FI94026B - Monoklonaalisia vasta-ainemolekyylejä, joilla on katalyyttisiä ominaisuuksia omaavia vasta-aineen sitovia kohtia - Google Patents

Monoklonaalisia vasta-ainemolekyylejä, joilla on katalyyttisiä ominaisuuksia omaavia vasta-aineen sitovia kohtia Download PDF

Info

Publication number
FI94026B
FI94026B FI874047A FI874047A FI94026B FI 94026 B FI94026 B FI 94026B FI 874047 A FI874047 A FI 874047A FI 874047 A FI874047 A FI 874047A FI 94026 B FI94026 B FI 94026B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
compound
ligand
ester
reaction
antibody
Prior art date
Application number
FI874047A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI874047A (fi
FI94026C (fi
FI874047A0 (fi
Inventor
Richard A Lerner
Alfonso Tramontano
Kim D Janda
Original Assignee
Scripps Clinic Res
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scripps Clinic Res filed Critical Scripps Clinic Res
Publication of FI874047A0 publication Critical patent/FI874047A0/fi
Publication of FI874047A publication Critical patent/FI874047A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI94026B publication Critical patent/FI94026B/fi
Publication of FI94026C publication Critical patent/FI94026C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0002—Antibodies with enzymatic activity, e.g. abzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/45—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C07C233/53—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C233/54—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a six-membered aromatic ring having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of a saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/46—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with hetero atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/20—Oxygen atoms
    • C07D215/24—Oxygen atoms attached in position 8
    • C07D215/26—Alcohols; Ethers thereof
    • C07D215/32—Esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/38—Nitrogen atoms
    • C07D215/40—Nitrogen atoms attached in position 8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/06—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2
    • C07D311/08—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring
    • C07D311/16—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring substituted in position 7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
    • C07F9/38—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)]
    • C07F9/40—Esters thereof
    • C07F9/4003—Esters thereof the acid moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
    • C07F9/4056—Esters of arylalkanephosphonic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
    • C07F9/38—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)]
    • C07F9/42—Halides thereof
    • C07F9/425—Acid or estermonohalides thereof, e.g. RP(=X)(YR)(Hal) (X, Y = O, S; R = H, or hydrocarbon group)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/5537—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom the heteroring containing the structure -C(=O)-N-C(=O)- (both carbon atoms belong to the heteroring)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/576—Six-membered rings
    • C07F9/58—Pyridine rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/576—Six-membered rings
    • C07F9/60—Quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
    • C07F9/65583—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system each of the hetero rings containing nitrogen as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Catalysts (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Quinoline Compounds (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

