PT85750B - Processo de preparacao de molecula receptora e de hidrolise catalitica - Google Patents

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Description

presente invento refere-se ao processo de preparação de moléculas receptoras de especificidade pré-determinada a partir de um ligando análogo com uma conformação que correspori de substancialmente à conformação de um estado hidrolítico de transição de um ligando reagente amida ou éster. As moléculas receptoras compreendem um centro de combinação com anticorpos que se liga a um ligando reagente e que desse modo estabiliza o átomo de carbono tetraédrico do estado de transição da hidró lise da amida ou do éster desse ligando reagente para hidrolisar cataliticamente o ligando reagente num local pré-determina do, o qual compreende os passos de (a) imunizar um animal hospedeiro com um ligando análo go que contém um átomo ligado tetraedricamente numa posição análoga à posição do átomo de carbono carbonilo da referida li gação amida ou ester de ácido carboxilo pré-seleccionada do re ferido ligando reagente;
(b) manter o referido animal hospedeiro durante um período de tempo suficiente para que os anticorpos se formem com o referido ligando análogo;
(c) recuperar os anticorpos formados;
(d) analisar os anticorpos recuperados em relação a ari ticorpos que se ligam ao referido ligando análogo;
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Ref: EPGíll-SCRF 43.2 (e) analisar os referidos anticorpos recuperados em re lação a anticorpos que se ligam ao referido ligando reagente;
(f) recuperar anticorpos dos passos (d) e (e) que se ligam a ambos o ligando análogo e ao ligando reagente;
(g) analisar os anticorpos recuperados do passo (f) em relação a anticorpos que hidrolisam cataliticamente a referida ligação ezster ou amida de ácido carboxílico pré-seleccionada do referido ligando reagente; e (h) recuperar os anticorpos que hidrolisam cataliticamente a referida ligação do ligando reagente.
presente invento refere-se ainda a um processo de hidrólise catalítica de uma ligação éster ou amida pré-seleccionada de uma molécula de ligando reactivo.
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Ref: EPGsll—SCRF 43.2
-3MEMORIA DESCRITIVA
Referência à Arte Anterior presente invento é uma continuação do pedido de patejn te copendente n2. 908313 depositado em 17 de Setembro de 1986, que é uma continuação do pedido de patente copendente nQ. 648406 depositado em 7 de Setembro de 1984, agora Patente dos E.U.A. n2. 4 659 567, cujo conteúdo de ambas é aqui incorporado como referência.
Campo da Invenção presente invento refere-se ao processo de preparação de anticorpos, antigénios e imunogénios, e mais particularmente, ao processo de preparação de moléculas que contêm um epítopo que liga, e que assim estabiliza, o átomo de carbono tetraédri. co do estado de transição de hidrólise duma amida ou de um éster, e que exibem propriedades catalíticas.
Antecedentes da Invenção
Os fenómenos de ligação entre ligandos e receptores desempenham diversos papéis cruciais em sistemas biológicos. Exem pios destes fenómenos são a ligação de moléculas de oxigénio à descxi-hemoglobina para formar a oxi-hemoglobina e a ligação de um substrato a uma enzima que actua sobre ele, tal como acoji tece entre uma proteína e uma protease como a tripsina. Outros exemplos de fenómenos biológicos de ligação incluem a ligação de um antigénio a um anticorpo e a ligação do componente de complemento C3 ao assim chamado receptor CRI.
Crê-se que muitas drogas e outros agentes terapêuticos estão também dependentes de fenómenos de ligação. Por exemplo os opiatos como a morfina, ligam-se a receptores específicos no cérebro. Os agonistas e antagonistas de opiato competem com drogas tais como morfina por esses centros de ligação.
Os ligandos, tais como as drogas preparadas pelo homem, do tipo morfina e seus derivados, e aquelas que estão naturalmente presentes em sistemas biológicos, tais como endorfinas e
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Ref: EPG:11-SCRF 43.2
-4hormonas, ligam-se a receptores que estão naturalmente presentes em sistemas biológicos e serão aí conjuntamente tratadas. Estas ligações podem conduzir a vários fenómenos biológicos incluindo particularmente, a hidrólise das ligações amida e és. ter, onde as proteínas são hidrolisadas nos polipeptídeos cons tituintes por uma enzima tal como a tripsina ou a papaína, ou onde uma gordura é clivada em glicerina e em três ácidos carbo xílicos, respectivamente.
A ligação imunológica pode ser usada para desviar experimentalmente as interacções de ligação para processos catalíticos. Jencks, W.P., Catalysis in Chemistry and Enzymology, pág. 288 (McGraw-Hill, Neto York 1969). As tentativas para introduzir grupos reactivos num centro de combinação de um anticorpo não têm sido porém bem sucedidas. Royer, G.P., Adv. Catal., 29, 197 (1980). E conhecido que alguns anticorpos monoclonais incluem resíduos nucleofílicos que reagem com um apêndice éster activado num hapteno homólogo reconhecido pelo anti corpo. Kohen et al., FEB5 Lett., 111, 427 (1980); Kohen et al., Biochem. Bjophys. Açta, 629, 328 (1980) e Kohen et al., FEB5 Lett., 100, 137 (1979). Nestes casos, a velocidade de acilação do nucleófilo é presumivelmente acelerada pela sua proximidade a um centro de ligação do fragmento hapténico.
Estas suposições, ainda que interessantes, estão severja mente limitadas pelo insucesso em endereçar o mecanismo de uti. lização da energia de ligação que é essencial às enzimas /~W. P. Oencks, Adv. Enzymol., 43, 219 (1975)_7. Além disto, quando uma ligação forte é dirigida a estados estáveis, a baixa \je locidade de dissociação do complexo impedirá a catálise. Estas deficiências podem ser ultrapassadas usando um estado de transição análogo, tal como o hapteno, para extrair os anticoj? pos desejados. Este hapteno (aqui também designado por ligajn do análogo”) pode desempenhar no sistema catalítico, o papel de inibidor.
Na teoria química actualmente aceite, pensa-se que a hi drólise das ligações amida e éster decorre em meio aquoso por uma reacção no átomo de carbono do carbonilo, para formar um
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Ref: EPG.-ll-SCRF 43.2
-5estado de transição que contém um átomo de carbono tetraédrico ligado a (a) um átomo de carbono do grupo ácido da amida ou do éster, (b) dois átomos de oxigénio, sendo um do grupo carbonilo e o outro de um ião hidróxilo ou de uma molécula de água do meio, e (c) ao átomo de oxigénio do grupo álcool de um éster ou ao átomo de azoto do grupo amina de uma amida. Os estados de transição destas reacções são construções mentais úteis que, por definição, não podem ser isolados, ao contrário dos intermediários que são isoláveis.
Ainda que os estados de transição hidrolíticos anteriores não possam ser isolados, existe uma grande quantidade de literatura científica dedicada ao assunto. Alguma desta literatura é aqui depois discutida.
Embora se pense que o estado de transição para as hidró lises de amidas e ésteres é suficientemente conhecido, os parSi metros da topologia, p.e. dimensão, forma e carga, dos centros de ligação dos receptores onde amidas particulares, tais como proteínas, ou ésteres, tais como gorduras, reagem através destes estados de transição, não são bem compreendidos. Seria des. te modo benéfico se fosse conhecida a topologia de uma plurali dade de centros de ligação, por forma a que as interacções dos ligandos que se ligam a esses centros pudessem ser estudadas. Infelizmente, é geralmente desconhecida a topologia dos centros de ligação do receptor em hidrólises biológicas, excepto para um número relativamente pequeno de enzimas, cujas estruturas cristalinas em raios X têm sido determinadas.
Esta falta de conhecimento sobre a topologia dos centros de ligação deriva em parte de uma falta de conhecimento, mesmo sobre a localização em células, de muitos centros de ligação de receptores. Adicionalmente, para os centros de ligação de receptores cuja localização é conhecida, a identidade química, i.e., a composição de proteínas e de carbo-hidratos, do centro de ligação é geralmente desconhecida. Assim o investigador es, tá geralmente empenhado em procurar compreender os requisitos topológicos dos centros de ligação de receptores, procurando deste modo preparar agentes terapêuticos que possam responder
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Ref: EPG:11-SCRF 43.2
-6a esses requisitos.
Os investigadores têm assim de testar os agentes terapêuticos potenciais, em estudos com animais ou com culturas de células, por forma a averiguar se um agente terapêutico potencial pode ser útil. Estes sistemas, ainda que úteis, são caros e morosos.
Mesmo quando se conhecem a topologia e a reactividade química de um receptor hidrolítico, tal como uma enzima, as enzimas tais como proteases hidrolíticas, fragmentam tipicameri te os seus substratos, cadeias de polipeptídeo, adjacentes a um resíduo aminoácido particular que podem existir várias vezes na cadeia polipeptídica da proteína. Embora esta clivagem relativamente aleatória possa ser útil na obtenção de um mapa dos polipeptídeos da proteína, essa clivagem relativamente al_e atória não é assim tão útil quando se desejam preparar sequências particulares de resíduos de aminoácidos.
As modernas técnicas de engenharia genética, por exemplo, têm sido úteis na preparação de proteínas de fusão, que contêm uma proteína ou um polipeptídeo desejado fundido com o produto de transcrição de um vector genético, tal como o gene lac Z. A utilização destas proteínas de fusão é porém impedida pela presença de fragmentos do produto do vector genético. Seria assim também benéfico que se pudessem preparar moléculas do tipo enzima proteolítico que clivassem estes produtos de fju são nos polipeptídeos e proteínas desejados e não desejados.
Recentemente, Lerner, Tramontano e Janda /~Science, 2 34, 1566 (1986)__7 descrevem anticorpos monoclonais que hidrolisam cataliticamente um éster. Na Patente dos E.U.A. p2. 4 656 567. Tramontano e Lerner descrevem também a utilização de anticorpos monoclonais na hidrólise de ésteres. Pollack, Jacobs e Schultz /~Science, 2 34, 1570 (198ó)_7 descrevem uma proteína mieloma denominada M0PC167 /~Leon et al., Biochem., 10, 1424 (1971)-/ que catalisa a hidrólise de um carbonato.
Nas duas descriçães de Lerner e Tramontano, os anticorpos foram cultivados para um fosfonato, que foi sintetizado p.a
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Ref: EPG:11-SCRF 43.2
-7ra representar um análogo estável do estado de transição hidro lítico, tetraédrico, do éster de ácido carboxílico ou de carbo nato. 0 anticorpo principalmente discutido por Pollack et al., foi uma proteína mieloma que estava ligada a um fosfonato que era estruturalmente análogo ao análogo carbonato hidrolisado. Assim, no trabalho de Lerner e Tramontano et al., o substrato a ser hidrolisado foi pré-seleccionado, sendo o análogo imunizante e os anticorpos hidrolíticos sintetizados de acordo com o produto desejado. Pollack et al. identificaram o substrato a ser hidrolisado quando conheceram a especificidade da proteí. na mieloma. Pollack et al. referiram também (acima) a existên cia de um anticorpo catalítico, sistema substrato e substrato análogo, para a hidrólise de carbonato, semelhante em conceito, ao de Lerner et al.. 0 trabalho em relação a esse sistema é descrito por Oacobs et al., J. Am. Chem Soc. , 109, 2174 (1987).
pedido de patente publicado W0 85/02414 discute a pos, sibilidade de utilização de anticorpos como catalisadores e apresenta valores relativos à utilização de soro policlonal na hidrólise do .o-nitrofenil-beta-D-galactosido. Diz-se que os anticorpos úteis nesse pedido de patente são induzíveis por um reagente, um intermediário da reacção, ou por um análogo do reagente, produto ou intermediário da reacção. 0 termo ”análo go” é aí definido como incluindo isómeros, homólogos ou outros compostos suficientemente parecidos com o reagente em termos de estrutura química, de modo que um anticorpo criado para um análogo possa participar numa reacção imunológica com o reage_n te, mas que não catalise necessariamente a reacção do análogo.
Os valores apresentados nessa descrição indicam apenas que ocorreu alguma clivagem do substrato (reagente) galactosido, durante um período de dezoito horas, usando uma preparação de anticorpos relativamente concentrada (diluições 1:10 e 1:20). Ainda que se tenha alegado catalise, não se observou actividade catalítica uma vez que não se observou a regeneração do anticorpo alegadamente catalítico nem existia uma indicação da percentagem de substrato galactósido clivado. Esse pedido de patente indica sim que a beta-D-galactosidase clivou cerca de
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-8dez vezes tanto substrato como os anticorpos policlonais, presumindo uma linearidade de absorvência na concentração não designada do substrato estudado.
Dos valores apresentados nesse pedido de patente é possível que tenha ocorrido a substituição nucleofilica do grupo £-nitrofenilo por um grupo amino terminal de um resíduo lisina da preparação de anticorpo usada. Assim, a absorvência observada podia ter sido devida à formação de epsilon-aminolisinil-ο,-nitrofenilanilina ou à formação de um epsilon-amino-lisinil galactosido e .o-nitrofenol, qualquer destas ocorrências que não podia ter sido catalítica uma vez que o anticorpo foi consju mido, em vez de regenerado.
Breve sumário da invenção presente invento contempla o processo de preparação de uma molécula receptora que contém um centro de combinação de anticorpo ou uma poliamida contendo um idiotipo, que é capaz de hidrolisar cataliticamente uma ligação éster ou amida de áci do carboxílico pré-seleccionada de um ligando reagente. Esse centro de combinação com anticorpos liga-se a (imuno-reage com):
(a) um ligando reagente que contém essa ligação amida ou éster de ácido carboxílico pré-seleccionada e (b) um ligando análogo ao ligando reagente que contém um átomo tetraedricamente ligado, tal como um átomo de fósforo, numa posição análoga à do átomo de carbono do carbonilo da ligação amida ou éster de áci do carboxílico pré-seleccionada do ligando reagente. 0 estado de transição hidrolítico do ligando reagente assim ligado, cori tém um átomo de carbono tetraédrico ligado (a) a um átomo de carbono, o carbono alfa do grupo ácido do éster ou da amida, (b) a dois átomos de oxigénio e (c) ao átomo de oxigénio de um éster ou ao átomo de azoto de uma amida.
As moléculas contendo um idiotipo criado para o estado hidrolítico de transição de um ligando reagente, são criados ou induzidos imunizando com moléculas de ligando análogo (preferivelmente ligado a uma proteína transportadora para formar um conjugado) contendo um análogo de um estado de transição hi
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-9drolítico do ligando. A molécula imunizante de ligando análogo no estado de transição hidrolítico contém um átomo central tetraedricamente ligado, tal como fósforo, ligado directamente a (a) um átomo de carbono do grupo ácido do ligando análogo amida ou éster (o carbono alfa do grupo ácido), (b) dois átomos de oxigénio, e (c) um terceiro átomo de oxigénio ou um átomo de azoto, estando o terceiro átomo de oxigénio ou o átomo de azoto, ligado ao átomo de carbono alfa de um éster ou amida análogos do ligando.
átomo de carbono alfa do grupo ácido (a) anterior, li gado directamente ao átomo central tetraédrico, tal como um átomo de fósforo da molécula de ligando-análogo, está incluído numa cadeia que contém pelo menos 5 átomos e mais preferivelmente pelo menos cerca de 15 átomos e incluindo um grupo fenilo substituído, como é o terceiro átomo de oxigénio ou o átomo de azoto, (c) anterior. Dos dois átomos de oxigénio, (b) ante riores, ligados directamente ao átomo central, um dos átomos de oxigénio (i) está duas vezes ligado (duplamente ligado) na forma de um grupo oxo ao átomo central, (ii) é parte de um gru po hidróxilo ou (iii) é o átomo de oxigénio de um grupo alcóxi lo contendo um grupo alquilo de cadeia curta. 0 segundo destes átomos de oxigénio ligados ao átomo central tem uma ligação simples ao átomo central e é um grupo -0R2, onde R2 é sje leccionado de um grupo consistindo de hidrogénio (H), e de um grupo alquilo de cadeia curta. 0 quarto átomo, (c) anterior, ligado ao átomo central da molécula de ligando análogo é o átomo de oxigénio do álcool de um éster ou o átomo de azoto da amina de uma amida do grupo éster ou amida análogo do ligar) do. Esse quarto átomo é parte de uma cadeia que contém pelo menos 5, e mais preferivelmente pelo menos 15 átomos, constitu indo o restante da cadeia um grupo R^.
átomo central tetraedricamente ligado pode ser silício, mas é preferivelmente fósforo de modo que o ligando-anál£ go seja um composto organofósforo com uma distribuição de subs tituintes à volta do fósforo que corresponde ao estado de trari sição do carbono tetraédrico. Um mono-ácido de fosfonato na
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-10sua forma ionizada simula também o desenvolvimento de carga no ataque nucleofílico a um centro carbonilo. Além disso os inibidores fosfonamidato e fosforamidato da hidrólise enzimática de peptídeos têm sido descritos como imitações de estados de transição. Galardy et al., Siochemistry, 22, 1990 (1983);
Bartlett et al., Biochemistry, 22, 4618 (1983); Thorsett et al., Proc. Natl. Açad. Sei. USA, 79, 2176 (1982); Oacobsen et al., J. Am. Chem. Soc., 103, 654 (19B1); Kam et al., Biochemistry , 18, 3032 (1979) e Weaver et al., J. Mol. Biol., 114, 119 (1977).
Numa das concretizações do presente invento prepararam-se ésteres fosfonatos de monoarilo, que funcionam como análogos do estado de transição na hidrólise de ésteres de ácido carboxílico, que foram utilizados como ligandos análogos para preparar anticorpos monoclonais específicos. Alguns destes a_n ticorpos reagem com ésteres arilcarboxílicos particulares libertando um álcool fluorescente. A reacção parece ser estequio métrica; contudo, a actividade é regenerada sob condições alcalinas ou por tratamento com um nucleófilo, tal como hidroxil amina o pode deste modo dizer-se que é catalítica.
Alguns exemplos de anticorpos (receptores) reagem apenas com ésteres de ácido carboxílico contendo o substituinte ja-trifluoracetamida que existe similarmente no ligando análogo fosfonato. 0 éster de ácido carboxílico análogo com um grupo acetamido nesta posição, não funciona como substrato. Para aqueles receptores observaram-se cinéticas de saturação e indi. cam-se aqui os parâmetros cinéticos para baixos valores de pH. As velocidades iniciais indicam uma reacção mais rápida acima de pH 8. 0 ligando análogo fosfonato é um inibidor competitivo da reacção (IG = 35 nM); enquanto que o produto carboxilato da hidrólise do éster é um inibidor menos eficaz (iG = 7000 nM). A modificação química dos grupos da cadeia lateral na proteína anticorpo, mostra uma redução parcial de actividade na acilação da lisina ou na nitração da tirosina e uma paragem dramática na modificação da histidina.
Outros exemplos de receptores catalisam a hidrólise de ) 66 685
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-11ambos os ligandos reagentes anteriormente mencionados. Entre estes últimos receptores, a especificidade por ligandos reagentes pode variar relativamente mantendo-se no entanto as suas propriedades de hidrólise catalítica.
Discutem-se os resultados em termos de um mecanismo pelo qual os resíduos aminoâcido do centro de combinação de anti corpos participam na catálise básica geral e/ou nucleofílica. As propriedades de alguns dos exemplos de anticorpos preparados de acordo com o presente invento sugerem que o mecanismo de hi drólise catalítica é um exemplo de transacilação enzimática, enquanto que o passo de desacilação ê limitativo da velocidade, e os resultados obtidos demonstram que a função enzimática pode ser devida à especificidade imunológica.
E assim de notar que o presente invento, num sentido mais lato, contempla o processo de preparação de ligandos reagentes e de ligandos análogos contendo um análogo do estado de transição hidrolítico do ligando reagente. Estas moléculas di, ferem pelo facto de o ligando reagente conter um grupo carboni lo de uma amida ou de um éster enquanto que o análogo ligando contém um átomo central que não é de carbono, tal como o fósfo ro. 0 ligando reagente e o ligando análogo podem também diferir na substituição dos dois átomos de oxigénio (b) ligados ao átomo central, uma vez que o ligando análogo tem de possuir es. tabilidade suficiente para ser usado como hapteno, enquanto que o estado de transição simulado pelo ligando análogo não po, de ser isolado. Além disso, ainda que um centro de combinação de anticorpos seja capaz de exibir uma especificidade notável, a estrutura de um ligando reagente pode variar mantendo-se no entanto a hidrólise catalítica.
Nos estudos aqui representados, as amidas e ésteres fos. fonato de monoarilo funcionam como análogos do estado de transição para gerar anticorpos que são preferivelmente monoclonais e que são esterases arilcarboxílicas. De facto, estes a_n ticorpos exprimem funcionalmente a sua energia de ligação inerente, como enzimas verdadeiras, para hidrolisar ésteres e classicamente, como anticorpos, para se ligarem a antigénios.
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• ,T
-12Pelas fórmulas seguintes representam-se moléculas imuni zantes de ligandos análogos que contêm um análogo de um estado de transição hidrolítico:
onde onde onde
0R2
X = 0 ou NH;
CF^ ou CH2!\O/ NHC0R6 ’
R^ = H ou ch2nhcd
e n é um inteiro de 1 a 8 inclusivé.
As moléculas de ligando análogo do estado de transição hidrolítico são elas próprias ligandos, ainda que não sejam li. gandos reactivos e o seu processo de preparação é também con templado no presente invento. Estas moléculas de ligando são
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de dimensão molecular relativamente pequena e deste modo, quajn do são usadas como imunogénios para induzir a produção de molé cuias receptoras, estão tipicamente ligadas a uma molécula transportadora maior, ou são usadas sozinhas com moléculas ini bidoras. Estas moléculas relativamente pequenas são normalmeri te designadas por haptenos. Estas moléculas de ligando análogo contêm também tipicamente um átomo ou um grupo de ligação, tal como um mercaptano, uma succinimida ou outro grupo, reacti vos,que constitua uma forma de ligar as moléculas hapténicas de ligando análogo aos transportadores para serem usadas como imu nogénios.
Pela fórmula seguinte representam-se exemplos de molécu las de ligando reagente que correspondem estruturalmente às mo léculas de ligando análogo anteriores:
onde R^, R5 e £ têm o significado anterior; R^g = H, NHCOR^^, onde = alquilo C^_6 de cadeia curta ou alquilo de cadeia curta substituído tal como um halo ou carboxialquilo.
