PT92884B - Processo de preparacao de moleculas de receptor com sitios de combinacao com anticorpos, que exibem catalise estereoespecifica de hidromas que segregam as mesmas e de catalisacao de hidrolise das referidas moleculas - Google Patents

Description

Ref ?'5-cia.....Cruzada ao Pedido de Patente Rei acicrado

Este pedido de patente é uma continuação parcial do pedido de patente copendente N°. de Série 083 681, depositado em 7 de Agosto de 1987, que é uma continuação parcial do pedido de patente copendente N°. de Série 055 177, depositado em 28 de Maio de 1987, cujas descrições são aqui incorporadas como referencia.

ÇâTPP... Técnico presente invento refere-se ao processo de preparação de anticorpos, antigénios e imunogénios, e, mais particularmente, a moléculas que contêm um sitio de combinação com anticorpos que se ligam, estereospecificamente, e estabilizam o átomo de carbono tetraédrico de um estado de transição, de hidrólise de éster ou amida, e que catalisam, estereo-selectivamente, a hidrólise de tais ligações.

ã.O-Lê.Ç.ecle.n.tes. ?*ΐ?....Ι.^ηνβΡΛρ

Os fenómenos de ligação entre ligandos e receptores podem desempenhar muitos papéis cruciais nos sistemas biológicos. Exemplos de tais fenómenos são a ligação das moléculas de oxigénio à desoxi-hemoglobina para formar oxi-hemoglobina, e a ligação de um substrato a uma enzima que actua sobre ele, tal como entre uma proteina e uma protease, tal como a tripsina. Ainda exemplos adicionais de fenómenos biológicos de ligação, incluem a ligação de um antigénio a um anticorpo, e a ligação do componente do complemento C3 ao assim denominado receptor CRI.

Considera-se que muitas drogas e outros agentes terapêuticos são também dependentes dos fenómenos de ligação. Por exemplo, refere-se que os opiáceos, tais como a morfina, se ligam a receptores específicos no cérebro. Descreve-se que os agonistas e antagonistas dos opiáceos competem com drogas, tais como a morfina, na ligação a esses sítios de ligação.

Os, ligandos tais como as drogas preparadas pelo homem, tais como a morfina e os seus derivados, e os que estão naturalmente presentes nos sistemas biológicos, tais como endorfinas e

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-4que estão naturalmente e serão aqui tratados a um número de hormonas, ligam-se aos receptores presentes nos sistemas biológicos, conjuntamente. Esta ligação pode conduzi fenómenos de biologia, incluindo, particularmente, a hidrólise de ligações amida e éster, por exemplo quando são hidrolisadas proteínas, nos constituintes polipeptídicos, por uma enzima tal como a tripsina ou a papaina, ou quando uma gordura é clivada em glicerina e três ácidos carboxi1icos, respectivamente.

Slobin, Biochemis tr y, 5:2836-2844 (1966) descreveu a preparação de anticorpos para um conjugado de p-nitrocarbobenzoxilo da albumina de soro de bovino. Esses anticorpos foram subsequentemente utilizados para hidrolisar acetato de p-nitrofenilo e ésteres de épsilon-aminocaproato. A reacção do éster de acetato foi traduzida por uma constante de velocidade de segunda ordem e referiu-se que parecia ser não especifica. Referiu-se que a constante de velocidade de segunda ordem, obtida utilizando gama-globulina normal, era aproximadamente igual ã dos anticorpos preparados especialmente.

dos anticorpos especialinente preparados inibe éster de aminocaproato.

Referiu-se que a presença a hidrólise do

Kohnen e colaboradores descreveram também tentativas, para catalisar a esterólise utili zando anticorpos. Os anticorpos utilizados por este grupo foram, em cada caso, cultivados para uma porção da molécula de substrato, finalmente utilizada, que não continha a ligação a ser hidrolisada.

Nos seus trabalhos iniciais Γ FEBSLetters. 100:137-140 (1979) e Biochim.Biophys. Acta, 629:328-337 (1980)] usaram anticorpos anti-esteróides para hidrolisar ésteres de 7-umbeliferona (7-hidroxicumerina) de um tioéter de carboxietilo de um esteróide. Em cada caso, observou-se um aumento na velocidade hidrolitica em comparação com a velocidade residual ou com uma velocidade obtida com IgG normal. Em ambos os casos, a eficiência foi baixa (cerca de uma mole de substrato por mole de anticorpo por minuto, ou menos), e as velocidades de reacção declinaram com o tempo, alcançando uma plataforma com a saturação do anticorpo. Essa descida lenta na velocidade foi atribuída a

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-5trica em vez uma ligação irreversível cio produto ácido esteróide ao anticorpo.

Kohen et al. descreveram também hidrólises de 7-[-N-(2,4-dini trofeni 1 )-6-ainino-hexanoi 1 ]-cumerina utilizando anticorpos monoclonais cultivados para as porções dinitrofenilo dessa molécula de substrato [FE8S Letters 111:427-431 (1980)]. Aqui, descreveu-se também um aumento na velocidade em relação á velocidade residual, mas referiu-se que a reacção era estequioméReferiu-se uma diminuição na cataii tica.

velocidade que tendia para zero quando se atingia a saturação do an ticorpo. De novo, a diminuição foi atribuída à inibição do produto causada pela ligação do produto ácido ao anticorpo, uma vez que algurna da actividade de hidrólise inicial podia ser regenerada por cromatografia de uma mistura de anticorpo-substrato-produto.

Quando a forte ligação de anticorpo é dirigida a estados estáveis de moléculas de substrato, a baixa velocidade de dissociação do complexo irá impedir a catálise. Esta é considerada ser a situação para os resultados descritos por Kohnen e colaboradores.

As construções anteriores, embora interessantes, estão severamente limitadas pela incapacidade para dirigir o mecanismo de utilização de energia de ligação, que é essencial para as enzimas [W. P. Jencks, Ady.Enzymol., 43, 219 (1975)].

Essas deficiências podem ser ultrapassadas pela utilização de um análogo de estado de transição, tal como o hapteno, para induzir os anticorpos desejados. Este hapteno (também aqui designado por ligando análógo ) pode assumir o papel de um inibidor no sistema catalítico.

Assim, a ligação imunológica pode ser utilizada para dirigir experimen talmente catalíticos. Por interacções de ligação para os processos exemplo, foi sugerido que a utilização de um anticorpo para um grupo hapténico, que se assemelha ao estado de transição de uma dada reacção, deveria causar uma aceleração na reacção do substrato, forçando os substratos a assemelhar'em-se ao estado de transição. Jencks, W. P. Catalysis in Chemistry and

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Enzymology, página 283 (McGraw-Hill , Nova Iorque 1969). Apesar dessa sugestão genérica, não foram sugeridos haptenos de estado de transição específicos, nem foram sugeridas reacções especificas,nas quais o conceito podia ser testado.

Considera-se que a hidrólise de ligações amida e éster de acordo com a teoria química presentemente aceite, ocorre em meios aquosos por uma reacção no átorno de carbono de carbonilo para formar um estado de transição que contém um átomo de carbono tetraédrico ligado (a) a um átomo de carbono da porção ácida da amida ou do éster, (b) a dois átomos de oxigénio, sendo um do grupo carbonilo e o outro de um ião hidroxilo ou de uma molécula de água do meio, e (c) ao átomo de oxigénio da porção álcool de um éster ou ao átomo de azoto da porção amina de uma amida. Os estados de transição destas reacções são construções mentais úteis que, por definição, não podem ser isoladas, quando comparadas a intermediários, que são isoláveis.

Embora os estados de transição hidroliticos anteriores não possam ser isolados, tem sido dedicada ao tema uma grande quantidade de literatura cientifica. Alguma dessa literatura é aqui a seguir referida.

Enquanto que se considera que o estado de transição, anteriormente descrito para a hidrólise de amida e de éster, é bem compreendido , os parâmetros da topologia, por exemplo, dimensão, forma e carga, dos sítios de ligação de receptores, nos quais as amidas particulares, tais como proteinas ou ésteres, tais como gorduras, que reagem através desses estados de transição, não são bem compreendidos. Deste modo, seria benéfico que a topologia de uma pluralidade de sítios de ligação fosse conhecida de modo a que se pudessem estudar as interacções dos ligandos que se ligam nesses sítios. Infelizmente, a topologia dos sitios de ligação de receptores, em hidrólises biológicas, é geralmente desconhecida, exceptuando o caso de um número relativamente pequeno de enzimas cujas estruturas foram determinadas por cristalografia de raios X.

Esta falta de conhecimento da topologia dos sitios de · ..Z

Τ'

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-7ligação deriva, em parte, de uma falta de conhecimento, mesmo da localização nas células, de muitos sitios de ligação de receptores. Adicionalmente, para os sitios de ligação de receptores cuja localização é conhecida, a identidade química; i. e., a composição em proteínas e em carbo-hidratos, do sitio de ligação é geralmente desconhecida. Assim, o investigador está geralmente limitado, na sua investigação, para compreender os requisitos topológicos dos sitios de ligação de receptores e, por consequência, na construção de agentes terapêuticos que podem preencher esses requisitos.

Os investigadores têm de , por consequência, pesquisar agentes terapêuticos potenciais,em estudos de culturas de células ou em animais para avaliar se um agente terapêutico potencial pode ou não ser útil. Estes sistemas, embora úteis, são caros e demasiado morosos para serem utilizados.

Mesmo quando se conhece a topologia e a reactividade química de um receptor hidrolitico, tal como uma enzima, as enzimas, tais como as proteases hidroliticas, clivam, tipicamente, os seus substratos, cadeias polipeptidicas, num local adjacente a um resíduo de aminoácidos particular que pode ocorrer várias vezes na cadeia polipeptídica da proteína. Embora possa ser útil uma tal clivagem relativamente aleatória, na obtenção de um mapa polipeptidico da proteína, essa clivagem relativamente aleatória não é tão útil quando se deseja produzir sequências de residuos aminoácidos particulares.

Por exemplo, as técnicas modernas de engenharia genética têm sido úteis na preparação de proteínas de fusão que contêm uma proteína ou um polipéptido, desejado, fundidos com produto de transcrição de um gene vector tal como o gene lac ζ. A utilização destas proteínas de fusão é, contudo, impedida pela presença de fragmentos do produto do gene vector. Deste modo, seria também benéfico que pudessem desenvolver-se moléculas semelhantes a enzimas proteoliticas, que irão clivar estes produtos de fusão entre as porções de polipéptidos ou proteínas de fusão desejadas e as não desejadas.

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-oRecentemente, Lerner, Tramontano ε Janda fScience. 234, 1566 (1986)] descreveram anticorpos monoclonais que hidrolisaram cataliticamente um éster. Tramontano e Lerner, na Patente dos E.U.A. N2 . 4 656 567, descrevem também o uso de anticorpos monoclonais para hidrolisar ésteres. Pollack, Jacobs e Schultz [ Science, 234, 1570 (1986)] descreveram uma proteina de mieloma, denominada NOPC167 [Leon e t al_. , Biochem. . 10, 1424 (1971)] que catalisa a hidrólise de um carbonato.

Nas duas referências de Lerner e Tramontano, os anticorpos foram cultivados para um fosfonato que foi sintetizado para representar um análogo estável do estado de transição hidrolitico tetraédrico, do éster de ácido carboxílico ou do éster de carbonato. 0 anticorpo de Pollack et al. principalmente descrito foi uma proteína de mieloma que se ligava a um fosfonato que era estruturalmente análogo ao análogo de carbonato hidrolisado. Assim, no trabalho de Lerner e Tramontano et.,al . , o substrato a foi pré-seleccionado, com o análogo de os anticorpos hidroliticos sintetizados de ser hidrolisado imunização, sendo acordo com o produto desejado. Pollack et al_._ conceberam o substrato a ser hidrolisado uma vez que eles conheciam a Pollack et al.

especificidade da proteina de mieloma. descreveram também (na referência anterior) a existência de um sistema catalítico de anticorpo, substrato e substrato análogo, para a hidrólise de carbonato, similar em conceito ao de Lerner et a 1 . . Em Jacobs et al. , J.Am. Chem Soo. , 1,09, 2174 (1987) descreve-se o trabalho relativo a esse sistema.

pedido de patente publicado W0 85/02414 discute a possível utilização de anticorpos como catalisadores, e apresenta dados relativos à utilização de soro políclonal na hidrólise de o-nitrofenilbeta-D-galactósido. Nesse pedido de patente descreve-se que os anticorpos úteis são induziveis por um reagente, por um intermediário da reacção ou por um análogo do reagente, produto ou intermediário da reacção.

definido para abranger os isómeros compostos suficientemente semelhantes ao reagente, em termos de estrutura quimica, de modo a que um anticorpo criado para um termo análogo é ali os homólogos ou outros

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-9análogo possa participar numa reacção imunológica com o reagente, mas não catalise, necessariaments,uma reacção do análogo.

Os dados proporcionados por essa descrição apenas indicam que ocorreu alguma clivagem do galactósido substrato (reagente) durante um periodo de tempo de dezoito horas, utilizando uma preparação de anticorpos relativamente concentrada (diluições 1=10 e 1:20). Embora fosse alegada catálise, não se mostrou qualquer actividade catalítica, uma vez que não se mostrou qualquer regeneração do anticorpo alegadamente catalítico, nem havia qualquer indicação da percentagem de galactósido substrato clivado. Esse pedido de patente referiu sim, que a beta-D-galactosidase clivou cerca de dez vezes mais substrato do que os anticorpos policlonais, supondo uma linearidade da absorvãncia para a concentração anónima do substrato estudado.

Dos dados apresentados nesse pedido de patente, é possível que ocorresse uma substituição nuoleofilica do grupo o-nitrofenilo por um grupo amino terminal de um residuo de lisina da preparação de anticorpos utilizada. Assim, a absorvãncia observada podia ter sido devida à formação de épsilon-aminolisinil-o-nitrofenilanilina ou à formação de um épsilon-aminolisinilgalactósido e de um o-nitrofenol, qualquer uma das ocorrências não podendo ser ca talitica,uma vez que o anticorpo foi consumido, em vez de ter sido regenerado.

