JPH0335781A - キメラｃｄ４イムノグロブリンポリペプチド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 可溶性ＣＤ４はいくつかの理由からヒト免疫不全ウィル
ス（Ｈｍの中和にとって最適な特異性を提供する。第一
には、ＣＤ４とＨＩＶ−会合リガントｇｐ１２０との間
の相互作用の強度が極めて高い、すなわち１０−’Ｍの
準位である（Ｓｍｉｔｈ、　Ｄ、Ｈ，らの５ｃｉｅｎｃ
ｅ罎阻、　１７０４−１７０７．１９８７；　Ｌａ５ｋ
ｙ、　Ｌ、らのＣｅ１ｌ　５０゜９７５−９８５．１９
８７）：とである。第二には、ＨｒＶ（７）遺伝的変異
体が頻繁に出現しそして免疫的監視からの“逃避”機構
を現出しうるものであるが（にｌａ　ｔｚａ＋ａｎｎお
よびＧｌｕｃｋｓａｎの！＋＋ｎｕｎｏ１．Ｔｏｄａｙ
　、１．２９１−２９６（１９８６Ｊ）、　それら変異
体はそれらの感染循環を維持するためにそれらのＣＤ４
結合性質を保持する必要があることである。第三に、感
染期間中に獲得された旧Ｖエンベロープ蛋白ｆｇｐ１２
０に対する免疫が免疫系に対して有害な作用を有し得、
ウィルスから脱落した遊離のｇｐ１２０　（Ｓｃｈｎｅ
ｉｄｅｒ、　Ｊ、らのＪ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、ｆ
ｉ！、　２５３３−２５３９　（１９８６］）　　はＣ
Ｄ４−陽性細胞上で特異的に捕捉され得るからである。

こうして、これらの非感染細胞は種々の形の抗−ａｐ１
２０免疫攻撃の標的となり得る（Ｌｙｅｒｌｙ、　Ｈ，
Ｋ。

らのＰＮＡＳ　ＵＳＡ　鉦、　４６０１−４６０５．　
［１９８７］　：　Ｗｅｉｎｈｏｌｄ。

Ｋ、Ｊ、らのＬａｎｃｅｔ＋　９０２−９０５＋　［１
９８８］　；　Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ。

＾、らのＮａｔｕｒｅ　３３４．５３０−５３４　［１
９８８］：　５ｉｌｉｃｉａｎｏ。

Ｒ，Ｆ、らのＣｅ１ｌ旦、　５６１−５７５　［１９８
８］）　、　ＣＤ４特異性に基づく受動免疫は、それが
細胞表面に結合したＣＤ４受容体に結合されたａｐ１２
０分子をウィルスに感染した細胞により産生されたもの
と区別することができるため、局外者によるこの破壊を
回避させることができる。該可溶性ＣＤ４分子の調製は
例えばＳｍ１ｔｈ、　Ｄ、Ｈ，らの５ｃｉｅｎｃｅ　１
３Ｊ１．１７０４−１７０７゜（１９８７）；　Ｆｉｓ
ｈｅｒ、　Ｒ，＾、らのＮａｔｕｒｅ　！ｌ１１．７６
−７８゜（１９８８）；　Ｈｕｓｓｅｙ、　Ｒ，Ｅ、ら
のＮａｔｕｒｅ　！１１１．７８−８Ｌ（１９８Ｂ）；
　Ｄｅｅｎ、　Ｋ、Ｃ，らのＮａｔｕｒｅ　、ｉｌｌ、
　８２−８４．（１９８８）；　Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ
、　Ａ、　　らのＮａｔｕｒｅ　フ４．８４−８６゜（
１９８８）　；およびコロンビア大学の研究者ら（ＷＯ
８８１０１３０４参照）によって報告されている。加う
るに、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ　、１１
１．８４−８６．１９８８）は、イムノグロブリン軽鎖
の定常ドメインに融合した場合にＣＤ４の最初の２つの
ドメインがインビトロにおいてＨＩＶ感染を阻止するの
に充分であることを示した。

かかる可溶性ＣＤ４−分子を種々のイムノグロブリン重
鎖分子と結合させることにより、いわゆるキメラＣＤ４
−イムノグロブリンポリペプチドが生成され、これらは
既に可溶性ＣＤ４−分子について述べた点に加えて以下
の利点を有する。すなわちイムノグロブリン部分は、キ
メラポリペプチドの残る部分に対して大きい安定性を付
与しそれにより、例えばヒトＩｇＧの２３日およびＩｇ
Ｍの５日のようにインビボにおけるそれらの半減期を高
める可能性がある（Ｗａｌｄｍａｎらの”Ｉｍｍｕｎｏ
ｇｌｏｂｕｌｉｎｓ　＋　Ｅ。

Ｍｅｒｌｅｒ編、　、１９７０．３３−４８頁、　Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ、
　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ＋　ｏｃ〉、更には、ｒ　（Ｉ
ｇＧ）およびμ（ＩｇＭ）重鎖の定常領域は補体を結合
でき、ＨＩＶウィルス類またはウィルス産生細胞の中和
または段孔をより効果的なものとなす（Ｙａｒｃｈｏｕ
ｎらの５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ＋　１
９８８年１０月参照）、インビボにおける半減期増大は
、最初の２つまたは４つの全てのＣＤ４−ドメインおよ
びヒトＩｇＧ＋１ｔｌｆ定常領域の３つの全てのドメイ
ンからなるキメラポリペプチドに関してＣａｐｏｎ＋　
Ｄ、Ｊ、らのＮａｔｕｒｅ　３３１＋５２５−５３１　
（１９８９）に示されている。これらの特定のキメラポ
リペプチドへの補体の結合は観察されなかった。しかし
ながら本発明のキメラポリペプチドに対する補体の結合
は示され得る〔詳細は実施例５および第５図参照〕、更
に、これらのポリペプチドはＰｃ−受容体に結合し〔実
施例６および第５図〕、それにより抗体依存性細胞毒性
（ＡＤＣＣ）を仲介し得るリンパ細胞を誘引し得た。　
　Ｆｃ−受容体への結合はＣａｐｏｎ＋口、Ｊ、ら（前
出）によってもそれらのキメラポリペプチドに関して示
されている。これらの作用は該キメラポリペプチド類の
軽鎖部分ではなくして重鎖部分の寄与によるものである
から、これらの作用のすべては、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ
らのＮａｔｕｒｅ　、ｉｌｌ、　８４−８６（１９８８
）およびＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ　ｌｊｌ、　
２９−３２　（１９８９）に記載されたキメラＣ［１４
−イムノグロブリン軽鎖ポリペプチドに比較したキメラ
ＣＤ４−イムノグロブリン重鎖ポリペプチドの長所であ
る。

更には、以下に記載される本発明のポリペプチドのいく
つかは、１個のポリマー構造中に数個のｇｐ１２０結合
部位を含有する明確なオリゴマーを形威し、それによっ
て、例えばＴｒａｕｎｅｃｋｅｒらのＮａｔｕｒｅ３ｍ
、　８４−８６　（１９８８）に記載されるキメラポリ
ペプチドと比較した場合にキメラＣＤ４−ＩｇＭ重鎖ポ
リペプチドに見出されるように、ＨＩＶ−依存性シンシ
チウムアッセイにおいてＨＩＶ−阻害効果を１０００倍
増大させる。

本発明は、一つの断片がヒトＣＤ４−分子の最初の２個
のドメインまたはその一部分をコードし、他方が哺乳類
イムノグロブリンの重鎖の定常領域の最初の部分を除く
すべてのドメインをコードするものである２つのＤＮＡ
断片の組合せからなるクローン化ＤＮＡに関する。ヒト
ＣＤ４−分子の最初の２個のドメインの部分とは下記の
ことを意味しうる： （ａ）　　第２のドメインの一部分と組合された完全な
第１のドメイン、または （ｂ）　　第１のドメインの一部分と組合された完全な
第２のドメイン、または （Ｃ）　　両頭域の一部分ずつの組合せ。