As moléculas do presente invento contendo centros de combinação de anticorpo, são elas próprias receptores e forne66 685 ,>
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-14cem informação sobre as preferências conformacionais das intejç acções anticorpo-hapteno, pelo estudo dos padrões de reactividade intramolecular dos complexos receptor-ligando, que são formados entre as moléculas contendo centros de combinação de anticorpo (receptores) e os ligandos de diferentes estruturas que contêm regiões epitópicas similares ou idênticas.
E também contemplado um processo de preparação de moléculas de receptor policlonais que se ligam ao estado de transi, ção hidrolítico de uma amida ou éster particular. Aqui prepara -se na forma de um conjugado imunogénico uma molécula hapténica de ligando análogo, anteriormente descrita, contendo um aná logo de estado de transição hidrolítico, ligando-a a um transportador. 0 conjugado assim preparado é dissolvido ou disperso num diluente fisiologicamente tolerável para formar um inóculo. Introduz-se o inóculo, p.e. por injecção, num hospedeiro mamífero numa quantidade suficiente para induzir anticorpos pja ra o ligando análogo hapténico. Recolhem-se os anticorpos assim induzidos. Os anticorpos recolhidos que imunorreagem com o ligando análogo hapténico imunizante são reunidos.
Na prática particularmente preferida, preparam-se anticorpos monoclonais. Aqui usa-se a técnica de imunização anterior e testam-se os anticorpos recolhidos para determinar a sua capacidade para se ligarem (imunorreagirem) ao ligando aná logo hapténico imunizante. Reunem-se as células produtoras de imunoglobulina tais como as células do baço de um animal cujos anticorpos se ligam ao ligando análogo hapténico imunizante e fundem-se com células de mieloma para formar células de hibridoma. Cultivam-se as células de hibridoma num meio de cultura e testa-se □ meio sobrenadante das células de hibridoma em crescimento para determinar a presença de anticorpos que se li gam ao ligando análogo hapténico imunizante. As células de hi bridoma cujo sobrenadante contém tais anticorpos ligantes são então clonadas para preparar os anticorpos monoclonais desejados, a partir do sobrenadante do meio de cultura ou a partir do fluído ascitico de um mamífero hospedeiro no qual se introduz o hibridoma.
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-15Os anticorpos policlonais e monoclonais anteriormente descritos podem ser usados como receptores do presente invento. Alternativamente podem remover-se as porções, designadas por Fc ou Fc’, dos anticorpos por clivagem enzimática, por for ma a facultar um centro de combinação de anticorpo (poliamida contendo um idiotipo) que se liga ao ligando análogo hapténico imunizante, tal como as partes Fab ou F(ab*)2 do anticorpo, respectivamente.
Os receptores policlonais, monoclonais e poliamida contendo um idiotipo podem ligar-se ao estado de transição hidrolítico do ligando amida ou éster» Esta ligação conduz tipicamente à hidrólise catalisada do ligando reagente.
presente invento traz vários benefícios e vantagens. Um dos benefícios consiste na preparação de receptores cujos requisitos topolégicos dos centros de ligação são talhados para um ligando particular a ser estudado.
Outro benefício do presente invento consiste na prepara ção de receptores que hidrolisam o ligando amida ou éster num centro pré-determinado e que exibem propriedades catalíticas.
Uma vantagem do presente invento reside no facto de, em virtude da especificidade dos receptores que podem ser prepara dos, poder hidrolisar-se um ligando contendo uma pluralidade de diferentes ligações hidrolisáveis, tal como um polipeptídeo ou proteína, numa ligação hidrolisável particular pré-seleccio nada.
Ainda uma outra vantagem do presente invento reside na preparação de receptores que se ligam ao estado de transição hidrolítico de um ligando pré-seleccionado particular e que exibem propriedades catalíticas, constituindo assim um meio p.a ra o estudo da reacção de hidrólise catalítica desse ligando.
Ainda outros benefícios e vantagens do processo do presente invento serão evidentes para os peritos na arte a partir das descrições que se seguem.
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-16Breve descrição dos desenhos
Nos desenhos, que constituem parte desta descrição:
A figura IA ilustra uma estrutura proposta do estado de transição em metalopeptidases. A coordenação bidentada da ami da parcialmente hidratada ao ião metálico, é um modelo que tem sido proposto para uma interacção de estabilização que ocorre no mecanismo de clivagem peptídica por uma peptidase de zinco. 0 modelo apresentado é apoiado por evidência recente que sugere que o ião zinco pode tornar-se penta-coordenado na termolisina, polarizando deste modo simultaneamente a ligação carboni. lo e libertando uma molécula de água nucleof11ica. Monzingo et al., Biochemistry, 23, 5724 (1984); Hangauer et al., Biochemistry, 23, 5730 (1984)__/.
A figura 1B ilustra as interacções de um análogo fosfonamidato com uma metaloenzima que permite que ele simule a con figuração do estado de transição de acordo com o modelo apresentado.
A figura 2 ilustra os ligandos análogos e os ligandos usados na preparação e teste de anticorpos monoclonais com pro priedades esterolíticas. As identidades dos substituintes R e R' são as seguintes: Compostos 1.,.3 e 2! R=NHCOCF^, R’=NHCOCH^; Compostos 2 e 4: R=NHC0CF^, R * = NHC0(CH.-,)^COON(COCH^)2 5 Composto 8: R=NHC0CF3, R' = NHC0(CH2)2C00H; Composto 9: R,R' = NHC0CH3; Composto .10: R=NHC0CFj, R’ = H; Composto 11: R=NHCOCH^, R'=NHCOCF,.
A figura 3 ilustra a velocidade de hidrólise de um éster carboxílico (Composto 2) determinada por HPLC sob as condições descritas na Tabela 1 (tampão fosfato 50 mM a pH 8,0 e a 235C). ( Àl ) Velocidade de hidrólise não catalisada (residual). (□ ) Efeito de IgG monoclonal não específica 0,5 micromolar. ( ) Anticorpo monoclonal anti-Composto 4 0,1 micromolar a partir do hibridoma P3 6D4. A curva sobreposta representa um decréscimo exponencial teórico que se adapta aos pontos experi mentais.
A figura 4 ilustra uma representação de Lineweaver-Burk
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-17para a hidrólise do Composto Ί_ por um anticorpo monoclonal anti-Composto 4, a partir do hibridoma P3 6D4. As velocidades fo ram determinadas espectrofotometricamente por medição das velo cidades iniciais durante a primeira parte linear da reacção tal como se descreve em relação à Tabela 2. As concentrações de substrato foram corrigidas em relação às quantidades consumidas durante o equilíbrio inicial. ( B ) Ausência de inibidor. ( ) Inibida por fosfonato 50 nM (Composto .3). (♦)
Inibida por fosfonato 100 nM (Composto 3).
A figura 5 ilustra um esquema proposto que tem em cons_i deração a química divergente observada na reacção de um anticorpo monoclonal anti-Composto 4., com diferentes ésteres carbo xílicos (Composto 5 e Composto 7.). Pensa-se que um resíduo histidina no centro de combinação actua como catalisador nucle ofílico (percurso reaccional superior) ou como catalisador básico geral (percurso reaccional inferior) durante a formação e quebra de um intermediário tetraédrico. 0 éster com um bom grupo rejeitado reage pelo percurso reaccional superior, uma vez que o passo limitador da velocidade, a formação do interme diário, é fácil. Este percurso reaccional é impossível para o éster com um grupo rejeitado pobre, uma vez que o passo limita dor da velocidade, a quebra do intermediário, não ê catalisado em relação ao passo análogo no percurso reaccional inferior, que pode ser catalisado por uma base geral.
Descrição pormenorizada da invenção
I· Introdução presente invento refere-se a moléculas colectivamente referidas como receptores, que são anticorpos e grupos poliami da contendo idiotipos (centros de combinação de anticorpo ou paratópicas) induzidos por um análogo de um ligando reagente que simula a conformação do estado de transição na sequência reaccional da hidrólise de um éster ou de uma amida. As moléculas receptoras (anticorpos e poliamidas contendo um idiotipo) ligam-se ao ligando análogo e ao ligando reagente e pensa-se que estabilizam o estado de transição hidrolítico de uma parte
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pré-seleccionada do ligando reagente, e que exibem assim propriedades catalíticas para o ligando reagente.
A trabalho aqui apresentado discute doze moléculas receptoras monoclonais, cada uma das quais é capaz de hidrolisar cataliticamente um ou mais ligandos reagentes. Estas moléculas receptoras foram induzidas por imunizações com ligandos análogos diferentes. Assim, é ilustrada a generalidade da invenção na preparação e uso de anticorpos catalisadores para a clivagem hidrolítica de ligandos reagentes, correspondentes em estrutura, aos ligandos análogos descritos.
Os anticorpos e enzimas são proteínas cuja função depejn de da sua capacidade para ligarem moléculas alvo específicas. As reacções enzimâticas diferem das reacções imunológicas, pois numa reacção enzimática, a ligação da enzima ao seu substrato conduz geralmente à catálise química, enquanto que o resultado usual da ligação anticorpo-antigénio é um complexo não catalítico.
Crê-se que as enzimas catalisam a hidrólise de proteínas combinando-se com a proteína para estabilizar □ estado de transição da reacção de hidrólise. Crê-se geralmente que a ve locidade da reacção enzimática é superior à velocidade da rea£ ção não enzimática, em virtude da capacidade da enzima para es. tabilizar o estado de transição da reacção, i.e., para reduzir a energia livre do estado de transição diminuindo assim a ene_r gia livre de activação da reacção. /~3encks, W.P., Adv. Enzymoloqy, 43, 219 (1975) e Pauling, L., (1948)J7. 0 suporte para esta teoria
Amer» Scientist, 36, 58 tem origem na observação de que as substâncias, que se pensa seguirem o modelo do estado de transição presumido, estão fortemente ligadas às enzimas como inibidores competitivos. Leinhard, G., Science, 180, 149 (1973) e Wolfenden, R., Acc. Chem. Res. , 5., 10 (1972). Pensa
-se ainda que a enzima consegue esta diminuição da energia livre da reacção, ligando-se à geometria do estado de transição do reagente mais fortemente do que se liga ao(s) substrato(s) ou produto(s) correspondente(s).
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-19Isto significa que a energia de ligação intrínseca da enzima é muito maior do que a que pode ser medida da ligação de substratos ou de produtos. Essencialmente, a energia de li gação da enzima é utilizada para realizar a reacção química /~Jencks, W.P., Wl/II INTERNATIONAL SOLVflY CONFERENCE (Novembro 1983)_7.
A afirmação inversa é a de que um receptor que é preparado para se ligar optimamente a um análogo adequado de um estado de transição, funcionará como catalisador. A demonstração deste resultado completa a correlação entre a função enzimática e a estrutura do receptor, e constitui uma aproximação útil na idealização de enzimas artificiais.
A ideia básica que está por detrás da hidrólise imuncló gica aqui descrita, contempla a utilização de ligandos análogos na preparação de anticorpos de especificidade predetermina da, que ligam preferencialmente, e que desse modo estabilizam, o estado de transição da hidrólise de uma ligação amida ou éster, depois de se ligarem ao ligando reagente específico. Um ligando análogo simula a conformação de um estado de transição de elevada energia na hidrólise, para induzir a produção de ari ticorpos com capacidade para se ligarem a substratos relaciona dos e estabilizarem as suas hidrólises.
Esta ligação e estabilização preferenciais têm como resultado uma redução na energia de activação para a reacção de hidrólise, satisfazendo assim um critério de catálise. Os anticorpos que apresentam esta propriedade podem ser obtidos por imunização com análogos sintéticos, que são quimicamente modifi cados por forma a apresentarem as características de ligação de um ligando reagente substrato, sofrendo uma hidrólise de uma ligação, i.e., por imunização com análogos do estado de transi, ção da reacção particular.
mecanismo pelo qual um anticorpo hidrólisa uma ligação éster ou amida de um ligando reagente ligado, pode ser imaginado em termos de um modelo de ataque induzido. Amedida que o substrato frouxamente ligado se distorce ou se rearranja por forma a adaptar-se à geometria da ligação do anticor;
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-20po, a tensão pode ser libertada por reorganização química de uma ligação simples amida ou ester predeterminada, de tal modo que esta reorganização conduza à hidrólise da ligação.
termo receptor é aqui utilizado pretendendo signifi, car uma molécula biologicamente activa que se liga a um ligando reagente, ligando inibidor ou ligando análogo. As moléculas receptoras do presente invento são anticorpos, anticorpos substancialmente intactos ou porções poliamida de um anticorpo contendo um idiotipo. A actividade biológica de uma molécula receptora é evidenciada pela ligação do receptor ao seu ligando reagente antigénico, ligando inibidor ou ligando análogo, por mistura num meio aquoso, pelo menos para valores fisiológi. cos de pH e de força iónica. Preferivelmente, os receptores ligam-se também a um ligando antigénico para uma gama de valores de pH de cerca de 5 a cerca de 9 e para forças iónicas des. de a da água destilada até cerca da do cloreto de sódio um molar.
As porções poliamida de anticorpos contendo idiotipos (centros de combinação de anticorpo) são as partes das moléculas de anticorpos que incluem o idiotipo e que se ligam ao ligando ou ao ligando análogo. Estas porções incluem os fregmejn tos Fab, Fab’ e F(ab’)2» preparados a partir de anticorpos por técnicas bem conhecidas de clivagem enzimática. Ver por exemplo a Patente dos E.U.A. n9. 4 342 566 de Theofilopoulos e Dixon, geralmente, e especificamente, Pollack et al., /Science, 234, 1570 (1987)_7 que referem que as velocidades hidrolíticas aceleradas para os fragmentos Fab eram as mesmas que para a Ig nativa. Uma vez que os anticorpos a partir dos quais se obtêm as poliamidas contendo idiotipos são descritos como sendo cria dos contra ou induzidos por imunogénios, os receptores poliami da contendo idiotipos são descritos como sendo criados” ou induzidos; tendo em conta que é tipicamente necessário um passo de clivagem por forma a obter-se uma poliamida contendo idiotipos a partir de um anticorpo. Contudo, preferem-se os anticorpos intactos e estes são utilizados como ilustrativos das moléculas receptoras deste invento.
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-21Preferivelmente, os receptores úteis no presente invento são anticorpos monoclonais. Um anticorpo monoclonal ê um receptor produzido por clones de uma única célula chamada hibridoma que segrega apenas um tipo de molécula receptora. A célula de hibridoma resulta da fusão de uma célula produtora de anticorpos com uma célula de mieloma ou com outra linha de células auto-perpetuantes.
São bem conhecidas as técnicas para preparar os anticojr pos monoclonais do presente invento. Estes receptores foram primeiro descritos por Kohler e Milstein, Nature, 256, 495 (1975), publicação esta que é aqui incorporada como referência. Os anticorpos monoclonais obtêm-se tipicamente a partir de cul turas. de tecido de hibridoma ou a partir de fluído ascítico obtido a partir de mamíferos nos quais se introduziu tecido de hibridoma. Descrevem-se aqui ambos os processos.
Os receptores monoclonais são aqui preferidos em virtude da sua especificidade única na ligação a um epítopo particu lar, tal como um ligando análogo imunizante e um ligando reagente particulares, bem como pela sua actividade catalítica re lativamente mais específica, quando comparados com os anticorpos policlonais. As preparações de anticorpos policlonais podem aqui ser também utilizadas, embora tenham tipicamente de ser separadas nas fracções que se ligam ao ligando análogo imu nizante e que se ligam a epítopos extrínsecos tais como os do transportador antigénico.
Os anticorpos policlonais que se ligam ao ligando análo go podem ser separados por separação da afinidade usando um li. gando análogo como sorvente de afinidade. Após se ter misturado e deixado uma preparação de anticorpos com o sorvente de afini dade por um tempo suficiente para ocorrer a imunorreacção apro priada, separa-se o sorvente de afinidade da parte restante da preparação de anticorpos.
A porção separada restante de anticorpos ligados ao sor vente de afinidade, contém os anticorpos que se ligam ao ligari do análogo enquanto que os anticorpos na porção separada restante da preparação de anticorpos se ligam a epítopos extrínse.
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-22cos. Os anticorpos ligados por afinidade podem depois ser isjo lados pelas técnicas usuais de separação de entidades ligadas de sorventes de afinidade, tais como por lavagem do sorvente com hidrocloreto de glicina a pH 2.
Define-se aqui um ligando como sendo uma molécula ou um complexo que imunorreage ou se liga ao centro de combinação de anticorpo de uma molécula receptora. São aqui contemplados dois tipos de ligandos. 0 primeiro é designado por ligando análogo e é usado como imunogénio para induzir a preparação de moléculas receptoras e como inibidor da reacção da molécula re ceptora catalisada por uma síntase. 0 segundo é designado por ligando, ligando reagente ou substrato de ligando reagente e é a molécula que sofre a reacção catalisada. 0 ligando análogo é substancialmente inerte em relação à reacção catalisada.
Como aqui se descreve, foram preparados análogos químicos de ligandos éster ou amida que incorporam, em centros espe. cíficos predeterminados, grupos fosfonamidato ou fosfonato, p.a ra simular a conformação do estado de transição da hidrólise de uma ligação éster ou amida. Estes análogos são candidatos adequados para esta investigação em virtude de ser conhecido que os fosfonamidatos têm sido usados como análogos do estado de transição na inibição de enzimas proteolíticas /~Bartlett, et al., Biochemistry, 22, 4618 (1983)__7.
A hidrólise da ligação amida de polipeptídeos ou de pro teínas requer ligandos análogos que não sofram substancialmente hidrólise quando utilizados como imunogénios hapténicos. Os fosfonamidatos descritos para a inibição de certas prcteases (Bartlett et. al., id. e Oacobsen et al., J. Am. Chem, Soc., 103, 654 (1981) podem também ser modificados para induzir aqui a preparação de receptores úteis.
As cadeias curtas de polipeptídeo podem induzir a produ ção de anticorpos que reconhecem e se ligam a uma proteína homóloga num centro específico predeterminado. 0 presente invejn to proporciona, ao trabalho anterior com polipeptídeos, avanços significativos. Aqui, os anticorpos (receptores) são indu, zidos por uma primeira molécula hapténica imunizante (o ligan66 685
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-23do análogo) e reconhecem e ligam-se, não apenas à primeira molécula, mas também a uma segunda molécula relacionada (o ligari do reagente). Na ligação a essa segunda molécula o receptor provoca a hidrólise (que tal como aqui se demonstra, pode ser catalítica) de uma ligação, éster ou amida, pré-seleccionada que corresponde em topologia à topologia da primeira molécula hapténica imunizante. A correspondência em topologia, i.e., dimensão, forma e carga, constitui um meio para pré-seleccionar o local no qual ocorre a hidrólise do ligando. Os ligandos inibidores que têm uma estrutura idêntica à de um ligando análogo ou de um ligando reagente, ligam-se também às moléculas receptoras.
Consequentemente, por síntese de um ligando análogo hapténico imunizante relativamente pequeno, pode-se induzir a produção de moléculas receptoras que reconheçam, se liguem e cataliticamente quebrem uma ligação éster ou amida noutra molé cuia que pode conter uma pluralidade de ligações amida ou éster» Assim, pode preparar-se um receptor que provoca a hidrólise de uma ligação amida predeterminada, seleccionada, de uma proteína ou polipeptídeo, tal como a proteína de fusão prepara da por engenharia genética anteriormente discutida.
Este resultado implica que se pode conferir a actividade de proteases até agora desconhecidas, a imunoglobulinas.
Além disso, a actividade do anticorpo pode ser dirigida para qualquer centro predeterminado à escolha, designando a li gação amida ou éster a ser clivada, com a configuração fosfona midato ou fosfonato no ligando análogo hapténico usado para a imunização. Isto é aqui demonstrado para os ésteres de hidroxicumarina onde a ligação éster exocíclico, que corresponde à ligação contendo fósforo do ligando análogo, é clivada, enquaji to que a ligação éster endocíclica (lactona) do grupo hidroxicumarina, que não tem nenhum duplicado contendo fósforo tetraédrico no ligando análogo, não é hidrolisada.
Assim, no presente invento, descreve-se um processo para clivagem selectiva de ligaçães, tal como a proteólise de uma proteína cuja sequência local está em conformidade com a
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-24da molécula contendo a ligação (polipeptídeo) pré-seleccionada. As aplicações de um tal processo na química das proteínas, bio química e medicina não têm limites.
A descrição da nossa Patente dos E.U.A. ηδ. 4 659 567 que é aqui incorporada como referência, refere-se em parte à hidrólise de ésteres de p-nitrofenilo e de cumarinilo. Prepararam-se compostos para actuar como análogos do estado de trajn sição por exemplo, do carbono p-nitrofenilo e cumarinilo correspondente em vez dos fosforoésteres, num estudo imunológico. Geraram-se por exemplo, anticorpos para um composto designado por Cl, ligados a uma proteínas transportadora, que foram isolados e analisados num teste de hidrólise do éster ligando que corresponde ao ligando análogo do composto Cl. Usou-se a libertação da molécula fluorescente, a 4-metilumbeliferona, na reacção para facilitar a detecção dos anticorpos hidroliticameji te activos. Estes anticorpos hidrolisaram de facto os ésteres de cumarina.
Os anticorpos e as porções poliamida de anticorpos contendo idiotipos, foram induzidos por uma molécula hapténicasli. gando análoga do estado de transição hidrolítico de um éster ou amida. A molécula hapténica, tal como é definida na nossa patente, contém um átomo central tetraedricamente ligado de fósforo ou sílicio, ligado directamente a (a) um átomo de carbono, (b) dois átomos de oxigénio e (c) um terceiro átomo de oxigénio ou um átomo de azoto, estando o terceiro átomo de oxi. génio ou o átomo de azoto ligado a um átomo de carbono (o carbono alfa) do grupo álcool ou amina de um éster ou amida, análogos do ligando.
Os estudos anteriores suportam a afirmação de que, a li. gação simples de anticorpos a ligandos é responsável pela catá lise química através do mecanismo baseado na conformação das estruturas hapténicas. A interacção de ligação dirigida ao grupo fosfonato ajuda a estabilizar o estado de transição ou o intermediário tetraédrico, com o qual tem uma semelhança estereoelectrónica, numa reacção de transacilação. 0 processo ilustrado pelos resultados descritos nessa patente não era ver
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-25dadeiramente catalítico em virtude de parecer resultar na trans. ferência do acilo para um resíduo essencial do centro de combi nação de anticorpo formando-se um anticorpo acilado estável. Este resultado é inesperado uma vez que um tal mecanismo não está indicado na conformação do análogo do estado de transição.
