CN109952317A - 使用pd-1结合蛋白治疗免疫病症的方法 - Google Patents

使用pd-1结合蛋白治疗免疫病症的方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了使用特异性地结合至程序性死亡‑1(PD‑1)并调节PD‑1的表达和/或活性的蛋白质来管理、治疗或预防免疫病症如自身免疫性疾病的方法。

Description

使用PD-1结合蛋白治疗免疫病症的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年9月19日提交的美国临时专利申请号62/396,736的优先权权益，所述临时专利申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。
1.技术领域
本文提供了使用特异性地结合至程序性死亡-1(PD-1)并调节PD-1的表达和/或活性的蛋白质来管理、治疗或预防免疫病症和炎性病症(如自身免疫性疾病)的方法。
2.发明内容
本公开提供了管理、预防或治疗对象的免疫病症的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的结合至PD-1(例如，人PD-1，SEQ ID NO:43)的蛋白质，包括结合蛋白，如结合至PD-1的抗体。此类结合蛋白(包括抗体)可结合至PD-1多肽、PD-1片段和/或PD-1表位。此类结合蛋白(包括抗体)可以是激动剂(例如，诱导PD-1配体样信号传导)。在一些实施方案中，所述结合蛋白不与PD-1配体(例如，PD-L1和PD-L2)竞争与PD-1(例如，非阻断性抗体)的相互作用。
在某些实施方案中，本公开还提供了管理、预防或治疗对象的免疫病症的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的结合蛋白(包括其抗体或片段)，所述结合蛋白(i)结合至人PD-1，(ii)诱导PD-1配体样信号传导，和(iii)不与PD-L1和/或PD-L2竞争与PD-1的相互作用。
在一些实施方案中，用于本文提供的方法的结合蛋白(例如，抗PD-1抗体)包含六个互补决定区(CDR)或少于六个CDR。在其它实施方案中，结合蛋白(例如，抗PD-1抗体)包含选自重链可变区(VH)CDR1、VH CDR2、VH CDR3、轻链可变区(VL)CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。在某些实施方案中，结合蛋白(例如，抗PD-1抗体)包含选自如本文所述的称为PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6的单克隆抗体或其人源化变体的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。在一些实施方案中，结合蛋白(例如，抗PD-1抗体)还包含人免疫球蛋白氨基酸序列或其变体的支架区或框架区(FR)，包括VH FR1、VHFR2、VH FR3、VH FR4、VL FR1、VL FR2、VL FR3和/或VL FR4。
在所述方法的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合至由抗体识别的人PD-1的表位，所述抗体包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ IDNO:13的氨基酸序列的重链可变区。
在所述方法的其它实施方案中，所述抗体或其抗体片段与包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区的抗体竞争结合至人PD-1。
在所述方法的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含VL，所述VL包含如表1中列出的抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在所述方法的其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含VH，所述VH包含如表2中列出的抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在所述方法的其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)VL，所述VL包含如表3中列出的抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4；以及
(b)VH，所述VH包含如表4中列出的抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。
在所述方法的某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸序列，并且所述抗体或其抗原结合片段的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列。
在所述方法的另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:7、2和3的氨基酸序列，并且所述抗体或其抗原结合片段的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列。
在所述方法的另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含VL，所述VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含其一种或多种保守修饰。
在所述方法的某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含VL，所述VL包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含其一种或多种保守修饰。
在所述方法的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含VL，所述VL包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含其一种或多种保守修饰。
在所述方法的某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含其一种或多种保守修饰。
在所述方法的其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含其一种或多种保守修饰。
在所述方法的另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含其一种或多种保守修饰。
在所述方法的某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；以及(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
在所述方法的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
在所述方法的其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；以及(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
在所述方法的一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；以及(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
在所述方法的另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
在所述方法的某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；以及(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
在所述方法的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；以及(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
在所述方法的其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
在所述方法的某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；以及(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
在一些实施方案中，所述VL的氨基酸序列包含其一种或多种保守修饰。在一些实施方案中，所述VH的氨基酸序列包含其一种或多种保守修饰。在一些实施方案中，所述VL和VH的氨基酸序列包含其一种或多种保守修饰。
在所述方法的一些实施方案中，所述抗体包含人IgG1Fc区。在其它实施方案中，所述抗体包含变体人IgG1Fc区。
在所述方法的一个实施方案中，所述抗体包含人IgG1-K322A Fc区。
在所述方法的一些实施方案中，所述抗体包含人IgG4Fc区。在其它实施方案中，所述抗体包含变体人IgG4Fc区。
在所述方法的另一个实施方案中，所述抗体包含人IgG4P Fc区。
在所述方法的另一个实施方案中，所述抗体包含人IgG4PE Fc区。
在所述方法的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
在所述方法的其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包含重链Fc区，所述重链Fc区包含选自由SEQ ID NO:36-40组成的组的氨基酸序列。
在所述方法的另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及重链Fc区，所述重链Fc区包含选自由SEQ ID NO:36-40组成的组的氨基酸序列。
在所述方法的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
在所述方法的另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在所述方法的其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及(b)重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在所述方法的某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在所述方法的其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及(b)重链，所述重链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在所述方法的一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
在所述方法的另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及(b)重链，所述重链包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
在所述方法的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
在所述方法的其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及(b)重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
在所述方法的某些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的残基100-109中的至少一个。
在所述方法的一些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的残基100-105中的至少一个。
在所述方法的特定实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的至少一个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在所述方法的一些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的两个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在所述方法的其它实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的三个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在所述方法的某些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的四个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在所述方法的一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的五个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在所述方法的另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的六个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在所述方法的另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的七个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在所述方法的另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的八个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在所述方法的某些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的九个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在所述方法的其它实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的所有十个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在所述方法的一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33。
在所述方法的另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的T51。
在所述方法的特定实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的S57。