本発明の好ましい実施態様は前記断片の一方が、ヒトＣ
Ｄ４−分子の最初の２つのドメインをコードしているク
ローン化ＤＮＡである。

他の好ましい実施態様は前記断片の一方が上記の特徴を
有し、前記断片の他方が、（ａ）哺乳類１ｇＭ、（ｂ）
哺乳類ｒｇｃ、または（Ｃ）＠乳類１ｇＡ、の重鎖の定
常領域の最初の部分を除くすべてのドメインをコードす
るクローン化ＤＮＡである。

本発明の他の好ましい実施態様は上記定義されたクロー
ン化ＤＮＡにおいて該哺乳類イムノグロブリンがマウス
またはヒトイムノグロブリンであるものである。

本発明の特に好ましい実施態様は上記定義されたクロー
ン化ＤＮＡにおいて、ＣＤ４コ一ド部分が前記のとおり
であり、そしてＤＮＡ断片の他方が、（ａ）　？ウスＩ
ｇ　ｒ　２ａ、または（ｂ）？ウスＩｇμ、または（Ｃ
）ヒトＩｇｕ、または（ｄ）ヒトＩｇ７１．または（ｅ
）ヒトＩｇγ３、または（ｆ）ヒト１ｇα１、または（
濁ヒトＩｇα２の重鎖の定常領域の最初の部分を除くす
べてのドメインをコードするものである。

本発明は更に、前記定義されたＤＮＡを含有するベクタ
ー好ましくは原核生物および真核生物宿主細胞内で複製
可能なシャトルベクター、更に好ましくは適切な宿主細
胞内で、組み込まれたＤＮＡによりコードされる蛋白質
を発現しうるシャトルベクターに関する。

本発明の他の目的は前記定義されたベクターにより形質
転換された原核生物および真核生物宿主細胞、ならびに
かかる形質転換された宿主細胞を適切な培地中で培養す
ることによる前記定義されたＤＮＡによりコードされる
ポリペプチドの製造方法にある。

本発明のもう一つの実施態様は、前記定義されたＤＮＡ
によりコードされるポリペプチド類それ自体である。か
かるポリペプチドはヒトＣＤ４−分子の最初の２つのド
メインまたはそれらの断片、および哺乳類イムノグロブ
リン（ｒｇ）の重鎖の定常領域の最初の部分を除くすべ
てのドメインを含んでなるキメラ的な実体のものである
。好ましいポリペプチド類はｒｇ部分に加え、ヒトＣＤ
４−分子の最初の２つのドメインを含むものである。特
に好ましい実施態様においてはこれらのポリペプチドの
ＣＤ４一部分はア案ノ酸配列 ＫＫＶＶＬＧＫＫＧＤＴＶＥＬＴＣＴＡＳＱＫＫＳＩＱ
ＦＨＷＫＮＳＮＱＩＫＩＬＧＮＱＳＦＬＴＫＧＰＳＫＬ
ＮＤＲＡＤＳＲＲ５ＬＷＤＱＧＮＦＰＬ　Ｉ　ＩＫＮＬ
Ｋ　Ｉ　ＥＤＳＤＴＹ　Ｉ　ＣＥＶＥＤＱＫＥＥＶＱＬ
ＬＶＦＧＬＴＡＮＳＤＴＨＬＬＱＧＱＳＬＴＬＴＬＥＳ
ＰＰＧＳＳＰＳＶＱＣＲ３ＰＲＧＫＮ　Ｉ　ＱＧＧＫＴ
ＬＳＶＳＱＬＥＬＱＤＳＧＴＷＴＣＴＶＬＱＮＱＫＫＶ
ＥＦＫＩＤＩＶＶＬを含有する。

本発明の他の好ましいポリペプチド類は前記詳細に述べ
たＤＮＡ類によりコードされるものである。

前記ポリペプチド類の少なくとも一種および治療上許容
される担体物質を含有する医薬組成物、ならびにそれら
の製法は本発明のもう一つの実施態様である。

最後に、本発明はまた医薬Ｍｉ戒物の調製のため、およ
び種々の疾患の治療特にエイズ（ＡＩＤＳ）の治療のた
めの前記ポリペプチドの使用にも関するものである。

本発明は、添付した図面と関連させて以下の詳細な記述
に基づきより良く理解されよう。

第１図はプラスくドｐＨＴ４−Ｙに１２　、ｐＣＤ４−
Ｍμ、およびｐＣＤ４−Ｍγ２ａを示す０箱は、エクソ
ンの特定の部分と同等なｃＤＮＡの断片〔実施例１参照
〕、またはプラスミドの作製に使用されたエクソンそれ
自体を示し、ここで白ぬきの箱は、ヒトＣＤ４分子のリ
ーダー領域（Ｌ）および４個すべて（１，２，３，４）
の細胞外ドメインをコードするＤＮＡを示す、Ｘの箱は
イムノグロブリンに軽鎖定常Ｎ域（Ｃに）をコードする
エクソンを示す０点を付した箱はマウスｔｇｃ、、定常
領域のヒンジ（Ｙ４）ならびに第２および第３のドメイ
ン（Ｃ２，Ｃ３）をそれぞれコードするエクソンを示す
。斜線を付した箱はマウス１１Ｍ定常領域の第２、第３
および第４のドメインをそれぞれコードするエクソンを
示す、他の略号は：　Ｂ＝Ｂａａ＋Ｈ１制限部位、Ｒ＝
ＥｃｏＲＩ制限部位、５＝Ｓａｌｌ制限部位、５ｓｘＳ
ｓｔｌ制限部位、５ｔ＝Ｓｔｕｌ制限部位、Ｘ−Ｘｂａ
ｌ制限部位、Ｘｈ　＝　Ｘｈｏｌ制限部位、ａｍｐ　”
アンピシリン耐性遺伝子、ｇｐｔ−大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）キサンチン−グアニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ遺伝子、にｐｒｏｙｓ−１ｇに７”ｔ）−
［−−ター、にＥＩＪＨ＝Ｉｇにエンハンサ−１Ｈ−Ｃ
ＨＮＨ＝Ｉｇｌｌ鎖エンハンサ−を示す。

第２図はプラス逅ドｐＨＴ４−ＹＫ１２（第１図参照）
、ｐＣＤ４−ＭμおよびｐｃＤ４−１１１１を示す、こ
れら後者プラスミドにおいて、箱は第１図のマウスエク
ソンに対応するヒトＩｇＧおよび１ｇＭ領域を示す、“
Ｐ”はＰｓｔｌ制限部位、および“Ｈａ“はＨａｓ　ｎ
制限部位、“Ｐν”はＰｖｕ　ＩＩ制限部位および“Ｓ
１１″は５ｅａｌ制限部位を示す、他のすべての記号お
よび略号は第１図におけると同じ意味を有する。