94026 5
Monoklonaalisia vasta-ainemolekyylejä, joilla on kata-lyyttiaiä ominaisuuksia omaavia vasta-aineen sitovia kohtia
Keksintö käsittelee vasta-ainemolekyylejä, jotka sisältävät epitoopin, joka sitoo ja samalla stabiloi amidin tai esterin hydrolyysin transitiotilan tetraedrisen hiiliato-10 min ja jolla on katalyyttisiä ominaisuuksia.
Ligandien ja reseptorien väliset sitoutumisilmiöt ovat keskeisessä osassa biologisissa systeemeissä. Esimerkkejä sellaisista ilmiöistä ovat happimolekyylien sitoutuminen 15 deoksihemoglobiiniin oksihemoglobiinin muodostamiseksi ja substraatin sitoutuminen siihen vaikuttavaan entsyymiin, kuten tapahtuu esimerkiksi proteiinin ja proteaasin, esim. trypsiinin, välillä. Lisäesimerkkejä biologisista sitoutumisilmiöistä ovat antigeenin sitoutuminen vasta-20 aineeseen ja vastakomponentin C3 sitoutuminen nk. CR1-reseptoriin.
Monien lääkkeiden ja muiden terapeuttisten aineiden uskotaan myös olevan riippuvaisia sitoutumisilmiöistä. Esi-25 merkiksi opiaattien, kuten morfiinin, on raportoitu sitoutuvan aivojen spesifisiin reseptoreihin. Opiaattiago-nistien ja -antagonistien on raportoitu kilpailevan lääkkeiden, kuten morfiinin, kanssa näistä sitoutumiskohdista.
30
Ligandit, kuten keinotekoisista lääkkeistä esimerkiksi morfiini ja sen johdannaiset, ja luonnostaan biologisissa systeemeissä esiintyvät ligandit, kuten endorfii-nit ja hormonit, sitoutuvat luonnostaan biologisissa 35 systeemeissä esiintyviin reseptoreihin, joten niitä käsitellään tässä yhdessä. Tällainen sitoutuminen voi johtaa lukuisiin biologisiin ilmiöihin, käsittäen eri- 94026 2 tyisesti amidi- ja esterisidoksien hydrolyysin, missä proteiinit hydrolysoituvat aineosikseen polypeptideiksi sellaisen entsyymin, kuten trypsiinin tai papaiinin vaikutuksesta, tai vastaavasti missä rasva hajoaa glyseriiniksi ja kolmeksi karboksyylihapoksi.
5
Immunologista sitoutumista voidaan käyttää käännettäessä kokeellisesti sitoutumisvuorovaikutuksia katalyyttisiksi prosesseiksi. Jencks, W.P., Catalysis 10 in Chemistry and Enzymology, sivu 288 (McGraw-Hill, New York 1969). Yritykset, joissa reaktiivisia ryhmiä haluttiin liittää vasta-aineen sitoutuviin kohtiin ovat kuitenkin epäonnistuneet. Royer, G.P., Adv. Catal.,29, 197 (1980). Joidenkin monoklonaalisten vasta-aineiden 15 on raportoitu sisältävän nukleofiilisia jäänteitä, jotka reagoivat homoloogisessa haptiinissa olevan aktiivisen esteriryhmän kanssa, jonka vasta-aine tunnistaa. Kohen et ai., FEBS Lett., Ill, 427 (1980); Kohen et ai., Biochem. Biophys. Acta, 629, 328 (1980) and Ko-20 hen et ai., FEBS Lett., 100. 137 (1979). Näissä tapauksissa nukleofiilin asyloitumisnopeutta luultavasti kiihdyttää sen läheisyys haptiiniosan sitoutuvaan kohtaan.
·, 25 Näitä rakenteita, vaikkakin kiinnostavia, rajoittaa voimakkaasti se, että on epäonnistuttu kohdistamaan si-toutumisenergian käytön mekanismi, mikä on entsyymeille oleellista (W.P. Jencks, Adv. Enzymol., 43, 219 (1975)). Paitsi tämä, kun voimakas sitoutuminen johtaa 30 stabiileihin tiloihin, estää kompleksin hidas dis- sosioituminen katalyysiä. Vajeet voidaan korjata käyttämällä transitiotilan analogia, kuten haptiinia saamaan esiin toivotut vasta-aineet. Tämä haptiini (jota tässä myös kutsutaan "analogi-ligandiksi") voi saada 35 inhibiittorin osan katalyyttisessä systeemissä.
li 3 94026
Amidi- ja esterisidoksien hydrolyysin on ajateltu nykyisin hyväksytyn kemiallisen teorian mukaan etenevän vesiliuoksessa reaktiolla karbonyylihiiliatomiin, missä muodostuu transitiotila, jossa on tetraedrinen hiili-5 atomi sitoutuneena (a) amidin tai esterin happo-osan hiiliatomiin, (b) kahteen happiatomiin, joista toinen on peräisin karbonyyliryhmästä ja toinen väliaineen hydroksyyli-ionista tai vesimolekyylistä, ja (c) esterin alkoholiosan happiatomiin tai amidin amiiniosan 10 typpiatomiin. Tällaisten reaktioiden transitiotilat ovat hyödyllisiä ei-aineellisia rakenteita, joita ei määritelmän mukaan voi eristää, verrattuna välituotteisiin, jotka ovat eristettävissä.
15 Vaikka yllä mainittuja hydrolyyttisiä transitiotiloja ei voida eristää, on suuri määrä tieteellistä kirjallisuutta omistettu aiheelle. Osaa tästä kirjallisuudesta käsitellään jäljempänä.
20 Vaikkakin edellä kuvattu amidi- ja esterihydrolyysien transitiotilan uskotaan olevan hyvin ymmärretty, niin niiden reseptorien sitoutumiskohtien topologisia parametreja, kuten kokoa, muotoa ja varausta, joiden sitoutumiskohtien kanssa erityiset amidit, kuten proteiinit \ 25 tai esterit, esimerkiksi rasvat reagoivat näiden transitiotilojen kautta, ei ole yhtä hyvin tunnettu. Niinpä olisi hyödyllistä, jos moninaisten sitoutumiskohtien topologia olisi tunnettu niin, että niiden ligandien, jotka sitoutuvat noihin kohtiin, vuorovaiku- 30 tuksia voitaisiin tutkia. Valitettavasti biologisissa hydrolyyseissa reseptorien sitoutumiskohtien topologia on yleensä tuntematon, paitsi suhteellisen pienellä joukolla entsyymejä, joiden röntgendiffraktometriset kiderakenteet on määritetty.
35
Tietämyksen puute sitoutumiskohtien topologiasta juontaa juurensa osittain siitä, ettei edes tiedetä resep- 4 94026 torien monien sitoutumispaikkojen sijaintia soluissa.
Lisäksi niissäkin tapauksissa, missä reseptorien sitoutumispaikko jen sijainti tiedetään, on sitoutumiskohdan kemiallinen identiteetti, so. proteiini- ja hiili-5 hydraattikoostumus, yleensä tuntematon. Niinpä tutkija on yleensä vaikeuksissa yrittäessään ymmärtää reseptorin sitoutumiskohtien topologisia vaatimuksia ja sen seurauksena yrittäessään rakentaa terapeuttisia aineita, jotka voivat täyttää nämä vaatimukset.
10
Siksi tutkijoiden täytyy seuloa mahdolliset terapeuttiset aineet eläin- tai soluviljelykokein varmistaakseen, onko mahdollinen terapeuttinen aine käyttökelpoinen.
Sellaiset menettelyt, vaikkakin hyödyllisiä, ovat kal-15 liitä ja aikaavieviä.
Niissäkin tapauksissa, joissa hydrolyyttisen reseptorin, kuten entsyymin topologia ja kemiallinen reaktiivisuus tunnetaan, entsyymit, kuten hydrolyyttiset pro-20 teaasit tyypillisesti irrottavat substraattinsa, poly-peptidiketjut, tietyn aminohappojäännöksen vierestä, mikä voi esiintyä useita kertoja proteiinin polypepti-diketjussa. Vaikkakin tällainen suhteellisen umpimähkäinen katkeaminen voi olla hyödyllinen proteiinin po-25 lypeptidikartan saamiseksi, ei melko mielivaltainen « katkeaminen ole niin käyttökelpoinen, jos halutaan tuottaa tietynlaisia aminohappojäännössekvenssejä.
Nykyaikainen geenimanipulaatiotekniikka on esimerkiksi 30 ollut hyödyllinen sellaisten fuusioproteiinien valmistamisessa, jotka proteiinit sisältävät toivotun proteiinin tai polypeptidin, joka on liitetty vektorigeenin, kuten lac z-geenin monistustuotteeseen.
Näiden fuusioproteiinien käytön kuitenkin estää 35 vektorigeenituotteiden fragmenttien läsnäolo. Siksi olisi myös hyödyllistä, jos voitaisiin kehittää proteo-lyyttisiä, entsyymin kaltaisia molekyylejä, jotka 5 94026 katkaisivat tällaiset fuusiotuotteet toivottujen ja ei-toivottujen fuusiopolypeptidi- tai proteiiniosien välillä.
5 Hiljattain Lerner, Tramontano ja Janda (Science, 234, 1566 (1986)) raportoivat monoklonaalisista vasta-aineista, jotka katalyyttisesti hydrolysoivat esterin. Tramontano ja Lerner kuvaavat myös monoklonaalisten vasta-aineiden käyttöä esterihydrolyysissa patentissa 10 US-4 656 567. Pollack, Jacobs ja Schultz (Science, 234, 1570 (1986)) raportoivat myeloma-proteiinista nimeltä MOPC167 (Leon et ai., Biochem., 10, 1424 (1971)), joka katalysoi karbonaatin hydrolyysia.
15 Lernerin ja Tramontanon kahdessa keksinnössä vasta-aineet kasvatettiin fosfonaattiin, joka oli syntetisoitu muistuttamaan karboksyylihappoesterin tai karbonaat-tiesterin tetraedrisen hydrolyyttisen trasitiotilan stabiilia analogia. Vasta-aine, jota Pollack et ai. pe-20 riaatteessa käsittelivät oli myeloma-proteiini, joka sattui sitoutumaan fosfonaattiin joka oli rakenteellisesti analoginen hydrolysoidun karbonaattianalogin kanssa. Niinpä Lernerin ja Tramontanon et ai.:in työssä hydrolysoitava substraatti oli ennalta valittu niin, 25 että immunoiva analogi ja hydrolyyttiset vasta-aineet syntetisoitiin toivotun lopputuotteen mukaisesti. Pollack et ai. muokkasi hydrolysoitavan substraatin saatuaan tiedon myeloma-proteiinin spesifisyydestä. Pollack et ai. myös raportoivat (yllä) katalyyttisen 30 vasta-aineen olemassaolon, substraatti- ja analogi- substraattisysteemin karbonaatin hydrolyysiin, joka on käsitteellisesti samanlainen kuin Lerner et ai.:in. Tähän systeemiin liittyvän työn on raportoinut Jacobs et ai., J. Am. Chem. Soc., 109, 2174 (1987).
35
Julkaistu patenttihakemus WO 85/02414 käsittelee vasta-aineiden mahdollista käyttöä katalyytteinä, ja esittää 6 94026 tietoja, jotka liittyvät polyklonaalisen seerumin käyttöön o-nitrofenyyli-beta-D-galaktosidin hydrolyysissä. Tässä sovellutuksessa hyödyllisten vasta-aineiden kerrotaan olevan indusoitavissa reagenssilla, reaktioväli-5 tuotteella tai reagenssin, tuotteen tai reaktioväli- tuotteen analogilla. Termi "analogi" määritellään siinä käsittämään isomeerit, homologit tai muut yhdisteet, jotka riittävästi muistuttavat reagenssia kemiallisen rakenteen puolesta siinä mielessä, että analogiin 10 kasvatettu vasta-aine voi ottaa osaa immunologiseen reaktioon reagenssin kanssa, mutta ei välttämättä katalysoi analogin reaktiota.
Tässä spesifikaatiossa esitetyt tiedot osoittavat vain, 15 että jonkin verran substraatin (reagenssin) eli galak-tosidin irtoamista tapahtui kahdeksantoista tunnin aikana käytettäessä suhteellisen konsentroitua vasta-ai-nepreparaattia (1:10 ja 1:20 laimennukset). Vaikka katalyysin esitettiin tapahtuvan, ei katalyyttistä aktii-20 visuutta havaittu, koska ei todettu väitetyn katalyyttisen vasta-aineen muutosta, kuten ei myöskään esiintynyt indikaatioita irronneen substraatti-galaktosidin määrästä. Sovellutus osoitti, että beta-D-galak-tosidaasi katkaisi noin kymmenen kertaa niin paljon 25 substraattia kuin polyklonaaliset vasta-aineet olet- taen, että tutkitun substraatin määrittelemättömän kon-sentraation kohdalla absorbanssi on lineaarinen.
Sovellutuksessa esitettyjen tietojen perusteella on 30 mahdollista, että o-nitrofenyyliryhmän nukleofiilinen korvautuminen tapahtui käytetyn vasta-ainepreparaatin lysiinijäännöksen terminaalisen aminoryhmän kautta. Niinpä havaittu absorbanssi on voinut johtua epsilon-aminolysinyyli-o-nitrofenyylianiliinin tai epsilon-35 amino-lysinyyligalaktosidin ja o-nitrofenolin muodostumisesta, joista kummankaan esiintyminen ei olisi kata- li 7 94026 lyyttistä, sillä vasta-aine kuluisi pikemmin kuin muuttuisi .
Keksintö koskee reseptorimolekyyliär jossa on vasta-ai-5 neen sitova kohta tai genotyypin sisältävä polyamidi, joka pystyy katalyyttisesti hydrolysoimaan valitun karboksyylihapon ja reagenssiligandin amidi- tai esterisidoksen. Tämä vasta-aineen yhdistävä kohta sitoutuu (immunoreagoi) seuraavien kanssa: (a) 10 reagenssiligandi, jossa on tämä valittu karboksyyli-happoamidi- tai esterisidos, ja (b) ligandi, joka on analoginen reagenssiligandin kanssa, joka ligandi sisältää tetraedrisesti sitoutuneen atomin kuten fosforiatomin asemassa, joka on analoginen reagenssi-15 ligandin valitun karboksyylihappoamidi- tai esteri-sidoksen karbonyylihiiliatomin aseman kanssa.Näin sitoutuneen reagenssiligandin hydrolyyttinen tran-sitiotila sisältää tetraedrisen hiiliatomin, joka on sitoutunut (a) hiiliatomiin, esterin tai amidin happo-20 osan alfa-hiileen, (b) kahteen happiatomiin, ja (c) esterin happiatomiin tai amidin typpiatomiin.
Molekyylit, jotka sisältävät genotyypin, joka on kasvatettu reagenssiligandin hydrolyyttiseen transitioti-25 laan, kasvatetaan tai indusoidaan immunoimalla analo-gialigandimolekyyleillä (mieluiten sitoutuneina proteiinikantajaan konjugaatin muodostamiseksi), jotka sisältävät ligandin hydrolyyttisen transitiotilan analogin. Immunoiva analogi-ligandi hydrolyyttinen 30 transitiotilamolekyyli sisältää tetraedrisesti sitoutuneen keskusatomin, kuten fosforin, sitoutuneena suoraan (a) analogisen ligandi-amidin tai -esterin happo-osan hiiliatomiin, (happo-osan alfa-hiileen), (b) kahteen happiatomiin ja (c) kolmanteen happiatomiin 35 tai typpiatomiin, joka on sitoutunut ligandin analogisen esterin tai amidin alfa-hiileen.
• 3 94026 t
Happo-osan alfa-hiiliatomi, (a) yllä, joka on suoraan sitoutunut keskustetraedriin kuten analogi-ligandimole-kyylin fosforiatomiin, liitetään ketjuun, joka sisältää vähintään 5 atomia, ja mieluiten ainakin noin 15 atomia 5 ja jossa on substituoitu fenyyliryhmä, kuten on kolmas happi- tai typpiatomi, (c) yllä. Kahdesta happiatomista, (b) yllä, jotka ovat suoraan sitoutuneet kes-kusatomiin, yksi happiatomi (i) on sitoutunut kahdesti (kaksoissitoutunut) oksoryhmänä keskusatomiin, (ii) on 10 osa hydroksyyliryhmää tai (iii) on sellaisen alkoksi-ryhmän happi, joka sisältää alemman alkyyliryhmän Ci -C<. Toinen keskusatomiin sitoutuneista happiatomeista on yksinkertaisesti sitoutunut keskusatomiin ja on OR2-ryhmä, missä R2 on joku ryhmästä: vety (H), tai alempi 15 alkyyli Ci-C«. Neljäs atomi, (c) yllä, joka on sitoutunut analogiligandimolekyylin keskusatomiin, on ligandin analogisen esteri- tai amidiosan amidin amiinityppiatomi tai esterin alkoholinen happiatomi.
Neljäs atomi on ketjun osa, joka sisältää ainakin 5 tai 20 mieluiten ainakin 15 atomia, ja ketjun loppu koostuu Ra:sta.
Tetraedrisesti sitoutunut keskusatomi voi olla pii, mutta mieluummin fosfori niin, että analogiligandi on 25 organofosforiyhdiste missä substituenttien järjestys fosforin ympärillä vastaa tetraedrisen hiilen transi-tiotilaa. Ionisoituneessa muodossaan fosfonaatti-monohappo myös simuloi nukleofiilin hyökkäyksessä kar-bonyylikeskukseen kehittyvää varausta. Lisäksi entsyy-30 misen peptidihydrolyysin fosfonamidaatti- ja fosfo- riamidaatti-inhibiittoreita on kuvattu transitiotilojen jäljitelmiksi. Galardy et ai., Biochemistry, 22, 1990 ((1983); Bartlett et ai., Biochemistry, 22, 4618 (1983); Thorsett et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 35 79, 2176 (1982); Jacobsen et ai., J. Am. Chem. Soc., 103, 654 (1981); Kam et ai., Biochemistry, 18, 3032
If 9 94026 (1979) ja Weaver et ai., J. Mol. Biol., 114, 119 (1977).
Tämän keksinnön yhdessä suoritusmuodossa monoaryylifos-5 fonaattiestereitä, jotka toimivat karboksyylihappoeste- reiden hydrolyysissä transitiotila-analogeina, syntetisoitiin ja käytettiin analogi-ligandeina tuottamaan spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita. Jotkut näistä vasta-aineista reagoivat erityisten aryylikarboksyyli-10 happoestereiden kanssa vapauttaen fluoresoivaa alkoholia. Reaktio vaikuttaa olevan stökiömetrinen; toimintakyky kuitenkin palautuu alkaalisissa olosuhteissa tai nukleofiililla, kuten hydroksyyliamiinilla, käsittelemällä, joten reaktion voidaan siksi sanoa olevan kata-15 lyyttinen.
Jotkut mallivasta-aineet (reseptorit) reagoivat vain sellaisten karboksyylihappoestereiden kanssa, joissa on p-trifluoriasetamidisubstituentti, joka on samalla ta-20 valla sijoittunut fosfonaattianalogiligandiin. Analoginen karboksyylihappoesteri, jolla on asetamidoryhmä tässä asemassa, ei toimi substraattina. Näillä reseptoreilla havaittiin kyllästymiskinetiikkaa, ja tässä raportoidaan kineettiset parametrit alhaisilla pH-ar-25 voilla. Alkunopeudet osoittavat reaktion olevan nopeampi yli pH 8:ssa. Fosfonaatti analogi-ligandi on reaktion kilpaileva inhibiittori (Ki«35 nM); kun taas esterihydrolyysin karboksylaattituote on vähemmän tehokas inhibiittori (Ki«7000 nM). Vasta-aineproteiinin si-30 vuketjuryhmien kemiallinen modifiointi aiheuttaa toimintakyvyn osittaista vähenemistä lysiinin asyloinnissa tai tyrosiinin nitrauksessa, ja dramaattisen sammumisen histidiinin modifioinnissa.
35 Muut mallireseptorit katalysoivat molempien yllämainittujen reagenssiligandien hydrolyysia. Jälkimmäisten reseptorien kohdalla reagenssiligandien spesifisyys voi 10 94026 olla suhteellisen vaihteleva sen silti aikaansaadessa katalyyttisen hydrolyysin.
Tuloksia käsitellään mekanismina, missä vasta-aineen 5 sitoutuvien kohtien aminohappojäänteet osallistuvat nu-kleofiiliseen ja/tai yleiseen emäskatalyysiin. Tämän keksinnön joidenkin mallivasta-aineiden ominaisuuksista on pääteltävissä, että katalyyttinen hydrolyysime-kanismi on esimerkki entsyymitransasyloinnista, missä 10 deasylointivaihe on nopeutta määräävä, ja saadut tulokset osoittavat, että entsyymitoiminto voi johtua immunologisesta spesifisyydestä.
Siten voidaan arvioida, että keksinnön kohteena ovat, 15 laajemmassa merkityksessä, ligandit ja analogiligandit, jotka sisältävät reagenssiligandin hydrolyyttisen trasitiotilan analogin. Nämä molekyylit eroavat siinä suhteessa, että reagenssiligandi sisältää amidin tai esterin karbonyyliryhmän, kun taas ligandianalogi si-20 sältää ei-hiilikeskusatomin, kuten fosforin. Reagenssiligandi ja analogiligandi voivat myös erota niiden kahden keskusatomiin sitoutuneen happiatomin (b) substituutiossa sillä analogiligandin täytyy olla riittävän stabiili käytettäväksi haptiinina, kun taas analogili-25 gandin jäijittelemää transitiotilaa ei voida eristää.
Ja vielä, vaikka vasta-aineen sitova kohta saattaa olla erinomaisen spesifinen, reagenssiligandin rakennetta voidaan vaihdella silti säilyttäen katalyyttinen hydro-lyysi.
30 Tässä kuvatuissa tutkimuksissa fosfonaattimonoaryyli-amidit ja -esterit toimivat transitiotila-analogeina aikaansaaden vasta-aineita, jotka ovat mieluiten mono-klonaalisia ja jotka ovat aryylikarboksyyliesteraaseja. 35 Itse asiassa nämä vasta-aineet ilmaisevat niihin liittyvän sitoutumisenergian toiminnallisesti, kuten todel-
II
il 94026 liset entsyymit, hydrolysoimalla estereitä ja klassi-sesti, kuten vasta-aineet, sitomalla antigeenejä.
Esimerkit immunoivista analogi-ligandimolekyyleistä, 5 joissa on hydrolyyttisen transitiotilan analogi, esitetään kaavoilla:
O
R»- P - *"* o* a.
10 missä X -= O tai NH; 15 R, . N«CO«.4 ,
O
\\ 20 missä Re « CF3 tai •t o
Ra H tai Cl - C« alempi alkyyli? ja 25 β-Μ R3 — = —NHCQRg tai 30 missä R< H tai ? c.v\xMHCO N cooch3 ♦ 35 i 12 94026 o R. - (cvO^COj, - : 5 ja n on kokonaisluku l:stä 8:aan.
Analogiligandin hydrolyyttitransitiotilamolekyylit ovat 10 itse ligandeja, vaikkakaan eivät reaktiivisia ligandeja, ja ne ovat myös tämän keksinnön kohteena. Nämä ligandimolekyylit ovat suhteellisen pieniä molekyyli-kooltaan ja siksi ne on tyypillisesti liitetty suurempaan kantajamolekyyliin käytettäessä niitä immuno-15 geeneinä indusoimaan reseptorimolekyylien tuotantoa, tai niitä käytetään yksin inhibiittorimolelyyleinä.
Sellaisia suhteellisen pieniä molekyylejä pidetään yleensä haptiineina. Tyypillisesti nämä analogiligandimolekyylit sisältävät myös yhdistävän 20 atomin tai ryhmän, kuten reaktiivisen merkaptaanin, sukkinimidin tai muun ryhmän, jonka avulla haptiini-analogiligandit kiinnittyvät kantajiin immunogeeneina käytettäväksi.
25 Esimerkkireagenssiligandimolekyylit, jotka rakenteelli sesti vastaavat edellä puhuttuja analogiligandimolekyy-lejä esitetään kaavoilla:
O
u
Λ, - C - XP.S
30
missä X O; /“"V
Rt- - -CH3 tai - ; missä R9 on CH3 tai CFs ;
II
35 13 94026 ¢.., "s R.- - -^0)- NHCS. , 5 ¢0 tai -<2>-r'<> 10 missä R<, Rs ja n ovat kuten edellä;
Rio = H, NHCORi i , missä Rii * Ci - Ce alempi alkyyli tai substituoitu Ci - Ce alempi alkyyli, kuten halo- tai karboksialkyyli.
15 Tämän keksinnön vasta-aineen sitovan kohdan sisältävät molekyylit ovat itse reseptoreja ja niistä saadaan tietoa vasta-ainehaptiinin vuorovaikutusten konforma-tionaalisesta suosituimmuudesta tutkimalla reseptorili-gandikompleksien molekyylien sisäisiä reaktiivisuus- 20 sääntöjä, jotka kompleksit ovat muodostuneet molekyylien, joissa on vasta-aineen sitova kohta (reseptoreja) ja erilaiset rakenteet omaavien ligandien, joissa on samanlaiset tai identtiset epitooppiset alueet, välille.
: 25
Kohteena on myös menetelmä sellaisten polyklonaalisten reseptorimolekyylien valmistamiseksi, jotka sitoutuvat erityisen amidin tai esterin hydrolyyttiseen transi-tiotilaan. Tässä tuotetaan edellä kuvattu haptiini- 30 analogiligandimolekyyli, jossa on hydrolyyttinen tran-sitiotila-analogi liittyneenä kantajaan, kuten im-munogeeniseen konjugaattiin. Näin aikaansaatu konju-gaatti liuotetaan tai dispergoidaan fysiologisesti sietokykyiseen laimentimeen istutteen muodostamiseksi.
35 Istute annetaan injektoimalla nisäkäsisäntään määränä, joka riittää indusoimaan vasta-aineita haptiinianalogi-**. ligandiin. Näin tuotetut vasta-aineet otetaan talteen.
i4 94026
Kerätyt vasta-aineet, jotka immunoreagoivat immunoivan, haptiinianalogiligandin kanssa puolestaan kerätään.
Erityisen suositussa käytännössä valmistetaan mono-5 klonaalisia vasta-aineita. Siinä käytetään yllä olevaa immunointitekniikkaa, ja kerätyille vasta-aineilla tehdään koe, jossa testataan niiden kyky sitoutua (im-munoreagoida) immunoivan, haptiiniligandi-analogin kanssa. Immunoglobuliinia tuottavat solut, kuten ne, 10 joita saadaan sellaisen eläimen pernasta, jonka vasta-aineet sitoutuvat immunoivaan haptiinianalogiligandiin, kerätään ja fusioidaan myelomasolujen kanssa hybridoma-solujen muodostamiseksi. Hybridomasolut kasvatetaan elatusalustalla ja pinnalle nouseva, kasvavista 15 hybridomasoluista peräisin oleva aine testataan sellaisten vasta-aineiden läsnäolon toteamiseksi, jotka sitoutuvat immunoivaan haptiinianalogiligandiin. Hybridomasolut, joiden pintaneste sisältää sellaisia sitoutuvia vasta-aineita, kloonataan toivottujen monoklonaa-20 listen vasta-aineiden tuottamiseksi elatusaineen pinnalle nousseesta kerroksesta tai isäntänisäkkään ve-sivatsasta, mihin hybridoma on istutettu.
Kuvattuja polyklonaalisia tai monoklonaalisia vasta-ai-25 neita voidaan käyttää tämän keksinnön reseptoreina.
• ·
Vaihtoehtoisesti vasta-aineiden niin kutsutut Fc tai Fc'-osat voidaan erottaa entsymaattisesti katkaisemalla tuottamaan vasta-aineen sitovan kohdan (genotyypin sisältävä polyamidi), joka sitoutuu immunoivaan haptiini-30 seen analogiligandiin, kuten Fab tai F(ab')a-vasta-aineosaan, vastaavasti.
Polyklonaaliset, monoklonaaliset ja genotyypin sisältävät polyamidireseptorit sitoutuvat myös amidi- tai es-35 teriligandin hydrolyyttiseen transitiotilaan. Sellainen sitoutuminen johtaa tyypillisesti reagenssiligandin ka-” talyyttiseen hydrolyysiin.
Il 15 94026 Tällä keksinnöllä on useita etuja ja hyötyjä. Yksi hyöty on sellaisten reseptorien valmistaminen, joiden sitoutumiskohdan topologiset vaatimukset räätälöidään sitä erityistä ligandia varten, jota tutkitaan.
5
Keksinnön toinen hyöty on sellaisten reseptorien valmistaminen, jotka hydrolysoivat amidi- tai esteriligandin ennalta määrätystä kohdasta ja joilla on katalyyttisiä ominaisuuksia.
10
Keksinnön etu on tuotettavien reseptorien spesifisyydestä johtuen se, että ligandit, joissa on useita erilaisia hydrolysoituvia sidoksia, kuten polypeptidit tai proteiinit, voidaan hydrolysoida ennalta valitun, erityisen 15 sidoksen kohdalta.
Vielä, keksinnön toinen etu on sellaisten reseptorien aikaansaaminen, jotka sitoutuvat erityisen, ennalta valitun ligandin hydrolyyttiseen transitiotilaan, ja joilla 20 reseptoreilla on katalyyttisiä ominaisuuksia, mikä tarjo aa keinon tämän ligandin katalyyttisen hydrolyysireaktion tutkimiseen.
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisessa 25 patenttivaatimuksessa.
Myös muut tämän keksinnön edut ja hyödyt ovat ilmeisiä niille, jotka ovat perehtyneet seuraavan selityksen aihepiiriin.
30
Kuvat, jotka ovat osa keksinnön aihepiiriä:
Kuva IA kuvaa metallopeptidaasien transitiotilalle ehdotettua rakennetta. Osittain hydratoituneen amidin 35 kaksihampainen koordinaatio metalli-ioniin on yksi malli stabiloivalle vuorovaikutukselle, jonka on ehdotettu tapahtuvan mekanismissa, jossa peptidi katkeaa sinkkipeptidaasin vaikutuksesta. Tätä mallia tukevat viime-aikaiset todisteet, joissa esitetään, että sinkki i6 94026 voi pentakoordinoitua termolysiiniin, jolloin se samanaikaisesti polarisoi karbonyylisidosta ja luovuttaa nukleofiilisen vesimolekyylin. Monzingo et ai., Biochemistry, 23, 5724 (1984); Hangauer et ai., Biochemistry, 5 23, 5730 (1984)).
Kuva IB esittää fosfonamidaattianalogin vuorovaikutuksia metalloentsyymin kanssa, mikä antaa sille mahdollisuuden simuloida transitiotilan konfiguraatiota 10 esitetyn mallin mukaisesti.
Kuva 2 esittää analogiligandeja ja ligandeja, joita on käytetty esterolyyttisiä ominaisuuksia omaavien mono-klonaalisten vasta-aineiden tuottamiseen ja testaami-15 seen. Substituenttien R ja R' tunnisteet ovat: yhdisteet 1,3 ja 7: R=NHCOCF3, R'« NHCOCHs; yhdisteet 2 ja 4: R= NHCOCF3, R’= NHCO(CH2) 4 COON(COCH2)2; yhdiste 8: R- NHCOCFe, R’= NHCOtCHa)*COOH; yhdiste 9: R,R’= NH-COCHs; yhdiste 10: R= NHCOCFs, R'= H; yhdiste 11: R= 20 NHCOCHs, R'« NHCOCFs.
Kuva 3 esittää karboksyylihappoesterin (yhdiste 7) HPLC:llä määritetyn hydrolyysinopeuden olosuhteissa, jotka on kuvattu taulukossa 1 (50 mM fosfaattipuskuri 25 pH 8:ssa ja 23°C:ssa). (▲) Katalysoimattoman hydro- lyysin nopeus (tausta). (□) ) 0.5 mikromolaarisen, ei-spesifisen monoklonaalisen IgG:n vaikutus. () 0.1 mikromolaarinen anti-yhdiste 4 monoklonaalinen vasta-aine hybridomasta P3 6D4. Päälle asetettu käyrä esittää 30 teoreettista, eksponentiaalista hajoamista, mikä sopii koepisteisiin.
Kuva 4 esittää Lineweaver-Burk -käyrää yhdisteen 7 hyd-rolyysille anti-yhdiste 4 monoklonaalisella vasta-ai-35 neella hybridomasta P3 6D4. Nopeudet määritettiin spektrofotometrisesti mittaamalla lähtönopeudet kuvatun reaktion ensimmäisen lineaarisen osan aikana, 17 94026 katso taulukko 2. Substraattikonsentraatioita korjattiin niillä määrillä, jotka kuluivat alkutasapainottu-misen aikana. () Ei inhibiittoria läsnä. (▲) Inhiboitu 50 nM fosfonaatilla (yhdiste 3). (♦) Inhiboitu 5 100 nM fosfonaatilla (yhdiste 3).