Λ
E possível que os grupos funcionais localizados no, ou próximos do centro hidrolítico activo, permitam a competição de dois mecanismos alternativos para a transacilação e que o percurso reaccional de mais baixa energia se modifique com a esco lha do substrato. Os ésteres lábeis, que são úteis no teste para detectar baixos níveis de actividade dB esterase, sofrem possivelmente transferência do acilo para um grupo nucleofílico no anticorpo.
estudo destes anticorpos monoclonais, quimicamente reactivos com ligandos mais estáveis, tem agora demonstrado que se exprime uma actividade de esterase altamente específica. Os ésteres carboxílicos que se correlacionam com os aspectos estruturais do hapteno particular usado, são aceites pelo anticorpo num processo catalítico que exibe muitas das características de uma enzima, incluindo a inibição específica pelo análogo do estado de transição.
II. Estado de transição da esterólise e conformação do hapteno (ligando análogo)
A conformação do ligando análogo é consequência da estrutura do produto a ser preparado, através do estado de transição para a formação da ligação a ser simulado, e portanto do ligando análogo. As reacçães que envolvem a hidrólise de uma amida ou éster constituem exemplos ilustrativos do conceito g.e ral e são aqui utilizados como exemplos de uma reacção de hidrólise de um éster ou amida.
Os processos de transacilação são caracterizados por me canismos de adição-eliminação no carbonilo. 0 grupo acilo pode deste modo possuir, neste estado de transição, vários graus de carácter tetraédrico. W. P. Jencks, Catalysis in Chemistry and Enzymology, cap. 10, (McGratu-Hill, New York, 1969). Pode esperar-se que as enzimas que catalisam reacções de transacila
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-26ção se liguem bem aos análogos do ligando reagente, com uma cojn figuração tetraédrica, à volta do centro acilo. Isto é verdade para proteases de serina, onde se forma temporariamente uma ligação covalente entre o ligando (substrato) e a enzima /Westerik et al., 3. Biol. Chem., 247, 8195 (1972); R.C. Thompson, Biochemistry, 12, 47 (1973) e Imperali et al., Biochemistry, 25, 3760 (1986)J, bem como para enzimas que catalisam a hidratação directa de amidas ou de ésteres. Esta última categoria é inibida por compostos com uma configuração tetraédrica incluindo um grupo fosfato, fosfonato ou fosfonamidato, em vez da unidade amida físsil /~Weaver et al., 3. Mol, Biol., 114, 119 (1977) e 3acobsen et al., 3. Am. Chem. Soc., 103, 654 (1981)_7·
As substâncias naturais e sintéticas contendo fósforo têm sido estudadas como inibidores de metalopeptidases. Nestas enzimas, o estado de transição parece conter a amida hidratada na esfera de coordenação do ião metálico /~W. N. Lipscomb, Acc. Chem. Res., 15, 232 (1982)-/. Uma descrição completa de um análogo do estado de transição pode então conter o grupo fosfono de um inibidor, como um ligando de um ião metálico ou de qualquer outro centro de polarização (ver a Figura 1) /Weaver et al., 3, Mol. Biol., 114, 119 (1977) e Christianson et al., 3, Am. Chem. 5oc., 108, 545 (1986)_/. 0 papel dos iões metáli cos nas metalopeptidases não é porém claramente compreendido. Podem ter uma função múltipla na hidrólise da amida onde os pas. sos de transferência de protões entre os intermediários tetraédricos podem ser limitadores da velocidade £~\-· M. Sayre, 3, Am. Chem. Soc., 108, 1632 (1986)_7.
A hidrólise de ésteres de ácido carboxílico é um exemplo mais simples de transacilação que poderá também ser aproximado pelo análogo do estado de transição contendo fosfonato. A ligação do grupo fosfonato carregado pode descrever uma interacção estabilizante no estado de transição que conduzirá à catá lise. As reacções de hidrólise de ésteres decorrem geralmente a velocidades espontâneas convenientes, sob as condições ambiejn tais que são adequadas para os anticorpos. Deste modo pode ser facilmente detectada qualquer pequena aceleração de velocidade.
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-27As estruturas dos ligandos análogos e dos ligandos reagentes foram, para a presente investigação, seleccionadas de acordo com certos critérios. Estes incluem a disponibilidade e a estabilidade dos precursores de organofósforo, do substrato ácido carboxílico correspondente, da conveniência da síntese química para a sua preparação, e da adaptabilidade a diversos es. quemas para apresentação imunológica.
Uma unidade molecular básica que proporciona as caracte rísticas necessárias é o análogo do ácido fenilacêtico arilo-substituído com as estruturas apresentadas, por exemplo, nos Compostos 1,-4. da Figura 2. Incluindo substituintes amino nos anéis aromáticos, pode proporcionar-se quer ao grupo benzílico quer ao grupo fenólico por exemplo, um apêndice funcional para acoplamento com proteínas imunogénicas transportadoras para apresentação hapténica. A estrutura permite também a incorpora, ção no anel fenólico, de um apêndice adicional para a criação de um centro de ligação a metais. Esta estrutura é desejável para a preparação de um anticorpo antiquelato com a organização estrutural de uma metalo-esterase.
Uma tal possibilidade foi investigada usando um halogeneto do ácido dipicolínico para se obter o grupo orto-aminometi. lo de uma estrutura fenólica (ver Compostos 3 e 4 da Figura 2). A desalquilação dos ésteres fosfonilo e acilo deste aducto expõe os ligandos potenciais para a formação de um quelato metálico. A estabilidade intrínseca de complexos deste ligando, de. terminada com metais de transição divalentes tais como cobalto, zinco e cobre, é porém provavelmente muito baixa, para se esperar que estes quelatos mantenham a sua integridade no processo de imunização. De facto, as constantes de formação de quelatos 1:1 do Composto ò. com iões metálicos divalentes, estão na gama
5-1 de 10 -10 M tal como é determinado por análises de titulação. 0 uso possível de complexos mais estáveis, de cobalto trivalente por exemplo, para gerar um quelato hapténico estável, pode fornecer resultados mais significativos.
Assim, o presente invento refere-se geralmente ao processo de preparação de receptores, preferivelmente monoclonais,
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-28que são capazes de hidrolisar uma ligação amida ou éster pré-seleccionada de um ligando, contendo os receptores um centro de combinação de anticorpo que se liga: (a) a um ligando reagente que pode formar o estado de transição hidrolítico tetraédrico de uma ligação éster ou amida pré-seleccionada do reagente, i.e., contém uma ligação amida ou éster de ácido carboxílico pré-seleccionada, e (b) a um análogo do ligando com um átomo de fósforo tetraedricamente ligado localizado na posição ocupada pelo átomo de carbono do grupo carbonilo da ligação éster ou amida pré-seleccionada do ligando reagente. 0 átomo de fósforo tetradricamente ligado está ligado directamente a:
(i) um átomo de carbono (o carbono alfa) do grupo ácido do ligando reagente análogo do éster ou amida;
(ii) dois átomos de oxigénio, um dos quais está:-ligado ao átomo de fósforo por uma ligação dupla, sendo o oxigénio um radical oxo, e o outro dos dois átomos de oxigénio está ligado por uma ligação simples ao fósforo e por outra ligação simples, a um radical seleccionado de um grupo consistindo de hidrogénio e de um alquilo de cadeia curta; e (iii) a um terceiro átomo de oxigénio ou a um átomo de azoto que está ligado a um átomo de carbono do éster ou amida análogos, i.e., ao carbono alfa do grupo álcool ou amina do éster ou da amida.
Quando o ligando reagente é uma amida ou éster cíclicos, não existem grupos distintos ácido e amina ou álcool na molécula. Os especialistas em química orgânica compreenderão porém, que as amidas e ésteres têm de conter, por definição, grupos ácido e amina ou álcool. Assim, pode desenhar-se para estas moléculas, uma linha imaginária de demarcação que inclui pelo menos o átomo do carbonilo e o seu carbono alfa directamente ligado no grupo ácido da molécula e que inclui o grupo amino ou hidroxilo e o seu carbono alfa directamente ligado no grupo amina ou hidróxilo da molécula.
Numa sua outra concretização o presente invento refere66 685
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-29-se a um processo de hidrólise catalítica de uma ligação éster ou amida pré-seleccionada numa molécula de ligando reagente. 0 processo compreende os passos de: (a) mistura de uma quantidade eficaz de um dos receptores anteriores com moléculas de liga_n do reagente num meio aquoso; e (b) deixar a mistura por um período de tempo suficiente para as moléculas de ligando se ligarem ao receptor e para as moléculas de receptor hidrolisarem a ligação pré-seleccionada. Se desejado os produtos de hidrólise podem depois ser recuperados.
Um processo hidrolítico de acordo com o presente invento utiliza um meio aquoso como parte da mistura reaccional. Es. se meio contém tipicamente água e sais tampão. Adicionalmente, o meio pode conter outros sais, tais como cloreto de sódio, bem como sais de cálcio e magnésio solúveis em água, tais como os que se encontram frequentemente em meios contendo proteínas. Po, dem também estar presentes outros sais de metais polivalentes solúveis em água, tais como sais de ferro, zinco e cobalto que são agentes complexantes úteis quando o ligando reagente é cons tituído por duas moléculas separadas. Podem também estar presentes solventes orgânicos tais como metanol, etanol, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, dioxano, hexametilfosforamida e N,N-d_i metilformamida. Podem também estar presentes agentes tensio ajç tivos que emulsionam o ligando reagente e a molécula receptora. 0 aspecto crítico dos ingredientes presentes no meio aquoso reside no facto de esses reagentes não deverem interferir substaji cialmente com, ou inibir, a reacção catalítica, p.e. por desnaturação da molécula receptora. Adicionalmente o meio aquoso de, verá estar substancialmente isento de sais, proteínas geralmente, e enzimas especificamente, que inibam a reacção de quebra de ligações catalisada pela molécula receptora.
meio aquoso tem tipicamente um valor de pH de cerca de 5 a cerca de 9, e preferivelmente, um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0. Podem também utilizar-se valores de pH superiores e inferiores aos indicados desde que a reacção catalisada não seja de novo substancialmente sujeita a interferências ou inibida.
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-30As reacções catalíticas são realizadas tipicamente à temperatura ambiente, i.e., a uma temperatura de cerca de 20 a cerca de 252C e a uma pressão atmosférica ambiente. Contudo ρ,ο dem também usar-se temperaturas inferiores ao ponto de congelação do meio aquoso e de até cerca do ponto de ebulição do meio à pressão atmosférica. Como é conhecido, as proteínas, tal como a molécula receptora, tendem a desnaturar-se a temperaturas elevadas tais como as temperaturas de ebulição de um meio aquoso, p.e. a cerca de 1002C, e assim preferem-se temperaturas inferiores a cerca de 40SC. Como é também bem conhecido, a velocidade de reacções que seguem expressões cinéticas multimoleculares diminui com a diminuição de temperatura. Assim prefere-se uma temperatura mínima de cerca de 152C.
ligando reagente está presente na mistura reaccional numa quantidade até à sua solubilidade no meio aquoso. Pode também usar-se um sistema de duas fases que inclui o ligando re.a gente insolúvel, embora tal normalmente não suceda. As concentrações do ligando reagente normalmente usadas são de cerca de 0,1 micromolar Ç^M) a cerca de 10 milimolar (mM) sendo essa quantidade também função da solubilidade do ligando reagente no meio solvente. Quando se deseja obter o produto per se, usam-se concentrações relativamente mais elevadas, quando comparadas com as concentrações mais baixas que são usadas quando se preteji de estudar um mecanismo reaccional ou a cinética de uma reacção.
Está também presente uma quantidade eficaz de molécula receptora. Essa quantidade eficaz é tipicamente uma quantidade catalítica, i.e., o receptor é usado na proporção molar para o ligando reagente, de cerca de 1:2 a cerca de 1:10000, preferindo-se uma proporção molar de 1:10 a 1:100. A proporção de molé cuia receptora para ligando reagente depende tipicamente da actividade específica da molécula receptora em relação ao ligando reagente, e do propósito do utilizador ao realizar a reacção. Assim quando se deseja obter o produto usa-se uma concentração de receptor relativamente elevada e um valor elevado da razão receptor-ligando reagente. Quando se estuda o mecanismo reaccional ou a cinética da reacção usam-se tipicamente, uma menor
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-31concentração e uma menor razão. Pode também usar-se uma quantidade estequiométrica do receptor ou uma quantidade inferior, mas uma vez que o receptor é uma molécula catalítica, mesmo a utilização de uma quantidade estequiométrica pode ser exagerada. Assim, usa-se pelo menos uma quantidade catalítica de receptor.
Tal como aqui se discute, exemplos de receptores são os segregados pelos hibridomas com números de acesso ATCC, HB 9168, HB 9169, HB 9500, HB 9501, HB 9502, HB 9503, HB 9504, HB 9505, HB 9506, HB 9507, HB 9508 e HB 9509, tendo as moléculas de reagente a estrutura aqui descrita.
III. Preparação de ligandos análogos e de ligandos
As sequências reaccionais seguintes referem-se à preparação dos compostos de 1-11 que são apresentados na Figura 2, bem como dos Compostos de 12-22. Para facilidade de descrição, a preparação dos Compostos (ligandos análogos) .3, .4, 1. e 2. e dos compostos (ligandos reagentes) 5., 6., Ί., 8., 10, 11 e 9 é descrita por esta ordem. Descreve-se também a preparação de inibidores para a clivagem catalítica dos Compostos .1-4. e 12, i.e., dos Inibidores li, 2i, 3i, 4i e 12i respectivamente.
4-Trifluoracetamidobenzilfosfonato de dietilo (Composto A)
H
A uma solução agitada de 4-aminobenzilfosfonato de dietilo (0,74 g, 3,04 mM) em 5 ml de diclorometano (destilado recentemente na presença de hidreto de cálcio) adiciona-se piridina (0,32 ml, 4 mM). Arrefece-se a mistura a 43C e à solu ção agitada adiciona-se gota a gota, por um período de 5 minutos, anidrido trifluoroacético (0,5 ml, 3,54 mM). Mantém-se a agitação durante 15 minutos deixando a solução aquecer até à temperatura ambiente (cerca de 235C). 0 fim da reacção é indi.
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-32cado por cromatografia de camada fina usando uma mistura 1:1 de diclorometano e acetato de etilo como eluente (Rp 0,2). Di lui-se a solução com 50 ml de acetato de etilo. Lava-se a solução orgânica duas vezes com fracções sucessivas de 25 ml de HC1 0,5 M e seca-se com sulfato de magnésio anidro. Por evapg ração obtém-se um óleo amarelo que é purificado por cromatogra fia flash em sílica gel usando uma mistura 1:1 de diclorometano e acetato de etilo como eluente. Obtém-se o fosfonato (Com posto A) (0,877 g, 85$ de rendimento) na forma de uma substância cristalina incolor.
RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz: delta 10,61 (singule to largo, 1H), 7,53 (dupleto, 0=8,22 Hz, 2H), 7,17 (dupleto dupleto, 3=8,67 Hz e 2,5 Hz, 2H), 4,02 (P, 3=7,18 Hz, 2(2H)), 3,10 (dupleto, 3=21,62, Hz, 2H) e 1,26 (tripleto, 3=7,05 Hz, 2(3H).
4-Trifluoracetamidobenzilclorofosfonato de etilo (Composto B)
H
A uma solução do fosfonato (Composto A) (0,1 g, 0,29 mM) em 5 ml de Clorofórmio (recentemente destilado na presença de hidreto de cálcio) adiciona-se pentacloreto de fósforo (PCl^) (0,070 g, 0,35 mM). Agita-se a mistura reaccional a 505C durante 2 horas. 0 fim da reacção é indicado por cromatografia de camada fina sendo um alíquoto removido e extinguida em metanol e trietilamina. Realiza-se a cromatografia usando uma mistura 1:1 de diclorometano e acetato de etilo como eluente (Rp 0,3). 0 PClç. restante é extinguido por aquecimento com bissulfito de sódio sólido fazendo-o borbulhar na mistura reaccional. Por evaporação do solvente obtém-se um óleo amare, lo a partir do qual, por adição de 30 ml de éter etílico anidro, se obtém um sólido cristalino branco. Lava-se o precipitado três vezes com fracções sucessivas de 30 ml de éter etíli
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-33co, obtendo-se o clorofosfonato (Composto B) (0,086, 89% de rendimento). 0 Composto B é usado directamente sem qualquer purificação adicional devido à sua natureza higroscópica.
RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz: delta 9,09 (singuleto largo, NH), 7,55 (dupleto, 3=7,72 Hz, 2H), 7,28 (multipleto, 2H), 4,29 (P, 3=7,12 Hz, 2H), 3,52 (dupleto, 3=20,5 Hz, 2H) e 1,39 (tripleto, 3=7,07 Hz, 3H).
Hidrobrometo de 2-hidróxi-5-nitrobenzil-hexametilenotetramina (Composto C)
N02
Dissolve-se hexametilenotetramina (1,88 g, 8,1 mM) em ml de clorofórmio (recentemente destilado na presença de hi %
dreto de cálcio). A solução agitada adiciona-se brometo de 2-hidróxi-5-nitrobenzilo (1,137 g, 8,1 mM). Deixa-se a suspensão em refluxo de um dia para o outro, a partir da qual por a_r refecimento, se obtém um precipitado amarelo brilhante. 0 pre cipitado é filtrado e lavado três vezes com fracções sucessivas de 50 ml de clorofórmio frio, obtendo-se, por secagem sob vácuo, 3,010 g (100% de rendimento) do sal quaternário. 0 coni posto C tem um ponto de fusão de 181-184SC.
RMN de protão em (CD^^SO a 100 MHz: delta 8,06 (duple to, 3=2,79 Hz, 1H), 7,96 (dupleto duplo, 3=8,92 e 2,74 Hz, 1H), 6,92 (dupleto, 3=8,87 Hz, 1H), 4,91 (singuleto largo, 6H) e 3,84 (singuleto, 2H).
Hidrocloreto de 2-hidroxi-5-nitrobenzilamina (Composto D)
•HC1
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-34A 15 ml de etanol adiciona-se Composto C (0,250 g, 0,67 mM) e HCl concentrado (0,56 ml, 0,67 mM). Lava-se a suspensão amarela ao refluxo durante 2,5 horas até a solução estar límpi. da. Por arrefecimento forma-se um precipitado branco (um sal de brometo de amónio). 0 precipitado é filtrado e o filtrado é concentrado até a secura obtendo-se um precipitado quase branco. Agita-se o precipitado em acetona e filtra-se a suspensão obtendo-se 0,128 g (94%) da amina (Composto D). Realiza-se cromatografia de camada fina usando como eluente uma mis. tura de l,2%/5/l de hidróxido de amónio/diclorometano/metanol (Rf 0,2). Para o produto obtém-se um teste da ninidrina posi. tivo. 0 ponto de fusão da amina (Composto D) é de 248-2519C (com decomposição).
RMN de protão em (CD^^SO a 100 MHz: delta 7,93 (dupl.e to, 0=3,10 Hz, 1H), 7,83 (dupleto duplo, 0=9,23 e 3,07 Hz), 6,14 (dupleto, 0=9,17 Hz, 1H) e 3,80 (singuleto, 2H).
6-metilesterpiridinil —2-hidroxi-5-nitrobenzamida
A uma solução de clorodipicolinato de monometilo (0,259 g, 1,27 mM) em diclorometano (recentemente destilado na presejn ça de hidreto de cálcio) adiciona-se hidrocloreto de 2-hidróxi. -5-nitrobenzilamina (Composto D) (0,259 g, 1,27 mM), obtendo-se uma suspensão que é vigorosamente agitada. Adiciona-se trietilamina (0,53 ml, 3,81 mM) gota a gota, obtendo-se uma so lução amarela, que se torna laranja após a adição completa da trietilamina. 0 fim da reacção é indicado por cromatografia de camada fina usando uma mistura 39:1 de diclorometano e eta66 685
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-35nol como eluente (R^, 0,2). Dilui-se a solução como 50 ml de acetato de etilo e lava-se três vezes com fracçães sucessivas de HC1 0,5 M e salmoura. Após secagem com sulfato de magnésio anidro e evaporação do solvente obtém-se 0,375 g de produto. Este é sujeito a cromatografia relâmpago em silica gel usando uma mistura 19:1 de diclorometano e etanol como eluente. Obte ve-se a amida (Composto E) (0,310 g, 74%) na forma de um sólido opaco com um ponto de fusão de 236-2389C.
RMN de protão em (CDj)gSO a 100 MHz: delta 11,39 (singuleto largo, NH), 9,15 (multipleto, 1H),Θ,34-8,01 (multipleto, 4H), 6,98 (dupleto, 3=9,3, 1H), 4,52 (dupleto, 3=4,521, 2H) e 3,92 (singuleto, 3H).
Preparação do composto F
A uma solução de Composto B (0,099 g, 0,3 mM) em diclorometano (destilado na presença de hidreto de cálcio) adiciona -se Composto E (0,1 g, 0,3 mM). Agita-se vigorosamente a suspensão e adiciona-se trietilamina (0,66 ml, 9 mM) gota a gota obtendo-se uma solução de cor oscilante amarela. Após a adição completa da trietilamina a solução permanece clara. Agita-se a solução durante mais 15 minutos. 0 fim da reacção é indicado por cromatografia de camada fina usando uma mistura 20:1 de diclorometano e etanol como eluente (R^ 0,6). Por diluição com 30 ml de acetato de etilo seguida de duas lavagens com fracçães sucessivas de 30 ml de HC1 0,5 M , e salmoura, seguida de secagem com sulfato de magnésio anidro e evaporação do solvente, obtém-se um óleo amarelo. Este produto é ainda purificado por cromatografia relâmpago em silica gel usando uma mistura 35:1 de diclorometano e etanol como eluente. Obtém
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-36-se o nitrofosfonato (Composto F) (0,154 g, 82% de rendimento) na forma de uma espuma branca.
RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz: delta 9,41 (singuleto largo, NH), 8,51-7,93 (multipleto, 5H), 7,71 (dupleto, 0=8,20 Hz, 2H), 7,55 (dupleto, 3=8,89 Hz, 1H), 7,35 (dupleto duplo, 3=8,62 e 2,51 Hz, 2H), 4,45 (dupleto, 3=6,54 Hz, 2H), 4,24 (multipleto, 2H), 4,01 (singuleto, 3H), 3,46 (dupleto, 3=20,8 Hz, 2H) e 1,27 (tripleto, 3=6,94 Hz, 3H).