Em trabalhos mais recentes, descreveu-se a formação de uma amida bimolecular, catalisada por moléculas de anticorpo [Senkovik et a1,... , Proc.........Natl. Acad. Sei. USA, 85:5355 (1988)], bem como um rearranjo de Çlaisen catalisado por anticorpos [Jackson et a 1 . , J. Am. Chem.......Soc. , 110:4841 (1988)]. Nenhum desses trabalhos, nem qualquer dos trabalhos anteriormente referidos, contemplam a utilização de anticorpos para catalisar qualquer reacção de uma maneira estereospecífica.

A estereospecificidade foi mostrada numa reacção de formação de lactona, catalisada por anticorpos [Napper et al., Science, 237:1041 (1987)] e numa reacção de Claisen catalisada por anticorpos [Hilvert et al ., Proc..........Natl,. Acad. Sei . USA , 85:4955

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-10(1988)]. A utilização de uma molécula contendo um sítio, de combinação com anticorpos para catalisar estereospecificamente uma reacção de hidrólise como aqui a seguir se descreve não foi, contudo, contemplada em qualquer uma das publicações anteriores.

Breve Sumár iodo Invento presente invento contempla uma molécula de receptor que contém um sitio de combinação com anticorpos ou uma poliamida contendo idiotipo, que è capaz de hidrolisar cataliticamente uma ligação éster ou amida de ácido carboxílico, cindivel, pré-seleccionada, de um estereoisómero de um ligando reagente, e não do outro estereoisómero. Esse sitio de combinação com anticorpos liga-se a (imunorreage com): (a) um estereoisómero de um ligando reagente contendo essa ligação éster ou amida de ácido carboxílico, cindivel, pré-seleccionada, e (b) um estereoisómero de um ligando análogo, que é estereoquimicamente análogo ao ligando - reagente, e que contém um átomo de fósforo, ligado tstraedricamente, numa posição análoga à do átomo de carbono de carbonilo cindivel da ligação éster ou amida de ácido carboxílico, pré-seleccionada, do ligando reagente. 0 estado de transição hidrolítico do ligando reagente assim ligado contém um átomo de carbono tetraédrico ligado (i) a um átomo de carbono, o carbono alfa da porção ácida do éster ou amida, (ii) a dois átomos de oxigénio, e (iii) ao átomo de oxigénio de um éster ou ao átomo de azoto de uma amida.

As moléculas contendo um sitio de combinação oom anticorpos criadas para o estado de transição hidrolítico de um ligando reagente são criadas ou induzidas por imunização oom um estereoisómero de uma molécula de ligando análogo (de preferência ligada a um transportador de proteína para formar um conjugado) contendo um análogo de um estado ds transição hidrolítico do ligando. 0 estereoisómero de imunização da molécula de estado de transição hidrolítico, de ligando análogo, contém um átomo de fósforo, ligado tetraedricamente, ligado directamente a (i) um átomo de carbono da porção ácida do éster ou da amida do ligando análogo, (o carbono alfa da porção ácida) (ii) dois átomos de oxigénio, (iii) um terceiro átomo de oxigénio ou um átomo de

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-11azoto, estancio o terceiro átomo de oxigénio ou o átomo de azoto ligados ao átomo de carbono alfa de uma amida ou éster análogos do ligando.

átomo de carbono alfa da porção ácida, (i) anterior, ligado directamente ao átomo de fósforo, tetraédrico, central, da molécula de ligando análogo, está incluído numa cadeia que contém pelo menos 5 átomos e, mais preferivelmente, pelo menos 15 átomos, e, de preferência, pelo menos 15 átomos e incluindo um grupo fenilo substituído, tal como o estão o terceiro átomo de oxigénio ou o átomo de azoto (iii) anteriores. Dos dois átomos de oxigénio, (ii) acima referidos, ligados directamente ao átomo central, um átomo de oxigénio (a) está duas vezes ligado (duplamente ligado), num grupo oxo, ao átomo central, (b) é parte de um grupo hidroxilo ou (o) é o oxigénio de um grupo alcoxilo contendo um grupo alquilo inferior C1-C4. 0 segundo , daqueles átomos de oxigénio ligados ao átomo central, está ligado singularmente ao átomo central e é um grupo - OR2, no qual R2 e seleccionado de entre o grupo constituído por hidrogénio (H), e por alquilo inferior C1-C4. 0 quarto átomo, (iii) anterior, ligado ao átomo central da molécula de ligando análogo, é o átomo de oxigénio de álcool de um éster ou o átomo de azoto de amina (imino) de uma amida da porção éster ou amida análoga do ligando. Esse quarto átomo è uma porção de uma cadeia que contém pelo menos 5, mais preferivelmente, pelo menos, 15 átomos e o restante da cadeia constitui R3.

Realça-se que quer o ligando reagente, quer o ligando análogo, contêm, pelo menos,. um átomo de carbono que pode existirem duas formas estereoisomériças e que constitui assim um centro estereoisomérico. Esse centro estereoisomérico está localizado em cada uma das moléculas de ligando e de ligando análogo, na mesma posição relativa em cada molécula. 0 centro estereoisomérico está também localizado suficientemente perto da ligação a ser hidrolisada de modo que o centro estereoisomérico está ligado pela molécula catalítica contendo o sitio de combinação com anticorpos.

átomo central ligado tetraedricamente é o fósforo, de modo

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-12que o ligando análogo é um composto de organofósforo com uma distribuição de substituintes, à volta do fósforo, que corresponde à de estado de transição de carbono tetraédrico. Um fosfonato ou um fosfonamidato monoácido, na sua forma ionizada, simulam também o desenvolvimento de carga num ataque nucleófilo a um centro de carbonilo.

Além disso, os inibidores de fosfonamidato de hidrólises peptidicas enzimáticas têm sido mimetizando estados de transição. Galardy et al e fosforamidato descritos como

22, 1990 (1933); Thorsett et a 1 . , Jacobsen et al., Biochemistry, 13 114 . 119 (1977).

Bartlett et al., Biochemistry, 22

Proc. Natl. Acad. Sei.

J..,...._ A m......Chem. Soc. , .103, 654 (1981) , 3032 (1979) e Weaver e: al., J_.

USA , 79 ,

Biochemistry,
4618 2176 Kam	(1983); (1982); et al.,
, Mol .	Biol.,

Nos estudos que aqui se descrevem, os ésteres de fosfonato e as amidas de fosfonamidato funcionam como análogos de estado de transição para produzir anticorpos, que são monoclonais e que são amidases e esterases carboxi1ioas, estereoespecificas. Com efeito, estes anticorpos exprimem funcionalmente a sua energia de ligação inerente, como verdadeiras enzimas, para hidrolísar cataliticamente ésteres e amidas, e classicamente, como anticorpos, para se ligarem a antigénios.

Exemplos de moléculas de ligando análogo de imunização que contêm um análogo de um estado de transição hidrolitico são os representados pela fórmula:

• 0

II

RÍ-P-XR3

I or₂ onde X = 0 ou NH;

Ri

CH'

NHCOR4 onde R4 - (CH2) f-|CO2R 5

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-13e R 5 = Η o u l'

Rg - H ou alquilo inferior C1-C4; e

CH —

CH3 onde a linha ondulada indica ambos os isómeros estereoquimicos; e n é um número inteiro de 1 a 8, inclusivé.

As moléculas de ligando análogo, do estado de transição hidrolitico, são elas próprias ligandos, embora não sejam ligandos reactivos, e são também contempladas neste invento. Estas moléculas de ligando são de tamanho molecular relativamente pequeno e são, por consequência, ligadas, tipicamente, a uma molécula transportadora maior, quando utilizadas como imunogénios para induzir a produção de moléculas receptoras, ou são utilizadas sozinhas como moléculas inibidoras. Estas moléculas relativamente pequenas são geralmente designadas oomo haptenos. Estas moléculas de ligando análogo contêm também, tipicamente, um átomo ou um grupo de ligação, tal como um mercaptano reactivo, uma succinimida ou um outro grupo que proporcione um meio para ligar as moléculas de ligando análogo hapténicas aos transportadores, para utilizaçãp como imunogénios.

Exemplos de moléculas de ligando reagente, que correspondem estruturalmente às moléculas de ligando análogo anteriores, são as representadas pela fórmula:

R2-C-XR3 em que X, R| e R3 são descritos como anteriormente.

II

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-14As moléculas contendo sítios de combinação com anticorpos do presente invento são, elas próprias, receptores e proporcionam informação sobre as preferências conformacionais das interacções anticorpo-hapteno, através do estudo de modelos de reaotividade intramolecular de complexos receptor-ligando que são formados, entre as moléculas contendo sítios de combinação com anticorpos (receptores) e os ligandos de estruturas diferentes que contêm regiões epitópicas, idênticas ou similares.

É também contemplado um processo de preparação de moléculas de receptor monoclonal que >e ligam ao estado de transição hidrolitico de uma amida ou de um éster particular proporcionada anteriormente transição conjugado uma molécula de ligando descrita, contendo um hidrolitico, ligada a um imunogénico. □ conjugado análogo, análogo de transpor tador

Aqui, é hapténica, estado de oomo assim proporcionado um é

dissolvido ou disperso num diluente fisiologicamente tolerável para formar um inóculo. 0 inoculo é introduzido, por exemplo, por injecção num hospedeiro mamífero não humano, adequado, numa quantidade suficiente para induzir anticorpos para o ligando análogo hapténico.

Os anticorpos assim induzidos são colhidos. Os anticorpos colhidos são testados para avaliar a sua capacidade para se ligarem ao (imunorreagirem com) análogo ligando hapténico de imunização. As células produtoras de imunoglobulina, tais como as células do baço de um animal, cujos anticorpos se ligam ao ligando análogo hapténico de imunização, são recolhidas e fundidas com células de mielonria para formar células de hibridoma. As células de hibridoma são cultivadas num meio de cultura e o meio sobrenadante das culturas de células de hibridoma é testado em relaçao à presença de anticorpos que se ligam ao ligando análogo hapténico de imunização.

As células de hibridoma, cujo sobrenadante contém estes anticorpos de ligação, são então pesquisadas para determinar quais dessas células segregaram anticorpos que também hidrolisam o ligando substrato duma maneira estereospecifica. As células de hibridoma cujos anticorpos segregados se ligam ao imunogénio, se

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-15ligam a um ligando reagente e hidrolisarn um ligando reagente, são então clonadas para proporcionar os anticorpos monoclonais

desejados a	par tir	do sobrenadante	do meio de	cultura ou de
ascites de	um mamífero hospedeiro	no qual	o hibridoma é
introduzido.
□s anticorpos	monoclonais descr	i tos podem	ser utilizados

como receptores deste invento. Alternativamente, as porções, assim denominadas Fc ou Fc’, dos anticorpos, podem ser removidas, por exemplo, por clivagem enzimática para proporcionar um sítio de combinação com anticorpos (poliamida contendo idiotipo) que se liga ao ligando análogo hapténico de imunização, tal como uma porção de anticorpo Fab ou F(ab’)2, respectivamente .

□ presente invento tem vários benefícios e vantagens. Um destes benefícios é a preparação de receptores cujos requisitos topológicos de sitios de ligação são talhados para um ligando reagente particular a ser estudado, e que hidrolisarn uma ligação pré-seleccionada num- só isómero desse ligando.

Um outro beneficio do presente invento é a preparção de receptores que hidrolisarn o ligando amida ou éster num sitio predeterminado apenas num estereoisómero do ligando, e que exibem propriedades catalíticas.

Uma vantagem do invento reside no facto de, em virtude da estereospecificidade dos receptores que podem ser preparados, um ligando contendo uma pluralidade de ligações hidrolisáveis diferentes, tais como um polipéptido ou uma proteína, contendo ambos os residuos de aminoácidos D e L, poder ser hidrolisado numa ligação hidrolisável particular, pré-seleccionada.

Ainda uma outra vantagem do presente invento consiste em proporcionar receptores que podem remover selectivamente um grupo bloqueador apenas de um estereoisómero, numa mistura de isómeros, durante ou após a síntese, facilitando assim a recuperação ou o uso, respectivamente, de um estereoisómero desejado.

Ainda outros benefícios e vantagens do presente invento serão evidentes para os peritos na arte a partir da discussão que

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jrse segue.

Descrição DetalhadadoInvento

I Introdução presente invento refere-se ao processo de preparação de moléculas colectivamente designadas por receptores que são anticorpos e porções de poliamida contendo idiotipo (sitio de combinação com anticorpos ou paratópicos) induzidos por um análogo de um éster ou de uma amida de ácido carboxílico de ligando reagente, que mimetiza a estereoquímica e a conformação do estado de transição, na sequência reaccional para a hidrólise desse éster ou de uma amida de ligando reagente. Pensa-se que as moléculas de receptor (anticorpos e sítios de combinação com anticorpos) que se ligam a um estereoisómero do ligando análogo e a um estereoisómero do ligando reagente, estabilizam o estado de transição hidrolitico de uma porção pré-seleccionada do ligando reagente, e exibem assim propriedades catalíticas apenas para um estereoisómero do ligando reagente.

Os anticorpos e as enzimas são ambos proteínas cuja função depende da sua capacidade para ligar moléculas alvo especificas. As reacções enzimáticas diferem das reacções imunológicas pelo facto de, numa reacção enzimática, a ligação da enzima ao seu substrato conduzir tipicamente à catálise química, enquanto que um complexo não catalítico é o resultado usual da ligação anticorpo-antigénio.