第３図は第１図中に示される相当するプラスミドルＣＤ
４−Ｍ　＃およびｐＣＤ４−Ｍ　７２ａ中に組込まれた
クローン化ＤＮＡによりコードされるキメラポリペプチ
ド類、“ＣＤ４−Ｍμ”および“ＣＤ４−Ｍ　ｒ　２ａ
”のウェスタンプロット分析を示す、レーンＡは細胞培
養上清由来の免疫沈降されたキメラ−ポリペプチドまた
は天然１ｇ分子、または（１）の場合のように免疫沈降
された細胞培養上清の還元条件下における１０％ポリア
クリルアミドゲル（ＰＡＧＩＩり操作のプロットを示す
： （１）　Ｘ６３−０　：　１ｇ分子を分泌しなイｘ６３
−０ξエローマ細胞系［Ｐ３Ｘ６３＾ｇ８細胞系と同一
］（２）　Ｌ３Ｔ４　　：　Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒらの
Ｉｍｓ＋ｕｎｏ１．Ｔｏｄａｙ　１０＋　２９−３２（
１９８９）記載の細胞系により分泌された可溶性マウス
ＣＤ４−分子 （３）　ＨＴ４−Ｙｌ：キメラＣＤ４−マウス１ｇに軽
鎖ポリペプチドを分泌するｐＨＴ４−Ｙｌ　［Ｔｒａｕ
ｎｅｃｋｅｒらのＮａｔｕｒｅ　本比、　８４−８６（
１９８Ｂ）］でトトランスフェラーゼされたＸ６３−０
ξエローマ細胞系 （４）　８１．８／Ｉｇ？Ｉ、λ：マウスＩｇＭを分泌
する細胞系［Ｒｅｔｈ、Ｍ、らのＥｕｒｏｐ、Ｊ、ｌ５
−ｕｎｏｌ、Ｊ、３９３（１９７８）］ （５）　ＣＤ４−Ｍμ：キメラＣＤ４−Ｍμｍポリペプ
チドを分泌するｐＣＤ４−１’ｌμでトランスフエフシ
ロンされたＸ６３−０　ミエローマ細胞系 （６）　ＵＰＣ１０／ＩｇＧ２ａ、　ｘ　：　ＩｇＧ２
ａを分泌するＵＰＣ１０細胞系［Ｌｉｔｔｏｎ　Ｂｉｏ
ｎｅｔｉｃｓ、　Ｋｅｎｓｉｎｇｔｏｎ＋Ｍａｒｙｌａ
ｎｄ、　ＵＳＡＩ （７）ＣＤ４−Ｍｒ２ａ：キメラＣＤ４−Ｍ　ｒ　２ａ
ポリペプチドを分泌する９ＣＤ４−Ｍ　Ｔ　２Ｍでトラ
ンスフエフシランされたＸ６３−Ｏａエローマ細胞系試
料１〜３はウサギ抗−マウスににより、試料４および５
は、ウサギ抗−マウスＩｇＭにより、試料６および７は
蛋白質−Ａにより免疫沈降させた。

すべての抗体類および蛋白質Ａはセファロース４Ｂ　（
Ｐｈａｒｇ＊ａｃｉａ、　ＩＪｐｐｓａｌａ＋　Ｓｗｅ
ｄｅｎ）上に固定化させた。ウェスタンプロット分析は
非還元条件下に３−７％勾配ＰＡＧＥ　（Ｂ）または７
％ＰＡＧＥ（Ｃ）操作の後に行なわれた。結果は第一段
階でウサギ抗−マウスｒｇ類（Ｎｏｒｄｉｃ　Ｌａｂｓ
＋　ＮＬ）の混合物を用いて可視化し次にロバＩＩ！Ｊ
−標識抗−ウサギＩｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ。

Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ、　ＧＢ）を用いて可視化した。標
準分子量マーカーを左側（Ａ）に示しである（ｋｄ）、
　（Ａ）における約４５ｋｄのバックグラウンドバンド
（１〜５）は試料が電気泳動用に調製された場合にセフ
ァロースから放出されたウサギＩｇＧによる。代謝的に
標識されたｇｐ１２０の存在下であってそれ以外は（Ａ
）　−（Ｃ）と同じ条件における、ＨＩＶ　Ｉ感染Ｈ９
細胞上清からの共同免疫沈降に続＜　ＰＡＧＥおよびフ
ルオログラフィが（Ｄ）に示される。

第４図は以下の組換え蛋白質に関するシンシチウム形成
の阻害の程度を示し、これらの蛋白質の濃度がＸ軸に対
数目盛で示され、そしてＹ軸には三通りで採点されたシ
ンシチウムの数が示される。

：ＣＤ４−Ｍ＃　雪プラスミＦｐＣＤ４ＪμのＤＮＡに
よりコードされるキメラ蛋白質。

：ＣＤ４−Ｍ　ｒ　２ａ　＝プラスミドルＣＤ４−Ｍ　
１２ａのＤＮＡによりコードされるキメラ蛋白質。

：ＣＤ４−Ｍに＝プラスミドｐＨＴ４〜ＹＫ１２のＤＮ
Ａによりコードされるキメラ蛋白質。

：Ｌ３Ｔ４−Ｍ　ｔｃ　＝Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら（Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、Ｔｏｄａｙ　１０＋　２９３２　［１９
８９］）に記載される可溶性マウスＣＤ４−分子。

第５図（Ａ、　Ｂ）は、実施例５により測定されるＣＬ
ｑに対するＣＤ４−ＭμおよびＣＤ４−門γ２ａの結合
のアッセイ結果を示し、ここでＣ１ｑはそれらの重鎖部
分の結合゛部位を介して補体カスケードの第１戒分であ
る［Ｂｕｒｔｏｎ、　ｏ、　Ｍｏ１ｅｃｕ１．　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、２２゜１６１−２０６　（１９８５））。マ
イクロタイタープレートを精製ＣＤ４−Ｉｇ類および対
照としての天然１ｇ類を用いて１０　ｕ　ｇｏｄ　（Ａ
）および１　ｕｇ／ｄ！（Ｂ）の濃度で被覆した。１′
■−標ＦＪｉ　Ｃ１ｑの直接結合は１分当りのカウント
数（ｃ、ｐ、ｍ、）によって与えられる。レーンａｒｃ
０４−Ｍ　１２ａ　；レーンｂ　：ＩｇＧ２ａ、　ｔｃ
　（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）であるモノ
クローナル抗体０ＫＴ３；レーンｃ　：ＣＤ４−門μ：
レーンｄ　：ＴＥＰＣ１８３（Ｌｉｔｔｏｎ　Ｂｉｏｎ
ｅｔｉｃｓ）からのマウス１ｇＭ、　ｘ　；レーンｅ：
ｃＤ４−Ｍｘ　［ＴｒａｕｎｅｃｋｅｒらのＮａｔｕｒ
ｅ　３３１．８４−８６　（１９８８））　　；レーン
ｆ：ウシ血清アルブξン。

第５図（Ｃ）は、マウスマクロファージ細胞系Ｊ７７４
　Ａ、１（ＡＴＣＣＮｔｌＴＩＢ６７）上のＦｃ７受容
体へのキメラ蛋白質ＣＤ４−Ｍγ２ａの結合結果を示す
。Ｉ２５ｊ−標識ＣＤ４−Ｍγ２ａの競合百分率（％）
は実施例６で測定されるように非標識競合体に応じて得
られている〔（○）：　ＣＤ４−Ｍ７２ａ、　（・）：
非標識１８Ｇ２ａ　＝モノクローナル抗体０ＫＴ３）。

本発明はまた、本発明のＤＮＡによりコードされるポリ
ペプチドの製造方法にも関するもので、この方法は前記
ポリペプチドを発現しうるづフタ−で形質転換された宿
主細胞を適当な培地中で培養しそして前記ポリペプチド
を単離することからなる。

本発明のクローン化ＤＮＡは一方においては例えばＭａ
ｎｉａｔｉｓ＋　Ｔ、らの”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ’　（１９８２）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより、また更
に詳細には例えばＭａｄｄｏｎ、　Ｊ、Ｐ、のＣｅ１ｌ
　Ｑ（１９８５）、　９３−１０４にヒトＣＤ４−分子
をコードするＣＤＮＡについて記載されているように、
適切なｍＲＮＡ調製物から出発してｃＤＮＡの形態で得
ることができることは５業上よく知られている。かかる
ｃＤＮＡが、本発明を実施するにあたっての所望の数取
上のドメインをコードしている場合には前記ｃＤＮＡを
、その配列に関する知識および所望のドメインのアミノ
酸配列に関する少なくとも部分的な知識に基づき、当業
者に周知のヌクレアーゼ処理により切断しなければなら
ない。