Kuva 5 esittää ehdotettua mallia, joka selittää havaitun vaihtelevan kemian anti-yhdiste 4 monoklonaalisen vasta-aineen reaktiossa erilaisten karboksyyliesterei-10 den kanssa (yhdiste 5 ja yhdiste 7). Sitoutumiskohdan histidiinijäännöksen on oletettu toimivan nukleofiili-sena (ylempi reitti) tai yleisenä emäksisenä (alempi reitti) katalyyttina tetraedrisen välituotteen muodostumisessa ja hajoamisessa. Esteri, jossa on hyvä ir-15 toava ryhmä reagoi ylempää reittiä pitkin, sillä nopeutta rajoittava vaihe, välituotteen muodostuminen, on helppo. Tämä reitti ei ole mahdollinen esterille, jossa on huono irtoava ryhmä, sillä nopeutta rajoittava vaihe, välituotteen hajoaminen, ei ole katalysoitu ver-20 rattuna analogiseen vaiheeseen alemmassa reaktiotiessä, mikä voi olla yleisesti emäskatalysoitu.
Tämä keksintö liittyy kollektiivisesti reseptoreiksi kutsuttuihin molekyyleihin, jotka ovat vasta-aineita ja 25 genotyypin sisältäviä polyamidin osia (vasta-aineen sisältävä kohta tai paratooppinen), jotka on indusoitu reagenssiligandin analogilla, joka jäljittelee konfor-maatiotransitiotilaa reaktiosarjassa esterin tai amidin hydrolysoimiseksi. Reseptorimolekyylit (vasta-aineet 30 tai genotyypin sisältävät polyamidit) sitoutuvat analogiligandiin ja reagenssiligandiin, ja niiden oletetaan stabiloivan reagenssiligandin ennalta valitun osan hydrolyyttistä transitiotilaa ja siten välittävän katalyyttisiä ominaisuuksia reagenssiligandiin.
Tämä työ käsittelee kahtatoista monoklonaalista resep-torimolekyyliä, joista jokainen pystyy katalyyttisesti 35 18 94026 hydrolysoimaan yhden tai useamman reagenssiligandeista.
Nämä reseptorimolekyylit indusoitiin immunoimalla eri analogiligandeilla. Niinpä keksinnön yleisyys sellaisten vasta-ainekatalyyttien valmistamiseksi ja käyt-5 tämiseksi, joilla hydrolyyttisesti katkaistaan reagens-siligandeja, joiden rakenteet vastaavat kuvattuja analogiligandeja, on esimerkein valaistu.
Vasta-aineet ja entsyymit ovat molemmat proteiineja, 10 joiden toiminta riippuu niiden kyvystä sitoa spesifisiä kohdemolekyylejä. Entsymaattiset reaktiot eroavat immunologisista reaktioista siinä, että entsymaattisessa reaktiossa entsyymin sitoutuminen substraattiinsa johtaa tyypillisesti kemialliseen katalyysiin, kun taas 15 vasta-aine-antigeenin sitoutumisen tyypillinen lopputulos on ei-katalyyttinen kompleksi.
Entsyymien uskotaan katalysoivan proteiinien hydrolyy-siä sitoutumalla niihin hydrolyysireaktion transitioti-20 lan stabiloimiseksi.Yleisesti uskotaan entsymaattisen reaktion nopeuden kasvavan verrattuna ei-entsymaattisen reaktion nopeuteen, koska entsyymi pystyy stabiloimaan reaktion transitiotilan; so., alentamaan transitiotilan vapaata energiaa, ja siten vapaata aktivointienergiaa 25 reaktiossa (Jencks, W.P., Adv. Enzymology, 43, 219 (1975) ja Pauling, L., Amer. Scientist, 36, 58 (1948)).
Tämä teoria saa tukea siitä havainnosta, että aineet, joiden on ajateltu olevan oletettujen transitiotilojen malleja, ovat usein voimakkaasti sitoutuneet entsyymei-30 bin kilpailevina inhibiittoreina. Leinhard, G.,
Science, 180, 149 (1973) ja Wolfenden, R., Acc. Chem.
Res., 5, 10 (1972). Edelleen on ajateltu, että entsyymi aikaansaa tämän reaktion vapaan energian alentamisen sitomalla reagenssin transitiotilan geometrian 35 voimakkaammin kuin se sitoutuu vastaavaan substraat-tiin(teihin) tai tuotteeseen(siin).
94026 19 Tämä tarkoittaa, että entsyymin sisäinen sitoutu-misenergia on paljon suurempi kuin mitä voidaan mitata substraattien tai tuotteiden sitoutumisesta. Oleellisesti, entsyymin sitoutmisenergiaa käytetään hyväksi 5 kemiallisen reaktion suorittamisessa (Jencks, W.P., XVII International Solvay Conference (November 1983)).
Vastakkainen ehdotus on, että reseptori, joka on valmistettu optimaalisesti sitomaan transitiotilan sopiva 10 analogi, toimisi katalyyttinä. Tämän tuloksen toteennäyttäminen täydentää entsyymin toiminnan ja reseptorin rakenteen välisen korrelaation ja antaa hyödyllisen lähestymistavan keinotekoisten entsyymien kehittämiseksi .
15 Tässä kuvatun immunologisen hydrolyysin perusajatus koskee analogiligandien käyttöä sellaisten vasta-aineiden valmistamisessa, joilla on ennalta määrätty spesifisyys 3® jotka ensisijaisesti sitoutuvat ja si-20 ten stabiloivat amidi- ja esterisidosten hydrolyysin transitiotilaa sitoutuessaan määriteltyyn reagenssili-gandiin. Analogiligandi simuloi hydrolyysissa kor-keaenergiaisen transitiotilan konformaatiota indusoi-dakseen sellaisten vasta-aineiden muodostusta, jotka .: 25 pystyvät sitomaan vastaavanlaisia substraatteja ja sta-biloimaan niiden hydrolyyseja.
Sellainen suosiva sitoutuminen ja stabilointi johtaa hydrolyysireaktion aktivoitumisenergian alenemiseen ja 30 täyttää siten katalyysin kriteerit. Vasta-aineita, joilla on tämä ominaisuus, voidaan saada immunoimalla synteettisillä analogeilla, jotka on kemiallisesti muunnettu muistuttamaan sellaisen substraattiligandin sitoutmisominaisuuksia, jolle tapahtuu sidoksen 35 hydrolyysi; so., immunoimalla erityisen reaktion transitiotila-analogeilla.
94026 20
Mekanismia, jolla vasta-aine hydrolysoi sitoutuneen reagenssiligandin amidi- tai esterisidoksen, voidaan kuvitella "indusoitu sovitus"-mallilla. Kun löysästi sitoutunut substraatti vääristyy tai järjestyy uudes-5 taan, täyttääkseen vasta-aineen sitoutumisgeometrian ehdot, jännitystä voidaan vähentää yhden, ennalta määrätyn amidi- tai esterisidoksen uudelleen järjestäytymisellä niin, että tämä uudelleen järjestäytyminen johtaa sidoksen hydrolyysiin.
10
Termiä "reseptori" käytetään tässä tarkoittamaan biologisesti aktiivista molekyyliä, joka sitoutuu reagenssi-ligandiin, inhibiittoriligandiin tai analogiligandiin.
Tämän keksinnön reseptorimolekyylit ovat vasta-aineita, 15 oleellisesti koskemattomia vasta-aineita tai vasta-aineen genotyypin sisältäviä polyamidiosia. Reseptori-molekyylin biologisen aktiivisuuden todistaa reseptorin sitoutuminen antigeeniseen reagenssiligandiinsa, inhibiittoriligandiin tai analogiligandiin, kun niitä se-20 koitetaan vesiliuoksessa keskenään, ainakin fysiologisilla pH-arvoilla ja ionivahvuuksilla. Reseptorit sitoutuvat myös antigeeniseen ligandiin mieluummin pH -välillä noin 5:stä noin 9:ään ja ionivahvuuksilla tislatusta vedestä noin yksimolaariseen natriumkloridi-25 liuokseen.
Vasta-aineiden genotyypin sisältävät polyamidiosat (vasta-aineen sitovat kohdat) ovat niitä vasta-ainemolekyylien osia, jotka sisältävät genotyypin ja 30 sitoutuvat ligandiin tai analogiligandiin. Tällaiset aineosat sisältävät Fab-, Fab'-ja F(ab')s -fragmentteja, jotka on valmistettu vasta-aineista tunnetulla entsymaattisella katkaisutekniikalla. Katso esimerkiksi Theofilopouloksen ja Dixonin patentti US-4 35 342 566, yleisesti, ja erityisesti, Pollack et ai.
(Science, 234, 1570 (1987)), jotka raportoivat, että ·* kiihdytetyt hydrolyyttiset nopeudet olivat samat Fab -
II
21 94026 fragmenteille ja natiiville Ig:lle. Siinä, missä vasta-aineita, joista genotyypin sisältäviä polyamideja saadaan, kuvataan immunogeeneja vastaan kasvatetuiksi tai immunogeeneilla indusoiduiksi, genotyypin sisältä-5 vien polyamidireseptorien "kasvatukseksesta” tai "indu-soinnista" puhuttaessa tarkoitetaan, että tyypillisesti tarvitaan katkeamisvaihe genotyypin sisältävän polyamidin saamiseksi vasta-aineesta. Koskemattomia vasta-aineita pidetään kuitenkin parempina, ja niitä 10 käytetään kuvaamaan tämän keksinnön re-septorimolekyylejä.
Tässä keksinnössä hyödylliset reseptorit ovat mieluiten monoklonaalisia vasta-aineita. "Monoklonaalinen vasta-15 aine" on reseptori, jota tuottavat yhden solun kloonit, jota solua kutsutaan hybridomaksi, joka erittää ainoastaan yhdenlaisen reseptorimolekyylin. Hybridomasolu fuusioidaan vasta-ainetta tuottavasta solusta ja myelomasolusta tai muusta itsestään toistuvasta solu-20 linjasta.
Tekniikat, joilla valmistetaan tämän keksinnön monoklonaalisia vasta-aineita, ovat tunnettuja. Sellaiset reseptorit kuvasi ensimmäisen kerran Kohler ja Mils-25 tein, Nature, 256, 495 (1975). Moniklonaalisia vasta- aineita saadaan tyypillisesti hybridomakudosviljelmistä tai vesivatsanesteestä, joka on saatu nisäkkäistä, joihin hybridomakudos oli istutettu. Molempia menetelmiä kuvataan tässä.
30
Monoklonaalisia reseptoreja pidetään tässä parempina, koska ne ovat ainutlaatuisen spesefisiä sitoutuessaan erityiseen epitooppiin, kuten erityiseen immunoivaan analogiligandiin ja reagenssiligandiin, kuten myös 35 siksi, että niillä on suhteellisenti suurempi spesifinen katalyyttinen aktiivisuus verrattuna polyklonaali-:* siin vasta-aineisiin. Myös polyklonaalisia vasta-aine- 22 94026 preparaatteja voidaan tässä käyttää, mutta ne on tyypillisesti jaettava fraktioihin, jotka sitoutuvat im-munoivaan analogiligandiin ja niihin, jotka sitoutuvat ulkoisiin epitooppeihin, kuten niihin, joita antigeeni-5 nen kantaja sisältää.
Analogiligandiin sitoutuvat polyklonaaliset vasta-aineet voidaan erottaa affiniteettierotuksella käyttämällä analogiligandia affiniteettisorbenttina. Sen jäl-10 keen, kun vasta-ainepreparaatti ja affiniteettisor-bentti on sekoitettu ja säilytetty riittävän pitkän ajan halutun immunoreaktion aikaansaamiseksi, erotetaan affiniteettisorbentti jäljellä olevasta vasta-ai-nepreparaatin osasta.
15
Affiniteettisorbenttiin sitoutunut ja erotettu jäljellä oleva vasta-aineosa sisältää ne vasta-aineet, jotka sitoutuvat analogiligandiin, kun taas erotetussa, jäljellä olevassa vasta-ainepreparaatin osassa olevat 20 vasta-aineet sitoutuvat ulkoisiin epitooppeihin. Nämä affiniteettisitoutuneet vasta-aineet voidaan tämän jälkeen eristää tavanomaisella tekniikalla, mitä käytetään sitoutuneiden ainesten erottamiseen affiniteettisorben-teista, kuten pesemällä sorbenttia glysiini-hydroklori-25 dilla pH 2:ssa.
Ligandi määritellään tässä molekyyliksi tai kompleksiksi , joka immunoreagoi reseptorimolekyylin vasta-aineen sitovan kohdan kanssa tai sitoutuu siihen. Tässä 30 käsitellään kahden tyyppisiä ligandeja. Toista nimitetään analogiligandiksi ja sitä käytetään immunogeenina indusoimaan reseptorimolekyylien valmistusta ja resep-torimolekyylisyntaasi-katalysoidun reaktion inhibiittorina. Toista kutsutaan ligandiksi, reagenssiligandiksi 35 tai reagenssiligandisubstraatiksi ja on se molekyyli, jolle katalysoitu reaktio tapahtuu. Analogiligandi on oleellisesti inertti katalysoitua rektiota kohtaan.
li 23 94026
Kuten tässä on kuvattu, on syntetisoitu amidi- tai es-teriligandien kemiallisia analogeja, joissa analogeissa on fosfonamidaatti- tai fosfonaattiosat spesefisissä, 5 ennalta määrätyissä kohdissa jäijittelemässä transi- tiotilan konformaatiota amidi- tai esterisidoksen hyd-rolyysissä. Tällaiset analogit ovat sopivia ehdokkaita tähän tutkimukseen, koska tiedetään, että fosfoamidaat-teja on käytetty transitiotila-analogeina proteolyyt-10 tieten entsyymien inhiboinnissa (Bartlett, et. at., Biochemistry, 22, 4618 (1983)).
Polypeptidaasien tai proteiinien amidisidoksen hydro-lyysi vaatii analogiligandeja, jotka ovat olennaisesti 15 vapaita hydrolyysista, kun niitä käytetään haptiinisena immunogeenina. Tiettyjen proteaasien inhibointiin kuvattuja fosfonamidaatteja (Bartlett et ai., id. ja Jacobsen et ai., J. Am. Chem. Soc., 103, 654 (1981) voidaan myös modifioida indusoimaan tässä hyödyllisten 20 reseptorien tuotantoa.
Lyhyet polypeptidiketjut voivat indusoida sellaisten vasta-aineiden tuotantoa, jotka tunnistavat ja sitoutuvat homologisen proteiinin ennalta määrättyyn spesifi-25 seen kohtaan. Tämä keksintö vie aikaisempaa polypepti-deilla tehtyä työtä suuren askeleen eteenpäin. Tässä vasta-aineet (reseptorit) indisoidaan immunoivalla hap-tiinisella ensimmäisellä molekyylillä (analogiligandi), ja ne tunnistavat ja sitoutuvat eivät ainoastaan tähän 30 ensimmäiseen molekyyliin, vaan myös toiseen, siihen liittyvään molekyyliin (reagenssiligandi). Sitoessaan tämän toisen molekyylin, reseptori aiheuttaa hydro-lyysin (mikä tässä kuvattuna voi olla katalyyttinen) ennalta valitussa esteri- tai amidisidoksessa, mikä 35 vastaa topologialtaan immunoivan, haptiinisen ensimmäisen molekyylin topologiaa. Topologian vastaavuus, so., * koon, muodon ja varauksen, suo mahdollisuuden sen 24 94026 kohdan ennalta valitsemiseen, johon ligandin hydrolyysi tapahtuu. Reseptorimolekyylit sitovat myös inhibiit-toriligandit, jotka muistuttavat analogiligandin tai reagenssiligandin rakennetta.
5
Niinpä, suhteellisen pienen, immunoivan haptiinisen analogiligandin syntetisoinnilla voidaan indusoida sellaisten reseptorimolekyylien valmistusta, jotka molekyylit tunnistavat, sitoutuvat ja katalyyttisesti kat-10 kaisevat toisessa molekyylissä olevan esteri- tai ami-disidoksen, jossa molekyylissä voi olla useita amidi-tai esterisidoksia. Niinpä voidaan valmistaa reseptori, joka aiheuttaa valitun, ennalta määrätyn proteiinisen tai polypeptidisen amidisidoksen hydrolyysin, kuten 15 esimerkiksi aiemmin puhutun geenimanipuloidun fuusio-proteiinin hydrolyysin.
Tämän tuloksen seuraus on se, että tähän saakka tuntemattomien proteaasien aktiivisuus immunoglobuliineiksi 20 voidaan antaa.
Lisäksi vasta-aineen aktiivisuus voidaan ohjata mihin tahansa ennalta määrättyyn kohtaan halujen mukaisesti määrittelemällä katkaistava amidi- tai esterisidos fos-25 fonamidaatti- tai fosfonaattikonfiguraatiolla, joka on immunointiin käytetyssä haptiinisessa analogiligan-dissa. Tämä on osoitettu tässä hydroksikumariinieste-reille, joissa eksosyklinen esterisidos, joka vastaa analogiligandin fosforin sisältävää sidosta, katkeaa, 30 kun taas hydroksikumariiniaineosan endosyklinen esterisidos (laktoni), jossa ei ollut analogiligandin tet-raedrista fosforia sisältävää vastinetta, ei hydrolysoidu.
35 Tässä kuvataan siis menetelmä sidoksen selektiiviseksi katkaisemiseksi, jollainen on esimerkiksi sellaisen proteiinin proteolyysi, jonka paikallinen sekvenssi on li 25 94026 yhteensopiva sen sekvenssin kanssa, joka on kohteena olevassa molekyylin sisältävässä sidoksessa (polypep-tidi). Tällaisen menetelmän sovellutukset ovat rajattomat proteiinikemiassa, biokemiassa ja lääketieteessä.
5
Ilmoitus, joka on patentissamme US- 4 659 567 koskee osittain p-nitrofenyyli- ja kumaryyliestereiden hydro-lyysiä. Yhdisteet valmistettiin toimimaan transi-tiotila-analogeina esimerkiksi vastaavalle p-nitro-10 fenyyli- ja kumaryylihiilelle mieluummin kuin fosfo- riestereille immunologisessa tutkimuksessa. Esimerkiksi vasta-aineet, joita kehitettiin proteiinikantajaan sitoutuneeseen yhdisteeseen Cl, eristettiin ja seulottiin ligandiesterin hydrolyysiä varten olevalla kokeella, 15 joka vastaa analogiligandi- yhdistettä Cl. Tässä reaktiossa vapautuvaa fluoresoivaa 4-metyyliumbelliferoni-molekyyliä käytettiin helpottamaan hydrolyyttisesti aktiivisten vasta-aineiden tunnistamista. Sellaiset vasta-aineet itse asiassa hydrolysoivat kumaryylieste-20 reitä.
Vasta-aineet ja vasta-aineiden genotyypin sisältävät polyamidiosat indusoitiin haptiinisella esteri- tai amidi-analogiligandi hydrolyyttisella transitiotila-: 25 molekyylillä. Haptiinimolekyyli, kuten patentissamme on määritelty, sisältää tetraedrisesti sitoutuneen keskus-fosfori- tai piiatomin sitoutuneena suoraan (a) hiili-atomiin, (b) kahteen happiatomiin ja (c) kolmanteen happiatomiin tai typpiatomiin, kolmannen happiatomin 30 tai typpiatomin ollessa sitoutuneena hiiliatomiin (alfa-hiili), joka on ligandin analogisen esterin tai amidin alkoholi- tai amiiniosassa.
Edeltävät tutkimukset tukevat sitä oletusta, että 35 vasta-aineiden yksinkertainen sitoutuminen ligandien kanssa on vastaanottavainen kemialliselle katalyysille * haptiinirakenteiden mekanismiin perustuvan mallin 26 94026 kautta. Sitoutumisvuorovaikutus, joka kohdistuu fos-fonaattiaineosaan auttaa stabiloimaan tetraedrisen välituotteen transitiotilaa, jonka kanssa se on stereo-elektronisesti samanlainen, transasylointireaktiossa.
5 Prosessi, jota tämän patentin tulokset kuvaavat, ei ollut tosiasiassa katalyyttinen, koska se näyttää johtavan asyylin siirtymiseen vasta-aineen sitovan kohdan olennaiseen jäännökseen, muodostaen siten stabiilin asyloituneen vasta-aineen. Tämä tulos on odottamaton, 10 sillä transitiotila-analogin mallissa ei ole osoitettu sellaista mekanismia. On mahdollista, että funktionaaliset ryhmät, jotka sijaitsevat aktiivisessa hydrolyyt-tisessa kohdassa tai sen lähellä, aikaansaavat kaksi vaihtoehtoista kilpailevaa transasylointimekanismia, ja 15 että alimman energian reitti vaihtuu substraatin valinnasta riippuen. Labiileille estereille, jotka ovat hyödyllisiä alhaisten esteraasiaktiivisuuksien havaitsemisen kokeiluun, tapahtuu todennäköisesti asyylin vaihtuminen nukleofiiliseksi ryhmäksi vasta-aineessa.
20 Näiden kemiallisesti reaktiivisten monoklonaalisten vasta-aineiden, joissa on stabiilimpia ligandeja, tutkiminen on nyt osoittanut, että hyvin spesifistä este-raasi-aktiivisuutta esiintyy. Karboksyyliesterit, jotka : 25 korreloivat käytetyn erityisen haptiinin rakenteel listen ominaisuuksien kanssa, vasta-aine hyväksyy katalyyttisessä prosessissa, jossa on paljon entsyymille luonteenomaisia ominaisuuksia, sisältäen transitiotila-analogin aikaansaaman spesifisen inhibiition.
30 II. Esterolyysin ja haptiinin transitiotila(analogili-gandi)malli
Analogiligandin malli virtaa taaksepäin sen tuotteen 35 rakenteesta, joka rakenne syntyy transitiotilan kautta, jossa muodostuu jäljiteltävä sidos, ja sitten analogi-ligandia kohti. Reaktiot, joissa tapahtuu amidin tai * 2V 94026 esterin hydrolyysi, ovat kuvaavia esimerkkejä yleisestä periaatteesta ja niitä käytetään tässä esimerkkeinä esterin tai amidin hydrolyysireaktioista.
5 Transasylointiprosesseja kuvataan karbonyyliadditio- eliminaatiomekanismein. Niinpä asyyliryhmällä voi olla tässä transitiotilassa vaihtelevia määriä tetredrista luonnetta. W. P. Jencks, Catalysis in Chemistry and En-zymology, ch. 10, (McGraw-Hill, New York, 1969). Ent-10 syymien, jotka katalysoivat transasylointireaktioita, voisi odottaa sitovan hyvin niitä reagenssiligandin analogeja, joissa on tetraedrinen konfiguraatio asyyli-keskuksen ympärillä. Tämä pätee seriiniproteaaseille, joissa muodostuu tilapäisesti kovalenttinen sidos li-15 gandin (substraatti) ja entsyymin välille (Hesterik et ai., J Biol. Chem., 247, 8195 (1972); R.C. Thompson, Biochemistry, 12, 47, (1973) ja Imperali et ai.. Biochemistry, 25, 3760 (1986)), kuten myös entsyymeille, jotka katalysoivat amidien tai esterien suoraa hydra-20 taatiota. Jälkimmäistä kategoriaa inhiboivat yhdisteet, joiden tetraedrisessa konfiguraatiossa on fosfaatti, fosfonaatti tai fosfonamidaattiryhmä helposti irtoavan amidiyksikön sijaan (Weaver et ai., J Mol. Biol., 114, 119 (1977) ja Jacobsen et ai., J. Am. Chem. Soc., 103, . 25 654 (1981)).
Luonnossa esiintyviä ja synteettisiä aineita, jotka sisältävät fosforia, on tutkittu metallopeptidaadien inhibiittoreina. Näissä entsyymeissä transitiotila näyt-30 täisi sisältävän hydratoituneen amidin metalli-ionin koordinaatiokehässä (W. N. Lipscomb, Acc. Chem. Res., 15, 232 (1982)). Täydellinen kuva transitiotila-analo-gista käsittäisi siten inhibiittorin fosfonoryhmän li-gandina metalli-ionissa tai muussa polaroivassa koh-35 dassa (katso kuva 1) (Weaver et ai.. J. Mol. Biol., 114, 119 (1977) ja Christianson et ai., J. Am. Chem. Soc., 108. 545 (1986)). Metalli-oinien roolia metallo- 28 94026 peptidaaseissa ei kuitenkaan täysin ymmärretä. Sillä voi olla erilaisia tehtäviä amidin hydrolyysissä, missä protonin siirtovaiheet tetraedrisissa välituotteissa voivat olla nopeutta määrääviä (L. M. Sayre, J. Am.
5 Chem. Soc., 108, 1632 (1986)).
Karboksyylihappoestereiden hydrolyysi on yksinkertaisempi esimerkki transasyloinnista, jota transitiotilan fosfonaatin sisältävä analogi myös läheisesti muistut-10 taa. Varautuneen fosfonaattiryhmän sitoutuminen saattaa kuvata stabiloivaa vuorovaikutusta trasitiotilassa, mikä johtaa katalyysiin. Esterin hydrolyysireaktiot etenevät yleensä sopivalla spontaanilla nopeudella ympäristön olosuhteissa, jotka ovat sopivia vasta-ai-15 neille. Siksi pienikin nopeuden kiihtyminen voidaan helposti havaita.
Tämän tutkimuksen analogiligandien ja reagenssiligan-dien rakenteet valittiin tiettyjen kriteerien mukai-20 sesti. Kriteerit käsittivät organofosforiprekursoreiden saatavuuden ja stabiiliuden, vastaavan karboksyylihap-posubstraatin, sen valmistamisessa tarvittavan kemiallisen synteesin vaivattomuuden, ja soveltuvuuden erilaisiin immunologisiin esityskaavioihin.
: 25
Perusmolekyyliyksikkö, jolla on nämä tarvittavat ominaisuudet, on substituoitu aryylifenyylietikkahappo-analogirakenne, joista on esimerkkinä kuvan 2 yhdiste 1-4. Liittämällä aminosubstituentteja aromaattisiin 30 renkaisiin, joko bentsyyli- tai fenoli-ryhmään voidaan, esimerkiksi, liittää funktionaalinen lisäke immunogee-nisiin kantajaproteiineihin kytkeytymistä varten haptiiniesityksessä. Rakenne sallii myös ylimääräisen lisäkkeen lisäämisen fenolirenkaaseen metallin sitovan 35 kohdan luomiseksi. Tämä rakenne on suotava tuotettessa antikelaattivasta-ainetta, joka on rakenteellisesti ;* järjestäytynyt metalloesteraasia varten.
II
29 94026 Tällaista mahdollisuutta tutkittiin käyttämällä dipiko-liinihappohalidia derivoimaan fenolirakenteen o-aminometyyliryhmä (katso yhdisteet 3 ja 4 kuvassa 2).
5 Tämän adduktin fosfonyyli- asyyliestereiden dealky- lointi aikaansaa mahdollisia ligandeja metallikelaatin muodostamiseksi. Tämän ligandin kompleksien sisäinen stabiilius, mitattuna kaksiarvoisilla siirtymämetal-leilla kuten koboltilla, sinkillä ja kuparilla, on 10 luultavasti liian alhainen, jotta voitaisiin olettaa näiden kelaattien säilyvän eheinä immunointiproses-sissa. Itse asiassa yhdisteen 3 1:1-kelaattien muodos- tumisvakiot kaksiarvoisten metalli-ionien kanssa ovat välillä 10«-109 M“1 titrimetrisellä analyysilla arvioi-15 tuna. Stabiilimpien, kolmiarvoisten kobolttikompleksien mahdollinen käyttö stabiilien haptiinikelaattien luomiseen voi esimerkiksi tuottaa merkittäviä tuloksia.
Tämän keksinnön kohteena ovat siis yleisesti sellaiset 20 reseptorit, mieluiten monoklonaaliset, jotka pystyvät hydrolysoimaan ligandin ennalta valitun amidi- tai es-terisidoksen, ligandin, jossa reseptoreilla on vasta-aineen yhdistävä kohta, joka sitoutuu: (a) reagenssili-gandiin, joka pystyy muodostamaan reagenssin ennalta 25 valitun esteri- tai aroidisidoksen tetraedrisen hydro- lyyttisen transitiotilan; so., jossa on ennalta valittu karboksylihappoamidi- tai -esterisidos, ja (b) sellaisen ligandin analogiin, jossa ligandissa on tetraedri-sesti sitoutunut fos£oriatomi asemassa, mihin reagens-30 siligandin ennalta valitun esteri- tai amidisidoksen karbonyyliryhmän hiiliatomi sitoutuu. Tetraedrisesti sitoutunut fosforiatomi on sitoutunut suoraan: (i) analogisen reagenssiligandiesterin tai -amidin happo-osan hiiliatomiin (alfa-hiili); 35 (ii) kahteen happiatomiin, joista toinen on sitoutunut fosforiatomiin kaksoissidoksella, jolloin happi on. okso-radikaali, ja toinen happiatomeista on sitoutunut • « i 30 94026 yksinkertaisesti fosforiin ja yksinkertaisesti radikaaliin, joka on valittu ryhmästä, jossa on vety ja Ci-C4 alempi alkyyli; ja (iii) kolmanteen happiatomiin tai typpiatomiin, joka on 5 sitoutunut analogisen esterin tai amidin hiiliatomiin; so., esterin tai amidin alkoholi- tai amiiniosan alfa-hiileen.
Jos reagenssiligandi on syklinen amidi tai esteri, mo-10 lekyylissä ei ole selviä happo-, amiini- tai alkoho- liosia. Kuitenkin ne, joilla on hyvät orgaanisen kemian tiedot, ymmärtävät, amideissa ja estereissä täytyy määritelmän mukaan olla happo- ja amiini- tai alkoho-liosat. Niinpä voidaan vetää kuvitteellinen rajalinja 15 niiden molekyylien väliin, joilla on vähintään yksi karbonyylihiili ja sen suoraan sitoutunut alfa-hiili molekyylin happo-osassa ja joka sisältää amino- tai hydroksyyliryhmän ja sen suoraan sitoutuneen alfa-hiilen molekyylin amiini- tai hydroksyyliosassa.
20
Toisessa suoritusmuodossaan tämä keksintö liittyy menetelmään, jolla katalyyttisesti hydrolysoidaan reagenssiligandimolekyylin ennalta valittu esteri- tai amidisidos. Menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: (a) 25 sekoitetaan vesiliuoksessa yhtä edellä mainituista reseptoreista vaikuttava määrä reagenssiligandimolekyy-lien kanssa; (b) ylläpidetään seosta niin pitkä aika, että ligandimolekyylit sitoutuvat reseptoriin ja että reseptorimolekyylit hydrolysoivat valitun sidoksen. Sen 30 jälkeen hydrolyysituotteet voidaan haluttaessa ottaa talteen.
Tämän keksinnön hydrolyyttinen menetelmä käyttää vesiliuosta reaktioseoksen osana. Väliaineessa on tyypil-35 lisesti vettä ja puskurisuoloja. Liuoksessa voi lisäksi olla muita suoloja, kuten natriumkloridia, kuten myös vesiliukoisia kalsium- ja magnesiumsuoloja, joita usein » · il 31 54026 tavataan proteiineja sisältävissä väliaineissa. Myös muita vesiliukoisia moniarvoisia metallisuoloja, kuten rautaa, sinkkiä ja kobolttia suoloinaan voi esiintyä, ja ne ovat käyttökelpoisia kompleksointiaineita sil-5 loin, kun reagenssiligandi koostuu kahdesta erillisestä molekyylistä. Myös orgaanisia liuottimia, kuten me-tanolia, etanolia, asetonitriiliä, dimetyylisulfoksidia, dioksaania, heksametyylifosforamidia ja N,N-dime-tyyliformamidia voi olla läsnä. Läsnä voi olla myös 10 pinta-aktiivisia aineita, jotka emulgoivat reagens- siligandin ja reseptorimolekyylin. Vesiliuoksessa oleville aineosille on kriittistä se, etteivät ne sanottavasti häiritse tai estä katalyyttistä reaktiota denaturoimalla reseptorimolekyylin. Lisäksi vesiliuos ei sa-15 nottavasti sisällä suoloja, proteiineja yleensä, ja entsyymejä erityisesti, jotka estävät sidoksen kat-keamisreaktiota, jota reseptorimolekyyli katalysoi.