Preparação do Composto G
A uma solução agitada de Composto F (0,061 g, 97 mM) em etanol adiciona-se ácido clorídrico concentrado (200 ml, 6,6 mM). Pára-se a agitação e adicionam-se 0,032 g de paládio em carvão activado. Coloca-se a mistura reaccional sob uma atmosfera de hidrogénio e agita-se vigorosamente durante 1 hora. 0 fim da reacção é indicado por cromatografia de camada fina usando uma mistura 20:1 de diclorometano e etanol como eluente (R^ 0,4). Com o produto obtém-se um teste de ninidri na positivo. A diluição com 25 ml de acetato de etilo segue-se a filtração através de Celite. 0 bolo de filtração é lavja do duas vezes com fracções sucessivas de 25 ml de acetato de etilo. Lava-se a fase orgânica com uma solução aquosa de bissulfito de sódio a 5% até aquela se tornar básica, seguindo-se a lavagem com duas fracções sucessivas de 25 ml de salmoura e a evaporação, obtendo-se a amina (Composto G) na forma de um óleo claro (0,038 g, 69% de rendimento) com uma pureza adequada para ser usada no passo seguinte.
RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz: delta 9,05 (singuleto largo, NH), 8,42-7,92 (multipleto, 3H), 7,71 (dupleto,
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-37(dupleto, 3=8,84 Hz, 1H, 7,15 (dupleto
Hz, 2H), 6,75 (dupleto, 3=3,22 Hz, 1H)
3=8,80 e 3,91 Hz, 1H), 4,92 (dupleto, (multipleto, 2H), 4,05 (singuleto, 3H) e 1,22 (tripleto, 3=6,95 Hz,
3=8,33 Hz, 2H), 7,35 duplo, 3=8,37 e 2,31
1,51 (dupleto duplo,
3=6,85 Hz, 2H), 4,10
3,39 (dupleto, 3=21,38 Hz, 2H) 3H).
Preparação do Composto 3
uma amostra da
Dissolve-se
9» é seusando Rf 0,2). lavaamina (Composto G) (0,063 0,106 mM) em Θ ml de diclorometano (destilada na presença de hidreto de cálcio). Adiciona-se anidrido acético (0,150 ml, 1,35 mM) e trietilamina (0,075 ml, 1,02 mM). A reacção guida até ao seu final por cromatografia de camada fina uma mistura 9:1 de diclorometano e metanol como eluente %
A diluição com 35 ml de acetato de etilo seguem-se três gens sucessivas com fracções de 20 ml de HC1 0,5 M, bicarbonato de sódio a 10% e salmoura. A evaporação do solvente é seguida de cromatografia flash em silica gel usando uma mistura 10:1 de diclorometano e metanol como eluente, obtendo-se o composto 3 (0,045 g, 67% de rendimento). Verifica-se estar o composto 2 analiticamente puro, por HPLC numa coluna analítica RP-C18 (Vydac 218TP54) usando 30-90% de acetonitrilo em água a um caudal de 1 ml por minuto durante 20 minutos, obtendo-se um único pico a 57%.
RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz: delta 9,61 (singuleto largo, NH), 8,41-8,22 (multipleto, 4H), 8,21-7,59 (multiple to, 3H), 7,58-7,14 (multipleto, 4H), 4,22 (multipleto, 4H), 4,05 (singuleto, 3H), 3,40 (dupleto, 3=21,25 Hz, 2H), 2,12 (sin guleto, 3H) e 1,23 (tripleto, 3=6,93 Hz, 3H).
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Preparação do Composto 4
Trata-se uma solução agitada da amina (Composto G) (0,035 g, 59 mM) em tetra-hidrofurano (destilado com sódio na presença de benzofenona) sob azoto, utilizando uma seringa com 0,140 ml de uma solução de cloreto de succinimidiladipoílo, A esta solução adiciona-se trietilamina (0,025 ml, 180 mM). A reacção é seguida por cromatografia de camada fina até ao seu final usando uma mistura 5:1 de diclorometano e etanol como eluente (R^ 0,6). Por diluição com 25 ml de acetato de etilo, seguida de duas lavagens com fracções sucessivas de 25 ml de HC1 0,5 M e salmoura, seguida de secagem com sulfato de magnésio anidro e de evaporação do solvente, obtém-se um óleo amare lo. Este produto é purificado por cromatografia flash em sili. ca gel usando uma mistura 10:1 de diclorometano e etanol como eluente. Obtém-se o nitrofosfonato (Composto 4) (0,036, 82/ de rendimento) na forma de uma espuma branca. Por HPLC usando a coluna anteriormente descrita e por eluição com 30-90/ de acetonitrilo em água a um caudal de 1 ml por minuto durante 25 minutos) verifica-se estar este produto analiticamente puro, tendo-se obtido um único pico.
RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz: delta 9,29 (singuleto largo, NH), 8,43-8,25 (multipleto, 4H), 8,24-7,67 (multiple to, 3H), 7,66-7,10 (multipleto, 3H), 4,24 (multipleto, 4H), 4,05 (singuleto, 3H), 3,40 (dupleto, 0=21,30 Hz, 2H), 2,84 (singuleto, 4H), 2,65 (multipleto, 2H), 2,38 (multipleto, 2H), 2,38 (multipleto, 2H), 1,79 (multipleto, 4H) e 1,26 (tripleto, 0=6,91 Hz, 3H).
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-39Preparação do inibidor 3i
Dissolve-se o fosfonato (Composto 3) (0,065 g, 0,1 mM) em 2,5 ml de acetonitrilo (destilado na presença de hidreto de %
cálcio). A solução adiciona-se iodeto de sódio (0,306 g, 2 mM) e depois sililcloreto de trimetilo (0,26 ml, 2 mM) obtendo-se uma solução cor laranja. Aquece-se a mistura reaccional a 609C. Após 12 horas de aquecimento e agitação, observou-se por HPLC um pico principal a 42%, usando a coluna anteriormente descrita e por eluição com 30-90% de acetonitrilo em água a um caudal de 1 ml por minuto durante 20 minutos. Deixa-se a solução arre fecer até à temperatura ambiente e dilui-se depois com 10 ml de uma mistura 50:50 de acetato de etilo e n-butanol. Agita-se a fase orgânica com uma solução de salmoura enquanto se adicio na bissulfito de sódio sólido até ao desaparecimento da cor l.a ranja. Separam-se as fases e extracta-se a fase aquosa com djj as fracções consecutivas de 10 ml de acetato de etilo e n-buta nol. As fases orgânicas combinadas são secas com sulfato de sódio e tamponadas com acetato de sódio (0,030 g). Remove-se o solvente por evaporação rotativa obtendo-se um pó branco (0,098 g, 145% de rendimento). Dissolve-se então este produto em 5 ml de água e arrefece-se a OBC. Acidifica-se a solução resultante até pH 2 com HC1 6 M. Por liofilização da solução acidificada obtém-se 0,085 gramas do Inibidor 3i. Este é então sujeito a uma cromatografia de fase inversa numa coluna
Waters A Sep-Pack, (Wat ers Associates, Millipore Corp., Milford, MA), por eluição com 10% de acetonitrilo em água tendo-se recolhido as fracções 4, 5 e 6. Estas fracções são combinadas e reanalisadas por HPLC, observando-se um pico a 42%,
A solução é liofilizada.
-4066 685
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Preparação do Composto 4i (usado para imunização)
Dissolve-se uma amostra de 23,5 mg do Composto 4 em 2 ml de acetonitrilo (destilado na presença de hidreto de cálcio). Este é então sujeito ao procedimento usado para desbloquear o Inibidor 3i. Verifica-se ser a amostra analiticamente pura, por HPLC usando a coluna anteriormente descrita e por eluição com 30-90% de acetonitrilo em água (um caudal de 1 ml por minu to durante 30 minutos) obtendo-se um pico principal, 4i a 49%. Tamponando a fase orgânica com acetato de sódio, seguindo-se a remoção do solvente obtém-se o Composto 4i (0,036 g, 162% de rendimento). Ainda que este produto esteja ainda contaminado com sais inorgânicos a amostra é adequada para acoplamento com proteínas transportadoras (incluindo a BSA e a KLH). 0 Compos_ to 4i é propenso a hidrólise (grupo NHS) e deverá ser armazena do a zero 9C num exsicador. A pureza do Composto 4i pode ser verificada por tratamento com diazometano. A reacção é seguida por cromatografia de camada fina usando uma mistura 10:1 de diclorometano e etanol como eluente (RP 0,4) que mostra uma ‘ 31 mancha sobreposta com a do Composto 4. RMN de P em DMSO a 100 MHzí delta 22,2 (singuleto).
Preparação do Composto H
H
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-41Dissolve-se o cloreto de fosfonilo (Composto B) (0,726 g, 2,2 mM) em clorofórmio anidro (destilado na presença de hidreto de cálcio). A esta solução adiciona-se p-nitrofenol (0,305 g, 2,2 mM) e trietilamina (0,32 ml, 2,5 mM). Agita-se a mistura reaccional durante 10 minutos e o fim da reacção é indicado por cromatografia de camada fina usando uma mistura de líl de diclorometano e etanol como eluente (R^ 0,8). Por diluição com 50 ml de acetato de etilo, seguida de três lavagens com fracções sucessivas de 50 ml de HC1 0,5 M, solução sa turada de bicarbonato de sódio e salmoura, secagem e evaporação, obtém-se o Composto H. Este produto é ainda purificado por cromatografia flash em sílica gel usando uma mistura 2:1 de diclorometano e etanol como eluente, obtendo-se o fosfonato (Composto H) (0,626 g, 66% de rendimento).
RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz: delta 8,79 (singuleto largo, NH), 8,19 (dupleto, 3=9,44 Hz, 2H), 7,54 (dupleto, 3=8,21 Hz, 2H), 7,25 (dupleto duplo, 3=8,57 e 2,62 Hz, 2H), 7,20 (dupleto, 3=9,13 Hz, 4,17 (p, 3=7,15 Hz, 2H), 3,35 (duple to, 3=21,77 Hz, 2H) e 1,29 (tripleto, 3=6,94 Hz, 3H).
Preparação do Composto I
Reduz-se uma amostra do Composta H (0,250 g, 0,63 mM) por um procedimento similar ao descrito para a redução do Composto F. Obtém-se a amina (Composto I) na forma de uma espuma clara (0,130 g, 51% de rendimento). Este produto é sujeito a cromatografia de camada fina usando uma mistura 1:1 de diclorjD metano e etanol como eluente (R^ 0,3). 0 produto dá um teste de ninidrina positivo.
RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz: delta 8,51 (singuleto largo, NH), 7,63 (dupleto, 3=8,19 Hz, 2H), 7,31 (dupleto duplo, 3=8,61 e 2,51 Hz, 2H), 7,24 (dupleto, 3=8,91 Hz, 2H), 6,61 (dupleto, 3=8,06 Hz, 2H), 4,18 (p, 3=7,18 2H), 3,39 (duple
B
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-42to, 3=21,55 Hz, 2H) e 1,24 (tripleto, 3=7,18 Hz, 3H).
Preparação do Composto 1
Et
A uma solução de diclorometano (destilado recentemente na presença de hidreto de cálcio) adiciona-se (0,030 g, 0,075 ml) de Composto I. A acilação do Composto I é realizada de uma forma idêntica à já descrita para a acilação do Composto G. Obtém-se o Composto 1. na forma de uma espuma (0,024 g, 73$ de rendimento). 0 produto é sujeito a cromatografia de camada fi na usando uma mistura de 4:1 de diclorometano e etanol como eluente (R^ 0,3).
RMN de protão em CDCl-j a 100 MHz: delta 9,57 (singuleto largo, NH), 8,28 (singuleto largo, NH), 7,50 (dupleto, 3=8,21 Hz, 2H), 7,39 (dupleto, 3=8,34 Hz, 2H), 7,18 (dupleto duplo, 3=8,31 e 2,59 Hz, 2H), 4,13 (p, 3=7,3 Hz, 2H, 3,26 (dupleto, 3=21,73 Hz, 2H), 2,07 (singuleto, 3H) e 1,24 (tripleto, 3=7,10 Hz, 3H).
Preparação do Composto 2
Faz-se reagir o Composto I (0,168 g, 0,42 mM) de acordo com um procedimento análogo ao já descrito na síntese do Composto 4.. Obtém-se o Composto 2 na forma de um cristal claro (0,188 g, 71$ de rendimento).
RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz: delta 9,35 (singuleto largo, NH), 8,39 (singuleto largo, NH), 7,53 (dupleto, 3=8,15 Hz, 2H), 7,41 (dupleto, 3=8,29 Hz, 2H), 7,19 (dupleto duplo,
B
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-433=8,30 e 2,57 Hz, 2H), 4,15 (p, 3=7,21 Hz, 2H), 3,25 (dupleto, 3=21,67 Hz, 2H), 2,85 (singuleto, 4H), 2,61 (multipleto, 2H), 2,33 (multipleto, 2H), 1,59 (multipleto, 4H) e 1,23 (tripleto, 3=7,23 Hz, 3H).
Preparação do Inibidor li
Dissolve-se o fosfonato (Composto jL) (0,030 g, 68 mM) em 3 ml de acetonitrilo (recentemente destilado na presença de hi dreto de cálcio). Adiciona-se lentamente sililbrometo de trime tilo (0,1 ml, 76 mM) e aquece-se a mistura reaccional a 503C du. rante 45 minutos. Deixa-se a solução arrefecer até à temperatu ra ambiente. 0 fim da reacção é indicado por cromatografia de camada fina de fase inversa usando uma mistura 3:7 de isopropa. nol e água (Rp 0,8). Por diluição com 30 ml de uma mistura 1:1 de acetato de etilo e n-butanol, e por duas lavagens com fracções sucessivas de 30 ml de HC1 0,5 M e salmoura, seguida de secagem e evaporação, obtém-se o Inibidor li (0,023 g, 83% de rendimento). Este produto foi ainda purificado de acordo com o método descrito para o inibidor 3i.
RMN de protão em (CD^)2S0 a 100 MHz: delta 9,15 (singu. leto largo, NH), 8,17 (singuleto largo, NH), 7,71-6,95 (multipleto, 8H), 2,23 (dupleto, 3=21,65 Hz, 2H) e 2,09 (singuleto, 3H).
Preparação do Composto 2i (usado para imunização)
B
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-44Dissolve-se uma amostra de 20 mg de Composto 2 em 2 ml de acetonitrilo (recentemente destilado na presença de hidreto de cálcio). Trata-se depois esta solução com sililbrometo de trimetilo (0,05 ml, 31 mM) e aquece-se a mistura a 509C durante 2 horas. 0 fim da reacção é indicado por cromatografia de camada fina usando uma mistura 2:1 de diclorometano e etanol como eluente (R^ 0,7). Remove-se o solvente por evaporação ro tativa e dissolve-se o resíduo em 20 ml de uma mistura 1:1 de acetato de etilo e n-butanol. Lava-se a fase orgânica duas ve zes com fracções sucessivas de 25 ml de água e salmoura. A fa se orgânica é concentrada obtendo-se um pó branco, Composto 2i (0,017 g, 87% de rendimento). Este produto é adequado para acoplamento com proteínas e não é necessária qualquer purifica, ção adicional.
Preparação do Composto 5
A uma solução de ácido 4-aminofenilacético (1,5 g) e de carbonato de sódio (1,5 g) em acetonitrilo aquoso a 10% a -109C, adiciona-se anidrido trifluoracético (2,8 ml). Acidifica-se a solução com HC1 6 N (0,2 ml) e a solução é concentrada in yacuo. Por filtração através de sílica com uma mistura 9:1 de dicloro metano e metanol, obtém-se 1,4 g (57% de rendimento em peso) de ácido p-trifluoracetamidofenilacético. Por cromatografia de camada fina em silica gel usando uma mistura 5:1 de clorofórmio e metanol como eluente obtém-se um valor de Rp de 0,35.
RMN de protão (em CDCl^); delta 3,15 (singuleto, 2H), delta 7,02 (dupleto duplo, 4H), delta 10,4 (singuleto largo, l\IH).
Dissolve-se o ácido anterior (0,6 g) em cloreto de tionilo e aquece-se a solução a 409C durante 2 horas. Remove-se o cloreto de tionilo in vacuo, e dissolve-se o resíduo em di-
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-45clorometano (5 ml) e adiciona-se esta solução a uma solução de 7-hidroxicumarina (0,40 g) e trietilamina (0,70 ml) em dicloro metano (5 ml). Dez minutos depois dilui-se a solução com acetato de etilo (50 ml) e lava-se com HC1 a 5% e com salmoura. A solução orgânica é seca e concentrada. Por cromatografia em silica gel usando uma mistura 15:1 de diclorometano e acetato de etilo como eluente, obtém-se 0,83 g (81% de rendimento em peso) de Composto 5. na forma de um sólido branco. Por cromato grafia de camada fina em silica gel usando uma mistura 9:1 de diclorometano e acetato de etilo como eluente, obtém-se um valor de Rp de 0,78.
RMN de protão (em CD^CN): delta 3,95 (singuleto, 2H), delta 6,40 (dupleto, 1H), delta 7,0-7,7 (multipleto, 7H), delta 7,85 (dupleto, 1H), delta 9,2 (singuleto largo, NH).
Preparação do Composto 6
H
Trata-se cloreto de p-trifluoracetamidofenilacetilo com N-hidroxissuccinimida e trietilamina em diclorometano e obtém-se o Composto 6. na forma de um sólido branco, após purificação do modo anteriormente descrito para o Composto 5_. Por cro matografia de camada fina em silica gel usando uma mistura 5:1 de clorofórmio e metanol como eluente, obtém-se um valor de Rp de 0,35.
RMN de protão (em CDCl^): delta 3,15 (singuleto, 2H), delta 7,02 (dupleto duplo, 4H) e delta 10,4 (singuleto largo, NH).
Preparação do Composto 7
NHCOCH-j
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-46Aquece-se uma mistura de ácido 4-trifluoracetamidofenil acético e de cloreto de tionilo durante 2 horas a 409C. Removem-se os componentes voláteis in vacuo. Dissolve-se o resíduo em diclorometano. Adiciona-se 4-acetamidofenol (1 equivalente) e depois trietilamina. 0 produto (Composto 7) é purifi cado e isolado pelos procedimentos de extracção e de cromatografia anteriormente descritos para os compostos anteriores.
Preparação do Composto 8
C''
II
NHC0(CH2)2C00H
Trata-se o cloreto de 4-trifluoracetamidofenilacetilo com p-nitrofenol e trietilamina em diclorometano. 0 éster de p-nitrofenilo é obtido por extracção e cromatografia em silica gel.
Agita-se o éster p-nitrofenilo em metanol e ácido fórmi co (50:1) com 10% de paládio em carvão activado. Faz-se borbu lhar hidrogénio na mistura durante 2 horas. Dilui-se então a mistura com acetato de etilo e filtra-se. Lava-se o filtrado com solução aquosa de bicarbonato de sódio a 5% e com salmoura e filtra-se e concentra-se, por forma a obter-se o éster de p-aminofenilo.
Faz-se reagir este e^ster com anidrido succínico e com trietilamina em diclorometanó por forma a obter-se o Composto
8.
Preparação do Composto 10
ch2^
Dissolve-se cloreto de trifluoracetamidofenilacetilo e
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fenol em diclorometano e trata-se a solução com trietilamina.
produto (Composto 10) é separado por extracção e cromatografia em sílica gel usando os procedimentos anteriormente descri, tos.
Preparação do Composto 11
A partir do ácido 4-aminofenilacético e de anidrido acé tico em acetonitrilo aquoso e bicarbonato de sódio, prepara-se o ácido 4-acetamidofenilacético.
Em dois passos, a partir de 4-nitrofenol por redução com f^/paládio em carvão activado em HC1 metanólico, e por ace tilação com anidrido acético em acetonitrilo aqucso, prepara-se o 4-trifluoracetamidofenol.
Trata-se uma mistura deste ácido e de 4-trifluoracetami dofenol em diclorometano com cloreto bis-(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (BOP-C1, um reagente comercial vendido pela Aldrich Chemical Co., Miluiaukee, Wl) e com trietilamina durante 1,5 h_o ras à temperatura ambiente. De acordo com os procedimentos de separação anteriormente descritos obtém-se o Composto 11.
Preparação do Composto 9
Por um procedimento similar combina-se uma mistura deste ácido e de 4-acetamidofenol com BOP-C1 e trietilamina em di. clorometano. Por procedimentos de separação análogos aos ant£ riormente descritos, obtendo-se o éster (Composto 9_).
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Ref: EPG-.ll-SCRF 43.2 Λ :-.Ι<1^··ΙΙ·*Ιΐη·'
-48Determinação dos valores de pKa e das constantes de estabilida. de K:
Todas as determinações de pKa e das constantes de estabilidade (K) são realizadas de acordo com o método de Martell. Este método consiste de uma titulação potenciométrica do composto particular (numa concentração de cerca de 1,4 mM) na ausência de e na presença do ião metálico que está a ser investi, gado. A força iónica é mantida constante usando NaClO^ 0,1 M como electrólito suporte. Todas as medições são efectuadas sob azoto a 259C mais ou menos 0,019C.
Preparação do Composto 3
Coloca-se a 2-metil-8-nitroquinaldina (0,5 g, 2,66x10“^ moles) num balão de fundo redondo de 25 ml conjuntamente com 15 ml de metanol e com 0,081 ml de HC1 concentrado (1 equivalente). Agita-se a mistura durante 5 minutos e adicionam-se 0,250 g de paládio em carvão activado. Coloca-se a mistura resultante sob uma atmosfera de hidrogénio gasoso onde o grupo nitro é reduzido. Após 25 minutos de agitação analisa-se a mistura reaccional por cromatografia de camada fina em silica (TLC) usando hexano/acetato de etilo (1/1) como eluente, por forma a avaliar o fim da reacção. Não se observa a presença de material de partida. 0 produto tem um valor de R^ de 0,85 e fica negro com a ninidrina.
Dilui-se a mistura reaccional reduzida com 50 ml de ace tato de etilo (EtOAc), filtra-se através de um leito de celite e concentra-se in vacuo. Redissolve-se o óleo resultante em 50 ml de EtOAc e extracta-se com solução aquosa saturada de bi carbonato de sódio e depois com cloreto de sódio saturado, e seca-se com sulfato de sódio. Por remoção do solvente in vacuo, obtém-se 0,353 g de um sólido amarelo (84/a de rendimento).