Crê-se que as enzimas catalisam a hidrólise de proteínas por combinação com a proteina pará estabilizar o estado de transição da reacção de hidrólise. Considera-se, geralmente, que a velocidade de uma reacção enzimática é aumentada relativamente à velocidade de uma reacção não enzimática em virtude da capacidade da enzima para estabilizar o estado de transição da reacção; i.e., para reduzir a energia livre do estado de transição, e assim, a energia livre de activação, da reacção [Jencks, W.P., Adv. Enzymology, 43, 218 (1975) e Pauling, L., Amer. Scientist, 36, 58 (1948)]. 0 suporte para esta teoria resulta da observação de que as substâncias, que se pensa que constituem modelos dos

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-17supostos estados de transição estão muitas vezes fortemente ligadas às enzimas como inibidores competitivos. Leinhard, G., So ience. 180, 149 (1973) ε Wolfenden, R., Acc. Chem. Res.. 5, 10 (1972). Adicionalmente, crê-se que a enzima realiza esta diminuição da energia livre de reacção ligando-se mais fortemente à geometria do estado de transição do reagente do que se liga ao(s) substrato(s) ou ao(s) produto(s) correspondentes.

Isto significa que a energia de ligação intrínseca da enzima é muito superior à que pode ser medida a partir da ligação de substratos ou de produtos. A energia de ligação da enzima é utilizada, essencialmente, para realizar a reacção química [Jencks, W.P., XVII International.....Solvay Conferenoe (Novembro de

1983)].

A proposição inversa é a de que um anticorpo que é preparado para se ligar optimamente a um análogo, adequado, de um estado de transição podia funcionar como um catalisador. A demonstração deste resultado por Lerner e colaboradores e por Schultz e colaboradores, nas referências previamente citadas, completa a correlação entre a função da enzima e a estrutura do anticorpo, e proporciona uma abordagem útil na concepção de enzimas artificiais.

A ideia básica que está por de trás da hidrólise imunológica aqui descrita contempla a utilização de ligandos análogos na preparação de anticorpos de especificidade predetermi nada que se ligam, preferencialmente e deste modo estabilizam o estado de transição de uma hidrólise de ligação éster ou amida, após ligação ao ligando reagente 'especificado. Um ligando análogo simula a conformação de um estado de transição de energia elevada na hidrólise,para induzir a produção de anticorpos tendo a capacidade de se ligarem a substratos relacionados e estabilizar as suas hidrólises.

Esta ligação estabilização preferencial resulta numa redução na energia de activação para a reacção satisfazendo assim um dos critérios da catálise, que exibem esta propriedade podem ser obtidos por de hidrólise,

Os anticorpos imunização com

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-18análogos sintéticos que são quimicamente assemelharem às caracteristicas de ligação de substrato, submetido a hidrólise de imunização com análogos de estado de particular.

modificados para se de um ligando reagente ligação; i.e., por transição da reacção

Adicionalmente, uma molécula de receptor do presente invento liga-se também e hidrolisa um estereoisómero de um par de estereoisõmeros de moléculas de ligando reagente idênticas. Assim, quando o ligando reagente è enantiomérico, apenas um dos enantiómeros é hidrolisado. Similarmente, quando o ligando reagente existe em ambas as formas ç_i_s e trans, apenas um destes isómeros é hidrolisado.

Atendendo a que uma molécula de receptor deste invento exibe estereospecificidade, tanto o ligando análogo como o ligando reagente, contêm, pelo menos, um átomo de carbono que pode existir em duas formas estereoisoméricas; i.e., um centro estereoisomérico. 0 centro estereoisomérico está localizado em cada uma das moléculas de ligando análogo e de ligando reagente nas mesmas posições, relativamente aos outros átomos nas moléculas análogas. Assim, se o centro estereoisomérico está localizado numa cadeia, a quatro átomos de distância do átomo de fósforo na porção ácida do ligando análogo, o centro estereoisomérico está localizado numa cadeia a quatro átomos de distância do carbono de carbonilo cindivel do ligando reagente.

É de notar que uma molécula de ligando análogo e/ou uma molécula de ligando reagente podem conter mais do que um centro estereoisomérico. 0 facto de um segundo, terceiro ou outro destes centros estarem localizados a uma distância do carbono de carbonilo cindivel (ou do átomo de fósforo) tal que não são ligados por uma molécula de receptor, não é aqui relevante. Contudo, quando estes se encontram suficientemente perto para serem ligados pela molécula de receptor, qualquer outro centro estereoisomérico produz estereoisõmeros adicionais. 0 número destes isómeros é determinado pela equação: número = 2ⁿ, onde n é o número de centros estereoisoméricos.

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-19No caso de existir apenas um centro estereoisomérico, este pode estar em qualquer uma das porções de áoido carboxílico ou álcool ou amina do ligando reagente e do ligando análogo, de éster ou amida. Se está presente mais do que um centro, nas moléculas de ligando reagente e de ligando análogo, essa pluralidade de centros estereoisoméricos pode estar distribuída de uma qualquer forma desejada, perto do átomo de carbono de carbonilo cindivsl (ou átomo de fósforo central).

estereoisomerismo proporcionado pelo átomo tetraédrico central não é aqui considerado.

Qualquer de fósforo

Uma molécula de receptor do presente invento distingue e catalisa, estereoselectivamente, a hidrólise de pelo menos una de um par de moléculas estereoisoméricas de ligando reagente que estão presentes numa mistura de pares estereoisoméricos ou como um par separado de moléculas de ligando reagente. Mais preferirsceptor hidrólise velmen te uma molécula de estereoselectivamen te distingue e de apenas catalisa, um dos estereoisómeros da molécula de ligando reagente.

A estereoselectividade anterior, da hidrólise catalítica presume que o local de estereoisomerismo, estereoisomérico, esteja presente, no ligando suficientemente perto da ligação a ser hidrolisada (o carbono de carbonilo cindivil), de modo a que o centro estereoisomérico seja ligado pela molécula contendo sitios de combinação com anticorpos, catalíticos, e assim, a molécula de receptor liga-se a um só estereoisómero e ao mesmo estereoisómero (R ou S) do ligando reagente e do ligando análogo. 0 local da ligação a ser hidrolisada é determinado pelá localização do átomo de fósforo do ligando análogo (e do carbono de carbonilo cindivel análogo,do ligando reagente) e pelo tamanho de um sitio de combinação com anticorpos. Considera-se que um sitio de combinação com anticorpos é normalmente capaz de acomodar cerca de cinco a cerca de sete resíduos de aminoácido.

o centro reagente, centro estereoisomérico localiza-se dentro do volume ocupado por um a cerca de quatro resíduos aminoácidos (um comprimento de cadeia de cerca de 12 átomos), e mais

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-20preferivelmente, por um a cerca de dois resíduos aminoácidos (um comprimento de cadeia de cerca de 6 átomos) em qualquer dos lados do átomo de fósforo do ligando análogo (carbono de carbonilo cindivel do ligando reagente). Assim, o centro estereoisomérico pode estar na porção de áoido carboxílico ou na porção amina ou álcool do carbono carbonilo cindivel do ligando reagente de amida ou de éster de ácido carboxílico. No exemplo de éster estereoisomérico aqui utilizado, o centro estereoisomérico está localizado na porção álcool da molécula.

Esta distância pode ser facilmente determinada por utilização de modelos de enchimento de espaço, ou, quando houver dúvida, por simples determinação se um receptor catalítico pode ou não resolver ou separar os estereoisómeros de um ligando análogo. Claro que o ensaio final consistirá em saber se a molécula de receptor , catalítica, hidrolisa um isómero e não o outro.

Deve entender-se que, no que se refere aos isómeros geométricos, o centro estereoisomérico não é um átomo único, como é o caso dos enantiómeros. De preferência, esse centro está presente perto de um grupo de átomos cujo número é governado pelo número de átomos requeridos para definir os isómeros cis/trans. Contudo, para facilidade de expressão, um centro estereoisomérico será aqui designado como se ele fosse um átomo único tal como um átomo quiral onde estão envolvidos os enantiómeros.

Como já se observou, o ligando análogo e o ligando reagente são um de um par de estereoisómeros. Esses estereoisómeros podem ser isómeros geométricos ou isómeros ópticos; i. e., enantiómeros. Os isómeros geométricos são isómeros cis/trans tais como os que se encontram nas moléculas cíclicas ou quando estão presentes ligações duplas. Os isómeros ópticos são pares D,L ou R,S de enantiómeros nos quais o centro estereoisomérico é chamado centro quiral uma vez que o átomo de carbono daquele centro é um átomo de carbono quiral.

Nuiti exemplo de reacção catalítica, que em seguida se descreve, os estereoisómeros de ligando reagente são um par

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-21enantiomérico, R,S. Embora o ligando análogo utilizado neste estudo exemplar incluísse ambos os enantiómeros e induzisse a produção de moléculas de receptor que hidrolisarem estereoselectivamente, quer a forma R, quer a forma S do ligando reagente, deve entender-se que apenas um dos ligandos análogos enantioméricos pode ser usado para induzir a produção de um só dos ligandos reagentes enantioméricos.

mecanismo pelo qual um anticorpo hidrolisa uma ligação éster ou amida de um ligando reagente, ligado, pode ser idealizado em termos de um modelo de ajuste induzido. À medida que o substrato frouxamente ligado se deforma ou rearranja para se adaptar à geometria de ligação do anticorpo, a tensão pode ser atenuada por reorganização quimica de uma ligação éster ou amida, predetermi nada, única, de modo a que esta reorganização conduza ã hidrólise da ligação.

termo receptor é aqui utilizado para designar uma molécula biologicamente activa que se liga a um ligando reagente, ligando inibidor, ou ligando análogo. As moléculas de receptor do presente invento são anticorpos, anticorpos substancíalmente intactos ou porções de poliamida contendo o i dio t ipo de um an ticorpo.

A actividade biológica de uma molécula de receptor é evidenciada pela ligação do receptor ao seu ligando reagente, ligando inibidor ou ligando análogo, antigénico, após a sua mistura num meio aquoso, pelo menos a valores fisiológicos de pH e de força iónica. De preferência, os receptores ligam-se também a um ligando antigénico dentro de um intervalo de valores de pH de cerca de 5 a cerca de 9, e a forças iónicas compreendidas entre a da água destilada e uma força iónica próxima da de uma solução de cloreto de sódio um molar.

As porções de poliamida contendo idiotipo (sítios de combinação com anticorpos) dos anticorpos são aquelas porções de moléculas de anticorpos que incluem o idiotipo, e que se ligam ao ligando· ou ligando análogo. Estas porções incluem os fragmentos Fab, Fab’ e F(ab’)2 preparados a partir de anticorpos, por

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-22técnicas de clivagem enzimática bem conhecidas. Ver, por exemplo, geralmente, patente dos E.U.A. N2. 4 342 566 de Theofilopoulos e Dixon, e especificamente, Pollack et__a_L· Γ Science. 234, 1570 (1987)] que descrevem que as velocidades hidroliticas aceleradas para os fragmentos Fab foram as mesmas do que as da Ig nativa. Devido ao facto de os anticorpos,a partir dos quais se contêm as poliamidas contendo idiotipo, serem descritos como sendo cultivados contra, ou induzidos por, imunogénios, os receptores de poliamida contendo idiotipo (contendo sítios de combinação com anticorpos) são aqui referidos como sendo cultivados ou induzidos com o pressuposto de que, tipicamente, se requer um passo de clivagem para se obter uma poliamida, contendo idiotipo, a partir de um anticorpo. Contudo, preferem-se anticorpos intactos e estes são utilizados como ilustrativos das moléculas de receptor deste invento.

□s receptores úteis no presente invento são anticorpos monoclonais. Um anticorpo monoclonal é um receptor produzido por clones de uma única célula, denominada um hibridoma, que segrega apenas um tipo de molécula de receptor. A célula de hibridoma resulta da fusão de uma célula produtora de anticorpos e de uma célula de mieloma ou de outra linha de células auto-perpetuante.

As técnicas para a preparação de anticorpos monoclonais do presente invento são bem conhecidas. Estes receptores foram primeiramente descritos por kohler e Milstein, em Nature, 256,

495 (1975), que é aqui incorporado como referência. Os anticorpos monoclonais são obtidos, tipicamente, a partir de culturas de tecidos de hibridbma ou a partir de fluidos ascíticos, obtidos a partir de mamíferos nos quais foi introduzido o tecido de hibridoma. Descrevem-se aqui ambos os processos.

Um 1 imunorreage anticorpos tipos de li é utilizado de receptor igando é aqui definido com, ou se liga, a um da molécula de receptor.

como uma molécula que sitio de combinação com São aqui contemplados dois gandos. Um primeiro é designado por ligando análogo e como imunogénio, para induzir a produção de moléculas , e como inibidor da reacção catalisada por moléculas

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-23de receptor. 0 ligando análogo é substancialmente inerte para sofrer a reacção catalisada. 0 segundo é designado por ligando reagente, ou substrato de ligando reagente, e é a molécula que é submetida à reacção catalisada.

Como aqui se descreve, sintetizam-se análogos químicos, dos ligandos de éster ou de amida, que incorporam grupos fosfonamidato ou fosfonato em sitios predeterminados, específicos, para mimetizar a conformação do estado de transição de hidrólise de uma ligação éster ou amida. Estes análogos são candidatos adequados para esta investigação' porque se sabe que os fosfonamidatos têm sido usados como análogos de estado de transição na inibição de enzimas proteoliticas [Bartlett, et al.. Biochemistry, 22, 4613 (1983)].

As cadeias polipeptidicas pequenas podem induzir a produção de anticorpos que reconhecem e que se ligam a uma proteína homóloga num sítio especifico predeterminado. 0 presente invento adiciona ao trabalho anterior com polipéptidos um avanço importante. No presente invento, os anticorpos (receptores) são por um estereoisómero de uma primeira molécula de imunização (o ligando análogo), e reconhecem e não só a essa primeira molécula, mas também a um de uma segunda molécula relacionada (o ligando induz idos hap ténica 1i gam-se estereoisóinero reagen te). provoca a

Na ligação hidrólise (a dessa segunda molécula, o receptor qual, como aqui se demonstra, é catalítica) de uma ligação amida ou éster, pré-seleccionada, que corresponde, em topologia, à topologia da primeira molécula hapténica de imunização. A correspondência em topologia i.e., dimensão, forma, estereoquimica e carga, proporciona um meio para a pré-selecção do sitio no qual ocorre a hidrólise do ligando. Os ligandos inibidores que se assemelham, em estrutura, a um ligando análogo ou a um ligando reagente, ligam-se também pelas moléculas de receptor.

