DE69636924T2

DE69636924T2 - Zusammensetzungen und methoden zur katalysierten hydrolyse von hiv gp120

Info

Publication number: DE69636924T2
Application number: DE69636924T
Authority: DE
Inventors: Sudhir Omaha PAUL; Ravishankar Omaha KALAGA
Original assignee: University of Nebraska
Current assignee: University of Nebraska
Priority date: 1995-07-21
Filing date: 1996-07-19
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2016-07-20
Also published as: DE69636924D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Behandlung einer HIV-Infektion und von assoziierten Erkrankungen. Insbesondere werden katalytische (proteolytische) Antikörper oder Derivate davon bereitgestellt, welche die Hydrolyse des HIV-gp120-Proteins katalysieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Hüllglykoproteine von HIV-1 werden anfangs als einzelner 160-kD-Vorläufer, gp160, synthetisiert, der an der Arg511-Ala512-Bindung durch eine zelluläre Protease gespalten wird, sodass gp120 und das integrale Membranprotein gp41 produziert werden (N. Kido et al., J. Biol. Chem. 268, 13406–13416 (1993)). Die biologische Aktivität von gp120 ist ein Schlüsselbestandteil der anfänglichen Bindung von Wirtszellen durch HIV-1, der Vermehrung des Virus und seiner toxischen Wirkungen auf nichtinfizierte Neuronen und andere Zellen (T. Kieber-Emmons et al., Biochim. Biophys. Acta 989, 281–300 (1987); Capon et al., Ann. Rev. Immunol. 9, 649–678). Somit ist gp120 ein Target von passiver und aktiver Immunisierung gegen AIDS (J.O. Kahn et al., J. Infec. Dis. 170, 1288–1291 (1994); D.L. Birx et al., Curr. Opin. Immunol. 5, 600–607 (1993); P.W. Berman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5200-5204 (1988)). Die Bindung eines Konformationsepitops von gp120 an CD4-Rezeptoren auf Wirtszellen ist der erste Schritt der HIV-1-Infektion. Einzelne Aminosäuren, die dieses Epitop darstellen, scheinen sich im zweiten (C2), dritten (C3) und vierten (C4) konservierten gp120-Segment zu befinden (T.J. Olshevsky et al., J. Virol. 64, 5701–5705 (1990)). Dies sind die gp120-Reste 256, 257, 368–370, 421–427 und 457. Monoklonale Antikörper, welche die CD3-Bindugnsstelle binden, wurden schon beschrieben (M. Thali et al., J. Virol. 65, 6188–6193 (1991); M. Thali et al., J. Virol. 66, 5635–5641 (1992)). Da die CD4-Bindungsstelle ein Konformationsepitop ist, können entfernte Reste, die selbst nicht Bestandteil des Epitops sind, wichtig für die Aufrechterhaltung der Fähigkeit, an CD4 zu binden, sein. gp120-Wechselwirkungen mit anderen Wirtszellproteinen sind ebenfalls essentiell für die Virusvermehrung. Die Bindung von gp120 durch Calmodulin kann beispielsweise an der HIV-1- Infektiösität beteiligt sein, wie durch die Hemmwirkung von Calmodulin-Antagonisten aufgezeigt wird (R.V. Srinivas et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 108, 1489–1496 (1994)). Asp180, das sich zwischen der V1- und V2-Region von gp120 befindet, ist entscheidend für die Virusreplikation (W-K. Wang et al., J. Virol. 69, 538–542 (1995)). Auf ähnliche Weise ist die V3-Schleife wesentlich für die Infektiösität (L.A. Ivanoff et al., Virology 187, 423–432 (1992)). Es ist somit klar, dass andere strukturelle Determinanten in gp120 als jene, welche die CD4-Bindungsstelle darstellen, wahrscheinlich für die Virusgenomreplikation, Hüllproteinsynthese und Virusteilchenverpackung erforderlich sind.
Die Ablösung („shedding") von gp120 durch Virusteilchen und infizierte Zellen wurde als Faktor der Pathogenese von AIDS vorgeschlagen (H.R. Gelderblom et al., Lancett ii, 1016–1017 (1985)). Gereinigtes gp120 ist toxisch für kultivierte Neuronen (D.E. Brenneman et al., Nature 335, 639–642 (1988); W.E.G. Muller et al., Eur. J. Pharmacol. 226, 209–214 (1992)). Nichtinfizierte T-Lymphozyten, die mit gp120 beschichtet sind, können durch antikörperabhängige Monozyten lysiert werden (D. Hober et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 10, 83–92 (1995)). Nichtinfizierte CD4+-Zellen können absterben, weil die Bindung des gp120-gp41-Komplexes Apoptose induziert (A.G. Laurent-Crawford et al., Res. Virol. 146, 5–17 (1995)). gp120 bindet auch Komplement-Komponenten (H. Stoiber et al., AIDS 9, 19–26 (1995)).
Es bestand großes Interesse an der Möglichkeit, dass gp120 zur neuralen Schädigung beiträgt, die bei AIDS-Patienten zu beobachten ist (I.P. Everall et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 52, 561–566 (1993)). Eine produktive Infektion im Hirn findet in einer relativ kleinen Zahl von Zellen statt, die Mikroglia, mehrkernige Riesenzellen und vom Blut stammende Makrophagen umfassen (L.G Epstein et al., Ann. Neurol. 33, 429–436 (1993)). Und doch gibt es weit verbreitete Hirnschädigungen in Bereichen, die nicht mit dem Virus infiziert sind. Dies hat zum Vorschlag geführt, dass vom Virus abgegebenes lösliches gp120 und durch die infizierten Zellen produzierte Cytokine für die Schäden verantwortlich sein könnten (S.A. Lipton, Brain Pathol. 1, 193–199 (1991), D. Giulian et al., Science 250, 1593–1595 (1990); D.J. Benos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 494–498 (1994)). Die neurotoxischen Wirkungen von gp120 können indirekt sein und eine Stimulierung des NMDA-Rezeptors (D.J. Benos et al., Proc. Natl. Acad. USA 91; 494–498 (1994)) oder eine Induktion von Cytokinen umfassen (M.C. Yeung et al., AIDS 9, 137–143 (1995)). gp120 stimuliert auch die Neurotoxin-Freisetzung aus Monozyten (D. Giulian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2769–2773 (1993)), was darauf hinweist, dass seine neurotoxischen Wirkungen die Teilnahme dieses Zelltyps erfordern. Beweise für die Neurotoxizität von löslichem gp120 umfassen Folgendes:

(a) transgene Mäuse, die gp120 im Hirn exprimieren, weisen weit ausgebreitete neuronale Schädigungen auf (S.M. Toggas et al., Nature 367, 188–193 (1994));
(b) reines gp120 in subpikomolaren Konzentrationen tötet kultivierte Astrozyten und Großhirnrindenzellen ab (D.E. Brenneman et al., Nature 335, 639–642 (1988); W.E.G. Muller et al., Eur. J. Pharmacol. 226, 209–214 (1992));
(c) Injektionen von reinem gp120 in vivo führen zu Hirnschäden (J.M. Hill et al., Brain Res. 603, 222–223 (1993));
(d) gp120-artige neurotoxische Aktivität in der Rückenmarksflüssigkeit wurde beschrieben (J. Buzy et al., Brain Res. 598, 10–18 (1992));
(e) Peptid-T, ein Octapeptid, das einem Segment von gp120 entspricht und einen gewissen Grad an Homologie zum Neuropeptid VIP aufweist, kann neuronale Dysfunktionen in AIDS-Patienten lindern (T.P. Bridge et al., Psychopharmacol. Bull. 27, 237–245 (1991)).