在所述方法的一个具体实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的L100。
在所述方法的一些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N102。
在所述方法的其它实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的G103。
在所述方法的另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的R104。
在所述方法的另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的G103和R104。
在所述方法的另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的D105。
在所述方法的一些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的H107。
在所述方法的某些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的S109。
在所述方法的一个实施方案中，人PD-1的所述表位不同于PD-L1结合位点。在另一个实施方案中，人PD-1的所述表位不同于PD-L2结合位点。在一个具体实施方案中，人PD-1的所述表位不同于PD-L1结合位点和PD-L2结合位点两者。
在所述方法的一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人PD-1和/或猴PD-1(例如，食蟹猴)，但不结合至啮齿动物PD-1。
在所述方法的某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有减弱的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。在其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有减弱的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有减弱的ADCC和/或减弱的CDC活性。
在一方面，本文提供了一种管理、预防或治疗对象的免疫病症的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的结合至人PD-1的表位的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段：(a)减弱T细胞活性；和/或(b)下调T细胞表面上的PD-1表达。
在所述方法的一个实施方案中，所述抗体减弱T细胞活性。在另一个实施方案中，所述抗体下调T细胞表面上的PD-1表达。
在某些实施方案中，T细胞活性的减弱通过T细胞效应子功能来测量。
在所述方法的一些实施方案中，T细胞活性的减弱通过细胞因子产生的抑制来测量。
在所述方法的某些实施方案中，受所述抗体或其抗原结合片段抑制的细胞因子包括IL-2、IL-17和/或IFN-γ。在一些实施方案中，所述细胞因子选自由以下组成的组：IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α。在某些实施方案中，所述细胞因子是IL-1。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-2。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-6。在另一个实施方案中，所述细胞因子是IL-12。在一些其它实施方案中，所述细胞因子是IL-17。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-22。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-23。在一些实施方案中，所述细胞因子是GM-CSF。在其它实施方案中，所述细胞因子是IFN-γ。在其它实施方案中，所述细胞因子是TNF-α。在某些实施方案中，所述细胞因子是IL-2和IL-17。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-2和IFN-γ。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-17和IFN-γ。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-2、IL-17和IFN-γ。还考虑了两种、三种或更多种上述细胞因子的其它组合。
在所述方法的一些实施方案中，T细胞活性的减弱通过T细胞增殖的抑制来测量。
在所述方法的某些实施方案中，T细胞活性的减弱通过T细胞表面上抑制性受体的表达的上调来测量，其中所述抑制性受体不是PD-1。在一些实施方案中，所述抑制性受体是选自由LAG-3、CTLA-4和TIM-3组成的组。在一个具体实施方案中，所述抑制性受体是LAG-3。在另一个具体实施方案中，所述抑制性受体是CTLA-4。在另一个具体实施方案中，所述抑制性受体是TIM-3。
在所述方法的一些实施方案中，T细胞活性的减弱通过T细胞回忆应答的抑制来测量。
在所述方法的某些实施方案中，T细胞活性的减弱通过T细胞耗竭的增加来测量。
在所述方法的一些实施方案中，T细胞活性的减弱通过T细胞活化标志物的下调来测量。
在所述方法的一些实施方案中，T细胞活性的减弱通过调控性T细胞生物标志物的上调来测量。
在所述方法的一些实施方案中，T细胞活性的减弱通过调控性T细胞数量的增加来测量。
在所述方法的某些实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后4小时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后6小时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后8小时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后10小时发生。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后12小时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后14小时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后16小时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后18小时发生。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后20小时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后22小时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后24小时发生。在一些实施方案中，所述接触是与所述抗体接触。在其它实施方案中，所述接触是与其抗原结合片段。
在一些实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调先于细胞因子抑制。在一个实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后4小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后6小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后8小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后10小时发生，并且先于细胞因子抑制。在一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后12小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后14小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后16小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后18小时发生，并且先于细胞因子抑制。在一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后20小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后22小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后24小时发生，并且先于细胞因子抑制。
在其它实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调与细胞因子抑制同时发生。在一个实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后4小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后6小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后8小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后10小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后12小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后14小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后16小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后18小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后20小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后22小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后24小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。
在其它实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调是在细胞因子抑制之后。在一个实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后4小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后6小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后8小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后10小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后12小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后14小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后16小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后18小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后20小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后22小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后24小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。
在所述方法的一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与纯化的人PD-1结合的KD是约1nM至约100nM。在所述方法的另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与细胞表面上表达的人PD-1和细胞表面上表达的猴PD-1结合的KD是约100pM至约10nM。
在所述方法的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段用于减弱T细胞活性的EC50是约1pM至约10pM、约10pM至约100pM、约100pM至约1nM、约1nM至约10nM或约10nM至约100nM。
在所述方法的其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段对T细胞活性的最大减弱百分比是至少约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
在所述方法的另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段对PD-1表达的最大下调百分比是至少约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
在所述方法的某些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体、人抗体或嵌合抗体。在另一个实施方案中，所述人源化抗体是脱免疫化抗体或复合人抗体。在某些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在具体实施方案中，所述抗体是特异性地结合人PD-1的人源化抗体。
在所述方法的某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双抗体、三抗体或四抗体。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是由抗体片段形成的多特异性抗体。在其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体。
在所述方法的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与剂缀合。在一个实施方案中，所述剂是放射性同位素、金属螯合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物或化学发光化合物。