他方において、このようなりローン化ＤＮＡはこの分野
で周知でありかつ例えばＭａｎｉａｔｉｓ、　？、らの
’Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”（前出）に記
載される方法によりゲノムライブラリーから単離された
ゲノムＤＮＡの形態で得ることができる。例えば、特定
のオリゴヌクレオチドプローブは、単離すべき特定のゲ
ノムＤＮＡ（エクソン）によりコードされるアごノ酸配
列の少なくとも部分的な知識に基づき、またはそのヌク
レオチド配列に関する少なくとも部分的な知識に基づき
調製され得る。このような配列情報は、原則的には任意
の配列データベース例えばＧｅｎｂａｎｋ（Ｉｎｔｅｌ
ｌｉｇｅｎｅｔｉｑｓ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ。

ＤＮＡ）、ＥＭＢＬ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、　ＦＲＧ
）、Ｎ８１？Ｆ　（Ｇｅｏｒｇｅ　ｔｏｗｎＵｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ、　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｒｅ、　Ｗａ
ｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ。

ＵＳＡ）およびＶｅｃｂａｓｅ　（［Ｉｎ１ｖｅｒｓｉ
ｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｅｎｔｒｅ、　Ｍａｄ
ｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、　ＵＳＡ）から、ま
たはより詳細には例えばヒトＣＤ４−分子についてはＭ
ａｄｄｏｎらの（１９８５）　Ｃｅ１ｌ　４２．９３−
１０４から、マウスＩｇμについては＾ｒｎｈｅｉ恥Ｎ
、らのＣｅ１１２２、１７９−１８５　（１９８０）か
ら、マウス１ｇ　ｒ　２ａについてはＲｏｅｄｅｒ、　
Ｈ，らのＰＮＡＳ　７８．４７４−４７８　（１，９８
１）から、ヒトＩｇｕについてはＲａｂｂｉｔｓ＋　Ｔ
、Ｈ，らのＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　　９
．４５０９−４５２４（１９８１）からヒトＩｇｒｌに
ついてはＥｌｌｉｓｏｎ、　Ｊ、Ｗ、らのＮｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　１０．４０７１−４０７９（
１９８２）から、ヒトＩｇ７３重鎖遺伝子についてはＨ
ｕｃｈ、　Ｓ、らのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ
４４．１７７９−１７８９（１９８６）から、そしてヒ
トＩｇｃｒｌおよびＩｇα２重鎖遺伝子についてはＦｌ
ａｎａｇａｎ、　Ｊ。

Ｇ、らのＣｅ１ｌ　Ｌ６．６８１−６８８（１９８４）
から得ることができ−る。

次いで、ＤＮＡの所望の断片のゲノムクローンは、上述
のように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを当業
者に知られた適切な特定のハイブリッド化条件のもとで
使用して検出することができる。

上述のようにして得られた種々のヒトＣＤ４−およびイ
ムノグロブリン重鎖ドメインをコードするＤＮＡのクロ
ーン化断片を次にこの分野で周知の例えばＭａｎｉａｔ
ｉｓらの“Ｍａｌｅｃｕｌａｒ　ＣＣｏ１ｎ１ｎ”（前
出）に記載の方法に従い処理して適当なベクター中に組
込む。キメラポリペプチド類をコードするＤＮＡ断片は
異なった起源のもの、すなわち一部はＣＤＮＡであり、
一部はゲノム起源であってもよいことはよく理解されま
た本発明に包含される。

本発明を実施するのに適するベクター類には、この分野
で周知でありかつ原核生物または真核生物宿主細胞に組
込まれたＤＮＡの複製に一般に使用されるベクター類、
特にこのような目的のために原核生物および真核生物宿
主細胞において使用され得るシャトルベクター類、なら
びに真核生物宿主細胞においてポリペプチドを発現する
ためのベクター類が包含される。特に好ましいものは、
真核生物宿主細胞内でのポリペプチド類の発現のために
使用され得るシャトルベクター、例えばｐＳＶ２−ｃａ
ｔ［ＡＴＣＣＮｃＬ３７１５５］　、　ｐＳＶ２−ｄｈ
ｆｒ　［ＡＴＣＣＮ１１３７１４６］、ｐＳＶ２−ｎｅ
ｏ［ＡＴＣＣＮａ　３７１４９］　またはｐＳＶ２ｇＰ
ｔ　［ＡＴＣＣｋ　３７１４５］　（７）ようなｐＳＶ
２由来ベクター類〔例えばＧｅｒｍａｎ、　Ｃ，の”Ｄ
ＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　＋　Ｖｏｌ、　ＩＩ　＋Ｇｌｏ
ｖｅｒ、　Ｄ、Ｍ、ｌｉ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘ
ｆｏｒｄ、　１９８５に記載されている〕である、ｐＳ
Ｖ２−ｇｐｔ由来ベクター類、特にｐＨＴ４−Ｙｌ、　
ｐＣＤ４−Ｍｒ２ａ、　ｐＣＤ４−Ｍ、ｃｚ、ｐＣＤ４
−Ｍμ、ｐＣＤ４−Ｈｒ　１およびｐＣＤ４−Ｈｒ　３
が好ましい。

プラスミドｐＣＤ４−Ｍγ２ａおよびｐＣＤ４−Ｍμは
特許出願のためにブダペスト条約のもとに、１９８９年
１月２６日付でそれぞれ寄託番号ＤＳＭ　５１７３およ
びＤＳＭ　５１７４のもとにＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍ
ｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ
ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　Ｇ＋＋＋ｂＨ（Ｄ
ＳＭ）、　Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＢＲＤに寄託さ
れており、プラスミドルＣＤ４−１μおよびｐＣＤ４−
Ｈｒ　ｌは１９８９年４月２１日にそれぞれ寄託番号Ｄ
ＳＭ　５３１５およびＯＳＭ　５３１４のちとに、そし
てプラスミドルＣＤ４−Ｈｒ　３は１９８９年９月１４
日に寄託番号０３Ｍ５５２３のもとに寄託されている。

次いで原核生物または真核生物宿主細胞をかかるベクタ
ー類で形質転換させることができる。かかる目的に適当
な原核生物宿主細胞は当業者には周知であり、細菌例え
ば大腸菌、特に大腸菌に１２株、例えばＮ１５（Ｖｉｌ
ｌａｒｅｊｏらのＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１２０＋
４６６−４７４　［１９７４］ニ０２２９１として記載
されテイル）およびＨＢＩＯＩ　［ＡＴＣＣＮａ　３３
６９４］　が包含される。

やはり当業者に周知の適当な真核生物宿主細胞にはを椎
動物細胞、酵母または他の起源のものが包含され、例え
ばＰ３Ｘ６３Ａｇ８［ＡＴＣＣＮａ　ＴＩＢ９］および
Ｊ５５８　［ＡＴＣＣ弘ＴＩＢ６］のようなミエローマ
細胞系が好ましい０本発明を実施するのに使用される特
定の宿主細胞に応じて適当なプロモーター要素、例えば
Ｉ　ｇ　！　！１プロモーターまたはＩｇに一プロモー
ター（実施例１参照）および所望により適当なエンハン
サ−要素例えば１ｇ１ｉ鎖エンハンサ−または１ｇ軽鎖
エンハンサ−（実施例１参照）を当業上周知の方法によ
りかかる宿主細胞の形質転換に使用されるプラスミド中
に組込むことができる。