Vesiliuoksen pH on tyypillisesti noin 5:stä noin 9:ään 20 ja mieluiten noin pH 6.0 - pH 8.0. Myös korkeampia ja matalampia kuin mainitut pH-arvot voidaan käyttää, kunhan katalysoitu reaktio ei taaskaan häiriinny tai esty.
25 Katalyyttireaktiot tehdään tyypillisesti vallitsevassa huoneen lämpötilassa; so., noin 20 - 25°C:ssa, ja ilmanpaineessa. Kuitenkin käyttökelpoinen lämpötilaväli on aina vesiliuoksen jäätymispisteestä kiehumispisteeseen saakka, ilmanpaineessa. Kuten tiedetään, prote-30 iineilla, kuten reseptorimolekyylillä on taipumus denaturoitua korkeissa lämpötiloissa, kuten niissä, missä vesiliuos kiehuu eli noin 100°C:ssa, ja tästä syystä suositellaankin alle 40°C:n lämpötiloja. On myöskin tunnettua, että reaktiot, jotka noudattavat multimole-35 kulaarisia kineettisiä teitä, hidastuvat, kun lämpötila laskee. Joten minimilämpötilana suositellaan käytettä-väksi noin 15eC:a.
94026 32
Reagoivan ligandin määrä reaktioseoksessa voi olla yhtä suuri kuin sen liukoisuus vesiliuokseen. Voidaan myös käyttää kaksifaasisysteemiä, jossa on liukenematon rea-5 genssiligandi, mutta tavallisesti sitä ei käytetä. Tavanomaiset reagenssiligandikonsentraatiot ovat noin 0,1 mik-romolaarisista (μΜ) noin 10 millimolaarisiin (mM), ja tämä määrä on myös funktio reagenssiligandin liukoisuudesta liuotinvällaineeseen. Silloin, kun tuote on toivot-10 tu, käytetään suhteellisen suuria konsentraatioita verrattuna niihin alempiin konsentraatioihin, joita käytetään reaktiomekanismia tutkittaessa.
Reseptorimolekyyliä on myös läsnä vaikuttava määrä. Tämä 15 vaikuttava määrä on tyypillisesti katalyyttinen määrä; so. reseptoria käytetään reagenssiligandin kanssa mooli-suhteessa noin l:2:sta noin 1:10 000:een, mollisuhteen noin l:10:stä noin 1:100:aan ollessa suositeltavin. Re-septorimolekyylin suhde reagenssiligandiin riippuu tyy-. · 20 pillisesti reseptorimolekyylin spesifisestä aktiivisuu desta reagenssiligandia kohtaan ja reaktiota tekevän käyttäjän tarkoitusperistä. Tapauksessa, jossa halutaan tuotetta, käytetään suurempaa reseptoriväkevyyttä ja suurempaa reseptori/reagenssiligandi-suhdetta. Kun tutkitaan 25 reaktion mekanismia tai kinetiikkaa, käytetään tyypillisesti pienempiä väkevyyksiä ja suhteita. Voidaan myös käyttää stökiometristä reseptorimäärää tai vähempääkin, mutta koska reseptori on katalyyttinen molekyyli, voi jopa stökiometrisen määrän käyttö olla tuhlausta. Ainakin 30 katalyyttinen määrä reseptoria käytetään.
Kuten on käynyt ilmi, mallireseptoreja erittävät hybri-domat, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 9168, HB 9169, HB 9500, HB 9501, HB 9502, HB 9503, HB 9504, HB 9505, HB 35 9506, HB 9507, HB 9508 ja HB 9509 ja reagenttiligandimo- lekyylien rakennen on kuvatunlainen.
33 94026 III. Analogiligandien ja ligandien valmistus
Seuraavat kappaleet liittyvät yhdisteiden 1-11 valmistukseen, jotka näkyvät kuvassa 2, samoin kuin yhdis- 5 teiden 12 - 22 valmistukseen. Kuvauksen helpottamiseksi yhdisteet (analogoligandit) 3, 4, 1 ja 2, ja yhdisteet (reagenssiligandit) 5, 6, 7, 8, 10, 11 ja 9 on kuvailtu tässä järjestyksessä. Myös niiden inhibiittoreiden, jotka katalyyttisesti katkaisevat yhdisteet 1 - 4 ja 10 12, valmistus kuvataan; so., inhibiittoreiden li, 2i, 3i, 4i ja 12i, vastaavasti.
Dietyyli-4-trifuoriasetamidobentsyylifosfonaatti (yhdiste A) 15 ^^3 O&t 20
Dietyyli-4-aminobentsyylifosfonaatin (0,74 g, 3,04 mM) sekoitettuun liuokseen 5 ml:ssa roetyleenikloridia lisätään (juuri tislattu kalsiumhydridin päältä) (0,32 ml, 25 :· 4 mM) pyridiinia. Seos jäähdytetään 4°C:een ja lisätään pisaroittain trifluorietikkahapon anhydridiä (0.5 ml, 3,54 mM) viiden minuutin aikana sekoitettuun liuokseen. Sekoitusta jatketaan 15 minuuttia ja samalla liuoksen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan (noin 23°C). Reak-tion täydellisyys tarkistetaan ohutlevykromatografiällä käyttämällä eluenttina 1:1 metyleenikloridin ja etyyliasetaatin seosta (Rt 0,2). Seos laimennetaan 50 ml:lla etyyliasetaattia. Orgaaninen liuos pestään kahdesti peräkkäin 25 ml:11a 0,5 M HC1 ja kuivataan vedettömän 35 magnesiumsulfaatin päällä. Haihdutettaessa saadaan keltainen öljy, joka puhdistetaan flash-kromatografiällä silikageelin päällä käyttäen 1:1 metyleenikloridin ja 34 94026 etyyliasetaatin seosta eluenttina. Fosfonaatti (yhdiste A) (0,877 g, 85 %:n saanto) saadaan värittömänä kiteisenä aineena.
5 Protoni-NMR deuterokloroformissa ja 100 MHz:ssa: delta 10,61 (leveä singletti, 1H), 8,53 (dubletti, J = 8,22
Hz, 2H), 7,17 (kaksoisdubletti, J = 8,67 Hz ja 2,5 Hz, 2H), 4,02 (P, J = 7,18 Hz, 2(2H)), 3,10 (dubletti, J = 21,62, Hz, 2H) ja 1,26 (tripletti, H 7,05 Hz, 2(3H).
10 Etyylikloori-4-trifluoroasetamidobentsyylifosfonaatti (yhdiste B)
H
° > N ^ /v O
V
15 C.F, O et
Fosfonaattiliuokseen (yhdiste A) (0,1 g, 0,29 mM) 5 ml:ssa kloroformia (juuri tislattu kalsiumhydridin päältä) lisättiin fosforipentakloridia (PClo) (0,070 g, 20 0,35 mM). Reaktiota sekoitettiin kaksi tuntia 50°C:ssa.
Reaktion täydellisyys todettiin ohutlevyklomatogra-fiällä, missä otetaan osanäyte, joka jäähdytetään me-tanolissa trietyyliamiinissa.
25 Kromatografinen ajo suoritetaan käyttämällä 1:1 mety- • ♦ leenikloridin ja etyyliasetaatin seosta eluenttina (Rt 0,3). Jäännös-PCls sammutetaan kuumentamalla kiinteää natriumbisulfiittia ja kuplittamalla sitä reaktioseok-sen läpi. Kun liuotin haihdutetaan, saadaan keltainen 30 öljy, joka muuttuu valkoiseksi kiteiseksi aineeksi lisättäessä 30 ml vedetöntä dietyylieetteriä. Sakka pestään kolmasti peräkkäin 30 ml:n annoksilla dietyylieetteriä, jolloin saadaan kloorifosfonaatti (yhdiste B) (0,986 g, 89 prosentin saanto). Yhdiste B käytetään 35 suoraan ilman lisäpuhdistusta sen hygroskooppisen luonteen vuoksi.
Il 35 94026
Protoni-NMR deuterokloroformissa ja 100 MHz:ssa: delta 9,09 (leveä singletti, NH), 7,55 (dubletti, J = 7,72 Hz, 2H), 7,28 (multipletti, 2H), 4,29 (P, J = 7,12 Hz, 2H), 3,52 (dubletti, J = 20,5 Hz, 2H) ja 1,39 (triplet-5 ti, H = 7,07 Hz, 3H).
2-Hydroksi-5-nitro-bentsyyliheksametyleenitetramiini-hydrobromidi (yhdiste C) rQk 15 Heksametyleenitetramiini (1,88 gm 8,1 mM) liuotetaan 20 ml:aan kloroformia (juuri tislattu kalsiumhydroksidin päältä). 2-Hydroksi-5-nitrobentsyylibromidia (1,137 g, 8,1 mM) lisätään sekoitettuun liuokseen. Seosta refluk-soidaan yli yön, jolloin jäähdutettäessä muodostuu 20 kirkkaan keltainen sakka. Sakka suodatetaan ja pestään kolmasti peräkkäisillä 5o ml:n annoksilla kylmää kloroformia, jolloin syntyy 3,010 g (100 prosentin saanto) kvaternääristä suolaa (yhdiste C), kun tuote kuivataan alipaineessa. Yhdisteen C sulamispiste on 181 - 184°C.
: 25 • «
Protoni- NMR (CDslzSOissa ja 100 MHz:ssä: delta 8,06 (dubletti, J * 2,79 Hz, 1H), 7,96 (kaksoisdubletti, J = 8,92 ja 2,74 Hz, 1H), 6,92 (dubletti, J = 8,87 Hz, 1H), 4,91 (leveä singletti, 6H) ja 3, 84 (singletti, 2H).
30 2-Hydroksi-5-nitrobentsyyliamiinihydrokloridi (yhdiste D) NHj. Het ir” NO, • *“ 36 94026 15 ml:aan etanolia lisätään (0,250 g, 0,67 mM) yhdistettä C ja väkevää HCl:ia (0,56 ml, 0,67 mM). Keltaista seosta refluksoidaan 2,5 tuntia, kunnes liuos on kir-5 kas. Kun seos jäähtyy, muodostuu valkoinen sakka (am-moniumbromidisuola). Sakka suodatetaan ja suodos väke-vöidään kuiviin tuottaen vaikeahkon sakan. Sakka sekoitetaan asetoniin ja seos suodatetaan antaen 0,128 g (94 %) amiinia (yhdiste D). Ohutlevykromatografia suorite-10 taan 1,2-prosenttisella/5/l -seoksella, jossa on am- moniumhydroksidia metyleenikloridi/metanolissa (eluent-ti) (Rf 0,2). Tuote antaa positiivisen ninhydriini-testin. Amiinin sulamispiste (yhdiste D) on 248 -251°C (samalla se hajoaa).
15
Protoni-NMR (CD3)2SO:ssa ja 100 MHz: delta 7,93 (dub-letti, J = 3,10 Hz, 1H), 7,83 (kaksoisdubletti, J = 9,23 ja 3,07 Hz), 6,14 (dubletti, J = 9,17 Hz, 1H) ja 3,80 (singletti, 2H).
20 2-Hydroksi-5-nitrobentsamidi, 6-roetyyliesteripyridiini (yhdiste E) * 25 NO,
30 L
2-Hydroksi-5-nitrobentsyyliamiinihydrokloridia (yhdiste D) (0,259 g, 1,27 mM) lisätään dipikoliinihappomonome-tyyliesterikloridin (0,254 g, 1,27 mM) metyleeniklori-diliuokseen (juuri tislattu kalsiumhydridin päältä), ja 35 saatua seosta sekoitetaan kiivaasti. Trietyyliamiinia (0,53 ml, 3,81 mM) lisätään pisaroittain, jolloin saadaan keltainen liuos, joka muuttuu sitten oranssik- |j 94026 37 si, kun trietyyliamiinilisäys on täydellinen. Reaktion loppuun meneminen todetaan ohutlevyromatografiällä käyttämällä eluenttina metyleenikloridin ja etanolin 39:1 -seosta (Rf 0,2). Liuos laimennetaan 50 ml:11a 5 etyyliasetaattia ja pestään kolmasti peräkkäisillä 25 ml:n annoksilla 0,5 M HC1 ja suolavettä. Sen jälkeen, kun tuote on kuivattu vedettömän magnesiumsulfaatin päällä ja liuotin on haihdutettu pois, saadaan 0,375 g tuotetta. Tälle tehdään flash-kromatografinen ajo 10 silikageelilla käyttäen eluenttina metyleenikloridin ja etanolin seosta. Amidi (yhdiste E) (0,310 g, 74 prosenttia) saatiin himmeänä kiinteänä aineena, jolla oli sulamispiste 236 - 238°C.
15 Protoni-NMR (CDs)2S0:ssa ja 100 MHz:ssä: delta 11,39 (leveä singletti, NH), 9,15 (multipletti, 1H), 8,34 - 8,01 (multipletti, 4H); 6,98 (dubletti, J « 9,3, 1H), 4,52 (dubletti, J = 4,521, 2H) ja 3,92 (singletti, 3H).
20 Yhdisteen F valmistaminen
CH>0 N H
° (Il :: -
Yhdistettä E (0,1 g, 0,3 mM) lisättiin yhdisteen B (0,099 g, 0,3 mM) metyleenikloridiliuokseen (juuri 30 tislattu kalsiumhydridin päältä). Seosta sekoitettiin kiivaasti ja trietyyliamiinia (0,66 ml, 9 mM) lisättiin pisaroittain tuottamaan oskilloivan keltaisen värin.
Kun trietyyliamiinin lisäys on loppuun suoritettu, pysyy liuos kirkkaana. Seosta sekoitetaan vielä 15 35 minuuttia. Reaktion loppuunmeno todetaan ohutlevy- kromatografisesti käyttäen eluenttina metyleenikloridin “ ja etanolin 20:1 -seosta (Rf 0,6). Tuotteena saadaan 38 9 4 0 2 6 keltainen öljy sen jälkeen, kun seos on laimennettu 30 ml:11a etyyliasetaattia ja pesty kahdesti peräkkäin 2 x 30 ml:lla 0,5 M HC1 ja suolavedellä ja lisäksi kuivattu vedettömän magnesiumsulfaatin päällä ja liuotin haih-5 dutettu pois. Tuote puhdistetaan edelleen flash-kro-matografisella silikageelillä käyttäen eluenttina metyleenikloridin ja etanolin 35:1 -seosta. Nitrofos-fonaatti (yhdiste F) (0,154 g, 82 prosentin saanto) saadaan valkeana vaahtona.
10
Protoni-NMR CHCl3:ssa ja 100 MHz:ssä: delta 9,41 (leveä singletti, NH), 8,51 - 7,93 (multipletti, 5H), 7,71 (dubletti, J - 8,20 Hz, 2H), 7,55 (dubletti J = 8,89 Hz, 1H), 7,35 (kaksoisdubletti, J * 8,62 ja 2, 51 Hz, 15 2H), 4,45 (dubletti, J = 6,54 Hz, 2H), 4,24 (multipletti, 2H), 4,01 (singletti, 3H), 3,46 (dubletti, J = 20,8 Hz, 2H) ja 1,27 (tripletti, J = 6,94 Hz, 3H).
20 Yhdisteen 6 valmistus
(0) O
'oVv***· : 25 t
CF, ^ ^ O
Yhdisteen F (0,061 g, 97 mM) etanoliliuokseen lisätään 30 väkevää suolahappoa (200 ml, 6,6 mM). Sekoitus lopetetaan ja 0,032 g palladiumia hiilessä lisätään. Reak-tioseos laitetaan vetyilmakehään ja sitä sekoitetaan kiivaasti yksi tunti. Reaktion täytellisyys todetaan ohutlevykromatografisesti käyttäen eluenttina mety-35 leenikloridin ja etanolin 20:1 -seosta (Rf 0,4). Tuote antaa positiivisen ninhydriinitestin. Seos laimennetaan * 25 ml:11a etyyliasetaattia ja suodatetaan Celiitin li 39 94026 läpi. Suodoskakku huuhdellaan kahdesti peräkkäisillä 25 inl:n annoksilla etyyliasetaattia. Orgaanista kerrosta pestään 5 -prosenttisella natriumbisulfiitin vesi-liuoksella, kunnes se on emäksinen, minkä jälkeen 5 pestään kahdesti 2 x 25 ml:11a suolavettä, kuivataan vedettömän magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan. Tuotteena on amiini (yhdiste G), joka on kirkas öljy (0,038 g, 69 prosentin saanto) ja joka on riittävän puhdasta seuraavaa vaihetta varten.
10
Protoni-NMR CDCI3:ssa ja 100 MHz:ssä: delta 9,05 (leveä singletti, NH) , 8,42 - 7,92 (multipletti, 3H), 7,71 (dubletti, J = 8,33 Hz, 2H), 8,35 (dubletti, J = 8,84 Hz, 1H), 7,15 (kaksoisdubletti, J = 8,37 ja 2,31 Hz, 15 2H), 6,75 (dubletti, J « 3,22 Hz, 1H), 1,51 (kak soisdubletti, J s 8,80 ja 3,91 Hz, 1H), 4,92 (dubletti, J 6,85 Hz, 2H), 4,10 (multipletti, 2H), 4,05 (singletti, 3H), 3,39 (dubletti, J = 21,38 Hz, 2H) ja 1,22 (tripletti, J = 6,95 Hz, 3H).
Yhdisteen 3 valmistus 0 n tt I h
cf5 G
30 Amiinista (yhdiste G) (0,063 g, 0,106 mM) liuotettiin näyte 8 ml:aan metyleenikloridia (juuri tislattu kalsi-umhydridin päältä). Lisätään etikkahappoanhydridiä (0,150 ml, 1,35 mM) ja trietyyliamiinia (0,075 ml, 1,02 mM). Reaktiota seurataan ohutlevykromatografiällä lop-35 puun saakka käyttäen eluenttina metyleenikloridin ja metanolin 9:1 -seosta (Rf 0,2). Lairoenntetaan 35 ml:lla ;* etyyliasetaattia, mitä seuraa pesu kolme kertaa 20 40 94026 ml:11a 0,5 M HClria , 20 -prosenttisella natriumbikarbonaatilla ja suolavedellä. Liuottimen haihdutusta seurataan flash-kromatografiällä silikageelissa käyttämällä eluenttina metyleenikloridin ja metanolin 10:1 5 -seosta, jolloin saadaan yhdiste 3 (0,045 g, 67 -prosenttinen saanto). Yhdiste 3 näyttää olevan analyyttisesti puhdasta HPLC:n perusteella, mihin käytettiin analyyttistä RP-C18 -kolonnia (Vydac 218TP54) ja 30-90 -prosenttista asetonitriiliä vedessä virtausnopeudella 10 1 ml/min. Puhdas piikki eluoitui 57- prosenttisena saantona 20 minuutin kohdalla.
Protoni-NMR CDCla:ssa ja 100 MHz:ssa: delta 9,61 (leveä singletti, NH), 8,41-8,22 (multipletti 4H), 8,21-7,59 15 (multipletti, 3H), 7,58-7,14 (multipletti, 4H), 4.22 (multipletti, 4H), 4.05 (singletti, 3H), 3,40 (dublet-ti, J s 21,25 Hz, 2H), 2,12 (singletti, 3H) ja 1,23 (tripletti, J = 6,93 Hz, 3H).
20 Yhdisteen 4 valmistus
NH O O
H ex t H k v ‘I 7 1 • v 'TäX^gr r CFa
Amiinin (yhdiste G) (0,035 g, 59 mM) sekoitettua 30 tetrahydrofuraaniliuosta (juuri tislattu natriumin päältä bentsofenonin läsnäollessa) käsitellään typpiatmosfäärissä ruiskulla, jossa 0,140 ml 0,5 M
liuosta. Tähän liuokseen lisätään trietyyliamiinia (0,025 ml, 180 mM). Reaktiota 35 seurataan loppuun saakka ohutlevykromatografiällä käyttämällä eluenttina metyleenikloridin ja etanolin 5:1 -seosta (Rf 0,6). Tuote laimennetaan 25 ml:lla 41 94026 etyyliasetaattia, pestään kaksi kertaa 25 ml:11a 0,5 M HC1 ja suolavedellä, kuivataan vedettömän magnesium-sulfaatin päällä. Kun liuotin haihdutetaan pois saadaan tuotteena keltainen öljy. Tuote puhdistetaan edelleen 5 flash-kromatografisesti silikageelillä käyttämällä metyleenikloridin ja etanolin 10:1 -seosta eluenttina. Nitrofosfonaatti (yhdiste 4) (0,036, 82 prosentin saanto) saadaan valkoisena vaahtona. Tuote on analyyttisesti puhdasta HPLC:n perusteella, missä käyte-10 tään yllä kuvattua kolonnia ja eluointi tehdään 30-90 -prosenttisella asetonitriilillä vedessä käyttäen virtausnopeutta 1 ml minuutissa. 25 Minuutin ajosta saadaan yksi piikki.
15 Protoni-NMR CDCla:ssa ja 100 MHz:ssä: delta 9,29 (leveä singletti, NH), 8,43-8,25 (multipletti, 4H), 8,24-7,67 (multipletti, 3H), 7,66-7,10 (multipletti, 3H), 4,24 (multipletti, 4H), 4,05 (singletti, 4H), 3,40 (dub-letti, J - 21,30 Hz, 2H), 2,84 (singletti, 4H), 2,65 20 (multipletti, 2H), 2,38 (multipletti, 2H), 2,38 (multipletti, 2H), 1,79 (multipletti, 4H) ja 1,26 (trip-letti, J 6,91 Hz, 3H).
Inhibiittorin 3i valmistus : 25 V§x
H W H
" k s
Fosfonaatti (yhdiste 3) (0,065 g, 0,1 mM) liuotetaan 2,5 ml:aan asetonitriiliä (tislattu kalsiumhydridin 35 päältä). Liuokseen lisätään natriumjodidia (0,306 g, 2 mM) ja trimetyylisilyylikloridia (0,26 ml, 2 mM), jolloin saadaan oranssi liuos. Reaktiota kuumennetaan „ 94026 60°C:ssa. 12 Tunnin kuumennuksen ja sekoituksen jälkeen saatiin yksi 42 -prosenttinen pääpiikki HPLCrstä käyttämällä yllä kuvattua kolonnia ja eluenttina 30-90 -prosenttista asetonitriiliä vedessä virtausnopeudella 1 5 ml minuutissa 20 minuutin ajan. Liuoksen annetaan jäähtyä huoneen lämpötilaan, minkä jälkeen se laimennetaan 10 ml:11a etyyliasetaatin ja n-butanolin 50:50 -seosta. Orgaanista kerrosta sekoitetaan suolaliuoksen kanssa, ja lisätään natriumbisulfiittia, 10 kunnes oranssi väri haalistuu. Kerrokset erotetaan ja vesifaasi uutetaan kahdella perättäisellä 10 ml:n annoksella etyyliasetaattia ja n-butanolia. Yhdistetyt orgaaniset kerrokset kuivataan natriurosulfaatin päällä ja puskuroidaan natriuasetaattia (0,030 g) käyttämällä.
15 Liuotin poistetaan pyöröhaihduttimessa, jolloin saadaan (0,088 g, 145 -prosenttinen saanto) valkeaa jauhetta.
Tuote liuotetaan 5 ml:aan vettä ja jäähdytetään nollaan C-asteeseen. Saatava liuos tehdään happamaksi 6 M HCl:llä pH 2:een. Happaman liuoksen kylmäkuivaus tuotti 20 0,085 grammaa inhibiittoria 3i. Tälle tehtiin nes- tekromatografinen ajo Watersin Cie -käänteisfaasi-Sep-Pack -kolonnilla (Waters Associates, Millipore Corp.,
Milford, MA), eluoimalla 10 -prosenttisella asetonit-riilillä vedessä, ja jakeet 4,5 ja 6 otettiin talteen.
25 Fraktiot yhdistettiin ja tarkistettiin uudestaan HPLC:llä, jolloin saatiin yksi 42 -prosenttinen piikki.
Liuos kylmäkuivattiin.
Yhdisteen 4i (käytetään immunointeihin) valmistus 30 •A·' C*S° MH °
H MO l H u li '''''I
35 terN ' H co V
Cf3 43 94026 23,5 mg:n näyte yhdistettä 4 liuotetaan 2 ml:aan asetonitriiliä (tislattu kalsiumhydridin päältä). Tälle tehdään käsittely, jota käytetään inhibiittorin 3i deblokkaamiseen. Näyte on analyyttisesti puhdasta 5 HPLC:n perusteella, missä on käytetty yllä kuvattua kolonnia ja eluointia 30-90 -prosenttisella aseto-nitriilillä vedessä virtausnopeudella 1 ml minuutissa 30 minuutin ajan, jolloin saadaan yksi pääpiikki 4i 49 -prosentin saannolla. Kun orgaaninen faasi puskuroitiin 10 natriumasetaatilla ja liuotin poistettiin, saatiin yhdiste 4i (0,036 g, 162 -prosentin saanto). Vaikka tähän tuotteeseen on yhä kontaminoitunut epäorgaanisia suoloja, on näyte sopiva kytkettäväksi proteiini-kantajiin (sisältäen BSA:n ja KLH:n). Yhdiste 4i on 15 altis hydrolysoitumaan (NHS-ryhmät), ja sitä pitäisi säilyttää nollassa °C:ssa eksikkaattorissa. Yhdisteen 4i puhtaus voidaan tarkistaa ohutlevykromatografiällä käyttämällä eluenttina metyleenikloridin ja etanolin 10:1 -seosta (Rf 0,4), jolloin saadaan yksi läikkä, 20 joka oli yhdessä yhdisteen 4 läikän kanssa. P31NMR DMSOrssa ja 100 MHz:ssa: delta 22.2 (singletti).
Yhdisteen H valmistus
• 25 H
r, Et NO, CF3 ° 30
Fosfonyylikloridia (yhdiste B) (0,726 g, 2,2 mM) liuotetaan kuivaan kloroformiin (tislattu kalsiumhydridin päältä). Tähän lisätään p-nitrofenolia (0,305 g, 2,2 mM) ja trietyyliamiinia (0,32 ml, 2,5 mM). Reak-35 tiota sekoitetaan 10 minuuttia ja täydellisyys todetaan ohutlevykromatografisesti eluenttina metyleenikloridin ja etanolin seos 1:1 (Rf 0,8). Laimentamalla 50 ml:lla 44 94026 etyyliasetaattia, pesemällä kolme kertaa peräkkäin 50 ml:n annoksilla 0,5 M HC1, kyllästetyllä natriumbikarbonaatilla ja suolaliuoksella, kuivaamalla ja haihduttamalla saatiin yhdiste H. Tuotetta puhdistet-5 tiin edelleen flash-kromatografisesti silikageelillä käyttämällä metyleenikloridin ja etanolin 2:1 -seosta eluenttina, näin saatiin fosfonaatti (yhdiste H) (0,626 g, 66 prosentin saanto). Protoni-NMR CDCla:ssa ja 100 MHz:ssa: delta 8,79 (leveä singletti, NH), 8,19 (dub-10 letti, J = 9,44 Hz, 2H), 8,54 (dubletti, J = 8,21 Hz, 2H), 7,25 (kaksoisdubletti, J = 8,57, ja 2,62 Hz, 2H), 8,20 (dubletti, J = 9,13 Hz, 4.17 (p, J * 7,15 Hz, 2H), 3,35 (dubletti, J = 21,77 Hz, 2H) ja 1,29 (tripletti, J = 6,94 Hz, 3H).
15
Yhdisteen I valmistus
H
O Ni V /V O Λ
X
Yhdisteestä H otetulle näytteelle (0,250 g, 0,63 mM tehdään samanlainen käsittely kuin yhdisteelle F.
,· 25 Amiini (yhdiste I) saadaan kirkkaana vaahtona (0,130 g, ' 51 prosentin saanto). Ohutlevykromatografia ajettiin käyttäen metyleenikloridin ja etanolin 1:1 -seosta eluenttina (Rf 0,3). Tuote antaa positiivisen ninhyd-riinitestin.
30
Protoni-NMR CDCle:ssa ja 100 MHz:ssa: delta 8,51 (leveä singletti, NH), 7,63 (dubletti, J = 8,19 Hz, 2H), 7,31 (kaksoisdubletti, J = 8,61 ja 2,51 Hz, 2H), 7,24 (dubletti, J * 8,91 Hz, 2H), 6,61 (dubletti, J - 8,06 35 Hz, 2H), 4,18 (p, J =7,18 Hz, 2H), 3.39 (dubletti, J = 21,55 Hz, 2H) ja 1,24 (tripletti, J = 7,18 Hz, 3H).
> · li 46 94026
Yhdisteen 1 valmistus
H H
5 CFj vi
Metyleenikloridiliuokseen (juuri tislattu kalsium-10 hydridin päältä) lisätään yhdistettä I (0,030 g, 0,075 ml). Yhdisteen I asylointi suoritetaan samalla tavalla kuin yhdisteen G asylointi. Yhdiste 1 saadaan vaahtona (0,024 g, 73 prosentin saanto). Ohutlevykromatografia tehtiin käyttämällä eluenttina roetyleenikloridin ja 15 etanolin 4:1 -seosta (Rf 0,3).
Protoni-NMR CDCla:ssa ja 100 MHz:ssa: delta 9,57 (leveä singletti, NH), 8,28 (leveä singletti, NH), 7,50 (dubletti J = 8,21 Hz, 2H), 7,39 (dubletti, J = 8,34 20 Hz, 2H), 7,18 (kaksoidubletti, J = 8,31 ja 2,59 Hz, 2H), 4,13 (p, J = 7,3 Hz, 2H, 3,26 (dubletti, J = 21,73 Hz, 2H), 2,07 (singletti, 3H) ja 1,24 (tripletti, J = 7,10 Hz, 3H).
25 Yhdisteen 2 valmistus
, O
O ^ VL
H H l' \ ' O €t M- c. (chz\ CC> rvl \ l y 30 ^3 0
Yhdiste I (0,168 g, 0,42 mM) reagoi vastaavanlaisella tavalla kuin mikä on kuvattu yhdisteen 4 synteesin 35 yhteydessä. Yhdiste 2 saadaan kirkkaana lasina (0,188 g, 71 prosentin saanto).
46 94026
Protoni-NMR CDCl3:ssa ja 100 MHzrssa: delta 9,35 (leveä singletti, NH), 8,39 (leveä singletti, HN), 7,53 (dubletti, J = 8,15 Hz, 2H), 7,41 (dubletti, J = 8,29 Hz, 2H), 7,19 (kaksoisdubletti, J = 8,30 ja 2,57 Hz, 5 2H), 4,15 (p, J = 7,21 Hz, 2H), 3,25 (dubletti, J = 21,67 Hz, 2H), 2,85 (singletti, 4H), 2,61 (multipletti, 2H), 2,33 (multipletti, 2H), 1,79 (multipletti, 4H) ja 1,23 (tripletti, J = 7,23 Hz, 3H).
10 Inhibiittorin li valmistus ^ o 15
Fosfonaattia (yhdiste 1) (0,030 g, 68 mM) liuotetaan 3 ml:aan asetonitriiliä (juuri tislattu kalsiumhydridin 20 päältä), Lisätään hitaasti trimetyylisilyylibromidia (0,1 ml, 76mM) ja reaktiota kuumennetaan 50°C:ssa 45 minuuttia. Liuoksen annetaan jäähtyä huoneen lämpo-tilaaan. Täydellisyys todetaan käänteisfaasiohut-levykromatografiällä käyttämällä isopropanolin ja veden 25 seosta 3:7 (Rf 0,8). Laimentamalla 30 ml:11a etyyliasetaatin ja n-butanolin 1:1 -seosta, pesemällä kahdella 30 ml:n annoksella 0,5 M HC1 ja suolavedellä saatiin inhibiittori li (0,023 g, 83 prosentin saanto). Tuote puhdistettiin edelleen menetelmällä, joka on 30 kuvattu inhibiittorille 3i.
Protöni-NMR (CD3)eSO:ssa ja 100 MHz:ssa: delta 9,15 (leveä singletti, NH), 8,17 (leveä singletti, NH), 7,71-6,95 (multipletti, 8H), 2,23 (dubletti, J 21.65 35 Hz, 2H) ja 2, 09 (singletti, 3H).
II
Yhdisteen 2i (käytetään immunointeihin) valmistus 47 94026 20 mg yhdistettä 2 liuotettiin 2 ml:aan asetonitriiliä 10 (juuri tislattu kalsiumhydridin päältä). Tätä käsitellään trimetyylisilyylibromidilla (0,05 ml, 31 mM) ja lämmitetään 50°C:ssa kaksi tuntia. Reaktion täydellisyys todetaan ohutlevykromatografisesti käyttämällä 2:1 -seosta, jossa on metyleenikloridia ja etanolia, 15 eluenttina (Rt 0,7). Liuotin poistetaan pyöröhaih-duttimella ja jäännös liuotetaan 20 ml:aan etyyliasetaatin ja n-butanolin 1:1 -seosta. Orgaaninen kerros pestään kahdesti peräkkäisillä 25 ml:n annoksilla vettä ja sitten suolavedellä. Orgaaninen kerros väkevöidään, 20 jolloin saadaan valkoinen jauhe, yhdiste 2i (0,017 g, 87 prosentin saanto). Tämä tuote on todettu sopivaksi proteiinien kytkentään, eikä se tarvitse lisäpuh-distusta.
25 Yhdisteen 5 valmistus VS§u..j@o.
30 cf3 o O o
Trifluorietikkahappoanhydridiä (2,8 ml) lisättiin 4-aminofenyylietikkahapon (1.5 g) natriumkarbonaatin (1.5 35 g) liuokseen, jossa on 10 prosenttia asetonitriiliä vedessä. Lisäys tehtiin -10°C:ssa. Liuos tehtiin *: happamaksi 6 -molaarisella HCl:llä (0,2 ml) ja väkevöi- 48 94026 tiin vakuumissa. Seos suodatettiin silikan läpi dikloo-rimetaanin ja metanolin 9:1 -seoksella, jolloin saatiin 1,4 grammaa (57 painoprosentin saanto) p-trifluori-asetamidofenyylietikkahappoa. Ohutlevykromatografia 5 tehtiin silikageelillä käyttämällä kloroformin ja metanolin 5:1 -seosta eluenttina (Rf 0,35).
Protoni-NMR CDCI3:ssa: delta 3,15 (singletti, 2H), delta 7,02 (kaksoisdubletti, 4H), delta 10,4 (leveä 10 singletti, NH).
Edeltävä happo (0,6 g) liuotettiin tionyylikloridiin ja liuosta kuumennettiin 40°C:ssa kaksi tuntia.
Tionyylikloridi poistettiin alipaineessa, ja jäännös 15 liuotettiin metyleenikloridiin (5 ml) ja lisättiin liuokseen, jossa oli 7-hydroksikumariinia (0,40 g) ja trietyyliamiinia (0,70 ml) metyleenikloridissa (5 ml).
10 Minuutin kuluttua liuos laimennettiin etyyliasetaatilla (50 ml) ja pestiin 5 -prosenttisella HCl:llä, 20 ja sitten suolavedellä. Orgaaninen liuos kuivattin ja väkevöitiin. Silikageelikromatografiällä, missä käytettiin dikloorimetaanin ja etyyliasetaatin 15:1 -seosta eluenttina, saatiin 0,83 g (81 painoprosentin saanto) yhdistettä 5, joka oli valkea kiintoaine.
25 Ohutlevykromatografia silikageelillä käyttämällä di kloorimetaanin ja etyyliasetaatin 9:1 -seosta eluenttina antoi Rf-arvon 0,78.
Protoni-NMR CD3CN:ssa: delta 3.95 (singletti, 2H), 30 delta 6,40 (dubletti, 1H), delta 7,0-7,7 (multipletti, 7H), delta 7,85 (dubletti, 1H), delta 9,2 (leveä singletti, NH).
35
II
Yhdisteen 6 valmistus 49 94026
°" ® V
5 'τ v1 o 10 p-Trifluoriasetamidofenyyliasetyylikloridia käsiteltiin N-hydroksisukkinimidillä ja trietyyliamiinilla dikloo-rimetaanissa, jolloin saatiin yhdiste 6 valkeana kiinteänä aineena sen jälkeen, kun tuote oli puhdistettu tavalla, joka on kuvattu yllä yhdisteen 5 yhteydessä.
15 Ohutlevykromatogra£ialla, joka tehtiin silikageelillä käyttäen kloroformin ja metanolin 5:1 -seosta eluent-tina, antoi R*-arvon 0,35.
Protoni-NMR CDCI3:ssa: delta 3.15 (singletti, 2H), 20 delta 7,02 (kaksoisdubletti, 4H) ja delta 10,4 (leveä singletti, NH).
Yhdisteen 7 valmistus sKry o ^ nhcoch, v COCP^ 30 4-Trifluoriasetamidofenyylietikkahapon ja tionyyli-kloridin seosta kuumennettiin kaksi tuntia 40°C:ssa. Haihtuvat aineosat poistettiin vakuumissa. Jäännös 35 liuotettiin dikloorimetaaniin. 4-Asetamidofenolia (1 ekvivalentti) lisättiin, ja sitten trietyyliamiinia.