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-49RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz (em relação ao TMS como padrão interno): 7,95 (dupleto, 3=7,92 Hz, 1H), 7,4-6,8 (multipleto, 4H), 5,0 (singuleto largo, 2H), 2,75 (singuleto, 3H).
Preparação do Composto 12
A
CFj 0
Coloca-se o Composto 2 (0,037 g; 2,34x10“^ moles) num balão de fundo redondo de 25 ml sob uma atmosfera de azoto. Adj. ciona-se tetra-hidrofurano (THF; 5 ml) para dissolver o Compos. to 3. e arrefece-se a solução resultante a -789C. Adiciona-se lentamente durante 5 minutos uma solução de butil-lítio (110 ml, 2,5 M em hexanos), obtendo-se uma solução negra púrpura. Após agitação durante 5 minutos adicionais, adiciona-se Compos. to B e deixa-se a mistura resultante aquecer até à temperatura ambiente; a cor da solução torna-se verde-clara. Por TLC em silica com EtOAc/CH^C^ (1/1) como eluente verifica-se ter o produto um valor de Rp de 0,4.
Remove-se o solvente in vacuo e redissolve-se o material resultante em 20 ml de EtOAc, lava-se a solução com HC1 0,5 M e com solução aquosa saturada de cloreto de sódio e seca-se depois com sulfato de sódio. Remove-se o solvente in vacuo e obtém-se, após cromatografia flash, 0,042 g (40$ de rendimento) de Composto 12.
RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz (em relação ao TMS como padrão interno): 10,4 (singuleto largo, 1H) 8,0 (dupleto,
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= 7,7 Hz, 1H), 7,7 (dupleto, 3 = 7,9 Hz, 1H), 7,4-6,8 (multipleto, 7H), 4,2 (p, 3 ~ 5,2 Hz), 3,35 (dupleto, 3 = 20,1 Hz, 2H), 2,6 (singuleto, 3H), 1,3 (tripleto, 3 = 6,2H).
Preparação do Composto K
Coloca-se o Composto 12 (0,010 g, 2,22x10” moles) num balão de fundo redondo de 5 ml, ao qual se adicionam 1,5 ml de metanol e 8 mg de carbonato de sódio sólido (8,88x10” moles) e depois 200 ml de água. A reacção é seguida por TLC em silica usando EtOAc/CHgClg (1/1) como eluente; o produto tem um valor de Rf de 0,35. Pára-se a reacção 12 horas depois a uma temperatura de 359C.
Dilui-se a mistura reaccional com EtOAc, marca-se com cloreto de sódio saturado e seca-se com sulfato de sódio. Remove-se depois o solvente in vacuo obtendo-se 6,5 mg de Compo_s to J< (83% de rendimento).
RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz (em relação ao TMS como padrão interno): 8 (dupleto, 3 = 7,1 Hz, 1H), 7,7 - 6,0 (multipleto, 9H), 6,6 (dupleto, 3 = 7,1 Hz, 1H), 4,2 (multiple to, 2H), 3,3 (dupleto, 3 = 20,1 Hz, 2H), 2,7 (singuleto, 3H, 1,3 (tripleto, 3 = 6,6Hz, 3H).
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-51Preparação do Composto L
Coloca-se o Composto (0,0065 g, 1,84x10 moles) num balão de fundo redondo de 5 ml ao qual se adicionam 2 ml de —5
Ch^C^, 16,4 mg (4x10“ moles) de cloreto de succinimidilgluta rilo (preparado de uma forma análoga à aqui depois descrita pa ra o derivado adipoílo) e depois trietilamina (0,003 ml, 4x10“^ moles). Observa-se subitamente o aparecimento de cor. A reaç. ção é seguida por TLC em silica usando EtOAc/CF^C^ (1/1) com solvente, tendo 0 produto um valor de R^ de 0,3. Agita-se a mistura reaccional durante um total de 30 minutos, dilui-se d£ pois com EtOAc, lava-se com HC1 0,5 M e com cloreto de sódio saturado, e seca-se depois com sulfato de sódio. Após remoção do solvente in vacuo obtém-se por cromatografia flash 3,5 mg do composto L. (34/ de rendimento).
RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz (em relação ao TMS como padrão interno): 8,0 (dupleto, 3 = 7,1 Hz, 1H), 7,8-7,0 (multipleto, 10H), 4,2 (multipleto, 2H), 3,3 (dupleto, 3 = 20,2 Hz, 2H), 2,9 (singuleto, 4H), 2,7 (singuleto, 3H), 2,6 - 1,9 (multipleto, 6H), 1,3 (tripleto, 3 = 6,5 Hz).
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-52Preparação do Composto 13
ch3
A um tubo de RMN seco, sob azoto gasoso, adiciona-se Composto L. (0,012 g) seguido de 1 ml de CDCl^ anidro. Adicionam-se ao tubo duas fracções de brometo de trimetilsililo (TMSBr), o tubo é rodado e depois colocado num banho de água a 383C durante 1 hora. A clivagem do etiléster do fosfonamidato é seguida por valores espectrais de RMN.
Após a clivagem do éster de etilo estar completa, coloca-se o conteúdo do tubo de RMN num balão de fundo redondo de 10 ml seco sob uma atmosfera de azoto. Remove-se o solvente in vacuo usando uma bomba de vácuo. Lava-se o sólido resultajn te com uma mistura de hexanos e seca-se de novo usando uma boni ba de vácuo.
Mistura-se acetato de sódio sólido (0,058 mg) com o sólido lavado e seco anterior, adicionando-se depois 2 ml de uma solução de acetonitrilo contendo 10 ml de metanol. Agita-se a mistura resultante dissolvendo-se substancialmente todo o mate rial presente, permanecendo no entanto não dissolvida, uma pequena quantidade de um sólido branco. Esta solução é congelada e liofilizada obtendo-se um sólido impuro amarelo (39 mg).
A pureza do Composto 13 é testada por HPLC, após dissolução em dimetilformamida, usando uma coluna C-18 de fase inversa, com o seguinte gradiente durantel5 minutos:
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o g/ q /□ □
A = acetonitrilo
B = água-0,1/3 de ácido trifluoracético
Observa-se um pico principal a 3,8 minutos. 0 material que origina este pico é estável a O^C durante 5 dias. 0 Composto 13 é acoplado a um transportador e usado para imunização sem qualquer outra purificação.
Preparação do Composto 12i
A um tubo de RMN seco adiciona-se Composto 12 (15 mg, 3,3x10 moles) conjuntamente com cerca de 1 ml de CDCl^. Agi. ta-se a solução e adicionam-se duas fracções de 35 ml de TMSBr. A solução resultante é ainda depois agitada e depois aquecida num banho de água durante 1 hora a 389C. 0 decorrer da reacção é de novo seguido por RMN.
Após a reacção estar completa retira-se a solução do tju bo, coloca-se num balão de fundo redondo de 10 ml e evapora-se até à secura com uma bomba de vácuo obtendo-se um sólido cor de laranja. Lava-se o sólido duas vezes com fracções de 10 ml de hexano e evapora-se de novo até à secura com auxílio da bom ba de vácuo.
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-54Mistura-se acetato de sódio sólido tri-hidratado (45 mg) com o sólido cor de laranja e adicionam-se 2 ml de acetonitrilo contendo 50 jj! de metanol. Com o sólido cor de laranja obtém-se uma solução amarela.
A pureza é de novo testada por HPLC numa coluna C-18 de fase inversa com o seguinte gradiente durante 15 minutos:
1_A
A = acetonitrilo
B = água-0,1% de ácido trifluoracético produto desejado, o Composto 12i, é eluído da coluna a 5,80 minutos como um pico principal. Este material é estável para valores de pH de 3,5-7,3 durante pelo menos 11 dias à temperatura ambiente.
Por tratamento do Composto 12i com diazometano em metanol obtém-se o éster de metilo correspondente o que constitui uma prova adicional da identidade do produto.
RMN de protão em CD^CN a 100 MHz do Composto 12i obtido por HPLC preparativa (em relação ao TMS como padrão interno): 9,0 (singuleto largo, 1H), 8,3 (dupleto, 3 = 7,3 Hz, 1H), 7,8 - 6,8 (multipleto, 9H), 3,3 (dupleto 3 = 21,0 Hz, 2H).
Procedimento geral para a preparação de ésteres ligandos substrato
Agita-se uma suspensão de ácido 4-acetamidofenilacético (5 mmole), B0P-C1 (5 mmole) trietilamina (10 mmole) e de um composto de hidróxilo (5,2 mmole) em diclorometano (10 ml), à temperatura ambiente (20-252C) durante 1 hora. Usando sílica como fase sólido obtém-se os seguintes valores de R^:
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Composto Solvente
16 0,45 CH2Cl2/EtoH (20/1)
17 0,8 CH2Cl2/EtoAc (1/1)
22 0,7 CH2Cl2/EtoAc (1/1)
21 0,5 CH2Clg/EtoAc (1/1)
Após tratamento com água (10 ml, tornada básica pela
adição de bicarbonato de sódio), decanta-se a fase orgânica e seca-se com sulfato de sódio. Da remoção do solvente obtém-se um resíduo, a partir do qual se obtém, após cromatografia flash usando o solvente de TLC anterior, os ésteres substrato ligandos reagentes que se seguem:
Composto 16
Rendimento = 49%. RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz (em relação ao TMS como padrão interno: 8,0 (dupleto largo, 3 = 7,2 Hz, 1H), 7,7 - 7,1 (multipleto 9H), 4,05 (singuleto, 2H), 2,75 (singuleto, 3H), 2,1 (singuleto, 3H).
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Composto 17
RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz (com
TMS como padrão interno): 7,8-7,0 (multipleto, 12H), 3,95 (singuleto, 2H), 2,0 (singuleto, 3H).
Composto 21
Rendimento = 13%. RMN de protão em dimetilsulfóxido -d^ a 100 MHz (com TMS como padrão interno): 7,6 (multipleto, 2H), 7,3 (multipleto, 2H), 6,9 (multipleto, 4H), 3,4 (singuleto, 2H), 1,9 (singuleto, 3H), 1,8 (singuleto, 3H).
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-57Composto 22
Rendimento = 58%. RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz (em relação ao TMS como padrão interno: 7,6-6,95 (multipleto, 9H), 3,8 (singuleto, 2H), 2,1 (singuleto, 3H).
Composto 20
Composto 20 é preparado de uma forma similar ao Compo£ to 5.
Preparação do Composto 18
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-58— 3
Dissolve-se alfa-naftol (0,3515 g; 2,44x10 mole) em ml de CH Clo, e arrefece-se a solução resultante a 02C. Adi, ciona-se cloreto de acetilo (0,26 ml 5 3,66x10” mole) com agi.
tação seguindo-se uma adição lenta, gota a gota, de trietilami na (1,02 ml; 7,32x10”^ mole). Forma-se rapidamente uma grande quantidade de um precipitado que pára a agitação. Adicicnam-se mais 5 ml de CH^C^ e deixa-se a solução aquecer até à temperatura ambiente.
Por cromatografia de camada fina em silica usando hexano/CH2Cl2 (1/1) como solvente, iniciada 5 minutos após a última adição de CH2C12, verifica-se não estar presente material de partida.
Adiciona-se acetato de etilo à mistura reaccional e extracta-se a mistura resultante com bicarbonato de sódio aquoso, HC1 0,5 M e depois com cloreto de sódio aquoso saturado. Seca, -se depois a fase orgânica com sulfato de sódio. Após purificação por cromatografia em coluna, obtém-se 63 mg de un líquido claro; rendimento = 42%.
RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz (em relação ao TMS como padrão interno): 8,0-7,2 (multipleto, 7H), 2,45 (singuleto, 3H).
Preparação do Composto 19
Dissolve-se ácido 4-N-acetilfenilacético (0,00030 g; 1,55x10 mole) em 5 ml de metanol. Adiciona-se gota a gota uma solução de diazometano em éter etílico até à solução resul. tante ficar amarela após a adição. Faz-se passar a mistura reaccional por leitos de resina de permuta catiónica na forma
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-59H+ até a solução ficar incolor.
Remove-se o solvente in vacuo obtendo-se um sólido brari co que pesa 0,032 g (100% de rendimento). Por TLC em sílica usando CH2Cl2/EtoAc como solvente verifica-se ter sido a reacção completa não restando material de partida.
RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz (em relação ao TMS como padrão interno): 7,2 (dupleto, 0=7,7 Hz, 2H), 6,8 (dupleto, 0=7,8 Hz, 2H), 3,95 (S, 3H), 3,2 (S, 2H).
Procedimento geral para a preparação de amidas ligandos substrato
Arrefece-se uma solução agitada de diclorometano (20 ml) do ácido carboxílico (10 mmoles), trietilamina (20 mmole) e de amina (10 mmole) a ÍOBC, e adiciona-se B0P-C1 (10 mmole). A dissolução ocorre tipicamente em 30 minutos a 25^0. Agita-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 1 hora. 0 progresso da reacção é seguido por TLC em silica usando EtoAc/ /CH2C12 como solvente. Sob estas condiçães o Composto 14 tem um valor de R^ de 0,6.
*
A mistura reaccional adiciona-se água (20 ml) e HC1 4F. por forma a obter-se um valor de pH de 1-1,5. A amida precipi. tada é removida por filtração. Lava-se a fase orgânica resta£ te com uma solução de bicarbonato de sódio, e evapora-se depois por forma a obter-se mais amida produto. Por cromatografia flash em sílica com o solvente da TLC obtém-se o produto purificado.
Composto 14
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-60Rendimento = 51/. RMN de protão em CDCl^ a 100 MHz (em relação ao TMS como padrão interno): 10,0 (singuleto largo, 1H), 8,7 (multipleto, 1 H), 8,0 (multipleto, 1H), 7,6-7,1 (mui. tipleto, 8H), 3,95 (singuleto, 2H), 2,6 (singuleto, 3H), 2,2 (singuleto, 3H).
composto 15 é preparado de forma análoga
Preparação do cloreto de succinimidiladipoílo (agente de acoplamento)
Aquece-se uma solução do éster de monometilo do ácido adípico (5,4 g, 33,3 mmole) em cloreto de tionilo (15 ml) a 409C durante 2 horas. A mistura é então concentrada e destila da in vacuo (ponto de ebulição 1195C a 20 mm Hg) obtendo-se 3,58 g (60/ de rendimento em peso) do éster de metilo do clore to de ácido. Dissolve-se este em 20 ml de diclorometano e adj. ciona-se N-hidroxissuccinimida (2,75 g, 24,0 mmole) e trietilamina (4,2 ml; 30 mmole). Agita-se a mistura durante 10 minu tos e dilui-se depois com acetato de etilo e lava-se com HC1 0,5 M e salmoura. Seca-se a solução com sulfato de magnésio anidro, filtra-se e concentra-se por forma a obterem-se 4,5 g (87,5/ de rendimento em peso) de adipato de metilsuccinimidilo na forma de um óleo incolor.
RMN de protão (em CDCl^): delta 3,73 (singuleto, 3H); delta 2,90 (singuleto, 4H), delta 2,70 (multipleto, 2H), delta 2,37 (multipleto, 2H), e delta 1,79 (multipleto, 4H).
Aquece-se ao refluxo uma solução de adipato de metilsuç.
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-61cinimidilo (4,5 g, 17,5 mmole), clorotrimetilsilano (11,1 ml, 87,5 mmole) e iodeto de sódio (13,1 g, 87,5 mmole) em 10 ml de acetonitrilo, durante 12 horas. Arrefece-se então a mistura até à temperatura ambiente e dilui-se com acetato de etilo. Lava-se repetidamente a mistura reaccional com bissulfito de sódio aquoso a 5% até a solução orgânica ficar incolor. Lava-se então a mistura com salmoura, seca-se com sulfato de magné sio anidro, filtra-se e concentra-se, obtendo-se 3,2 g (71% de rendimento em peso) do éster de monossuccinimidilo do ácido adipíco na forma de um sólido branco.
RMN de protão (em CDCl^): delta 3,90 (singuleto, 4H), delta 2,70 (multipleto, 2H), delta 2,4 (multipleto, 2H), delta 1,80 (multipleto, 4H).
Aquece-se uma mistura do éster de succinimidilo do ácido adípico (1,00 g, 3,80 mmole) e de cloreto de tionilo (5 ml) a 40SC durante 3 horas, arrefece-se depois até à temperatura ambiente e concentra-se in vacuo. Agita-se várias vezes o resíduo com hexano anidro, separa-se □ óleo e seca-se in vacuo por forma a obterem-se 0,97 g (90% de rendimento em peso) de cloreto de succinimidiladipoílo. Dissolve-se este em tetra-hidrofurano por forma a ter-se uma solução 5 molar, solução esta que é usada como tal na preparação de compostos adequadas, para acoplamento com proteínas transportadoras.
RMN de protão (em CDCl^): delta 3,00 (multipleto, 2H), delta 2,90 (singuleto, 4H), delta 2,70 (multipleto, 2H), delta 1,80 (multipleto, 4H).
Os conjugados proteicos com os Compostos 1 e 4 fosfonato preparam-se por adição de 0,5 mililitros (ml) de uma solução do fosfonato em água fria (2 miligramas (mg)/ml) para 1,0 ml de uma solução de proteína (KLH ou BSA, 5 mg/ml) em tampão fosfata de sódio (pH 7,2, 0,2 M), agitando suavemente durante 2 horas a 42C.
A introdução de um grupo trifluoracetilo no aminobenzil fosfonato de Compostos 1-4, simplifica ainda os passos da síntese nos quais se requer cloreto de fosfonilo. 0 grupo ácido
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dipicolínico dos Compostos 2 e Δ facilita uma interacção de li gação adicional, entre um anticorpo e o grupo fenôlico destas estruturas.
Os ésteres de nitrofenilo de p-trifluoracetamidDbenzilfosfonatos são úteis como intermediários na sequência de acopla mento dos haptenos a proteínas transportadoras, por redução do grupo nitro a uma função amino, e acilação desta com um deriva, do do ácido adípico heterobifuncional tal como o cloreto de succinimidiladipoílo, como aqui se descreve. 0 grupo éster aç. tivado de N-hidroxissuccinimidilo no anel fenôlico (Compostos 2 e 4.) permite o acoplamento eficaz a proteínas transportadoras (KLH ou BSA) em soluções aquosas tamponadas.
Similarmente prepara-se e utiliza-se o cloreto de succi nimidilglutaroílo.
IV. Preparação de conjugados e de inóculos
Podem preparar-se conjugados de moléculas hapténicas de ligandos análogos, com proteínas transportadoras tais como a KLH (keyhole limpet hemocyanin) hemocianina da lapa do género Fissurela, por exemplo, por activação do transportador com um agente acoplante tal como o MBS (éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida), e acoplamento ao grupo tiol do li gando análogo. Ver, por exemplo, Liu et al., Biochem., 80, 690 (1979). Tal como é também bem conhecido na arte, é muitas vezes vantajoso ligar um composto ao seu transportador utilizando um intermediário, i.e., um grupo ligante.
São bem conhecidos na arte transportadores úteis que são geralmente as próprias proteínas. Exemplos de tais transportadores são a hemocianina de lapa do género Fissurela, a edestina, a tiroglobulina, albuminas tais como a albumina de soro de bovino ou a albumina de soro humano (BSA ou HSA, respectivamente), glóbulos vermelhos tais como os eritrócitos de ovino (SRBC), toxoide do tétano ou toxoide da cólera, bem como ácidos poliamino tais como o ácido poli-(D-lisina:D-glutâmico), etc..
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-63A escolha do transportador está mais dependente do uso final pretendido do antigénio do que da parte determinante do antigénio, e ê baseada em critérios não particularmente envol. vidos no presente invento. Se o conjugado se destina a ser usado em animais de laboratório por exemplo, deverá ser seleccionado um transportador que não provoque no animal particular nenhuma reacção inconveniente.
Dissolve-se ou dispersa-se o conjugado transportador-hapteno numa composição aquosa de um diluente fisiologicamente tolerável, tal como solução fisiológica normal, PBS ou água esterilizada, por forma a preparar um inóculo. Pode também in cluir-se no inóculo um adjuvante tal como o adjuvante completo ou incompleto de Freund, ou alúmen. Introduz-se o inóculo por injecção no animal utilizado para gerar os anticorpos numa quantidade suficiente para, como é conhecido, induzir anticorpos .
A partir dos ésteres fosfonato prepararam-se exemplos de conjugados imunogénicos adaptando as suas sínteses por forma a incorporar, no grupo fenólico, uma cadeia linear de átomos de carbono (parte álcool do éster ligando análogo) como elemejn to de espaçamento. Prepararam-se outros exemplos de conjugados imunogénicos a partir de fosfonamidas adaptando estas sínteses por forma a incorporar, como elemento de espaçamento na parte ácida do ligando análogo, a cadeia linear de átomos de carbono. Concluiu-se que a cadeia flexível de átomos de carbo no de um apêndice adipato ou glutarato reduz qualquer diminuição de imunorreactividade devida ao constrangimento de conformação imposto pela ligação covalente à proteína transportadora. 0 reagente bifuncional preparado com este propósito deixa também livre um grupo carboxilo pré-activado para ligação, via formação de uma ligação amida, com os resíduos lisina do trans portador. 0 método particular de acoplamento usado neste estu do é ainda aqui descrito. Os ésteres fosfonato foram acoplados a hemocianina de lapa do género Fissurela através do grupo amino da parte fenólica da estrutura.
De acordo com o presente invento, o agente de ligação
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-64intermediário é preferivelmente cloreto de succinimidiladipoílo ou glutaroílo preparados como anteriormente se descreveu.
V. Preparação de Receptores Monoclonais
Usaram-se os conjugados KLH anteriores para imunizar ra tinhos (estirpe 129G1X+), e obtiveram-se anticorpos monoclonais tal como é descrito por Niman et al., Proc. Natl, flcad. Sei. USA, 77, 4524 (1980) e N iman et al., em Monoclonal Antibodies and T-Cell Products, ed., Katz, D.H., 23-51 (CRC Press, Boca Raton, FL 1982). Os linfócitos utilizados para preparar os hi bridomas de acordo com o presente invento podem ser obtidos a partir de qualquer mamífero, tal como um primata, roedor (p.e., ratinho ou ratazana), coelho, cobaia, vaca, cão, ovelha, porco, etc.. Como é apropriado, o hospedeiro pode ser sensibilizado por injecção do imunogénio, neste caso um ligando análogo hapténico, seguida de uma injecção de reforço, após o que o ba ço é isolado.
