JPH0335781A - キメラcd4イムノグロブリンポリペプチド類 - Google Patents
キメラcd4イムノグロブリンポリペプチド類Info
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- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70514—CD4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
可溶性CD4はいくつかの理由からヒト免疫不全ウィル
ス(Hmの中和にとって最適な特異性を提供する。第一
には、CD4とHIV−会合リガントgp120との間
の相互作用の強度が極めて高い、すなわち10−’Mの
準位である(Smith、 D、H,らの5cienc
e罎阻、 1704−1707.1987; La5k
y、 L、らのCe1l 50゜975−985.19
87):とである。第二には、HrV(7)遺伝的変異
体が頻繁に出現しそして免疫的監視からの“逃避”機構
を現出しうるものであるが(にla tza+annお
よびGlucksanの!++nuno1.Today
、1.291−296(1986J)、 それら変異
体はそれらの感染循環を維持するためにそれらのCD4
結合性質を保持する必要があることである。第三に、感
染期間中に獲得された旧Vエンベロープ蛋白fgp12
0に対する免疫が免疫系に対して有害な作用を有し得、
ウィルスから脱落した遊離のgp120 (Schne
ider、 J、らのJ、 Gen、 Virol、f
i!、 2533−2539 (1986]) はC
D4−陽性細胞上で特異的に捕捉され得るからである。
ス(Hmの中和にとって最適な特異性を提供する。第一
には、CD4とHIV−会合リガントgp120との間
の相互作用の強度が極めて高い、すなわち10−’Mの
準位である(Smith、 D、H,らの5cienc
e罎阻、 1704−1707.1987; La5k
y、 L、らのCe1l 50゜975−985.19
87):とである。第二には、HrV(7)遺伝的変異
体が頻繁に出現しそして免疫的監視からの“逃避”機構
を現出しうるものであるが(にla tza+annお
よびGlucksanの!++nuno1.Today
、1.291−296(1986J)、 それら変異
体はそれらの感染循環を維持するためにそれらのCD4
結合性質を保持する必要があることである。第三に、感
染期間中に獲得された旧Vエンベロープ蛋白fgp12
0に対する免疫が免疫系に対して有害な作用を有し得、
ウィルスから脱落した遊離のgp120 (Schne
ider、 J、らのJ、 Gen、 Virol、f
i!、 2533−2539 (1986]) はC
D4−陽性細胞上で特異的に捕捉され得るからである。
こうして、これらの非感染細胞は種々の形の抗−ap1
20免疫攻撃の標的となり得る(Lyerly、 H,
K。
20免疫攻撃の標的となり得る(Lyerly、 H,
K。
らのPNAS USA 鉦、 4601−4605.
[1987] : Weinhold。
[1987] : Weinhold。
K、J、らのLancet+ 902−905+ [1
988] ; Lanzavecchia。
988] ; Lanzavecchia。
^、らのNature 334.530−534 [1
988]: 5iliciano。
988]: 5iliciano。
R,F、らのCe1l旦、 561−575 [198
8]) 、 CD4特異性に基づく受動免疫は、それが
細胞表面に結合したCD4受容体に結合されたap12
0分子をウィルスに感染した細胞により産生されたもの
と区別することができるため、局外者によるこの破壊を
回避させることができる。該可溶性CD4分子の調製は
例えばSm1th、 D、H,らの5cience 1
3J1.1704−1707゜(1987); Fis
her、 R,^、らのNature !l11.76
−78゜(1988); Hussey、 R,E、ら
のNature !111.78−8L(198B);
Deen、 K、C,らのNature 、ill、
82−84.(1988); Traunecker
、 A、 らのNature フ4.84−86゜(
1988) ;およびコロンビア大学の研究者ら(WO
88101304参照)によって報告されている。加う
るに、Trauneckerら(Nature 、11
1.84−86.1988)は、イムノグロブリン軽鎖
の定常ドメインに融合した場合にCD4の最初の2つの
ドメインがインビトロにおいてHIV感染を阻止するの
に充分であることを示した。
8]) 、 CD4特異性に基づく受動免疫は、それが
細胞表面に結合したCD4受容体に結合されたap12
0分子をウィルスに感染した細胞により産生されたもの
と区別することができるため、局外者によるこの破壊を
回避させることができる。該可溶性CD4分子の調製は
例えばSm1th、 D、H,らの5cience 1
3J1.1704−1707゜(1987); Fis
her、 R,^、らのNature !l11.76
−78゜(1988); Hussey、 R,E、ら
のNature !111.78−8L(198B);
Deen、 K、C,らのNature 、ill、
82−84.(1988); Traunecker
、 A、 らのNature フ4.84−86゜(
1988) ;およびコロンビア大学の研究者ら(WO
88101304参照)によって報告されている。加う
るに、Trauneckerら(Nature 、11
1.84−86.1988)は、イムノグロブリン軽鎖
の定常ドメインに融合した場合にCD4の最初の2つの
ドメインがインビトロにおいてHIV感染を阻止するの
に充分であることを示した。
かかる可溶性CD4−分子を種々のイムノグロブリン重
鎖分子と結合させることにより、いわゆるキメラCD4
−イムノグロブリンポリペプチドが生成され、これらは
既に可溶性CD4−分子について述べた点に加えて以下
の利点を有する。すなわちイムノグロブリン部分は、キ
メラポリペプチドの残る部分に対して大きい安定性を付
与しそれにより、例えばヒトIgGの23日およびIg
Mの5日のようにインビボにおけるそれらの半減期を高
める可能性がある(Waldmanらの”Immuno
globulins + E。
鎖分子と結合させることにより、いわゆるキメラCD4
−イムノグロブリンポリペプチドが生成され、これらは
既に可溶性CD4−分子について述べた点に加えて以下
の利点を有する。すなわちイムノグロブリン部分は、キ
メラポリペプチドの残る部分に対して大きい安定性を付
与しそれにより、例えばヒトIgGの23日およびIg
Mの5日のようにインビボにおけるそれらの半減期を高
める可能性がある(Waldmanらの”Immuno
globulins + E。
Merler編、 、1970.33−48頁、 Na
tional Academy ofScience、
Washington+ oc〉、更には、r (I
gG)およびμ(IgM)重鎖の定常領域は補体を結合
でき、HIVウィルス類またはウィルス産生細胞の中和
または段孔をより効果的なものとなす(Yarchou
nらの5cientific American+ 1
988年10月参照)、インビボにおける半減期増大は
、最初の2つまたは4つの全てのCD4−ドメインおよ
びヒトIgG+1tlf定常領域の3つの全てのドメイ
ンからなるキメラポリペプチドに関してCapon+
D、J、らのNature 331+525−531
(1989)に示されている。これらの特定のキメラポ
リペプチドへの補体の結合は観察されなかった。しかし
ながら本発明のキメラポリペプチドに対する補体の結合
は示され得る〔詳細は実施例5および第5図参照〕、更
に、これらのポリペプチドはPc−受容体に結合し〔実
施例6および第5図〕、それにより抗体依存性細胞毒性
(ADCC)を仲介し得るリンパ細胞を誘引し得た。
Fc−受容体への結合はCapon+口、J、ら(前
出)によってもそれらのキメラポリペプチドに関して示
されている。これらの作用は該キメラポリペプチド類の
軽鎖部分ではなくして重鎖部分の寄与によるものである
から、これらの作用のすべては、Traunecker
らのNature 、ill、 84−86(1988
)およびImmunologyToday ljl、
29−32 (1989)に記載されたキメラC[14
−イムノグロブリン軽鎖ポリペプチドに比較したキメラ
CD4−イムノグロブリン重鎖ポリペプチドの長所であ
る。
tional Academy ofScience、
Washington+ oc〉、更には、r (I
gG)およびμ(IgM)重鎖の定常領域は補体を結合
でき、HIVウィルス類またはウィルス産生細胞の中和
または段孔をより効果的なものとなす(Yarchou
nらの5cientific American+ 1
988年10月参照)、インビボにおける半減期増大は
、最初の2つまたは4つの全てのCD4−ドメインおよ
びヒトIgG+1tlf定常領域の3つの全てのドメイ
ンからなるキメラポリペプチドに関してCapon+
D、J、らのNature 331+525−531
(1989)に示されている。これらの特定のキメラポ
リペプチドへの補体の結合は観察されなかった。しかし
ながら本発明のキメラポリペプチドに対する補体の結合
は示され得る〔詳細は実施例5および第5図参照〕、更
に、これらのポリペプチドはPc−受容体に結合し〔実
施例6および第5図〕、それにより抗体依存性細胞毒性
(ADCC)を仲介し得るリンパ細胞を誘引し得た。
Fc−受容体への結合はCapon+口、J、ら(前
出)によってもそれらのキメラポリペプチドに関して示
されている。これらの作用は該キメラポリペプチド類の
軽鎖部分ではなくして重鎖部分の寄与によるものである
から、これらの作用のすべては、Traunecker
らのNature 、ill、 84−86(1988
)およびImmunologyToday ljl、
29−32 (1989)に記載されたキメラC[14
−イムノグロブリン軽鎖ポリペプチドに比較したキメラ
CD4−イムノグロブリン重鎖ポリペプチドの長所であ
る。
更には、以下に記載される本発明のポリペプチドのいく
つかは、1個のポリマー構造中に数個のgp120結合
部位を含有する明確なオリゴマーを形威し、それによっ
て、例えばTrauneckerらのNature3m
、 84−86 (1988)に記載されるキメラポリ
ペプチドと比較した場合にキメラCD4−IgM重鎖ポ
リペプチドに見出されるように、HIV−依存性シンシ
チウムアッセイにおいてHIV−阻害効果を1000倍
増大させる。
つかは、1個のポリマー構造中に数個のgp120結合
部位を含有する明確なオリゴマーを形威し、それによっ
て、例えばTrauneckerらのNature3m
、 84−86 (1988)に記載されるキメラポリ
ペプチドと比較した場合にキメラCD4−IgM重鎖ポ
リペプチドに見出されるように、HIV−依存性シンシ
チウムアッセイにおいてHIV−阻害効果を1000倍
増大させる。
本発明は、一つの断片がヒトCD4−分子の最初の2個
のドメインまたはその一部分をコードし、他方が哺乳類
イムノグロブリンの重鎖の定常領域の最初の部分を除く