*: Tuote (yhdiste 7) puhdistettiin ja eristettiin 50 94026 uuttamalla ja kromatografisin menettelyin, jotka on kuvattu edellä aiempien yhdisteiden yhteydessä.
Yhdisteen 8 valmistus 5
HM
10 1 _ 4-Trifluoriasetamidofenyyliasetyylikloridia käsiteltiin p-nitrofenolilla ja trietyyliamiinilla dikloorime-15 taanissa. p-Nitrofenyyliesteri saatiin uuttamalla sili-kageelikromatografiällä.
p-Nitrofenyyliesteriä sekoitettiin metanolin ja muurahaishapon (50:1) seoksessa, jossa oli palladiumia hii-20 lessä. Vetyä kuplitettiin seokseen kaksi tuntia. Sitten seos laimennettiin etyyliasetaatilla ja suodatettiin.
Suodos pestiin 5-prosenttisella natriumbikarbonaatilla ja suolavedellä, suodatettiin ja väkevöitiin, jolloin saatiin p-aminofenyyliesteri.
;* 25 Tämän esterin annettiin reagoida meripihkahappoan-hydridin ja trietyyliamiinin kanssa dikloorimetaanissa yhdisteen 8 saamiseksi.
30 Yhdisteen 10 valmistus
HN
i Q 4 Π 9 < 4-Trifluoriasetamidofenyyliasetyylikloridia ja fenolia liuotettiin dikloorimetaaniin ja käsiteltiin trietyy-liamiinilla. Tuote {yhdiste 10) erotettiin uuttamalla ja kromatografisesti silikageelillä käyttäen yllä ku-5 vattuja menettelytapoja.
Yhdisteen 11 valmistus 15 4-Asetamidofenyylietikkahappo valmistettiin 4-aminofe- nyylietikkahaposta ja etikkahappoanhydridistä aseto-nitriilin ja natriumbikarbonaaatin vesiliuoksessa.
4-Trifluoriasetamidofenoli valmistettiin kahdessa 20 vaiheessa 4-nitrofenolista pelkistämällä H2/palla diumilla hiilessä metanolisessa suolahappoliuoksessa, ja asetyloimalla etikkahappoanhydridilla asetonitriilin vesiliuoksessa.
25 Tämän hapon ja 4-trifluoriasetamidofenolin seosta dikloorimetaanissa käsiteltiin bis(2-okso-3-oksat-solidinyyli)fosfiinikloridilla (ΒΟΡ-CI, kaupallinen reagenssi, jota valmistaa Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) ja trietyyliamiinilla 1,5 tuntia huoneen 30 lämpötilassa. Yhdiste 11 saatiin aiemmin kuvattuja erotusmenetelmiä käyttäen.
35 i 52 94026
Yhdisteen 9 valmistus C*3 10 Samanlaisella menettelyllä yhdistettiin tämän hapon ja 4-asetamidofenolin seos BOP-Cl:een ja trietyyliamii-niin dikloorimetaanissa. Vastaavanlaisella erotuksella, mitä käytettiin aiemmin kuvattujen menettelyjen yhteydessä saatiin esteri (yhdiste 9).
15 pK^-arvojen ja stabiilisuusvakioiden K määritys:
Kaikki pKj|- ja stabiilisuusvakio(K)-määritykset tehtiin Marteliin menetelmällä. Tässä menetelmä käsittää erityisen yhdisteen potentiometrisen titrauksen 20 (väkevyydessä noin 1,4 mM) tutkittavan metalli-ionin poissaollessa ja sen läsnäollessa. Ionivahvuus pidettiin vakiona käyttämällä 0,1 M NaC104:ia tukielekt-rolyyttinä. Kaikki mittaukset tehtiin typpi-ilmakehässä . 25 25°C:n lämpötilassa (± 0,01°C).
Yhdisteen J valmistus 30 xsyv
IpTol
N
3-Metyyli-8-nitro-kinaldiinia (0,5 g; 2,66x10-3 moolia) laitettiin 25 ml:n pyörökolviin, lisättiin 15 ml meta-nolia ja sitten 0,081 ml väkevää HC1 (1 ekvivalentti).
li 53 94026
Seosta sekoitettiin 5 minuuttia ja 0,250 g palladiumia hiilessä lisättiin. Saatava seos laitettiin vetyilmake-hään, jolloin nitroryhmä pelkistyi. 25 Minuutin sekoituksen jälkeen reaktion täydellisyys tarkistettiin 5 ohutlevykromatografisesti silikalla (TLC) käyttämällä heksaani/etyyliasetaattia (1/1) eluenttina. Lähtöainetta ei todettu. Tuotteen Rf-arvo on 0,85 ja se värjäytyy mustaksi ninhydriinillä.
10 Pelkistetty reaktioseos laimennetaan 50 ml:11a etyyliasetaattia (EtOAc), suodatetaan seliittikerroksen läpi ja väkevöidään alipaineessa. Saatava öljy liuotetaan uudestaan 50 ml:aan EtOAc, ja uutetaan ensin kylläisellä natriumbikarbonaatti- ja sitten kylläisellä nat-15 riumkloridiliuoksella, ja kuivataan natriumsulfaatilla. Kun liuotin poistetaan alipaineessa, saadaan 0,353 g keltaista kiinteää ainetta (84 % saanto).
Protoni-NMR CDCls:ssa ja 100 MHz:ssa (suhteessa m 20 TMS:ään, joka oli sisäinen standardi): 7,95 (dubletti, J « 7,92 Hz, 1H), 7,4-6,8 (multipletti, 4H), 5,0 (leveä singletti, 2H), 2,75 (singletti, 3H).
Yhdisteen 12 valmistus : 25 (ρχοΐ l Ν H S. Ofc*.
V*.
»»M
«Λ 35 Yhdistettä J (0,037 g, 2,34x10“4 moolia) laitetaan 25 ml:n pyörökolviin typpi-ilmakehässä. Lisätään tetrahyd-.·' rofuraania (THF, 5 ml) yhdisteen J liuottamiseksi, ja 54 94026 saatu liuos jäähdytetään -78°C:seen. Lisätään hitaasti butyylilitiumliuosta (110 ml, 2,5 M heksaanissa) 5 minuutin aikana purppuraisen, mustan liuoksen aikaansaamiseksi. Viiden minuutin lisäsekoituksen jälkeen lisä-5 tään yhdistettä B, ja seoksen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan; liuoksen väri muuttuu vaalean vihreäksi. Silika-TLC:llä, käyttäen EtOAc/CHiCI2;ia (1/1) liuottimena saadaan tuotteelle Rf-arvo 0,4.
10 Liuotin poistetaan alipaineessa ja saatava aine liuotetaan uudestaan 20 ml:aan EtOAc, pestään 0,5 M HCl:llä ja kylläisellä natriumkloridilla ja kuivataan natrium-sulfaatilla. Liuotin poistetaan alipaineessa, ja 0,042 g (40% saanto) yhdistettä 12 saadaan flash-15 kromatografiän jälkeen.
Protoni-NMR CDCI3:ssa ja 100 MHz:ssä: (verrattuna TMS:iin, joka toimii sisäisenä standardina): 10,4 (leveä singletti, 1H) 8,0 (dubletti, J * 7,7 Hz, 1H), 7,7 20 (dubletti, J = 7,9 Hz, 1H), 7,4-6,8 (multipletti, 7H), 4,2 (p, J * 5,2 Hz), 3,35 (dubletti, J = 20,1 Hz, 2H), 2,6 (singletti, 3H), 1,3 (tripletti, J = 6,2H).
Yhdisteen K valmistus 25 •
CoTo\
Oftt 35 Yhdistettä 12 (0,010 g, 2,22x10"8 moolia) laitetaan 5 ml:n pyörökolviin, johon lisätään 1,5 ml metanolia ja 8 : mg kiinteää natriumkarbonaattia (8,88x10-° moolia), ja
II
ss 94026 vielä 200 ml vettä. Reaktiota seurataan silika-TLC-le-vyllä käyttäen EtOAc/CH2CI2:ia (1/1) liuottimena; tuotteella on Rf-arvo 0,35. Reaktio on mennyt loppuun 12 tunnissa 35° C:ssa.
5
Reaktioseos laimennetaan etyyliasetaatilla, merkitään kyllästetyllä natriumkloridilla, ja kuivataan natrium-sulfaatilla. Sen jälkeen liuotin poistetaan alipaineessa, jolloin saadaan 6,5 mg yhdistettä K (83% saan-10 to).
Protoni-NMR CDCI3:ssa ja 100 MHz:ssä verrattuna TMS:iin, joka on sisäinen standardi: 8 (dubletti, J = 7,1 Hz, 1H), 7,7-6,0 (multipletti, 9H), 6,6 (dubletti, 15 J = 7,1 Hz, 1H), 4,2 (multipletti, 2H), 3.3 (dubletti, J = 20,1 Hz, 2H), 2,7 (singletti, 3H, 1,3 (tripletti, J = 6,6 Hz, 3H).
Yhdisteen L valmistus 20
N
:· 25 JS/0 - O 0 ö 30
Yhdistettä K (0,0065 g, 1,84x10-9 moolia) laitetaan 5 ml:n pyörökolviin, johon lisätään 2 ml CH2, 16,4 mg (4xl0~s moolia) sukkinimidyyliglutaryylikloridia (valmistetaan samalla tavalla kuin adipoyylijohdannainen, 35 josta puhutaan tämän jälkeen) ja sitten trietyyli-amiinia (0,003 ml, 4xl0~9 moolia). Välitön värin-muodostus havaitaan. Reaktiota seurataan silika-TLC- ί 56 94026 levyllä käyttäen EtOAc/CH2CI2:ia (1/1) liuottimena, jolloin tuote saa Rf-arvon 0,3. Reaktioseosta sekoitetaan kaikkiaan 30 minuuttia, sitten laimennetaan EtOAcrlla, pestään 0,5 M HCl:llä ja kyllästetyllä nat-5 riumkloridilla, ja lopuksi kuivataan natriumsulfaa- tilla. Liuottimen vakuumissa poiston ja flash-kromato-grafian jälkeen saadaan tuotteena 3,5 mg yhdistettä L (34% saanto).
10 Protoni-NMR CDCl3:ssa ja 100 MHz:ssä (verrattuna TMSriin, joka on sisäinen standardi): 8,0 (dubletti, J = 7,1 Hz, 1H), 7,8-7,0 (multipletti, 10H), 4,2 (multi-pletti, 2H), 3,3 (dubletti, J = 20,2 Hz, 2H), 2,9 (sin-gletti, 4H), 2,7 (singletti, 3H), 2,6-1,9 (multipletti, 15 6H), 1,3 (tripletti, J = 6,5 Hz).
Yhdisteen 13 valmistus (olpl 20 CJW3
Hm ό ^ v
> N
o' NCcWi)5 - C - O - I
ö Y
Yhdistettä L (0,012 g) laitetaan kuivaan NMR-putkeen 30 typpiatmosfäärissä, sitten lisätään 1 ml kuivaa CDCleiia. Kaksi 25 ml:n annosta trimetyylisilyylibromi-dia (TMSBr) lisätään putkeen ja putki ajetaan, minkä jälkeen se laitetaan vesihauteeseen 38®C:seen yhdeksi tunniksi. Fosfonamidaatin etyyliesterin irtoamista seu-35 rataan NMR-spektritiedoista.
Il 57 94026
Kun etyyliesterin irtoaminen on mennyt loppuun, siirretään NMR-putken sisältö kuivaan 10 ml:n pyörökolviin typpi-ilmakehään- Liuotin poistetaan alipaineessa käyttämällä vakuumipumppua. Saatu kiintoaine pestään hek-5 saanilla ja kuivataan uudestaan vakuumipumppua käyttäen.
Kiinteää natriumasetaattia (0,058 mg) sekoitetaan yllä olevan pestyn ja kuivatun kiintoaineksen kanssa, sen 10 jälkeen lisätään 2 ml asetonitriililiuosta, jossa on 1,0 ml metanolia. Saatavaa seosta sekoitetaan, kunnes lähes kaikki aine on liuennut, tosin pieni määrä valkeaa kiintoainetta jää liukenematta. Tämä liuos jäädytetään ja kylmäkuivataan (pakastekuivataan), jolloin 15 saadaan keltainen, epäpuhdas kiinteä aine (38 mg).
Yhdisteen 13 puhtaus testataan HPLC:llä dimetyyliforma-midiin liuotuksen jälkeen käyttäen käänteisfaasi C-18-kolonnia ja seuraavaa gradienttia 15 minuutin aikana:
20 % A % B
25 75 70 30 A * asetonitriili, B = vesi-0,1% trifuorietikkahappo.
25 Yksi suuri piikki havaitaan 3,8 minuutin kohdalla.
Aine, joka tämän piikin aiheuttaa, on pysyvä 0°C:ssa viisi päivää. Yhdiste 13 kytketään kantajaan ja sitä käytetään immunointeihin ilman lisäpuhdistusta.
30 35 I ·
Yhdisteen 12i valmistus 58 94026 (οχδ^
5 « O
10 3
Yhdistettä 12 (15 mg, 3,3xl0~e moolia) laitetaan kuivaan NMR-putkeen yhdessä noin 1 ml:n CDCl3:ia kanssa.
Liuosta pyöritetään ja kaksi 35 ml:n erää TMSBriia li-15 sätään. Saatavaa liuosta pyöritetään edelleen ja sitten kuumennetaan vesihauteessa yhden tunnin ajan 38°C:ssa.
Reaktion edistymistä seurataan NMR:llä.
Kun reaktio on täydellinen, poistetaan liuos putkesta, 20 laitetaan 10 ml:n pyörökolviin ja pumpataan kuiviin va-kuumipumpulla, jolloin saadaan oranssi kiintoaine.
Kiintoaine pestään kahdesti 10 ml:n annoksilla heksaa-nia ja pumpataan uudestaan kuiviin.
. 25 Kiinteää natriumasetaattitrihydraattia (45 mg) sekoite taan oranssin kiintoaineen kanssa ja 2 ml asetonitrii-liä, jossa on 50 μΐ metanolia, lisätään. Tällöin oranssi kiintoaine muuttuu keltaiseksi liuokseksi.
30 Puhtaus tarkistetaan HPLC:llä ja käänteisfaasikolon-nilla C-18 seuraavaa gradienttia 15 minuutin aikana käyttäen:
%A %B
35 25 75 90 10 : A = asetonitriili, B = vesi-0,1% trifluorietikkahappo 59 94026
Toivottu tuote, yhdiste 12i , eluoituu kolonnista 5,80 minuutissa yhtenä pääpiikkinä. Tämä aine on pysyvä pH-arvoissa 3,5 - 7,3 ainakin 11 päivää huoneen lämpöti-5 lassa.
Kun yhdistettä 12i käsitellään diatsometaanilla metano- lissa saaaadaan vastaava metyyliesteri, mikä on lisätodiste tuotteen tunnistuksessa.
10
Protoni-NMR CDeCNrssä ja 100 MHz:ssä tuotteesta 12i, joka on saatu preparatiivisella HPLC:llä (TMS sisäisenä standardina): 9,0 (leveä singletti, 1H), 8,3 (dubletti, J = 7,3 Hz, 1H), 7,8 - 6,8 (multipletti, 9H), 3,3 (dub-15 letti J = 21,0 Hz, 2H).
Yleinen ohje substraattiligandiestereiden valmistamiseksi 20 Suspensiota, jossa on 4-asetamidofenyylietikkahappoa (5 roillimoolia), BOP-C1 (5 millimoolia), trietyyliamiinia (10 millimoolia) ja hydroksiyhdistettä (5,2 millimoolia) dikloorimetaanissa (10 ml),sekoitetaan huoneen lämpötilassa (20-25°C) yhden tunnin ajan. Rf-arvot . 25 olivat seuraavat käytettäessä silikaa kiinteänä faasina: yhdiste Rf liuotin 30 16 0,45 CH2 CI2/EtOH (20/1) 17 0,8 CH2 CI2/EtOAc (1/1) 22 0,7 - " - (1/1) 21 0,5 - " - (1/1) 35 Vesikäsittelyn (10 ml, tehty alkaaliseksi natriumbikarbonaatilla) jälkeen orgaanisen kerros dekantoidaan ja kuivataan natriumsulfaatilla. Kun liuotin on poistettu, 6„ 94026 saadaan jäännös, josta flash-kromatografiän, missä käytetään yllä mainittua TLC-liuotinta, jälkeen antaa seu-raavia esteriligandisubstraatteja: 5 Yhdiste 16 -«3Λ° 15
Saanto = 49%. Protoni-NMR CDCI3:ssa 100 MHzissä (verrattuna TMS-sisäiseen standardiin): 8,0 (leveä dub-letti, J = 7,2 Hz, 1H), 7,7 - 7,1 (multipletti, 9H), 4,05 (singletti, 2H), 2,75 (singletti, 3H), 2,1 (sing-20 letti, 3H).
Yhdiste 17 (oJo\ 25
H M
30 Ct^O
Saanto 62%. Protoni-NMR COCI3:ssa ja 100 MHzrssä (TMS 35 sisäinen standardi): 7,8 -7,0 (multipletti, 12H), 3,95 (singletti, 2H), 2,0 (singletti, 3H).
n I · 94026 61
Yhdiste 21 ©k
„ O
5 \fP
& HM ^ A0 CH, o 10 s
Saanto 13%. Protoni-NMR dimetyylisulfoksidissa-de ja 100 MHz:ssä (TMS sisäisenä standardina): 7,6 (multi-pletti, 2H) , 7,3 (multipletti, 2H), 6,0 (multipletti, 15 4H), 3,4 (singletti, 2H), 1,9 (singletti, 3H), 1,8 (singletti, 3H).
Yhdiste 22 20 (O) βί 25
Saanto - 58%. Protoni-NMR CDCI3:ssa ja 100 MHz:ssä 30 (suhteessa TMS-sisäiseen standardiin): 7,6 - 6,95 (mul-tipletti, 9H), 3,8 (singletti, 2H), 2,1 (singletti, 3H) .
35
Yhdiste 20 62 94026 & ‘ 10
Yhdiste 20 valmistetaan samalla tavalla kuin yhdiste 5.
Yhdisteen 18 valmistus 15 v° 20
Alfa-naftolia (0,3515 g; 2,44x10'3 moolia) liuotetaan 5 ml:aan CK2C12, ja saatava liuos jäähdytetään 0°C:seen. Asetyylikloridia (0,26 ml? 3,66x10-3 moolia) lisätään sekoittaen ja sen jälkeen hitaasti pisaroittain tri-25 etyyliamiinia (1,02 ml; 7,32xl0-3 moolia). Nopeasti muodostuu suuri sakka sekoitettaessa. Lisätään uudestaan 5 ml CH2 CI2:ia ja annetaan reaktioseoksen lämmetä huoneen lämpötilaan.
30 Ohutlevykromatografia, silikalla ja liuottimena hek- saani/CH2Cl2 (1/1), joka aloitettiin 5 minuutin kuluttua viimeisestä CH2CI2 -lisäyksestä, osoittaa, että lähtöainetta ei ole jäljellä.
35 Reaktioseokseen lisätään etyyliasetaattia ja saatava seos uutetaan natriumbikarbonaatin vesiliuoksella, 0,5 ’ M HCl:llä ja sitten kylläisellä natriumkloridin vesi- il 63 94026 liuoksella. Sen jälkeen orgaaninen kerros kuivataan natriumsulfaatin päällä. Sen jälkeen kun tuote on puhdistettu kolonnikromatografiällä, on saantona 63 mg kirkasta nestettä; saanto = 42%.
5
Protoni-NMR CDCla:ssa ja 100 MHz:ssä (suhteessa TMS:iin, joka toimii sisäisenä standardina): 8,0 - 7,2 (multipletti, 7H), 2,45 (singletti, 3H).
10 Yhdisteen 19 valmistus C«3 ( y & C«5 20 4-N-Asetyylifenyylietikkahappoa (0,00030 g; 1,55x10-4 moolia) liuotetaan 5 ml:aan metanolia. Lisätään diatso-metaania dietyylieetterissä pisaroittaan, kunnes seokseen jää keltainen väri lisäyksen jälkeen.
25 Kationinvaihtohartsihelmiä, jotka ovat vetymuodossa, lisätään reaktioseokseen, kunnes liuos on väritön.
Liuotin poistetaan alipaineessa, jolloin saadaan valkea kiinteä aine, joka painaa 0,032 g (100%:n saanto). TLC 30 silikalla liuottimena CH2Cl2/EtOAc (1/1) ilmaisee puhtaan reaktion, jossa ei ole jäljellä lähtöainetta.
Protoni-NMR CDCla:ssa ja 100 MHz:ssä (suhteessa TMS:iin, joka on sisäinen standardi): 7,2 (dubletti, J 35 = 7,7 Hz, 2H), 6,8 (dubletti, J » 7,8 Hz, 2H), 3,95 (S, 3H), 3,2 (S, 2H).
64 i 94026
Yleinen menetelmä substraattiligandiamidien valmistamiseksi
Sekoitettu dikloorimetaaniliuos (20 ml), jossa on kar-5 boksyylihappoa (10 millimoolia), trietyyliamiinia (20 millimoolia) ja amiinia (10 millimoolia), jäähdytetään 10°C:seen, ja BOP-Cl:ia (10 millimoolia) lisätään.
Liukeneminen tapahtuu 30 minuutissa 25°C:ssa. Reaktiota sekoitetaan huoneen lämpötilassa noin tunnin ajan.
10 Reaktion etenemistä seurataan TLC:llä silikalla käyttämällä EtOAc/CH2 CI2:ia liuottimena. Yhdisteen Rf-arvo on näissä olosuhteissa 0,6.
Reaktioseokseen lisätään 20 ml vettä ja 4 M HCl:ia pH:n 15 säätämiseksi 1 - l,5:een. Saostunut amidi suodatetaan eroon. Jäljelle jäänyt orgaaninen kerros pestään natriumbikarbonaatin vesiliuoksella, ja suodatetaan lisäa-midin saamiseksi. Puhdistettu tuote saadaan flash-kro-matografiällä, joka tehdään silikan päällä ja TLC-liu-20 ottimella.
Yhdiste 14
:· 25 COTOX
H »4 "r° & 30 hn'
Saanto = 51%. Protoni-NMR CDCI3:ssa ja 100 MHz:ssä 35 (verrattuna TMSriin, joka on sisäinen standardi): 10,0 (leveä singletti, 1H), 8,7 (multipletti, 1H), 8,0 (mul- « 65 9 4 0 2 6 tipletti, 1H), 7,6 - 7,1 (multipletti, 8H), 3,85 (sing-letti, 2H), 2,6 (singletti, 3H), 2,2 (singletti, 3H).
Samalla tavalla valmistetaan yhdiste 15.
5 to© H M 0 &
HN
15 Sukkinimidyyliadipoyylikloridin (kytkentä-aine) valmistus
Liuosta, jossa on adipiinihapon monometyyliesteriä (5,4 g, 33,3 mmol) tionyylikloridissa (15 ml), kuumennettiin 20 30°C:ssa kaksi tuntia. Seos väkevöitiin ja tislattiin alipaineessa (kiehumapiste 119°C 20 mmHg:ssa), jolloin saatiin 3,58 g (60 painoprosentin saanto) happokloridi-metyyliesteriä. Tämä liuotettiin 20 ml:aan dikloorime-taania ja N-hydroksisukkinimidiä (2,75 g, 24,0 mmol) 25 lisättiin, ja lisäksi trietyyliamiinia (4,2 ml, 30 mmol). Seosta sekoitettiin 10 minuuttia, minkä jälkeen se laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin 0,5 M HCl:llä ja suolaliuoksella. Liuos kuivattiin vedettömän magnesiumsulfaatin päällä, suodatettiin ja väkevöitiin, 30 jolloin saatiin 4,5 g (87,5 painoprosenttia) metyyli-sukkinimidyyliadipaattia värittömänä öljynä.
Protoni-NMR (deuterokloroformissa): delta 3,73 (singletti, 3H); delta 2,90 (singletti 4H), delta 2.70 (multipletti, 2H), delta 2,37 (multipletti, 2H), ja 35 delta 1,79 (multipletti 4H).
94026 66
Liuosta, jossa on metyylisukkinimidyyliadipaattia (4,5 g, 17,5 mmol), klooritrimetyylisilaania (11,1 ml, 87,5 mmol) ja natriumjodidia (13,1 g, 87,5 mmol) 10 ml:ssa asetonitriiliä, kuumennettiin refluksoimalla 12 tuntia.
5 Sen jälkeen seos jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja laimennettiin etyyliasetaatilla. Reaktioseosta pestiin toistuvasti 5-prosenttisella natriumbisulfiitin vesiliuoksella, kunnes orgaaninen liuos oli väritön. Sitten se pestiin suolavedellä, kuivattiin vedettömällä mag-10 nesiumsulfaatilla, suodatettiin ja konsentroitiin; tuotteena oli 3,2 g (71 painoprosenttia) valkeaa kiinteää monosukkinimidyyliesteriä.
Protoni-NMR (deuterokloroformissa); delta 3,90 (sing-15 letti, 4H) , delta 2,70 (multipletti, 2H), delta 2,4 (multipletti, 2H), delta 1,80 (multipletti, 4H).
Seosta, jossa oli adipiinihapon sukkinimidyyliesteriä (1,00 g, 3,80 mmol) ja tionyylikloridia (5 ml), 20 kuumennettiin 40°C:ssa kolme tuntia, minkä jälkeen se jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja väkevöitiin alipaineessa. Jäännöstä sekoitettiin useita kertoja kuivan heksaanin kanssa, öljy erotettiin ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin 0,97 g (90 prosentin '. 25 saanto painosta) sukkinimidyyliadipoyylikloridia. Tuote liuotettiin kuivaan tetrahydrofuraaniin 5 molaariseksi liuokseksi, mitä käytettiin sellaisenaan sellaisten yhdisteiden valmistamiseen, jotka olivat sopivia kytkeytymään kantajaproteiineihin. Protoni-NMR 30 (CDC1|:ssa): delta 3,00 (multipletti, 2H), delta 2,90 (singletti, 4H), delta 2,70 (multipletti, 2H), delta 1,80 (multipletti 4H).
Proteiinikonjugaatit, joissa on fosfonaattiyhdisteet 1 35 ja 4, valmistetaan lisäämällä 0,5 millilitraa fosfonaa-tin kylmää vesiliuosta (2 mg/ml) 1,0 mitään proteiinin • liuosta (KLH tai BSA, 5 mg/ml), joka on fosfaattipusku- 67 94026 rissa (pH 7,2, 0,2 M), ja sekoittamalla kevyesti kahden tunnin ajan 4°C:ssa.
Liittämällä trifluoroasetyyliryhmä yhdisteiden 1-4 5 aminobentsyylifosfonaattiin yksinkertaistaa seuraavia synteesivaiheita, joissa fosfonyylikloridia tarvitaan. Yhdisteiden 3 ja 4 dipikoliinihappo-osalla saadaan li-säsitoutumisvuorovaikutus vasta-aineen ja näiden rakenteiden fenolisen osan välille.
10 p-Trifluoriasetamidobentsyylifosfonaattien nitrofenyy-liesterit ovat hyödyllisiä välituotteita kaaviossa, missä haptiinit kytkeytyvät kantajaproteiineihin, pelkistämällä nitroryhmän amiinifunktioksi ja asyloimalla 15 tämän heterobifunktionaalisen adipiinihappojohdannai sen, kuten sukkinimidyyliadipoyylikloridin, kanssa, kuten tässä kuvataan. Fenolirenkaan N-hydroksisukkinimi-dyyliaktivoitu esteri-osa (yhdisteet 2 ja 4) ansiosta kytkeytyminen kantajaproteiineihin (KLH tai BSA) tapah- m 20 tuu tehokkaasti vesipuskuriliuoksissa.
Samalla tavalla valmistettiin ja käytettiin sukkiinimi-dyyliglutaroyylikloridia.
• 25 IV. Konjugaattien ja istutteiden valmistus
Haptiinilanalogiligandimolekyylien konjugaatit prote-iinikantajien kanssa, kuten keyhole limpet(syylä)hemo-syaniini (KLH) voidaan valmistaa esimerkiksi aktivoi-30 maila kantaja kytkentäaineella, kuten MBS:llä (m-malei-midobentsoyyli-N-hydroksisukkinimidiesteri), ja kytkemällä tioliryhmä analogiligandiin. Katso esimerkiksi 35 ββ 94026 i
Liu et ai., Biochem. 80, 690 (1979). Kuten myöskin on tunnettua, on usein edullista sitoa yhdiste kantajaansa väliaineen, yhdistävän ryhmän avulla.
5 Käyttökelpoiset kantajat ovat tunnettuja ja ovat yleensä itse proteiineja. Esimerkkejä sellaisista kantajista ovat keyhole limpet-hemosyaniini (KLH), edes-tiini, tyroglobuliini, albumiinit, kuten nautaseeru-mialbumiini tai ihmisseerumialbumiini (BSA tai HSA, 10 vastaavasti), punaiset verisolut, kuten lampaan eryt-rosyytit (SRBC), tetanus-toksoidi, koleratoksoidi, kuten myös polyaminohapot, kuten poly(D-lysiini:D-glutamiinihappo) ja vastaavat.
15 Kantajan valinta riippuu enemmän vasta-aineen varsinaisesta käyttötarkoituksesta kuin vasta-aineen määrittelevästä osasta, ja valinta perustuu kriteereihin, joita ei erityisesti käsitellä tässä keksinnössä. Esimerkiksi, jos konjugaattia aiotaan käyttää laboratorioeläi-20 miin, tulee valita kantaja, joka ei aiheuta epäsuotuisaa reaktiota valitussa eläimessä.
Kantaja-haptiinikonjugaatti liuotetaan tai dispergoi-25 daan istutteen muodostamiseksi vesiliuokseen, jonka koostumus on fysiologisesti siedettävä, kuten normaali suolaliuos, PBS, tai steriili vesi. istutteeseen voidaan myös lisätä apuaine, kuten täydellinen Freundin adjuvantti tai aluna. Istute lisätään esim. injektoi-30 maila eläimeen, jota on käytetty vasta-aineiden kasvattamisessa, sellaisena annoksena, mikä riittää in-dusoimaan vasta-aineet, kuten on tunnettua.
, 4
II
69 94026
Esimerkki-immunogeenisia konjugaatteja valmistettiin fosfonaattiestereistä ottamalla käyttöön niiden synteesit, joissa suora hiiliketju liitetään fenoliseen ryhmään (analogiligandiesterin alkoholiosa) avaruusele-5 mentiksi.
Muita malli-immunogeenisia konjugaatteja valmistettiin fosfonamideista käyttämällä näitä synteesejä suoran hiiliketjun liittämiseen analogiligandin happo-osaan 10 tilaelementiksi. Pääteltiin, että adipaatti- tai gluta-raattilisäkkeen taipuisa hiiliketju vähentäisi im-munoreaktiivisuuden vinoutumista johtuen konformaa-tiojännitteestä, jonka kovalenttinen sitoutuminen kantajaproteiiniin aiheuttaa. Tähän tarkoitukseen valmis-15 tetusta bifunktionaalisesta reagenssista saadaan myös karboksyyliryhmä sidokseen, kun muodostuu amidisidos kantajan lysiinijäänteiden kanssa. Tässä tutkimuksessa käytettyä erityistä kytkentämenetelmää kuvataan edelleen tässä. Fosfonaattiesterit kytkettiin keyhole 20 limpet(ontelosyylä)hemosyaniiniin (KLH) rakenteen fenoliosan aminoryhmän kautta.
Tämän tutkimuksen mukaan väliaineena toimivaksi kytkeväksi aineeksi sopii parhaiten sukkinimidyyli-. 25 adipoyyli- tai -glutaroyylikloridi, joka valmistetaan seuraavalla tavalla.
« 70 94026 V. Monoklonaalisten reseptorien valmistus
Edellä puhuttuja KLH -konjugaatteja käytettiin immunoi- maan hiiriä (129G1X+ -kanta), ja monoklonaaliset vasta-5 aineet saatiin, kuten kuvaavat Niman et ai., Proc.
Natl. Acad. Sei. USA, 77, 4524 (1980) ja Niman et ai..
Monoclonal Antibodies and T-Cell Products, ed. Katz, D.H., 23-51 (CRC Press, Boca Raton, FL 1982).
Lymfosyytit, joiden tehtävä on muodostaa hybridomia tä-10 hän keksintöön, voidaan saada mistä tahansa nisäkkäästä, kuten kädellisistä, jyrsijöistä (esim. hiirestä tai rotasta), jäniksestä, marsusta, kanista, lehmästä, koirasta, lampaasta, siasta tai vastaavista. Isäntä voidaan sitten herkistää immunogeeni-injektiolla, tässä 15 tapauksessa haptiinianalogiligandilla, jota seuraa li-säinjektio, ja sen jälkeen pernan eristys.
On suositeltavaa, että myelomasolulinja on samaa kantaa . kuin lymfosyytit. Tästä syystä tyypillisesti käytetään 20 fuusioituja hybridejä, kuten hiiri-hiiri-hybridejä (Shulman et ai., Nature, 276, 269 (1978)) tai rotta-rottahybridejä (Galfre et ai., Nature, 277, 131 (1979)). Hybridomien valmistuksessa on kuitenkin myös onnistuttu käyttämään joitakin rotta-hiiri-hybridejä * 25 (Goding, "Production of Monoclonal Antibodies by Cell
Fusion", kirjassa: Antibody as a Tool, Marchalonis et al. eds., John Wiley & Sons Ltd., p. 273 (1982)). Tässä keksinnössä käytettäviksi sopivat myelomaketjut ovat mm. MPC-11 (ATCC CRL 167), P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 30 1580), Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581), P3 X 63 Ag8U.l (ATCC
CRL 1597), Y3-Agl.2.3. (joita säilytetään Collection Nationale de Cultures de Microorganisms, Paris,
France:ssa numeroina 1-078) ja P3X63Ag8 (ATCC TIB 9).
Tässä keksinnössä suositellaan käytettäväksi ei-3^ erittävää hiiri-myelomaketjua Sp2/0 tai Sp2/0-Agl4.
I · • Φ tl 7i 94026
Hybridomasoluja, jotka lopulta saadaan aikaan, voidaan viljellä noudattamalla tavanomaista in vitro -kudosvil-jelytekniikkaa hyvin tunnetuille soluille. Suositeltavammin, hybridomasoluja viljellään eläimissä käyttä-5 mällä myös tunnettuja tekniikoita, jolloin monoklonaaliset reseptorit saadaan muodostuneesta vesivatsanes-teestä. Vesivatsanesteen muodostamiseen käytetyt eläimet olivat naarashiiriä 129G1X*, jotka oli kasvatettu Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, Cali-10 fornian hiiriyhdyskunnassa; jos kuitenkin muita eläimiä kuin hiiriä käytetään hybridomien valmistukseen, voidaan hiiriä tai sen tyyppisiä eläimiä käyttää vesivatsanesteen tuottamiseen.
15 Standardi-hybridomatekniikalla on tuotettu, erityisesti, mallikelpoinen monoklonaalinen reseptori: Kohler et ai.. Nature, 256, 495 (1975). Naarashiiret 129G1X* immunoitiin intraperitonaalisella injektiolla istutteella, jossa oli 100 pg konjugaattia (esimerkiksi 20 yhdistettä 4 sitoutuneena KLH:hon) 300 pl:ssa seosta, jossa oli 1 osa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) pH 7,4 ja 1 osa täydellistä Freundin apuainetta. Kaksi viikkoa myöhemmin, hiiret injektoitiin uudestaan samalla tavalla käyttäen 50 pg:aa edeltävää konjugaattia 25 300 pl:ssa seosta, jossa oli 1 osa PBS:ää (pH 7,4) ja 1 osa 10 mg/ml alunaa. Kahdeksan lisäviikon kuluttua, hiiret immunoitiin suonensisäisesti 50 pg:lla konjugaattia 200 pl:ssa PBS (pH 7,4). Hiirten pernat erotettiin neljä päivää myöhemmin, ja pernasolut fuusioi-30 tiin myelomasolujen kanssa.