在所述方法的另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段减弱T细胞活性。在一个实施方案中，T细胞活性的最大减弱百分比是至少约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，T细胞活性的减弱通过T细胞增殖的抑制来测量。在一些实施方案中，T细胞活性的减弱通过细胞因子产生的抑制来测量。在一些实施方案中，所述细胞因子是选自由IL-2、IL-17、IFN-γ或其任何组合组成的组。在某些实施方案中，所述细胞因子选自由以下组成的组：IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α。在某些实施方案中，所述细胞因子是IL-1。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-2。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-6。在另一个实施方案中，所述细胞因子是IL-12。在一些其它实施方案中，所述细胞因子是IL-17。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-22。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-23。在一些实施方案中，所述细胞因子是GM-CSF。在其它实施方案中，所述细胞因子是IFN-γ。在其它实施方案中，所述细胞因子是TNF-α。在某些实施方案中，所述细胞因子是IL-2和IL-17。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-2和IFN-γ。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-17和IFN-γ。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-2、IL-17和IFN-γ。还考虑了两种、三种或更多种上述细胞因子的其它组合。在某些实施方案中，细胞因子产生的抑制在T细胞表面上PD-1表达的下调之后。在其它实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时发生。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后4小时发生，并且先于细胞因子抑制。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后6小时发生，并且先于细胞因子抑制。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后8小时发生，并且先于细胞因子抑制。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后10小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后12小时发生，并且先于细胞因子抑制。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后14小时发生，并且先于细胞因子抑制。在其它实施方案中，所述下调早在所述接触后16小时发生，并且先于细胞因子抑制。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后18小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后20小时发生，并且先于细胞因子抑制。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后22小时发生，并且先于细胞因子抑制。在一些实施方案中，所述下调早在所述接触后24小时发生，并且先于细胞因子抑制。在一些实施方案中，细胞因子产生的抑制与T细胞表面上PD-1表达的下调同时发生。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后4小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后6小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后8小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后10小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后12小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后14小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在其它实施方案中，所述下调早在所述接触后16小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后18小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后20小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后22小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在一些实施方案中，所述下调早在所述接触后24小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在一些实施方案中，细胞因子产生的抑制先于T细胞表面上PD-1表达的下调。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后4小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后6小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后8小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后10小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后12小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后14小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在其它实施方案中，所述下调早在所述接触后16小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后18小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后20小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后22小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在一些实施方案中，所述下调早在所述接触后24小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。
在所述方法的另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段下调T细胞表面上的PD-1表达。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段对PD-1表达的最大下调百分比是至少约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在另一个实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后4小时发生。在一个实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调先于细胞因子抑制。在一个实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调与细胞因子抑制同时发生。在一个实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调在细胞因子抑制之后。在某些实施方案中，所述细胞因子是IL-2、IL-17、IFN-γ或其任何组合。在某些实施方案中，所述细胞因子选自由以下组成的组：IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α。在某些实施方案中，所述细胞因子是IL-1。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-2。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-6。在另一个实施方案中，所述细胞因子是IL-12。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-17。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-22。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-23。在一些实施方案中，所述细胞因子是GM-CSF。在其它实施方案中，所述细胞因子是IFN-γ。在其它实施方案中，所述细胞因子是TNF-α。在某些实施方案中，所述细胞因子是IL-2和IL-17。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-2和IFN-γ。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-17和IFN-γ。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-2、IL-17和IFN-γ。
在所述方法的另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段通过抑制细胞因子产生而减弱T细胞活性。在一些实施方案中，受所述抗体或其抗原结合片段抑制的细胞因子是选自由IL-2，IL-17，IFN-γ或其任何组合组成的组。在某些实施方案中，所述细胞因子选自由以下组成的组：IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α。在某些实施方案中，所述细胞因子是IL-1。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-2。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-6。在另一个实施方案中，所述细胞因子是IL-12。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-17。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-22。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-23。在一些实施方案中，所述细胞因子是GM-CSF。在其它实施方案中，所述细胞因子是IFN-γ。在其它实施方案中，所述细胞因子是TNF-α。在某些实施方案中，所述细胞因子是IL-2和IL-17。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-2和IFN-γ。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-17和IFN-γ。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-2、IL-17和IFN-γ。还考虑了两种、三种或更多种上述细胞因子的其它组合。
本文还提供了一种管理、预防或治疗对象的免疫病症的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的包含本文所述的抗体或其抗原结合片段的组合物。在所述方法的某些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
本公开提供了一种管理、预防或治疗对象的免疫病症的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的任何抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述免疫病症是炎性疾病。在一个实施方案中，所述炎性疾病是葡萄膜炎。在其它实施方案中，所述免疫病症是超敏性疾病。在一个实施方案中，所述超敏性疾病是T细胞超敏性疾病。在其它实施方案中，所述免疫病症是自身免疫性疾病。
在某些实施方案中，所述超敏性疾病是过敏症、特应性皮炎或超敏性血管炎。在一个实施方案中，所述超敏性疾病是过敏症。在其它实施方案中，所述超敏性疾病是特应性皮炎。在其它实施方案中，所述超敏性疾病是超敏性血管炎。
在某些实施方案中，所述免疫病症是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、克罗恩氏病、银屑病、银屑病性关节炎、多发性硬化、狼疮、强直性脊柱炎、I型糖尿病、斯耶格伦氏综合征(syndrome)、溃疡性结肠炎、视神经脊髓炎、乳糜泻、硬皮病以及颞动脉炎。在某些实施方案中，狼疮是全身性红斑狼疮(SLE)、皮肤型红斑狼疮(CLE)或狼疮性肾炎。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是克罗恩氏病。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是银屑病。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是多发性硬化症。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是强直性脊柱炎。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是I型糖尿病。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是斯耶格伦氏综合征。在另一实施方案中，所述自身免疫性疾病是溃疡性结肠炎。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是视神经脊髓炎。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是乳糜泻。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是颞动脉炎。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是硬皮病。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是SLE。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是CLE。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是狼疮性肾炎。
在某些实施方案中，所述对象患有自身免疫性疾病，或正在用抗炎治疗剂治疗自身免疫性疾病。
在某些其它实施方案中，所述对象中的免疫细胞表达PD-1。
3.附图说明
图1A-1B示出T细胞减毒抗PD-1抗体(PD1AB)不与PD-L1(PD-L1-DyL650表示与染料DyL650缀合的PD-L1)竞争结合至PD-1：(A)PD1AB-1、PD1AB-2和PD1AB-6；(B)PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4和PD1AB-5。MDX4H1(一种拮抗剂抗体)阻断PD-L1与PD-1的结合。