すべてのドメインをコードするものである2つのDNA
断片の組合せからなるクローン化DNAに関する。ヒト
CD4−分子の最初の2個のドメインの部分とは下記の
ことを意味しうる: (a) 第2のドメインの一部分と組合された完全な
第1のドメイン、または (b) 第1のドメインの一部分と組合された完全な
第2のドメイン、または (C) 両頭域の一部分ずつの組合せ。
のドメインまたはその一部分をコードし、他方が哺乳類
イムノグロブリンの重鎖の定常領域の最初の部分を除く
すべてのドメインをコードするものである2つのDNA
断片の組合せからなるクローン化DNAに関する。ヒト
CD4−分子の最初の2個のドメインの部分とは下記の
ことを意味しうる: (a) 第2のドメインの一部分と組合された完全な
第1のドメイン、または (b) 第1のドメインの一部分と組合された完全な
第2のドメイン、または (C) 両頭域の一部分ずつの組合せ。
本発明の好ましい実施態様は前記断片の一方が、ヒトC
D4−分子の最初の2つのドメインをコードしているク
ローン化DNAである。
D4−分子の最初の2つのドメインをコードしているク
ローン化DNAである。
他の好ましい実施態様は前記断片の一方が上記の特徴を
有し、前記断片の他方が、(a)哺乳類1gM、(b)
哺乳類rgc、または(C)@乳類1gA、の重鎖の定
常領域の最初の部分を除くすべてのドメインをコードす
るクローン化DNAである。
有し、前記断片の他方が、(a)哺乳類1gM、(b)
哺乳類rgc、または(C)@乳類1gA、の重鎖の定
常領域の最初の部分を除くすべてのドメインをコードす
るクローン化DNAである。
本発明の他の好ましい実施態様は上記定義されたクロー
ン化DNAにおいて該哺乳類イムノグロブリンがマウス
またはヒトイムノグロブリンであるものである。
ン化DNAにおいて該哺乳類イムノグロブリンがマウス
またはヒトイムノグロブリンであるものである。
本発明の特に好ましい実施態様は上記定義されたクロー
ン化DNAにおいて、CD4コ一ド部分が前記のとおり
であり、そしてDNA断片の他方が、(a) ?ウスI
g r 2a、または(b)?ウスIgμ、または(C
)ヒトIgu、または(d)ヒトIg71.または(e
)ヒトIgγ3、または(f)ヒト1gα1、または(
濁ヒトIgα2の重鎖の定常領域の最初の部分を除くす
べてのドメインをコードするものである。
ン化DNAにおいて、CD4コ一ド部分が前記のとおり
であり、そしてDNA断片の他方が、(a) ?ウスI
g r 2a、または(b)?ウスIgμ、または(C
)ヒトIgu、または(d)ヒトIg71.または(e
)ヒトIgγ3、または(f)ヒト1gα1、または(
濁ヒトIgα2の重鎖の定常領域の最初の部分を除くす
べてのドメインをコードするものである。
本発明は更に、前記定義されたDNAを含有するベクタ
ー好ましくは原核生物および真核生物宿主細胞内で複製
可能なシャトルベクター、更に好ましくは適切な宿主細
胞内で、組み込まれたDNAによりコードされる蛋白質
を発現しうるシャトルベクターに関する。
ー好ましくは原核生物および真核生物宿主細胞内で複製
可能なシャトルベクター、更に好ましくは適切な宿主細
胞内で、組み込まれたDNAによりコードされる蛋白質
を発現しうるシャトルベクターに関する。
本発明の他の目的は前記定義されたベクターにより形質
転換された原核生物および真核生物宿主細胞、ならびに
かかる形質転換された宿主細胞を適切な培地中で培養す
ることによる前記定義されたDNAによりコードされる
ポリペプチドの製造方法にある。
転換された原核生物および真核生物宿主細胞、ならびに
かかる形質転換された宿主細胞を適切な培地中で培養す
ることによる前記定義されたDNAによりコードされる
ポリペプチドの製造方法にある。
本発明のもう一つの実施態様は、前記定義されたDNA
によりコードされるポリペプチド類それ自体である。か
かるポリペプチドはヒトCD4−分子の最初の2つのド
メインまたはそれらの断片、および哺乳類イムノグロブ
リン(rg)の重鎖の定常領域の最初の部分を除くすべ
てのドメインを含んでなるキメラ的な実体のものである
。好ましいポリペプチド類はrg部分に加え、ヒトCD
4−分子の最初の2つのドメインを含むものである。特
に好ましい実施態様においてはこれらのポリペプチドの
CD4一部分はア案ノ酸配列 KKVVLGKKGDTVELTCTASQKKSIQ
FHWKNSNQIKILGNQSFLTKGPSKL
NDRADSRR5LWDQGNFPL I IKNL
K I EDSDTY I CEVEDQKEEVQL
LVFGLTANSDTHLLQGQSLTLTLES
PPGSSPSVQCR3PRGKN I QGGKT
LSVSQLELQDSGTWTCTVLQNQKKV
EFKIDIVVLを含有する。
によりコードされるポリペプチド類それ自体である。か
かるポリペプチドはヒトCD4−分子の最初の2つのド
メインまたはそれらの断片、および哺乳類イムノグロブ
リン(rg)の重鎖の定常領域の最初の部分を除くすべ
てのドメインを含んでなるキメラ的な実体のものである
。好ましいポリペプチド類はrg部分に加え、ヒトCD
4−分子の最初の2つのドメインを含むものである。特
に好ましい実施態様においてはこれらのポリペプチドの
CD4一部分はア案ノ酸配列 KKVVLGKKGDTVELTCTASQKKSIQ
FHWKNSNQIKILGNQSFLTKGPSKL
NDRADSRR5LWDQGNFPL I IKNL
K I EDSDTY I CEVEDQKEEVQL
LVFGLTANSDTHLLQGQSLTLTLES
PPGSSPSVQCR3PRGKN I QGGKT
LSVSQLELQDSGTWTCTVLQNQKKV
EFKIDIVVLを含有する。
本発明の他の好ましいポリペプチド類は前記詳細に述べ
たDNA類によりコードされるものである。
たDNA類によりコードされるものである。
前記ポリペプチド類の少なくとも一種および治療上許容
される担体物質を含有する医薬組成物、ならびにそれら
の製法は本発明のもう一つの実施態様である。
される担体物質を含有する医薬組成物、ならびにそれら
の製法は本発明のもう一つの実施態様である。
最後に、本発明はまた医薬Mi戒物の調製のため、およ
び種々の疾患の治療特にエイズ(AIDS)の治療のた
めの前記ポリペプチドの使用にも関するものである。
び種々の疾患の治療特にエイズ(AIDS)の治療のた
めの前記ポリペプチドの使用にも関するものである。
本発明は、添付した図面と関連させて以下の詳細な記述
に基づきより良く理解されよう。
に基づきより良く理解されよう。
第1図はプラスくドpHT4−Yに12 、pCD4−
Mμ、およびpCD4−Mγ2aを示す0箱は、エクソ
ンの特定の部分と同等なcDNAの断片〔実施例1参照
〕、またはプラスミドの作製に使用されたエクソンそれ
自体を示し、ここで白ぬきの箱は、ヒトCD4分子のリ
ーダー領域(L)および4個すべて(1,2,3,4)
の細胞外ドメインをコードするDNAを示す、Xの箱は
イムノグロブリンに軽鎖定常N域(Cに)をコードする
エクソンを示す0点を付した箱はマウスtgc、、定常
領域のヒンジ(Y4)ならびに第2および第3のドメイ
ン(C2,C3)をそれぞれコードするエクソンを示す
。斜線を付した箱はマウス11M定常領域の第2、第3
および第4のドメインをそれぞれコードするエクソンを
示す、他の略号は: B=Baa+H1制限部位、R=
EcoRI制限部位、5=Sall制限部位、5sxS
stl制限部位、5t=Stul制限部位、X−Xba
l制限部位、Xh = Xhol制限部位、amp ”
アンピシリン耐性遺伝子、gpt−大腸菌(E。
Mμ、およびpCD4−Mγ2aを示す0箱は、エクソ
ンの特定の部分と同等なcDNAの断片〔実施例1参照
〕、またはプラスミドの作製に使用されたエクソンそれ
自体を示し、ここで白ぬきの箱は、ヒトCD4分子のリ
ーダー領域(L)および4個すべて(1,2,3,4)
の細胞外ドメインをコードするDNAを示す、Xの箱は
イムノグロブリンに軽鎖定常N域(Cに)をコードする
エクソンを示す0点を付した箱はマウスtgc、、定常
領域のヒンジ(Y4)ならびに第2および第3のドメイ
ン(C2,C3)をそれぞれコードするエクソンを示す
。斜線を付した箱はマウス11M定常領域の第2、第3
および第4のドメインをそれぞれコードするエクソンを
示す、他の略号は: B=Baa+H1制限部位、R=
EcoRI制限部位、5=Sall制限部位、5sxS
stl制限部位、5t=Stul制限部位、X−Xba
l制限部位、Xh = Xhol制限部位、amp ”
アンピシリン耐性遺伝子、gpt−大腸菌(E。
coli)キサンチン−グアニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ遺伝子、にproys−1gに7”t)−
[−−ター、にEIJH=Igにエンハンサ−1H−C
HNH=Igll鎖エンハンサ−を示す。
スフェラーゼ遺伝子、にproys−1gに7”t)−
[−−ター、にEIJH=Igにエンハンサ−1H−C
HNH=Igll鎖エンハンサ−を示す。
第2図はプラス逅ドpHT4−YK12(第1図参照)
、pCD4−MμおよびpcD4−1111を示す、こ
れら後者プラスミドにおいて、箱は第1図のマウスエク
ソンに対応するヒトIgGおよび1gM領域を示す、“
P”はPstl制限部位、および“Ha“はHas n
制限部位、“Pν”はPvu II制限部位および“S
11″は5eal制限部位を示す、他のすべての記号お
よび略号は第1図におけると同じ意味を有する。
、pCD4−MμおよびpcD4−1111を示す、こ
れら後者プラスミドにおいて、箱は第1図のマウスエク
ソンに対応するヒトIgGおよび1gM領域を示す、“
P”はPstl制限部位、および“Ha“はHas n
制限部位、“Pν”はPvu II制限部位および“S
11″は5eal制限部位を示す、他のすべての記号お
よび略号は第1図におけると同じ意味を有する。
第3図は第1図中に示される相当するプラスミドルCD
4−M #およびpCD4−M 72a中に組込まれた
クローン化DNAによりコードされるキメラポリペプチ
ド類、“CD4−Mμ”および“CD4−M r 2a
”のウェスタンプロット分析を示す、レーンAは細胞培
養上清由来の免疫沈降されたキメラ−ポリペプチドまた
は天然1g分子、または(1)の場合のように免疫沈降
された細胞培養上清の還元条件下における10%ポリア
クリルアミドゲル(PAGIIり操作のプロットを示す
: (1) X63−0 : 1g分子を分泌しなイx63
−0ξエローマ細胞系[P3X63^g8細胞系と同一
](2) L3T4 : Trauneckerらの
Ims+uno1.Today 10+ 29−32(
1989)記載の細胞系により分泌された可溶性マウス
CD4−分子 (3) HT4−Yl:キメラCD4−マウス1gに軽
鎖ポリペプチドを分泌するpHT4−Yl [Trau
neckerらのNature 本比、 84−86(
198B)]でトトランスフェラーゼされたX63−0
ξエローマ細胞系 (4) 81.8/Ig?I、λ:マウスIgMを分泌
する細胞系[Reth、M、らのEurop、J、l5
−unol、J、393(1978)] (5) CD4−Mμ:キメラCD4−Mμmポリペプ
チドを分泌するpCD4−1’lμでトランスフエフシ