Prefere-se que a linha de cálulas mieloma seja da mesma espécie que os linfócitos. Deste modo, utilizam-se tipicamente híbridos fundidos tais como híbridos ratinho-ratinho Shul man et al., Nature, 276, 269 (1978)_7 ou híbridos ratazana-ratazana /~Galfre et al., Nature, 277, 131 (1979)_7. Contudo, na preparação de hibridomas, tem também sido utilizados com su cesso híbridos ratazana-ratinho /”Goding, Production of Monoclonal Antibodies by Cell Fusion, em Antibody as a Tool, Marchalonis et al., eds., Oohn Wiley & Sons Ltd., p. 273 (1982)_7. Linhas de mieloma adequadas para utilização no presente invento incluem MPC-11 (ATCC CRL 167), P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580), Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581), P3 X 63 Ag8U.l (ATCC CRL 1597), Y3-Agl.2.2. (depositado no Collection Nationale de CuJL tures de Microorganisms, Paris, França, número 1-078) e P3X63Ag8 (ATCC TIB 9). Para utilização no presente invento prefere-se a linha de mieloma murino não segregadora, Sp2/0 ou Sp2/0-Agl4.
As células de hibridoma finalmente preparadas podem cul tivar-se, como é bem conhecido, de acordo com as técnicas usuais de cultura in vitro de tecidos, aplicadas a estas células.
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-65Mais preferivelmente, cultivam-se as células de hibridoma em animais, usando técnicas igualmente bem conhecidas, obtendo-se os receptores monoclonais a partir do fluído ascítico assim qe rado. Os animais utilizados para gerar o fluído ascítico foram ratinhos fêmea 129G1X criados na colónia de ratinhos da Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, Califórnia, E.U.A.. Porém quando se utilizam outros animais sem serem ratinhos para a preparação dos hibridomas, podem usar-se ratinhos ou esses animais para a preparação de fluído ascitíco.
Em particular, preparou-se, de acordo com a tecnologia convencional de preparação de hibridomas de Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975), um exemplo de um receptor monoclonal.
4*
Especificamente, imunizaram-se ratinhos fêmea 129G1X por injecção intraperitoneal com um inóculo de 100 microgramas de conjugado (p.e., Composto 4. ligado a KLH) em 300 microlitros de uma mistura 1:1 de solução fisiológica tamponada com fosfato (PBS) a pH 7,4, e de adjuvante completo de Freund. Duas s_e manas mais tarde, injectaram-se de novo os ratinhos de um modo análogo com 50 microgramas do conjugado anterior em 300 microlitros de uma mistura 1:1 de PBS (pH 7,4) e de uma solução de alúmen 10 mg/1. Após um período adicional de seis semanas imu nizaram-se os ratinhos intravenosamente com 50 microgramas do conjugado em 200 microlitros de PBS (pH 7,4). Removeram-se os baços dos ratinhos 4 dias depois e fundiram-se as células do baço com células de mieloma.
Reuniram-se as células dos baços num recipiente e prepja rou-se uma única suspensão de células. Fundiram-se então as células de baço nucleadas (1,4x10 ) com 3x10 células mieloma Sp2/0 não segregadoras, na presença de um promotor da fusão ce lular (polietilenoglicol 2000). Seleccionou-se o hibridoma que produz um anticorpo monoclonal particular semeando as célu las de baço em placas de 96 cavidades e cultivando-as em meio Eagle de Dulbecco modificado (DMEM) contendo 4500 mg/litrc de glucose (10%), 10% de soro fetal de vitela (FCS), hipoxantina, aminopterina e timidina (i.e., meio HAT) que não suporta o crejs cimento das células de mieloma não fundidas.
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-66Duas a três semanas depcis colhem-se amostras do sobrenadante anterior do clone de células em cada cavidade e testajm -se num ensaio ELISA (teste de enzima ligado a um imuno-sorveri te, como aqui depois se descreve) para determinar a presença de anticorpos anti-Composto j4. Clonaram-se as cavidades positivas duas vezes, limitando a diluição. Expandiram-se os clones que continuaram a produzir anticorpo específico anti-Composto 4 após duas clonações, para preparar maiores volumes de fluído sobrenadante. Os hibridomas e os receptores monoclonais preparados a partir daqueles e aqui descritos são identificados pelas designações laboratoriais P3 6D4” e P3 8D2, sendo evidente a partir do contexto qual o material particular referido.
Prepararam-se similarmente dois outros receptores monoclonais catalíticos com outra fusão, usando como imunogénio o Composto 2i ligado a um transportador antigénico. Designaram-se essas duas moléculas receptoras catalíticas e os seus hibridomas por P2 50D8 e P2 57G4. Esses dois receptores foram capazes de hidrolisar cataliticamente os Compostos Jj, 9, e 11. Se o Composto 7_ foi ou não cataliticamente hidrolisado, subsistem ainda algumas dúvidas.
Criaram-se similarmente trinta e dois outros hibridomas usando como imunogénio o Composto 13 ligado à KLH como transportador antigénico. Por molécula de KLH acoplaram-se cerca de trinta e cinco moléculas de Composto 13 sendo a eficiência da ligação similar à observada para a SSA.
Um imunogénio deverá ter um tempo de semi-vida de pelo menos dois dias para um valor ambiente de pH sanguíneo por for ma a ocorrer a imunização. Estudos anteriores /~Bartlett et al., 3. Am. Chem. Soc., 103, 654 (1981),7 mostraram que os alquilfosfonamidatos podem ter um tempo de semi-vida de apenas alguns minutos, para uma gama de valores de pH de 2-5, enquanto que para pH 8,5 à temperatura de 59C, a estabilidade parece ser infinita. Verificou-se que o Composto 13 tem um tempo de semi-vida de onze dias à temperatura ambiente para um valor de pH de 7,3. Para valores de pH de 3,5 e 6,2 não se notaram
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-67quaisquer sinais de decomposição.
Hiper-imunizaram-se ratinhos com o conjugado Composto 13-KLH por um período de três a quatro semanas. Os soros foram testados num ELISA usando como antigénio de fase sólida, um conjugado Composto 13-BSA ligado às cavidades da placa de microtítulo. Usando esse ensaio ELISA testaram-se também os hibridomas clonados.
Oito dos trinta e dois receptores monoclonais que imunorreagiram com o Composto 13, hidrolisaram cataliticamente um ou mais ésteres ligandos reagentes. Cada uma dessas catálises pode ser inibida por um ligando análogo apropriado. Assim uma percentagem relativamente alta de receptores monoclonais induzidos foi capaz de catalisar uma reacção esterolítica. Desconhece-se a razão para esta percentagem relativamente elevada de receptores úteis que são induzidos, embora possa ser devida à presença do átomo de azoto do grupo fosfonamidato, quando com parado com átomo de oxigénio de um fosfonato ou com o núcleo quinolina do ligando análogo. Esses oito receptores monoclonais catalíticos e os hibridomas que os segregam são identifica dos pelas designações laboratoriais QPNI 7E5 , QPNI 12C9, QPNI 13E10, QPNI 17G8, QPNI 21G2, QPNI 22F5, QPNI 37G2 e QPNI 44A2. 0 prefixo QPNI é aqui por vezes omitido quando forem referidos estes hibridomas e receptores.
Os hibridomas foram depositados no American Type Cultu re Collection, Rockville, MD, E.U.A. tal como se indica na Ta. bela de depósito de Hibridoma seguinte:
Designação Laboratorial do Hibridoma
ATCC
Data de depósito
P3 6D4 HB 9168 6 de Agosto de 1986
P3 8D2 HB 9169 6 de Agosto de 1986
QPNI 12C9 HB 9500 18 de Agosto de 1987
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Ref: EPG:11-SCRF 43.2
QPN1 44A2 HB 9501 18 de Agosto de 1987
QPN1 7E5 HB 9502 18 de Agosto de 1987
QPN1 13E10 HB 9503 18 de Agosto de 1987
QPN1 17G8 HB 9504 18 de Agosto de 1987
P2 57G4 HB 9505 18 de Agosto de 1987
P2 50D8 HB 9506 18 de Agosto de 1987
QPN1 21G2 HB 9507 18 de A gosto de 1987
QPN1 37G2 HB 9508 18 de Agosto de 1987
qPNl 22F5 HB 9509 18 de Agosto de 1987
Os presentes depósitos foram efectuados de acordo com os requisitos do Tratado de Budapeste que estabelece que a duração dos depósitos deverá ser de 30 anos a partir da data de depósj. to ou de 5 anos após o último pedido de depósito no depositário ou durante a vida executória de uma patente dos E.U.A. de£ de este pedido de patente, adoptando-se o período de maior duração. Os hibridomas serão substituídos à medida que se vão tornando não viáveis no depositário.
E aqui muitas vezes feita referência ao uso dos recepto res preparados, criados ou segregados, a partir do hibridoma P3 6D4. Deverá entender-se porém que podem obter-se e obtiveram-se, resultados comparáveis usando receptores preparados a partir do hibridoma P3 8D2.
Pode também preparar-se um receptor monaclonal do presente invento introduzindo o hibridoma, p.e. por injecção na cavidade peritoneal de um mamífero, p.e. um ratinho. Preferivelmente, tal como já foi referido, usam-se mamíferos singénicos ou semi-singénicos, tal como na Patente dos E.U.A. n^. 4 361 549, cuja descrição é aqui incorporada como referência. A introdução do hibridoma provoca a formação de hibridomas pro dutoras de anticorpos após um período de crescimento adequado, p.e. 1-2 semanas, e tem como resultado uma concentração elevada de receptor produzido que pode ser recolhido da corrente sajn gufnea e do exsudado peritoneal (fluido ascítico) do ratinho hospedeiro. Ainda que os ratinhos hospedeiros tenham também no seu sangue e fluido ascítico os receptores normais, a con66 685
Ref: EPG:11-SCRF 43.2 “y
-69centração de receptores normais é tipicamente apenas de cerca de cinco por cento da concentração do receptor monoclonal.
Pode usar-se o receptor monoclonal presente no sobrenadante do hibridoma sem purificação ou pode recolher-se o recej? tor a partir do fluido ascítico ou do soro do ratinho usando técnicas convencionais, tais como cromatografia de afinidade usando células infectadas com AD 169 ligadas a um imuno-sorveri te tal como a Sepharose 68 ou 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscatauiay, N3, E.U.A.) seguida da eluição do imuno-sorvente com um tampão ácido tal como hidrocloreto de glicina a um valor de pH de cerca de 2,5.
Nos presentes estudos, obtiveram-se tipicamente fracções de IgG a partir do fluido ascitico de ratinho, por precipitação com sulfato de amónio saturado a 45% seguida de cromatografia em DEAE-Sephacel com eluição com cloreto de sódio. Dialisou-se e concentrou-se a fracção que foi eluída com uma concentração de sal 100 mM. Determinaram-se as concentrações de proteína pelo método de Loujry. /~3, Biol. Chem. , 193:265 (1951)_7. As soluço es concentradas resultantes contendo fracções isoladas de IgG foram tipicamente preparadas em soluções de reserva de receptor, a 20 mg/ml usando Tris-HCl (50 mM, pH 6,5) para os receptores segregados pelos hibridomas P3 6D4 ou P3 8D2, e a 4-5 mg/ml usando fosfato de sódio 50 mM (pH 8,0) contendo azida de sódio 0,01 M para o receptor segregado a partir dos hibridomas QPN1 7E5, QPN1 1209, QPN1 13E10, QPN1 17G8, QPN1 21G2, QPN1 22F5, QPN1 37G23 e QPN1 44A2.
VI. Teste de enzima ligada a um imuno-sorvente (ELISA)
A ligação de ligandos e o efeito da modificação química foram testados por ELISA com os anticorpos, numa concentração fixa na gama do seu título, e variando a concentração do reagente ou do ligando. Considera-se que houve inibição se o título é reduzido em 50 por cento para uma razão inferior a 1000:1 de reagente para hapteno.
Os testes realizaram-se em placas de microtítulo de polivinilo de fundo chato (Dynatech, Alexandria, VA, E.U.A.).
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-70Uustrativamente, as cavidades foram revestidas com uma solução compreendendo o Composto 4 ligado a BSA como antigénio em solução salina tamponada com fosfato (PBS) usando 50 microlitros de solução por cavidade. Os ligandos foram revestidos a 1 micrograma por mililitro, Incubaram-se então as placas de um dia para o outro a 379C numa estufa seca. Armazenaram-se as placas secas a 49C até serem utilizadas. Antes do teste ELISA re-hidrataram-se as placas secas com duas lavagens de 2 minutos cada, com PBS 10 milimolar (mM), pH 7,4, contendo 0,1% de sorbitano monolaureato de polioxalquileno (20) (tiueen 20) e 0,02% de Thimerosal (etilmercuritiosalicilato de sódio), (Sigma, St. Louis, M0, E.U.A.).
Por forma a reduzir a ligação não especifica, diluiram-se os sobrenadantes do hibridoma de 1:2 em tampão de lavagem contendo 0,1% de BSA, como diluente. Adicionaram-se depois a cada cavidade 50 microlitros de sobrenadante de hibridoma diluído e incubou-se durante 1 hora a 49C num agitador rotativo para pôr em contacto o sobrenadante contendo os anticorpos monoclonais, com o Composto 4 ligado. Após duas lavagens de 2 minutos cada, adicionaram-se a cada cavidade, 50 mililitros de IgG+IgM de cabra anti-ratinhc marcado com peroxidase (Tago Bur lingame, CA, E.U.A.) diluído de 1:1000, e incubou-se a mistura reaccional a 49C durante 1 hora para ligar o anticorpo marcado ao anticorpo monoclonal ligado.
substrato usado para testar a actividade da peroxidase ligada foi preparado exactamente antes de ser utilizado e consistiu em 400 microgramas/ml de .o-fenilenodiamina (Sigma, St. Lcuis, M0, E.U.A.) em tampão citrato-fosfato 80 mM, pH 6,0, contendo 0,12% de H202. Após duas lavagens finais adicionaram -se, a cada cavidade, 50 microlitros de solução de substrato, e deixou-se desenvolver a cor durante 15 minutos no escuro. Pa, rou-se o desenvolvimento da cor por adição de 25 microlitros de H-^SO^ 4 molar (M) a cada cavidade e mediu-se a densidade óptica a 492 nanometros (nm) com um leitor de placas Multiskan ELISA. Verificou-se que os anticorpos criados para o Composto 4 imunorreagiram (ligaram-se) com o ligando análogo, o mesmo
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Ref: EPG:11-SCRF 43.2 acontecendo com os anticorpos policlonais criados para o Composto 13 que imunorreagiram com esse ligando análogo.
VII. Ensaios Hidrolíticos e Determinações Cinéticas
Determinou-se a clivagem de éster para ligandos reagentes tais como os Compostos 5. e 20 por medição do aumento na fluorescência devido à produção de 7-hidroxicumarina e de 4-me til-7-hidroxicumarina. Operou-se com um espectrofotómetro de fluorescência Perkin-Elmer LS-5 a um comprimento de onda fixo, usando 355 nanémetros (nm) para excitação e medindo a emissão a 455 nm. Preparou-se uma solução de reserva do éster de cuma rina 2 em dioxano e diluiu-se, para as concentrações desejadas, em Tris-HCl (50 mM, pH 7) ou fosfato de sódio (50 mM, pH 4-9).
As reacções foram conduzidas a 232C e iniciadas pela adição de uma alíquota de solução de anticorpo (1 mg/ml) às so luções de substrato, por forma a obter-se uma concentração final de proteína de 100 mM. Determinaram-se os valores finais de fluorescência por hidrólise do substrato com esterase de fí gado de porco. Corrigiu-se a velocidade observada da reacção por forma a ter em conta a hidrólise espontânea. A cinética da reacção fci estudada medindo as velocidades iniciais sob condições de pseudo-primeira ordem. No fim da reacção extrapçi lou-se a concentração de proteína activa a partir dos valores de fluorescência. Os parâmetros cinéticos foram obtidos ajustando os dados obtidos a uma curva hiperbólica e a partir de representações duplamente recíprocas. As constantes de inibição foram determinadas a partir da representação de Lineiueavex -Burk dos dados usando pelo menos cinco concentrações de inibi, dor. Todos os valores foram estudados por teste dos mínimos quadrados.
Analisou-se a clivagem de amida para os Compostos 14 e 15 pela determinação da produção de aminoquinaldina ou aminonaftaleno medindo o aumento no corante azo que resulta da trans. formação da aminoquinaldina livre ou do aminonaftaleno com um reagente de diazotação.
Conduziu-se a catálise das reacções preparando uma misΒ
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-72tura reaccional de 100 microlitros (yd.) de volume total contejn do, anticorpo monoclonal 5 micromolar (y<M), substrato amida l_i gando reagente, 50-75 ytM, e um tampão que aqui depois se descreve. 0 tampão incluído na mistura anterior variou, dependeri do do pH utilizado, como se segue: pH 5, acetato de sódio 10 milimolar (mM), cloreto sódio 10 mM; pH 7,2, fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 0,15 molar (M); pH 8,0 fosfato de sódio 50 mM. Adicionaram-se os substratos contendo amida, analjL sados neste ensaio, à mistura anterior numa quantidade de 1 yd. de uma solução de reserva 100 vezes concentrada, de dimetilfor.
te mamida (DMF), A mistura anterior adicionou-se anticorpo monoclonal de uma solução de reserva concentrada. Colocou-se a mistura resultante na cavidade de uma placa de microtitulo de fundo plano de 96 cavidades (Costar, Cambridge, MA, E.U.A.) e manteve-se numa câmara ambiente de vapor húmido a 235C. Anali sou-se então a produção de aminoquinaldina ou aminonaftaleno, 2, 3, 5 ou 6 dias depois, como a seguir se descreve.
Mediu-se o produto aminoquinaldina ou aminonaftaleno produzido pela reacção catalisada, misturando primeiro 20 y^l de HC1 5 M, 80 yd de acetona e 10 ytil de nitrito de sódio a °,5/ (p/v) com a mistura reaccional para preparar uma segunda mistura e mantendo essa segunda mistura durante 3 minutos à temperatura ambiente. Adicionaram-se depois 10 yd. de sulfama to de amónio a 2,5/ (p/v) para formar uma terceira mistura que foi mantida durante 2 minutos à temperatura ambiente. Adicionaram-se ainda mais 10 yd. de di-hidrocloreto de N-(l-naftil)etilenodiamina a 0,5/ (p/v) para formar uma quarta mistura que foi então mantida durante 15 minutos à temperatura ambiente. Mediu-se depois o corante azo resultante presente na quarta mistura, por espectroscopia de absorvância a 540 nanometros (nm) para determinar a aminoquinaldina usando um Leitor Automá tico de microplacas, Modelo EL 309 (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, E.U.A.).
Usando este teste pôde observar-se a presença de aminoquinaldina 10 ytM à vista desarmada. Com o leitor automático de microplaca puderam detectar-se quantidades nanomolares.
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VIII. Modificação e Inactivação de Proteínas
Inactivaram-se preparações de anticorpos sem a introdução de produtos fluorescentes, pela adição do éster actiuado (Composto 8.) em dioxano a uma solução do IgG (5 mg/ml) em Tris-HCl (50 mM, pH 6,5) numa proporção de 5 moles do éster (Composto 8.) por mole de IgG. A perda de actividade foi confirmada por reacção com o éster de cumarina (Composto 5,).
De uma forma análoga realizou-se a modificação da prote_í na, por adição ao anticorpo de uma solução do reagente de concentração conhecida. Incubou-se a solução durante 30 minutos antes da filtração através de Sephadex G-25. Comparou-se a aç, tividade restante com amostras de controlo. Diluiram-se alíquotas de IgG (5 mg/ml) inactivados com o éster (Composto 8.), com quatro volumes de tampão fosfato (50 mM, pH 4-9, em intervalos de 1 unidade de pH). Registou-se qualquer variação de pH e armazenou-se a amostra a 4SC durante 24 horas. Verificojj -se a actividade por diluição de cada amostra em 50 volumes de uma solução de éster de cumarina (Composto 5.) em tampão fosfato 0,2 M a pH 7, e comparou-se a velocidade de hidrólise com as amostras controlo.
IX. Anticorpos monoclonais seleccionados por testes imunológicos e esterolíticos
Ainda que possam usar-se receptores policlonais, o presente invento utiliza preferivelmente receptores monoclonais. Um receptor monoclonal constitui uma fonte contínua de uma imu noglobulina uniforme com uma dada especificidade. A não utili zação de anticorpos monoclonais origina muitos obstáculos em virtude da variedade de respostas imunológicas que tornam muito difícil a reprodução de resultados /~C. Milstein, Sçjence, 231, 1261 (1986)_7.
A estratégia desta investigação consistiu em gerar tantas especificidades clonais únicas quanto possível, a partir de um dado protocolo de imunização e seleccionar inicialmente a partir destas, algumas para ensaios de imuno-reactividade. Para os testes esterolíticos consideraram-se apenas aquelas cé
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-74lulas hibridoma produtoras de anticorpos de título significati vo. Assim, numa preparação típica identificaram-se inicialmejo te, numa experiência de fusão particular usando o Composto 4i como imunogênio, 50-100 clones segregando o anticorpo anti-hapteno. As culturas de cerca de dois terços destes clones não eram viáveis. Os restantes foram subclonados e determinou, -se o seu isotipo. Propagaram-se os hibridomas produzindo um título significativo (superior a 1:64) de IgG, em ascite de tumores, para produzir o anticorpo em grande quantidade [_ Niman et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Products, D. H. Katz, ed. (CRC, Boca Raton, FL, 1982), pag. 23-51_/.
Para os ensaios esterolíticos de fluorescência, o substrato designado para o teste de esterólise foi baseado na grajn de diferença na fluorescência da 7-hidroxicumarina ou da 4-metil-7-hidroxicumarina, e dos seus derivados acilados. A varia, ção de fluorescência resultante da hidrólise de ésteres de cumarina é facilmente detectável em concentrações nanomolares. 0 carácter fenólico do anel cumarina permite que este se acomode no local de ligação do hapteno, quando se usou como imunogênio um derivado fenol como o Composto 4i» ou quando se usou como imunogênio um composto de dois anéis, tal como um quinolino-dje rivado como o Composto 13.