图2描绘PD-1:PD1AB-6Fab相互作用位点相对于PD-1:PD-L1相互作用位点位于PD-1的远侧。
图3描绘PD1AB-6Fab抵靠PD-1β折叠结合，具有与由残基100-105组成的PD-1环形成的显著相互作用。
图4示出PD1AB-6-IgG1的重链(HC)和轻链(LC)以及其变体PD1AB-6-K3和PD1AB-6-4P的HC的氨基酸序列。
图5A-5B描绘PD1AB-6-IgG1对CHO细胞上表达的食蟹猴(A)或人(B)PD-1的亲和力。
图6描绘PD1AB-6-IgG1、同种型对照和人PD-L1Fc融合蛋白(hPD-L1 Fc)与在CD4+T细胞上门控的活化的人PBMC的结合。
图7描绘PD1AB-6-IgG1、同种型对照和人PD-L1Fc融合蛋白(hPD-L1 Fc)与在CD4+T细胞上门控的活化的食蟹猴PBMC的结合。
图8A-8D示出使用Cisbio Tag-liteTM检测，PD1AB-6变体与在HEK293细胞上表达的FcγRI(A)、FcγRIIIa(V158)(B)或FcγRIIb(C)的结合，以及(D)PD1AB-6变体与FcγRI、FcγRIIIa(V158)或FcγRIIb的结合的EC50值。
图9A-9C描绘使用FACS，PD1AB-6变体与在CHO细胞上表达的FcγRIIIa(V158)(A)或FcγRI(B)的结合，以及(C)PD-1抗体变体与FcγRI或FcγRIIIa的结合的EC50值。
图10A-10B描绘四个个体健康供体中的两个代表：(A)供体7和(B)供体8中PD1AB-6变体和对照人IgG1Fc的ADCC活性。
图11描绘PD1AB-6变体的CDC活性。数据代表3个独立实验：(i)PD1AB-6-IgG1和抗人CD20IgG1的CDC活性；(ii)PD1AB-6-IgG1和PD1AB-6-K3的CDC活性；(iii)PD1AB-6-4P和商业人IgG4同种型对照抗体和人IgG1Fc蛋白的CDC活性。
图12描绘通过刺激后24小时培养上清液中的IL-2水平测量的PD1AB-6变体在人PBMC测定中的有效减弱活性。
图13描绘PD1AB-6-K3在人全血测定中的活性。所述图示出来自供体4的用于计算IFN-γ抑制的EC50的代表性曲线。所述表示出具有PD1AB-6变体和CTLA4Ig的4个健康供体的IFN-γ抑制的EC50值。
图14A-14C描绘如通过(A)在用抗CD3+抗CD28活化48小时的人PBMC中CD3+T细胞上的同种型对比PD-1染色、(B)同种型IgG1对比PD1AB-6-IgG1处理的PBMC中的PD-1表达(检测抗PD-1抗体不被PD1AB-6阻断)以及(C)来自3个不同供体的用抗CD3+抗CD28和三种不同浓度的同种型IgG1或PD1AB-6-IgG1活化的人PBMC中CD3+T细胞上的PD-1表达测定的PD1AB-6-IgG1对PD-1表达的下调。
图15A-15C示出T200上(A)PD1AB-6-IgG1、(B)PD1AB-6-4P和(C)PD1AB-6-K3与PD-1抗原的结合。
图16示出PD1AB-6-IgG1抑制CD4+T细胞破伤风回忆应答，在来自三个不同供体的PBMC中具有相似的IC50值。
图17A-17B示出PD1AB-6-K3阻断来自自身免疫性疾病患者的全血样品中IFN-γ(A)和IL-17(B)的分泌。
图18示出PD1AB-6-K3减少未耗尽的IL-7Rhi CD8+T细胞。
图19A-19B示出PD1AB-6-K3抑制(A)分离的CD4+T细胞和(B)分离的CD8+T细胞的增殖。
图20示出PD1AB-6-IgG1在各种浓度的转化生长因子β(TGF-β)下增加CD25+Foxp3+诱导的调控性T细胞。
图21示出在RA患者5的滑膜中卵泡形成中的淋巴细胞中的强PD-1表达(左图)和淋巴聚集体中的低PD-L1表达(右图)。
图22示出RA患者1的关节的结缔组织中的淋巴聚集体中的罕见PD-1+淋巴细胞(左图)和相似位置中的罕见PD-L1+抗原呈递细胞(右图)。
图23示出PD-1+细胞在卵泡中占主导地位并且在深层固有层中罕见(左图)，并且PD-L1在卵泡中以及在克罗恩患者的肠中的固有层中的巨噬细胞和淋巴细胞中广泛表达(右图)。
图24示出克罗恩氏病肠样品的沿着溃疡区域附近的固有层的罕见PD-1+淋巴细胞(左图)和相同区域中的许多PD-L1+巨噬细胞(右图)(40X)。
图25A-25C示出(A)克罗恩氏病、(B)类风湿性关节炎(RA)和(C)银屑病的初步研究中的PD-1和PD-L1表达评分。
图26A-26B示出具有降低的C1q结合的PD1AB-6-K3在PBMC转移异种-GvHD模型中具有与PD1AB-6-IgG1分子相似的抑制活性，如通过(A)hGM-CSF水平和(B)脾脏中人CD45+细胞的数量所测定。
图27A-27B示出PD1AB-6-K3抑制CD4+T细胞转移异种-GvHD模型中血液(A)和脾脏(B)中的人CD45+淋巴细胞植入。
图28A-28C示出PD1AB-6-K3抑制CD4+T细胞转移异种-GvHD模型中GM-CSF(A)、TNF-α(B)和IL-17(C)的分泌。
图29A-29B示出PD1AB-6-K3诱导的PD-1表达的下调(A)先于细胞因子GM-CSF分泌的抑制(B)。
图30A-30B示出通过IL-17抑制(A)和IFN-γ抑制(B)例示的PD1AB-6变体诱导的PD-1表达的下调与细胞因子分泌的抑制之间的相关性。
图31示出PD1AB-6-K3的鼠类替代物抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型中的疾病评分。
图32A-32B示出PD1AB-6-K3的鼠类替代物抑制EAE模型中在第23天脾脏的回忆测定中IFN-γ分泌(A)和IL-17分泌(B)。
图33示出使用来自四个示例性供体的纯化的CD3+T细胞和总B细胞，在体外T细胞/B细胞共培养系统中CD20+CD38-活化的B-淋巴细胞分化成CD20-CD38+浆母细胞。
图34A-34C示出在T细胞受体活化的CD3+T细胞/总B细胞共培养物中由PD1AB-6-K3诱导的浆母细胞数量(A)、IgG分泌(B)和IgM表面表达(C)的减少百分比。
图35A-35C示出在T细胞受体活化的CD3+T细胞/总B细胞共培养物中由PD-L1Fc融合蛋白诱导的浆母细胞数量(A)、IgG分泌(B)和IgM表面表达(C)的减少百分比。
4.具体实施方式
本文提供了管理、预防或治疗对象的免疫病症的方法，所述方法包括向对象施用有效量的结合蛋白，如结合至PD-1的抗体。在一个实施方案中，本文提供了一种管理对象的免疫病症的方法，所述方法包括向对象施用有效量的PD-1结合蛋白。在一个实施方案中，本文提供了一种预防对象的免疫病症的方法，所述方法包括向对象施用有效量的PD-1结合蛋白。在一个实施方案中，本文提供了一种治疗对象的免疫病症的方法，所述方法包括向对象施用有效量的PD-1结合蛋白。在一个具体实施方案中，所述PD-1结合蛋白是结合至PD-1的抗体。本文提供了可用于这些方法中的示例性PD-1抗体。
在本文提供的各种方法的一些实施方案中，所述抗体结合至人和/或食蟹猴PD-1。在一些实施方案中，所述结合蛋白(如结合至人和/或食蟹猴PD-1的抗体)不结合至啮齿动物PD-1。在某些实施方案中，所述PD-1结合蛋白(包括本文公开的抗体)是激动剂(例如，可模拟PD-1配体的作用并诱导PD-1信号传导)。在一些实施方案中，所述结合蛋白(如本文提供的针对PD-1的抗体)(i)结合至人和/或食蟹猴PD-1，(ii)不与PD-1配体(例如，PD-L1和/或PD-L2)竞争结合，和/或(iii)诱导PD-1信号传导。在一个实施方案中，所述PD-1抗体结合至人PD-1。在一个实施方案中，所述PD-1抗体结合至食蟹猴PD-1。在一个实施方案中，所述PD-1抗体结合至人PD-1和食蟹猴PD-1。在一些实施方案中，所述PD-1抗体不与PD-L1竞争结合至PD-1。在其它实施方案中，所述PD-1抗体不与PD-L2竞争结合至PD-1。在其它实施方案中，所述PD-1抗体不与PD-L1或PD-L2竞争结合至PD-1。在其它实施方案中，所述PD-1抗体诱导PD-1信号传导。在具体实施方案中，本文提供的PD-1抗体结合至人PD-1和食蟹猴PD-1，不与PD-L1或PD-L2竞争结合至PD-1，并且诱导PD-1信号传导。在一些实施方案中，在体外，例如在基于细胞的测定中测定所述结合、竞争和/或信号传导。在其它实施方案中，离体地，例如在T细胞功能测定中测定所述结合、竞争和/或信号传导。在其它实施方案中，使用来自对象(例如，人对象)的样品测定所述结合、竞争和/或信号传导。在某些实施方案中，测定和测量包括(1)人或食蟹猴PBMC测定(参见，例如，实施例5.2.1和5.2.2)；(2)人全血样品测定(参见，例如，实施例5.2.1和5.4.2)；(3)破伤风类毒素抗原(TTX)回忆测定(参见，例如，实施例5.4.1)；(4)测量T细胞抑制性受体的表达(参见，例如，实施例5.4.3和5.4.6)；(5)测量T细胞增殖(参见，例如，实施例5.4.4)；以及(6)测量调控性T细胞的数量(参见，例如，实施例5.4.5)。在某些实施方案中，如本文所述的结合蛋白(如抗PD-1抗体)表现出与PD-L1和/或PD-L2的天然生物学功能一致的活性。在一些实施方案中，所述活性在体外表现。在其它实施方案中，所述活性离体表现。
在其它实施方案中，在体内，例如在用于人疾病的异种移植物抗宿主病(xeno-GvHD)模型中测定所述结合、竞争和/或信号传导。在具体实施方案中，使用动物疾病模型(例如，小鼠疾病模型)测定所述结合、竞争和/或信号传导。在具体实施方案中，使用来自疾病模型对象(例如，小鼠疾病模型对象)的样品测定所述结合、竞争和/或信号传导。在某些实施方案中，动物疾病模型和测定包括(1)异种-GvHD模型(参见，例如，实施例5.5.1)；和(2)人PD-1敲入(KI)小鼠中的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型(参见，例如，实施例5.5.2)。在某些实施方案中，如本文所述的结合蛋白(如抗PD-1抗体)表现出与PD-L1和/或PD-L2的天然生物学功能一致的活性。在其它实施方案中，所述活性在体内表现。
此类结合蛋白(包括抗PD-1抗体)诱导PD-1信号传导的发现使其成为治疗免疫病症的可行治疗剂。在某些实施方案中，所述免疫病症是炎性疾病。在一个实施方案中，所述炎性疾病是葡萄膜炎。在其它实施方案中，所述免疫病症是超敏性疾病。在一些实施方案中，所述超敏性疾病是T细胞超敏性疾病。在某些实施方案中，所述超敏性疾病是过敏症。在其它实施方案中，所述超敏性疾病是特应性皮炎。在其它实施方案中，所述超敏性疾病是超敏性血管炎。在一些实施方案中，所述免疫病症是自身免疫性疾病。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是克罗恩氏病。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是银屑病。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是多发性硬化症。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是强直性脊柱炎。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是I型糖尿病。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是斯耶格伦氏综合征。在另一实施方案中，所述自身免疫性疾病是溃疡性结肠炎。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是视神经脊髓炎。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是乳糜泻。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是颞动脉炎。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是硬皮病。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是SLE。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是CLE。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是狼疮性肾炎。这一发现还可使所公开的结合蛋白(包括抗PD-1抗体)成为广泛用于治疗希望模拟或增强PD-1信号传导(例如，体内或体外)的任何疾病、病症或疾患的可行治疗剂。
在本文提供的各种方法的具体实施方案中，本文所述的结合蛋白(如结合至PD-1的抗体)具有彼此竞争结合PD-1的共同特征。这种竞争性抑制可表明，每种抗体结合至PD-1的同一区域(例如，同一表位)，从而显示类似的作用。在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体包括人源化抗PD-1抗体，如源自或基于抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5和/或PD1AB-6的那些抗体。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体与源自或基于PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5和/或PD1AB-6的抗体竞争结合。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体具有如表1-2中描述的CDR序列。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体结合至人PD-1的特定结构域或表位(例如，残基100-105；参见实施例5.1.4)。此外，这种结合可主要归因于所述区域内的特定氨基酸残基(例如，G103和R104；参见实施例5.1.4)，其包含被本文提供的抗PD-1抗体识别的表位。总之，本文描述的结果证明，对于源自或基于PD1AB-6的抗PD-1抗体(包括具有表1-2中描述的一个或多个CDR的抗体)观察到的作用可外推至具有相同或相似表位特异性(例如，相同或相似CDR)的本文提供的其它抗PD-1抗体。例如，对于示例性人源化抗PD-1抗体，如实施例5.1.2-3、5.1.7-10、5.2.1-3、5.3.1、5.4.1-4、5.5.1-3中所示的抗体的活性代表本文提供的抗PD-1抗体的活性和作用。
在本文提供的各种方法的一些实施方案中，结合蛋白(如抗PD-1抗体)可包含免疫球蛋白可变区，所述免疫球蛋白可变区包含如表1-2中所述的一个或多个CDR。在此类结合蛋白(例如，抗PD-1抗体)中，所述CDR可与一个或多个支架区或框架区(FR)连接，所述支架区或框架区(FR)定向所述CDR，以使得实现所述CDR的适当抗原结合特性。此类结合蛋白(包括如本文所述的抗PD-1抗体)可诱导PD-1信号传导。
4.1一般技术