Pernasolut yhdistettiin ja tehtiin yksi suspensio. Tiivistetyt pernasolut (l,4xl08) fuusioitiin sitten 3x107:n Sp2/0 -ei-erittävän myelomasolun kanssa 35 fuusiota edistävän aineen (polyetyleeniglykoli 2000) läsnäollessa. Hybridoma, joka tuottaa erityistä mono-: klonaalista vasta-ainetta valittiin ymppäämällä per- 72 94026 k nasolut 96-paikkaisilla levyillä ja kasvattamalla Dul-beccon muunnetussa Eagle -väliaineessa (DMEM), joka sisälsi 4500 mg/1 glukoosia (10%), 10 prosenttia vasikan sikiöseerumia (FCS), hypoksantiinia, aminopteriinia ja 5 tymidiiniä (so. HAT -väliaine), joka ei edistä fuusioi-mattomien myelomasolujen kasvua.
Kolmen viikon kuluttua jokaisen näyteastian syvennyksen solukloonin pinnalle erottuneesta kerroksesta otettiin 10 näyte, joka testattiin ELISA -kokeella (entsyymisidonnainen immunosorbenttikoe, kuten tästä eteenpäin kutsutaan) yhdistettä 4 vastustavien vasta-aineiden läsnäolon toteamiseksi. Positiiviset näytteet kloonattiin kahdesti rajalaimennuksella. Niitä klooneja, jotka jat-15 koivat yhdisteelle 4 spesifisten vasta-aineiden muodostusta kahden kloonauksen jälkeen, laajennettiin suurempien pinnalle erottuvien nestemäärien saamiseksi. Hyb-ridomat ja monoklonaaliset reseptorit, joita siitä tuotettiin ja joita kuvataan tässä, on nimetty labora-20 rorionimityksin "P3 6D4" ja "P3 8D2", sen erityisen materiaalin, johon viitataan, käyden ilmi asiayhteydestä.
Lisää katalyyttisia monoklonaalisia reseptoreja valmistettiin samalla tavalla toisella fuusiolla käyttämällä . 25 yhdistettä 2i liittyneenä antigeenikantajaan im- munogeenina. Nämä toiset kaksi katalyyttistä reseptori-molekyyliä ja niiden hybridomat nimettiin: "P2 50D8" ja "P2 57G4". Nämä kaksi reseptoria pystyvät katalyytti-sesti hydrolysoimaan yhdisteet 5, 9 ja 11. Todisteet 30 yhdisteen 7 katalyyttisesta hydrolysoituvuudesta ovat epäselvät.
32 Hybridomaa kasvatettiin samalla tavalla käyttämällä yhdistettä 13 immunogeenina, joka on sitoutunut KLHrhon 35 antigeenikantajana. Yhtä KLH -molekyyliä kohti kytket tiin noin 25 yhdisteen 13 molekyyliä, ja BSA:lla todet- ·· tiin samanlainen sitoutmistehokkuus.
• ·
II
m 94026
Immunogeenien puoliintumisajan tulisi olla ainakin kaksi päivää veren pH-arvoissa, jotta immunoituminen ehtisi tapahtua. Aiemmat tutkimukset (Bartlett et ai., 5 J. Am. Chem. Soc. , 103., 654 (1981)) ovat osoittaneet, että alkyylifosfonamidaattien puoliintumisaika voi olla vain muutamia minuutteja pH-arvoissa 2-5, kun taas pH-arvolla 8,5 stabiilisuus näytti olevan rajaton lämpötilassa 5° C. Yhdisteen 13 puoliintumisaika oli 11 päivää 10 huoneen lämpötilassa ja pH-arvossa 7,3. Hajoamista ei havaittu pH-arvoilla 3,5 ja 6,2.
Hiiret hyperimmunoitiin yhdisteen 13 KLH -konjugaatilla kolmen tai neljän viikon ajan. Seerumit testattiin 15 ELISA:11a käyttäen yhdisteen 13 BSA -konjugaattia, joka oli sidottu mikrotiitterilevyn syvennyksiin kiinteäolo-muotoisena vasta-aineena. Kloonatut hybridomat seulottiin myös ELISA -testillä.
20 Kahdeksan niistä 32 monoklonaalisesta reseptorista, jotka immunoreagoivat yhdisteen 13 kanssa, katalyytti-sesti hydrolysoivat yhden tai useamman reagenssi-ligandiesterin. Sopiva analogiligandi pystyi estämään jokaisen noista katalyyseista. Joten suhteellisen suuri 25 %-osuus indusoiduista monoklonaalisista reseptoreista pystyi katalysoimaan esterolyyttista reaktiota. Syytä tähän käyttökelpoisten indusoituvien reseptorien suhteellisen suureen osuuteen ei tiedetä, mutta se saattaisi johtua fosfonamidaattiryhmän typpiatomin 30 läsnäolosta, tai analogiligandin kinoliiniytimestä.
Nämä kahdeksan katalyyttistä monoklonaalista reseptoria ja hybridomat, jotka erittävät niitä on nimetty laboratorionimillä: "QPNl 7E5", QPNl 12C9", QPNl 13E10", QPNl 17G8",QPN1 21G2”, "QPNl 22F5”, QPNl 37G2" 35 ja "QPNl 44A2”. Etuliite "QPNl" jätetään joskus pois keskusteltaessa näistä hybridomista ja reseptoreista.
, · 74 94026
Hybridomat talletettiin American Type Culture Collection, Rockville, MD:iin, kuten nähdään hybridomien tal-letustaulukosta alia.
5 Hybridomien talletustaulukko
Hybridoman määrittely
Laboratorio ATCC Talletuspäivä 10 P3 6D4 HB 9168 elokuun 6. 1986 P3 8D2 HB 9169 - ” - QPN1 12C9 HB 9500 elokuun 18. 1987 QPN1 44A2 HB 9501 - " - 15 QPN1 7E5 HB 9502 - " - QPN1 13E10 HB 9503 - " - QPN1 17G8 HB 9504 - " - P2 57G4 HB 9505 - " - P2 50D8 HB 9506 - ” - 20 QPN1 21G2 HB 9507 - " - QPN1 37G2 HB 9508 - " - QPN1 22F5 HB 9509 - " -
Talletus tehtiin Budapestin sopimuksen vaatimusten mu-. 25 kaisesti, eli niin, että talletusten kestoaika on 30 vuotta talletuspäivästä laskettuna, tai 5 vuotta viimeisestä pyynnöstä, joka on tehty talletuspaikkaan, tai US-patentin voimassaoloajan, joka patentti syntyy tästä hakemuksesta, riippuen siitä, mikä edellä maini-30 tuista on ajallisesti pitempi. Hybridomia täydennetään, mikäli niitä ei ole saatavissa talletuspaikasta.
Tässä viitataan usein hybridomasta P3 6D4 tuotettujen, kasvatettujen tai erittyneiden reseptorien käyttöön.
35 Tulee kuitenkin ymmärtää, että vertailukelpoisia tuloksia voidaan saada ja saatiin myös käyttämällä ·* reseptoreja, jotka oli tuotettu hybridomasta P3 8D2.
• « 75 94026 Tämän keksinnön monoklonaalinen reseptori voidaan myös tuottaa lisäämällä, esim. injektoimalla, hybridoma nisäkkään, kuten hiiren, peritonaaliseen onteloon.
5 Mieluummin käytetään, kuten jo on mainittu, syngeenisiä tai semisyngeenisiä nisäkkäitä, kuten patentissa US-4 361 549. Hybridoman lisääminen aiheuttaa sopivan ajan, esimerkiksi 1-2 viikon, jälkeen vasta-ainetta tuottavien hybridomien muodostusta, ja johtaa suureen 10 tuotettuun reseptorikonsentraatioon, joka reseptori voidaan ottaa talteen verestä ja isäntähiiren vesi-vatsan tulehdusnesteestä. Vaikka isäntähiirillä on myös normaalit reseptorit veressään ja vesivatsassaan, on normaalien reseptorien konsentraatio tyypillisesti vain 15 noin viisi prosenttia monoklonaalisten reseptorien väkevyydestä.
Hybridoman pintakerroksen monoklonaalista reseptoria voidaan käyttää ilman puhdistusta tai reseptori voidaan 20 ottaa talteen hiiren vesivatsasta tai seerumista käyttämällä vakiotekniikkaa, kuten affiniteettikromatogra-fiaa, jossa käytetään immunosorbenttiin, kuten Sepha-rose 6B tai 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), sidottuja AD 169-infektoituja soluja, mitä seuraa 25 eluointi immunosorbentista käyttämällä hapanta puskuria, kuten glysiinihydrokloridia pH:ssa noin 2,5.
Näissä tutkimuksissa IgG-£raktiot saatiin tyypillisesti hiiren vesivatsasta saostamalla 45-prosenttisella kyl-30 lästetyllä ammoniumsulfaattiliuoksella, minkä jälkeen suoritettiin kromatografointi DEAE-Sephacelilla natriu-kloridia eluenttina käyttäen. Fraktio, joka eluoitiin 100 mM suolalla, dialysoitiin ja väkevöitiin. Prote-iinikonsentraatiot määritettiin Lowryn menetelmällä.
35 (J. Biol. Chem., 193, 265 (1951)). Saaduista väkevöi- dyistä liuoksista, jotka sisälsivät eristetyt IgG-ja-: keet, valmistettiin reseptoriperusliuoksia, 20 mg/ml, 76 94026
käyttäen Tris-HCl:ia (50 mM, pH 6,5), reseptoreille, jotka olivat erittyneet hybridomista P3 6D4 tai P3 8D2, ja 4-5 mg/rol, käyttäen 50 mM natriumfosfaattia (pH
8,0), joka sisältää 0,01 M natriumatsidia, resepto-5 reille, jotka ovat erittyneet hybridomista QPN1 7E5, QPN1 12C9, QPN1 13E10, QPN1 17G8, QPN1 21G2, QPN122F5, QPN1 37G23 ja QPN1 44A2.
VI. Entsyymisidonnainen immunosorbenttitesti (ELISA) 10
Ligandien sitoutumista ja kemiallisen muuntamisen vaikutusta testattiin ELISA:lla, missä vasta-aineella oli vakioväkevyys tiitterinsä alueella ja missä reagenssin tai ligandin konsentraatiota vaihdeltiin. Inhibiitio 15 raportoidaan, jos tiitteri vähenee 50 prosenttia, kun reagenssi/haptiini -suhde on pienempi kuin 1000:1.
Testit tehtiin tasapohjaisilla polyvinyylimikrotiitte-rilevyillä (Dynatech, Alexandria, VA). Esimerkinomai-20 sesti syvennykset peitettiin liuoksella, jossa oli BSA:han sitoutunutta yhdistettä 4 antigeeniligandina fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), käyttäen liuosta 50 pl:aa syvennystä kohti. Ligandit peitettiin 1 ugrlla millilitraa kohti. Levyjä inkuboitiin sitten 25 yli yön 37°C:ssa kuivassa uunissa. Kuivattuja levyjä säilytettiin käyttöön saakka 4°C:ssa. Ennen ELISA -testiä kuivatut levyt uudelleenhydratoitiin kahdella 2 minuutin pesulla, jossa oli 10 millimolaarista (mM) PBS:ia, pH 7,4, 0,1 prosenttia polyoksalky-30 leeni(20)sorbitaanimonolauraattia (Tween 20) ja 0,02 prosenttia Thimerosalia (natriumetyylimerkuri-tiosalisylaatti), (Sigma, St. Louis, MO).
Ei-spesifisen sitoutumisen vähentämiseksi hybridoma-35 pintanesteet laimennettiin 1:2 pesupuskurilla, joka sisältää 0,1 prosenttia BSA:ta laimentimena. Sitten jo-kaiseen syvennykseen lisättiin 50 Ml:aa tätä laimennet-
II
π 94026 tua hybridomapintanestettä, ja inkuboitiin yhden tunnin ajan 4°C:ssa kiertoravistimessa monoklonaalista vasta-ainetta sisältävän pintanesteen saattamiseksi yhteen yhdisteen 4 kanssa. Kahden 2 minuutin pesukerran jäl-5 keen jokaiseen syvennykseen lisättiin 50 μΐ 1:1000reen laimennettua peroksidaasimerkittyä vuohen anti-hiiri-IgG + IgMrää (Tago, Burlingame, CA), ja reaktioseosta inkuboitiin 4°C:ssa yhden tunnin ajan merkityn vasta-aineen sitomiseksi sitoutuneeseen monoklonaaliseen 10 vasta-aineeseen.
Substraatti, jolla testattiin sidottu peroksidaasiak-tiivisuus, valmistettiin juuri ennen käyttöä ja se sisälsi 400 pg/ml o-fenyyleenidiamiinia (Sigma, St. Lo-15 uis, MO) 80 mM sitraatti-fosfaattipuskurissa, jonka pH oli 6,0 ja jossa oli 0,12 % H2O2. Kahden viimeisen pesukerran jälkeen lisättiin 50 mikrolitraa substraatti-liuosta jokaiseen syvennykseen, ja värin annettiin kehittyä 15 minuutin ajan pimeässä. Värinkehitys keskey-20 tettiin lisäämällä 25 μΐ 4 molaarista (M) H2SO<:ia jokaiseen syvennykseenpä optinen tiheys mitattiin 492 nanometrissä (nm) Multiskan ELISA levylukijalla. Yhdisteeseen 4 kasvatettujen polyklonaalisten vasta-aineiden todettiin immunoreagoivan (sitoutuvan) analogiligandin 25 kanssa, kuten immunoreagoivat myös yhdisteeseen 13 kasvatetut vasta-aineet analogiligandin kanssa.
VII. Hydrolyyttiset testit ja kineettiset mittaukset 30 Reagenssiligandien, kuten yhdisteiden 5 ja 20, esterei- den katkeaminen määritettiin mittaamalla fluoresenssin lisääntyminen 7-hydroksikumariinin ja 4-metyyli-7-hyd- roksikumariinin muodostuksessa. Perkin-Elmer LS-5 fluoresenssispektrometria käytettiin vakioaallonpituu- 35 della, käyttämällä 355 nanometria (nm) viritykseen ja emissiomittaukseen 455 nm. Kumariiniesterin 5 perusli- *: uos valmistettiin dioksaaniin ja laimenntettiin halut- « 78 94026 tuihin väkevyksiin Tris-HCl:llä (50 mM, pH 7) tai nat-riumfosfaatilla (50 mM, pH 4-9).
5 Reaktiot tehtiin 23°C:ssa ja pantiin käyntiin lisäämällä annos vasta-aineliuosta (1 mg/ml) substraattili-uokseen niin, että lopullinen proteiinikonsentraatio oli 100 nM. Lopulliset fluoresenssiarvot määritettiin hydrolysoimalla substraatti sianmaksaesteraasilla. To-10 dettu reaktionopeus korjattiin spontaanin hydrolyysin suhteen. Reaktiokinetiikkaa tutkittiin mittaamalla lähtönopeudet pseudo-ensimmäisen kertaluvun olosuhteissa. Aktiivinen proteiinikonsentraatio ekstrapoloitiin reaktion lopussa saaduista fluoresenssiarvoista. Kineetti-15 set parametrit saatiin sovittamalla tiedot hyperboliseen käyrään ja kaksoisresiprookkikäyristä. Inhibii-tiovakiot määritettiin Lineweaver-Burk -käyrätiedoista ainakin viidellä inhibiittoriväkevyydellä. Kaikkia tietoja tutkittiin pienimmän neliösumman menetelmällä.
20
Yhdisteiden 14 ja 15 amidien katkeamista testattiin analysoimalla vapaan aminokinaldiinin tai aminonafta-leenin tuotanto diatsotointireagenssilla.
25 Katalyysireaktiot tehtiin valmistamalla reaktioseos, jonka kokonaistilavuus oli 100 μΐ ja joka sisälsi 5 mikroroolaarista (μΜ) monoklonaalista vasta-ainetta, 50-75 μΜ amidireagenssiligandisubstraattia ja seuraavassa kuvattua puskuria. Puskurin sisältö, yllä mainitussa 30 seoksessa, vaihteli käytetystä pH:sta riippuen seuraavasti: pH 5, 10 millimolaarinen (mM) natriumasetaatti, 10 mM natriumkloridi; pH 7,2, 10 mM natriumfosfaatti, 0,15 molaarinen (M) natriumkloridi; pH 8,0, 50 mM natriumfosf aatti . Tässä testissä seulotut amidia sisältä-35 vät substraatit lisättiin yllä olevaan seokseen 1 plrssa 100-kertaisesti väkevöityä dimetyyliformamidin : (DMF) perusliuosta. Monoklonaalinen vasta-aine
II
79 94026 lisättiin yllä olevaan seokseen väkevöidystä pe-rusliuoksesta. Saatu seos laitettiin 96-altaisen tasapohjaisen mikrotiitterilevyn syvennykseen (Coster, Cambridge, MA) ja säilytettiin kosteasssa höyryastiassa 5 23°C:ssa. Aminokinaldiinin tai aminonaftaleenin tuo tanto testattiin sitten alla kuvatulla tavalla 2,3,5 tai 6 päivän päästä.
Katalysoidulla reaktiolla tuotettu aminokuinaldiini-10 tai aminonaftaleenituote mitattiin sekoittamalla ensin 20 μΐ 5 M HC1, 80 μΐ asetonia ja 10 μΐ 0,5% (w/v) natriumnitriittiä rektioseokseen toisen seoksen aikaansaamiseksi, ja pitämällä toista seosta 3 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sitten lisättiin 10 μΐ 15 2,5% (w/v) ammoniumsulfamaattia kolmannen seoksen saamiseksi, jota seosta pidettiin 2 minuuttia huoneen lämpötilassa. Ja vielä 10 μΐ 0,5% (w/v) N-(l-naf-tyyli)etyleenidiamiinidihydrokloridia lisättiin, jotta saataisiin neljäs seos, jota sitten pidettiin 15 mi-20 nuuttia huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen saatu at- soväri neljännessä seoksessa mitattiin absorbanssis-pektroskopialla 540 nanometrissä (nm) aminokinaldiinin suhteen käyttämällä Model EL 309 Automated Microplate Reader (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) (so. auto-25 maattinen mikrolevyn lukija).
Tätä koetta käyttämällä voitiin todeta 10 μΜ:η aminokinaldiinimäärä paljaalla silmällä. Nanomolaariset määrät voitiin todeta automaattisella mikrolevyn luki-30 jalla.
VIII. Proteiinin muuntaminen ja inaktivointi
Vasta-ainevalmisteet inaktivoitiin, lisäämättä fluo-35 resoivia tuotteita, lisäämällä aktivoitua esteriä (yhdiste 8) dioksaanissa IgG-liuokseen (5 mg/ml) Tris-HCl:ssä (50 mM, pH 6,5) suhteessa 5 moolia esteriä (yh- 80 94026 diste 8) moolia IgG:tä kohti. Aktiivisuuden väheneminen vahvistettiin reaktiolla kumariiniesterin (yhdiste 5) kanssa.
5 Proteiinin muuntaminen suoritettiin vastaavalla tavalla, lisäämällä reagenssin tunnetun väkevyistä diok-saaniliuosta vasta-aineeseen. Liuosta inkuboitiin 30 minuuttia ennen suodatusta Sephadex G-25:n läpi. Jäänösaktiivisuutta verrattiin vertailunäytteisiin.
10 IgG-osanäytteet (5mg/ml), jotka oli inaktivoitu esterillä (yhdiste 8), laimennettiin neljällä tilavuudella fosfaattipuskuria (50 mM, pH 4-9, yhden pH-yksikön välein) . Kaikki pH-muutokset kirjattiin, ja näytettä säilytettiin 4°C:ssa 24 tuntia. Aktiivisuus tarkistettiin 15 laimentamalla jokainen näyte 50-kertaisella tilavuudella kumariiniesterin (yhdiste 5) liuosta, joka on 0,2 M fosfaattipuskurissa, pH 7:ssä, ja hydrolyysi-nopeutta verrattiin vertailunäytteisiin.
20 IX· Immunotestillä ja esterolyyttisellä testillä valitut monoklonaaliset vasta-aineet
Vaikkakin polyklonaalisia reseptoreja voidaan käyttää, tässä keksinnössä käytetään mieluummin monoklonaalisia ; 25 reseptoreja. Monoklonaalinen reseptori on tasalaatuisen immunoglobuliinin, jolla on tietty spesifisyys, jatkuva lähde. Ilman monoklonaalisia vasta-aineita tulee vaikeuksia jo siitä syystä, että immuunivaste vaihtelee, jopa saman eläinlajin sisällä, jolloin toistettavien 30 tulosten aikaansaaminen tulee vaikeaksi (C. Milstein,
Science, 231, 1261 (1986)).
Tämän tutkimuksen strategia oli luoda niin paljon ainutlaatuisia klonaalisia erityispiirteitä, kuin mahdol-35 lista annetulla immunointiroenettelyllä, ja alustavasti tehdä niistä valinta immunoreaktiivisuuden suhteen.
Vain ne hybridomasolut, jotka tuottivat vasta-aineita, #· 4
II
81 94026 joilla oli huomattava tiitteri, otettiin huomioon este-rolyyttisessä testissä. Niinpä, tyypillisessä valmistuksessa noin 50-100 klooneja erittävää antihap-tiinivasta-ainetta tunnistettiin aluksi erityisessä 5 fuusiokokeessa, missä käytettiin yhdistettä 4i immunogeenina. Noin kaksi kolmasosaa näistä ei ollut elinvoimaisia viljelmissä. Loput alikloonautuivat ja niiden isotyyppi määritettiin. Hybridomat, jotka aiheuttivat huomattavan tiitteri-IgG:n (suuremman kuin 10 1:64), lisääntyivät vesivatsan kasvaimissa ja tuottivat suuria määriä vasta-ainetta (Niman et ai., Monoklonal Antibodies and T-Cell Products, D. H. Katz, ed. (CRC, Boca Raton, FL, 1982), pp. 23-51).
15 Fluoresenssiesterolyyttisissä testeissä substraatti, joka oli muokattu esterolyyttistä testiä varten, perustui suureen fluoresenssieroon, joka oli 7-hydroksikuma-riinin tai 4-metyyli-7-hydroksikumariinin ja niiden asyloitujen johdannaisten välillä. Kumariiniestereiden 20 hydrolyysissä syntyvä suuri fluoresenssin muutos voidaan helposti havaita nanomolaarisissakin konsentraa-tioissa. Kumariinirenkaan frenolinen luonne tekee mahdolliseksi sovittaa se haptiinin sitoutuvaan kohtaan, missä fenolijohdannaista, kuten yhdistettä 4, käytet-25 tiin immunogeenina, tai missä kaksirenkaista yhdistettä, kuten kinoliinijohdannaista, kuten on yhdiste 13, käytettiin immunogeenina.
Trifluoriasetamidofenyyliasetyyliesteri käyttäytyi vas-30 taavalla tavalla, ja sillä oli fluoresenssi-intensiteetti 455 nm:ssä (viritys 355 nm:ssä), joka oli verrannollinen hydrolyysin määrään. 7-Hydroksikumariinin fluoresenssi-intensiteetti on pH:sta riippuva, ja se kasvaa jyrkästi pH-arvoissa yli 7,0. Kokeen käytännol-35 linen pH-alue on rajoitettu johtuen esteriyhdisteen 5 nopeasta spontaanista hydrolyysistä pH-arvoilla yli :* 8,0. Aluksi esteriä käytettiin konsentraatiossa, joka 82 94026 oli noin neljä kertaa suurempi kuin proteiinin konsent-raatio, ja seosta inkuboitiin pH 7,2:ssa 10 minuuttia. Kaikki tausta-arvon ylittävät fluoresenssimuutokset havaittiin .
5
Yhdessä tutkimuksessa 28 fosfonaatin 2i monoklonaalista antihaptiinivasta-ainetta kahdesta fuusiokokeesta testattiin. Mikään näistä ei ollut reaktiivinen kuma-riiniesterin (yhdiste 5) kanssa fluoresenssikokeessa.
10 Haptiinina toimivan yhdisteen 4i vasta-aineet testattiin samalla tavalla. Kaksitoista gammaglobuliinia seulottiin yllä kuvatulla tavalla. Yhdiste 5 on homologinen vain tämän suuremman haptiinin asyyliosan suhteen; kuitenkin kaikki paitsi kolme näistä reagoivat ristiin 15 pienemmän fosfonaatin 2 kanssa ELISA-testissä, kuten tässä on kuvattu. Kahdella näistä havaittiin fluo-resenssimuutos, joka tapahtui ensimmäisen 5 minuutin inkuboinnin jälkeen, mikä vastaa noin 50 prosenttia täydellisessä hydrolyysissa saatavasta arvosta. Hydro-20 lyysin taustanopeus ilmestyi uudestaan, kun tämä alkuperäinen reaktio oli vaimentunut.
Joten yksinkertainen esteriyhdiste 5 oli ainakin riittävä näiden tapahtumien tunnistamiseen fluoresenssitek-25 nilkkaa käytettäessä. Tämä ei kuitenkaan tarkasti paljasta muiden vaikutusten olemassaoloa, joilla vaikutuksilla voi olla kapeita rakenteellisia erityispiirteitä, joita kumariiniesterit eivät sisällä. Tämä näkökohta havainnollistettiin monoklonaaliselle reseptorille P3 30 6D4 seuraavissa tutkimuksissa.
X. Aktivoitujen estereiden ohjattu transasylointi mono-klonaalisen reseptorin P3 6D4 sitoutuvalla kohdalla » 35
II
S3 94026 A. Proteiinin transasylointi Tämän vasta-aineen välittämän esterolyysin, sisältäen reaktion spesifisyyden ja kinetiikan, luonne on kuvattu 5 yllä. Reaktion stökiömetria ja tuotteiden kemiallinen käyttäytyminen johti hypoteesiin, että muodostuu pysyvä asyloitunut vasta-aine esterin transasyloitumisesta sitoutuvan kohdan nukleofiiliseen ryhmään.
10 7-Hydroksikumariinin vasta-aineella lisätty tuotanto, joka tapahtuu asyloitujen johdannaisten esterolyysilla, on ainutlaatuista trifluoroasetamidofenyyliasetyyliyh-disteelle 5. Tapahtumaa ei havaita kumariiniesterillä, jolla on ilmeisesti pienempi metyyliryhmän vaihtelu, 15 joka korvaa trifluorimetyyliryhmän yhdisteessä 5. Tämä lähtevä ryhmä ei ilmeisesti määrittele reaktiota, koska reaktiivinen N-hydroksisukkinimidiesteri (yhdiste 6) sitoutuu myös spesifisesti vasta-aineiden kanssa aikaansaaden ei-vaikuttavan tuotteen. Reaktion päättymi- 9 20 nen havaitaan siitä, että fluoresenssin kasvunopeus palaa taustatasolle. Fluoresenssin nettomuutos on verrannollinen lisätyn proteiinin määrään. Kun tämä kon-sentraatio saadaan riippumattomasti selville Lowryn kokeesta (Lowry et ai., J. Biol. Chem., 193, 265 (1951)) 25 IgG:n keskimääräiseksi molekyylipainoksi oletetaan 150,000, on reaktion stökiömetria yhdenmukainen yhden moolin esteriä reagoimiselle yhden moolin sitoutuvia kohtia kanssa. Reaktio noudattaa toisen kertaluvun kinetiikkaa ja lähtönopeudessa on havaittavissa entsyy-30 minkaltaista tyydyttymistä.
Alustavien havaintojen mukaan nopeus oli myös pH-riip-puvainen. Lievä nousu pH 8,0:ssa pH 7,0:aan verrattuna viittasi aktiivisen kohdan emäksen tai nukleofiilin 35 ionisoitumiseen. Kun aktiivinen proteiini saatiin ei-aktiivisesta tuotteesta altistamalla se korkeille pH-arvoille tai hydroksyyliamiinille, määriteltiin tämä 9 84 94026 tuote kemiallisesti muunnetuksi proteiiniksi, missä sitoutuvan kohdan spesifinen jäännös asyloituu. Fos-fonaattianalogiligandien (yhdisteet li ja 3i) kyky estää tämä reaktio näkyy niiden inhibiitiovakioista. Kah-5 den inhibiittorin (yhdisteet li ja 3i) inhibiitiova-kioiksi arvioitiin 100 mM ja 35 mM, vastaavasti, sto-kiömetrisella reaktiolla yhdisteen 5 kanssa. Toisaalta, katalyyttisessa reaktiossa, joka on havaittu yhdisteen 7 kanssa, oli näillä yhdisteillä inhibiitiovakiot ki 10 0,80 mikromoolinen (μΜ) ja 0,16 μΜ, vastaavasti.
Lisäksi havaittiin proteiinin inaktivoitumista ty-rosiini- ja histidiini-spesifisillä reagansseilla. Haptiinit pystyvät myös estämään tämän inaktivoitumi-15 sen. Ei ole mahdollista erottaa asyyli-imidatsolin läsnäoloa asyylityrosiinista käsittelemällä transasyloin-tituotetta joko tetranitrometaanilla tai dietyylipyro-karbonaatilla, mitä seuraa deasylointi pH 9,0:ssa. Molemmat reagenssit suojaavat asyloitua proteiinia ei-20 käänteiseltä inaktivoitumiselta. Tämä voi yksinkertaisesti tarkoittaa sitä, että asyyliryhmän kovalenttiset ja ei-kovalenttiset vuorovaikutukset riittävät estämään sekä histidiinin karboetoksyloinnin että tyrosiinin nitrautumisen sitoutuvassa kohdassa.
25
Dipikoliinihappoa sisältävän haptiinin käytön alkuperäinen tarkoitus oli määrittää, voitaisiinko tätä li-gandia pitää immunologisesti metallikelaattina (Reardon et ai,, Nature (London), 316, 265 (1985)). Vaikka yri-30 tyksiä ei tehty metalli-ionin koordinaation saamiseksi haptiini-kantajakonjugaattiin immunogeenina, jäi mahdollisuus, että antihaptiini vasta-aine saattaisi ottaa kelaatin muodon. Niinpä tutkittiin pikoliinihappo- ja sinkkilisäysten vaikutusta vasta-aineilla parannettuun 35 esterolyysiin kumariinireagenssin (yhdiste 5) kanssa.
Mitään vaikutusta primäärireaktioon ei havaittu lisät-j taessa sinkkiä ja pikoliinihappoa aina 100 mikromolaa-
II
85 94026 riseen saakka. Hivenmetalli-ionien mahdollinen mukanaolo suljettiin pois, koska lisätty EDTA ei vaikuttanut reaktioon.
5 Työhypoteesi, joka esitettiin transasylointimekanis- mille, ottaa huomioon histidiinin mukanaolon vaikutukset ja ilmeisesti reagenssiligandin ja vasta-aineen välille poikkeuksellisesti muodostuvan kovalenttisen sidoksen. Koska fosfonaattiesterin perusteella ei oleteta 10 kovalenttista mekanismia, havaittu mekanismi voisi edustaa poikkeamaa odotetusta mekanistisesta reak-tiotiestä, mikä on tulosta aktiivisuustutkimuksiin käytetyn substraatin erityisestä valinnasta. Histidiinin katalyyttinen rooli nukleofiilinä transasyloinnissa 15 viittaisi imidatsolille havaittuun nukleofiili- seen/happo-emäs-katalysoituun kaksijakoisuuteen (Bender et ai., The Bioorganic Chemistry of Enzymatic Catalysis, p. 150, (Wiley, New York, 1984)). Imidatsolille tämän mekanistisen vaihtoehdon määrää transasyloinnissa 20 irtoavan ryhmän emäksisyys. Aktiivisen kohdan yhteydessä, missä imidatsoli on varustettu proteiinin rakenteella, tämä mekanistinen vaihtoehto tulisi ilmi entsyymin kovalenttisena tai ei-kovalenttisena katalyysina. Tämän havainnollistaminen vaati esterisubstraatin 25 muuntamista muuttamaan reaktiossa erottuvan fenolaatin (irtoava ryhmä) emäksisyyttä, silti säilyttäen rakenteellisen yhdenmukaisuuden oikeana sitoutumista vasten.
B. Esteraasiaktiivisuus: transasylointi liuottimeen 30
Analogiligandin (tai haptiinin) esittämä irtoavan ryhmän rakenne on disubstituoitu fenolirengas, missä on lyhentynyt para-substituentti, joka ottaa kytkeytyvän lisäkkeen paikan. Asetamidiryhmää käytettiin korvaamaan 35 tämä sidos vapaissa haptiinianalogiligandi-inhibiitto-reissa (yhdisteet li ja 3i). Analogisessa reagenssili- 86 S4026 gandisubstraatissa olisi 2-pikolinyylikarboksamidome-tyyli-4-asetamidofenoli esterin alkoholiosana.
Ensimmäisessä yrityksessä valmistettiin 4-asetamido-5 fenolin (yhdiste 7) esteri, joka on yhdenmukainen fosfonaatin (yhdiste li) kanssa. Rakenteellisesti merkittävän orto-substituentin poissaolo saattaisi vähentää esterin sitoutumismahdollisuuksia, mutta ei rajusti vaikuttaisi esterisidoksen kemialliseen 10 reaktiivisuuteen. Sitoutumiseroa voidaan arvioida vertaamalla fosfonaattien inhibiitiovakioita (yhdisteet li ja 3i), jotka fosfonaatit eroavat tämän rakenteellisen yksikön suhteen. Kuten kappaleessa X(A) on osoitettu, kahden inhibiittorin (yhdisteet li ja 3i) inhibii-15 tiovakioiksi arvioitiin vastaavasti 100 nM ja 35 nM, stökiömetrisessa reaktiossa yhdisteen 5 kanssa.
Havaitussa katalyyttisessa reaktiossa (yhdiste 7) oli näillä yhdisteillä inhibiitiovakiot vastaavasti ki 0,80 mikromolaarinen ja 0,16 mikromolaarinen. Ehkä yhden 20 kertaluokan sitoutumismyötävaikutus johtuu tästä rakenteesta.