ロンされたX63−0 ミエローマ細胞系 (6) UPC10/IgG2a、 x : IgG2
aを分泌するUPC10細胞系[Litton Bio
netics、 Kensington+Maryla
nd、 USAI (7)CD4−Mr2a:キメラCD4−M r 2a
ポリペプチドを分泌する9CD4−M T 2Mでトラ
ンスフエフシランされたX63−Oaエローマ細胞系試
料1〜3はウサギ抗−マウスににより、試料4および5
は、ウサギ抗−マウスIgMにより、試料6および7は
蛋白質−Aにより免疫沈降させた。
4−M #およびpCD4−M 72a中に組込まれた
クローン化DNAによりコードされるキメラポリペプチ
ド類、“CD4−Mμ”および“CD4−M r 2a
”のウェスタンプロット分析を示す、レーンAは細胞培
養上清由来の免疫沈降されたキメラ−ポリペプチドまた
は天然1g分子、または(1)の場合のように免疫沈降
された細胞培養上清の還元条件下における10%ポリア
クリルアミドゲル(PAGIIり操作のプロットを示す
: (1) X63−0 : 1g分子を分泌しなイx63
−0ξエローマ細胞系[P3X63^g8細胞系と同一
](2) L3T4 : Trauneckerらの
Ims+uno1.Today 10+ 29−32(
1989)記載の細胞系により分泌された可溶性マウス
CD4−分子 (3) HT4−Yl:キメラCD4−マウス1gに軽
鎖ポリペプチドを分泌するpHT4−Yl [Trau
neckerらのNature 本比、 84−86(
198B)]でトトランスフェラーゼされたX63−0
ξエローマ細胞系 (4) 81.8/Ig?I、λ:マウスIgMを分泌
する細胞系[Reth、M、らのEurop、J、l5
−unol、J、393(1978)] (5) CD4−Mμ:キメラCD4−Mμmポリペプ
チドを分泌するpCD4−1’lμでトランスフエフシ
ロンされたX63−0 ミエローマ細胞系 (6) UPC10/IgG2a、 x : IgG2
aを分泌するUPC10細胞系[Litton Bio
netics、 Kensington+Maryla
nd、 USAI (7)CD4−Mr2a:キメラCD4−M r 2a
ポリペプチドを分泌する9CD4−M T 2Mでトラ
ンスフエフシランされたX63−Oaエローマ細胞系試
料1〜3はウサギ抗−マウスににより、試料4および5
は、ウサギ抗−マウスIgMにより、試料6および7は
蛋白質−Aにより免疫沈降させた。
すべての抗体類および蛋白質Aはセファロース4B (
Pharg*acia、 IJppsala+ Swe
den)上に固定化させた。ウェスタンプロット分析は
非還元条件下に3−7%勾配PAGE (B)または7
%PAGE(C)操作の後に行なわれた。結果は第一段
階でウサギ抗−マウスrg類(Nordic Labs
+ NL)の混合物を用いて可視化し次にロバII!J
−標識抗−ウサギIg(Amersham。
Pharg*acia、 IJppsala+ Swe
den)上に固定化させた。ウェスタンプロット分析は
非還元条件下に3−7%勾配PAGE (B)または7
%PAGE(C)操作の後に行なわれた。結果は第一段
階でウサギ抗−マウスrg類(Nordic Labs
+ NL)の混合物を用いて可視化し次にロバII!J
−標識抗−ウサギIg(Amersham。
Aylesbury、 GB)を用いて可視化した。標
準分子量マーカーを左側(A)に示しである(kd)、
(A)における約45kdのバックグラウンドバンド
(1〜5)は試料が電気泳動用に調製された場合にセフ
ァロースから放出されたウサギIgGによる。代謝的に
標識されたgp120の存在下であってそれ以外は(A
) −(C)と同じ条件における、HIV I感染H9
細胞上清からの共同免疫沈降に続< PAGEおよびフ
ルオログラフィが(D)に示される。
準分子量マーカーを左側(A)に示しである(kd)、
(A)における約45kdのバックグラウンドバンド
(1〜5)は試料が電気泳動用に調製された場合にセフ
ァロースから放出されたウサギIgGによる。代謝的に
標識されたgp120の存在下であってそれ以外は(A
) −(C)と同じ条件における、HIV I感染H9
細胞上清からの共同免疫沈降に続< PAGEおよびフ
ルオログラフィが(D)に示される。
第4図は以下の組換え蛋白質に関するシンシチウム形成
の阻害の程度を示し、これらの蛋白質の濃度がX軸に対
数目盛で示され、そしてY軸には三通りで採点されたシ
ンシチウムの数が示される。
の阻害の程度を示し、これらの蛋白質の濃度がX軸に対
数目盛で示され、そしてY軸には三通りで採点されたシ
ンシチウムの数が示される。
:CD4−M# 雪プラスミFpCD4JμのDNAに
よりコードされるキメラ蛋白質。
よりコードされるキメラ蛋白質。
:CD4−M r 2a =プラスミドルCD4−M
12aのDNAによりコードされるキメラ蛋白質。
12aのDNAによりコードされるキメラ蛋白質。
:CD4−Mに=プラスミドpHT4〜YK12のDN
Aによりコードされるキメラ蛋白質。
Aによりコードされるキメラ蛋白質。
:L3T4−M tc =Trauneckerら(I
mmunol、Today 10+ 2932 [19
89])に記載される可溶性マウスCD4−分子。
mmunol、Today 10+ 2932 [19
89])に記載される可溶性マウスCD4−分子。
第5図(A、 B)は、実施例5により測定されるCL
qに対するCD4−MμおよびCD4−門γ2aの結合
のアッセイ結果を示し、ここでC1qはそれらの重鎖部
分の結合゛部位を介して補体カスケードの第1戒分であ
る[Burton、 o、 Mo1ecu1. Imm
unol、22゜161−206 (1985))。マ
イクロタイタープレートを精製CD4−Ig類および対
照としての天然1g類を用いて10 u god (A
)および1 ug/d!(B)の濃度で被覆した。1′
■−標FJi C1qの直接結合は1分当りのカウント
数(c、p、m、)によって与えられる。レーンarc
04−M 12a ;レーンb :IgG2a、 tc
(Ortho Diagnostics)であるモノ
クローナル抗体0KT3;レーンc :CD4−門μ:
レーンd :TEPC183(Litton Bion
etics)からのマウス1gM、 x ;レーンe:
cD4−Mx [TrauneckerらのNatur
e 331.84−86 (1988)) ;レーン
f:ウシ血清アルブξン。
qに対するCD4−MμおよびCD4−門γ2aの結合
のアッセイ結果を示し、ここでC1qはそれらの重鎖部
分の結合゛部位を介して補体カスケードの第1戒分であ
る[Burton、 o、 Mo1ecu1. Imm
unol、22゜161−206 (1985))。マ
イクロタイタープレートを精製CD4−Ig類および対
照としての天然1g類を用いて10 u god (A
)および1 ug/d!(B)の濃度で被覆した。1′
■−標FJi C1qの直接結合は1分当りのカウント
数(c、p、m、)によって与えられる。レーンarc
04−M 12a ;レーンb :IgG2a、 tc
(Ortho Diagnostics)であるモノ
クローナル抗体0KT3;レーンc :CD4−門μ:
レーンd :TEPC183(Litton Bion
etics)からのマウス1gM、 x ;レーンe:
cD4−Mx [TrauneckerらのNatur
e 331.84−86 (1988)) ;レーン
f:ウシ血清アルブξン。
第5図(C)は、マウスマクロファージ細胞系J774
A、1(ATCCNtlTIB67)上のFc7受容
体へのキメラ蛋白質CD4−Mγ2aの結合結果を示す
。I25j−標識CD4−Mγ2aの競合百分率(%)
は実施例6で測定されるように非標識競合体に応じて得
られている〔(○): CD4−M72a、 (・):
非標識18G2a =モノクローナル抗体0KT3)。
A、1(ATCCNtlTIB67)上のFc7受容
体へのキメラ蛋白質CD4−Mγ2aの結合結果を示す
。I25j−標識CD4−Mγ2aの競合百分率(%)
は実施例6で測定されるように非標識競合体に応じて得
られている〔(○): CD4−M72a、 (・):
非標識18G2a =モノクローナル抗体0KT3)。
本発明はまた、本発明のDNAによりコードされるポリ
ペプチドの製造方法にも関するもので、この方法は前記
ポリペプチドを発現しうるづフタ−で形質転換された宿
主細胞を適当な培地中で培養しそして前記ポリペプチド
を単離することからなる。
ペプチドの製造方法にも関するもので、この方法は前記
ポリペプチドを発現しうるづフタ−で形質転換された宿
主細胞を適当な培地中で培養しそして前記ポリペプチド
を単離することからなる。
本発明のクローン化DNAは一方においては例えばMa
niatis+ T、らの”Mo1ecular Cl
oning’ (1982)、Co1d Spring
Harbor Laboratoryにより、また更
に詳細には例えばMaddon、 J、P、のCe1l
Q(1985)、 93−104にヒトCD4−分子
をコードするCDNAについて記載されているように、
適切なmRNA調製物から出発してcDNAの形態で得
ることができることは5業上よく知られている。かかる
cDNAが、本発明を実施するにあたっての所望の数取
上のドメインをコードしている場合には前記cDNAを
、その配列に関する知識および所望のドメインのアミノ
酸配列に関する少なくとも部分的な知識に基づき、当業
者に周知のヌクレアーゼ処理により切断しなければなら
ない。
niatis+ T、らの”Mo1ecular Cl
oning’ (1982)、Co1d Spring
Harbor Laboratoryにより、また更
に詳細には例えばMaddon、 J、P、のCe1l
Q(1985)、 93−104にヒトCD4−分子
をコードするCDNAについて記載されているように、
適切なmRNA調製物から出発してcDNAの形態で得
ることができることは5業上よく知られている。かかる
cDNAが、本発明を実施するにあたっての所望の数取
上のドメインをコードしている場合には前記cDNAを
、その配列に関する知識および所望のドメインのアミノ
酸配列に関する少なくとも部分的な知識に基づき、当業
者に周知のヌクレアーゼ処理により切断しなければなら
ない。
他方において、このようなりローン化DNAはこの分野
で周知でありかつ例えばManiatis、 ?、らの
’Mo1ecular Cloning”(前出)に記
載される方法によりゲノムライブラリーから単離された
ゲノムDNAの形態で得ることができる。例えば、特定
のオリゴヌクレオチドプローブは、単離すべき特定のゲ
ノムDNA(エクソン)によりコードされるアごノ酸配
列の少なくとも部分的な知識に基づき、またはそのヌク
レオチド配列に関する少なくとも部分的な知識に基づき
調製され得る。このような配列情報は、原則的には任意
の配列データベース例えばGenbank(Intel
ligenetiqs、 Ca1ifornia。
で周知でありかつ例えばManiatis、 ?、らの
’Mo1ecular Cloning”(前出)に記
載される方法によりゲノムライブラリーから単離された
ゲノムDNAの形態で得ることができる。例えば、特定
のオリゴヌクレオチドプローブは、単離すべき特定のゲ