上記のベクターによる宿主細胞の形質転換は任意の慣用
的方法または下記実施例に記載される特定の方法により
行なうことができる。

宿主細胞が例えば大腸菌のような原核生物である場合に
は、ＤＮＡを取込みうるコンピテントな細胞は対数増殖
期後に収穫し次いで周知のＣａＣ１ｇ−法により処理し
た細胞から調製する。形質転換は、該宿主細胞のプロト
プラスト形成後に、または５業上知られた他の方法によ
り実施することもできる。

用いられる宿主が真核生物である場合には、リン酸カル
シウム沈澱およびＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｃ，Ｇｏ
ｒｍａｎの“ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、　Ｖｏｌ、　
ＩＩも参照）のようなトランスフェクション法、マイク
ロインジェクシッンのような慣用の機械的操作、赤血球
宿主内またはリポソーム内にカプセル化されたプラスミ
ドの挿入、リゾホスファチジルコリンのような薬剤での
細胞の処理、ウィルスベクターの使用、またはプロトプ
ラスト融合のようなトランスフェクシコン法が本発明の
実施に際して使用でき、プロトプラスト融合法が好適な
方法である（実施例２参照）。

形質転換された細胞を次にこの分野で公知の方法に従っ
て選択し培養することができる。例えば、ホスホトラン
スフェラーゼをコードする“ｎｅｏ”遺伝子を担持する
ベクターにより形質転換された細胞はここで薬剤６４１
８の存在下に培養することができ、また、ベクターが”
ｇｐｔ’遺伝子を担持する場合には形質転換細胞はキサ
ンチンおよびミコフェノール酸（ｍｇｃｏｐｈｅｎｏｌ
ｉｃ　ａｃｉｄ）　・を含有する特定の培地中で増殖さ
せることができる（Ｇｏｒｍａｎの“ＤＮＡＣｌｏｎｉ
ｎｇ　、　Ｖｏｌ、　ＩＩ、前出）。

上記のようにして形質転換された細胞により産生された
本発明のキメラポリペプチドは蛋白質およびペプチド化
学の分野で公知の任意の適切な方法、例えば、硫酸アン
モニウムによる沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過または
イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点
電気泳動、免疫アフィニティクロマトグラフィーのよう
なアフィニティクロマトグラフィー、）ＩＰＬＣ等によ
り回収することができる。

本発明のキメラポリペプチドは例えば当業者には周知の
技術であるウェスタンプロット分析（第３図および実施
例２参照）によるか、または例えば：Ｈ９、ＭＯＬＴ−
４（ＡＴＣＣｋ　ＣＲＬ　１５８２）、ＪＵＲＫＡＴ、
　ＪＭまたはＣＥＭ　（ＡＴＣＣｋ　ＣＣＬ　１１９；
　Ｃｈａｆｆｅｅ、Ｓ　らのＪ。

Ｅｘｐｔ、　Ｍｅｄ、　ｌｆｌ！１−６０５−６２１　
（１９８８））　［Ｐｏｐｏｖｉｃう（７）のＬａｒ＋
ｃｅｔ　（１９８４）　ｉｉ、　１４７２　；　Ｎａｒ
ａ、　Ｐ、Ｌ、およびＦｉｓｃｈｉｎｇｅｒ＋　Ｐ、Ｊ
、のＮａｔｕｒｅ　３３２．４６９−４７０　（１９８
８）も参照〕のような細胞系を使用して５業上知られた
アッセイにおけるそれらのシンシチウム形成阻害能によ
るか、あるいは実施例４に詳細に記載されているように
して特性決定を行なうことができ、ここで実施例４にお
いてはＭＯＬＴ−４またはＣＥ？細胞系がＭＴ−２細胞
に置換され得る。シンシチウム形成を誘導しうる任意の
）ＩＩＶ−１ウイルス、例えば当分野で公知の方法によ
りまたは例えばＰｏｐｏｖｉｃらの５ｃｉｅｎｃｅ　２
２！Ｌ、　４９７−４９９（１９Ｂ４）に記載されてい
るようにして感染Ｈ９細胞系（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ
　８５４３）から得ることができるＨＴＬＶ−ＩＩＩ　
Ｂ　、あるいはＬＡＶ（ＣＮＣ？’ｌ　Ｎａｌ−２３２
）をかかるアッセイに使用することができる０本発明の
ポリペプチドを特性決定するもう一つの方法は、当分野
で公知のアッセイ、または実施例３に詳細に記載されて
おりそして標準的方法に従ったフルオログラフィ（第３
図）により可視化されたＨＩＶ表面蛋白質ｇｐ１２０に
対する結合能力によるか、あるいは、当分野で公知のア
ッセイ、または実施例５に詳細に記載されておりそして
第５図（ＡおよびＢ）に示される補体カスケードの第１
１分であるｃｔｑに対する結合能力によるものである。

この図は、ＣＤ４−ＭＴ２ａおよびＣＤ４−Ｍμが天然
の抗体と同様に効果的にｃｔｑに結合し一方軽鎖定常ド
メインを含有する対照構築物ＣＤ４−Ｍには何ら特異的
な結合を示さないことを示している。

本発明のキメラポリペプチドは、ＩｇＧ重鎖部分のＰｃ
部分（Ｂｕｒｔｏｎ、　Ｄ、のＭｏ１ｅｃｕ１．　ｒｍ
ｍｕｎｏｌ、　２１−＋１６１−２０６　（１９８５）
）ゆえに単球／マクロファージおよび好中球上に存在す
るＰｃ−受容体に結合する能力を有することから、当分
野で公知のアッセイ、または実施例６に詳細に記載され
ており第５図（Ｃ）に示される方法で特性決定すること
もできる。

この図は、ＣＤ４−ＭＴ２ａがマウスＩｇＧ２ａと同程
度および区別し得ない親和性をもってＪ７７４４．１細
胞上のＦｃ受容体に結合することを明示している。キメ
ラヒトＣＤ４−ＨγポリペプチドのＦｃ受容体への結合
は例えば実施例６記載の方法に従ってヒト単球／マクロ
ファージ細胞系０９３７（ＡＴＣＣＮｉｌ　ＣＲＬ　１
５９３）を用いて示すことができる。更にはかかるキメ
ラポリペプチドは例えばＰａｕｗｅｌｓら（Ｊ、Ｖｉｒ
ｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ並、　１７１−１８５　（１９８
７））記載のアッセイ、または細胞と細胞の接触による
ウィルス転移の阻止能力によっても特性決定することが
できる。

本発明によれば新規なキメラ蛋白質は種々の疾患、特に
エイズの治療に使用することができる。

それらは、医薬上許容される形態、特に注射可能な形態
で投与され得る。投与量および投与割合は同様な構造お
よび／または機能を有する他の公知のポリペプチドの臨
床的適用において現在用いられているのと同程度である
。医薬Ｍ放物は本発明のキメラポリペプチドの少なくと
も１種を医薬上許容される固形または液体担体物質と組
合せて含有しうる。任意の慣用的に使用される担体物質
を使用できる。更には、該医薬組成物は他の医薬活性薬
剤を含有でき、当分野で公知の方法により調製され得る
。

本発明を一般的に記述したが、本発明は下記詳細な実施
例によりさらにより良く理解されよう。

これら実施例は例示目的のためにのみここに含めたもの
で、特記しない限り本発明はそれらに限定されるもので
はない。

実施例１ プラスミド頻の作製 ＭａｎｉａｔｉｓらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：＾Ｌａｂｏｒａ　ＬｏｒｙＭａｎｕａｌ、　Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ＋　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、　ニューヨーク　（１９８２）に記載される標
準方法を使用してプラス【ドの作製を行なった。