gp120 exprimiert zahlreiche lineare und konformationelle Antigenepitope, gegen die Antikörper gebildet werden. Diese umfassen neutralisierende Antikörper, die von HIV-infizierten Individuen gegen die V3-Schleife gebildet werden (E.B. Dreyer et al., Science 248, 364–367 (1990); P.R. Meylan et al., AIDS 6, 128–130 (1992); S. Pollard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11320–11324 (1991)). Da die V3-Schleife eine hypervariable Region ist, sind diese Antikörper typspezifisch, wobei ihre neutralisierende Aktivität nur gegen HIV-Varianten mit V3-Sequenzen gerichtet ist, die dem Virusstamm ähneln, der für die anfängliche Infektion verantwortlich ist. Andererseits können Antikörper, die in der späteren Phase der Erkrankung gebildet werden, breiteren Schutz bieten, wie durch die Hemmung der Fähigkeit verschiedener HIV-1- Stämme, anfällige Zelllinien und primäre Lymphzellkulturen in vitro zu infizieren, gemessen wird. Eine Untergruppe diese schützenden Antikörper ist gegen konservierte Regionen von gp120 gerichtet, die essentiell für die Bindung des CD4-Rezeptors und für die Virusvermehrung sind (T. Hattori et al., FEBS Lett. 248, 48–52 (1989); T. Schulz et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9, 159–166 (1993); G.J. Clements et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 7, 3–16 (1991)). Die Ansicht, dass die Nutzung von Reaktionen neutralisierender Antikörper auf die konservierten Regionen von gp120 für eine wirksame Impfung gegen AIDS erforderlich sein wird, ist weit verbreitet. Auf ähnliche Weise hängt der Erfolg einer passiven Immunisierung mit Antikörpern von ihrer Fähigkeit ab, konservierte gp120-Regionen zu erkennen.
Andere Forscher haben beobachtet, dass in Patienten mit systemischem Lupus erythematodes gefundene Autoantikörper in der Lage sind, gp120 zu binden (R. Gu et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9, 1007–1015 (1993); C Callebaut et al., Science 262, 2045–2050 (1993)). Kreuzreaktivität zwischen Antikörpern gegen gp120 und gegen HLA-Klasse-I-Schwerketten (H-Ketten) wurde vorgeschlagen (Q.J. Sattentau et al., J. Virol. 67, 7383–7393 (1993)). Außerdem wurde beschrieben, dass AIDS-Patienten DNA-hydrolysierende katalytische Antikörper exprimieren (D.W. Woolley et al., John Wiley & Sons, Inc., S. 82 (1952)).
Spekulationen, dass Antikörper katalytische Aktivität entwickeln könnten, gehen auf Woolley zurück (Q.S. Gao et al., J. Biol. Chem. 269, 32389–32393 (1994)), der 1952 meinte, dass das Immunsystem, wenn es einem Antigen ausreichend lange ausgesetzt wird, katalytische Antikörper synthetisieren könnte. Zwischen Antikörper-L-Ketten und Serinproteasen ist eine Sequenzhomologie nachweisbar (M. Sun et al., J. Biol. Chem. 269, 734–738 (1994)). Kohen et al. berichteten, dass eine Immunisierung mit Steroiden oder Dinitrophenol, die an Trägerproteine konjugiert waren, die Bildung von Antikörpern mit Esterasefähigkeiten auslöste (M. Sun et al., J. Immunol. 153, 5121–5126 (1994); S. Paul et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47, 241–255 (1994)). Menschliche Autoantikörper, die das Neuropeptid VIP hydrolysieren, wurden nachgewiesen (L. Li et al., Mol. Immunol., im Druck (1996)). Eine durch Autoantikörper katalysierte Hydrolyse von VIP wurde reproduziert (L. Li et al., J. Immunol. 154, 3328–3332 (1995)). Andere Gruppen haben eine durch Autoantikörper vermittelte Hydrolyse von DNA gezeigt (S. Tyutyulkova et al., Biochimica Biophysica Acta, im Druck (1996); R. Kalaga et al., J. Immunol. 155, 2695–2702 (1995)).
Antikörper mit enzymatischer Aktivität bieten die Möglichkeit einer spezifischen, äußerst wirksamen katalytischen chemischen Überführung von Liganden. Viele biologische Mediatoren sind Peptide oder Proteine, einschließlich der Antigene von pathogenen Organismen, Hormonen, Neurotransmittern und tumorspezifischen Antigenen. Es ist möglich, das große Repertoire an Spezifitäten, die das Immunsystem bereitstellt, zu nutzen, um chemische Reaktionen zu katalysieren, die nicht im Rahmen natürlich vorkommender Enzyme liegen. Die Kombination von Antikörperspezifität mit der katalytischen Kraft von Enzymen hat das Potenzial, starke therapeutische Wirkstoffe, d.h. katalytische Antikörper, die in der Lage sind, Schlüssel-Virushüllproteine zu hydrolysieren, zu bilden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Heilung für HIV-Infektionen wurde bisher noch nicht entwickelt. Die bisher verfügbaren Behandlungen sind auf die Hemmung von Virusreplikation ausgerichtet, um die Latenzzeit der Krankheit zu verlängern. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die an AIDS-Patienten angewendet werden können, um die Konzentration an HIV und löslichem gp120 im Körper zu verringern. Die Verabreichung dieser Zusammensetzungen an Patienten kann die neurologischen Symptome von Patienten lindern, die an AIDS-bezogener Demenz leiden.