ノムDNA(エクソン)によりコードされるアごノ酸配
列の少なくとも部分的な知識に基づき、またはそのヌク
レオチド配列に関する少なくとも部分的な知識に基づき
調製され得る。このような配列情報は、原則的には任意
の配列データベース例えばGenbank(Intel
ligenetiqs、 Ca1ifornia。
DNA)、EMBL(Heidelberg、 FRG
)、N81?F (George townUnive
rsity、 Medical Centre、 Wa
shington DC。
)、N81?F (George townUnive
rsity、 Medical Centre、 Wa
shington DC。
USA)およびVecbase ([In1versi
ty of Wisconsin。
ty of Wisconsin。
Biotechnology Centre、 Mad
ison、 Wisconsin、 USA)から、ま
たはより詳細には例えばヒトCD4−分子についてはM
addonらの(1985) Ce1l 42.93−
104から、マウスIgμについては^rnhei恥N
、らのCe1122、179−185 (1980)か
ら、マウス1g r 2aについてはRoeder、
H,らのPNAS 78.474−478 (1,98
1)から、ヒトIguについてはRabbits+ T
、H,らのNucleicAcids Res、 9
.4509−4524(1981)からヒトIgrlに
ついてはEllison、 J、W、らのNuclei
c Ac1dsRes、 10.4071−4079(
1982)から、ヒトIg73重鎖遺伝子についてはH
uch、 S、らのNucleic Ac1dsRes
44.1779−1789(1986)から、そしてヒ
トIgcrlおよびIgα2重鎖遺伝子についてはFl
anagan、 J。
ison、 Wisconsin、 USA)から、ま
たはより詳細には例えばヒトCD4−分子についてはM
addonらの(1985) Ce1l 42.93−
104から、マウスIgμについては^rnhei恥N
、らのCe1122、179−185 (1980)か
ら、マウス1g r 2aについてはRoeder、
H,らのPNAS 78.474−478 (1,98
1)から、ヒトIguについてはRabbits+ T
、H,らのNucleicAcids Res、 9
.4509−4524(1981)からヒトIgrlに
ついてはEllison、 J、W、らのNuclei
c Ac1dsRes、 10.4071−4079(
1982)から、ヒトIg73重鎖遺伝子についてはH
uch、 S、らのNucleic Ac1dsRes
44.1779−1789(1986)から、そしてヒ
トIgcrlおよびIgα2重鎖遺伝子についてはFl
anagan、 J。
G、らのCe1l L6.681−688(1984)
から得ることができ−る。
から得ることができ−る。
次いで、DNAの所望の断片のゲノムクローンは、上述
のように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを当業
者に知られた適切な特定のハイブリッド化条件のもとで
使用して検出することができる。
のように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを当業
者に知られた適切な特定のハイブリッド化条件のもとで
使用して検出することができる。
上述のようにして得られた種々のヒトCD4−およびイ
ムノグロブリン重鎖ドメインをコードするDNAのクロ
ーン化断片を次にこの分野で周知の例えばManiat
isらの“Malecular CCo1n1n”(前
出)に記載の方法に従い処理して適当なベクター中に組
込む。キメラポリペプチド類をコードするDNA断片は
異なった起源のもの、すなわち一部はCDNAであり、
一部はゲノム起源であってもよいことはよく理解されま
た本発明に包含される。
ムノグロブリン重鎖ドメインをコードするDNAのクロ
ーン化断片を次にこの分野で周知の例えばManiat
isらの“Malecular CCo1n1n”(前
出)に記載の方法に従い処理して適当なベクター中に組
込む。キメラポリペプチド類をコードするDNA断片は
異なった起源のもの、すなわち一部はCDNAであり、
一部はゲノム起源であってもよいことはよく理解されま
た本発明に包含される。
本発明を実施するのに適するベクター類には、この分野
で周知でありかつ原核生物または真核生物宿主細胞に組
込まれたDNAの複製に一般に使用されるベクター類、
特にこのような目的のために原核生物および真核生物宿
主細胞において使用され得るシャトルベクター類、なら
びに真核生物宿主細胞においてポリペプチドを発現する
ためのベクター類が包含される。特に好ましいものは、
真核生物宿主細胞内でのポリペプチド類の発現のために
使用され得るシャトルベクター、例えばpSV2−ca
t[ATCCNcL37155] 、 pSV2−dh
fr [ATCCN1137146]、pSV2−ne
o[ATCCNa 37149] またはpSV2gP
t [ATCCk 37145] (7)ようなpSV
2由来ベクター類〔例えばGerman、 C,の”D
NA Cloning + Vol、 II +Glo
ver、 D、M、li、IRL Press、 0x
ford、 1985に記載されている〕である、pS
V2−gpt由来ベクター類、特にpHT4−Yl、
pCD4−Mr2a、 pCD4−M、cz、pCD4
−Mμ、pCD4−Hr 1およびpCD4−Hr 3
が好ましい。
で周知でありかつ原核生物または真核生物宿主細胞に組
込まれたDNAの複製に一般に使用されるベクター類、
特にこのような目的のために原核生物および真核生物宿
主細胞において使用され得るシャトルベクター類、なら
びに真核生物宿主細胞においてポリペプチドを発現する
ためのベクター類が包含される。特に好ましいものは、
真核生物宿主細胞内でのポリペプチド類の発現のために
使用され得るシャトルベクター、例えばpSV2−ca
t[ATCCNcL37155] 、 pSV2−dh
fr [ATCCN1137146]、pSV2−ne
o[ATCCNa 37149] またはpSV2gP
t [ATCCk 37145] (7)ようなpSV
2由来ベクター類〔例えばGerman、 C,の”D
NA Cloning + Vol、 II +Glo
ver、 D、M、li、IRL Press、 0x
ford、 1985に記載されている〕である、pS
V2−gpt由来ベクター類、特にpHT4−Yl、
pCD4−Mr2a、 pCD4−M、cz、pCD4
−Mμ、pCD4−Hr 1およびpCD4−Hr 3
が好ましい。
プラスミドpCD4−Mγ2aおよびpCD4−Mμは
特許出願のためにブダペスト条約のもとに、1989年
1月26日付でそれぞれ寄託番号DSM 5173およ
びDSM 5174のもとにDeutsche Sam
mlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen G+++bH(D
SM)、 Braunschweig、BRDに寄託さ
れており、プラスミドルCD4−1μおよびpCD4−
Hr lは1989年4月21日にそれぞれ寄託番号D
SM 5315およびOSM 5314のちとに、そし
てプラスミドルCD4−Hr 3は1989年9月14
日に寄託番号03M5523のもとに寄託されている。
特許出願のためにブダペスト条約のもとに、1989年
1月26日付でそれぞれ寄託番号DSM 5173およ
びDSM 5174のもとにDeutsche Sam
mlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen G+++bH(D
SM)、 Braunschweig、BRDに寄託さ
れており、プラスミドルCD4−1μおよびpCD4−
Hr lは1989年4月21日にそれぞれ寄託番号D
SM 5315およびOSM 5314のちとに、そし
てプラスミドルCD4−Hr 3は1989年9月14
日に寄託番号03M5523のもとに寄託されている。
次いで原核生物または真核生物宿主細胞をかかるベクタ
ー類で形質転換させることができる。かかる目的に適当
な原核生物宿主細胞は当業者には周知であり、細菌例え
ば大腸菌、特に大腸菌に12株、例えばN15(Vil
larejoらのJ、 Bacteriol、120+
466−474 [1974]ニ02291として記載
されテイル)およびHBIOI [ATCCNa 33
694] が包含される。
ー類で形質転換させることができる。かかる目的に適当
な原核生物宿主細胞は当業者には周知であり、細菌例え
ば大腸菌、特に大腸菌に12株、例えばN15(Vil
larejoらのJ、 Bacteriol、120+
466−474 [1974]ニ02291として記載
されテイル)およびHBIOI [ATCCNa 33
694] が包含される。
やはり当業者に周知の適当な真核生物宿主細胞にはを椎
動物細胞、酵母または他の起源のものが包含され、例え
ばP3X63Ag8[ATCCNa TIB9]および
J558 [ATCC弘TIB6]のようなミエローマ
細胞系が好ましい0本発明を実施するのに使用される特
定の宿主細胞に応じて適当なプロモーター要素、例えば
I g ! !1プロモーターまたはIgに一プロモー
ター(実施例1参照)および所望により適当なエンハン
サ−要素例えば1g1i鎖エンハンサ−または1g軽鎖
エンハンサ−(実施例1参照)を当業上周知の方法によ
りかかる宿主細胞の形質転換に使用されるプラスミド中
に組込むことができる。
動物細胞、酵母または他の起源のものが包含され、例え
ばP3X63Ag8[ATCCNa TIB9]および
J558 [ATCC弘TIB6]のようなミエローマ
細胞系が好ましい0本発明を実施するのに使用される特
定の宿主細胞に応じて適当なプロモーター要素、例えば
I g ! !1プロモーターまたはIgに一プロモー
ター(実施例1参照)および所望により適当なエンハン
サ−要素例えば1g1i鎖エンハンサ−または1g軽鎖
エンハンサ−(実施例1参照)を当業上周知の方法によ
りかかる宿主細胞の形質転換に使用されるプラスミド中
に組込むことができる。
上記のベクターによる宿主細胞の形質転換は任意の慣用
的方法または下記実施例に記載される特定の方法により
行なうことができる。
的方法または下記実施例に記載される特定の方法により
行なうことができる。
宿主細胞が例えば大腸菌のような原核生物である場合に
は、DNAを取込みうるコンピテントな細胞は対数増殖
期後に収穫し次いで周知のCaC1g−法により処理し
た細胞から調製する。形質転換は、該宿主細胞のプロト
プラスト形成後に、または5業上知られた他の方法によ
り実施することもできる。
は、DNAを取込みうるコンピテントな細胞は対数増殖
期後に収穫し次いで周知のCaC1g−法により処理し
た細胞から調製する。形質転換は、該宿主細胞のプロト
プラスト形成後に、または5業上知られた他の方法によ
り実施することもできる。
用いられる宿主が真核生物である場合には、リン酸カル
シウム沈澱およびDEAE−デキストラン法(C,Go
rmanの“DNA Cloning 、 Vol、
IIも参照)のようなトランスフェクション法、マイク
