τζ 48 sidotulla konsentraatiolla sen tiitterin alueella ja muuttuvalla inhibiittori- (vapaa yhdiste F) konsentraatiolla. yhdisteen F käyttö inhibiittorina auttaa varmistamaan, että havaittu sitomis-vuorovaikutus on antigeeni-spesifinen.

5

Analyysit suoritettiin litteäpohjäisillä polyvinyylimikro-tiitterimaljoilla (Dynatech, Alexandria, VA). Kaivot peitettiin tyypillisesti liuoksella, jossa oli yhdistettä F sitoutuneena BSA:han, kuten antigeeniligandi fosfaattipus-10 kuroidussa suolaliuoksessa (PBS) käyttämällä 50 μΐ liuosta maljaa kohti. BSA:ta käytettiin kantajana sitomaan hapteeni soluseinään ja analogi-ligandi/BSA-konjugaattia käytettiin immunisoivan KLHrta sisältävän sijasta seulomaan pois mahdolliset anti-KLH-vasta-aineet.

15

Sidotut ligandit peitettiin 1 pg/ml. Sitten maljoja inku-boitiin yön yli 37’C:ssa kuivassa uunissa. Kuivatut maljat säilytettiin 4'C:ssa, kunnes käytettiin. Ennen ELISA-analyy-siä maljat rehydrattiin kahdella 2 minuutin pesulla, jokai-20 nen 10 mM PBS, pH 7,4, jossa oli 0,1 % polyoksialkyleeni- (20) sorbitaanimonolauraattia (Tween 29) ja 0,02 % Thimero-salia (natriumetyylielohopeatiosalisylaatti), (Sigma, St. Louis, MO).

25 Jotta vähennettäisiin ei-spesifistä sitoutumista, hybrido-( . ma-supernatantit laimennettiin 1:2 pesupuskuriin, jossa oli 0,1 % BSArta laimentimena. Jokaiseen kaivoon lisättiin sen jälkeen 50 μΐ laimennettuja hybridoma-supernatantteja ja inkuboitiin 1 h 4‘C:ssa gyroravistelijassa, jotta saataisiin 30 monoklonaalista vasta-ainetta sisältävä supernatantti kosketuksiin sidotun yhdisteen F kanssa. Kahden, jokainen 2 ; min, pesun jälkeen lisättiin jokaiseen kaivoon 50 μΐ perok- sidaasi-leimattua vuohen anti-hiiri IgG + IgM (Tago, Bur-linngame, CA), laimennettu 1:1000 ja reaktioseosta inkuboi-35 tiin 4‘C:ssa 1 h, jotta leimattu vasta-aine sitoutuu mono-klonaaliseen vasta-aineeseen.

49 95928

Substraatti, jota käytettiin analysoimaan sidottu peroksi-daasiaktiivisuus, valmistettiin juuri ennen käyttöä ja koostui 400 pg/ml o-fenyleenidiamiinia (Sigma, St. Louis, MO) 80 mM sitraattifosfaattipuskurissa, pH 6,0, jossa oli 5 0,12 % H,02. Kahden lopullisen pesun jälkeen lisättiin jo kaiseen kaivoon 50 μΐ substraattiliuosta ja värin annettiin kehittyä 15 min pimeässä. Värin kehitys lopetettiin lisäämällä 25 μΐ 4 M H}SO,:ää jokaiseen kaivoon ja optinen tiheys 492nm:ssä mitattiin Multiskan ELISA-maljalukijalla.

10

Reseptorimolekyylien toista valmistamista varten voidaan geeni, joka koodaa vasta-ainetta liittävää kohtaa muodostavaa fragmenttia, saada mistä tahansa solusta, joka tuottaa vasta-ainemolekyylin, joka immunoreagoi, kuten tässä on 15 keskusteltu. Edullinen solu on hybridomasolu.

Esimerkkejä yleisistä rekombinantti-DNA-kloonaustekniikois-ta katso Molecular Cloning, Maniatis et ai., Cold Spring Harbor Lab., N.Y., 1982; DNA Cloning, Glover, ed., IRL 20 Press, McLean VA (1985). Immunoglobuliinigeenien genomista kloonausta ja ilmenemistä lymfasoluissa, katso Neuberger et ai., Nature, 312:604-8 (1984); Ochi et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:6351-55 (1977); ja Oi et ai., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA, 80:825-29 (1983). Immunoglobuliini-25 geenien kloonaamiseksi hybridomasoluista ja ilmentämiseksi \ Xenopus-varhaismunasoluissa, katso Roberts et ai., protein

Engineering, 1:59-65 (1986) ja katso Wood et ai. ilmeneminen hiivassa. Nature, 314:446-9 (1985).

30 Edellä ollut on tarkoitettu valaisemaan tätä keksintöä eikä rajoittamaan. Lukuisia muita muunnelmia ja modifikaatioita voidaan toteuttaa luopumatta tämän keksinnön todellisesta hengestä ja alasta.

35

Claims (3)

95928

1. Reseptorimolekyyli, tunnettu siitä, että siinä on vasta-aineen liittävä kohta, joka kykenee katalyyttisesti hydrolysoimaan edeltä valitun, reaktantti-ligandin yhden 5 stereoisomeerin halkaistavan karboksyylihappoamidin tai esterin sidoksen, ja siitä, että reseptorin erittää hybri-dooma 2H6, jonka ATCC-talletusnumero on HB 9969 tai hybri-dooma 21H3, jonka ATCC-talletusnumero on HB 9970.

2. Hybridooma, tunnettu siitä, että se erittää mono- klonaalista reseptorimolekyyliä, jossa on vasta-aineen liittävä kohta, joka kykenee katalyyttisesti hydrolysoimaan edeltä valitun, reaktantti-ligandin yhden stereoisomeerin halkaistavan karboksyylihappoamidin tai esterin 15 sidoksen, ja että hybridooman ATCC-talletusnumero on HB 9969 tai HB 9970.

3. Menetelmä, jolla katalysoidaan yhden parin stereoiso-meeristen karboksyylihappoamidi- tai esterimolekyylien '· 20 hydrolyysireaktiota, tunnettu siitä, että se käsittää seu- raavat vaiheet: sekoitetaan katalyyttisesti tehokas määrä reseptorimole-kyylejä, jotka on erittänyt hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 9969 tai HB 9970, stereoisomeeristen reak-25 tantti-ligandimolekyylien kanssa vesipitoisessa alustassa * seoksen muodostamiseksi, ja pidetään seosta riittävä ajanjakso mainitun reaktantti-ligandimolekyylien sitoutua mainittuihin reseptorimolekyy-leihin ja mainittujen reseptorimolekyylien hydrolysoida 30 mainittu edeltä valittu halkaistava sidos. Il 51 95928