éster de trifluoroacetamidofenilacetilo comportou-se deste modo e exibiu intensidades de fluorescência a 455 nm (ex. citação a 355 nm) proporcionais ao grau de hidrólise. A interi sidade de fluorescência da 7-hidroxicumarina ê dependente do pH, aumentando subitamente acima de pH 7,0. A gama prática de pH para o ensaio ê limitada pela rápida velocidade espontânea de hidrólise de um éster, Composto 5., que ocorre acima de pH 8,0. Inicialmente usou-se o éster numa concentração cerca de quatro vezes superior à da proteína e incubou-se a mistura a pH 7,2 durante 10 minutos. Notou-se qualquer variação na fluo rescência acima da fluorescência residual.
Num estudo testaram-se vinte e oito anticorpos monoclonais anti-hapteno para o fosfonato 2i, resultantes de dois ensaios de fusão diferentes. Nenhum destes era reactivo com o
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-75éster de cumarina (Composto 5.) de acordo com o teste de fluores. cência. Do mesmo modo se testaram anticorpos para o Composto 4i como hapteno. Analisaram-se vinte globulinas gama, como a_n teriormente se descreve. 0 Composto 5_ é homólogo apenas no grupo acilo deste hapteno maior: contudo todas, menos três, reagiram cruzadamente num teste ELISA, com o fosfonato mais pe. queno 2, tal como aqui se descreve. Para duas destas observou, -se uma variação de fluorescência, que ocorreu nos primeiros 5 minutos de incubação, que corresponde a cerca de 50 por cento da que se observa para a hidrólise completa. A velocidade resj. dual de hidrólise foi restabelecida após esta diminuição inici al da velocidade da reacção.
Assim o éster simples, o Composto 5., foi pelo menos sufi ciente para a identificação destas actividades usando a técnica de fluorescência. Esta não identifica porém rigorosamente a existência de outras actividades, que podem ter especificidades estruturais mais restritas, que não incluem os ésteres de cumarina. Este aspecto é demonstrado nos estudos seguintes para o receptor monoclonal P3 6D4.
X. Centro de combinação do receptor monoclonal P3 6D4: Transacilação dirigida de esteres activados
A· Transacilação para proteína
Anteriormente descreveu-se a natureza da hidrólise media da por este anticorpo, incluindo a especificidade e a cinética da reacção. A estequiometria da reacção e o comportamento quí. mico dos produtos conduziu à hipótese de que da transacilação do éster para um grupo nucleófilo no centro de combinação se forma um anticorpo acilado estável.
A produção de 7-hidroxicumarina, aumentada pelo anticor. po, por esterólise de derivados acilados é única para o triflu. oracetamidofenilacetilo, Composto 5. 0 prodcessc não é detectado para um éster de cumarina com a diferença estrutural, ap.a rentemente sem importância, de um grupo metilo em substituição do grupo trifluormetilo do Composto 5.. A reacção não é presumivelmente definida por este grupo rejeitado, uma vez que o és.
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ter reactivo de N-hidroxissuccinimida (Composto ,6) também se combina com anticorpos para produzir um produto inactivc. 0 fim da reacção é notado pelo retorno do aumento da velocidade de fluorescência ao nível residual. A variação absoluta na fluorescência é proporcional à quantidade de proteína adicionada. Quando esta concentração é conhecida independentemente do ensaio de Louiry /~Loujry et al., 3. Biol. Chem., 193, 265 (1951)_7 e se pressupõe ser o peso molecular médio de uma IgG de 150000, a estequiometria é consistente com a reacção de uma mole de éster por mole de centro de combinação. A reacção decorre de acordo com uma cinética de segunda ordem e a velocidja de inicial mostra como que uma saturação da enzima.
As observações preliminares incluíram também uma depen dência da velocidade do pH. 0 aumento modesto na velocidade de pH 8,0 versus pH 7,0 sugeriu a ionização de um centro activo, base ou nucleófilo. Uma vez que se recuperou uma proteína activa por exposição do produto inactivo a altos valores de pH ou a hidroxilamina, este produto foi formulado como sendo uma proteína quimicamente modificada na qual está acilado um resíduo específico do centro de combinação. A capacidade dos ligandos análogos fosfonato (Compostos li e 3i)para bloquear esta reacção é demonstrada pelas suas constantes de inibição. As constantes de inibição para estes dois inibidores (Compstos li e 3i), na reacção estequiométrica com o Composto 5., foram est_i madas em 100 nM e 35 nm, respectivamente. Por outro lado, na reacção catalítica observada com o Composto Ί_ι estes compostos têm constantes de inibição de 0,80 micromolar (hN) e 0,16 respectivamente
Além disso, verificou-se a inactivação da proteína por reagentes específicos de tirosina e histidina. Os haptenos são também capazes de bloquear esta inactivação. Não é possível distinguir entre a existência de um acilimidazole ou de uma aciltirosina, por tratamento do produto de transacilação, quer com tetranitrometano, quer com dietilpirocarbonato, seguida de desacilação a pH 9,0. A proteína acilada é protegida da inactivação irreversível por outro reagente. Isto pode significar simplesmente que as interacções covalentes e não cjo
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valentes do grupo acilo, são suficientes para impedir no centro de combinação, tanto a carboetoxilação da histidina como a nitração da tirosina.
A intenção original que está por detrás do uso do hapte no contendo ácido dipicolínico, foi a de determinar se esse li gando seria imunologicamente reconhecido como um quelatc metálico Reardon et al., Nature (London), 316, 265 (1985)_Z* Ain da que não se tenha feito qualquer tentativa para impor a coor denação do ião metálico ao conjugado hapteno-transportador como imunogénio, permanece a possibilidade de um anticorpo anti-hapteno poder aceitar a forma de quelato. Assim, investigou-se o efeito da adição de ácido picolínico e de zinco, na este rólise aumentada pelo anticorpo com o reagente cumarina (Composto 2)· Não se observou qualquer efeitona reacção principal, com zinco e ácido picolínico adicionados até 100 micromolar. 0 envolvimento de iões metálicos vestigiais foi excluído pelo facto de o EDTA adicionado não afectar a reacção.
A hipótese de trabalho que fci proposta para o mecanismo de transacilação tem em conta as implicações do envolvimento da histidina e a formação aparentemente anormal de uma liga ção covalente entre o ligando reagente e o anticorpo. Uma vez que o éster fosfonato não sugere qualquer mecanismo covalente, o mecanismo observado pode representar um desvio ao percurso reaccional mecanístico esperado, que é resultado da escolha particular do substrato usado para estudar a actividade. 0 pa pel catalítico da histidina como nucleófilo aludiria à dualida, de catalítica nucleófilo/ácido-base observada para o imidazcle /~Bender et al., The Bioorqanic Chemistry of Enzymatic Catalysis, p. 150, (Wiley, Netu York, 1984)_/. Para o imidazole essa escolha de mecanismo é determinada pela basicidade do grupo re jeitado na transacilação. No contexto de um centro activo, quando a estrutura da proteína fornece o imidazole, esta alte.r nativa mecanística manifestar-se-ía como sendo uma catálise, covalente ou não covalente, pela enzima. A demonstração deste facto requereu a modificação do éster substrato para modificar a basicidade do fenolato expelido na reacção (o grupo rejeitado) mantendo-se a analogia estrutural correcta para a ligação.
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-78B. Actividade da esterase: Transacilação para o solvente
A estrutura do grupo rejeitado sugerida para o ligando análogo (ou hapteno) é o anel fenólico di-substituído, com um substituinte para abreviado, a ocupar a posição do apêndice de acoplamento. Nos inibidores ligando análogo hapténicos livres (Compostos li e 3i) usou-se para substituir esta ligação, o grupo acetamida, 0 reagente ligando substrato análogo teria o 2-picolinilcarboxamidometil-4-acetamidofenol como grupo álcool do éster.
Como primeira tentativa preparou-se o éster de 4-acetamidofenol (Composto 2) que & análogo ao fosfonato (Composto li). A ausência de um substituinte orto estruturalmente significati vo pode diminuir o potencial de ligação do éster, mas não deve, rá afectar drasticamente a reactividade química da ligação éster. A diferença na ligação pode ser estabelecida por compara ção das constantes de inibição do fosfonato (Compostos li ou 3i) que diferem nesta unidade estrutural. Como se indica na Secção X(A), as constantes de inibição para os dois inibidores (Compostos li e 3i) foram estimadas em 100 nM e 35 nM, res. pectivamente, na reacção estequiométrica com □ Composto 5.· Na reacção catalítica observada com o Composto 2» estes compostos têm constantes de inibição de 0,80 micromolar e 0,16 micromolar, respectivamente. A esta estrutura se deve uma contribui, ção na ligação de talvez uma ordem de magnitude.
A falta de distinção espectroscópica entre estes ésteres e os seus produtos de hidrólise recomendou uma análise cro matográfica do processo. Em relação à figura 3, analisou-se ao longo do tempo uma mistura do Composto 2 (Sj/M) e do anticorpo monoclonal do hibridoma P3 6D4 (O,1JUM) em tampão fosfato (50 mM; pH 8,0), por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). A hidrólise acelerada do éster é demonstrada pela diminuição do seu pico e pelo aumento simultâneo de dois novos picos que correspondem aos produtos esperados. Sob estas condições, o éster é completamente consumido em 60-80 minutos, pe. ríodo durante o qual a velocidade residual considera cerca de
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-7912 a 16 por cento de hidrólise. 0 perfil cromatográfico é o mesmo que o obtido por tratamento com esterase de fígado de porco. Os anticorpos não específicos, ou os anticorpos anti-hapteno, que eram inactivos na reacção estequiométrica com o éster de cumarina (Composto 5.) não demonstram esta capacidade.
A estreita especificidade do ligando reagente substrato, é verificada pela falha em detectar a hidrólise acelerada em ésteres arilo, com várias variaçães de substituintes nos anéis aromáticos. Em relação à Tabela 1, o éster succinilado (Composto 8.) foi hidrolisado pelo receptor a uma velocidade mais lenta do que a acetamida correspondente (Composto 2)· Com esterase de fígado de porco observa-se também esta diferença de velocidade. Ela pode representar a electrostática desfavorável do succinato carregado interactuando com a proteína ou a desvantagem de ter um ligando hidrofílico ligando-se a um centro de combinação de anticorpo hidrofóbico ou em terminologia de enzimas, a um centro activo. Esteres similares que não são aceites como substratos incluem o Composto 9.» 0 que demonstra a necessidade absoluta do grupo trifluormetilo, tal como também se observou na reacção estequiométrica.
TABELA 1*
Compos to t1/2 (mn) k , c ncat (xlO^seg”1)
Anticorpo (P3 6D4) Esterase
2 16 4 2,8
8 60 52 3,8
9 a 4 0,25
10 a 2b 1,63
11 a 5 6,10
Hidrólise de ésteres carboxílicos por anticorpo monoclonal (a partir de hibridoma P3 6D4) e por esterase de fígado de porco (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EC 3.1.1.1) deter,
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-80minada por HPLC numa coluna analítica RP-C18 (Vydac 218TP54) com eluição isocrática acetonitrilo:água com 0,1% de ácido trifluoracético; (35:65)_7 para um caudal de 1,0 ml/mn e para um comprimento de onda do detector de 245 nm. A concentração inicial de substrato foi de 5 micromolar e a do padrão interno (acetofenona) foi de 10 micromolar, em tampão fosfato 50 mM a pH 8,0. Os tempos de retenção (minutos) foram os seguintes: acetofenona, 5,0; Composto 2> Composto 8., 6,7; Composto 4,1; Composto .10, 11,1 (40 por cento da eluição com ace tonitrilo) ; Composto 11, 8,2. A concentração de anticorpo foi de 15 microgramas/ml (0,1 micromolar) e a de esterase foi de 5,5 microgramas/ml. Manteve-se a mistura reaccional a 259C e analisaram-se alíquotas em intervalos de 2 a 20 minutos. Us.a ram-se três ou mais determinações para representar uma curva a partir da qual se estimou o tempo de meia-vida da reacção (ver Figura 3).
a '
A velocidade de consumo do éster não foi superior a ve, locidade de hidrólise residual.
b A reacção é rápida demais para ser medida por HPLC com exactidão.
c As constantes de velocidade foram determinadas espectrofotometricamente (a 245 nm), medindo as velocidades iniciais para cinco concentrações de éster.
Mais notável é ainda a especificidade conferida pelo grupo acetamido do fenol. 0 éster de fenilo (Composto 10) tem aproximadamente a mesma reactividade que o éster de acetamidofenilo (Composto 7.) e é mais adequado com a estrutura hapténica do que o éster de cumarina (Composto 5,). Ainda aqui de novo, o receptor não teve qualquer efeito na velocidade hidrolítica. 0 éster (Composto 11), no qual os grupos trifluoracetilo e acetilo do Composto 2 s^° interpermutáveis, apresenta a opção única para orientação invertida da ligação éster no centro de ligação, se as similaridades entre os grupos fenólico e benzílico permitirem este tipo de troca. Apesar disso, esta possibilidade não é manifestada pela hidrólise acelerada deste éster. Por outro lado, a hidrólise de todos estes ésteres é
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-81acelerada pela esterase indiscriminada de fígado de porco. A selectividade química é um aspecto destrinçador do anticorpo catalítico e pode ser considerada um reflexo da especificidade de ligação notável de reconhecimento imunológico.
Era desejável preparar o Composto 8. para demonstrar que a velocidade de saturação observada com o Composto Ί. não era uma consequência da sua limitada solubilidade em soluções aquo sas tampão. 0 éster succinilado (Composto 8.) é facilmente solúvel em concentrações até 100 micromolar em tampão fosfato (50 mH, pH 8,0), enquanto que as soluções de Composto 1_ se nam ligeiramente turvas acima de 15 micromolar.
A cinética da reacção foi determinada espectrofctometri camente seguindo a variação na absorção a 245 nanómetros. A velocidade de pseudo-primeira ordem mostra como que uma satura ção do tipo enzima e, tal como se mostra na Figura 4, os ligari dos análogos fosfonato comportam-se, em análises Linemeaver-Burk, como inibidores competitivos. Na Tabela 2 apresentam-se os parâmetros cinéticos obtidos com estes substratos, conjuntamente com as constantes de inibição obtidas com o fosfona to (Composto 3,)· Sob estas condições, a aceleração acima da velocidade residual é cerca de 960 vezes maior para o Composto 7 e cerca de 200 vezes maior para o Composto 8. (corrigida para ter em conta a velocidade de hidrólise residual).
TABELA 2*
Composto K m (x106M) K. 1 (x107M) V K . max cat (xlO^M seg”l) (xlO^ seg”^) Kcat
^ncat
7 1,90 1,60 2,2 2,7 960
8 0,62 0,65 1,0 0,8 210
Os parâmetros cinéticos apresentados na Tabela 2 refe rem-se à hidrólise de ésteres (Compostos 7. e 8.) pelo anticorpo monoclonal P3 6D4. Para medir as variações de absorção a 245 nm, usou-se um espectrofotómetro Perkin-Elmer lambda 4B equipa.
Β 66 685
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do com um suporte de células termoestatizado. As células contendo o substrato em concentrações de 0,5 a 50 micromolar em tampão fosfato (50 mM, pH 8,0) foram pré-equilibradas a 25QC.
A concentração de IgG activo na solução de reserva, foi determinada fazendo-o reagir com o éster de cumarina e medindo o rendimento em hidroxicumarina por fluorescência. Iniciou-se o estudo cinético por adição de umaalíquota da solução de anticorpo de reserva (em tampão fosfato 50 mM, pH 8,0) calculada para se ter uma concentração de IgG 100 nf-ΐ. Deixou-se a mistu ra equilibrar durante 2 a 3 minutos e mediu-se então a velocidade durante os 10 minutos subsequentes. A variação de absorção para a hidrólise completa foi determinada por tratamento com esterase. 0s parâmetros cinéticos foram obtidos a partir de representações de Lineweaver-Burk (ver Figura 4). As constantes de inibição foram determinadas a partir dos declives com pelo menos quatro concentrações de inibidor de Composto J5. Os dados foram analisados por regressão linear.
Os valores de pH para os quais estas determinações foram feitas não são muito provavelmente óptimos. As indicações preliminares sugerem que esta reacção é mais sensível ao valor do pH do que a transacilação com o éster de cumarina anteriormente discutida. A reacção catalítica é praticamente não detectada a pH 7,0. Outros estudos cinéticos podem definir a v.e locidade de aceleração real com estes substratos. Para um éster contendo todos os epítopos do hapteno, incluindo o grupo piconilo, pode esperar-se uma maior diferença na velocidade.
A adição de ácido picolínico ou de ácido picolínico e cloreto de zinco à mistura reaccional de éster, Composto 7, e de anticorpo, não teve qualquer efeito na velocidade observada. Isto sugere, mas não demonstra conclusivamente, que o cejn tro de ligação pode não acomodar simultaneamente dois fragmentos da estrutura hapténica. Essa situação seria extremamente importante para identificar, uma vez que se refere à capacidade das enzimas para se ligarem a mais do que um substrato ou simultaneamente a um substrato e a um cofactor. A presente si tuação envolve presumivelmente uma tal interacção onde uma molécula de água é complementar com o éster no preenchimento do
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C. Mecanismo e Catalise nucleófila versus base geral
As indicações de que uma histidina è crítica para as actividades dos anticorpos esterolíticos constituiu a primeira prova em relação ao mecanismo de transacilação. Está bem esta belecido o carácter nucleofílico do imidazole. Não existe porém qualquer prova de que as enzimas utilizem o grupo imidazole da histidina para a catálise nucleofílica. Por outro lado, a função do grupo imidazole da histidina na catálise ácido-base geral é largamente observada em mecanismos enzimáticos /-C. Walsh, Enzymatic Reaction Mechanisms, p. 43, (Freeman, San Francisco, 1979)__7.
papel duplo do imidazole como nucleofilo e como catalisador básico geral é entendido em termos do mecanismo da hidrólise de ésteres. A transição entre estes mecanismos, é determinada pelas velocidades relativas de formação de produto, a partir de dois intermediários tetraédricos possíveis: o deri vado da adição do imidazole ao grupo acilo versus o resultante da adição de hidróxido. 0 éster de 7-hidroxicumarina relativa mente lábil forma um aducto imidazole que pode facilmente dege. nerar no intermediário acilimidazole por perda do cumarinoalcó xido. Este passo torna-se mais difícil com grupos rejeitados pobres que formam alcóxidos menos estáveis. A 7-hidroxicumari na (pk 8,3) é um grupo rejeitado substancialmente melhor do α
que o 4-acetamidofenol (pkQ 9,9). 0 éster de acetamidofenilo,
Composto 5_> pode deste modo formar um aducto tetraédrico com água ou com hidróxido, cuja quebra é presumivelmente catalisada (ver Figura 5).
Como evidência para a existência de mecanismos separados, determinou-se que o produto da reacção do centro de combi nação de anticorpo com o Composto 5, não é um intermediário na reacção catalítica com o Composto J7. 0 Composto 5. actua de facto como um inactivador específico do catalisador, quando é adicionado a uma mistura do receptor e do Composto 2· Os dois ésteres são diferenciados com uma fidelidade considerável, uma
I
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uez que se observa ser o receptor regenerado várias centenas de vezes com o Composto T. substrato, sem qualquer inactivação apreciável. A catálise pelo receptor por ambos os mecanismos, implica que as interacçoes de ligação podem estabilizar ambos os estados de transição nestes processos de dois passos. Porém, para a tentativa de esquematização apenas o processo bási. co geral é relevante,onde o segundo passo (quebra para formar produtos) é limitativo da velocidade.
A contribuição da ligação para a catálise via este meca nismo básico geral é melhor ilustrada pelo diferente comportamento do éster de 4-acetamidofenilo (Composto 7.) e do éster de fenilo simples (Composto 10). Como grupo rejeitado o fenol (pk 9,89) é equivalente ao 4-acetamidofenol, ainda que a hidrélise do Composto 10 não seja catalisada pelo receptor P3 6D4. A reacção estequiométrica não é aparente, ainda que o Composto 10 tenha a estrutura correcta para o grupo acilo.
Deste modo, ainda que este ligando se possa ligar à pro teína, a interacção não é adequada para expressão da função es. terase inerente. 0 efeito de ligação do grupo acetamida do Composto 2 & suficiente para estabilizar o estado de transição limitativo da velocidade, ou alternativamente para desestabili. zar o intermediário tetraédrico relativo a esse estado de traj-i sição.
refinamento adicional da estrutura do substrato, como na adição do substituinte picolinato, revelará a influência to tal das interacçães de ligação na catálise. Neste sistema, existe a vantagem de os baixos valores de puderem eventualmente confundir a contribuição das interacçães de ligação adicionais na catálise. 0 critério da complementaridade do estado de transição pode assegurar que o valor k tenderá a ser maximizado, enquanto que para um dado valor de k ,/KM a ma ximização da velocidade (k ca|.) depende da pobre ligação de subs. trato (alto K^) /~A. Fersht, Enzyme Structure and Mechanism, 2a ed., págs. 311-346, (Freeman, San Francisco, 1985)_/.
I
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XI. Transacilações dirigidas por centros de combinação de oito receptores monoclonais adicionais
A. Reactividade con ligandos reagentes
Os oito receptores monoclonais denominados 21G2, 7E5, 37G2, 13E10, 1209, 44A2, 17G8 e 22F5 exibem uma variedade de actividades catalíticas. Esta variedade é exibida tanto em relação aos substratos ligando reagente cuja hidrólise catalisam, como em relação às velocidades de hidrólise observadas em relação às velocidades hidrolíticas espontâneas residuais desses substratos ligando reagente.
Na Tabela 3 seguinte mostram-se as reactividades relati vas preliminares para dez substratos.
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-86Β
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A b_ CM
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Hidrólises iniciais preliminares apresentadas como percentagem de ligando reagente misturado, consumido para hidrólise catalisada e espontânea. = NB. hidrólises observado. Todas as reacções se realizaram a pH 8,0 num tampão fosfato 50 mM, excepto onde se indica. As percentagens hidrolíticas foram determinadas por HPLC usando um cromatografo líquido Hitachi modelo 655A-12 com uma coluna 018 Vydac 201TP54, excepto onde a seguir se indica. Como eluente usaram-se mistu. ras de acetonitrilo e água contendo 0,1 por cento de ácido trifluoracético /”28:72-50:50 (v/v)__7. Testaram-se as hidróli ses dos Compostos 5. e 20 usando dados de fluorescência.