ロインジェクシッンのような慣用の機械的操作、赤血球
宿主内またはリポソーム内にカプセル化されたプラスミ
ドの挿入、リゾホスファチジルコリンのような薬剤での
細胞の処理、ウィルスベクターの使用、またはプロトプ
ラスト融合のようなトランスフェクシコン法が本発明の
実施に際して使用でき、プロトプラスト融合法が好適な
方法である(実施例2参照)。
シウム沈澱およびDEAE−デキストラン法(C,Go
rmanの“DNA Cloning 、 Vol、
IIも参照)のようなトランスフェクション法、マイク
ロインジェクシッンのような慣用の機械的操作、赤血球
宿主内またはリポソーム内にカプセル化されたプラスミ
ドの挿入、リゾホスファチジルコリンのような薬剤での
細胞の処理、ウィルスベクターの使用、またはプロトプ
ラスト融合のようなトランスフェクシコン法が本発明の
実施に際して使用でき、プロトプラスト融合法が好適な
方法である(実施例2参照)。
形質転換された細胞を次にこの分野で公知の方法に従っ
て選択し培養することができる。例えば、ホスホトラン
スフェラーゼをコードする“neo”遺伝子を担持する
ベクターにより形質転換された細胞はここで薬剤641
8の存在下に培養することができ、また、ベクターが”
gpt’遺伝子を担持する場合には形質転換細胞はキサ
ンチンおよびミコフェノール酸(mgcophenol
ic acid) ・を含有する特定の培地中で増殖さ
せることができる(Gormanの“DNACloni
ng 、 Vol、 II、前出)。
て選択し培養することができる。例えば、ホスホトラン
スフェラーゼをコードする“neo”遺伝子を担持する
ベクターにより形質転換された細胞はここで薬剤641
8の存在下に培養することができ、また、ベクターが”
gpt’遺伝子を担持する場合には形質転換細胞はキサ
ンチンおよびミコフェノール酸(mgcophenol
ic acid) ・を含有する特定の培地中で増殖さ
せることができる(Gormanの“DNACloni
ng 、 Vol、 II、前出)。
上記のようにして形質転換された細胞により産生された
本発明のキメラポリペプチドは蛋白質およびペプチド化
学の分野で公知の任意の適切な方法、例えば、硫酸アン
モニウムによる沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過または
イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点
電気泳動、免疫アフィニティクロマトグラフィーのよう
なアフィニティクロマトグラフィー、)IPLC等によ
り回収することができる。
本発明のキメラポリペプチドは蛋白質およびペプチド化
学の分野で公知の任意の適切な方法、例えば、硫酸アン
モニウムによる沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過または
イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点
電気泳動、免疫アフィニティクロマトグラフィーのよう
なアフィニティクロマトグラフィー、)IPLC等によ
り回収することができる。
本発明のキメラポリペプチドは例えば当業者には周知の
技術であるウェスタンプロット分析(第3図および実施
例2参照)によるか、または例えば:H9、MOLT−
4(ATCCk CRL 1582)、JURKAT、
JMまたはCEM (ATCCk CCL 119;
Chaffee、S らのJ。
技術であるウェスタンプロット分析(第3図および実施
例2参照)によるか、または例えば:H9、MOLT−
4(ATCCk CRL 1582)、JURKAT、
JMまたはCEM (ATCCk CCL 119;
Chaffee、S らのJ。
Expt、 Med、 lfl!1−605−621
(1988)) [Popovicう(7)のLar+
cet (1984) ii、 1472 ; Nar
a、 P、L、およびFischinger+ P、J
、のNature 332.469−470 (198
8)も参照〕のような細胞系を使用して5業上知られた
アッセイにおけるそれらのシンシチウム形成阻害能によ
るか、あるいは実施例4に詳細に記載されているように
して特性決定を行なうことができ、ここで実施例4にお
いてはMOLT−4またはCE?細胞系がMT−2細胞
に置換され得る。シンシチウム形成を誘導しうる任意の
)IIV−1ウイルス、例えば当分野で公知の方法によ
りまたは例えばPopovicらの5cience 2
2!L、 497−499(19B4)に記載されてい
るようにして感染H9細胞系(ATCCNo、 CRL
8543)から得ることができるHTLV−III
B 、あるいはLAV(CNC?’l Nal−232
)をかかるアッセイに使用することができる0本発明の
ポリペプチドを特性決定するもう一つの方法は、当分野
で公知のアッセイ、または実施例3に詳細に記載されて
おりそして標準的方法に従ったフルオログラフィ(第3
図)により可視化されたHIV表面蛋白質gp120に
対する結合能力によるか、あるいは、当分野で公知のア
ッセイ、または実施例5に詳細に記載されておりそして
第5図(AおよびB)に示される補体カスケードの第1
1分であるctqに対する結合能力によるものである。
(1988)) [Popovicう(7)のLar+
cet (1984) ii、 1472 ; Nar
a、 P、L、およびFischinger+ P、J
、のNature 332.469−470 (198
8)も参照〕のような細胞系を使用して5業上知られた
アッセイにおけるそれらのシンシチウム形成阻害能によ
るか、あるいは実施例4に詳細に記載されているように
して特性決定を行なうことができ、ここで実施例4にお
いてはMOLT−4またはCE?細胞系がMT−2細胞
に置換され得る。シンシチウム形成を誘導しうる任意の
)IIV−1ウイルス、例えば当分野で公知の方法によ
りまたは例えばPopovicらの5cience 2
2!L、 497−499(19B4)に記載されてい
るようにして感染H9細胞系(ATCCNo、 CRL
8543)から得ることができるHTLV−III
B 、あるいはLAV(CNC?’l Nal−232
)をかかるアッセイに使用することができる0本発明の
ポリペプチドを特性決定するもう一つの方法は、当分野
で公知のアッセイ、または実施例3に詳細に記載されて
おりそして標準的方法に従ったフルオログラフィ(第3
図)により可視化されたHIV表面蛋白質gp120に
対する結合能力によるか、あるいは、当分野で公知のア
ッセイ、または実施例5に詳細に記載されておりそして
第5図(AおよびB)に示される補体カスケードの第1
1分であるctqに対する結合能力によるものである。
この図は、CD4−MT2aおよびCD4−Mμが天然
の抗体と同様に効果的にctqに結合し一方軽鎖定常ド
メインを含有する対照構築物CD4−Mには何ら特異的
な結合を示さないことを示している。
の抗体と同様に効果的にctqに結合し一方軽鎖定常ド
メインを含有する対照構築物CD4−Mには何ら特異的
な結合を示さないことを示している。
本発明のキメラポリペプチドは、IgG重鎖部分のPc
部分(Burton、 D、のMo1ecu1. rm
munol、 21−+161−206 (1985)
)ゆえに単球/マクロファージおよび好中球上に存在す
るPc−受容体に結合する能力を有することから、当分
野で公知のアッセイ、または実施例6に詳細に記載され
ており第5図(C)に示される方法で特性決定すること
もできる。
部分(Burton、 D、のMo1ecu1. rm
munol、 21−+161−206 (1985)
)ゆえに単球/マクロファージおよび好中球上に存在す
るPc−受容体に結合する能力を有することから、当分
野で公知のアッセイ、または実施例6に詳細に記載され
ており第5図(C)に示される方法で特性決定すること
もできる。
この図は、CD4−MT2aがマウスIgG2aと同程
度および区別し得ない親和性をもってJ7744.1細
胞上のFc受容体に結合することを明示している。キメ
ラヒトCD4−HγポリペプチドのFc受容体への結合
は例えば実施例6記載の方法に従ってヒト単球/マクロ
ファージ細胞系0937(ATCCNil CRL 1
593)を用いて示すことができる。更にはかかるキメ
ラポリペプチドは例えばPauwelsら(J、Vir
ol、Methods並、 171−185 (198
7))記載のアッセイ、または細胞と細胞の接触による
ウィルス転移の阻止能力によっても特性決定することが
できる。
度および区別し得ない親和性をもってJ7744.1細
胞上のFc受容体に結合することを明示している。キメ
ラヒトCD4−HγポリペプチドのFc受容体への結合
は例えば実施例6記載の方法に従ってヒト単球/マクロ
ファージ細胞系0937(ATCCNil CRL 1
593)を用いて示すことができる。更にはかかるキメ
ラポリペプチドは例えばPauwelsら(J、Vir
ol、Methods並、 171−185 (198
7))記載のアッセイ、または細胞と細胞の接触による
ウィルス転移の阻止能力によっても特性決定することが
できる。
本発明によれば新規なキメラ蛋白質は種々の疾患、特に
エイズの治療に使用することができる。
エイズの治療に使用することができる。
それらは、医薬上許容される形態、特に注射可能な形態
で投与され得る。投与量および投与割合は同様な構造お
よび/または機能を有する他の公知のポリペプチドの臨
床的適用において現在用いられているのと同程度である
。医薬M放物は本発明のキメラポリペプチドの少なくと
も1種を医薬上許容される固形または液体担体物質と組
合せて含有しうる。任意の慣用的に使用される担体物質
を使用できる。更には、該医薬組成物は他の医薬活性薬
剤を含有でき、当分野で公知の方法により調製され得る
。
で投与され得る。投与量および投与割合は同様な構造お
よび/または機能を有する他の公知のポリペプチドの臨
床的適用において現在用いられているのと同程度である
。医薬M放物は本発明のキメラポリペプチドの少なくと
も1種を医薬上許容される固形または液体担体物質と組
合せて含有しうる。任意の慣用的に使用される担体物質
を使用できる。更には、該医薬組成物は他の医薬活性薬
剤を含有でき、当分野で公知の方法により調製され得る
。
本発明を一般的に記述したが、本発明は下記詳細な実施
例によりさらにより良く理解されよう。
例によりさらにより良く理解されよう。
これら実施例は例示目的のためにのみここに含めたもの
で、特記しない限り本発明はそれらに限定されるもので
はない。
で、特記しない限り本発明はそれらに限定されるもので
はない。
実施例1
プラスミド頻の作製
ManiatisらのMo1ecular Cloni
ng:^Labora LoryManual、 Co
1d Spring Harbor+ Laborat
ory、 ニューヨーク (1982)に記載される標
準方法を使用してプラス【ドの作製を行なった。
ng:^Labora LoryManual、 Co
1d Spring Harbor+ Laborat
ory、 ニューヨーク (1982)に記載される標
準方法を使用してプラス【ドの作製を行なった。
すべての作製のための出発プラスミドはpHT4−Yl
と呼ばれ、↑raunecker+ Li1keおよび