すべての作製のための出発プラスミドはｐＨＴ４−Ｙｌ
と呼ばれ、↑ｒａｕｎｅｃｋｅｒ＋　Ｌｉ１ｋｅおよび
Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎによって以前Ｎａｔｕｒｅ　３
３１．８４−８６　（１９８８）に記載されたと同様に
して調製することができる。アンピシリン耐性遺伝子お
よびｇｐｔ遺伝子（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、
　１９８０．５ｃｉｅｎｃｅ　迅巴、　１４２２）を選
択マーカーとして有するこのベクターは、更にマウスイ
ムノグロブリンカッパ軽鎖定常領域に融合したヒトＣ０
４受容体の全細胞外部分からなるハイブリッド蛋白質を
もコードする。

ベクターｐＨ７４−Ｙｌを、ベクターｐＨ７４（Ｔｒａ
ｕｎｅｃｋｅｒら、１９８６．　ＩＥｕｒ、　Ｊ、　Ｉ
ｎｕｓｕｎｏｌ、ｌｆｉ、　８５１−８５４）に由来す
るより効率のよいマウス１ｇカッパプロモーターにより
マウスｒｇ重鎖プロモーターを置換することによって修
飾した。カッパプロモーターを始めに、Ｂａｇ旧および
５ａｌＩで消化したベクターｐＵｃ１８中にＢａ１ｌｌ
／５ａｌｌフラグメントとしてサブクローンし、２．２
ｋｂの旧ｎｄｌｌｌ（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのタレ
ナラフラグメントを用いて３゛−後退末端を充填、以下
“平滑末端”と称す）／ＥｃｏＲＩフラグメントを回収
し次にＸｂａｌ　（平滑末端）／ＥｃｏＲＩ消化ｐＨＴ
４−Ｙｌに挿入してプラスミドｐＨＴ４４に１２（第１
図参照〉を生成させた。

次いでこのプラスミドをＢａａ＋旧で消化し、ＣＤ４遺
伝子のエクソン３および４、およびマウスｒｇカッパ軽
鎖定常領域をコードするエクソンを除去し、３°−後退
末端をタレナウボリメラーゼで充填し、そして仔つシ腸
アルカリホスフ１ターゼを用いて脱リン酸化して以下の
遺伝子フラグメント（連結前に平滑末端化）の挿入を促
進させたニーマウス■ｇμ重鎖遺伝子（Ａｒｎｈｅｉｓ
　Ｎ、ら、Ｃｅ１ｌ坐、　１７９−１８５　（１９８Ｇ
））の定常領域エクソンＣ２、Ｃ３およびＣ４を含有す
る、予備プラス果ドｐｃ［１４−Ｍμｍを生ずる３、５
Ｋｂの５ｓｔｌ／Ｘｂａｌ　ＤＮＡフラグメント。

一マウスＩｇ　Ｔ　２ａｌｌ鎖遺伝子（Ｒｏｅｄｅｒ、
　Ｈ，ら、ＰＮＡＳｌ、　４７４−４７９　（１９８１
））のヒンジおよびＣ２およびＣ３定常領域エクソンを
含有し、予備プラスミドルＣＤ４−Ｍ　ｒ　２ａ”を生
ずる３、ＯＫｂの５ｔｕｌ　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメント。

一ヒトＩｇ　ｒ　１重鎖遺伝子（Ｅｌ、１ｉｓｏｎ、　
Ｊ、　Ｈ，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
ｌｆｌ、　４０７１−４０７９　（１９８２））のヒン
ジおよびＣ２およびＣ３定常領域エクソンを含有し、予
備プラスξドｐｃｏｉｉ−）１　ｒ　１”を生ずるＨａ
ｅｌｌＤＮＡフラグメント　（Ｔ４　ＤＮＡポリメラー
ゼを用いて平滑末端化）。

−ヒトＩｇμ重鎖遺伝子（Ｒａｂｂｉｔｓ、Ｔ、Ｈ，ら
、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　９　、４５０
９−４５２４　（１９８１）　）の定常領域エクソンＣ
２、Ｃ３およびＣ４を含有するＤＮＡフラグメント。

このＤＮＡフラグメントは以下の様にして作製された：
始めにヒ目ｇｒ１重鎖遺伝子のＨａｅｌｌフラグソント
を前記のようにして平滑末端化しそしてヒンジエクソン
をＢａｍ＋旧部位の方向に向けて位置させる配向でｐＨ
ｃ１９の平滑末端化された５ａｌＩ部位に挿入した。次
いでこの中間作製物をＰｓｔｌで消化して、遺伝子中の
Ｐｓｔ１部位（第２のＰｓｔＩ部位はｐ［Ｉｃ１９ポリ
リンカー中にある）をはさむ、ヒンジエクソンのスプラ
イスアクセプタ一部位以外の３γｌエクソンを除去し、
次にエクソンＣ２、Ｃ３およびＣ４（Ｒａｂｂｉｔｓら
、前出）を含有するしトμ遺伝子のＰｓｔｌフラグメン
トの挿入を行った０次いでこの最終遺伝子作製物をＢａ
ｍＨＩおよび旧ｎｄＩ［Ｉ消化（両部位共ｐＵｃ１９ポ
リリンカー中）により回収し、続いて前記のようにして
フレナラ処理およびベクターｐＨ７４−ＹＫ１２中への
挿入を行って予備プラスミドルＣＤ４−ＨＢ　”を生成
させた。

これら予備プラスミド（ｐＣＤ４−Ｍμ”　、ｐＣＤ４
−ＭＴ２ａ”、ρＣＤ４−Ｈγ１１）はマウスμ重鎖遺
伝子エンハンサーを含有するＸｈｏｌ−ＳａｌＩフラグ
メントをプロモーターに対して５′−位にある特有の５
ａｌＩ部位（第１図および第２図参照）中に挿入するこ
とによって完成させ、そして予備プラスミドルＣＤ４−
８μｍはマウスμ“コア”エンハンサ−をＳ＠ａ）−Ｐ
ｖｕＩＩフラグメントとしてプロモーターに対して５″
−位にある平滑末端化５ａｌＩ部位中に挿入することに
よって完成させて最終プラスミドルＣＤ４−Ｍμ、ｐＣ
Ｄ４−Ｍ　Ｔ２ａ、　ｐＣＤ４−ＨＴ　１およびｐＣＤ
４−）＋　／／を得た。始めにＧ１１ｌｅｓら（Ｃｅｌ
ｌ　３３．７１７−７２８．１９８３）によって記述さ
れたエンハンサ−フラグメントＸｂａｌ−ＥｃｏＲＩを
、Ｘｂａ　Ｉ上のＥｃｏＲＩ　リンカ−を介してＸｂａ
ｌ＜ＥｃｏＲＩ）部位がＥｃｏＲＶ部位の次に位置する
配向でブルースクリプト　（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ベ
クター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　ＬａＪｏｌｌａ、　
　米国）のＥｃｏＲ１部位中に挿入した。該ベクターの
固有の５ａｌＩ部位中にＸｈｏＩ部位を含有するアダプ
ターを挿入した。最後に、作製物ｐｃＤ４−Ｍμ、ｐＣ
Ｄ４−Ｍ　ｒ　２ａおよびｐＣＤ４−Ｈｒ　１に関して
はＸｈｏｌ−Ｓａｉｌを用いて、または作製物ｐＣＤ４
−Ｈμに関してはＳｍａＩ−Ｐｖｕｌｌを用いてエンハ
ンサ−フラグメントを回収した。