Consequentemente, por síntese de um' ligando análogo, hapténico, de imunização, relativamente pequeno, pode-se induzir a produção de moléculas de receptor que reconhecem, se ligam e clivam, cataiiticamente, uma ligação amida ou éster numa outra

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-24molécula, que pode conter uma pluralidade de ligações éster ou amida. Assim, pode preparar-se um receptor que provoca, estereoselectivamente, a hidrólise de uma ligação amida predeterminada, seleccionada, de uma proteína ou polipéptido tal oomo a construída por

Similarmente.

proteína de fusão, anteriormente referida receptor que hidrolisa, estereospecifica ligação éster predeterminada, seleccionada ou de uma molécula de gordura.

engenharia genética, pode-se preparar um cataiiticamente, uma de um composto modelo

A implicação deste resultado consiste no facto de se poder conferir a actividade de proteases e lipases, até agora desconhecidas, a imunoglobulinas. Adicionalmente, a actividade do anticorpo pode ser dirigida, conforme desejado, para qualquer sitio predeterminado por designação da ligação éster ou amida a ser clivada, com a configuração do fosfonamidato ou do fosfonato no ligando análogo hapténico utilizado de para imunização.

Assim, os anticorpos e as porções de poliamida, contendo idiotipo, de anticorpos são induzidos por uma molécula hapténica do estado ds transição hidrolitico de ligando análogo, de amida ou éster. A molécula hapténica contém um átomo de fósforo ou de si 1icio,central, ligado tetraedricamente, ligado directamente (a) a um átomo de carbono da porção ácido carboxílico da amida ou do éster análogos, (b) a dois átomos de oxigénio e (c) a um terceiro átomo de oxigénio ou a um átomo de azoto, estando o terceiro átomo de oxigénio ou o átomo de azoto ligados a um átomo de carbono (o carbono alfa) da porção álcool ou amina de um éster ou de uma amida análogos do ligando.

. Estado de Transição da Es terólise e Concepção do_Hapteno (Ligando Análogo)

A concepção do ligando análogo deriva da estrutura do produto a ser formado através do estado de transição para a formação da ligação a ser mimetizada e, depois, do ligando análogo. As reacções que envolvem a hidrólise de amida ou de éster constituem exemplos ilustrativos do conceito geral e são aqui utilizadas como exemplos para uma reacção de hidrólise de um

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-25éster ou de uma amida.

neste estado de transição, W. P. Jencks, Catalysis in

Os processos de transacilação são caracterizados por mecanismos de adição-eliminação no carbonilo. 0 grupo acilo pode, por consequência, possuir, vários graus de carácter tetraédrico.

Chemistry and Enzymology, ch. 10, (McGraw-Hi11, New York, 1969).

Podia-se esperar que as enzimas que catalisam as reacções de transacilação se ligassem bem aos análogos do ligando reagente com uma configuração tetraédrica no centro acilo. Isto é verdade para as serina-proteases onde se forma, temporariamente, uma ligação covalente entre o ligando (substrato) e a enzima [Westerik et al., J. Biol. Chem., 247, 8195 (1972); R.C.

Thompson, Biochemistry, 12, 47 (1973) e Imperaii et____al . .

Biochemistry, 25, 3760 (1986)], assim como para enzimas que catalisam a hidratação directa de amidas ou ésteres. A última categoria é inibida por compostos com uma configuração te traédr ica incluindo um grupo fosfato, fosfonato fosfonamidato em vez da unidade de amida cindivil [Weaver et al . ,

Jtio 1 · Biol . , 114, 119 (1977) e Jacobsen et_a 1 . , J_.___Am.___Chem .

Soc.;.., 103, 654 (1981)].

As substâncias de ocorrência natural e as substâncias sintéticas contendo fósforo têm sido estudadas como inibidores de metalopeptidases. Nessas enzimas, o estado de transição parecia conter a amida hidratada na esfera de coordenação do ião metálico [W. N. Lipscomb, Acc.___Chem. Res. , 15. 232 (1982)]. Uma imagem completa de um análogo do estado de transição podia então ter o grupo fosfono de um inibidor como ligando de um ião metálico ou de qualquer outro sitio polarizante [Weaver et al . , J. Nol .

Biol. , 114, 119 (1977) e Christianson et a 1. . J .__Am. Chem, Soc. ,

108, 545 (1986)]. Contudo, o papel dos iões metálicos nas metalopeptidases não é claramente compreendido. Pode ter uma função múltipla na hidrólise de amida, na qual os passos de transferência de protão entre os intermediários tetraédricos podem ser limitadores da velocidade [L. 1*1. Sayre, J_.___Am. Chem.

Soc., 108, 1632 (1986)].

ou

A hidrólise de ésteres de ácidos carboxilicos é um exemplo

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mais simples de transacilação que deve também ser abordada pelo análogo do estado de transição contendo fosfonato. A ligação do grupo fosfonato carregado pode definir uma interacção estabi1izante no estado de transição que conduz à catálise. As reacções de hidrólise de éster ocorrem, geralmente, a velocidades espontâneas convenientes, sob condições ambientais que são adequadas para os anticorpos. Por consequência, qualquer pequena aceleração na velocidade pode ser, facilmente, detectada.

As estruturas dos ligandos análogos e dos ligandos reagentes para esta investigação foram seleccionadas de acordo com certos critérios. Estes incluíram a disponibilidade e a estabilidade dos precursores de organofósforo, do substrato de ácido carboxílico correspondente, da conveniência da sintese química para a sua preparação e da capacidade de adaptação aos diversos esquemas para apresentação imunológica.

Uma.unidade molecular básica que possui as caracteristicas necessárias para a hidrólise catalítica, estereoselectiva, é o análogo de éster do ácido fenilacético substituído (Composto F) que é representado pela Fórmula I, seguinte.

II

HOOCCH CH CH -C-Í\JH

O-CHCH, composto de Fórmula I, Composto F, é o ligando análogo aqui utilizado para produzir receptores do presente invento. 0 Composto F è mostrado na sua forma, antes do acoplamento a um transportador antigénico, para imunização. Será de notar que o Composto F existe na forma de uma modificação racémica, com o seu centro estereoisomérico sendo identificado por um asterisco (*), sobre o carbono do metino, indicando que são possíveis duas estruturas estereoisoméricas (R e S).

Pela inclusão de um substituinte amino quer no ácido, quer nas porções amina ou álcool do ligando análogo, tal como na

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-27porção ácida do Composto F, pode-se dotar o ligando análogo de um apêndice funcional para acoplamento a uma proteína transportadora antigénica (imunogénica). Um tal apêndice adicionado é útil quando o ligando análogo é um hapteno. 0 apêndice e os átomos ligantes acompanhantes podem também estar presentes no ligando reagente, particularmente, quando o ligando reagente é relativamente pequeno, de modo que o sítio de combinação com anticorpos possa ser relativamente preenchido com o ligando.

Deste modo, o presente invento refere-se, geralmente, a receptores monoclonais que são capazes de hidrolisar cataliticamente uma ligação éster ou amida, pré-seleccionada, de um estereoisómero de um ligando reagente. Os receptores contêm um sitio de combinação com anticorpos que se liga: (a) a um estereoisómero de um ligando reagente que pode formar o estado de transição, hidrolítico, tetraédrico, de uma ligação amida ou éster do reagente, pré-seleccionada; i.e., contém uma ligação éster ou amida de ácido carboxílico pré-seleccionada, e ( b) a um estereoisómero de um ligando análogo, que é estereoquimicamente análogo ao ligando reagente e que tem um átomo de fósforo ligado tetraedricamente, localizado na posição ocupada pelo átomo de carbono de grupo carbonilo cindivil da pré-seleccionada, do ligando reagente, ligado tetraedricamente, está ligado directamente:

ligação éster ou amida, 0 átomo de fósforo.

(i) a um átomo de carbono (o carbono alfa) da porção ácida do éster ou amida de ligando reagente análogo, que está incluído numa cadeia que contém pelo menos 5 átomos, mais preferivelmente, pelo menos 15 átomos, e, muito preferivelmente, pelo menos 15 átomos e incluindo um grupo fenilo substituído;

(ii) a dois átomos de oxigénio, um dos quais estã ligado ao átomo de fósforo por uma ligação dupla, pela qual o oxigénio é um radical oxo, e o outro dos dois átomos de oxigénio está ligado singularmente ao fósforo e ligado singularmente a um radical seleccionado de entre o grupo constituído por hidrogénio e alquilo inferior C1-C4;

//

		/ C - '	• ~ : V’ 1
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	-28-
(111)	a um terceiro átomo de oxigénio ou a um átomo de	azo to
	que está ligado a um átomo de carbono da	amida	ou do

éster análogos; i.e., ao carbono alfa da porção álcool ou amina do éster ou da amida, que é uma porção de uma cadeia que contém pelo menos 5 átomos, mais preferivelmente, pelo menos 15 átomos, e, muito preferivelmente, pelo menos 15 átomos e inclui um grupo fenilo substituído.

Quando o ligando reagente é uma amida ou um éster cíclico, não há porções de ácido e de amina ou álcool distintas, da molécula. Contudo, os peritos em química orgânica compreenderão que as amidas e os ésteres têm de, por definição, conter porções ácido e amina ou álcool. Assim, pode conceber-se uma linha imaginária de demarcação para estas moléculas que inclui, pelo menos, o carbono de carbonilo e o seu carbono alfa, ligado directamente, na porção ácida da molécula, e que inclui o grupo amino ou hidroxilo e o seu carbono alfa, ligado directamente, na porção amina ou hidroxilo da molécula. Estes compostos cíclicos incluem também, evidentemente, um centro estereoisomérico que está incluído na porção de ligando reagente que está ligada á molécula de receptor, catalítica.

Numa outra concretização, o presente invento refere-se a um processo estereoselectivo para hidrolisar, ca taliticamente, uma ligação éster ou amida, pré-seleccionada, na molécula de ligando reagente. 0 processo compreende os passos de: (a) mistura de uma quantidade ca taliticamente eficaz de um dos receptores anteriores com moléculas de ligando reagente que contêm um centro estereoisomérico, num meio aquoso; e (b) manutenção da mistura durante um periodo de tempo suficiente para as moléculas de ligando se ligarem aos receptores e para as moléculas de receptor hidrolisarem a ligação pré-selsccionada de um dos estereoisómeros possíveis do ligando reagente. Os produtos dessa hidrólise podem ser recuperado, subsequentemente, se desejado. Deve ser entendido que se usa urn ligando reagente que tem a mesma estereo-configuração do que a do ligando análogo utilizado para induzir as moléculas de receptor. Pode-se usar um par estereoisomérico

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-29de ligandos reagentes, ainda que apenas um dos estereoisómeros reaja.

Um processo hidrolitico do presente invento utiliza um meio aquoso como parte da mistura reaccional. Esse meio contém, tipicamente, água e sais tampão. Adicionalmente, o meio pode conter outros sais tais como cloreto de sódio, assim como sais de magnésio e de cálcio solúveis em água tais como os que se encontram, frequentemente, em meios contendo proteinas. Podem também estar presentes solventes orgânicos tais como metanol, etanol. acetonitrilo, dimetilsulfóxido, dioxano, hexameti1fosforamida e N,N-dimeti 1formamida. Podem também estar presentes agentes tensio-activos que emulsionam o ligando reagente e a molécula de receptor.

ingredientes presentes no meio

A característica critica dos aquoso é a de que esses ingredientes não interfiram substancialmente com, ou inibam.

reacção catalítica tal molécula de receptor.

como, por exemplo, por desnaturação da Adicionalmente, o meio aquoso está substancialmente isento de sale proteinas,em geral e de enzimas, em especial, que inibem a reacção de quebra de ligação catalisada pela molécula de receptor.

meio aquoso tem, tipicamente, um valor de pH de cerca de 5 a cerca de 9, e, de preferência, um pH de cerca de 6,0 a cerca de

8,0.

desde

Podem-se também usar valores de pH superiores e inferiores que reacçao ca talisada nao seja de novo.

substancialmente, prejudicada ou inibida.

Tipicamente, as reacções catalíticas são realizadas à temperatura ambiente; i.e., a uma temperatura de cerca de 20 a cerca de 25 graus C, ou a 37 graus C, e a uma pressão atmosférica ambiente; i.e., a cerca de uma atmosfera. Contudo, podem também ser usadas temperaturas mais baixas, até próximo do ponto de congelação do meio aquoso e mais elevadas, até próximo do ponto de ebulição do meio, à pressão atmosférica. Como é sabido, as proteinas, tais como a molécula de receptor, tendem a desnaturar a temperaturas elevadas tais como a temperatura de ebulição de um meio aquoso, por exemplo, a cerca de 100 graus C, e assim preferem-se temperaturas inferiores a cerca de 40 graus C. Como

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-30é também bem conhecido, as reacções que seguem expressões de cinética multimolecular diminuem de velocidade com as diminuições de temperatura. Assim, prefere-se uma temperatura mínima de cerca de 15 graus.

ligando reagente está presente numa mistura reaccional numa quantidade até à sua solubilidade no meio aquoso. Pode-se também usar um sistema de duas fases que inclui o ligando reagente insolúvel, mas este sistema não é, normalmente, tão utilizado. As concentrações, normalmente usadas, de ligando reagente estão compreendidas entre cerca de 0,1 micromolar (μ,Μ) e cerca de 10 milimolar (mM), com essa quantidade sendo também função da solubilidade do ligando reagente no meio solvente.

Quando se deseja o produto per_________se, usam-se concentrações relativamente mais elevadas, quando comparadas com as concentrações mais baixas usadas quando se pretendem estudar os mecanismos de reacção ou a cinética de reacção.