本文描述或引用的技术和程序包括本领域技术人员使用常规方法通常良好理解和/或通常使用的那些技术和程序，例如像Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第3版2001)；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑，2003)；Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An编辑2009)；Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Albitar编辑2010)；以及Antibody Engineering第1卷和第2卷(Kontermann和Dübel编辑，第2版2010)中描述的广泛使用的方法。
4.2术语
除非另外描述，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下术语描述并且在适当时，以单数形式使用的术语还将包括复数并且反之亦然。所有专利、申请、公布的申请以及其它公布以引用的方式整体并入。如果所提出的任何术语描述与以引用的方式并入本文的任何文件冲突，则以下文列出的术语的描述为准。
除非另外指明，否则术语“程序性死亡1”、“程序性细胞死亡1”、“蛋白质PD-1”、“PD-1”、“PD-1多肽”或“PD1”涵盖多肽(“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地使用)，包括来自任何脊椎动物来源的任何天然多肽，所述脊椎动物来源包括哺乳动物如灵长类动物(例如人和食蟹猴(cyno))、狗和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，所述术语包括“相关PD-1多肽”，包括其SNP变体。术语“PD-1”还涵盖“全长”、未加工的PD-1以及由细胞中的加工产生的任何形式的PD-1。在一些实施方案中，PD1具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列。GenBankTM登录号U64863提供另一种示例性人PD-1核酸序列。
“相关PD-1多肽”包括等位基因变体(例如，SNP变体)；剪接变体；片段；衍生物；取代、缺失和插入变体；融合多肽；以及种间同源物，其可保留PD-1活性。如本领域技术人员将理解的，本文提供的抗PD-1抗体可结合至PD-1多肽、PD-1多肽片段、PD-1抗原和/或PD-1表位。“表位”可以是较大PD-1抗原的一部分，所述较大PD-1抗原可以是较大PD-1多肽片段的一部分，所述较大PD-1多肽片段进而可以是较大PD-1多肽的一部分。PD-1可以天然或变性形式存在。本文所述的PD-1多肽可从多种来源(如从人组织类型或从另外来源)分离，或通过重组或合成方法来制备。PD-1多肽的直系同源物也是本领域中熟知的。
术语“PD1AB-6-IgG1”、“PD1AB-6IgG1”、“PD1AB-6_IgG1”、“IgG1_PD1AB-6”和“IgG1-PD1AB-6”可互换地使用，并且是指具有IgG1Fc区的抗体PD1AB-6。在某些实施方案中，所述抗体PD1AB-6包含LC_PD1AB-6-IgG1(SEQ ID NO:31)的轻链氨基酸序列和HC_PD1AB-6-IgG1(SEQ ID NO:32)的重链氨基酸序列，例如，如图4中所示。
术语“PD1AB-6-K3”、“PD1AB-6-IgG1-K322A”、“PD1AB-6-K322A”、“IgG1_PD1AB-6_K322A”、“IgG1_PD1AB-6_K3”、“IgG1-PD1AB-6-K322A”和“IgG1-PD1AB-6-K3”可互换地使用，并且是指IgG1Fc区中具有K322A取代的PD1AB-6变体。在某些实施方案中，所述PD1AB-6变体具有HC_PD1AB-6-IgG1-K322A(SEQ ID NO:33)的重链氨基酸序列，例如，如图4中所示。
术语“PD1AB-6-4P”、“IgG4P_PD1AB-6”、“IgG4P-PD1AB-6”、“PD1AB-6_IgG4P”和“PD1AB-6-IgG4P”可互换地使用，并且是指具有IgG4P Fc区的PD1AB-6变体。在某些实施方案中，所述PD-1抗体变体具有HC_PD1AB-6-IgG4P(SEQ ID NO:34)的重链氨基酸序列，例如，如图4中所示。
术语“PD1AB-6-4PE”、“IgG4PE_PD1AB-6”、“IgG4PE-PD1AB-6”和“PD1AB-6_IgG4PE”以及“PD1AB-6-IgG4PE”可互换地使用，并且是指具有IgG4PE重链氨基酸序列如HC_PD1AB-6-IgG4PE(SEQ ID NO:35)的PD1AB-6变体。
术语“PD-1配体”是指例如在体内或体外结合至PD-1的分子。PD-1配体的非限制性实例包括天然存在的配体，例如PD-1配体1(PD-L1，也称为B7-H1或CD274)和PD-1配体2(PD-L2，也称为B7-DC或CD273)和人工产生的配体。
术语“PD-L1”和“PDL-1”在本文中可互换使用，并且是指PD-1配体1(也称为B7-H1或CD274)。
当应用于结合蛋白(如结合至本公开的PD-1的抗体)时，术语“PD-1活性”、“PD-1信号传导”和“PD-1配体样信号传导”意指结合蛋白(例如，抗体)模拟或调节由PD-1配体的结合诱导的生物作用，并且诱导生物应答，所述生物应答否则将由PD-1配体与PD-1结合例如在体内或体外的结合引起。在评估抗PD-1抗体，例如，结合至PD-1(例如，人PD-1)的抗体或其片段的结合特异性时，当应答等于或大于野生型PD-1配体标准品的活性的5％，如等于或大于野生型PD-1配体标准品的活性的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％时，所述抗体被认为诱导生物应答。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或PD-1配体被固定(例如，在塑料表面或珠粒上)。在某些实施方案中，所述抗体具有以下性质：在例如(1)人或食蟹猴PBMC测定(参见，例如，实施例5.2.1和5.2.2)；(2)人全血样品测定(参见，例如，实施例5.2.1和5.4.2)；(3)TTX回忆测定(参见，例如，实施例5.4.1)；(4)T细胞抑制性受体表达测定(参见，例如，实施例5.4.3和5.4.6)；(5)T细胞增殖测定(参见，例如，实施例5.4.4)；(6)调控性T细胞测定(参见，例如，实施例5.4.5)；(7)异种-GvHD模型(参见，例如，实施例5.5.1)；以及(8)人PD-1KI小鼠中的EAE模型(参见，例如，实施例5.5.2)中表现出等于或大于PD-1配体标准品的5％的功效水平，其中EC50等于或小于100nM，例如90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、2nM、1nM、0.5nM、0.2nM或0.1nM。
术语“结合蛋白”是指包含结合至PD-1(包括人和/或食蟹猴PD-1)的部分(例如，一个或多个结合区，例如CDR)以及任选的支架或框架部分(例如，一个或多个支架或框架区)的蛋白质，所述支架或框架部分允许结合部分采用促进结合蛋白与PD-1多肽、片段或表位的结合的构象。此类结合蛋白的实例包括抗体，如人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体以及其片段。所述结合蛋白可包含例如具有移植的CDR或CDR衍生物的替代蛋白质支架或人工支架。此类支架包括，但不限于：抗体来源的支架，其包含被引入以便例如使结合蛋白的三维结构稳定的突变；以及完全合成的支架，其包含例如生物相容性聚合物。参见例如，Korndorfer等人,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics 53(1):121-29；以及Roque等人,2004,Biotechnol.Prog.20:639-54。此外，可使用肽抗体模拟物(“PAM”)，以及基于抗体模拟物的支架，所述抗体模拟物利用纤连蛋白组分作为支架。在本公开的上下文中，例如当解离常数(KD)为≤10-7M时，据称结合蛋白特异性地结合或选择性地结合至PD-1。在一些实施方案中，所述结合蛋白(例如，抗体)可特异性地结合至PD-1，其中KD为从约10-7M至约10-12M。在某些实施方案中，当KD为≤10-8M或KD为≤10-9M时，所述结合蛋白(例如，抗体)可以高亲和力特异性地结合至PD-1。在一个实施方案中，所述结合蛋白(例如，抗体)可特异性地结合至纯化的人PD-1，其中KD为如通过测量的从1x10-9M至10x10-9M。在另一个实施方案中，所述结合蛋白(例如，抗体)可特异性地结合至纯化的人PD-1，其中KD为如通过KinExATM(Sapidyne,Boise,ID)测量的从0.1x10-9M至1x10-9M。在另一个实施方案中，所述结合蛋白(例如，抗体)特异性地结合至细胞上表达的人PD-1，其中KD为从0.1x10-9M至10x10-9M。在某些实施方案中，所述结合蛋白(例如，抗体)特异性地结合至细胞上表达的人PD-1，其中KD为从0.1x10-9M至1x10-9M。在一些实施方案中，所述结合蛋白(例如，抗体)特异性地结合至细胞上表达的人PD-1，其中KD为1x10-9M至10x10-9M。在一些实施方案中，所述结合蛋白(例如，抗体)特异性地结合至细胞上表达的人PD-1，其中KD为约0.1x10-9M、约0.5x10-9M、约1x10- 9M、约5x10-9M、约10x10-9M或其任何范围或区间。在另一个实施方案中，所述结合蛋白(例如，抗体)可特异性地结合至细胞上表达的食蟹猴PD-1，其中KD为0.1x10-9M至10x10-9M。在某些实施方案中，所述结合蛋白(例如，抗体)特异性地结合至细胞上表达的食蟹猴PD-1，其中KD为从0.1x10-9M至1x10-9M。在一些实施方案中，所述结合蛋白(例如，抗体)特异性地结合至细胞上表达的食蟹猴PD-1，其中KD为1x10-9M至10x10-9M。在一些实施方案中，所述结合蛋白(例如，抗体)特异性地结合至细胞上表达的食蟹猴PD-1，其中KD为约0.1x10-9M、约0.5x10- 9M、约1x10-9M、约5x10-9M、约10x10-9M或其任何范围或区间。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文中可互换地使用，并且以最广泛的含义使用，并且具体地涵盖例如单独抗PD-1单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗PD-1抗体组合物、多克隆或单价抗体、多价抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性)、单链抗PD-1抗体以及抗PD-1抗体的片段，如下文所提供。抗体可以是人、人源化、嵌合和/或亲和力成熟的，以及来自其它物种(例如小鼠和兔等)的抗体。术语“抗体”意图包括免疫球蛋白类别的多肽内的B细胞的多肽产物，所述多肽产物能够结合至特异性分子抗原并且由两对相同的多肽链组成，其中每对具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包含约100至约130个或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包含恒定区。参见例如，Antibody Engineering(Borrebaeck编辑,第2版1995)；以及Kuby,Immunology(第3版1997)。在具体实施方案中，所述特异性分子抗原可被本文提供的抗体结合，包括PD-1多肽、PD-1片段或PD-1表位。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、骆驼化抗体、胞内抗体、抗独特型(抗Id)抗体以及上述任一者的功能片段(例如，抗原结合片段，如PD-1结合片段)，所述功能片段是指抗体重链或轻链多肽的保留所述片段所来源的抗体的一些或全部结合活性的一部分。功能性片段(例如，抗原结合片段，如PD-1结合片段)的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab’)片段、F(ab)2片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体。特别地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如含有结合至PD-1抗原的抗原结合位点(例如，抗PD-1抗体的一个或多个CDR)的抗原结合结构域或分子。此类抗体片段可在例如Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(1989)；Mol.Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference(Myers编辑,1995)；Huston等人,1993,Cell Biophysics 22:189-224；Plückthun和Skerra,1989,Meth.Enzymol.178:497-515；以及Day,Advanced Immunochemistry(第2版1990)中找到。本文提供的抗体可具有免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。抗PD-1抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。本文提供了针对PD-1的激动性抗体，包括诱导PD-1信号传导的抗体。在具体实施方案中，针对PD-1的激动性抗体不竞争PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合。
“抗原”是抗体可选择性地结合的预定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。在一些实施方案中，所述靶抗原是多肽。
术语“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”、“抗原结合区”和类似术语是指抗体的那一部分，所述部分包含与抗原相互作用并赋予结合剂对所述抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基(例如，CDR)。
术语“结合(binds)”或“结合(binding)”是指分子之间的相互作用，包括例如以形成复合物。相互作用可以是例如非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用。复合物还可包括通过共价或非共价键、相互作用或力保持在一起的两个或更多个分子的结合。抗体上的单个抗原结合位点与靶分子的单个表位(如PD-1)之间的总非共价相互作用的强度是抗体或功能片段对所述表位的亲和力。抗体与单价抗原的解离速率(koff)与缔合速率(kon)的比率(koff/kon)是解离常数KD，其与亲和力负相关。KD值越低，抗体的亲和力越高。KD的值因抗体和抗原的不同复合物而异，并且取决于kon和koff两者。本文提供的抗体的解离常数KD可使用本文提供的任何方法或本领域技术人员熟知的任何其它方法来确定。一个结合位点的亲和力并不总是反映抗体与抗原之间的相互作用的真实强度。当含有多个重复抗原决定簇(如多价PD-1)的复合抗原与含有多个结合位点的抗体接触时，所述抗体与抗原在一个位点处的相互作用将增加在第二位点处的反应的可能性。多价抗体与抗原之间的这种多重相互作用的强度被称为亲合力。与其单独结合位点的亲和力相比，抗体的亲合力可以是其结合能力的更好量度。例如，高亲合力可补偿低亲和力，如有时针对五聚体IgM抗体所发现的，所述五聚体IgM抗体可具有比IgG更低的亲和力，但是由其多价性产生的IgM的高亲合力使其能够有效地结合抗原。