Die vorliegende Erfindung umfasst hydrolytische Anti-gp120-Antikörper und L-Ketten-Antikörperkomponenten, die aus Patientenseren isoliert wurden, die gp120 wirksam in inaktiven Subfragmente spalten. Verfahren zur Isolation und Reinigung von katalytischen Antikörpern und Antikörperkomponenten, welche die Hydrolyse von gp120 vermitteln, werden bereitgestellt.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Antikörper und Antikörperkomponenten, die unter Einsatz von Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Nach dem Screenen von Seren auf gp120-Spaltungsaktivität werden Peripherblut-Lymphozyten isoliert und als Quelle von mRNA verwendet, die für die Aktivität zur Bildung einer cDNA-Bibliothek kodiert. Die Isolation von Genen, die für die katalytischen Antikörper und Antikörperkomponenten der Erfindung kodieren, erfolgt mithilfe von Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind. Phagendisplay der L-Ketten der Erfindung zur Isolation von L-Ketten-exprimierenden Klonen wird in Betracht gezogen. Auch die Klonierung des Immunrepertoires aus Lymphozyten, die aus HIV-1- und SLE-Patienten isoliert wurden, unter Verwendung von Primern an konservierte Regionen von IgG-Genen ist vorgesehen.
Nach der Isolation, Expression und Reinigung von rekombinanten gp120-Hydrolysierungsantikörpern oder -antikörperkomponenten wird ein Verfahren zur Verabreichung an HIV-infizierte Patienten bereitgestellt. Der katalytische gp120-Spaltungsantikörper oder Komponenten davon können in einem geeigneten pharmazeutischen Präparat i.v. verabreicht werden. Alternativ dazu können die hydrolytischen gp120-Antikörper der Erfindung mithilfe einer Kanüle in das intraventrikuläre Kompartiment des Hirns verabreicht werden. Die katalytischen L-Ketten der Erfindung können auch translational an Transferrin fusioniert werden, um die Passage der Blut-Hirn-Schranke in mit HIV-1 infizierte Patienten zu vermitteln.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein silbergefärbtes Gel von Bence-Jones-Proteinen und ihren V_L-Domänen unter reduzierenden (A) und nichtreduzierenden (B) Bedingungen.
2A ist ein Autoradiogramm, das die Hydrolyse von radioaktiv markiertem gp120 veranschaulicht, das 6 Stunden lang bei 37 °C mit einer Lay2-L-Kette inkubiert worden war.
2B ist ein silbergefärbtes SDS-Page-Gel, das die Hydroylse von unmarkiertem gp120 durch die Lay2-L-Kette zeigt.
3 ist eine graphische Darstellung der fortschreitenden Verarmung eines radioaktiv markierten gp120-Substrats in Gegenwart von steigenden Konzentrationen der Lay2-L-Kette.
4 ist eine graphische Darstellung der pH-Abhängigkeit von Lay2-L-Ketten-katalysierter Hydrolyse von radioaktiv markiertem gp120.
5 ist eine graphische Darstellung der Reduktion von Neurotoxizität von gp120 auf Nervenzellen nach einer Behandlung mit einer Lay2-L-Kette.
6 ist eine graphische Darstellung der Hemmung von HIV-1-Infektiösität durch Vorbehandlung mit einer Lay2-L-Kette.
7 ist ein Gel, das die Größe der cDNA zeigt, die für die Lay2-V_L-Domäne kodiert, synthetisiert durch rekursive PCR.
8 ist ein Autoradiogramm, das die Hydrolyse von radioaktiv markiertem gp120 durch aus einem SLE-Patienten isolierte L-Ketten zeigt.
9 ist ein Autoradiogramm, das die Hydrolyse von radioaktiv markiertem gp120 durch aus einem HIV-Patienten isolierte L-Ketten zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die unerwartete Entdeckung, dass ein normales menschliches Protein in der Lage ist, gp120 spezifisch zu erkennen und die Lyse einer Peptidbindung in gp120 zu katalysieren, eröffnet die Möglichkeit, einen neuen therapeutischen Eingriff in das erworbene Immundefektsyndrom (AIDS) zu entwickeln. Ein hydrolytischer Anti-gp120-Antikörper kann pharmakologisch bei der Behandlung von AIDS-Patienten einge setzt werden, beispielsweise bei der Behandlung von AIDS-bezogener Demenz. Vorläufige Daten haben gezeigt, dass eine Anti-gp120-Proteolyse gp120-vermittelte Neurotoxizität eliminiert. Eine weitere und direktere Anwendung wäre als injizierbare Proteinlösung, die durch Bindung an und Spaltung von gp120 die HIV-Infektiösität verringern würde, entweder durch Zerstörung der gp120-Rezeptorbindungsstelle oder durch Destabilisierung der Virusrezeptorbindungsstelle. Der hydrolytische gp120-Antikörper kann als Immunsystemverstärker eingesetzt werden, um die Fähigkeit der natürlichen Mechanismen eines Körpers, die Krankheit zu kontrollieren, zu steigern. Eine der L-Ketten mit der gp120-Hydrolyseaktivität, die in dieser Anmeldung als Beispiel angeführt wird, wurde aus einem Patienten mit multiplem Myelom (Lay2) isoliert. Der ursprüngliche Antigenstimulus, der für die Spezifität der Myelom-L-Kette verantwortlich ist, ist nicht bekannt. Die Reaktion der L-Kette mit gp120 könnte ein Kreuzreaktivitätsphänomen aufgrund einer zufälligen strukturellen Übereinstimmung zwischen der Bindungsstelle und gp120 widerspiegeln. Bis zum Zeitpunkt des Todes des Patienten war AIDS nicht als Krankheitsbild erkannt worden, und es ist nicht bekannt, ob der Patient HIV-1-Antikörper aufwies. Multiple Myelome können bei AIDS-Patienten häufiger vorkommen (S. Erhan et al., Nature 251, 353-355 (1974)), aber es gibt keine Beweise dafür, dass der Spender der katalytische L-Kette AIDS hatte.
Neuere Berichte haben gezeigt, dass eine HIV-Infektion ein Gleichgewicht zwischen rascher HIV-Replikation und hohem Umsatz von CD4-T-Zellen einschließt (Wei et al., Nature 373, 117–122 (1995); Ho et al. Nature 373, 123–126 (1995)). Eine aggressive virusspezifische proteolytische Behandlung in der Phase, in der das Immunsystem immer noch stark ist und die Infektion eindämmt, würde die Möglichkeit, die Infektion zu eliminieren oder die Latenzzeit zu verlängern, steigern.