Koska näiden estereiden ja niiden hydrolyysituotteiden välillä ei ole spektroskooppisia eroja, suositeltiin 25 prosessin analysointia kromatografisesti. Kuvaan 3 vii-täten, analysoitiin seos, jossa oli yhdistettä 7 (5 μΜ) ja monoklonaalista vasta-ainetta hybridomasta P3 6D4 (0,1 μΜ) fosfaattipuskurissa (50 mM, pH 8,0) nestekro-matografisesti (HPLC) ajan funktiona. Esterin kiihtynyt 30 hydrolyysi oli ilmeinen sen pienentyneen piikin perusteella kahden uuden piikin samanaikaisesti kasvaessa, jotka uudet piikit vastaavat odotettuja tuotteita.
Näissä olosuhteissa esteri kuluu täydellisesti 60-80 minuutissa, minä aikana taustanopeudet vastaavat noin 35 12-16 prosentin hydrolyysiä. Kromatografinen profiili on sama kuin mikä saadaan käsiteltäessä sianmaksaes-teraasilla. Ei-spesifiset vasta-aineet tai anti-hap-
II
87 94026 tiinivasta-aineet, jotka olivat epäreaktiivisia stö-kiömetrisessä reaktiossa kumariiniesterin kanssa (yhdiste 5), eivät osoita tätä kykyä.
5 Tiukka reagenssiligandisubstraattispesifisyys havaitaan siitä, että kiihtynyttä hydrolyysia ei voida havaita aryyliestereillä, joiden aromaattisissa renkaissa on erilaisia substituenttimuunnelmia. Viitaten taulukkoon 1., reseptori hydrolysoi sukkinyloidun esterin (yhdiste 10 8) hiukan hitaammin kuin vastaavan asetamidin (yhdiste 7). Tämä nopeusero nähdään muös sianmaksaesteraasilla.
Se voi kuvata epäsuotuisia elektrostaattisia ominai-kuuksia varautuneessa sukkinaatissa, joka on vuorovaikutuksessa proteiinin kanssa, tai hydrofiilisen ligan-15 din epäedullista sitoutumista hydrofobisen vasta-aineen sitovaan kohtaan. Samanlaisia estereitä, jotka eivät ole hyväksyttäviä substraatteina, on yhdiste 9, mikä osoittaa trifluorimetyyliryhmän absoluuttisen vaatimuksen, mikä havaittiin myös stökiömetrisessa reaktiossa.
20
Taulukko l1 ti/2 (min) k« i - k · t c : 25 yhdiste vasta- (P3 6D4) este- (xlOBs_1) aine raasi) 7 16 4 2,8 8 60 52 3,8 9 a 4 0,25 30 10 a 2to 1,63 11 a 5 6,10
Karboksyyliestereiden hydrolyysi monoklonaalisella vasta-aineella (hybridomasta P3 6D4) ja sianmaksaeste-35 raasilla (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EC
3.1.1.1); hydrolyysi määritettiin HPLC:llä analyyttisessa RP-C18 -kolonnissa (Vydac 218TP54) isokraattista 8δ 94026 eluutiota käyttäen (asetonitriili: vesi + 0,1 % tri-fluorietikkahappoa; (35:65)) virtausnopeudella 1,0 ml/min ja ilmaisimen aallonpituudella 245 nm. Substraatin alkukonsentraatio oli 5 mikromolaarinen ja 5 sisäinen standardi oli 10 mikromolaarinen (asetofenoni) 50 mM fosfaattipuskurissa ja pH:ssa 8,0. Retentioajat olivat seuraavat (minuutteja): asetofenoni 5,0; yhdiste 7 8,3; yhdiste 8 6,7; yhdiste 9 4,1; yhdiste 10 11,1 (40-prosenttinen asetonitriilieluointi); yhdiste 11 10 8,2. Vasta-aineen väkevyys oli 15 mikrogrammaa/ml (0,1 mikromolaarinen) ja esteraasin 5,5 gg/ml. Reaktio-seoksia pidettiin 25°C:ssa ja osanäytteet analysoitiin 2-20 min välein. Kolmesta tai useammasta määrityksestä saaduista pisteestä tehtiin käyrä, josta 15 arvioitiin rektion puoliintumisaika (ks. kuva 3).
esteri ei kulunut nopeammin kuin mikä oli hydrolyysin taustanopeus b reaktio on liian nopea tarkasti HPLC:llä mitattavaksi 20 c nopeusvakiot määritettiin spektrofotometrisesti (245 nm:ssä) mittaamalla viiden esteriväkevyyden alkunopeudet .
Fenolin asetamidoryhmän antama spesifisyys on huomatta-. 25 vampi. Fenyyliesterin (yhdiste 10) reaktiivisuus on suunnilleen sama kuin 4-asetamidofenyyliesterin (yhdiste 7), ja se sopii paremmin yhteen haptiinirakenteen kanssa kuin kumariiniesteri (yhdiste 5). Tässäkään tapauksessa reseptorilla ei ollut vaikutusta hydrolyytti-30 seen nopeuteen. Esteri (yhdiste 11), missä yhdisteen 7 trifluoriasetyyli- ja asetyyliryhmät ovat vaihtuneet keskenään, antaa erinomaisen mahdollisuuden este-risidoksen kääntyneeseen suuntautumiseen sitoutumiskohdassa, jos fenoli- ja bentsyyliosat ovat riittävän sa-35 manlaisia salliakseen tällaisen vaihtumisen.
|j 89 94026
Siitä huolimatta tämän esterin nopeutunut hydrolyysi ei vahvista tätä mahdollisuutta. Toisaalta kaikkien näiden estereiden hydrolyysi nopeutuu sianmaksan umpimähkään valitulla esteraasilla. Kemiallinen selektiivisyys on 5 katalyyttisen vasta-aineen tunnusomainen ominaisuus, ja sitä voidaan pitää immunologisen tunnistuksen erinomaisen sidosspesifisyyden heijastumana.
Yhdisteen 8 valmistaminen oli suositeltavaa sen osoit-10 tamiseksi, että yhdisteellä 7 todettu kyllästyrnisnopeus ei johtunut sen rajoitetusta liukoisuudesta puskuroituihin vesiliuoksiin. Sukkinyloitu esteri (yhdiste 8) on 100 mikromolaarisiin konsentraatioihin saakka helposti liukoinen fosfaattipuskureihin (50 mM, pH 8,0), 15 kun taas yhdisteen 7 liuokset tulevat hieman sameiksi 15 mikromolaarista väkevyyttä suuremmissa konsentraa-tioissa.
Reaktiokineettiset mittaukset tehtiin spektrofotometri-20 sesti seuraamalla absorptiomuutosta 245 nm:ssä. Pseudo- 1. kertaluvun nopeus osoittaa entsyyminkaltaista kyllästymistä, ja kuvan 4 mukaisesti, fosfonaatti-analogiligandit käyttätyivät kilpailevina inhibiittoreina Lineweaver-Burk -analyyseissa. Näillä substraa-25 teillä saadut kineettiset parametrit ovat taulukossa 2 samoin kuin fosfonaatilla saadut inhibiitiovakiot (yhdiste 3). Näissä olosuhteissa taustanopeuden ylittävä kiihtynyt nopeus oli yhdisteellä 7 noin 960-kertainen ja yhdisteellä 8 noin 200-kertainen 30 (korjattuna taustahydrolyysinopeuden suhteen).
35 « 90 94026
Taulukko 21
Yhdiste Ka Kl Va a x kk a t kk a t /ke 1 - k a t (xlO6 M) (xlO7 M) (xlO9 Ms-1) (xlO2 S" 1 ) 5 7 1,90 1,60 2,2 2,7 960 8 0,62 0,65 1,0 0,8 210
1 Taulukon 2 kineettiset parametrit ovat esterihydro-10 lyyseille (yhdisteet 7 ja 8) monoklonaalisella vasta-aineella P3 6D4. Perkin-Elmer lambda 4B -spektrofoto-metria, joka oli varustettu termostoidulla kyvettiteli-neellä, käytettiin absorptiomuutosten mittaamiseen 245 nm:ssä. Kyvetit, joissa oli substraattia 0,5-5 mikro-15 molaarisina väkevyyksinä fosfaattipuskurissa (50 mM, pH
8,0), tasapainotettiin 25°C:ssa. Aktiivisen IgG:n väkevyys perusliuoksessa saatiin selville reaktiolla kuma-riiniesterin (yhdiste 5) kanssa ja mittaamalla hydrok-sikumariinin saanto fluoresenssilla. Kineettinen ajo 20 aloitettiin lisäämällä sellainen annos vasta-aineperus-liuosta (50 mM fosfaattipuskurissa , pH 8,0), jonka oli laskettu antavan 100 nM IgG-liuoksen. Seoksen annettiin tasapainottua 2-3 minuuttiea ja nopeus mitattiin seu-raavan 10 minuutin aikana. Täydellisen hydrolyysin ab-25 sorptiomuutos määritettiin esteraasikäsittelyllä. Ki- neettiset parametrit saatiin Lineweaver-Burk -käyriltä (katso kuva 4). Inhibiitiovakiot määritettiin kulmaker-toimista muodostetusta käyrästä käyttämällä ainakin neljää yhdisteen 3 inhibiittoriväkevyyttä. Tulokset 30 analysoitiin lineaarisella regressiolla.
pH-Arvot, joissa mittaukset tehtiin, eivät mitä todennäköisimmin olleet optimaalisia. Alustavien havaintojen mukaan reaktio on herkempi pH:lie kuin aiemmin mainittu 35 transasylointi kumariiniesterillä. Katalyyttista reak tiota tuskin havaitaan pH 7:ssä. Lisäkineettisillä tutkimuksilla voitaneen määritellä näillä substraateilla li 91 94026 saatu todellinen nopeuden kiihtyminen. Suurempi nopeusero on odotettavissa esterille, joka sisältää pi-kolinyyliryhmän käsittävän haptiinin kaikki epitoopit.
5 Lisättäessä pikoliinihappoa tai pikoliinihappoa ja sinkkikloridia esterin, yhdiste 7, ja vasta-aineen reaktioseokseen, ei havaittu vaikutusta nopeuteen. Tämä viittaa, vaikkakaan ei lopullisesti osoita, että sitoutuva kohta ei samanaikaisesti voi ottaa haptiiniraken-10 teen kahta osasta. Tämä tilanne olisi äärimmäisen tärkeää tunnistaa, sillä se viittaa siihen, että entsyymit pystyvät sitomaan enemmän kuin yhden substraatin tai substraatin ja kofaktorin samanaikaisesti. Tässä tilanteessa lienee kysymys sellaisesta vuorovaikutuksesta, 15 missä vesimolekyyli täydentää esteriä sitoutumiskohdan täyttämisessä.
C. Nukleofiilinen vastaan yleinen emäsmekanismi ja katalyysi 20
Viitteet siitä, että histidiini on kriittinen estero-lyyttisten vasta-aineiden toiminnalle, antoivat trans-asyloinnin mekanismiin liittyvän ensimmäisen vihjeen. Imidatsolin nukleofiilinen luonne on hyvin tunnettu. Ei 25 kuitenkaan ole todisteita siitä, että entsyymit käyttävät histidiinin imidatsoliryhmää nukleofiiliseen katalyysiin. Toisaalta histidiinin imidatsoliryhmän toimintatapa yleisessä happo-emäskatalyysissa on entsyymime-kanismien yhteydessä laajalti hyväksytty. (C. Walsh, 30 Enzymatic Reaction Mechanisms, s. 43, (Freeman, San Francisco, 1979)).
Imidatsolin kaksinaisrooli sekä nukleofiilisenä että happo-emäskatalyyttina ymmärretään esterihydrolyysiroe-35 kanismeista. Siirtyminen näiden mekanismien välillä määritetään kahden mahdollisen tetraedrisen välituotteen kautta muodostuvien tuotteiden suhteellisista muo- 92 94026 t dostumisnopeuksista: sen, joka syntyy, kun imidatsoli liittyy asyyliryhmään verrattuna siihen, joka syntyy hydroksidin liittymisestä. Suhteellisen labiili 7-hyd-roksikumariiniesteri muodostaa imidatsoliadditioyhdis-5 teen, joka hajoaa helposti asyyli-imidatsolivälituot-teeksi kumariinialkoksidin irrotessa. Tämä vaihe vaikeutuu huonompien irtoavien ryhmien kyseessäollen, koska ne muodostavat vähemmän pysyviä alkoksideja. 8-Hyd-roksikumariini (pKa 8,3) on selvästi parempi irtoava 10 ryhmä kuin 4-asetamidofenoli (pK* 9,9). 4-Asetamido- fenyyliesteriyhdiste 5 voi siksi muodostaa tetraedrisen additioyhdisteen veden tai hydroksidin kanssa ja jonka hajoaminen on luultavasti katalysoitu (ks. kuva 5).
15 Erilaisten mekanismien olemassaolon todisteeksi määritettiin, että reaktiotuote, joka syntyy, kun vasta-aineen sitova kohta reagoi yhdisteen 5 kanssa, ei ole katalyyttisen reaktion, joka tapahtuu yhdisteen 7 kanssa, välituote. Yhdiste 5 toimii todellakin katalyytin spe-20 sifisenä inaktivoijana lisättäessä sitä reseptorin ja yhdisteen 7 seokseen. Nämä kaksi esteriä eroavat suurella tarkkuudella, kun reseptorin on todettu kääntyvän useasatakertaisesti substraattiyhdisteen 7 puoleen ilman havaittua inaktivoitumista. Katalyysi, jonka resep-25 tori aikaansaa molempien mekanismien kautta, merkitsee « sitä, että sitoutumisvuorovaikutukset voivat stabiloida kumpaa tahansa transitiotilaa näissä kaksivaiheisissa prosesseissa. Suunnittelutarkoituksia varten yleinen emäsprosessi on kuitenkin asiaankuuluva, milloin toinen 30 vaihe (hajoaminen tuotteiksi) on nopeutta määräävä.
Sitoutumisen myötävaikutusta katalyysiin tämän yleisen eroäsmekanismin välityksellä kuvaa parhaiten 4-asetamidof enyyliesterin (yhdiste 7) ja yksinkertaisen fenyy-35 liesterin (yhdiste 10) erilainen käyttäytyminen. Fenoli on irtoavana ryhmänä (pKa 9,89) yhtenevä 4-asetamido-fenolin kanssa, vaikkakaan reseptori P3 6D4 ei kata- 93 94026 lysoi yhdisteen 10 hydrolyysia. Myöskään stökiömetrinen reaktio ei ole todennäköinen, vaikka yhdisteellä 10 on oikea rakenne asyyliryhmää varten.
5 Niinpä, vaikka tämä ligandi voi sitoutua proteiiniin, vuorovaikutus ei ole sopiva kuvaamaan luontaista este-raasireaktiota. Yhdisteen 7 asetamidiryhmään sitoutumisen vaikutus riittää stabiloimaan nopeutta määräävän transitiotilan tai vaihtoehtoisesti destabiloi tähän 10 transitiotilaan liittyvän tetraedrisen välituotteen.
Substraatin rakenteen edelleenkehittely, kuten pikoli-naattisubstiuentin lisäyksessä, paljastaa lopullisesti sitoutumisvuorovaikutusten määrän katalyysissa. Tämän 15 järjestelmän haittana on, että alhaiset log Kn-arvot voivat loppujen lopuksi peittää alleen myötävaikutuksen, minkä lisäsitoutumisvuorovaikutukset aiheuttavat katalyysille. Transitiotilan täydentävyyskriteeri takaa, että kk·t/Km-arvolla on taipumus maksimoitua, kun 20 taas annetulla kk at/Km-arvolla nopeuden (kkat) maksimointi riippuu substraatin huonosta sitoutumisesta (suuri Km) (A. Fersht, Enzyme Structure and Mechanism, 2nd ed., ss. 311-346, (Freeman, San Francisco, 1985)}.
25 XI. Kahdeksan lisämonoklonaalisen reseptorin ohjaamat « transasyloinnit A. Reaktiivisuus reagenssiligandien kanssa
Kahdeksalla monoklonaalisella reseptorilla 21G2, 7E5, 30 37G2, 13E10, 12C9, 44A2, 17G8 ja 22F5, on joukko kata lyyttisia toimintoja. Nämä ilmenevät sekä niiden rea-genssiligandisubstraattien suhteen, joiden hydrolyysia ne katalysoivat, että niiden hydrolyysinopeuksien suhteen, jotka on havaittu verrattuna näiden reagenssi-35 ligandisubstraattien spontaaneihin taustahydrolyysi-nopeuksiin. Alustavat, suhteelliset reaktiivisuudet kymmenelle substraatille ovat taulukossa 3 alla.
94 94026 m o Γ? vo I o co co vr
^ | | | ·Η ir .H | ·« < I tN
CO
o ^ ir. e- o- c kl m
" I I | iH z 02 I n iH I CN
4->
•H
U ™ O tn m m r- *9·
ti | I I I—I VX5 cc I Π rj- I (M
04 ^ Q) tn ω ί-ι σ» ® in in vo vd h m
| i i m in in i ^-i rH ! »H
(1) «H
m
H
' ·—I O
, π5 tH m m c\ vd m
2 “ i i i n n vc i ι-t ^ i »H
j (0 C en 'm ‘n O Ή
2 ® -I
S Ό *
2 C O
n® G c\ O m cr m tn ® Oi O O i | | m U5 σ'. | ro ,h | Tr S -rt S t" W t-4 ΓΟ 0) .*j u w UI (0 w _, G en in o cx> in 03 i σι ω I I i m m t"- i ·—i lis i «H m 3 (0 * * ^ ,«•0 O O O m VO m <Π £ , , , _ r- I m *Γ I r-1 Ä 3 *
g -H
n ^ « 2 « g K O rr ^ 'T in in
4J Π „0* III ro I r-l I
•H ° W
£ * • ? Ul • J7 m mm 7? -H m m in r O Tr -q· · · ,3·ο to I I I nj rsj no I o o I m * K « eo
. VO
D> ttI mi vol r~| r-| co en| o| in| r-c| ml
•H rH j r—11 ·Η [ rH I t—I | i—I I—i J m I m I CN I
N >J
4-) 0
H
4-) * oooino oo
(0 Ö) III·—I ·—I *H rH m iH r—I
tO -H
^4 J
4-) c O) vt tn c ω O ai iiirHr-injmmrHtnin : u:
II
95 94026 1 Alustavat, ensimmäiset hydrolyysit prosentteina sekoitetun reagenssiligandin kulutuksesta katalysoiduissa ja spontaaneissa hydrolyyseissa. " - " = ei havaittua -5 hydrolyysia. Kaikki reaktiot tehtiin pH 8,0:ssa ja 50 mM fosfaattipuskurissa, ellei toisin mainita. Hydro-lyyttiset prosenttiosuudet määritettiin HPLC:llä käyttäen Hitachin mallin 655A-12-nestekromatografia ja Vydacin C18-201TP54-kolonnia allamainituin poikkeuksin. 10 Eluenttina käytettiin asetonitriilin ja veden seoksia (28:72 - 50:50 (v/v)), jotka sisälsivät 0,1 prosenttia trifluorietikkahappoa. Yhdisteiden 5 ja 20 hydrolyysit testattiin fluoresenssitiedoista.
15 2 Reseptorimolekyylien (Res.) ja reagenssiligandien (Lig.) konsentraatiot yksiköissä mikromoolia (mM) olettaen, että jokaisen reseptorimolekyylin molekyylipaino oli 150 000 daltonia.
20 3 Substraattina käytetty reagenssiligandi (Lig.) 4 Aika, tunteina, jonka reaktion annettiin tapahtua 9 Spontaanit hydrolyysiprosenttiosuudet ilmoitetun .' 25 reaktioajan kuluttua 6 Reaktio tehtiin pH 7,2:ssa 50 mM fosfaattipuskurissa.
Katalysoidun hydrolyyttisen reaktiivisuuden ja subst-30 raatteina käytettyjen reagenssiligandien rakenteiden korrelaatio paljastaa useita piirteitä.
Ensinnä, jokainen kahdeksasta monoklonaalisesta reseptorista muuntui ja katalysoi suuremman kuin stökiömet-35 risen määrän (verrattuna reseptorikonsentraatioon) reagenssiligandia hydrolyysia, sekä yllämainituissa .: että muissa tutkimuksissa. Niinpä minkään näistä kah- 94026 96 deksasta reseptorimolekyylistä kanssa ei muodostunut stabiilia välituotetta, jolla olisi ollut analoginen sen tuotteen kanssa, joka muodostuu, kun yhdiste 5 reagoi reseptorin 3P 6D4 kanssa, riippumatta 5 esterireagenssiligandin alkoholiosan pKa-arvosta.
Toiseksi, esterireagenssiligandin kaksirenkainen alko-holiosa oli edullisempi kuin yksirenkainen, sillä kaikki reseptorit katalysoivat yhdisteiden 17 ja 5 hyd-10 rolyysia, joissa yhdisteissä oli alfanaftoksi- ja ku-mirinoksiesterit, kun taas viisi kahdeksasta ja ei yksikään reseptoreista katalysoi vastaavasti yhdisteiden 22 ja 19 hydrolyysia, joissa yhdisteissä oli fenoksi-ja metoksiesterit.
15
Kolmanneksi, fenyylirengas, joka on sitoutunut happiatomiin, joka puolestaan on sitoutunut keskusatomiin, so. reagenssiligandien karbonyylihiileen, näyttää olevan vallitseva tunnistettu epitooppi, sillä kaikki re-20 septorit 12C9:ää lukuunottamatta katalysoivat yhdisteen hydrolyysia, missä yhdisteessä oli vety renkaan tilalla esterin happo-osassa, ja viisi kahdeksasta reseptorista katalysoi fenoksiesterin, yhdiste 22, hydrolyysia. Vain nämä samat viisi reseptoria katalysoivat myös 4-metyy-25 likumarinoksiesterin, yhdiste 20, hydrolyysia.
Neljänneksi, yksikään reseptoreista ei katalysoinut kummankaan amidin, yhdisteet 14 ja 15, hydrolyysia.
Reaktiivisuuden puuttumista ei tunneta, sitä tutkitaan.
30
Viidenneksi, reagenssiligandisubstraatit, joilla on typpiatomi gamma-asemassa esterireagenssiligandien al-koholiosien happiatomiin nähden, eivät reagoineet, so. yhdisteet 16 ja 22. Tämä oli yllättävää ottaen huomioon 35 sen erinomaisen reaktiivisuuden, mikä esiintyi isora- kenteisella kumarinoksiesterillä ja samalla tavalla ra-kentuneella alfa-naftalenoksiesterillä. Syytä siihen, li 97 94026 miksi reagenssiligandisubstraatit, joiden typpiatomi on gamma-asemassa alkoholiosan happiatomiin nähden, eivät katalyyttisesti hydrolysoidu, on tuntematon. Yksi mahdollisuus on, että reagenssiligandin typpiatomi (yh-5 diste 16 tai analogiligandi, tässä yhdiste 13) oli positiivisesti varautunut käytetyissä pH-arvoissa ja että reseptorimolekyylin sitoutuvan kohdan aminohappojäännös on asettunut stabiloimaan sitä. Tämä mekanismi ei kuitenkaan ottaisi huomioon sitä, että yhdisteen 21 hydro-10 lyysia ei tapahdu, missä yhdisteessä gammatyyppi on osa amidia, eikä stabiloinnin, joka tapahtuu varattuun typ-piatomiin, pitäisi vaikuttaa siihen.
Toinen mahdollisuus, joka selittäisi yhdisteiden 16 ja 15 21 reaktiivisuuden, on, että gamma-typen vapaa elekt- ronipari stabiloituu reseptorimolekyylin sitoutuvan kohdan aminohappojäänteen vaikutuksesta, jollaisia ovat mm. asparagiini- tai glutaamihappojen karboksyyliryh-mät, histidiinijäänteen imidatsoli tai kysteiinin mer-20 kaptaani. Kun gamma-typpi on läsnä, stabiloivalla ryhmällä on taipumus inhiboida hydrolyysia, kun taas gamma-typen poissaollessa aiempi stabiloiva ryhmä voi edesauttaa hydrolyyttista reaktiota. Avustus entsyymi-katalysoiduissa hydrolyyttisissa reaktioissa tunnetaan ; 25 hyvin karboksyyli-, imidatsoli- ja merkaptaaniryhmille.
« B. Kineettiset tutkimukset
Reaktiokinetiikkaa tutkittiin käyttämällä kolmea 30 reagenssiligandia substraatteina monoklonaaliselle reseptoreille 37G2 ja 22F5. Alkunopeuksista saadut tiedot olivat yhdenmukaisia Michaelis-Mentenin reaktiomekanismin kanssa tavallisille entsyymi-substraattisystee-meille. Lähtönopeuksia seurattiin yhdisteelle 17 käyt-35 tämällä UV-spektrofotometria aallonpituudella 271 nm ja yhdisteille 5 ja 20 fluoresenssispektrometria ja viri- 98 94026 tysaallonpituutta 355 nm ja emissioaallonpituutta 455 nm.
Lineweaver-Burke -käyrät valmistettiin yhdisteiden 17, 5 5 ja 20 katalysoiduille hydrolyyseille, jotka saatiin sekä inhibiittorina toimivan yhdisteen 12i läsnä- että poissaollessa, kuten on kuvattu kuvaa 4 varten. Erityisesti yhdistettä 17 oli konsentraatioissa 2 - 16 μΜ in-hibiittorikonsentraatioiden ollessa 100 ja 300-nanomo-10 laarisia (nM). Yhdisteen 5 konsentraatiot olivat 1-10 μΜ ja inhibiittoriväkevyydet 100 ja 200 nM. Yhdiste 20 esiintyi konsentraatioissa 2 - 20 μΜ ja inhibiittoriväkevyydet olivat 25 ja 100 nM. Näistä käyristä saadut kuneettiset parametrit ovat taulukossa 4 alla.
15
Taulukko 41
Km Ki V· · x Kk et Kel-kat (xlO6 M) (xlO7 M) (xlO9 Ms-1) (s-1) (xlO6 s-1 ) 20
Monoklonaalinen respetori 3302 ja yhdiste 17 15 1,4 0,77 0,0016 9,29
Monoklonaalinen respetori 22F5 ja yhdiste 20 25 5 0,7 4,5 0,023 19,3
Monoklonaalinen respetori 22F5 ja yhdiste 5 1,4 1,1 1,52 0,0022 42,6 30 1 Fluoresenssikokeet yhdisteillä 20 ja 5 tehtiin
Perkin-Elmerin fluoresenssispektrometrilla (malli LS-5; Oakbrook, IL) 200 nM reseptorikonsentraatiolla (olettaen molekyylipainoksi 150 000 daltonia) 50 mM fosfaattipuskurissa pH 8,0:ssa. Reagenssiligandi 35 liuotettiin dioksaaniin ja sekoitettiin yllämainittuina määrinä. Reaktioliuosta käytettiin 2 ml, kun dioksaani-konsentraatio oli 2 til-%. Testeissä yhdisteellä 17 ii 99 94026 reagenssiligandina käytettiin 500 nM:sta reseptoria (perustuen molekyylipainoon 150 000 daltonia) yllämainitussa puskurissa, ja dioksaaniin liuotettua reagenssiligandia sekä dioksaanin kokonaisväkevyyttä 2 5 til-%.
Kuten taulukosta 4 voidaan nähdä, olivat näistä tutkimuksista saadut kineettiset parametrit yleensä samanlaisia kuin taulukossa 2 olevat. Kiinnostavaa oli kui-10 tenkin, että reseptorilla P3 6D4 havaittua lähtevän ryhmän vaikutusta ei todettu kummallakaan taulukon 4 reseptorilla. Niinpä reseptori P3 6D4 näytti muodostavan suhteellisen stabiilin N-asyylihistidiinin 7-hyd-roksikumariiniesterin (pKa kumariinilla noin 8,3) 15 kanssa mahdollisesti hydrolyyttisen katkeamisen nukleo-fiilisella mekanismilla, siinä missä tämä reseptori näytti katalysoivan hydrolyyttista katkeamista esterin yleisellä emäsmekanismilla, jonka esterin irtoavalla ryhmällä (p-asetamidofenoli) oli korkeampi pK*-arvo 20 (noin 9,9). Tässä tapauksessa ei muodostunut suhteellisen pysyvää välituotetta, ja jokainen kolmesta katalyyttisesta hydrolyysista näytti etenevän paremminkin transitiotilan kuin välituotteen muodostuksen kautta. Lisäksi reagenssiligandeilla, joilla oli lähtevän ryh-: 25 män alkoholiosa, alfa-naftoli ja kumariinijohdannaiset, joiden pKa-arvot olivat noin 9,3 ja 8,3, oli samanlaiset Kk at-arvot jokaisen tutkitun monoklonaalisen reseptorin kanssa. Yhdisteillä 17 ja 5, joita käytettiin reagenssiligandien monoklonaalisten reseptorien 37G2 ja 30 22F5 kanssa, havaitut katalysoidusta reaktiosta joh tuvat erot nopeutumisessa olivat pääasiassa spontaanin, katalysoimattoman nopeuden funktioita, mikä nopeus oli tekijän neljä verran suurempi esterille, jonka alkoholilla on alempi pKa-arvo.
35 XII. Arviointia loo 94Q26
Nimitystä trasitiotila-analogi käytetään entsyymitutkimuksessa varovasti, koska niin katalyyttiset mekanismit 5 kuin entsyymien vuorovaikutuskaan näiden ligandien kanssa ei ole useimmissa tapauksissa täysin selvä. Yksityiskohtainen selvitys edeltää usein lopullista päätöstä tällaisen nimityksen käyttöönotosta (Bartlett et ai., Biochemistry, 22, 4618 (1983) ja Imperali et ai., 10 Biochemistry, 2.5, 3760 (1986)).
Kuten tässä on kuvattu, fosfonaattirakenne on määritelmän mukaan ansainnut tämän identiteetin, koska siihen liittyvä kemiallinen reaktiomekanismi tunnetaan.
15 Täsmentämällä odotetun toiminnon immunologisessa resep torissa se täyttää tarkkoituksensa ja antaa vakuuttavan todisteen teoreettisesti johdetusta periaatteesta, joka koskee entsyymitransitiotilan täydennettävyyttä. Tämä kyky on ainutlaatuinen ja riippumaton entsyymikata-20 lyysin fysiologisista alkuperistä. Tällä on erityistä merkitystä, koska "entsyymin kaltaisen" katalyysin tutkimus ei välttämättä edistä sitä erillistä kemian aluetta, jota luonnolliset entsyymit vahvistavat. Minkä tahansa reaktion katalyysiin, mille reaktiolle voidaan 25 esittää luotettava mekanismi, voidaan kiinnittää huomiota.
Entsyymisysteemien jatkotutkimusten suunta ja kohdistaminen ei riipu olemassaolevien entsyymien täydellisestä 30 ymmärtämisestä. Luonnollisilla entsyymeillä tehtävää työtä on kuitenkin pidettävä katalyysin paradigmana. Entsyymimekanismien tutkimuksesta saatavalla hyödyllisellä informaatiolla voi olla merkitystä keinotekoisen katalyysin malleille. Alkukantaisessa muodossaan ent-35 syymit eivät ole muuta kuin erikoistuneita proteiinimo-lekyylejä, kuten ovat ainutlaatuisen spesifisyyden omaavat monoklonaaliset vasta-aineetkin. Proteiinilla lnl 94026 yksinomaan ei voida kuvata kaikkea elävien prosessien kemiaa. Siksi proteiinit ovat kehittyneet tuomaan esiin solunulkopuolisia aineosia, jotka proteiineihin yhdistyneinä muodostavat entsyymitoimintojen laajan kirjon.
5 Entsyymeillä, jotka pyrkivät pääsemään tähän kemiallisten reaktioiden sarjaan, on oltava kofaktoreita. Yritykset sisällyttää metallikelatoituminen trasitioti-lan sitoutumiseen, on yksi esimerkki tällaisesta kaaviosta. Luonnosta löydetyt kofaktorit ovat oletetta-10 vasti arvokkaita malleja määriteltäessä systeemejä, joissa immunologisella sitoutumisella voi olla merkitystä esim. hapettavan, elektroninsiirto- tai hydridin-siirtotoiminnan katalysoinnille.
15 Tekniikat, joilla saadaan haluttuja erityisominaisuuksia sisältäviä vasta-aineita, ovat johtaneet lääketieteessä ja biologiassa laajaan sovellutusten joukkoon. Nämä kaikki käyttävät antigeenitunnistuksen yleistä toimintaa jollain kytketyllä tavalla muiden 20 toimintojen tai ominaisuuksien liittämiseksi vasta- aine-antigeenikompleksiin. Yksinkertaisen sitoutumis-vuorovaikutuksen on ajateltu olevan vasta-aineiden muuttumaton ominaisuus.
: 25 Näissä tutkimuksissa kemiallisten mekanismien tunte- musta on käytetty valjastamaan vasta-aine-anti-geenisitoutumisen potentiaalienergia uuden, kineettisen toiminnan toteuttamiseen. Tämän perustutkimuksen onnistumisen pitäisi rohkaista tämän mekanistisen malli so-30 veltamista mielenkiintoisempien ja ehkä hyödyllisten proteiinien esiinsaamiseen immuunijärjestelmästä. Kyky siirtää hydrolyyttista aktiivisuutta vasta-aineille, joilla on ennalta määrätty spesifisyys, antaa olettaa, että paikkaspesifisiä reagensseja tai katalyytteja voi-35 daan luoda toiveiden mukaan. Tämän näkymän perustavaa laatua olevan mielenkiinnon lisäksi sillä voi olla valtava käytännön hyöty proteiinikemialle.
ί 102 94026
Edeltävän tekstin on tarkoitus havainnollistaa, vaan ei rajoittaa kyseessä olevaa keksintöä. Lukuisia muunnelmia voidaan luoda poikkeamatta keksinnön todellisesta 5 hengestä ja aihepiiristä.
ϋ
FI874047A 1986-09-17 1987-09-16 Monoklonaalisia vasta-ainemolekyylejä, joilla on katalyyttisiä ominaisuuksia omaavia vasta-aineen sitovia kohtia FI94026C (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US90831386A 1986-09-17 1986-09-17
US90831386 1986-09-17
US07/086,896 US5030717A (en) 1986-09-17 1987-08-18 Antibodies which catalyze hydrolysis of ester bonds
US8689687 1987-08-18