Concentrações de moléculas receptoras (Rec.) e de ligandos reagente (Lig.) em unidades micromolar, presumindo um peso molecular de 150 000 dalton para cada molécula receptora.
Ligando reagente (Lig.) usado como substrato.
Tempo em horas que se permitiu que a reacção decorre-se.
Percentagens hidrolíticas espontâneas para o período de tempo indicado.
Reacção realizada a pH 7,2 num tampão fosfato 50 mM.
A correlação da reactividade hidrolítica catalisada com as estruturas dos ligandos reagentes usados como substratos re vela vários aspectos importantes.
Em primeiro lugar, cada um dos oito receptoras monoclonais regeneraram-se e catalisaram, no estudo anterior e noutros estudos, a hidrólise de uma quantidade (em relação ès concentrações de receptor) superior à estequiométrica. Assim, um in termediário relativamente estável, análogo ao que se forma a partir do Composto 5. por reacção com o receptor 3P 6D4, não se formou com qualquer destas oito moléculas receptoras, independentemente do valor de pka do grupo álcool do éster ligando reagente.
Em segundo lugar preferiu-se um grupo álcool de dois
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anéis do eZster ligando reagente em vez de um anel simples, uma vez que todos os receptores catalisaram a hidrólise dos Compos. tos 17 e 5. que continham ésteres de alfa-naftóxilo e de cumari. noxilo, enquanto que cinco dos oito e nenhum dos receptores ca talisaram a hidrólise dos Compostos 22 e .19., respectivamente, que continham ésteres de fenóxilo e de metoxilo.
Em terceiro lugar, um anel fenilo ligado a um átomo de oxigénio que está ele próprio ligado ao átomG central, um átomo de carbono de carbonilo nos ligandos reagente, parece ser um epítopo predominante reconhecido, uma vez que todos os receptores, excepto o 12C9, catalisaram a hidrólise do Composto 18 que tinha um hidrogénio em vez do anel no grupo ácido do és ter e cinco dos oito receptores catalisaram a hidrólise do éster de fenóxilo, Composto 22. Apenas os mesmos cinco receptores catalisaram também a hidrólise do éster de 4-metilcumarino. xilo, Composto 20.
Em quarto lugar, nenhum dos receptores catalisou a hidrólise de qualquer das amidas, Compostos 14 e 15. A razão pa. ra esta falta de reactividade é desconhecida e está a ser examinada.
Em quinto lugar, as substratos de ligando reagente com um átomo de azoto, na posição gama em relação ao átomo de oxigénio nos grupos álcool dos ligandos reagente éster, foram incapazes de reagir; i.e., Compostos 16 e 22. Este facto foi surpreendente tendo em conta a excelente reactividade exibida pelo éster de cumarinoxilo isoestrutural e pelo éster de c<-nafta lenoxilo similarmente estruturado.
Desconhece-se a razão pela qual es substratos de ligando reagente com um átomo de azoto na posição gama, em relação ao átomo de oxigénio do grupo álcool, não são cataliticamente hidrolisados. Uma possibilidade é a de o átomo de azoto do li. gando reagente (Composto 16 ou ligando análogo, aqui Composto 13) estar positivamente carregado para os valores de pH utilizados, e um resíduo aminoácido do centro de combinação da molécula receptora estar posicionado por forma a estabilizá-lo.
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-89Esse mecanismo não teria porém em conta a ausência de hidrólise do Composto 21 cujo azoto gama é parte de uma amida que não deveria ser afectada pela estabilização atribuída a um átomo de azoto carregado.
Outra possibilidade que tem em conta a reactividade de ambos os Compostos 16 e 21 reside no facto de o par de electrões sozinho do azoto gama estar estabilizado por um resíduo aminoácido de um centro de combinação de uma molécula receptora, tal como um grupo carboxilo de um ácido aspártico ou glutã mico, um imidazole de um resíduc histidina ou um mercaptano de uma cisteína. Quando está presente um azoto gama, o grupo estabilizador tende a inibir a hidrólise enquanto que, quando es. tá ausente o azoto gama, o grupo estabilizador anterior pode colaborar na reacção hidrolítica. Está bem documentada a participação de grupos carboxilo, imidazolilo e mercaptano em reacções hidrolíticas catalisadas por enzimas.
B. Estudos cinéticos
As cinéticas das reacções foram estudadas usando três li. gandos reagente como substratos, para os receptores monoclonais 37G2 e 22F5. Os dados obtidos a partir das velocidades iniciais foram consistentes com um mecanismo reaccional de Michaelis-Menten para um sistema enzima-substrato usual. As velocidades iniciais foram seguidas usando um espectrofotómetro U.V.-visível a 271 nm para o Composto 17, e um espectrofotometro de fluorescência para os Compostos 5. e 20, usando um comprimejn to de onda de excitação de 355 nm e um comprimento de onda de emissão de 455 nm para ambos os Compostos.
Prepararam-se representações de Lineuieaver-Burke para a hidrólise catalisada dos Compostos 17, 5. e 20 obtidos na presença e na ausência de Composto 12i como inibidor, tal como se discute para a Figura 4. Em particular, o Composto 17 estava presente em concentrações de 2-16ju.M com concentrações de inibidor de 100 e de 300 nanomolar (nM). 0 Composto 5. estava pre. sente em concentrações de 1-10 com concentrações de inibidor de 100 e 200 nM. 0 Composto 20 estava presente em concen66 685
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-90trações de 2-20JL*M com concentrações de inibidcr de 25 e 100 nM. Na Tabela 4 seguinte apresentam-se os parâmetros cinéticos obtidos a partir desses representações
Tabela 4*
K m A K. Vfnaxn ^cat . K 4. ncat .
(xl0°M) (χΙΟ'Μ) (xlOMseq ) (se9 1) (xl0°seq x)
Receptor monoclonal 33G2 e Composto 17
15 1,4 0,77 0,0016 9,29
Receptor monoclonal 22F5 e Composto 20
5 0,7 4,5 0,023 19,3
Receptor monoclonal 22F5 e Composto 5
1,4 1,1 1,52 0,0022 42,6
X
Os ensaios de fluorescência usando os Compostos 20 e
5, foram realizados num espectrofotómetro de fluorescência Perkin-Elmer (modelo LS-5; Oakbrook, IL) usando um receptor 200 nanomolar (com base num peso molécular de 150 000 daltons) em tampão fosfato 50 mH a um valor de pH 8,0. Dissolveu-se o ligando reagente em dioxano e misturou-se nas quantidades anteriormente referidas. Utilizaram-se 2 mililitros de solução reaccional tendo-se uma concentração de dioxano de 2 por cento em volume. 0s testes com o Composto 17 como ligando reagente utilizaram um receptor 500 nanomolar (com base num peso molecu lar de 150 000 daltons) no tampão anterior, usando o ligando reagente dissolvido em dioxano e uma concentração total de dio xano de 2 por cento em volume.
Como pode observar-se na Tabela 4, os parâmetros cinéti cos obtidos a partir destes estudos fcram geralmente similares aos apresentados na Tabela 2. Interessantemente porém, o efei, to do grupo rejeitado notado com o receptor P3 6D4, não foi no tado com nenhum dos receptores da Tabela 4. Assim, o receptor P3 6D4 pareceu formar uma N-acil-histidina relativamente está66 685
Ref: EPG:11-SCRF 43.2
-91vel com o éster de 7-hidroxicumarina (o pk da cumarina é cerd ca de 8,3) presumivelmente por um mecanismo nucleófilico de cli vagem hidrolítica, enquanto que o receptor pareceu catalisar a clivagem hidrolítica por um mecanismo básico geral para um éster, cujo grupo rejeitado (p-acetamidofenol) tinha um valor de pk superior (cerca de 9,9). Aqui, não se formou um intermediário relativamente estável e cada uma das três hidrólises ca. talíticas pareceu decorrer através da formação de um estado de transição em vez da formação de um intermediário. Adicionalmente os ligandos reagentes com grupos álcool, derivados alfa
-naftol e cumarina como grupos rejeitados, com valores de pka de cerca de 9,3 e cerca de 8,3 exibiram valores de k .
7 cat simila res com cada um dos receptores monoclonais estudados. Para os
Compostos 17 e 5. usados como ligandos reagentes como os recepto res monoclonais 37G2 e 22F5, as diferenças observadas na acele ração devida à reacção catalisada foram principalmente função da velocidade espontânea não catalisada, que era de cerca de 4 vezes mais rápida para o éster cujo álcool tinha um menor valor de Pka.
XII. Discussão
No estudo de enzimas a designação de análogo do estado de transição é aceite com cautela uma vez que, nem os mecanismos catalíticos, nem a interacção das enzimas com estes ligandos são, na maioria dos casos, bem compreendidas. Um inquéri. to detalhado precederá muitas vezes uma reivindicação definiti. va a um tal título Bartlett et al., Biochemistry, 22, 4618 (1983) e Imperali et al., Biochemistry, 25, 3760 (1986)_7·
Tal como aqui se descreve, a estrutura fosfonato tem ganho esta identidade por definição uma vez que está associada à compreensão do mecanismo da reacção. A exigência da função esperada num receptor imunológico preenche este propósito e constitui uma evidência persuasiva para □ princípio de complementaridade enzima-estado de transição teoricamente deduzido. Essa capacidade é única e independente das origens fisiológicas da catálise enzimática. Este facto tem o significado particular de o estudo de catálise tipo-enzima não necessitar
685
Ref: EPG:11-SCRF 43.2 de ser subserviente à química discreta reforçada pelas enzimas naturais. Pode dar-se atenção à catálise de qualquer reacção para a qual se possa formular um mecanismo credível.
A direcção e o objectivo de trabalhos adicionais em sis temas enzimáticos não está dependente de uma compreensão detalhada das enzimas existentes. 0 trabalho das enzimas naturais tem contudo de ser sempre encarado como o paradigma da catálise. Muita informação útil obtida pelo estudo dos mecanismos enzimáticos pode ser usada para apoiar modelos de catálise artificial. As enzimas na sua forma incipiente, não são mais do que moléculas de proteína especializadas, tal como os anticorpos monoclonais de especificidade única. As proteínas sozinhas não podem exibir toda a química dos processos biológicos. Des. te modo desenvolveram-se organismos para importar componentes extracelulares que combinados com proteínas constituem a vasta lista de actividades enzimáticas. Para as enzimas aspirarem a essa gama de reacções químicas têm de ser dotadas com cofactores. Um exemplo de um tal esquema é a tentativa de englobar, na ligação do estado de transição, a quelação metálica. Os co factores encontrados na natureza deverão ser modelos valiosos para a definição de sistemas nos quais a ligação imunológica possa servir como suporte para a actividade oxidativa, de trans. porte de electrões ou de transferência de hidreto, por exemplo.
As técnicas de obtenção de anticorpos de especificidades desejáveis conduziram a uma grande gama de aplicações em medicina e em biologia. Estas utilizam todas a função comum de reconhecimento antigénico em alguma forma acoplada, para as. sociar outras actividades ou propriedades com o complexo anticorpo-antigénio. Pensa-se ser a simples interacção de ligação uma propriedade invariante dos anticorpos.
Nestes estudos foi usado o conhecimento dos mecanismos químicos, para apetrechar a energia potencial da ligação anticorpo-antigénio, para desempenhar uma nova função cinética. 0 sucesso desta investigação básica deverá encorajar a aplicação do esquema mecanístico para invocar de um sistema imunogénico, proteínas mais interessantes e talvez mais úteis. A capacida66 685
Ref: EPG:11-SCRF 43.2
-93de de atribuir actividade hidrolítica a anticorpos de especifi cidade prédeterminada sugere que podem criar-se se desejado, reagentes ou catalisadores específicos para determinados locais. Além do interesse fundamental desse panorama, este pode trazer um benefício prático enorme para a química das proteínas .
Pretende-se ter sido a descrição anterior ilustrativa e não limitativa do presente invento. Podem efectuar-se numerosas variações e modificações sem partirem do verdadeiro espíri to e objectivc da invenção.

Claims (8)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1 - Processo de preparação de uma molécula recsptora, compreendendo um centro de combinação com anticorpos, capaz de hidrolisar cataliticamente uma ligação éster ou amida de ácido carboxílico, pré-seleccionada, de um ligando reagente, □ dito centro de combinação com anticorpos ligando-se a um ligando reagente contendo a dita ligação éster ou amida de ácido carbo xílico, pré-seleccionada e a um ligando análogo à dita posição reagente, análoga à do átomo de carbono do carbonilo da dita ligação éster ou amida de ácido carboxílico, pré-seleccionada do dito ligando reagente, caracterizado por compreender os pas. sos de:
    (a) imunizar um animal hospedeiro com um ligando análo go que contém um átomo ligado tetraedricamente numa posição análoga à posição do átomo de cartono carbonilo da referida li. gação amida ou éster de ácido carboxílico pré-seleccionada do referido ligando reagente;
    (b) manter o rsferido animal hospedeiro durante um período de tempo suficiente para que os anticorpos se formem com o referido ligando análogo;
    (c) recuperar os anticorpos formados;
    (d) analisar os anticorpos recuperados em relação a a.n ticorpos que se ligam ao referido ligando análogo;
    (e) analisar os referidos anticorpos recuperados em re lação a anticorpos que se ligam ao referido ligando reagente;
    (f) recuperar anticorpos dos passos (d) e (e) que se ligam a ambos o ligando análogo e ao ligando reagente;
    (g) analisar os anticorpos recuperados do passo (f) em relação a anticorpos que hidrolisam cataliticamente a referida ligação éster ou amida de ácido carboxílicc pré-seleccionada do referido ligando reagente; e (h) recuperar os anticorpos que hidrolisam cataliticamente a referida ligação do ligando reagente.
    66 685
    Ref: EPG:11-SCRF 43.2
  2. 2 - Processo de preparação de uma. molécula receptora de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o di, to átomo ligado tetraedricamente ser um átomo de fósforo que está directamente ligado a:
    (i) um átomo de carbono do grupo ácido da dita amida ou éster de ligando análogo;
    (ii) dois átomos de oxigénio, um dos quais está dupla- mente ligado ao dito átomo de fósforo estando outro átomo de oxigénio ligado por uma ligação simples ao dito átomo de fósfo ro, e, por uma ligação simples a um radical seleccionado de um grupo consistindo de hidrogénio e de um alquile de cadeia curta;
    (iii) um terceiro átomo de oxigénio ou a um átomo de azoto que está ligado ao átomo de carbono alfa do grupo álcool ou amina do dito éster ou amida análogos.
  3. 3 - Processo de preparação de uma molécula receptora mo. noclonal compreendendo um centro de combinação de anticorpo ca paz de hidrolisar cataliticamente uma ligação éster ou amida de ácido carboxílico pré-seleccionada de um reagente ligando, o referido centro de combinação do anticorpo ligando a um ligando reagente que contém ligação éster ou amida de ácido carboxílico pré-seleccionada de um ligando reagente, ligando-se o referido centro de combinação de anticorpo a um ligando reageri te contendo a referida ligação éster ou amida de ácido carbcxí. lico pré-seleccionada e a um ligando análogo à referida posição de reagente análoga à do átomo de carbono carbonilo da referida ligação éster ou amida de ácido carboxílico pré-selecci onada do referido ligando reagente caracterizado por compreender os passos de:
    (a) imunizar um animal hospedeiro com um ligando análo. go que contém um átomo ligado tetraedricamente numa posição análoga à posição do átomo de carbono carbonilo da referida li. gação amida ou éster de ácido carboxílico pré-seleccionada do referido ligando reagente;
    66 685
    Ref: EPG:11-SCRF 43.2 (b) manter o referido animal hospedeiro durante um período de tempo suficiente para que os anticorpos se formem com o referido ligando análogo;
    (c) recuperar os anticorpos formados;
    (d) analisar os anticorpos recuperados em relação a ari ticorpos que se ligam ao referido ligando análogo;
    (e) analisar os referidos anticorpos recuperados em re lação a anticorpos que se ligam ao referido ligando reagente;
    (f) recuperar células de baço do animal hospedeiro imu nizado, cujos anticorpos se ligam a ambos os referidos ligando análogo do passo (d) e ligando reagente do passo (e);
    (g) fundir as referidas células de baço com células de mieloma para formar células de hibridoma;
    (h) clonar as referidas células de hibridoma de forma a obter um monoclone e cultivar as células monoclonais;
    (i) analisar o meio de crescimento, das referidas culturas de células de hibridoma monoclonais, em relação a anticor, pos segregados que se ligam a ambos o referido ligando análogo e que hidrolisam cataliticamente o referido ligando reagente, e (j) recuperar os anticorpos do passo (i) que se ligam ao referido ligando análogo e que hidrolisam cataliticamente o referido ligando reagente.
  4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteri. zado pela facto de os referidos anticorpos serem segregados por um hibridoma com o número de acesso ATCC seleccionado de um grupo consistindo de HB 9168, HB 9169, HB 9500, HB 9501, HB 9502, HB 9503, HB 9504, HB 9505, HB 9506, HB 9507, HB 9508 e HB 9509.
  5. 5 - Processo de hidrolisar cataliticamente uma ligação éster ou amida pré-seleccionada numa molécula de ligando reactivo caracterizado por compreender os passos de:
    66 685
    Ref: EPG:11-SCRF 43.2 (a) misturar uma quantidade eficaz de uma molécula receptora preparada de acordo com a reivindicação 1, com as refe ridas moléculas de ligando reagente num meio aquoso para formar uma mistura; e (b) manter a referida mistura durante um período de tempo suficiente para que a referida molécula de ligando se li gue à referida molécula receptora e para que as referidas molé cuias receptoras hidrolisem a dita ligação pré-seleccionada.
  6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracteri. zado pelo facto de incluir ainda o passo adicional de recuperar os produtos da referida hidrólise.
  7. 7 - Processo de hidrolisar cataliticamente uma ligação éster ou amida pré-seleccionada numa molécula/ligando reactivo caracterizado por compreender os passos de:
    (a) misturar uma quantidade eficaz de molécula recepto ra preparada de acordo com a reivindicação 3, com as referidas moléculas de ligando reagente num meio aquoso para formar uma mistura; e (b) manter a referida mistura durante um período de tempo suficiente para que a referida molécula de ligando se li gue à referida molécula receptora e para que as referidas molé. cuias receptoras hidrolisem a dita ligação pré-seleccionada.
  8. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracteri. zado por incluir ainda o passo adicional de recuperar os prodtj tos da referida hidrólise.
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Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5229272A (en) * 1989-04-25 1993-07-20 Igen, Inc. Catalytic antibody components
US4963355A (en) * 1986-06-23 1990-10-16 Igen, Inc. Production of antibody catalysts
EP0305870B1 (en) * 1987-09-02 1994-04-13 Igen, Incorporated Production of immunoproximity catalysts
US6702705B1 (en) * 1988-05-04 2004-03-09 Igen International, Inc. Prodrugs activated by targeted catalytic proteins
ZA893284B (en) * 1988-05-04 1990-03-28 Igen Inc Peptide analogs and their use as haptens to elicit catalytic antibodies
US5215889A (en) * 1988-11-18 1993-06-01 The Regents Of The University Of California Catalytic and reactive polypeptides and methods for their preparation and use
US5236825A (en) * 1989-01-17 1993-08-17 Scripps Clinic And Research Foundation Polyvalent metal ion-containing antibody combining site catalysts
US5429936A (en) * 1989-04-21 1995-07-04 The Regents Of The University Of California Antibody-mediated juxtaposition of reactive moieties
US6048717A (en) * 1989-04-25 2000-04-11 Igen International, Inc. Inhibitors of catalytic antibodies
US5194585A (en) * 1989-04-25 1993-03-16 Igen, Inc. Inhibitors of catalytic antibodies
US5658753A (en) * 1989-04-25 1997-08-19 Paul; Sudhir Catalytic antibody components
US5599538A (en) * 1989-04-25 1997-02-04 Igen, Inc. Autoantibodies which enhance the rate of a chemical reaction
US5236836A (en) * 1989-04-25 1993-08-17 Igen, Inc. Autoantibodies which enhance the rate of a chemical reaction
DK547589D0 (da) * 1989-11-02 1989-11-02 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af organiske forbindelser
US5444155A (en) * 1991-09-10 1995-08-22 The Scripps Research Institute Molecules with antibody combining sites that induce asymmetry
US5250426A (en) * 1991-10-22 1993-10-05 The Scripps Research Institute Molecules with antibody combining sites that induce asymmetry
US5463028A (en) * 1992-04-03 1995-10-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reagents for generating a polyclonal hydrolytic antibody response against cocaine and the monoclonal hydrolytic antibodies against cocaine derived through these reagents
JP2721296B2 (ja) * 1993-09-08 1998-03-04 株式会社蛋白工学研究所 糖エステル誘導体を位置選択的に加水分解する触媒抗体
US5571681A (en) * 1994-03-10 1996-11-05 The Scripps Research Institute Chemical event selection by suicide substrate conjugates
GB9510830D0 (en) * 1995-05-27 1995-07-19 Zeneca Ltd Proteins
JP2002515965A (ja) * 1995-08-18 2002-05-28 ダブリュー． ランドリ，ドナルド 抗体触媒反応の調節による有機化合物の検出
US5948658A (en) 1996-06-25 1999-09-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Anti-cocaine catalytic antibody
WO2001032908A1 (fr) * 1999-10-29 2001-05-10 Wakamoto Pharmaceutical Co., Ltd. Anticorps monoclonal, hybridome, immunoessai et necessaire a diagnostic
EA036225B1 (ru) 2012-03-14 2020-10-15 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы и их применения
EP3722318A1 (en) 2015-07-06 2020-10-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
WO2017190079A1 (en) 2016-04-28 2017-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
CN110809583A (zh) 2017-06-07 2020-02-18 瑞泽恩制药公司 用于内化酶的组合物和方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0162920A1 (en) * 1983-11-29 1985-12-04 IGEN, INC. (a California corporation) Method of catalyzing chemical reactions
US4659567A (en) * 1984-09-07 1987-04-21 Scripps Clinic & Research Foundation Molecules with antibody combining sites that bind to hydrolytic transition states
US4963355A (en) * 1986-06-23 1990-10-16 Igen, Inc. Production of antibody catalysts
US4792446A (en) * 1986-06-23 1988-12-20 Igen, Inc. Production of antibody catalysts

Also Published As

Publication number Publication date
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EP0260939A2 (en) 1988-03-23
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DE3785633D1 (de) 1993-06-03
ES2053552T3 (es) 1994-08-01
DK486087A (da) 1988-03-18

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