Die folgenden Beispiele dienen zur genaueren Beschreibung der Erfindung. Sie sind in keinster Weise als Einschränkung der Erfindung zu verstehen.
Beispiel 1
Antikörper-L-Ketten-vermittelte Hydrolyse von gp120
29 monoklonale Antikörper-L-Ketten, die aus Patienten mit multiplen Myelomen gereinigt worden waren, wurden schon beschrieben (A. Solomon, Meth. Enzym. 116, 101–121 (1985); Proben bereitgestellt von Dr. Solomon, University of Tennessee, USA), eine rekombinante L-Kette mit VIP-Hydrolyseaktivität (Q-S. Gao et al., J. Biol. Chem. 269, 32389–32393 (1994)) und polyklonale Anti-VIP-Antikörper (S. Paul et al., J. Biol. Chem. 266, 16128–16134 (1991)) wurden auf ihre Fähigkeit gescreent, ¹²⁵I-markiertes gp120 zu hydrolysieren. Die radioaktive Markierung von elektrophoretisch reinem gp120 (IIIB; AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH) erfolgte durch das Chloramin-T-Verfahren, gefolgt von einer Reinigung von ¹²⁵I-gp120 durch Gelfiltration. Eine einzelne Bande von radioaktiv markiertem gp120 bei 120 kD wurde durch SDS-PAGE und Autoradiographie erhalten. 1 ist ein silbergefärbtes SDS-PAGE-Gel, das die Reinheit des L-Ketten-Präparats zeigt. Die L-Ketten wurden mit ¹²⁵I-gp120 inkubiert, und die Reaktionsgemische wurden durch SDS-Polyacrylamid-gelelektrophorese und quantitative Autoradiographie analysiert (C. Brugger et al., J. Biol. Chem. 266, 18358–18362 (1991)). Eine menschliche monoklonale L-Kette mit gp120-Hydrolyseaktivität wurde identifiziert (Lay2). Die restlichen L-Ketten und Anti-VIP-Antikörper wiesen keine Aktivität auf. Die gp120-Hydrolyseaktivität coeluierte aus einer Gelfiltrationssäule mit dem L-Ketten-Protein-Peak. Fast die gleiche Spaltung von gp120 durch Lay2 wurde in physiologischen Puffern und Nährmedien (phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Hanks gepufferte Kochsalzlösung (HBSS) und RPMI 1640) beobachtet. Vier radioaktiv markierte gp120-Spaltprodukte mit einer Masse von etwa 80 kD, einem Schmier bei etwa 50 kD, 20 kD und <6 kD wurden durch nichtreduzierende Elektrophorese nachgewiesen. Siehe 2A. Die 80-kD-Bande scheint unter reduzierenden Bedingungen eine Fragmentierung zu durchlaufen, was darauf hinweist, dass es disulfidgebundene Fragmente enthielt. Identische Produktprofile wurden unter Einsatz von ¹²⁵I-gp120-Präparaten aus den HIV-1-Stämmen IIIB, SF2 und MN erhalten. Die radioaktiv markierte 80-kD-Bande schien bei verlängerter Inkubation bis zu 36 Stunden einen weiteren Verdau zu durchlaufen. Die Spaltungsprofile von unmarkiertem gp120 und radioaktiv markier tem gp120 waren ähnlich, mit der Ausnahme, dass die Intensität der einzelnen Banden unterschiedlich war, was wahrscheinlich die zur Detektion der zwei Arten von Substraten verwendeten Verfahren widerspiegelt (Silberfärbung bzw. ¹²⁵I-Makeriung an Tyr-Resten, gefolgt von Autoradiographie). Aus den HIV-1-Stämmen IIIB, SF2 und MN isoliertes unmarkiertes gp120 wurde durch Lay2 (250 nM, 6 h) ähnlich stark hydrolysiert (50, 44 bzw. 60 %) und durch quantitatives Scanning der Bandenintensität geschätzt.
Immun-Blotting von reduzierenden Gelen mit einem Anti-gp120-Antikörper, der proteolytische Abbauprodukte des Proteins erkennt (S. Pollard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11320–11324 (1991)), ergab gut abgegrenzte Produktbanden, die durch Lay2 erzeugt wurden. Siehe 2B. Eine steigende Hydrolyse von gp120 war bei zunehmenden Lay2-Konzentration zu erkennen, wie in 3 dargestellt ist, was als Reduktion der Intensität der 120-kD-Substratbande geschätzt wurde. Dies war begleitet von einer steigenden Akkumulation der 80-kD- und anderer Spaltprodukte.
Vorläufige Schätzungen der Kinetik der Reaktion, die durch Inkubation von 20 nM Lay2 mit steigenden Konzentrationen von Lay2 (10–300 nM) erreicht wurde, ergab anfängliche Raten, die in die Michaelis-Menten-Gleichung eingesetzt werden konnten. Der scheinbare Km-Wert der Reaktion war 30 nM, und Vmax betrug 0,06 nmol gp120/nmol Lay2/h. Diese vergleichsweise hohe Affinität von gp120 für Lay2 wurde durch die Beobachtung aufgezeigt, dass in parallelen Reaktionen analysierte Trypsin-katalysierte Hydrolyse bei Konzentrationen von bis zu 1 μM nichtsättigbar war, was vermuten lässt, dass die Km von Trypsin für gp120 wesentlich größer ist als die von Lay2.
Es gab keine Hydrolyse von ¹²⁵I-Albumin durch Lay2, was darauf hinweist, dass die beobachtete gp120-Hydrolyse nicht ein nichtspezifisches Phänomen ist, 2A. Steigende Konzentrationen von VIP hemmten die Hydrolyse von ¹²⁵I-gp120 durch Lay2 (scheinbare Ki von VIP, 620 nM). Lay2 hydrolysiert auch radioaktiv markiertes VIP mit einer Km von 144 nM. Ausgehend von einem Vergleich seiner Km für gp120 mit Ki/Km für VIP scheint Lay2 gp120 etwa 5- bis 21-mal stärker zu binden als VIP.
gp120 weist zwei kurze Homologieregionen mit VIP auf (G.J. LaRosa et al., Science 149, 932–935 (1990); M. Gorny et al., J. Immunol. 150, 635–643 (1993)), was der Reaktivität beider Polypeptide mit Lay2 zugrunde liegen könnte.