ｐＣＤ４−ＨＴ３を作製するには、プラスミドル）ＨＴ
４−ＹＫ１２（第１図参照）をＢａｍ１ｌｌで消化して
ＣＤ４遺伝子のエクソン３および４ならびにマウス１ｇ
カッパ軽鎖定常領域をコードするエクソンを除去し、そ
して仔つシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化して
、ヒトＩｇ７３重鎖遺伝子［Ｈｕｃｈ、　Ｓ、ら、Ｎｕ
ｃｌｅｔｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、Ｌ４．１？７９−１
７８９　（１９８６））のヒンジおよびＣ２およびＣ３
定常領域エクソンを含有する６、ＯＫｂのＢｇｌｌＩ　
ＤＮＡフラグメントの挿入を促進させて予備プラスミド
ルＣＤ４−Ｈγ３Ｉを生成させた。この予備プラスミド
ルＣＤ４−Ｈｒ　３”はプラスミドルＣＤ４−Ｈμにつ
いて前述したと同様にしてマウスμｃａｅ”エンハンサ
−を挿入することによって完成させた。

実施例２ ＣＤ４−ＭｕおよびＣＤ４−Ｍｙ２ａコード遺伝子の発
現動物細胞および細胞系の維持、クローニング方法、選
択方法およびクローン化細胞の増殖は”Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　ｏｆ　ａｎｉｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　：　Ａ　ｓ＋ａｎ
ｕａｌ　ｏｆ　ｂａｓｉｃｔｅｃｈｎｉｇｕｅ、　Ａｌ
ａｎ　Ｒ，Ｌｔｓｓ、　Ｉｎｃ、＋−１−ニーヨーク（
１９Ｂ３）’中にＦｒｅｓｈｎｅｙ、　Ｒ９１，によっ
て記載される標準方法を用いて行なった。

マウス３ｚｏ−７細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣＮａ
　ＴｉＢ９）またはＪ５５８（ＡＴＣＣｋ　ＴｉＢ２）
を、Ｏｌら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　ｕ、　８２５−８２９
．１９８３）によって記載されるようにしてプロトプラ
スト融合により、プラスミドｐｃＤ４−ＭμまたはｐＣ
Ｄ４−Ｍ　ｒ　２ａを用いて安定にトランスフエフシラ
ンさせた。トランスフエクタントは基礎培地（ダルベツ
コ改良イーグル培地、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）、
５Ｘ１０−’Ｍ　２−メルカプトエタノール）中に５ａ
ｇ／−のミコフェノール酸および２５０　ｕ　ｇ／ｄの
キサンチン（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｅｕｒ、　Ｊ、
ｒｍｍｕｎｏｌ、　ｌｆｌ、　８５１−８５４　［１９
８６１）を包含させることによって選択した。トランス
フエフシランの頻度は１０−Ｓｍ１０−４の範囲であっ
た。

適当な抗体または蛋白質Ａを用いる分泌蛋白質ＣＤ４−
ＭμおよびＣＤ４−Ｍｒ２ａの免疫沈降に続くウェスタ
ンプロット分析（Ｔｉｗｂｉｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７６、４３５０−４３５３　［１
９７９］）により、これらの蛋白質が予期された明らか
な分子量を有することが示された（第３Ａ図）、非還元
条件下（２−メルカプトエタノールを省略）、同じゲル
電気泳動分析（Ｕ、に、Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒ
ｅ　２２７．６８０−６８５［１９７０１による）を行
うと、ＣＤ４−Ｍμがオリゴマーとして、恐らくペンタ
マーとして分泌され、一方ＣＤ４−Ｍ７２ａは、蛋白質
Ａに結合するダイマーを明らかに形成したことが示され
た（第３図ＢおよびＣ）。

実施例３ ｇｐ１２０−結合アッセイ ２Ｘ１０’個（７）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ　Ｂ−感染Ｈ９細
胞（ＡＴＣＣＮａ　ＣＲＬ　８５４３：　Ｐｏｐｏｖｉ
ｃら、５ｃｉｅｎｃｅ　２Ｌ２Ａ＋　４９７−４９９［
１９８４］　；　Ｇａ１ｌｏら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２
Ａ、　５００−５０２　（１９８４］）を、標識培地（
１０％０％ウシ胎清（Ｆｅ２）を補添したシスティン非
含有ＲＰＭＩ−１６４０培地）で洗浄し、１０−の標識
培地中３７℃で３０分間インキュベートし、次いで４Ｉ
Ｉ１１の新たな標識培地に移した。２．５ｍＣ１の２Ｓ
Ｓ−システィン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、米国）を添加後、
細胞をゆるやかに動かしながらインキュベーションを継
続した。４時間後細胞を１０％ｐｃｓを含有する新たな
ＲＰＭＩ−１６４０培地に移して更に１４時間インキュ
ベートした。細胞を沈降させ、両インキュベーション期
間の細胞非含有培養液を混合し、４℃、１５０、ＯＯＯ
Ｘｇ″？！１時間遠心することによりウィルスを取り除
いた。１１１ｔ細胞の培養液を合したもの５０ｕｌを、
ＣＤ４−Ｍ／７またはＣＤ４−ＭＴ２ａを産生するミエ
ローマ細胞の培養液８ｄおよびマウスＩｇＭ重鎖マタは
マウスカッパー鎖のいずれかに対するセファロース結合
ラットモノクローナル抗体５０μｌまたは蛋白質Ａセフ
ァロース（Ｐｈａｒｓ＋ａｃｉａ、ウプサラ、スエーデ
ン）５０＃ｊ！に添加した０次いでこの混合物を４°Ｃ
で１５時間全体を振とうさせた０次にセファロースビー
ズを沈降させ、５ｃｈｎｅｉｄｅｒらにヨッテＶｉｒｏ
ｌｏｇｙ　１３２．１−１１．１９８４に記載されてい
るようにして高塩濃度および低塩濃度洗浄緩衝液中で洗
浄した。最後の洗浄後、セファロースペレットを１００
ｕｊ！の試料緩衝液中で沸騰させた。

次いでこの試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動に続
くフルオログラフィーにより分析してＣＤ４Ｈμまたは
ＣＤ４−Ｍ７２ａに結合された放射性標ｉ６ｇｐ１２０
を検出した（第３図、Ｄレーン３．５．７）実施例４ ジンシチウムアッセイ 種々のキメラ分子の生物学的活性をアッセイするために
、ＨＩＶエンベロープ遺伝子産物を発現する先に報告さ
れた融合誘発性ウィルス感染細胞（４ｕｓｉｇｅｎｉｃ
）およびＣＤ４分子を担持する未感染隣接細胞（Ｓｏｄ
ｒｏｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３２２．４７０−４７４
．（１９８６）：１にもとづく旧Ｖ依存型シンシチウム
アッセイを用いた。あらかじめ滴定された量の旧Ｖ−１
ウィルスを１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０培地中連続
希釈した組み換え蛋白質と共に室温で３０分間インキュ
ベートした６次に２５μｌずつの各混合物を、１ウェル
当り５０μｌの培地中に２５．０００個の酊−２細胞（
Ｍｙｏｓｈｉｌ、らＮａｔｕｒｅ　２９４．７７０−７
７１　（１９８１））をあらかじめ含有する９６−ウェ
ルマイクロタイタープレートのウェル中に３通りずつ移
した。３日間培養後１００μｌの新たな培地を添加し、
２日後シンシチウムを数えた。シンシチウム形成の５０
％阻害（ＩＤｓｏ）はＣＤ４−Ｍｕで１０ｎｇ／ｄの濃
度で得られこれはＣＤ４−Ｍｙ、２ａおよびＣＤ４−Ｈ
にのＩＤ５ｏ（１０μｇ／ｄ）よりも約１０００分の−
低かった。ネズミ可溶性ＬｓＴａレセプター　（Ｔｒａ
ｕｎｅｃｋｅｒ、　Ａ、ら、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　
Ｔｏｄａｙ　ｌＪｌ＋２９−３２　（１９８９））は不
活性であった。シンシチウム形成の完全な阻害はＣＤ４
−Ｍｕで１−２ｄｇ／ｒｘｌΦ濃度で得られた（第４図
参照）。