术语“特异性地结合至PD-1的抗体”、“特异性地结合至PD-1表位的抗体”和类似术语在本文中也可互换使用，并且是指特异性地结合至PD-1多肽，如PD-1抗原或片段或表位(例如，人PD-1，如人PD-1多肽、抗原或表位)的抗体。特异性地结合至PD-1的抗体(例如，人PD-1)可结合至来源于PD-1的细胞外结构域的细胞外结构域或肽。特异性地结合至PD-1抗原(例如，人PD-1)的抗体可与相关抗原(例如，食蟹猴PD-1)交叉反应。在某些实施方案中，特异性地结合至PD-1抗原的抗体不与其它抗原交叉反应。可例如通过免疫测定、或本领域技术人员已知的其它技术来鉴别特异性地结合至PD-1抗原的抗体。当如使用实验技术(如放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA))所确定，抗体与PD-1抗原结合的亲和力比与任何交叉反应抗原的亲和力更高时，所述抗体特异性地结合至PD-1抗原。通常，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，并且可以是背景的大于10倍。关于抗体特异性的论述，参见例如，Fundamental Immunology 332-36(Paul编辑,第2版1989)。“结合目标抗原”(例如，靶抗原如PD-1)的抗体是以足够的亲和力结合抗原，以使得所述抗体可用作靶向表达所述抗原的细胞或组织的治疗剂、并且不与其它蛋白质显著地交叉反应的抗体。在此类实施方案中，如通过荧光活化细胞分选(FACS)分析或RIA所测定，所述抗体与“非靶标”蛋白质的结合的程度将小于所述抗体与其特定靶蛋白质的结合的约10％。关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性地结合至”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位意指与非特异性相互作用有可测量的不同的结合。特异性结合可例如通过测定分子的结合相较于对照分子的结合来测量，所述对照分子一般为不具有结合活性的结构类似分子。例如，特异性结合可通过与类似于靶标(例如，过量未标记靶标)的对照分子的竞争来测定。就此而言，若标记靶标对探针的结合受到过量未标记靶标的竞争抑制，则指示为特异性结合。术语“抗PD-1抗体”和“结合至PD-1的抗体”包括能够以足够的亲和力结合PD-1，以使得所述抗体在靶向PD-1方面可用作例如诊断剂的抗体。如本文所用的术语“特异性结合”、“特异性地结合至”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位是指其中分子结合至特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不结合至任何其它多肽或多肽表位的结合。在某些实施方案中，结合至PD-1的抗体具有小于或等于10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM的解离常数(KD)。在某些实施方案中，抗PD-1抗体结合至在来自不同物种的PD-1中(例如，在人与食蟹猴PD-1之间)保守的PD-1的表位。
当在抗PD-1抗体(例如，结合至PD-1并竞争靶标上的相同表位或结合位点的激动性抗体和结合蛋白)的上下文中使用时，术语“竞争”意指如通过测定确定的竞争，其中所研究的抗体(或其结合片段)阻止或抑制参考分子(例如，参考配体或参考抗原结合蛋白，如参考抗体)与共同抗原(例如，PD-1或其片段)的特异性结合。许多类型的竞争性结合测定可用于确定测试抗体是否与参考抗体竞争结合至PD-1(例如，人PD-1)。可使用的测定的实例包括固相直接或间接RIA、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如，Stahli等人,1983,Methods in Enzymology9:242-53)、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如，Kirkland等人,1986,J.Immunol.137:3614-19)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如，Harlow和Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(1988))、使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见例如，Morel等人,1988,Mol.Immunol.25:7-15)和直接标记的RIA(Moldenhauer等人,1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。通常，这种测定涉及使用与固体表面结合的纯化的抗原(例如，PD-1，如人PD-1)，或携带未标记的测试抗原结合蛋白(例如，测试抗PD-1抗体)或标记的参考抗原结合蛋白(例如，参考抗PD-1抗体)的细胞。可通过在测试抗原结合蛋白存在下测定与固体表面或细胞结合的标记的量来测量竞争性抑制。通常，测试抗原结合蛋白过量存在。由竞争测定鉴别的抗体(竞争性抗体)包括结合至与参考抗体所结合的表位相同的表位的抗体，和/或结合至相邻表位的抗体，所述相邻表位足够邻近由参考抗体结合的表位以使抗体发生位阻。本文描述了关于用于测定竞争性结合的方法的另外细节。通常，当竞争性抗体蛋白过量存在时，它将使参考抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少30％，例如40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些情况下，结合被抑制至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。
“分离的”抗体基本上不含来自所述抗体源自其中的细胞或组织来源和/或其它污染组分的细胞物质或其它污染蛋白质，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品。语言“基本上不含细胞物质”包括抗体的制剂，其中所述抗体自所述细胞自其分离或重组产生的细胞的细胞组分中分离。因此，基本上不含细胞物质的抗体包括具有少于约30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％(按干重计)的异源蛋白质(本文也称为“污染蛋白质”)的抗体制剂。在某些实施方案中，当抗体重组产生时，所述抗体基本上不含培养基，例如，培养基占蛋白质制剂的体积的小于约20％、15％、10％、5％或1％。在某些实施方案中，当抗体通过化学合成产生时，所述抗体基本上不含化学前体或其它化学品，例如所述抗体从涉及蛋白质合成的化学前体或其它化学品中分离出来。因此，此类抗体制剂具有除目标抗体以外的少于约30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％(按干重计)的化学前体或化合物。污染组分还可包括但不限于，将干扰抗体的治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在某些实施方案中，所述抗体将(1)被纯化至如通过劳立法(Lowry method)(Lowry等人,1951,J.Bio.Chem.193:265-75)所测定大于95重量％，如96重量％、97重量％、98重量％或99重量％的抗体；(2)被纯化至足以通过使用旋杯式测序仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或者(3)通过使用考马斯蓝(Coomassie blue)或银染色法，在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE被纯化至均质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常将通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。在具体实施方案中，分离本文提供的抗体。
4链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的异源四聚糖蛋白。在IgG的情况下，4链单元通常是约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键连接至H链，同时两条H链取决于H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每个H链和L链还具有规律间隔的链内二硫桥键。每个H链在N-末端具有可变结构域(VH)，接着α和γ链各自的三个恒定结构域(CH)以及μ和ε同种型的四个CH结构域。每个L链在N-末端具有可变结构域(VL)，接着在其另一端具有恒定结构域(CL)。将VL与VH进行比对，并且将CL与重链的第一恒定结构域(CH1)进行比对。据信，特定氨基酸残基形成轻链可变结构域与重链可变结构域之间的界面。VH与VL的配对一起形成单一抗原结合位点。关于不同类别的抗体的结构和性质，参见例如，Basic and Clinical Immunology 71(Stites等人编辑,第8版1994)。
术语“可变区”、“可变结构域”、“V区”或“V结构域”是指抗体的轻链或重链的通常位于所述轻链或重链的氨基末端并且具有在重链中约120至130个氨基酸且在轻链中约100至110个氨基酸的长度的一部分，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性中。重链的可变区可称为“VH”。轻链的可变区可称为“VL”。术语“可变”是指可变区的某些区段在序列上在抗体之间广泛不同的事实。V区介导抗原结合并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变区的110个氨基酸跨度上不均匀分布。实际上，V区由具有约15-30个氨基酸的称为框架区(FR)的变化较小(例如，相对不变)的伸长区组成，所述伸长区通过各自约9-12个氨基酸长的称为“高变区”的更大可变性(例如，极具可变性)的较短区分开。重链和轻链的可变区各自包含四个FR，主要采用由形成环连接的三个高变区连接的β-折叠构型，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密地保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见例如，Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版1991))。虽然恒定区不直接参与抗体与抗原结合，但表现出各种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。可变区在序列上在不同抗体之间差异很大。在具体实施方案中，可变区是人可变区。
术语“如Kabat中的可变区残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变型是指用于Kabat等人，同上中的抗体编译的重链可变区或轻链可变区的编号系统。使用此编号系统，实际线性氨基酸序列可包含较少或额外的氨基酸，所述氨基酸对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或对其进行的插入。例如，重链可变结构域可包含残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和残基82之后的3个插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可通过在抗体序列的同源区处与“标准”Kabat编号序列比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。当提及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人，同上)。“EU编号系统”或“EU索引”通常在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如，Kabat等人，同上中报告的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG 1EU抗体的残基编号。其它编号系统已经例如由AbM、Chothia、Contact、IMGT和AHon描述。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可包括人恒定区或其氨基酸序列变体。在某些实施方案中，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，如完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体和二-双抗体(参见，例如，Holliger等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.90:6444-48；Lu等人,2005,J.Biol.Chem.280:19665-72；Hudson等人,2003,Nat.Med.9:129-34；WO93/11161；以及美国专利号5,837,242和6,492,123)；单链抗体分子(参见，例如，美国专利号4,946,778；5,260,203；5,482,858；和5,476,786)；双可变结构域抗体(参见，例如，美国专利号7,612,181)；单可变结构域抗体(sdAb)(参见，例如，Woolven等人,1999,Immunogenetics 50:98-101；以及Streltsov等人,2004,Proc Natl Acad Sci USA.101:12444-49)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
治疗性抗体的“功能片段”、“结合片段”或“抗原结合片段”将表现出至少一种(如果不是一些或全部)归因于完整抗体的生物学功能，所述功能至少包括结合至靶抗原(例如，结合至PD-1的PD-1结合片段或片段)。
如本文所用的术语“融合蛋白”是指包含抗体的氨基酸序列和异源多肽或蛋白质(例如，通常不是抗体的一部分的多肽或蛋白质(例如，非抗PD-1抗原结合抗体))的氨基酸序列的多肽。当关于PD-1或抗PD-1抗体使用时，术语“融合”是指肽或多肽或其片段、变体和/或衍生物与异源肽或多肽的连接。在某些实施方案中，所述融合蛋白保留PD-1或抗PD-1抗体的生物活性。在某些实施方案中，所述融合蛋白包含PD-1抗体VH区、VL区、VH CDR(一个、两个或三个VH CDR)和/或VL CDR(一个、两个或三个VL CDR)，其中所述融合蛋白结合至PD-1表位、PD-1片段和/或PD-1多肽。
当关于抗体使用时，术语“重链”是指约50-70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包含约120至130个或更多个氨基酸的可变区，并且羧基末端部分包含恒定区。基于重链恒定区的氨基酸序列，恒定区可以是被称为α(α)、δ(δ)、ε(ε)、γ(γ)和μ(μ)的五种不同类型(例如，同种型)之一。不同的重链在大小上不同：α、δ和γ含有大约450个氨基酸，而μ和ε含有大约550个氨基酸。当与轻链组合时，这些不同类型的重链分别产生五种熟知的抗体类别(例如，同种型)IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四种亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重链可以是人重链。