Der optimale pH für die gp120-Hydrolyse durch Lay2 lag im neutralen Bereich, wie in 4 dargestellt ist, was die Beteiligung von Aminosäureresten mit neutralen pKa-Werten als katalytische Reste (Ser, Thr, Tyr, His) vermuten lässt. In Gegenwart eines Serinproteaseinhibitors (0,3 mM Diisopropylfluorphosphat) wurde die Lay2-katalysierte Hydrolyse im Wesentlichen vollständig gehemmt. Im Vergleich dazu hatten Inhibitoren von Metalloproteasen, Cysteinproteasen und Säureproteasen (EDTA, Iodacetamid, Pepstatin A) keine Auswirkung auf die Reaktion. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass ein Ser-Rest an der gp120-Hydrolyse beteiligt sein könnte.
Die Sequenz von Lay2 wurde bestimmt. Lay2 ist ein Mitglied der k-IIc-Untergruppe. Die Anzahl an Ser/Thr-Resten in den CDRs dieser L-Kette ist unüblich hoch. Eine ortsgerichtete Mutagenese einer katalytischen Anti-VIP-L-Kette hat gezeigt, dass ihr Ser27a und His93 die katalytischen Reste sind. Ein Ser-Rest ist auch an Position 27a in Lay2 vorhanden. Position 93 in Lay2 wird von Glu eingenommen (anstelle von His in der Anti-VIP-L-Kette). In einem vorläufigen Modell von Lay2, das mithilfe des Computerprogramms AbM erzeugt wurde (A.C.R. Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9268–9272 (1989)), sind Ser27a und Glu93 in Wasserstoff-Brückenbindungsreichweite (2,9 Ångström). Wenn diese Reste über Wasserstoffbrücken gebunden sind, kann die resultierende Steigerung der Nucleophilität des Ser-Rests seine Teilnahme an der Peptidbindungshydrolyse durch einen Mechanismus erlauben, der analog zu dem bei Serinproteasenkatalyse ist.
Die Wirkungen von Kontroll-gp120 und mit Lay2 behandeltem gp120 (10 μM, 30 h) auf die Lebensfähigkeit von kultivierten Maus-Großhirnrindenzellen wurden verglichen. Wie schon früher berichtet (D.E. Brenneman et al., Nature 335, 639–642 (1988)) sind subpikomolare Konzentrationen von Kontroll-gp120 für diese Zellen toxisch. Kurz gesagt wurden Großhirnrindenzellen von neugeborenen Wistar-Ratten mit 0,25 % Trypsin vorbereitet, um das Gewebe zu dissoziieren. Die Zellen wurden in MEM-Medium kultiviert, das mit 10 % fötalem Kälberserum ergänzt war. Nach 2 Tagen sind etwa 80 % der Zellen Neuronen und etwa 20 % saure Gliafaserproteinpositive Astrozyten. Nach einer Behandlung mit Lay2 war die Wirksamkeit von gp120 um mehr als das 10fache verringert, was direkt dem Hydrolysegrad entspricht. Siehe 5. Eine Elektrophorese und Silberfärbung des Lay2-behandelten gp120 zeigten, dass etwa 85 % des Proteins verdaut wurden. Kontroll-Lay2 ohne gp120 wies keine neurotoxische Wirkung auf.
Lay2 wurde auf seine Fähigkeit getestet, HIV-1-Infektiösität zu hemmen. Unter serumfreien Bedingungen hemmte eine Vorbehandlung mit dieser katalytischen L-Kette tatsächlich die Infektion von MT-2-Zellen, einer T-Zelllinie, durch HIV-1 (IIIB), wie durch eine Mikroskopuntersuchung auf zytopathische Wirkungen (Synzytium-Bildung) und den Mikrokultur-Tetrazolium-Test (MTA) unter Einsatz von 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-2N-tetrazoliumhydroxid gezeigt wurde. Siehe 6. Die Infektionsmultiplizität (MOI) in diesem Experiment betrug 3,2. Bei niedrigeren MOI-Werten ist die Wahrscheinlichkeit groß, dass die L-Kette noch größere Wirksamkeit aufweist. Eine Behandlung der Zellen mit der L-Kette in Abwesenheit von HIV-1 führte zu keiner zytopathischen Wirkung. Diese Ergebnisse zeigen, dass die L-Kette in der Lage ist, natives gp120 zu erkennen und zu spalten.
Beispiel II
Herstellung von rekombinanter Lay2-V_L
Wie schon erwähnt, wurde das menschliche Bence-Jones-Protein mit Namen Lay2 von Dr. Alan Solomon, University of Tennessee, USA, bereitgestellt und stammte von einem Patienten, der mittlerweile verstorben ist. Der Notwendigkeit einer wiederauffüllbaren Versorgung mit dem Katalysator wurde Rechnung getragen, indem eine rekombinante Form von Lay2 in einem bakteriellen Expressionssystem konstruiert wurde. Es ist zu erwarten, das dies die Herstellung von Derivaten von Lay2 mit verbesserten katalytischen Eigenschaften ermöglicht.
Eine erfolgreiche Klonierung und Isolation einer katalytischen L-Kette mit Aktivität gegen vasoaktives Intestinalpeptid wurde im US-Patent Nr. 5.229.272 beschrieben, dessen gesamte Offenbarung durch Verweis hierin aufgenommen ist.
Die Sequenz der variablen Domäne der Lay2-L-Kette wurde schon früher im Labor von Dr. Solomon bestimmt. Der V-Exon-kodierte Abschnitt unterscheidet sich von jenem der drei Keimbahngene (011-01) (R. Klein et al., Eur. J. Immunol. 23, 3248–3271 (1993)), die für die Human-II-L-Ketten-Familie kodieren, an sechs Positionen. Von diesen Unterschieden, die vermutlich somatische Mutationen widerspiegeln, betrifft einer eine CDR-Position. An Position 92 in CDR2 weist Lay2 einen Leu-Rest und kein IIe auf. Die restlichen fünf Unterschiede zwischen dem Lay2-Protein und dem Keimbahngen 011-01 betreffen FR-Stellen, die von den CDR-Segmenten entfernt positioniert sind; Lay2 weist außerdem einen zusätzlichen Rest, Glu, an Position 0 auf, der einen siebten Varianz mit unbekannter Signifikanz darstellt. Die Ähnlichkeit zwischen der Lay2-Sequenz und der 011-01-Keimbahnsequenz ist beachtenswert, da sie die Fähigkeit anderer von diesem Keimbahngen abgeleiteter V_L-Domänen widerspiegeln könnte, gp120 zu binden und zu hydrolysieren.