Karjalainenによって以前Nature 3
31.84−86 (1988)に記載されたと同様に
して調製することができる。アンピシリン耐性遺伝子お
よびgpt遺伝子(MulliganおよびBerg、
1980.5cience 迅巴、 1422)を選
択マーカーとして有するこのベクターは、更にマウスイ
ムノグロブリンカッパ軽鎖定常領域に融合したヒトC0
4受容体の全細胞外部分からなるハイブリッド蛋白質を
もコードする。
と呼ばれ、↑raunecker+ Li1keおよび
Karjalainenによって以前Nature 3
31.84−86 (1988)に記載されたと同様に
して調製することができる。アンピシリン耐性遺伝子お
よびgpt遺伝子(MulliganおよびBerg、
1980.5cience 迅巴、 1422)を選
択マーカーとして有するこのベクターは、更にマウスイ
ムノグロブリンカッパ軽鎖定常領域に融合したヒトC0
4受容体の全細胞外部分からなるハイブリッド蛋白質を
もコードする。
ベクターpH74−Ylを、ベクターpH74(Tra
uneckerら、1986. IEur、 J、 I
nusunol、lfi、 851−854)に由来す
るより効率のよいマウス1gカッパプロモーターにより
マウスrg重鎖プロモーターを置換することによって修
飾した。カッパプロモーターを始めに、Bag旧および
5alIで消化したベクターpUc18中にBa1ll
/5allフラグメントとしてサブクローンし、2.2
kbの旧ndlll(大腸菌DNAポリメラーゼのタレ
ナラフラグメントを用いて3゛−後退末端を充填、以下
“平滑末端”と称す)/EcoRIフラグメントを回収
し次にXbal (平滑末端)/EcoRI消化pHT
4−Ylに挿入してプラスミドpHT44に12(第1
図参照〉を生成させた。
uneckerら、1986. IEur、 J、 I
nusunol、lfi、 851−854)に由来す
るより効率のよいマウス1gカッパプロモーターにより
マウスrg重鎖プロモーターを置換することによって修
飾した。カッパプロモーターを始めに、Bag旧および
5alIで消化したベクターpUc18中にBa1ll
/5allフラグメントとしてサブクローンし、2.2
kbの旧ndlll(大腸菌DNAポリメラーゼのタレ
ナラフラグメントを用いて3゛−後退末端を充填、以下
“平滑末端”と称す)/EcoRIフラグメントを回収
し次にXbal (平滑末端)/EcoRI消化pHT
4−Ylに挿入してプラスミドpHT44に12(第1
図参照〉を生成させた。
次いでこのプラスミドをBaa+旧で消化し、CD4遺
伝子のエクソン3および4、およびマウスrgカッパ軽
鎖定常領域をコードするエクソンを除去し、3°−後退
末端をタレナウボリメラーゼで充填し、そして仔つシ腸
アルカリホスフ1ターゼを用いて脱リン酸化して以下の
遺伝子フラグメント(連結前に平滑末端化)の挿入を促
進させたニーマウス■gμ重鎖遺伝子(Arnheis
N、ら、Ce1l坐、 179−185 (198G
))の定常領域エクソンC2、C3およびC4を含有す
る、予備プラス果ドpc[14−Mμmを生ずる3、5
Kbの5stl/Xbal DNAフラグメント。
伝子のエクソン3および4、およびマウスrgカッパ軽
鎖定常領域をコードするエクソンを除去し、3°−後退
末端をタレナウボリメラーゼで充填し、そして仔つシ腸
アルカリホスフ1ターゼを用いて脱リン酸化して以下の
遺伝子フラグメント(連結前に平滑末端化)の挿入を促
進させたニーマウス■gμ重鎖遺伝子(Arnheis
N、ら、Ce1l坐、 179−185 (198G
))の定常領域エクソンC2、C3およびC4を含有す
る、予備プラス果ドpc[14−Mμmを生ずる3、5
Kbの5stl/Xbal DNAフラグメント。
一マウスIg T 2all鎖遺伝子(Roeder、
H,ら、PNASl、 474−479 (1981
))のヒンジおよびC2およびC3定常領域エクソンを
含有し、予備プラスミドルCD4−M r 2a”を生
ずる3、OKbの5tul D N Aフラグメント。
H,ら、PNASl、 474−479 (1981
))のヒンジおよびC2およびC3定常領域エクソンを
含有し、予備プラスミドルCD4−M r 2a”を生
ずる3、OKbの5tul D N Aフラグメント。
一ヒトIg r 1重鎖遺伝子(El、1ison、
J、 H,ら、Nucleic Ac1ds Res、
lfl、 4071−4079 (1982))のヒン
ジおよびC2およびC3定常領域エクソンを含有し、予
備プラスξドpcoii−)1 r 1”を生ずるHa
ellDNAフラグメント (T4 DNAポリメラー
ゼを用いて平滑末端化)。
J、 H,ら、Nucleic Ac1ds Res、
lfl、 4071−4079 (1982))のヒン
ジおよびC2およびC3定常領域エクソンを含有し、予
備プラスξドpcoii−)1 r 1”を生ずるHa
ellDNAフラグメント (T4 DNAポリメラー
ゼを用いて平滑末端化)。
−ヒトIgμ重鎖遺伝子(Rabbits、T、H,ら
、NucleicAcids Res、 9 、450
9−4524 (1981) )の定常領域エクソンC
2、C3およびC4を含有するDNAフラグメント。
、NucleicAcids Res、 9 、450
9−4524 (1981) )の定常領域エクソンC
2、C3およびC4を含有するDNAフラグメント。
このDNAフラグメントは以下の様にして作製された:
始めにヒ目gr1重鎖遺伝子のHaellフラグソント
を前記のようにして平滑末端化しそしてヒンジエクソン
をBam+旧部位の方向に向けて位置させる配向でpH
c19の平滑末端化された5alI部位に挿入した。次
いでこの中間作製物をPstlで消化して、遺伝子中の
Pst1部位(第2のPstI部位はp[Ic19ポリ
リンカー中にある)をはさむ、ヒンジエクソンのスプラ
イスアクセプタ一部位以外の3γlエクソンを除去し、
次にエクソンC2、C3およびC4(Rabbitsら
、前出)を含有するしトμ遺伝子のPstlフラグメン
トの挿入を行った0次いでこの最終遺伝子作製物をBa
mHIおよび旧ndI[I消化(両部位共pUc19ポ
リリンカー中)により回収し、続いて前記のようにして
フレナラ処理およびベクターpH74−YK12中への
挿入を行って予備プラスミドルCD4−HB ”を生成
させた。
始めにヒ目gr1重鎖遺伝子のHaellフラグソント
を前記のようにして平滑末端化しそしてヒンジエクソン
をBam+旧部位の方向に向けて位置させる配向でpH
c19の平滑末端化された5alI部位に挿入した。次
いでこの中間作製物をPstlで消化して、遺伝子中の
Pst1部位(第2のPstI部位はp[Ic19ポリ
リンカー中にある)をはさむ、ヒンジエクソンのスプラ
イスアクセプタ一部位以外の3γlエクソンを除去し、
次にエクソンC2、C3およびC4(Rabbitsら
、前出)を含有するしトμ遺伝子のPstlフラグメン
トの挿入を行った0次いでこの最終遺伝子作製物をBa
mHIおよび旧ndI[I消化(両部位共pUc19ポ
リリンカー中)により回収し、続いて前記のようにして
フレナラ処理およびベクターpH74−YK12中への
挿入を行って予備プラスミドルCD4−HB ”を生成
させた。
これら予備プラスミド(pCD4−Mμ” 、pCD4
−MT2a”、ρCD4−Hγ11)はマウスμ重鎖遺
伝子エンハンサーを含有するXhol−SalIフラグ
メントをプロモーターに対して5′−位にある特有の5
alI部位(第1図および第2図参照)中に挿入するこ
とによって完成させ、そして予備プラスミドルCD4−
8μmはマウスμ“コア”エンハンサ−をS@a)−P
vuIIフラグメントとしてプロモーターに対して5″
−位にある平滑末端化5alI部位中に挿入することに
よって完成させて最終プラスミドルCD4−Mμ、pC
D4−M T2a、 pCD4−HT 1およびpCD
4−)+ //を得た。始めにG11lesら(Cel
l 33.717−728.1983)によって記述さ
れたエンハンサ−フラグメントXbal−EcoRIを
、Xba I上のEcoRI リンカ−を介してXba
l<EcoRI)部位がEcoRV部位の次に位置する
配向でブルースクリプト (Bluescript)ベ
クター(Stratagene、 LaJolla、
米国)のEcoR1部位中に挿入した。該ベクターの
固有の5alI部位中にXhoI部位を含有するアダプ
ターを挿入した。最後に、作製物pcD4−Mμ、pC
D4−M r 2aおよびpCD4−Hr 1に関して
はXhol−Sailを用いて、または作製物pCD4
−Hμに関してはSmaI−Pvullを用いてエンハ
ンサ−フラグメントを回収した。
−MT2a”、ρCD4−Hγ11)はマウスμ重鎖遺
伝子エンハンサーを含有するXhol−SalIフラグ
メントをプロモーターに対して5′−位にある特有の5
alI部位(第1図および第2図参照)中に挿入するこ
とによって完成させ、そして予備プラスミドルCD4−
8μmはマウスμ“コア”エンハンサ−をS@a)−P
vuIIフラグメントとしてプロモーターに対して5″
−位にある平滑末端化5alI部位中に挿入することに
よって完成させて最終プラスミドルCD4−Mμ、pC
D4−M T2a、 pCD4−HT 1およびpCD
4−)+ //を得た。始めにG11lesら(Cel
l 33.717−728.1983)によって記述さ
れたエンハンサ−フラグメントXbal−EcoRIを
、Xba I上のEcoRI リンカ−を介してXba
l<EcoRI)部位がEcoRV部位の次に位置する
配向でブルースクリプト (Bluescript)ベ
クター(Stratagene、 LaJolla、
米国)のEcoR1部位中に挿入した。該ベクターの
固有の5alI部位中にXhoI部位を含有するアダプ
ターを挿入した。最後に、作製物pcD4−Mμ、pC
D4−M r 2aおよびpCD4−Hr 1に関して
はXhol−Sailを用いて、または作製物pCD4
−Hμに関してはSmaI−Pvullを用いてエンハ
ンサ−フラグメントを回収した。
pCD4−HT3を作製するには、プラスミドル)HT
4−YK12(第1図参照)をBam1llで消化して
CD4遺伝子のエクソン3および4ならびにマウス1g
カッパ軽鎖定常領域をコードするエクソンを除去し、そ
して仔つシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化して
、ヒトIg73重鎖遺伝子[Huch、 S、ら、Nu
cletcAcids Res、、L4.1?79−1
789 (1986))のヒンジおよびC2およびC3
定常領域エクソンを含有する6、OKbのBgllI
DNAフラグメントの挿入を促進させて予備プラスミド
ルCD4−Hγ3Iを生成させた。この予備プラスミド
ルCD4−Hr 3”はプラスミドルCD4−Hμにつ
いて前述したと同様にしてマウスμcae”エンハンサ
−を挿入することによって完成させた。
4−YK12(第1図参照)をBam1llで消化して
CD4遺伝子のエクソン3および4ならびにマウス1g
カッパ軽鎖定常領域をコードするエクソンを除去し、そ
して仔つシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化して