当关于抗体使用时，术语“轻链”是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端部分包含约100至约110个或更多个氨基酸的可变区，并且羧基末端部分包含恒定区。轻链的近似长度是211至217个氨基酸。基于恒定结构域的氨基酸序列，存在两种不同的类型，称为卡帕(κ)或拉姆达(λ)。轻链氨基酸序列是本领域中熟知的。轻链可以是人轻链。
如本文所用的术语“宿主”是指动物，如哺乳动物(例如，人)。
如本文所用的术语“宿主细胞”是指可用核酸分子转染的特定受试细胞和这种细胞的子代或潜在子代。这种细胞的子代可与用核酸分子转染的亲本细胞不相同，这归因于可发生在传代或核酸分子整合至宿主细胞基因组中的过程中的突变或环境影响。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同质性的抗体的群体的抗体，例如，除了可少量存在的可能天然存在的突变以外，构成所述群体的单独抗体是相同的，并且每种单克隆抗体通常将识别抗原上的单个表位。在具体实施方案中，如本文所用的“单克隆抗体”是由单个杂交瘤或其它细胞产生的抗体，其中所述抗体仅结合至PD-1表位，如例如通过ELISA或本领域中已知的其它抗原结合或竞争性结合测定所测定。术语“单克隆”不限于用于制备抗体的任何特定方法。例如，适用于本公开的单克隆抗体可通过最初由Kohler等人,1975,Nature 256:495描述的杂交瘤方法来制备，或者可使用重组DNA方法在细菌或真核动物或植物细胞中制备(参见例如，美国专利号4,816,567)。还可使用例如Clackson等人,1991,Nature 352:624-28和Marks等人,1991,J.Mol.Biol.222:581-97中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。用于制备克隆细胞系和由其表达的单克隆抗体的其它方法是本领域中熟知的。参见例如，Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑,第5版2002)。产生单克隆抗体的示例性方法在本文的实施例中提供。
当与生物材料如核酸分子、多肽、宿主细胞等结合使用时，术语“天然的”是指在自然界中发现并且未通过人类操纵、修饰和/或改变(例如，分离、纯化、选择)的那些。
本文提供的抗体可包括“嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；以及此类抗体的片段，只要其表现出所需生物活性即可(参见美国专利号4,816,567；以及Morrison等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-55)。
“人源化”形式的非人(例如，鼠类)抗体是包含人免疫球蛋白(例如，受体抗体)的嵌合抗体，其中天然CDR残基被来自非人物种(例如，供体抗体)(如具有所需特异性、亲和力以及能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的相应CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的一个或多个FR区残基被相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可包括在所述受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以便使抗体性能进一步改进。人源化抗体重链或轻链可包含基本上所有的至少一个或多个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR与非人免疫球蛋白的CDR相对应，并且所有或基本上所有的FR是具有人免疫球蛋白序列的FR。在某些实施方案中，所述人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，所述免疫球蛋白恒定区通常是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区。关于进一步细节，参见Jones等人,1986,Nature 321:522-25；Riechmann等人,1988,Nature 332:323-29；Presta,1992,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-96；Carter等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89；美国专利号：6,800,738；6,719,971；6,639,055；6,407,213；以及6,054,297。
“人抗体”是具有氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人产生的抗体的氨基酸序列和/或已使用如本文公开的制备人抗体的任一种技术制备。人抗体的定义特异性地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域中已知的各种技术来产生，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.227:381；Marks等人,1991,J.Mol.Biol.222:581)和酵母展示文库(Chao等人,2006,Nature Protocols 1:755-68)。也可用于制备人单克隆抗体的方法是描述于Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77(1985)；Boerner等人,1991,J.Immunol.147(1):86-95；以及van Dijk和van de Winkel,2001,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74中的方法。可通过将抗原施用至转基因动物来制备人抗体，所述转基因动物已进行修饰以响应于抗原激发而产生此类抗体，但其内源性基因座已经失效，例如小鼠(关于XENOMOUSETM技术，参见例如，Jakobovits,1995,Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561-66；Brüggemann和Taussing,1997,Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455-58；以及美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，还参见例如，Li等人,2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:3557-62。
“CDR”是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)之一，或抗体VLβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)之一。因此，CDR是散布在框架区序列内的可变区序列。CDR区是本领域技术人员熟知的，并且已经由例如Kabat定义为抗体可变(V)结构域内最具高变性的区(Kabat等人,1997,J.Biol.Chem.252:6609-16；Kabat,1978,Adv.Prot.Chem.32:1-75)。CDR区序列也已在结构上被Chothia定义为不是保守β-折叠框架的一部分且因此能够适应不同的构象的那些残基(Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。两个术语均是本领域中公认的。CDR区序列也已由AbM、Contact和IMGT定义。已经通过比较多种结构确定了规范抗体可变区内的CDR的位置(Al-Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol.273:927-48；Morea等人,2000,Methods 20:267-79)。因为高变区内残基的数量在不同的抗体中不同，所以相对于规范位置的额外残基常规地用与规范可变区编号方案中的残基数相邻的a、b、c等编号(Al-Lazikani等人，同上)。这种命名法是本领域技术人员类似熟知的。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变区在序列方面高变和/或形成结构上确定的环的区域。通常，抗体包含六个高变区，三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。多个高变区描述在使用中并且涵盖在本文中。Kabat互补决定区(CDR)是基于序列可变性并且是最常用的(参见例如，Kabat等人，同上)。而Chothia是指结构环的位置(参见例如，Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。当使用Kabat编号惯例编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度而在H32与H34之间变化(这是由于Kabat编号方案将插入放置于H35A和H35B处；如果35A或35B不存在，则环结束于32处；如果仅35A存在，则环结束于33处；如果35A和35B均存在，则环结束于34处)。AbM高变区表示Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并且通过Oxford Molecular的AbM抗体建模软件来使用(参见例如，Antibody Engineering第2卷(Kontermann和Dübel编辑,第2版2010))。“contact”高变区是基于可用复合物晶体结构的分析。来自这些高变区或CDR中的每个的残基在下文指出。
最近，已经开发并广泛采用了通用编号系统ImMunoGeneTics(IMGT)Information(Lafranc等人,2003,Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77)。IMGT是专门研究人和其它脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TCR)和主要组织相容性复合物(MHC)的综合信息系统。本文中，CDR是就氨基酸序列和轻链或重链内的位置两者而言指代。由于免疫球蛋白可变结构域的结构内的CDR的“位置”在物种之间是保守的并且存在于称为环的结构中，所以通过使用根据结构特征比对可变结构域序列的编号系统，可容易地鉴别CDR和框架残基。这一信息可用于将来自一种物种的免疫球蛋白的CDR残基移植和置换为通常来自人抗体的受体框架。另外的编号系统(AHon)已经由Honegger和Plückthun,2001,J.Mol.Biol.309:657-70开发。编号系统(包括例如Kabat编号和IMGT独特编号系统)之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(参见例如，Kabat，同上；Chothia和Lesk，同上；Martin，同上；Lefranc等人，同上)。在一些实施方案中，CDR如IMGT编号系统所定义。在其它实施方案中，CDR如Kabat编号系统所定义。在某些实施方案中，CDR如AbM编号系统所定义。在其它实施方案中，CDR如Chothia系统所定义。在其它实施方案中，CDR如Contact编号系统所定义。
<u>IMGT</u> <u>Kabat</u> <u>AbM</u> <u>Chothia</u> <u>Contact</u>
V<sub>H</sub>CDR1 27-38 31-35 26-35 26-32 30-35
V<sub>H</sub>CDR2 56-65 50-65 50-58 53-55 47-58
V<sub>H</sub>CDR3 105-117 95-102 95-102 96-101 93-101
V<sub>L</sub>CDR1 27-38 24-34 24-34 26-32 30-36
V<sub>L</sub>CDR2 56-65 50-56 50-56 50-52 46-55
V<sub>L</sub>CDR3 105-117 89-97 89-97 91-96 89-96
高变区可包含如下的“延伸的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)以及89-97或89-96(L3)，以及VH中的26-35或26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)以及93-102、94-102或95-102(H3)。如本文所用，术语“HVR”和“CDR”可互换使用。
术语“恒定区”或“恒定结构域”是指轻链和重链的羧基末端部分，所述部分不直接参与抗体与抗原的结合、但表现出各种效应子功能，如与Fc受体的相互作用。所述术语是指相对于免疫球蛋白的其它部分，即含有抗原结合位点的可变区具有更保守的氨基酸序列的免疫球蛋白分子的部分。恒定区可含有重链的CH1、CH2和CH3区以及轻链的CL区。
术语“框架”或“FR”是指侧接CDR的那些可变区残基。FR残基存在于例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、结构域抗体、双抗体、线性抗体和双特异性抗体中。FR残基是除高变区残基或CDR残基以外的那些可变结构域残基。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个HVR中具有一种或多种改变(例如，氨基酸序列变化，包括改变、添加和/或缺失)的抗体，所述改变导致与不具有那些改变的亲本抗体相比，抗体对抗原的亲和力提高。亲和力成熟的抗体可对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域中已知的程序产生。关于综述，参见Hudson和Souriau,2003,Nature Medicine 9:129-34；Hoogenboom,2005,Nature Biotechnol.23:1105-16；Quiroz和Sinclair,2010,Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其所结合的抗原的生物活性的抗体。例如，阻断抗体或拮抗剂抗体可基本上或完全地抑制抗原的生物活性。
“激动剂”抗体是触发应答的抗体，例如，模拟目标多肽(例如PD-L1)的至少一种功能活性的抗体。激动剂抗体包括为配体模拟物的抗体，例如，其中配体结合至细胞表面受体并且所述结合经由细胞间细胞信号传导途径诱导细胞信号传导或活性，并且其中所述抗体诱导相似的细胞信号传导或活化。PD-1的“激动剂”是指能够如在表达PD-1的细胞中活化或以其它方式增加PD-1的一种或多种生物活性的分子。在一些实施方案中，PD-1的激动剂(例如，如本文所述的激动性抗体)可例如通过活化或以其它方式增加表达PD-1蛋白的细胞的活化和/或细胞信号传导途径而起作用，从而在激动剂不存在下相对于PD-1介导的生物活性，增加细胞的PD-1介导的生物活性。在一些实施方案中，本文提供的抗体是激动性抗PD-1抗体，包括诱导PD-1信号传导的抗体。