Die für das Lay2-V_L-Domänenprotein kodierende cDNA wurde durch rekursive PCR synthetisiert. Siehe 7. Die vollständige funktionelle rekombinante Form des Proteins kann wie nachstehend beschrieben exprimiert werden. Diese Verfahren wurden schon früher eingesetzt, um erfolgreich Gene zu konstruieren, die für menschliche variable Domänen kodieren (P. Wilkins-Stevens et al., Prot. Science 4, 421–432 (1995)). Kurz gesagt umfasst die Konstruktion der V_L-Domänen-cDNA die Verwendung von rekursiver PCR (C. Prodromou et al., Prot. Eng. 5, 827-829 (1992)), um acht überlappende synthetische Oligonucleotide zu verbinden, die Codons bereitstellen, welche die gesamte V_L-Domäne, eine N-terminale Signalsequenz und flankierende Sequenzen, die Sfil- und Notl-Restriktionsstellen enthalten, überspannen, um eine Insertion in den Expressionsvektor zu ermöglichen. Die cDNA umfasst außerdem ein kurzes C-terminales Linkersegment zur Verwendung bei der Konstruktion eines Fv.
Beispiel III
Isolation von katalytischen gp120-Antikörpern aus AIDS- und SLE-Patienten und rekombinante Produktion davon
Die im vorangegangenen Abschnitt beschriebene L-Kette wurde durch Zufallsscreening von Patienten mit multiplen Myelomen isoliert. Es ist bekannt, dass katalytische Antikörper bei Autoimmunerkrankungen wie Lupus in großen Mengen gebildet werden, und in SLE-Patienten wurden gp120-bindende Antikörper gefunden. Diese Beobachtung bewegte die Erfinder dazu, die Seren von HIV-1-positiven Patienten und Lupus-Patienten auf die Gegenwart von katalytischen Antikörpern gegen gp120 zu analysieren.
Die aus dem Serum isolierte IgG-Fraktion (~0,5 ml) von AIDS-Patienten und SLE-Patienten wurde durch DEAE-Cellulose-Chromatographie (DE52-Matrix, Whatman) oder Protein-G-Sepharose (Pharmacia) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,002 % Natriumazid gereinigt. Die IgG-Fraktionen wurden als ungebundenes Material aus der DEAE-Cellulosesäule und als säureeluiertes Protein aus der Protein-G-Säule erhalten. Die Elution wurde unter Einsatz von 100 mM Glycin, pH 2,7, durchgeführt, gefolgt von einer Neutralisierung der Lösung mit 1 M Tris-Base, pH 9,0. Da IgG-Präparate bekannterweise kleine Mengen freie L-Ketten enthalten, wurde das DEAE-Cellulose-gereinigte IgG einer weiteren Chromatographie auf einer Hochleistungs-Gelfiltrationssäule (Superose-12, Pharmacia) in 50 mM Tris-HCl, 100 mM Glycin, 150 mM NaCl, 0,025 % Tween-20, 0,02 % Natriumazid, pH 7,5 (Durchflussgeschwindigkeit 0,5 ml/min; Fraktionsgröße 0,5 ml) unterzogen. L-Ketten, die im DEAE-Cellulose-gereinigten IgG vorhanden waren, wurden als Fraktion identifiziert, die bei einer Masse von 25 kD eluierte, basierend auf einer Säulenkalibration mit Standard-Proteinen mit bekannter Masse. Proteinkonzentrationen wurden durch Messung von Ultraviolettlicht-Absorptionsvermögen bei 280 nm bestimmt (0,8 mg/ml Proteinlösung ergibt eine Ablesung einer optischen Dichte von 1,0 bei 280 nm bei Verwendung einer Küvette mit einer Weglänge von 1 cm). gp120-Spaltung wurde durch SDS-Elektrophorese und Autoradiographie gemessen, wie im vorangegangenen Abschnitt beschrieben wurde.
Die oben beschriebenen Seren sind polyklonal. Die Auflösung von einzelnen L-Ketten kann mithilfe von zweidimensionaler Gelelektrophorese, gefolgt von einer Elektroelution von einzelnen L-Ketten, erfolgen. Sobald Monomer-L-Ketten isoliert sind, würde eine Sequenzierung des aminoterminalen Peptids erfolgen, um spezifische Oligonucleotidsonden für Klonierungszwecke zu erzeugen.
8 zeigt, dass eine Inkubation von ¹²⁵I-gp120 (2 nM) mit Protein-G-Sepharose-gereinigtem IgG (3 μM) aus einem SLE-Patienten (Laborcode Nr. 530) für 18 Stunden bei 37 °C im Auftreten von Spaltprodukten von gp120 resultierten, die einem Schmier bei etwa 110 kD und aufgelösten Banden bei einer Masse von 37 kD, 24 kD und 10 kD resultierten. Das intakte gp120 ist als 120-kD-Bande erkennbar. Der 110-kD-Schmier kann ein Gemisch aus Polypeptiden oder ein einzelnes Produkt sein, dessen Masse zu nah an der von intaktem gp120 liegt, um seine saubere Trennung durch die in diesem Versuch eingesetzten experimentellen Verfahren zu ermöglichen.
9 zeigt die Inkubation von ¹²⁵I-gp120 (2 nM) mit L-Ketten, die aus einem HIV-positiven Patienten (Laborcode Nr. 005) gereinigt worden waren, für 17 Stunden bei 37 °C, die zum Auftreten von Spaltprodukten von gp120 führte, die 90 kD, 25 kD, 12 kD und <10 kD entsprachen. Ähnliche L-Ketten-Fraktionen von HIV-negativen Kontrollen wiesen keine gp120-Spaltungsaktivität auf. Es ist bekannt, dass die Konzentrationen von L-Ketten in IgG-Präparaten, wie sie beispielsweise in diesem Experiment für die Gelfiltration eingesetzt wurden, sehr gering sind. Eine SDS-Elektrophorese und Silberfärbung zeigen, dass die L-Ketten-Konzentration in dieser IgG-Fraktion <1,5 % war. Die spezifische Aktivität (% Spaltung von gp120/Proteinkonzentration) der als Katalysatoren verwendeten L-Ketten kann berechnet werden und ist zumindest 112-mal größer als die der im vorangegangenen Abschnitt beschriebenen L-Kette des katalytischen Lay2-Antikörpers.