、ヒトIg73重鎖遺伝子[Huch、 S、ら、Nu
cletcAcids Res、、L4.1?79−1
789 (1986))のヒンジおよびC2およびC3
定常領域エクソンを含有する6、OKbのBgllI
DNAフラグメントの挿入を促進させて予備プラスミド
ルCD4−Hγ3Iを生成させた。この予備プラスミド
ルCD4−Hr 3”はプラスミドルCD4−Hμにつ
いて前述したと同様にしてマウスμcae”エンハンサ
−を挿入することによって完成させた。
実施例2
CD4−MuおよびCD4−My2aコード遺伝子の発
現動物細胞および細胞系の維持、クローニング方法、選
択方法およびクローン化細胞の増殖は”Cu1ture
of animal cells : A s+an
ual of basictechnigue、 Al
an R,Ltss、 Inc、+−1−ニーヨーク(
19B3)’中にFreshney、 R91,によっ
て記載される標準方法を用いて行なった。
現動物細胞および細胞系の維持、クローニング方法、選
択方法およびクローン化細胞の増殖は”Cu1ture
of animal cells : A s+an
ual of basictechnigue、 Al
an R,Ltss、 Inc、+−1−ニーヨーク(
19B3)’中にFreshney、 R91,によっ
て記載される標準方法を用いて行なった。
マウス3zo−7細胞P3X63Ag8(ATCCNa
TiB9)またはJ558(ATCCk TiB2)
を、Olら(Proc、 Natl。
TiB9)またはJ558(ATCCk TiB2)
を、Olら(Proc、 Natl。
Acad、 Sci、 USA u、 825−829
.1983)によって記載されるようにしてプロトプラ
スト融合により、プラスミドpcD4−MμまたはpC
D4−M r 2aを用いて安定にトランスフエフシラ
ンさせた。トランスフエクタントは基礎培地(ダルベツ
コ改良イーグル培地、10%ウシ胎児血清(Fe2)、
5X10−’M 2−メルカプトエタノール)中に5a
g/−のミコフェノール酸および250 u g/dの
キサンチン(Trauneckerら、Eur、 J、
rmmunol、 lfl、 851−854 [19
861)を包含させることによって選択した。トランス
フエフシランの頻度は10−Sm10−4の範囲であっ
た。
.1983)によって記載されるようにしてプロトプラ
スト融合により、プラスミドpcD4−MμまたはpC
D4−M r 2aを用いて安定にトランスフエフシラ
ンさせた。トランスフエクタントは基礎培地(ダルベツ
コ改良イーグル培地、10%ウシ胎児血清(Fe2)、
5X10−’M 2−メルカプトエタノール)中に5a
g/−のミコフェノール酸および250 u g/dの
キサンチン(Trauneckerら、Eur、 J、
rmmunol、 lfl、 851−854 [19
861)を包含させることによって選択した。トランス
フエフシランの頻度は10−Sm10−4の範囲であっ
た。
適当な抗体または蛋白質Aを用いる分泌蛋白質CD4−
MμおよびCD4−Mr2aの免疫沈降に続くウェスタ
ンプロット分析(Tiwbinら、Proc、Natl
、Acad。
MμおよびCD4−Mr2aの免疫沈降に続くウェスタ
ンプロット分析(Tiwbinら、Proc、Natl
、Acad。
Sci、 USA 76、4350−4353 [1
979])により、これらの蛋白質が予期された明らか
な分子量を有することが示された(第3A図)、非還元
条件下(2−メルカプトエタノールを省略)、同じゲル
電気泳動分析(U、に、Laemmli、 Natur
e 227.680−685[19701による)を行
うと、CD4−Mμがオリゴマーとして、恐らくペンタ
マーとして分泌され、一方CD4−M72aは、蛋白質
Aに結合するダイマーを明らかに形成したことが示され
た(第3図BおよびC)。
979])により、これらの蛋白質が予期された明らか
な分子量を有することが示された(第3A図)、非還元
条件下(2−メルカプトエタノールを省略)、同じゲル
電気泳動分析(U、に、Laemmli、 Natur
e 227.680−685[19701による)を行
うと、CD4−Mμがオリゴマーとして、恐らくペンタ
マーとして分泌され、一方CD4−M72aは、蛋白質
Aに結合するダイマーを明らかに形成したことが示され
た(第3図BおよびC)。
実施例3
gp120−結合アッセイ
2X10’個(7)HTLV−III B−感染H9細
胞(ATCCNa CRL 8543: Popovi
cら、5cience 2L2A+ 497−499[
1984] ; Ga1loら、5cience 22
A、 500−502 (1984])を、標識培地(
10%0%ウシ胎清(Fe2)を補添したシスティン非
含有RPMI−1640培地)で洗浄し、10−の標識
培地中37℃で30分間インキュベートし、次いで4I
I11の新たな標識培地に移した。2.5mC1の2S
S−システィン(Amersham、米国)を添加後、
細胞をゆるやかに動かしながらインキュベーションを継
続した。4時間後細胞を10%pcsを含有する新たな
RPMI−1640培地に移して更に14時間インキュ
ベートした。細胞を沈降させ、両インキュベーション期
間の細胞非含有培養液を混合し、4℃、150、OOO
Xg″?!1時間遠心することによりウィルスを取り除
いた。111t細胞の培養液を合したもの50ulを、
CD4−M/7またはCD4−MT2aを産生するミエ
ローマ細胞の培養液8dおよびマウスIgM重鎖マタは
マウスカッパー鎖のいずれかに対するセファロース結合
ラットモノクローナル抗体50μlまたは蛋白質Aセフ
ァロース(Phars+acia、ウプサラ、スエーデ
ン)50#j!に添加した0次いでこの混合物を4°C
で15時間全体を振とうさせた0次にセファロースビー
ズを沈降させ、5chneiderらにヨッテViro
logy 132.1−11.1984に記載されてい
るようにして高塩濃度および低塩濃度洗浄緩衝液中で洗
浄した。最後の洗浄後、セファロースペレットを100
uj!の試料緩衝液中で沸騰させた。
胞(ATCCNa CRL 8543: Popovi
cら、5cience 2L2A+ 497−499[
1984] ; Ga1loら、5cience 22
A、 500−502 (1984])を、標識培地(
10%0%ウシ胎清(Fe2)を補添したシスティン非
含有RPMI−1640培地)で洗浄し、10−の標識
培地中37℃で30分間インキュベートし、次いで4I
I11の新たな標識培地に移した。2.5mC1の2S
S−システィン(Amersham、米国)を添加後、
細胞をゆるやかに動かしながらインキュベーションを継
続した。4時間後細胞を10%pcsを含有する新たな
RPMI−1640培地に移して更に14時間インキュ
ベートした。細胞を沈降させ、両インキュベーション期
間の細胞非含有培養液を混合し、4℃、150、OOO
Xg″?!1時間遠心することによりウィルスを取り除
いた。111t細胞の培養液を合したもの50ulを、
CD4−M/7またはCD4−MT2aを産生するミエ
ローマ細胞の培養液8dおよびマウスIgM重鎖マタは
マウスカッパー鎖のいずれかに対するセファロース結合
ラットモノクローナル抗体50μlまたは蛋白質Aセフ
ァロース(Phars+acia、ウプサラ、スエーデ
ン)50#j!に添加した0次いでこの混合物を4°C
で15時間全体を振とうさせた0次にセファロースビー
ズを沈降させ、5chneiderらにヨッテViro
logy 132.1−11.1984に記載されてい
るようにして高塩濃度および低塩濃度洗浄緩衝液中で洗
浄した。最後の洗浄後、セファロースペレットを100
uj!の試料緩衝液中で沸騰させた。
次いでこの試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動に続
くフルオログラフィーにより分析してCD4Hμまたは
CD4−M72aに結合された放射性標i6gp120
を検出した(第3図、Dレーン3.5.7)実施例4 ジンシチウムアッセイ 種々のキメラ分子の生物学的活性をアッセイするために
、HIVエンベロープ遺伝子産物を発現する先に報告さ
れた融合誘発性ウィルス感染細胞(4usigenic
)およびCD4分子を担持する未感染隣接細胞(Sod
roshiら、Nature 322.470−474
.(1986):1にもとづく旧V依存型シンシチウム
アッセイを用いた。あらかじめ滴定された量の旧V−1
ウィルスを100μlのRPMI−1640培地中連続
希釈した組み換え蛋白質と共に室温で30分間インキュ
ベートした6次に25μlずつの各混合物を、1ウェル
当り50μlの培地中に25.000個の酊−2細胞(
Myoshil、らNature 294.770−7
71 (1981))をあらかじめ含有する96−ウェ
ルマイクロタイタープレートのウェル中に3通りずつ移
した。3日間培養後100μlの新たな培地を添加し、
2日後シンシチウムを数えた。シンシチウム形成の50
%阻害(IDso)はCD4−Muで10ng/dの濃
度で得られこれはCD4−My、2aおよびCD4−H
にのID5o(10μg/d)よりも約1000分の−
低かった。ネズミ可溶性LsTaレセプター (Tra
unecker、 A、ら、 Immunology
Today lJl+29−32 (1989))は不
活性であった。シンシチウム形成の完全な阻害はCD4
−Muで1−2dg/rxlΦ濃度で得られた(第4図
参照)。
くフルオログラフィーにより分析してCD4Hμまたは
CD4−M72aに結合された放射性標i6gp120
を検出した(第3図、Dレーン3.5.7)実施例4 ジンシチウムアッセイ 種々のキメラ分子の生物学的活性をアッセイするために
、HIVエンベロープ遺伝子産物を発現する先に報告さ
れた融合誘発性ウィルス感染細胞(4usigenic
)およびCD4分子を担持する未感染隣接細胞(Sod
roshiら、Nature 322.470−474
.(1986):1にもとづく旧V依存型シンシチウム
アッセイを用いた。あらかじめ滴定された量の旧V−1
ウィルスを100μlのRPMI−1640培地中連続
希釈した組み換え蛋白質と共に室温で30分間インキュ
ベートした6次に25μlずつの各混合物を、1ウェル
当り50μlの培地中に25.000個の酊−2細胞(
Myoshil、らNature 294.770−7
71 (1981))をあらかじめ含有する96−ウェ
ルマイクロタイタープレートのウェル中に3通りずつ移
した。3日間培養後100μlの新たな培地を添加し、
2日後シンシチウムを数えた。シンシチウム形成の50
%阻害(IDso)はCD4−Muで10ng/dの濃
度で得られこれはCD4−My、2aおよびCD4−H
にのID5o(10μg/d)よりも約1000分の−
低かった。ネズミ可溶性LsTaレセプター (Tra
unecker、 A、ら、 Immunology
Today lJl+29−32 (1989))は不
活性であった。シンシチウム形成の完全な阻害はCD4
−Muで1−2dg/rxlΦ濃度で得られた(第4図
参照)。
実施例5
C1qへの結合
マイクロタイタープレートを、食塩水中における10μ
s/adl (第5図、A)および1μs/d(第5図
、B)の濃度の精製CD4−My2aまたはCD4−M