Está também presente uma quantidade eficaz de molécula de receptor. Tipicamente, essa quantidade eficaz é uma quantidade catalítica; i.e., o receptor é usado numa razão molar, para ligando reagente, de cerca de 1:2 a cerca 1:10 000, preferindo-se uma razão molar de cerca de 1:10 a cerca de 1:100. A razão de molécula de receptor para ligando reagente depende, tipicamente, da actividade específica da molécula de receptor, em relação ao ligando reagente, e da finalidade do utilizador ao realizar a reacção. Assim, quando se deseja obter o produto, usa-se uma concentração relativamente mais elevada da receptor e uma razão mais elevada de receptor para ligando reagente. Quando se estão a estudar o mecanismo de reacção ou a cinética da reacção, usam-se, tipicamente, uma concentração e uma razão mais baixas. Pode-se também usar uma quantidade estequiométrica de receptor, ou inferior, mas uma vez que o receptor é uma molécula catalítica, a utilização mesmo de uma quantidade estequiométrica, pode ser inútil. Assim, usa-se, pelo menos, uma quantidade catalítica do receptor.

A mistura receptor e de formada a partir ligando reagente, da mistura de moléculas de num meio aquoso, é mantida

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-31durants urn período de tempo suficiente para que a ligação e as reacções estereospecificas ocorram. A duração desse período de manutenção é uma função de vários parâmetros, incluindo o receptor ε o ligando reagente seleccionados, as suas concentrações, o valor de pH e a temperatura, e bem como o que se pretende ao realizar a reacção.

Assim, quando se realizam estudos de cinética, usam-se, frequentemente, tempos de manutenção de minutos a horas. Quando se desejam qs produtos de reacção, são mais usuais tempos de manutenção de horas a dias.

III. Resultados

Usou-se o composto enantiomérico F, ligado covalentemente a KLH, como conjugado imunogénico para imunizar ratinhos. Prepararam-se hibridomas usando células de baço de um animal imunizado.

Preparam-se doze hibridomas cujos anticorpos monoclonais segregados (receptores) ligados ao Composto F se acoplaram a BSA num ensaio ELISA. Cada uma dessas interacções de ligação foi inibida por pré-incubação do receptor com Composto F livre, em solução, indicando assim que as ligações ELISA observadas foram especificas para o ligando análogo, hapténico, ligado.

Desses doze anticorpos monoclonais, os oito receptores monoclonais a seguir enumerados foram capazes de hidrolísar cataliticamente o ligando reagente de éster enantiomérico exemplar, Composto H (R,S). Desses oito receptores catalíticos, dois catalisaram a hidrólise , apenas do ligando reagente S(-), Composto H [S(-)], enquanto que os outros seis catalisaram a hidrólise apenas do ligando reagente R( + ), Composto H [R(+) ]. Descrevern-se aqui depois as condições especificas utilizadas para essas hidrólises estereoselectivas.

Deve realçar-se que as moléculas de receptor que hidrolisaram um enantiómero não catalisaram a hidrólise do outro enantiómero. É também de realçar que não se encontrou nenhum receptor que catalisasse a hidrólise de ambos os enantiómeros R(+) e S(-) do Composto H.

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SCRF 123.2 PORTUGAL 'Λ

-jz~

Descrevem-se aqui as estruturas dos como dos intermediários envolvidos conjuntamente com uma discussão das várias compostos F nas suas e Η, bem sínteses, sínteses envolvidas.

Crê-se que as hidrólises catalíticas estereoselectivas antsriormente descritas são as primeiras reacções deste tipo a serem descritas. Adicionalmente, crê-se que esta é a primeira descrição da preparação de moléculas de receptor, contendo sítios de combinação com anticorpos, que podem catalisar estereoselectivamente uma reacção de cada um dos membros separados de um par de estereoisomeros; no presente caso, enantiómeros. Assim, as referências anteriormente citadas de Napper et al., Science, 237=1041 (1987) e Hilvert et al. , Proc.

Na tl............ Acad . _ Sc i __________USA , 85 = 4953 (1988) descrevem ambas, a preparação de moléculas de receptor que catalisam uma reacção de apenas uma das duas moléculas de substrato, estereoisoméricas.

Os resultados que aqui se descrevem complementam deste modo os resultados dos dois pedidos de patente originais e do artigo de Napper et al. , anteriormente citados. Essa complementar idade é observada na hidrólise estereoselectiva quando comparada com a sintese anteriormente descrita, e também na obtenção de moléculas de receptor, individuais, capazes de catalisar uma reacção de cada um dos estereoisómeros do ligando reagente.

Iniciaram-se estudos da cinética das reacções hidrolíticas. Os resultados iniciais indicam que a hidrólise é relativamente rápida e que há alguma inibição do 'produto provocada pelo produto ácido da molécula de ligando reagente.

IV. Preparaçãode L i g a n d o sAnálogos e de Ligandos

É ds notar que as sínteses que a seguir se descrevem referem-se apenas a um éster carboxílico como ligando reagente e a um fosfonato como ligando análogo. Contudo, estas sínteses podem ser facilmente adaptadas para a preparação de diferentes compostos de fosfonato e de éster, por simples substituições dos reagentes. Os ligandos reagentes de amida de ácido carboxílico e os ligandos análogos de fosfonamida podem também ser facilmente

S7

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-33preparados por procedimentos análogos aos que se descrevem usando reagentes apropriados em vez dos aqui usados.

f₃c -C-NH

ch₂-p0-CH₂CH₃

0-CH₂CH₃

A uma solução agitada de 4-aminobenzilfosfonato de dietilo (0.74 g, 3,04 mM) em 5 ml de cloreto de metileno (recentemente destilado sobre hidreto de cálcio) adicionou-se piridina (0,32 ml, 4 mM) . A mistura foi arrefecida a 4 graus C e a solução adicionou-se, gota-a-gota, sob agitação anidrido trifluoroacético (0,5 ml, 3,54 mM) durante um periodo de 5 minutos. Continuou-se a agitação durante 15 minutos enquanto se deixava aquecer a solução até à temperatura ambiente (cerca de 23 graus C). 0 fim da reacção foi indicado por cromatografia de camada fina usando uma mistura 1:1 de cloreto de metileno (CH2CI2) e de acetato de etilo (ETOAc) como o eluente (Rf 0,2).

Subsequentemente, diluiu-se a solução com 50 ml de acetato de etilo. A solução orgânica foi lavada duas vezes com porções sucessivas de 25 ml de HC1 0,5 M e secou-se depois sobre sulfato de magnésio anidro. Por evaporação obteve-se um óleo amarelo que foi purificado por cromatografia flash em silica gel, utilizando uma mistura 1:1 de cloreto de metileno e de acetato de etilo,como eluente. Obteve-sé o fosfonato (Composto A) (0,877 g, forma de um material cristalino rendimento i noolor.

por cento) na

RMN do protão em CDCI3 padrão interno):

a TMS como 1H), 7,53

100 MHZ (relativamente delta 10,61 (singuleto largo, (dupleto, J = 8,22 Hz, 2H), 7,17 (dupleto duplo, J = 8,67 Hz e 2,5

Hz, 2H), 4,02 (P, J-7,18 Hz, 2(2H)), 3,10 (dupleto, J=21,62, Hz,

2H) e 1,26 (tripleto, J = 7,05 Hz, 2(3H).

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-34CompostoB

F₃C-C-NH

ch₂-p>

O-CH₃ o-ch₃

A um balão de fundo redondo contendo 0,2 g (5,88 x 10 moles) de Composto A em 2 ml de diclorometano (CH2CI2) recentemente destilado, seco, adicionaram-se 0,8 ml de brometo de tr ime t i lsi 1 i lo (TMSBr; 5,9 x 10 ‘^J moles). A mistura resultante foi agitada, a uma temperatura de 402C , durante um periodo de 3 horas.

Subsequentemente, o solvente foi removido obtendo-se um sólido branco. Esse sólido foi tratado com uma solução de 5¾ de água em éter etílico (v/v), que dissolveu o sólido. Após permanecer em repouso, formou-se um sólido branco adicional, identificado como ácido fosfónico, que foi recolhido e seco, e que pesava 0,1274 g. A análise por crornatografia de camada fina (tlc) em silica gel com CH2CI2/ETOAC (1:1, v:v) indicou que o ácido fosfónico estava puro.

ácido fosfónico (0,1221 g) foi dissolvido em metanol e adicionou-se diazometano. Após esperar que a reacção ocorresse, adicionou-se uma resina de permuta catiónica (forma de protão), em pequenas quantidades, até a cor amarela desaparecer da solução. Removeu-se o solvente, adicionou-se CH2CI2 para dissolver o Composto B, e a solução resultante foi filtrda para remover as pérolas de resina. □ solvente foi depois removido obtendo-se 0,1284 g de Composto B (rendimento 95¾).

A cromatografia de camada fina, como anteriormente, mostrou um único produto.

RMN do protão em CDCI3 a 100 MHz (relativamente a TMS como padrão -interno: delta 8,78 (singuleto largo, 1H), 7,42 (multipleto, 4H), 3,7 (dupleto, J = ll Hz, 6H), 3,17 (dupleto, J = 20

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-35Hz, 2H).

Composto.....C

Colocou-se o Composto B (0,50 g; 1,6 x 10 moles), num balão de fundo redondo, com 4 ml de clorofórmio seco ao qual se adicionou um equivalente de PCI5 (0,034 g). A solução resultante foi aquecida a uma temperatura de 452C com agitação. Após uma hora, por tlc (como anteriormente) verificou-se que a reacção estava cerca de 95 por cento completa. Foi adicionado mais meio equivalente de PCI5, e continuou-se a reacção durante mais uma hora, periodo após o qual se verificou, por tlc, que a reacção estava completa.

Subsequentemente, fez-se borbulhar dióxido de enxofre na solução. 0 solvente e os voláteis foram então removidos e o residuo foi lavado com éter etílico e seco sob pressão reduzida. 0 Composto C foi recolhido numa quantidade de 0,0255 g.

RMN do protão padrão interno): (multipleto , 4H ),

J = 20 Hz, 2H) .

em CDCI3 a 100 delta 8,5

3,86 (dupleto,

MHz (relativamente a TMS como (singuleto largo, 1H), 7,42

J = 14 Hz, 3H), 3,55 (dupleto,

Composto D

Dissolveu-se uma mistura racémica do álcool sec-fenetílico ζ/ 'τ-·: .-ÍTST'

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-36(álcool alfametilbenzί1ico) (0.152 ml; 12,66 x 10~⁴ moles) em tetra-hidrofurano (THF) seco. Á solução adicionou-se hidreto de -4 sódio (0,038 g; 15,83 x 10 moles) e aqueoeu-se a mistura resultante ao refluxo durante um período de 2 horas. Após arrefeoimento da mistura até á temperatura ambiente, adicionaram-4

-se, à mistura arrefecida 0,10 g (3,165 x 10 moles) de Composto C e agitou-se a mistura resultante durante 5 minutos.

Removeu-se o THF e diluiu-se o residuo em ETOAc. A solução foi lavada com HCI aquoso 0,5 M, e com cloreto de sódio saturado, e depois secou-se sobre sulfato de sódio. Por remoção do ETOAc obteve-se um óleo amarelo. Esse óleo foi purificado por cromatografia flash em coluna utilizando CH2C1₂/ET0Ac como solvente, 10/1, 5/1 e 3/1 (v/v), obtendo-se 0,083 g do Composto D (rendimento 65%).

RMN do protão em CDCI3 a 100 MHz (relatívamente a TMS como padrão interno): delta 9,72 (dupleto largo, J-10 Hz), 7,28 (multipleto, 9H), 5,45 (multipleto, 1H), pares diastereoméricos: [3,65 (dupleto, J=ll Hz) 3,32 (dupleto, J = ll Hz), 3H], pares diastereoméricos: [3,1 (dupleto, J=21 Hz), 2,95 (dupleto duplo,

J=21 Hz) 2H], pares diastereoméricos. [1,6 (dupleto, J = 7 Hz), 1,45 (dupleto, J = 7 Hz) 3H] .

Dissolveu-se o Composto D (0,0250 g; 6,22 x 10~⁵ moles) em 1 ml de etanol, com agitação. Λ solução etanólica adicionou-se boro-hidreto de sódio (0,0161 g; 7 equivalentes), e agitou-se a solução resultante durante um periodo de uma hora à temperatura ambiente.

Λ solução anterior adicionou-se então uma solução aquosa a

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por cento cie hidróxido de amónio. Extractou-se a solução resultante com ETOAc, e secou-se o extracto de ETOAc, resultante, sobre sulfato da sodio. Removeu-se o solvente obtendo-se 0,015 g de Composto E (rendimento aproximado, 80%).

RMN do protão em CDCI3 a 100 MHz (relativamente a TMS como padrão inter no): delta 6,95 (multipleto, 9H), 5,48 (multipleto, 1H) pares diastereomériccs: [3,62 (dupleto, J = 11 Hz), 3,3 (dupleto, J-ll Hz) 3H] pares diastereomericos: [3,08 (dupleto, J = 21 Hz), 2,88 (dupleto, J = 21 Hz), 2H] pares diastereomér icos: [1,58 (dupleto, J = 7 Hz), 1,45 (dupleto, J=7 Hz), 3H].

ÇRTPOs.tǹ. £.....(Ligando Análogo)

Dissolveu-se o Composto E (0,032 g; 1,046 x 10 moles) em 3 ml de CH2CI2 seco, e adicionou-se trietilamina (0,0145 ml; um equivalente), e agitou-se a solução resultante durante 10 minutos á temperatura ambiente. Subsequentemente, adicionou-se anidrido glutárico (0,0110 g; um equivalente) com agitação continua. A reacção foi seguida por tlc em silica gel com CH2Cl2/metanol (5/1, v/v) como solvente.