Diese Beobachtungen zeigen, dass die Synthese von L-Ketten mit gp120-Spaltungsaktivität eine relativ häufige Komponente der Immunantwort bei HIV-1- und SLE-Patienten darstellen könnte. Eine wiederauffüllbare Versorgung mit L-Ketten kann er reicht werden, indem das Immunrepertoire der oben genannten Patienten unter Einsatz von Verfahren kloniert wird, die erfolgreich bei der Isolation von VIP-spaltenden L-Ketten von einem Asthma-Patienten eingesetzt wurden, wie in Gao et al., Antibody Engineering Protocols 51, 286–291, Hrsg. S. Paul, Humana Press, Totowa, NJ, USA (1995), beschrieben ist.
Seltene Antikörper können rasch durch ligandenspezifische Affinitätschromatographie von Phagenteilchen isoliert werden, die rekombinante Antikörperfragmente auf ihrer Oberfläche als GenIII-Fusionsproteine aufweisen. Eine VL-Ketten-Phagendisplay-Bibliothek wurde aus den Peripherblut-Lymphozyten eines Asthma-Patienten hergestellt (S. Tyutyulkova et al., Appl. Biochem. Biotech. 47, 191–198 (1994); S. Tyutyulkova et al., Antibody Engineering Protocols 5121, 377–394, Hrsg. S. Paul, Humana Press, Totowa, NJ, USA (1995)). In diese Experimenten wurden Phagenteilchen mit VIP-Bindungsaktivität durch Affinitätschromatographie auf immobilisiertem VIP angereichert. Zwei VIP-bindende L-Ketten wurden in löslicher Form in E. coli exprimiert, wobei ihre Primärstruktur durch cDNA-Sequenzierung abgeleitet wurde, und die Proteine wurden durch Metallchelat- und Protein-L-Affinitätschromatographie bis zur elektrophoretischen Homogenität gereinigt.
Die proteolytische Aktivität der L-Ketten wurde mithilfe eines (Tyr10-¹²⁵I)-VIP-Substrats gemessen. Bei steigenden Konzentrationen der rekombinanten L-Ketten war eine lineare Steigerung der VIP-Hydrolyse zu erkennen. Die Reaktion für beide L-Ketten wies Sättigungskinetik in Bezug auf die Substratkonzentration auf. Die kinetische Wirksamkeit (kcat/Km) unter Verwendung von VIP als Substrat war besser als die oder vergleichbar mit der von Trypsin, einer hochentwickelten Protease. Die L-Ketten katalysierten nicht die Spaltung von Resorufin, ein nichtspezifisches Proteasesubstrat. Die Monomerform der L-Kette war verantwortlich für die Hydrolyse von VIP, was durch die Elution der Aktivität bei ~26 kD aus einer Gelfiltrationssäule gezeigt wurde.
Ähnliche Verfahren können angepasst werden, um die L-Ketten der oben beschriebenen HIV- und SLE-Patienten zu klonieren und zu exprimieren. Peripherblut- Lymphozyter würden gesammelt, und L-Ketten-cDNA würde durch das Umkehrtranskriptase-PCR-Verfahren hergestellt. Die PCR-Produkte würden dann in den Phagemid-Vektor pCANTABhis6 kloniert, der eine Präsentation der L-Ketten auf der Oberfläche von Phagenteilchen oder ihre Expression als lösliche Proteine ermöglicht. Nach der Elektroporation von kompetenten E.-coli-TG1-Zellen mit der Phagemid-DNA wurden Phagenteilchen, die an Protein 3 fusionierte L-Ketten präsentierten, durch Superinfektion mit einem VCSM13-Helferphagen gerettet, mit Polyethylenglykol gefällt und einer Affinitätschromatographie auf einer gp120-Sepharosesäule unterzogen. Klone werden durch Elution bei niedrigem pH isoliert und durch eine Radioimmuntest und/oder ELISA auf gp120-Bindung getestet. Die Klone würden dann in E.-coli-Zellen gezüchtet und die Kulturen mit IPTG (1 mM) 24 Stunden lang induziert, um eine Sekretion von löslichen L-Ketten in den Überstand zu erlauben. L-Ketter können auch im periplasmatischen Raum exprimiert werden, indem die Induktionsperiode mit IPTG von 24 auf 3 Stunden verkürzt wird.
Wie schon erwähnt, werden katalytische Antikörper als Reaktion auf eine Immunisierung mit einem Substrat synthetisiert. Eine Antikörper-L-Ketten-Bibliothek wurde aus einer mit VIP immunisierten Maus kloniert. Die proteolytische Aktivität von L-Ketten-Klonen, die zufällig ausgewählt oder aufgrund ihrer Antigenbindungsaktivität ausgewählt wurden, wurde bestimmt. Die Selektion erfolgt durch Chromatographie von Phagen auf immobilisiertem VIP. Wirksame Katalysatoren, die zur Hydrolyse von (Tyr10-¹²⁵I)-VIP und generischen Proteasesubstraten (Peptidmethylcumarinamide) in der Lage sind, wurden isoliert. Die aufgrund ihrer VIP-Bindungsaktivität selektierten Klone wiesen eine um 1–2 Größenordnungen verbesserte Katalyse auf. Die Steigerung der katalytischen Aktivität war auf die gesteigerte VIP-Bindungsaffinität zurückzuführen. Umsatzzahlen bei Verwendung von VIP als Substrat reichten von 0,1–2,2/min. Etwa 20 % der gereinigten L-Ketten von 156 zufällig ausgewählten Klonen, die bei 10 nM Protein getestet wurden, wiesen bei Verwendung eines synthetischen Peptids als Substrat katalytische Aktivität auf. Die variable Region der zwölf L-Ketten-Klone wurde sequenziert, und mit katalytischer Aktivität assoziierte Consensus-Sequenzen und Raummotive werden nun gesucht. Diese Beobachtungen zeigen eine häufige Katalyse durch das natürliche Antikörper-L-Kettenrepertoire und die Entwicklung von antigenspezifischer katalytischer Aktivität durch Immunisierung mit einem Polypeptid auf. Dies kann durch eine De-novo-Entwicklung von katalytischer Aktivität aufgrund einer Sequenzdiversifikation von variablen Regionen oder seiner Vererbung als Keimbahnaktivität und Aufrechterhaltung während der Reifung von hoher Affinität für das Immunogen erfolgen.
Eine Infektion mit HIV-1 induziert eine starke Immunreaktion. Die Klonierung einer L-Ketten-Bibliothek aus den Lymphozyten des oben beschriebenen Patienten unter Verwendung des hierin beschriebenen Verfahrens für VIP-L-Ketten-Klonierung wäre auch bei der Isolation einer wiederauffüllbaren Versorgung mit Anti-gp120-Hydrolyseantikörper-L-Ketten erfolgreich.