#ポリペプチドで被覆するかまたは対照として同じ濃度
のマウスI gG2aまたはIgMで被覆した。−夜イ
ンキエベーションしたのちプレートをPBS (リン酸
緩衝食塩水)中の1%BSAで遮断し、次に50.00
0cpm(〜2ng)の1tSI標識ヒトC1q (C
albiocheo+。
s/adl (第5図、A)および1μs/d(第5図
、B)の濃度の精製CD4−My2aまたはCD4−M
#ポリペプチドで被覆するかまたは対照として同じ濃度
のマウスI gG2aまたはIgMで被覆した。−夜イ
ンキエベーションしたのちプレートをPBS (リン酸
緩衝食塩水)中の1%BSAで遮断し、次に50.00
0cpm(〜2ng)の1tSI標識ヒトC1q (C
albiocheo+。
米国〉と共に室温で6時間インキエベートした。
(C1qの放射性標識は、製造業者(Pierce、米
国〉の推薦に従ってヨードダン法によって行った〕イン
キュベーション後、ウェルを洗浄しそして結合された放
射能を測定した。結果は第5図参照。
国〉の推薦に従ってヨードダン法によって行った〕イン
キュベーション後、ウェルを洗浄しそして結合された放
射能を測定した。結果は第5図参照。
実施例6
Pc受容体へのCD 4−M2aの結合マウス細胞系J
774A、1 (ATCC随TIB67)上のFcT受
容体を用いる競合結合アッセイを用いてCD4−M 1
2aのFc受容体結合の特性決定を行った。従って、2
X10’個の細胞を、5%ウシ胎児血清(Fe2)を補
添した100.fの培地中、200ngのus)標識C
D4−Mr2a (放射性標識は実施例5記載のように
して行った〉および漸増濃度の未標識競合体CD4−M
r2aもしくは未標識競合体マウスIgG2aと共に4
’Cで1時間インキュベートした。インキュベート後
、細胞を200μlのFCSクツションを通して遠心し
、ペレット中の放射能を測定した。500倍過剰の未標
識1gG2aの添加後に得られた放射能を非特異的結合
とした。特異的結合はそこで実験値から非特異的結合値
を差し引くことにより得られた。
774A、1 (ATCC随TIB67)上のFcT受
容体を用いる競合結合アッセイを用いてCD4−M 1
2aのFc受容体結合の特性決定を行った。従って、2
X10’個の細胞を、5%ウシ胎児血清(Fe2)を補
添した100.fの培地中、200ngのus)標識C
D4−Mr2a (放射性標識は実施例5記載のように
して行った〉および漸増濃度の未標識競合体CD4−M
r2aもしくは未標識競合体マウスIgG2aと共に4
’Cで1時間インキュベートした。インキュベート後
、細胞を200μlのFCSクツションを通して遠心し
、ペレット中の放射能を測定した。500倍過剰の未標
識1gG2aの添加後に得られた放射能を非特異的結合
とした。特異的結合はそこで実験値から非特異的結合値
を差し引くことにより得られた。
以下に本発明の好ましい態様を列挙する。
(1) DNAの2種の断片の組み合わせから戒って
おり、該一方の断片は、ヒトCD4−分子の最初の2個
のドメインまたはその一部分をコードし、該他方の断片
は哺乳動物のイムノグロブリンの重鎖の定常領域の最初
の部分を除くすべての領域をコードするものであるクロ
ーン化DNA。
おり、該一方の断片は、ヒトCD4−分子の最初の2個
のドメインまたはその一部分をコードし、該他方の断片
は哺乳動物のイムノグロブリンの重鎖の定常領域の最初
の部分を除くすべての領域をコードするものであるクロ
ーン化DNA。
(2) DNAの一方の断片がヒトCD4分子の最初
の2個のドメインをコードする前記(1)に記載のDN
A。
の2個のドメインをコードする前記(1)に記載のDN
A。
(3) DNAの他方の断片が哺乳動物」訓の重鎖の
定常領域の最初の部分を除くすべてのドメインをコード
する前記(1)または(2)に記載のDNA。
定常領域の最初の部分を除くすべてのドメインをコード
する前記(1)または(2)に記載のDNA。
(4) DNAの他方の断片が哺乳動物1gGの重鎖
の定常領域の最初の部分を除くすべてのドメインをコー
ドする前記(1)または(2)に記載のDNA。
の定常領域の最初の部分を除くすべてのドメインをコー
ドする前記(1)または(2)に記載のDNA。
(5)DNAの他方の断片が哺乳動物IgAの重鎖の定
常領域の最初の部分を除くすべてのドメインをコードす
る前記(1)または(2)に記載のDNA。
常領域の最初の部分を除くすべてのドメインをコードす
る前記(1)または(2)に記載のDNA。
(6) ′@乳動物イムノグロブリンがマウスまたは
ヒトイムノグロブリンである前記(1)ないしく5)の
いずれかに記載のDNA。
ヒトイムノグロブリンである前記(1)ないしく5)の
いずれかに記載のDNA。
(7) DNAの他方の断片がマウスIg 72aの
重鎖の定常領域の最初の部分を除くすべてのドメインを
コードする前記(1)、 (2)または(4)に記載の
DNA。
重鎖の定常領域の最初の部分を除くすべてのドメインを
コードする前記(1)、 (2)または(4)に記載の
DNA。
(8)DNAの他方の断片がヒトigrlまたはIg7
3の重鎖の定常領域の最初の部分を除くすべてのドメイ
ンをコードする前記(1)、 (2)または(4)に記
載のDNA。
3の重鎖の定常領域の最初の部分を除くすべてのドメイ
ンをコードする前記(1)、 (2)または(4)に記
載のDNA。
(9)前記(1)ないしく8)のいずれかに記載のDN
Aを含有するベクター。
Aを含有するベクター。
0■ 原核生物および真核生物の宿主細胞中で複製しう
るシャトルベクターである前記(9)に記載のベクター (II)発現ベクターである前記(9)または0ωに記
載のベクター 021 前記(9)ないしくIQのいずれかに記載の
ベクターで形質転換された原核生物または真核生物宿主
細胞。
るシャトルベクターである前記(9)に記載のベクター (II)発現ベクターである前記(9)または0ωに記
載のベクター 021 前記(9)ないしくIQのいずれかに記載の
ベクターで形質転換された原核生物または真核生物宿主
細胞。
03)前記(1)ないしく8)のい−ずれかに記載のD
NAでコードされたポリペプチド。
NAでコードされたポリペプチド。
側 治療上活性な薬剤としての前記01)に記載のポリ
ペプチド。
ペプチド。
05)エイズに対する治療上活性な薬剤としての前記a
3)に記載のポリペプチド。
3)に記載のポリペプチド。
06)前記aつないし05)のいずれかに記載のポリペ
プチドを製造するに当り、前記(12)に記載の形質転
換された宿主細胞を適当な培地中で培養し、そしてポリ
ペプチドを単離することを特徴とする製造方法。
プチドを製造するに当り、前記(12)に記載の形質転
換された宿主細胞を適当な培地中で培養し、そしてポリ
ペプチドを単離することを特徴とする製造方法。
a7)前記a31に記載のポリペプチドの少なくとも1
種および治療上許容しうる担体物質を含有する医薬組成
物。
種および治療上許容しうる担体物質を含有する医薬組成
物。
08)医薬組成物の調製への前記09ないし05)のい
ずれかに記載のポリペプチドの使用。
ずれかに記載のポリペプチドの使用。
09 エイズ治療用医薬組成物の調製への前記03)
ないし05)のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
ないし05)のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
QΦ 前記06)に記載の方法によって調製された前記
03)に記載のポリペプチド。
03)に記載のポリペプチド。
第1図は、グラ:1. ミFpHT4−YK12、pC
D4−MμおよびpCD4−Mγ2aの構造を示す模式
図、第2図は、プラスミドpHT4−YK12、pCD
4−HμおよびpCD4−Hr 1の構造を示す模式図
、第3図は、ウェスタンプロット分析の結果を示す電気
泳動図、 第4図は、&lI換え蛋白質によるシンシチウム形成阻
害の測定結果を示すグラフ、ならびに第5図は、A、、
BがC1qに対するCD4−MμおよびCD4−Mγ2
aの結合アッセイの結果を示すグラフ、および、CがF
c7受容体に対するCD4−Mγ2aの結合の測定結果
を示すグラフである。 D +11!11 p120− ・ 345 一−S−13T4 B [ 競合体 ](μ9)
D4−MμおよびpCD4−Mγ2aの構造を示す模式
図、第2図は、プラスミドpHT4−YK12、pCD
4−HμおよびpCD4−Hr 1の構造を示す模式図
、第3図は、ウェスタンプロット分析の結果を示す電気
泳動図、 第4図は、&lI換え蛋白質によるシンシチウム形成阻
害の測定結果を示すグラフ、ならびに第5図は、A、、
BがC1qに対するCD4−MμおよびCD4−Mγ2
aの結合アッセイの結果を示すグラフ、および、CがF
c7受容体に対するCD4−Mγ2aの結合の測定結果
を示すグラフである。 D +11!11 p120− ・ 345 一−S−13T4 B [ 競合体 ](μ9)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、DNAの2種の断片の組み合わせから成っており、
該一方の断片は、ヒトCD4分子の最初の2個のドメイ
ンまたはその一部分をコードし、該他方の断片は哺乳動
物イムノグロブリンの重鎖の定常領域の最初の部分を除
くすべてのドメインをコードするものであるクローン化
DNA。 2、請求項1記載のDNAを含有するベクター。 3、請求項2記載のベクターで形質転換された原核生物
または真核生物宿主細胞。 4、請求項1記載のDNAでコードされたポリペプチド
。 5、請求項4記載のポリペプチドを製造するに当り、請
求項3記載の形質転換された宿主細胞を適当な培地中で
培養し、そしてポリペプチドを単離することからなる製
造方法。 6、請求項4記載のポリペプチドの少なくとも1種およ
び治療上許容しうる担体物質を含有する医薬組成物。 7、医薬組成物の調製への請求項4記載のポリペプチド
の使用。 8、請求項5記載の方法によって調製された請求項4記
載のポリペプチド。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP89107572.3 | 1989-04-26 | ||
EP89107572 | 1989-04-26 | ||
EP89117606.7 | 1989-09-23 | ||
EP89117606 | 1989-09-23 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0335781A true JPH0335781A (ja) | 1991-02-15 |
Family
ID=26120142
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10896790A Pending JPH0335781A (ja) | 1989-04-26 | 1990-04-26 | キメラcd4イムノグロブリンポリペプチド類 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0394827A1 (ja) |
JP (1) | JPH0335781A (ja) |
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