Diluiu-se a mistura reaccional com ETOAc e adicionou-se HC1 aquoso 0,5 M. Subsequentemente, adicionou-se HC1 aquoso quatro molar até a fase aquosa ficar ácida. Separou-se a fase de solvente orgânico, secou-se sobre sulfato de sódio e depois removeu-se o solvente sob pressão reduzida. Por tlc preparativa em silica gel obteve-se o produto resultante utilizando o solvente anterior como eluente.

Composto F foi preparado por reacção do composto preparado anteriormente (32 mg) com 2 ml de t-butilamina, num tubo vedado, a 602C, durante um periodo de 10 dias. Removeram-se os .·?

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-38solventes, o produto foi purificado por cromatografia líquida de proteínas rápida, e obteve-se o Composto F racémico por 1iofi1ização. Obteve-se um total de 26,3 mg de Composto F (rendimento 85¾).

RMN do protão em DMSO-dg a 100 MHz (reiativamente a DMSO como padrão interno): delta 9,8 (singuleto, 1H), 7,3 (muitipleto, 9H), 5,39 (multipleto, 1H), 2,98 (dupleto, J = 21 Hz), 2,30 (muitipleto, 4H), 1,82 (multipleto, 2H) , 1,45 (dupleto, J = 7 Hz,

3H).

Composto6

A uma solução de ácido 4-aminofenilacético (1,5 g) e carbonato de sódio (1,5 g) em acetonitrilo aquoso a 10 por cento, adicionou-se anidrido trifluoroacético (2,8 ml) a -10 graus C. Acidificou-se a solução com HC1 6 normal (0,2 ml) e concentrou-se i.Q.._y.ê..Ç..y,9- P°r- filtração através de silica com uma mistura 9:1 de diclorometano a metanol, obtiveram-se 1,4 gramas (rendimento 57 por cento em peso) de acido p-trif1uoroacetamidofenilacético. Por cromatografia de camada fina em silica gel, utilizando uma mistura 5/1 de clorofórmio e metanol (v/v) como eluente, obteve-se um valor de Rf de 0 ,33.

RMN do protão em DMSO-dg, a 100 MHz (reiativamente a TMS como padrão interno): 7,37 (dupleto, J = 8,7 Hz, 2H), 7,02 (dupleto, 0 = 8,7 Hz, 2H), 3,3 (singuleto, 2H).

Dissolveu-se o ácido anterior (0,6 g) em cloreto de tionilo e aqueceu-se a solução a 40 graus C durante 2 horas. 0 cloreto de tionilo foi removido invacuo obtendo-se o cloreto de ácido correspondente.

Preparou-se uma solução contendo 0,0461 g (3,773 x 10 moles)

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-39de álcool S(-) sec-fenetí1ico e 0,0525 ml de trietilamina (um equivalente) dissolvida em CH2CI2- Agitou-se essa solução à temperatura ambiente durante meia hora. Adicionou-se depois cloreto de ãcido preparado anteriormente (0,10 g; 3,774 x 10 moles) seguindo-se um outro equivalente de trietilamina. A adição do cloreto de ácido fez com que a solução ficasse castanha e a adição da amina provocou o inicio da precipitação de um sólido. Agitou-se a mistura reaccional durante meia hora.

Subsequentemente, diluiu-se a mistura reaccional com ETOAc, lavou-se com HC1 aquoso 0,5 M, secou-se o solvente orgânico sobre sulfato de sódio e removeu-se o solvente orgânico. 0 produto foi purificado numa coluna de sílica gel utilizando Ch^Clo/^TOAc (5/1, v/v) como eluente. Após secagem, recuperaram-se 0,0153 g de Composto G [3(-)].

isómero R(+) foi preparado de um modo, em geral similar, com um rendimento de 48¾.

Preparou-se também uma mistura racémica contendo quantidades iguais dos isómeros enantioméricos R( + ) e S(-). Esse material é designado por Composto G (R,S).

RMN do protão em CDCI3 a 100 MHz (relativamente a TMS como padrão interno): delta 8,1 (singuleto largo, 1H) , 7,3 (muitipleto, 9H), 5,9 (multipleto, 1H), 3,62 (singuleto, 2H) , 1,55 (dupleto, J = 6 Hz, 3H).

Compos “9....d (Ligando Reagente)

Dissolveu-se o Composto G [R(+)] (0,6447 g; 1,84 x 10 moles) em 5 ml de etanol num balão de fundo redondo e adicionaram-se 5 equivalentes de boro-hidreto de sódio. Agitou-se a mistura resultante durante 2,5 horas, e depois adicionou-se

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-40a 20 ml de solução aquosa de hidróxido de amónio a 10 por cento em volume. Extractou-se a solução aquosa oom ETOAc e secou-se a solução de ETOAo sobre sulfato de sódio. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e dissolveu-se o residuo em 5 ml de CH2CI2 recentemente destilado.

Á solução deCH2Cl2 anterior adicionaram-se dois equivalentes de trietilamina (0,51 ml) e a solução resultante foi agitada durante pouco tempo. Adicionou-se depois um equivalente de anidrido glutárico (0,2095 g), e agitou-se a mistura reaccional resultante, à temperatura ambiente, durante 18 horas.

Os voláteis foram removidos sob pressão reduzida e o residuo foi redissolvido em ETOAc. Lavou-se essa solução com HC1 aquoso 0,5 M, oom solução de bicarbonato de sódio (10 por cento em peso), e depois, oom cloreto de sódio aquoso saturado. Secou-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio, e depois removeu-se sob pressão reduz ida. Dissolveu-se o residuo numa quantidade mínima de metanol, e adioionou-se uma mistura de hexanos para precipitar o produto. Lavou-se o produto com quantidades adicionais da mistura de hexanos e secou-se, obtendo-se 0,300 g (rendimento aproximado 43%).

produto, Composto H (R(+)], exibiu, num polarímetro, uma rotação óptica de +30,62 corn a linha D do sódio.

outro enantiómero, Composto H [S(-)], foi preparado de um modo, em geral similar, e exibiu uma rotação óptica de -30,32 como anteriormente.

Similarmente, preparou-se uma mistura racémioa utilizando o Composto G (R,S) como material de partida. Este produto foi utilizado para a pesquisa inicial, e é designado por Composto H (R.S).

RMN do protão em DMSO-dg a 100 MHz (rela ti vamen te a DMSO como padão interno): delta 9,9 (singuleto, 1H), 7,35 (multipleto, 9H), 5,78 (multipleto, 1H), 3,6 (singuleto, 2H), 2,25 (multipleto, 4H), 1,75 (multipleto, 2H), 1,45 (dupleto, J = 6 Hz, 3H).

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-41Preparação de Agentes de Acoplamento de Succi nimidilo e de CloretodeÁcidoparaPreparaoãodeConjugados ligando análogo (Composto F) possuía um grupo hemi-amida de glutarilo que foi utilizado para ligar o ligando análogo hapténico a um transportador antigénico (imunogénico) para a indução dos anticorpos. São também úteis grupos de ligação adicionais que contêm um total de 1 a 8 grupos metileno (CH2) entre os grupos carboxilo.

Assim, são úteis diáeidos glutárico, ácido adipico, até materiais podem ser ligados ao anidrido, ou de um cloreto de outra ligação aos grupos ácido, tais como ácido malónico, ácido ao ácido decanodióico. Esses ligando análogo pelo uso de um ácido adequados ou por qualquer activada, adequada.

Um gr upo de 1igação, derivado de ácido dicarboxilico, particularmente útil, contém um grupo o-sucoinimidilo num terminal de ácido carboxílico e um cloreto de ácido no outro terminal. Os procedimentos seguintes discutem a preparação especifica de cloreto de succ i nim i dil-adi po i 1 o como exemplo das sínteses de outros grupos de ligação, similares.

Aqueceu-se adípico (5,4 g, graus C durante uma solução do éster de monometilo do ácido 33,3 mmol) em cloreto de tionilo (15 ml) a 40 rnistura foi então concentrada e horas. A destilada in.....vacuo (ponto de ebulição, 119 graus C a 20 mm Hg) obtendo 3,5S g (rendimento 60 por cento, em peso) do éster de metilo-cloreto de áoido . Este foi dissolvido em 20 ml de diclorometano e adicionou-se N-hidroxisuccinimida (2,75 g, 24,0 mmol), seguindo-se trietilamina (4,2 ml, 30 mmol). Agitou-se a mistura durante 10 minutos, depois diluiu-se com acetato de etilo e lavou-se com HC1 0,5 14 e com salmoura.

Uecou-se solução sobre sulfato de magnésio anidro, filtrou-se concentrou-se obtendo-se 4,5 (rendimento 87,5 por cento em peso) succinimidi-adipato de metilo na forma de um óleo incolor.

RMN do protão em CDCI3 a 100 MHz (relativamente a TMS como padrão interno): delta 3,73 (singulsto, 3H) , delta 2,90 (singuleto 4H), 2,70 (muitipleto , 2H) , 2,37 (multipleto, 2H), e

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1,79 (multipleto 4H).

Aqueceu-se ao refluxo uma solução de succinimidil-adipato de metilo (4,5 g, 17,5 mmol), clorotrimetilsilano (11,1 ml, 87,5 mmol) e iodeto de sódio (13,1 g, 87,5 mmol) em 10 ml de acetonitrilo, durante 12 horas. Depois, arrefeceu-se a mistura ate à temperatura ambiente e diluiu-se com acetato de etilo. Lavou-se a mistura reaccional, repetidamente, com solução aquosa de bissulfito de sódio, a 5 por cento, até a solução orgânica ficar incolor. Depois, lavou-se oom salmoura, secou-se sobre sulfato de magnésio anidro, filtrou-se e concentrou-se obtendo-se

3,2 g (rendimento 71 por cento, em peso) do éster de monosuccinimidilo do áoido adipico na forma de um sólido branco.

RMN do protão em CDCI3 a 100 MHz (rela tivamente a TMS como padão interno): delta 3,90 (singuleto, 4H), 2,70 (multipleto, 2H), 2,4 (multipleto, 2H), 1,80 (multipleto, 4H) .

Aqúeceu-se uma mistura de éster de succinimidilo do ácido adipico (1,00 g, 3,80 mmol) e de cloreto de tionilo (5 ml), a 40 graus C durante 3 horas, depois arrefeceu-se até à temperatura ambiente e concentrou-se invacuo. Agitou-se o resíduo várias vezes com hexano seco, separou-se o óleo e secou-se in vacuo obtendo-se 0,97 g (rendimento 90 por cento em peso) de cloreto de succi nimidil-adipoi lo. Este foi dissolvido em tetra-hidrof urano seco até uma solução 5 molar, que foi utilizada tal e qual na preparação de compostos adequados para acoplamento a transportadores de proteina.

RMN do protão em CDCI3 a 100 MHz (relativamente a TMS como padrão interno): 3,00 (multipleto, 2H), 2,90 (singuleto, 4H), 2,70 (multipleto, 2H) , 1,80 (multipleto 4H) .

A reacção do agente de cloreto de ácido e de succinimidilo com um ligando análogo hapténico é realizada de uma maneira substancíalmente similar à que previamente se descreveu para a preparação do Composto F. Por essa reacção liga-se a porção contendo cloreto de ácido do agente de cloreto de ácido e de' succinimidilo à amina do hapteno, e deixa-se o grupo succinimidilo livre para reagir mais tarde com o transportador.

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-43V PreparaçãodeConjugadosedeInóculos

Podem preparar-se conjugados de moléculas de ligando análogo, hapténicas, com transportadores de proteínas antigénicas (imunogénicas) tais como a hemocianina de lapa (Fissurella) (KLH), por exemplo, por activação do transportador com um agente de acoplamento, tal como MBS (ester de m-maleimidobenzoi1-N-hidroxisuccinimida, e acoplamento ao grupo tiol do ligando análogo. Ver, por exemplo, Liu etal., Biochem., 80, 690 (1979). Como é também bem conhecido na arte, é muitas vezes benéfico ligar um composto ao seu tr anspor tador por meio de um grupo de ligação, intermediário.

Os transportadores úteis são bem conhecidos na arte, e geralmente são, eles próprios, proteínas. Exemplos destes transportadores são a hemocianina de lapa (Fissurella) (KLH), a edestina, a tiroglobulina, as albuminas tais como a albumina de soro de bovino ou a albumina de soro humano (BSA ou HSA, respectivamente), glóbulos vermelhos tais como eritrócitos de ovelha (SRBC), o toxóide do tétano, o toxóide da cólera, assim como poliaminoácidos tais como po1i(D-lisi naácido D-glutâmico ), e similares.

A escolha do transportador está mais dependente da utilização final pretendida do antigénio do que da porção determinante do antigénio, e é baseada em critérios não envolvidos no presente invento. Por exemplo, utilizar o conjugado em animais de seleccionar-se um transportador que não produza uma reacção prejudicial no animal particular.

par ticularmente se se pretende laboratório, deverá , conjugado de transportador-hapteno é dissolvido ou disperso numa composição aquosa de um diluente fisiologicamente tolerável tal como solução salina normal, PBS, ou água estéril para formar um inoculo. Pode também incluir-se, no inoculo, um adjuvante tal como adjuvante de Freund completo ou incompleto ou alúmen. 0 inóculo é introduzido, por exemplo por injecção, no animal usado para produzir os anticorpos, numa quantidade suficiente para induzir anticorpos, como è bem conhecido.

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-44Num procedimento exemplar, adicionam-se lentamente 2,5 mg de um produto da reacção do ligando análogo, hapténico, e de cloreto de succinimidil-adipoilo ou de cloreto ds succinimidilglutaroilo, em 250 ul de dimetilformamida, a 2 mg de KLH em 750 ul de tampão de fosfato de sódio 0,01 M a um valor de pH de 7,2. Usa-se uma temperatura de 4 graus C e agita-se a mistura resultante durante cerca de uma hora, para formar o conjugado de KLH ligado a hapteno. Subsequentemente, o produto de reacção conjugado assim formado é purificado pelos meios usuais.