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI874047A0 FI874047A0 (fi) 1987-09-16
FI874047A FI874047A (fi) 1988-03-18
FI94026B true FI94026B (fi) 1995-03-31
FI94026C FI94026C (fi) 1995-07-10

Family

ID=26775276

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI874047A FI94026C (fi) 1986-09-17 1987-09-16 Monoklonaalisia vasta-ainemolekyylejä, joilla on katalyyttisiä ominaisuuksia omaavia vasta-aineen sitovia kohtia

Country Status (13)

Country Link
US (1) US5030717A (fi)
EP (1) EP0260939B1 (fi)
JP (1) JP2556869B2 (fi)
AU (1) AU620019B2 (fi)
CA (1) CA1312835C (fi)
DE (1) DE3785633T2 (fi)
DK (1) DK175518B1 (fi)
ES (1) ES2053552T3 (fi)
FI (1) FI94026C (fi)
GR (1) GR3007997T3 (fi)
IE (1) IE61322B1 (fi)
NO (1) NO171223C (fi)
PT (1) PT85750B (fi)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5229272A (en) * 1989-04-25 1993-07-20 Igen, Inc. Catalytic antibody components
US4963355A (en) * 1986-06-23 1990-10-16 Igen, Inc. Production of antibody catalysts
EP0305870B1 (en) * 1987-09-02 1994-04-13 Igen, Incorporated Production of immunoproximity catalysts
US6702705B1 (en) * 1988-05-04 2004-03-09 Igen International, Inc. Prodrugs activated by targeted catalytic proteins
ZA893284B (en) * 1988-05-04 1990-03-28 Igen Inc Peptide analogs and their use as haptens to elicit catalytic antibodies
US5215889A (en) * 1988-11-18 1993-06-01 The Regents Of The University Of California Catalytic and reactive polypeptides and methods for their preparation and use
US5236825A (en) * 1989-01-17 1993-08-17 Scripps Clinic And Research Foundation Polyvalent metal ion-containing antibody combining site catalysts
US5429936A (en) * 1989-04-21 1995-07-04 The Regents Of The University Of California Antibody-mediated juxtaposition of reactive moieties
US6048717A (en) * 1989-04-25 2000-04-11 Igen International, Inc. Inhibitors of catalytic antibodies
US5194585A (en) * 1989-04-25 1993-03-16 Igen, Inc. Inhibitors of catalytic antibodies
US5658753A (en) * 1989-04-25 1997-08-19 Paul; Sudhir Catalytic antibody components
US5599538A (en) * 1989-04-25 1997-02-04 Igen, Inc. Autoantibodies which enhance the rate of a chemical reaction
US5236836A (en) * 1989-04-25 1993-08-17 Igen, Inc. Autoantibodies which enhance the rate of a chemical reaction
DK547589D0 (da) * 1989-11-02 1989-11-02 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af organiske forbindelser
US5444155A (en) * 1991-09-10 1995-08-22 The Scripps Research Institute Molecules with antibody combining sites that induce asymmetry
US5250426A (en) * 1991-10-22 1993-10-05 The Scripps Research Institute Molecules with antibody combining sites that induce asymmetry
US5463028A (en) * 1992-04-03 1995-10-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reagents for generating a polyclonal hydrolytic antibody response against cocaine and the monoclonal hydrolytic antibodies against cocaine derived through these reagents
JP2721296B2 (ja) * 1993-09-08 1998-03-04 株式会社蛋白工学研究所 糖エステル誘導体を位置選択的に加水分解する触媒抗体
US5571681A (en) * 1994-03-10 1996-11-05 The Scripps Research Institute Chemical event selection by suicide substrate conjugates
GB9510830D0 (en) * 1995-05-27 1995-07-19 Zeneca Ltd Proteins
JP2002515965A (ja) * 1995-08-18 2002-05-28 ダブリュー． ランドリ，ドナルド 抗体触媒反応の調節による有機化合物の検出
US5948658A (en) 1996-06-25 1999-09-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Anti-cocaine catalytic antibody
WO2001032908A1 (fr) * 1999-10-29 2001-05-10 Wakamoto Pharmaceutical Co., Ltd. Anticorps monoclonal, hybridome, immunoessai et necessaire a diagnostic
EA036225B1 (ru) 2012-03-14 2020-10-15 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы и их применения
EP3722318A1 (en) 2015-07-06 2020-10-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
WO2017190079A1 (en) 2016-04-28 2017-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
CN110809583A (zh) 2017-06-07 2020-02-18 瑞泽恩制药公司 用于内化酶的组合物和方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0162920A1 (en) * 1983-11-29 1985-12-04 IGEN, INC. (a California corporation) Method of catalyzing chemical reactions
US4659567A (en) * 1984-09-07 1987-04-21 Scripps Clinic & Research Foundation Molecules with antibody combining sites that bind to hydrolytic transition states
US4963355A (en) * 1986-06-23 1990-10-16 Igen, Inc. Production of antibody catalysts
US4792446A (en) * 1986-06-23 1988-12-20 Igen, Inc. Production of antibody catalysts

Also Published As

Publication number Publication date
US5030717A (en) 1991-07-09
EP0260939B1 (en) 1993-04-28
JPS63159325A (ja) 1988-07-02
JP2556869B2 (ja) 1996-11-27
GR3007997T3 (fi) 1993-08-31
EP0260939A2 (en) 1988-03-23
DE3785633T2 (de) 1993-08-12
DK175518B1 (da) 2004-11-22
NO171223C (no) 1993-02-10
NO873884D0 (no) 1987-09-16
NO873884L (no) 1988-03-18
AU620019B2 (en) 1992-02-13
DK486087D0 (da) 1987-09-16
FI874047A (fi) 1988-03-18
NO171223B (no) 1992-11-02
IE872512L (en) 1988-03-17
FI94026C (fi) 1995-07-10
FI874047A0 (fi) 1987-09-16
IE61322B1 (en) 1994-11-02
CA1312835C (en) 1993-01-19
PT85750A (en) 1987-10-01
EP0260939A3 (en) 1990-04-18
PT85750B (pt) 1990-08-31
AU7843487A (en) 1988-03-24
DE3785633D1 (de) 1993-06-03
ES2053552T3 (es) 1994-08-01
DK486087A (da) 1988-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI94026B (fi) Monoklonaalisia vasta-ainemolekyylejä, joilla on katalyyttisiä ominaisuuksia omaavia vasta-aineen sitovia kohtia
US4659567A (en) Molecules with antibody combining sites that bind to hydrolytic transition states
US5126258A (en) Molecules with antibody combining sites that exhibit catalytic properties
AU643186B2 (en) Peptide analogs and their use as haptens to elicit catalytic antibodies
US4900674A (en) Antibody combining sites that exhibit amide or ester synthase activity
FI108437B (fi) Molekyylit, jotka sisõltõvõt vasta-aineenyhdistõmiskohtaosia, jotka katalysoivat hydrolyysireaktioita
US5079152A (en) Antibody combining sites that exhibit stereoselective synthase activity, and methods using the same
US5977314A (en) Catalytic antibodies against cocaine
CA2721422C (en) Chemical and biochemical adducts as biomarkers for organophosphate exposure
US5248611A (en) Stereoisomer separation method using antibody combing site-containing molecules
FI95928B (fi) Molekyylit, joissa on vasta-ainetta liittävät kohdat ja joilla on stereospesifinen katalyysi
JP3822231B2 (ja) 一級アミドを加水分解する触媒抗体およびそのような抗体を誘発する方法
US5952462A (en) Transition state analogs
Odenbaugh et al. An investigation of antibody acyl hydrolysis catalysis using a large set of related haptens
JPH04505853A (ja) 触媒抗体
WO1993005146A1 (en) Molecules with antibody combining sites that induce asymmetry

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
FG Patent granted

Owner name: SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION

MA Patent expired