Beispiel IV
Behandlung von Patienten mit den gp120-hydrolysierenden L-Ketten der Erfindung
Die katalytischen Anti-gp120-L-Ketten-Antikörper können in einem geeigneten pharmazeutischen Exzipienten an Patienten verabreicht werden, um die Werte von löslichen gp120-Antigenen im Körper zu senken.
Über die klinische Verwendung von Immunglobulin zur intravenösen Verabreichung (IVIG) wurde steht ein detaillierter Überblick zur Verfügung (siehe beispielsweise Dietrich et al., Blood 9, 2946–51 (1992); Rossi et al., Immunol. Rev.110, 135–149 (1989); J.M. Dwyer, New Eng. J. Med. 326, 107–16, (1992); S.A. Schwartz, J. Clin. Immunol. 10, 81 (1990)).
Die gereinigtes gp120 hydrolysierenden L-Ketten der vorliegenden Erfindung würden i.v. an Patienten verabreicht, um die Werte an HV-1 und löslichem gp120 im Körper zu senken. Die Dosierungen würden je nach Virusbelastung im Patienten angepasst und variieren zwischen 1/100 der Virusbelastung bis zu stöchiometrischen (1:1) Werten. Da die L-Ketten katalytisch sind, können für eine Virusneutralisation gegebenenfalls wesentlich geringere Dosen erforderlich sein. Es ist bekannt, dass Dosierungen von IgG im Bereich von 0,25–1 g/kg Körpergewicht sicher sind. Die Wirksamkeit wür de durch eine ELISA-Analyse der Werte an löslichem gp120 vor und nach einer Behandlung gemessen.
Alternativ dazu würde die Anti-gp120-Hydrolyseantikörper der Erfindung direkt in das Hirn von Patienten verabreicht, die an AIDS-bezogener Demenz leiden. Die Verabreichung von Therapeutika in das Hirn wurde in der Literatur beschrieben. Siehe beispielsweise R.E. Harbaugh, Biomed. Pharmacother. 43, 483–485 (1989); Johnson et al., J. Neurosurg. 70, 240–248 (1989); L. Giannone et al., J. Clin. Oncol. 4, 68–73 (1986).
Die gp120 hydrolysierenden Leichtketten können direkt mithilfe einer Kanüle in das intraventrikuläre Kompartiment verabreicht oder alternativ dazu an ein Transferrin-Molekül konjugiert und i.v. verabreicht werden. Die Konstruktion von Fusionsproteinen ist auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Die Gensequenzen, die für die katalytische L-Kette der Erfindung kodieren, würden operabel an die für Transferrin kodierenden Gensequenzen gebunden. Es wurde gezeigt, dass Transferrin in der Lage ist, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, sodass es die L-Kette der Erfindung effektiv in das Hirn transportieren könnte (Shin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 2820–2824 (1995).

Claims

Isolierter menschlicher katalytischer Antikörper, der die Spaltung einer Peptidbindung im Glykoprotein 120 eines menschlichen Immunschwächevirus („Human Immunodeficiency Virus", HIV) katalysiert, wobei der Antikörper aus dem Serum von Menschen, die mit HIV infiziert sind, oder von SLE-Patienten erhältlich ist.
Antikörper nach Anspruch 1, worin der Antikörper ein IgG ist.
Fv, das unter Einsatz von für einen Antikörper nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 kodierenden Nucleinsäuren rekombinant hergestellt ist.
Verfahren zur Isolation eines menschlichen katalytischen Antikörpers, der die Spaltung von gp120 katalysiert, folgende Schritte umfassend: a) das Screenen von menschlichen Serumproben auf die Gegenwart des menschlichen katalytischen Antikörpers, wie anhand der Bildung von Spaltprodukten des gp120 mit weniger als 120 kD gemessen; und b) das Reinigen des Antikörpers; worin das Serum von einem mit HIV-1 infizierten Patienten oder von einem SLE-Patienten stammt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Verfahren weiteres folgende Schritte umfasst: c) das Bestimmen der genetischen Sequenz des menschlichen katalytischen Antikörpers; d) das Einführen der für den menschlichen katalytischen Antikörper kodierenden Sequenz in eine Zelle; e) das Exprimieren des Antikörpers in der Zelle.
Verfahren zur Herstellung eines katalytischen Anti-gp120-Antikörpers aus dem Serum von mit HIV infizierten Menschen oder von SLE-Patienten, umfassend: a) das Isolieren von mRNA aus den Lymphozyten im peripheren Blut des Menschen; b) das Bilden einer cDNA aus der mRNA unter Einsatz von Umkehrtranskriptase-PCR; c) das Einführen der cDNA in einen Vektor unter Einsatz von geeigneten Restriktionsstellen; und d) das Inkorporieren des Vektors in einen Phagen, sodass cDNA-Sequenzen exprimiert werden und rekombinante Proteine auf der Oberfläche des Phagen exponiert werden; e) das Isolieren von Phagenteilchen, welche die Anti-gp120-Katalyseaktivität exprimieren, mittels Säulenchromatographie; f) das Transformieren von E. coli mit dem Phagen, der die gp120-Katalyseaktivität exprimiert; und g) das Reinigen der katalytischen Anti-gp120-Antikörper aus den transformierten E.-coli-Zellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, worin der Antikörper ein IgG ist.
Verwendung eines menschlichen katalytischen Antikörpers nach Anspruch 1 oder 2 oder eines Fv nach Anspruch 3 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines HIV-1-positiven Patienten, worin die Herstellung eines Medikaments, das ein Fv nach Anspruch 3 umfasst, Folgendes umfasst: a) das operable Verbinden einer genetischen Sequenz, die für das Fv kodiert, mit einer genetischen Sequenz, die für Transferrin kodiert; b) das Transformieren einer Zelle mit diesen operabel verbundenen Sequenzen, sodass ein Fusionsprotein synthetisiert wird; c) das Reinigen des Fusionsproteins; und d) das Herstellen eines Medikaments, das dieses Fusionsprotein umfasst, zur Verabreichung an einen Patienten in einem geeigneten pharmazeutischen Träger.
Verwendung nach Anspruch 8 eines menschlichen katalytischen Antikörpers nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Antikörper i.v. in einem Dosierungsbereich von 0,1–1 g/kg Körpergewicht verabreicht wird.