No presente trabalho, misturou-se o Composto F (5 mg) com KLH (2 mg) em água (2 ml). Ajustou-se o pH a 4,5 com HC1 e adicionaram-se depois 10 equivalentes de l-etil-3-(3dimetilaminopropi1)carbodiimida. Agitou-se a mistura durante cerca de 12 horas. 0 produto em bruto resultante foi injectado em ratinhos .

VI. Preparação de Receptores Monoclonais

Usaram-se os conjugados de KLH anteriores (cerca de 100 u.g) para imunizar ratinhos (estirpe 129G1X*), e anticorpos monoclonais foram obtidos como descrito por Niman et al . , Proc.

Na.tl_. _ 4.9Α°1.·.______ S.Ç.Í..USA, Z.Z. 4524 (1980) e Niman et al . , em

Upnocio9.êl4.9.91.b.od1.23 and T-Cell Products, ed., Katz, D.H., 23-51 (CRC Press, Soca Raton, FL 1982). Os linfócitos utilizados para formar os hibridomas do presente invento podem ser obtidos a partir de qualquer mamífero, tal como um primata, roedor (por exemplo, ratinho ou ratazana), coelho, cobaia, vaca, cão, ovelha, porco ou similar, Como for apropriado, o hospedeiro pode ser sensibilizado por injecção do imunogénio, neste caso um ligando análogo hapténico, seguindo-se uma injecção de reforço e, depois, o isolamento do baço.

Prefere-se que a linha de células de mieloma seja da mesma espécie do que a dos linfócitos. Por consequência, usam-se tipicamente híbridos fundidos tais como híbridos ratinho-ratinho [ Schulman et__al., Nature, 276, 269 (1978)] ou híbridos ratazana-ratazana [Galfre et al., Nature, 277, 131 (1979)]. Contudo, têm também sido usados com êxito, na formação de hibridomas, alguns t .j

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-45híbridos ratazana-ratinho [Goding, Production of Monoclonal Antíbodiss by Cell Fusion, em AntibqdyasaTool, Marchalonis et al . eds., John Wiley & Sons Ltd., p. 273 (1982)]. As linhas de mieloma adequadas para utilização no presente invento incluem MPC-11 (ATCC CRL 167), P3XÓ3-Ag8.653 (ATCC CRL 1580), Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581), P3X63Ag8U.1 (ATCC CRL 1597), Y3-Agl.2.3.

(depositadas na Collection Nationale de Cultures de Microorganisms, Paris, França, número 1-078) e P3X63Ag8 (ATCC TIS 9). A linha de mieloma de rnurino não secretora Sp2/0 ou Sp2/0-Agl4 é preferida para utilização no presente invento.

As células de hibridoma que são finalmente produzidas podem ser cultivadas seguindo as técnicas de cultura de tecidos in Y..í_trq, usuais para estas células, como é bem conhecido. Mais preferivelmente, as células de hibridoma são cultivadas em animais utilizando técnicas, similarmente bem conhecidas, com os receptores monoclonais sendo obtidos a partir dos fluidos de ascites assim produzidos. Os animais utilizados para a produção dos fluidos de ascites foram os ratinhos 129G1X fêmeas criadas na colónia de ratinhos da Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, Califórnia, contudo, quando se usam outros animais, diferentes dos ratinhos, para a preparação dos hibridomas, os ratinho;

ou outro tipo de animais, podem ser utilizados para a produção de fluidos de ascites.

Em particular, produziu-se um receptor monoclonal exemplar pela tecnologia convencional de hibridomas de Kohler et al., Na ture, 256, 495 (1975). Especificamente, os ratinhos 129Θ1Χ* fêmeas foram imunizados, por injecção intraperitonea1 com um inoculo de 100 microgramas de' conjugado (por exemplo, Composto F ligado a KLH) em 300 microlitros de uma mistura 1:1 de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4, e adjuvante de Freund completo. Duas semanas mais tarde, os ratinhos foram de novo injectados, dum modo similar, com 50 microgramas do conjugado anterior em 300 microlitros de uma mistura 1:1 de PBS (pH 7,4) e 10 mg/ml de alumén. Após oito semanas adicionais, os ratinhos foram imunizados intravenosamente com 50 microgramas do conjugado em 200 microlitros de PBS (pH 7,4). Os baços foram removidos dos

533

SCRF 123.2 PORTUGAL *··> -46ratinhos 4 dias mais tards e as células ds baço foram fundidas com células de mieloma.

Reuniram-se as células dos baços e preparou-se uma única 8 suspensão de células. As células de baço nucleadas (1,4 x 10 ) foram então fundidas com 3x10 células de mieloma não secretoras Sp2/0-Agl4, na presença de um promotor de fusão de células (polietilsnoglicol 2000). 0 hibridoma que produz um anticorpo monoclonal particular foi seleccionado, por sementeira das células de baço em placas de 96 cavidades e por crescimento em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), contendo 4500 mg/litro de glucose (10 por cento), 10 por cento ώsoro de feto de vitelo (FCS), hipoxantina, aminopterina e timidina (i.e., meio HAT) que não sustenta o crescimento das células de mieloma não fundidas.

Após duas a três semanas, o sobrenadante por cima do clone de células em cada cavidade foi recolhido e testado num ensaio ELISA (ensaio de imunosorvente ligado a enzima como a seguir se descreve) para determinar a presença de anticorpos contra o Composto F. As cavidades positivas foram clonadas duas vezes por diluição limitante. Os clones que continuaram a produzir anticorpo especifico do Composto F, após as duas clonações , foram expandidos para produzir volumes maiores de sobrenadante fluido. Os hibridomas e os receptores monoclonais dai produzidos, e que aqui se descrevem, são identificados pelas designações labor atoriais como se mostra na Tabela que a seguir se apresenta.

Um receptor monoclonal do presente invento pode também ser produzido por introdução, por exemplo, por injecção, do hibridoma na cavidade peritoneal de um mamífero, tal como um ratinho. De preferência, como jã se referiu, usam-se mamíferos singénicos oú semi-singénicos, tal como na Patente U.5. 4 361 549, cuja descrição é aqui incorporada como referência.

hibridoma provoca a formação de hibridomas anticorpos após um periodo adequado de crescimento, por exemplo 1-2 semanas, e resulta numa concentração elevada do receptor produzido, que pode ser recuperado da corrente sanguínea e do exsudádo peritoneal (ascite ) do ratinho hospedeiro.·

A introdução do produtores de

hospedeiros tenham também ascite , a concentração de apenas csrca de cinco por monoclonal.

533

SCRF 123.2 PORTUGAL

-47tr’-

Embora normais no normais é, os ratinhos seu sangue e tipicamente, receptores receptores cento da concentração de receptor

Os receptores monoclonais são precipitados a partir dos fluidos asciticos, purificados por cromatografia de permuta aniónica, e dialisados contra três tampões diferentes.

Nos presentes estudos, as fracções de IgG foram tipicamente obtidas a partir de ascites de ratinho, por precipitação com solução de sulfato de amónio saturada a 45 por cento, seguida por cromatografia em DEAE-Sephacel por eluição com solução de cloreto de sódio. A fracção,que foi eluída com uma concentração de sal 100 mM,foi dialisada e concentrada. As concentrações de proteína foram determinadas pelo processo de Lowry. [ J..__ Biol_. Çhem^, 1.23/265 (1951)]. As soluções concentradas resultantes, contendo fracções de IgG isoladas, foram tipicamente preparadas como soluções de armazenamento de receptor a 1-20 mg/ml, usando um tampão apropriado tal como Tris-HCl 50 mM ou fosfato de sódio contendo azida de sódio 0,01 M.

Dos doze receptores monoclonais que se ligaram ao antigénio no ELISA, oito catalisaram a hidrólise do Composto H racémico (R,S), substrato. Dois desses oito hibridomas secretores de catalisador, cada um catalisando uma reacção de cada um dos estereoisomeros, foram depositadc hibridomas foram depositados Collection, 12301 Parklawn Drive, Tabela de Depósito de Hibridomas, s como exemplos do invento. Os na American Type Culture

Rockville, MD como se mostra na seguinte.

SEGUE TABELA

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SCRF 123	.2 PORTUGAL	-48-
	Tabela de Depósito de Hibridomas
Designaç	ãodo Hibr idoma
	Reage com
Laboratório R( + )/'S(-)	................ATÇÇ	.............Data do Depc	i>si to
2H6	R( + )	HB 9969	13 de Janeiro	de 1989
21H3	S(-)	HB 9970	13 de Janeiro	de 1989
		♦	♦
1F5	R( + )	ND	ND
9C7	S(-)	ND*	ND*
18E9	R( + )	ND*	ND*
11D9	R( + )	ND*	ND*
20C10	R(+)	ND*	ND*
26 D 3	E( + )	ND*	ND*
*N.D. =	não depositado.
Os	.presentes depósitos	foram feitos de acordo	com os
requisitos do Tratado de Budapeste no qual	a duração dos depósitos
deve ser	de 30 anos a partir	da data do	depósito, ou de	5 anos

após o último pedido para o depósito no depositário ou para a vida possível de uma patente dos E.U.A. que resultará do pedido, escolhendo-se o periodo mais longo. Os hibridomas deverão ser substituídos quando forem considerados não viáveis no deposi tar· io .

Um fragmento Fab de um receptor monoclonal foi preparado- a partir do receptor purificado utilizando papaína pré-digerida num tampão de acetato de sódio 0,1 M, a um valor de pH de 5,5,a 37 graus C, seguida da reacção com iodoacetamida. Adicionalmente, o fragmento Fab é purificado, tipicamente, por cromatografia de permuta aniónica, diálise e crornatografia de permuta aniónica em DEAE, e a sua homogeneidade é avaliada por electroforese em gel.

VII. Ensaio de Imunosorvente Ligado a Enzima.....(ELISA)

A ligação de um ligando análogo pela molécula de receptor monoclonal induzida, foi testada por ELISA com anticorpo, numa concentração fixa no intervalo do seu titulo, e com uma concentração de inibidor variável (Composto F livre).

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-49utilização de Composto F livre como inibidor ajuda a assegurar que uma interacção de ligação, observada, é especifica do antigénio.

Os ensaios foram realizados em placas de microtitulo de polivinilo com cavidades de fundo plano (Dynatech, Alexandria, VA). I1ustrativamente, as cavidades foram revestidas com uma solução compreendendo Composto F ligado a BSA, como o ligando antigénio, em solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando 50 microlitros de solução por cavidade. 0 BSA foi utilizado como um transportador para ligar o hapteno à parede celular, e usou-se um conjugado de ligando análogo/BSA, em vez do conjugado contendo KLH de imunização, para pesquisar possíveis anticorpos anti-KLH.

Os ligandos ligados foram usados como revestimento numa concentração de 1 micrograma por mililitro. As placas foram então incubadas durante a noite, a 37 graus C numa estufa de secagem. As placas secas foram armazenadas a 4 graus C até à utilização. Antes do ensaio ELISA, as placas secas foram de novo hidratadas por duas lavagens, de 2 minutos cada uma, com PBS 10 milimolar (mM), pH 7,4, contendo 0,1 por cento de monolaurato de políoxialquileno (20) sorbitano (Tween 20) e 0,02 por cento de Thimerosal (e ti lmer cur i tiosal ic i .lato de sódio), (Sigma, St. Louis, M0).

De forma a reduzir a ligação não especifica, os sobrenadantes de hibridoma foram diluídos de 1:2 usando tampão de lavagem contendo BSA a 0,1 por cento como diluente. A cada cavidade, adicionaram-se subsequentemente 50 microlitros de sobrenadantes de hibridoma diluídos e incubaram-se, durante 1 hora a 4 graus C, num agitador rotativo, para promover o contacto do sobrenadante,contendo anticorpo monoclonal, com o. Composto F ligado. A seguir a duas lavagens de 2 minutos cada, adicionaram-se a cada cavidade, 50 microlitros de IgG + IgM de cabra anti-ratinho marcada com peroxidase (Tago, Burlingame, CA) di1uidos a 1:1000, e a mistura reaccional foi incubada a 4 graus C durante 1 hora para ligar o anticorpo marcado ao anticorpo monoclonal ligado .

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SCRF 123.2 PORTUGAL

-500 substrato utilizado para testar a actividade da peroxidase ligada foi preparado imediatamen te antes do uso e consistia em 400 microgramas/ml de q-fenilenodiamina (Sigma, St. Louis, MO) em tampão de oitrato-fosfa to 80 mM, pH 6,0, contendo 0,12 por cento de H2O2· Após duas lavagens finais, adicionaram-se, a cada cavidade, 50 microlitros de solução de substrato, e deixou-se desenvolver a cor durante 15 minutos no escuro. 0 desenvolvimento de cor foi parado por adição de 25 microlitros de H23O4 4 molar a cada cavidade, e mediu-se a densidade óptica a 492 nanómetros (nm) com um leitor de placas ELISA Multiskan.

Para uma outra preparação de moléculas de receptor, pode obter-se o gene, que codifica um fragmento que forma sítios de combinação com anticorpos, a partir de qualquer célula que produza uma molécula de anticorpo que imunorreage como aqui se descreveu. Uma célula preferida é uma célula de hibridoma.

Para exemplos de processos gerais de clonação de ADN recombinante, ver Mo1ecular.......Cloning, Maniatis et_aL, Cold Spring

Harbor Lab., N.Y., 1982; DNA Cloning, Glover, ed. , IRL Press, MoLean VA (1985). Para a clonação genómioa e expressão de genes de imunoglobulina em células linfóides, ver Neuberger et a 1.. ,

Nature , 312:604-8 (1984); Ochi et _ a 1... , P r q c ........ Na11_....... Aç ad ......Sei .

USA, 80 = 6351-55 (1987); e Oi e.t...al...., Proc_........Natl. Acad. Sei. USA,

80:825-29 (1983). Para a clonação de genes de imunoglobulina a partir de células de hibridoma e expressão em oócitos de Xenopus, ver Roberts et.. al..., Pr otei n Engineering, 1:59-65 (1986), e ver Wood et. al . , para a expressão em levedura. Nature, 314:446-9 (1985).