実施例５ Ｃ１ｑへの結合 マイクロタイタープレートを、食塩水中における１０μ
ｓ／ａｄｌ　（第５図、Ａ）および１μｓ／ｄ（第５図
、Ｂ）の濃度の精製ＣＤ４−Ｍｙ２ａまたはＣＤ４−Ｍ
＃ポリペプチドで被覆するかまたは対照として同じ濃度
のマウスＩ　ｇＧ２ａまたはＩｇＭで被覆した。−夜イ
ンキエベーションしたのちプレートをＰＢＳ　（リン酸
緩衝食塩水）中の１％ＢＳＡで遮断し、次に５０．００
０ｃｐｍ（〜２ｎｇ）の１ｔＳＩ標識ヒトＣ１ｑ　（Ｃ
ａｌｂｉｏｃｈｅｏ＋。

米国〉と共に室温で６時間インキエベートした。

（Ｃ１ｑの放射性標識は、製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ、米
国〉の推薦に従ってヨードダン法によって行った〕イン
キュベーション後、ウェルを洗浄しそして結合された放
射能を測定した。結果は第５図参照。

実施例６ Ｐｃ受容体へのＣＤ　４−Ｍ２ａの結合マウス細胞系Ｊ
７７４Ａ、１　（ＡＴＣＣ随ＴＩＢ６７）上のＦｃＴ受
容体を用いる競合結合アッセイを用いてＣＤ４−Ｍ　１
２ａのＦｃ受容体結合の特性決定を行った。従って、２
Ｘ１０’個の細胞を、５％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を補
添した１００．ｆの培地中、２００ｎｇのｕｓ）標識Ｃ
Ｄ４−Ｍｒ２ａ　（放射性標識は実施例５記載のように
して行った〉および漸増濃度の未標識競合体ＣＤ４−Ｍ
ｒ２ａもしくは未標識競合体マウスＩｇＧ２ａと共に４
　’Ｃで１時間インキュベートした。インキュベート後
、細胞を２００μｌのＦＣＳクツションを通して遠心し
、ペレット中の放射能を測定した。５００倍過剰の未標
識１ｇＧ２ａの添加後に得られた放射能を非特異的結合
とした。特異的結合はそこで実験値から非特異的結合値
を差し引くことにより得られた。

以下に本発明の好ましい態様を列挙する。

（１）　　ＤＮＡの２種の断片の組み合わせから戒って
おり、該一方の断片は、ヒトＣＤ４−分子の最初の２個
のドメインまたはその一部分をコードし、該他方の断片
は哺乳動物のイムノグロブリンの重鎖の定常領域の最初
の部分を除くすべての領域をコードするものであるクロ
ーン化ＤＮＡ。

（２）　　ＤＮＡの一方の断片がヒトＣＤ４分子の最初
の２個のドメインをコードする前記（１）に記載のＤＮ
Ａ。

（３）　　ＤＮＡの他方の断片が哺乳動物」訓の重鎖の
定常領域の最初の部分を除くすべてのドメインをコード
する前記（１）または（２）に記載のＤＮＡ。

（４）　　ＤＮＡの他方の断片が哺乳動物１ｇＧの重鎖
の定常領域の最初の部分を除くすべてのドメインをコー
ドする前記（１）または（２）に記載のＤＮＡ。

（５）ＤＮＡの他方の断片が哺乳動物ＩｇＡの重鎖の定
常領域の最初の部分を除くすべてのドメインをコードす
る前記（１）または（２）に記載のＤＮＡ。

（６）　　′＠乳動物イムノグロブリンがマウスまたは
ヒトイムノグロブリンである前記（１）ないしく５）の
いずれかに記載のＤＮＡ。

（７）　　ＤＮＡの他方の断片がマウスＩｇ　７２ａの
重鎖の定常領域の最初の部分を除くすべてのドメインを
コードする前記（１）、　（２）または（４）に記載の
ＤＮＡ。

（８）ＤＮＡの他方の断片がヒトｉｇｒｌまたはＩｇ７
３の重鎖の定常領域の最初の部分を除くすべてのドメイ
ンをコードする前記（１）、　（２）または（４）に記
載のＤＮＡ。

（９）前記（１）ないしく８）のいずれかに記載のＤＮ
Ａを含有するベクター。

０■　原核生物および真核生物の宿主細胞中で複製しう
るシャトルベクターである前記（９）に記載のベクター （ＩＩ）発現ベクターである前記（９）または０ωに記
載のベクター ０２１　　前記（９）ないしくＩＱのいずれかに記載の
ベクターで形質転換された原核生物または真核生物宿主
細胞。

０３）前記（１）ないしく８）のい−ずれかに記載のＤ
ＮＡでコードされたポリペプチド。

側　治療上活性な薬剤としての前記０１）に記載のポリ
ペプチド。

０５）エイズに対する治療上活性な薬剤としての前記ａ
３）に記載のポリペプチド。

０６）前記ａつないし０５）のいずれかに記載のポリペ
プチドを製造するに当り、前記（１２）に記載の形質転
換された宿主細胞を適当な培地中で培養し、そしてポリ
ペプチドを単離することを特徴とする製造方法。

ａ７）前記ａ３１に記載のポリペプチドの少なくとも１
種および治療上許容しうる担体物質を含有する医薬組成
物。

０８）医薬組成物の調製への前記０９ないし０５）のい
ずれかに記載のポリペプチドの使用。

０９　　エイズ治療用医薬組成物の調製への前記０３）
ないし０５）のいずれかに記載のポリペプチドの使用。

ＱΦ　前記０６）に記載の方法によって調製された前記
０３）に記載のポリペプチド。

【図面の簡単な説明】

第１図は、グラ：１．　ミＦｐＨＴ４−ＹＫ１２、ｐＣ
Ｄ４−ＭμおよびｐＣＤ４−Ｍγ２ａの構造を示す模式
図、第２図は、プラスミドｐＨＴ４−ＹＫ１２、ｐＣＤ
４−ＨμおよびｐＣＤ４−Ｈｒ　１の構造を示す模式図
、第３図は、ウェスタンプロット分析の結果を示す電気
泳動図、 第４図は、＆ｌＩ換え蛋白質によるシンシチウム形成阻
害の測定結果を示すグラフ、ならびに第５図は、Ａ、、
ＢがＣ１ｑに対するＣＤ４−ＭμおよびＣＤ４−Ｍγ２
ａの結合アッセイの結果を示すグラフ、および、ＣがＦ
ｃ７受容体に対するＣＤ４−Ｍγ２ａの結合の測定結果
を示すグラフである。 Ｄ ＋１１！１１ ｐ１２０− ・ ３４５ 一−Ｓ−１３Ｔ４ Ｂ ［ 競合体 ］（μ９）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＤＮＡの２種の断片の組み合わせから成っており、
   該一方の断片は、ヒトＣＤ４分子の最初の２個のドメイ
   ンまたはその一部分をコードし、該他方の断片は哺乳動
   物イムノグロブリンの重鎖の定常領域の最初の部分を除
   くすべてのドメインをコードするものであるクローン化
   ＤＮＡ。 ２、請求項１記載のＤＮＡを含有するベクター。 ３、請求項２記載のベクターで形質転換された原核生物
   または真核生物宿主細胞。 ４、請求項１記載のＤＮＡでコードされたポリペプチド
   。 ５、請求項４記載のポリペプチドを製造するに当り、請
   求項３記載の形質転換された宿主細胞を適当な培地中で
   培養し、そしてポリペプチドを単離することからなる製
   造方法。 ６、請求項４記載のポリペプチドの少なくとも１種およ
   び治療上許容しうる担体物質を含有する医薬組成物。 ７、医薬組成物の調製への請求項４記載のポリペプチド
   の使用。 ８、請求項５記載の方法によって調製された請求項４記
   載のポリペプチド。