Pretende-se que a descrição anterior seja ilustrativa do presente invento mas não limitativa. Podem ser efectuadas numerosas variações e modificações que não saiem do verdadeiro espirito e âmbito do invento.

Claims (16)

1 - Processo de preparação de uma molécula de receptor compreendendo um sitio de combinação com anticorpos que é capaz de hídrolisar cataiιticamente uma ligação éster ou amida de ácido carboxílico cindivel, pré-seleccionada de um estereoisómero de um ligando reagente, ligando-se, o referido sitio de combinação com anticorpos, a um estereoisómero de um par de estereoisómeros de um ligando reagente, o qual contém a referida ligação éster ou amida de ácido carboxílico cindivel, pré-seleccionada e a um, de um par, de estereoisómeros de um ligando análogo que é estereoquimicamente análogo ao referido ligando reagente e que contém um átomo de fósforo ligado tetraedricamente muma posição análoga à do referido átomo de carbono de carbonilo cindivel da referida ligação éster ou amida de ácido carboxílico pré-seleccionada, do referido ligando reagente, caracterizado por compreender os passos de:

(a) proporcionar anticorpos produzidos por um animal hospedeiro previamente imunizado com o referido ligando de modo a produzir anticorpos contra o referido ligando;

(b) pesquisa, nos anticorpos formados, de anticorpos que se ligam ao referido ligando;

(c) recuperação dos anticorpos, do passo (b), que se ligam ao ligando análogo;

(d) pesquisa, nos anticorpos recuperados do passo (c), de anticorpos que hidrolisarn ca taliticamente um estereoisómero da referida ligação éster ou amida de ácido carboxílico pré-seleccionada do referido ligando reagente; e (e) recuperação dos anticorpos que hidrolisarn cataliticamente um estereoisómero da referida ligação de ligando reagente.

2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido átomo de fósforo estar directamente ligado a:

(i) um átomo de carbono da porção ácido do éster ou amida de ligando reagente análogo, o qual está incluído numa cadeia contendo pelo menos cinco átomos;

70 533

SCRF 123.2 PORTUGAL

-52(ii) um átomo de oxigénio que tem uma ligação dupla com o referido átomo de fósforo:

(iii) um átomo de oxigénio que tem uma ligação simples com o referido átomo de fósforo e uma ligação simples com um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior C1-C4; e (iv) um terceiro átomo de oxigénio ou um átomo de azoto de imino que está ainda ligado ao carbono alfa da porção amina ou álcool da amina ou do éster análogos, respectivamente, e é uma porção de uma cadeia que contém pelo menos cinco átomos.

3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o centro estereoisomérico do referido estereoisómero ligado pelo referido sitio de combinação com anticorpos estar localizado na porção amina ou álcool do referido ligando reagente.

4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o centro estereoisomérico do referido estereoisómero de ligando reagente ligado pelo referido sitio de combinação com anticorpos estar' dentro de um volume ocupado por um a cerca de quatro resíduos de aminoácidos da referida ligação éster ou amida de ácido carboxílico cindivel.

5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os referidos estereoisómeros serem enantiomeros.

6 - Processo de preparação de uma molécula de receptor que contém um sitio de combinação com anticorpos que é capaz de hidrolisar cataiiticamente uma ligação éster ou amida de ácido carboxílico cindivel, pré-selsccionada, de um estereoisómero de um ligando reagente, e não a pio outro estereoisómero, ligando-se o referido sitio de combinação com anticorpos a um estereoisómero de um par de estereoisómeros de uma molécula de ligando análogo representada pela fórmula

II

R-ι -P-XRt ||

0R₂

70 533

SCRF 123.2 PORTUGAL onde X = 0 ou NH;

onde R4 - (CH2) 1-1CQ2R 5 5 R5 = H, ou

-53R₁ = CH //

NHCOR,

H ou alquilo inferior C1-C4

R_f =

CH )

CH, onde a linha ondulada indica ambos os isómeros estereoquimiCOÍ n é um número inteiro de 1 a 8, inclusivé, e um 'estereoisómero de um ligando reagente representado pela fórmula:

RÍ-C-XR3 onde X, R e R3 são como anteriormente descritos, caracterizado por compreender os passos de:

(a) proporcionar anticorpos produzidos por um animal hospedeiro, previamente imunizado com o referido ligando análogo de modo a produzir anticorpos contra o referido ligando análogo;

(b) pesquisa, nos anticorpos formados, de anticorpos que se ligam ao referido ligando análogo;

(c) proporcionar células do baço do animal hospedeiro imunizado cujos anticorpos se ligam ao referido ligando análogo do passo (b ) ;

(d) fusão das referidas células do baço com células de mieloma para formar células de hibridoma;

(ej clonação das referidas células de hibridoma, até monoclonicidade, e cultura das células monoclonais;

70 533

SCRF 123.2 PORTUGAL «

-54(f) pesquisa, no meio de crescimento das referidas culturas de células de hibridoma monoclonais, de anticorpos segregados que indrolisem cataliticamente um estereoisómero do referido ligando reagente, e (g) recuperação dos anticorpos do passo (f) que hidrolisam cataiiticamente um estereoisómero do referido ligando reagente.

7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido receptor ser segregado pelo hibridoma 2H6 tendo o número de acesso no ATCC, HB 9969.

3 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido receptor ser segregado pelo hibridoma 21H3 tendo o número de acesso no ATCC, HB 9970.

9 - Processo de preparação de um hibridoma que segrega uma molécula de receptor monoclonal contendo um sitio de combinação com anticorpos que é capaz de ligação éster -seleccionada, ligando-se o referido hidrolisar ca taliticamente uma ou amida de ácido carboxilico cindível, préde um estereoisómero de um ligando reagente, sitio de combinação com anticorpos a um estereoisómero de um par de estereoisõmeros de um ligando reagente que contém a referida ligação éster ou amida de ácido carboxilico cindivel pré-seleccionada, e um estereoisómero de um par de estereoisõmeros de um ligando análogo que é estereoquimicamente análogo ao referido ligando reagente e que contém um átomo de fósforo tetraedricamente ligado numa posição análoga à do referido átomo de carbono do carbonilo cindivel da referida ligação éster ou amida de ácido carboxilico pré-seleocionada do referido ligando reagente, caracterizado por compreender os passos de:

(a) proporcionar anticorpos de um animal hospedeiro previamente imunizado oom o referido ligando análogo, de modo a produzir anticorpos contra o referido ligando análogo;

(b) ligam ao pesquisa, nos anticorpos formados,de anticorpos que se referido ligando análogo;

(c) proporcionar células do baço do animal hospedeiro

70 533 '~^ν'

SCRF 123.2 PORTUGAL Mj β F '

-55imunizado cujos anticorpos se ligam ao referido ligando análogo do passo ( b);

(d) fusão das referidas células do baço com células de mieloma para formar células de hibridoma;

(e) pesquisa, no meio de crescimento das referidas culturas de células de hibridoma monoclonais, de anticorpos segregados que hidrolisem ca taliticamente um estereoisómero do referido ligando reagente; e (f) clonação, até monoclonicidade, das células de hibridoma cujos anticorpos hidrolisam cataliticamente o referido estereoisómero, e cultura das células monoclonais.

10 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o átomo de fósforo estar directamente ligado a:

(i) um átomo de carbono da porção ácido do éster ou amida de ligando reagente análogo, que esta incluido numa cadeia contendo pelo menos cinco átomos;

(ii) um átomo de oxigénio, que tem uma ligação dupla corn o referido átomo de fósforo;

(iii) um átomo de oxigénio que tem uma ligação simples com o referido átomo de fósforo e uma ligação simples com um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior C1-C4; e (iv) um terceiro átomo de oxigénio ou um átomo de azoto de imino que está ainda ligado ao carbono alfa da porção amina ou álcool da amida ou do éster análogos, respectivamente, e é uma porção de uma cadeia que contém pelo menos cinco átomos.

11 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o referido hibridoma ser designado por 2H6 e possuir o número de acesso no ATCC, HB 9969.

12 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o referido hibridoma ser ο 21H3 e possuir o número de acesso no ATCC, HB 9970.

Processo de catalisação da reacção de hidrólise de uma

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SCRF 123.2 PORTUGAL

-56molécula de um par de moléculas amida ou éster de ácido carboxílico estereoisoméricas, car ac ter i zado por compreender os passos de:

mistura de uma quantidade cataliticamente eficaz de moléculas de receptor com moléculas de ligando reagente estereoisoméricas num meio aquoso para formar uma mistura, em que as referidas moléculas de receptor contêm um sitio de combinação com anticorpos que é capaz de hidrolisar uma ligação amida ou éster de áoido carboxílico cindivel, pré-seleccionada, de um estereoisómero do referido ligando reagente e não do outro estereoisómero, ligando-se o referido sitio de combinação com anticorpos a:

um estereoisõmero de um par de estereoisómeros de um ligando reagente que contém a referida ligação amida ou éster de áoido carboxílico cindivel pré-seleccionada, e um estereoisõmero de um par de estereoisómeros de um ligando análogo que é estereoquimioamente análogo ao referido ligando reagente e que contém um átomo de fósforo tetraedricamente ligado numa posição análoga à do referido átomo de carbono de carbonilo cindivel da referida ligação amida ou éster de ácido carboxílico pré-seleccionada do referido ligando reagente; e manutenção da referida mistura durante um período de tempo suficiente para as referidas moléculas de ligando reagente se ligarem às referidas moléculas de receptor e para as referidas moléculas de receptor catalisarem a hidrólise da referida ligação cindivel pré-seleccionada.

14 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o referido sitio de combinação com anticorpos se ligar a:

(i) um átomo de carbono da porção áoido da amida ou éster do ligando reagente análogo que está incluído numa cadeia contendo pelo menos 5 átomos;

(ii) um átomo de oxigénio que tem uma ligação dupla com o referido átomo de fósforo;

(iii) um átomo de oxigénio que tem uma ligação simples com

70 533 / /*·' : '

SCRF 123.2 PORTUGAL ' ·’

-57o referido átomo de fósforo e uma ligação simples com um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo de cadeia inferior C1-C4; e (iv) um terceiro átomo de oxigénio ou um átomo de azoto de imino que está ainda ligado ao carbono alfa da porção álcool ou amina do éster ou da amida análogos, respectivamente, e é uma porção de uma cadeia que contém pelo menos 5 átomos.

15 Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por 0 referido ligando reagente estar presente como um par de estereoisómeros. 16 Processo de acordo com a reivindicação 15, caracter i zado por 0 referido par estereoisomérico ser de enantiómeros. 17 Processo de acordo com a reivindicação 13, caracter izado por 0 centro estereoisomérico do referido estereo-

isómero ligado pelo referido sítio de combinação com anticorpos estar localizado na porção álcool ou amina do referido ligando reagente.

18 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o centro estereoisomérico do referido estereoisómero ligando reagente, ligado pelo referido sitio de combinação com anticorpos estar dentro de um volume ocupado por um a cerca de quatro resíduos de aminoácido da referida ligação amida ou éster de ácido carboxilico cindivel.

19 - Processo de catalisação da hidrólise de uma de um par de moléculas amida ou éster de ácido carboxilico estereoisoméricas, caracterizado por compreènder os passos de :

mistura de uma quantidade cataliticamente eficaz de moléculas de receptor com moléculas de ligando reagente estereoisoméricas num meio aquoso para formar uma mistura, em que as referidas moléculas de receptor contêm um sítio de combinação com anticorpos que é capaz de hidrolisar uma ligação amida ou éster de ácido carboxilico cindivel, pré-seleccionada, de um estereoisómeró do referido ligando reagente e não do outro estereoisómero, ligando-se o referido sitio de combinação com

70 53ό

SCRF 123.2 PORTUGAL anticorpos a:

(a) um estsreoisómero de um par de ester eoisómeros de um ligando reagente que contém a referida ligação amida ou éster de ácido carboxílico cindivel pré-seleccionada localizada dentro de um volume ocupado por um a cerca de quatro resíduos de aminoácido de um centro estereoisomérico do referido ligando reagente, e (b) um estereoisómero de um par de ester eoisómeros de um ligando análogo que é estereoquimicamente análogo ao referido ligando reagente, que contém um átomo de fósforo tetraedricamente ligado numa posição análoga à do referido átomo de carbono de carbonilo cindivel da referida ligação amida ou éster de ácido carboxílico pré-seleccionada do referido ligando reagente, e contém um centro estereoisomérico localizado dentro de um volume ocupado por um a quatro resíduos de aminoácido a partir do referido átomo de fósforo, estando o referido átomo de fósforo directamente ligado a:

(i) um átomo de carbono da porção ácido da amida ou éster do ligando reagente análogo que está incluída numa cadeia contendo pelo menos 5 átomos;

(ii) um átomo de oxigénio que tem uma ligação dupla oom o referido átomo de fósforo;

(iii) o referido hidrogénio um átomo de oxigénio que tem uma ligação simples com átomo de fósforo e uma ligação simples com um átomo de ou um grupo alquilo de cadeia inferior C1-C4; e (iv) um terceiro átomo de oxigénio ou um átomo de azoto de irnino que está ainda ligado ao carbono alfa da porção álcool ou amina do éster ou da amida análogos, respectivamente, e é uma porção de uma cadeia que contém pelo menos 5 átomos; e manutenção da referida mistura durante um período de tempo suficiente para as referidas moléculas de ligando reagente se ligarem às referidas moléculas de receptor e para as referidas moléculas de receptor catalisarem a hidrólise da referida ligação cindivel pré-seleccionada.

20 - Processo de acordo com a reivindicação 19,

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SCRF 123.2 PORTUGAL

-59caracterizado por as referidas moléculas de receptor serem segregadas pelo hibridoma 2H6 tendo o número de acesso ATCC, HB

9969.

21 - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por as referidas moléculas de receptor serem segregadas pelo hibridoma 21H3 tendo o número de acesso ATCC, HB