“结合亲和力”通常是指在分子(例如，结合蛋白，如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映在结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。结合分子X对其结合配偶体Y的亲和力通常可通过解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域中已知的常用方法(包括本文所述的那些)进行测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于保持结合时间更长。测量结合亲和力的多种方法是本领域中已知的，其中的任何方法均可用于本公开的目的。具体的说明性实施方案包括以下。在一个实施方案中，“KD”或“KD值”可通过本领域中已知的测定(例如通过结合测定)进行测量。KD可在RIA中测量，例如用目标抗体的Fab型式及其抗原进行(Chen等人,1999,J.Mol Biol 293:865-81)。KD或KD值也可通过使用的表面等离子体共振测定(使用例如TM-2000或TM-3000)或通过使用例如QK384系统的生物层干涉测量法来测量。“缔合速率(on-rate)”或“缔合速率(rate of association)”或“缔合速率(association rate)”或“kon”也可用上述相同的表面等离子体共振或生物层干涉测量技术，使用例如TM-2000或TM-3000或QK384系统来测定。
短语“基本上相似”或“基本上相同”表示两个数值(例如，一个数值与本公开的抗体相关并且另一个数值与参考抗体相关)之间的足够高的相似度，以使得本领域技术人员将认为在通过所述值(例如，KD值)测量的生物学特性的背景下所述两个值之间的差异几乎没有或没有生物学和/或统计显著性。例如，所述两个值之间的差异可随着参考抗体的值的变化而小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％或小于约5％。
如本文所用，短语“基本上增加”或“基本上降低”或“基本上不同”表示两个数值(例如，一个数值与本公开的抗体相关并且另一个数值与参考抗体相关)之间的足够高的差异程度，以使得本领域技术人员将认为在通过所述值测量的生物学特性的背景下所述两个值之间的差异具有统计显著性。例如，所述两个值之间的差异可随着参照抗体的值的变化而大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％或大于约50％。
当在本文中使用时，术语“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibit)”是指部分(如1％、2％、5％、10％、20％、25％、50％、75％、90％、95％、99％)或完全(即100％)抑制。
“抗体效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区(例如，天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物活性，并且随着抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括但不限于：C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。
“T细胞效应子功能”是指可归因于各种类型的T细胞的生物活性，所述T细胞包括但不限于细胞毒性T细胞、T辅助细胞、调控性T细胞和记忆T细胞。T细胞效应子功能的实例包括：增加T细胞增殖、分泌细胞因子、释放细胞毒素、表达膜相关分子、杀死靶细胞、活化巨噬细胞和活化B细胞。
“T细胞耗竭”是指在慢性感染、癌症和其它疾病、病症或疾患期间出现的T细胞功能障碍的状态。T细胞耗竭包括但不限于较差的T细胞效应子功能(例如，减少的T细胞增殖或减少的细胞因子产生)、抑制性受体(例如PD-1)的持续表达以及与功能性效应T细胞或记忆T细胞的转录状态不同的转录状态。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区，包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可变化，但是人IgG重链Fc区通常限定为从位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230伸长至其羧基末端。Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可例如在抗体产生或纯化期间或通过对编码抗体的重链的核酸进行重组工程化来除去。因此，完整抗体的组合物可包含除去所有K447残基的抗体群体，不除去K447残基的抗体群体和具有有或无K447残基的抗体混合物的抗体群体。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调等。此类效应子功能通常需要Fc区与结合区或结合结构域(例如，抗体可变区或结构域)组合，并且可使用如所公开的各种测定来评估细胞。
“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列，并且未通过人操纵、修饰和/或改变(例如，分离、纯化、选择，包括其它序列如可变区序列或与其它序列组合)。天然序列人IgG1Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；以及天然序列人IgG4Fc区以及其天然存在的变体。例如，下文提供了天然人IgG1Fc区氨基酸序列：
下文提供了示例性天然人IgG4Fc区序列：
“变体Fc区”所包含的氨基酸序列由于至少一个氨基酸修饰(例如，取代、添加或缺失)而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。在某些实施方案中，变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸取代，例如约一个至约十个氨基酸取代或约一个至约五个氨基酸取代。本文中的变体Fc区可与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，或与其具有至少约90％同源性，例如与其具有至少约95％同源性。例如，在人IgG1Fc氨基酸序列中的322位置处具有一个氨基酸K变化为A的变体IgG1-K322A Fc区在下文提供：
在人IgG4Fc氨基酸序列中的228位置处具有一个氨基酸S变化为P的示例性变体IgG4P Fc区在下文提供：
在人IgG4Fc氨基酸序列中的228和235位置处具有两个氨基酸变化的示例性变体IgG4PE Fc区在下文提供：
当关于PD-1或抗PD-1抗体使用时，术语“变体”可指与天然或未修饰的序列相比，包含一个或多个(例如像，约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10或约1至约5个)氨基酸序列取代、缺失和/或添加的肽或多肽。例如，PD-1变体可由对天然PD-1的氨基酸序列的一个或多个(例如像，约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10或约1至约5个)变化产生。同样作为实例，抗PD-1抗体的变体可由对天然或先前未修饰的抗PD-1抗体的氨基酸序列的一个或多个(例如像，约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10或约1至约5个)变化产生。变体可以是天然存在的，如等位基因或剪接变体，或者可以是人工构建的。多肽变体可由编码所述变体的相应核酸分子制备。在具体实施方案中，所述PD-1变体或抗PD-1抗体变体分别至少保留PD-1或抗PD-1抗体功能活性。在具体实施方案中，抗PD-1抗体变体结合PD-1和/或对PD-1活性具有拮抗性。在具体实施方案中，抗PD-1抗体变体结合PD-1和/或对PD-1活性具有激动性。在某些实施方案中，所述变体由编码PD-1或抗PD-1抗体VH或VL区或亚区(如一个或多个CDR)的核酸分子的单核苷酸多态性(SNP)变体编码。
术语“载体”是指用于携带或包含核酸序列的物质，包括例如编码如本文所述的抗PD-1抗体的核酸序列，以便将核酸序列引入宿主细胞中。适用于使用的载体包括，例如，表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，其可包括可操作用于稳定整合到宿主细胞的染色体中的选择序列或标记。另外，载体可包括一种或多种选择性标记基因和合适当的表达控制序列。例如，可包括的选择性标记基因提供对抗生素或毒素的抗性、补充营养缺陷型缺乏或提供不在培养基中的关键营养物。表达控制序列可包括组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等，它们是本领域中熟知的。当两种或更多种核酸分子待共表达时(例如，抗体重链和轻链或抗体VH和VL)，两种核酸分子可插入例如单一表达载体中或单独插入表达载体中。对于单一载体表达，编码核酸可与一种常见的表达控制序列可操作地连接或与不同的表达控制序列(如一种诱导型启动子和一种组成型启动子)连接。可使用本领域中熟知的方法确认核酸分子引入至宿主细胞中。此类方法包括例如，核酸分析，如RNA印迹或mRNA的聚合酶链反应(PCR)扩增；用于基因产物的表达的免疫印迹；或测试所引入核酸序列或其对应基因产物的表达的其它合适的分析方法。本领域技术人员应理解，核酸分子以足以产生所需产物(例如，如本文所述的抗PD-1抗体)的量表达，并且应进一步理解，表达水平可被优化以使用本领域中熟知的方法来获得足够的表达。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞毒性的一种形式，其中结合至存在于某些细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞以及巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上的分泌的免疫球蛋白使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性地结合至带有抗原的靶细胞并且随后用细胞毒素杀伤该靶细胞。所述抗体“武装”细胞毒性细胞并且绝对是这种杀伤所需要的。NK细胞(用于介导ADCC的主要细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达是已知的(参见，例如，Ravetch和Kinet,1991,Annu.Rev.Immunol.9:457-92)。为评估目标分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定(参见例如，美国专利号5,500,362和5,821,337)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者或另外，目标分子的ADCC活性可例如在动物模型中进行体内评估(参见例如，Clynes等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:652-56)。可选择具有很少或没有ADCC活性的抗体用于使用。
“抗体依赖性细胞吞噬作用”或“ADCP”是指当免疫球蛋白结合至某些吞噬细胞(例如，嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)时，经由单核细胞或巨噬细胞介导的吞噬作用破坏靶细胞使得这些吞噬细胞特异性地结合至携带抗原的靶细胞并且随后杀伤靶细胞。为了评估目标分子的ADCP活性，可进行体外ADCP测定(参见，例如，Bracher等人,2007,J.Immunol.Methods 323:160-71)。用于此类测定的有用的吞噬细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、来自PBMC的纯化的单核细胞或分化成单核类型的U937细胞。或者或另外，目标分子的ADCP活性可例如在动物模型中进行体内评估(参见例如，Wallace等人,2001,J.Immunol.Methods 248:167-82)。可选择具有很少或没有ADCP活性的抗体用于使用。
“Fc受体”或“FcR”描述结合至抗体的Fc区的受体。示例性FcR是天然序列人FcR。此外，示例性FcR是结合IgG抗体的受体(例如，γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，所述受体具有主要在其细胞质结构域方面不同的类似氨基酸序列(参见例如，1997,Annu.Rev.Immunol.15:203-34)。各种FcR是已知的(参见例如，Ravetch和Kinet,1991,Annu.Rev.Immunol.9:457-92；Capel等人,1994,Immunomethods 4:25-34；以及de Haas等人,1995,J.Lab.Clin.Med.126:330-41)。本文的术语“FcR”涵盖其它FcR，包括有待在将来鉴别的那些FcR。所述术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(参见例如，Guyer等人,1976,J.Immunol.117:587-93；和Kim等人,1994,Eu.J.Immunol.24:2429-34)。已经描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的抗体变体(参见例如，WO 2000/42072；美国专利号7,183,387；7,332,581；以及7.335,742；Shields等人2001,J.Biol.Chem.9(2):6591-604)。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的活化通过补体系统的第一组分(C1q)结合至与其同源抗原结合的(具有适当亚类的)抗体而起始。为了评估补体活化，可进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等人,1996,J.Immunol.Methods 202:163)。已经描述了具有改变的Fc区氨基酸序列(具有变体Fc区的多肽)和增加或降低的C1q结合能力的多肽变体(参见例如，美国专利号6,194,551；WO1999/51642；Idusogie等人,2000,J.Immunol.164:4178-84)。可选择具有很少或没有CDC活性的抗体用于使用。
PD-1多肽“细胞外结构域”或“ECD”是指基本上不含跨膜和细胞质结构域的一种形式的PD-1多肽。例如，PD-1多肽ECD可具有少于1％的此类跨膜和/或细胞质结构域，并且可具有少于0.5％的此类结构域。
术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对且比较所述序列所测定。相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并且在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以本领域技术内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNAStar,Inc.)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
氨基酸残基/位置的“修饰”是指与起始氨基酸序列相比一级氨基酸序列的变化，其中所述变化由涉及所述氨基酸残基/位置的序列改变引起。例如，典型的修饰包括用另一种氨基酸取代残基(例如，保守或非保守取代)、紧邻所述残基/位置插入一个或多个(例如，通常少于5、4或3个)氨基酸和/或缺失所述残基/位置。
“表位”是抗原分子表面上的与单个抗体分子结合的位点，如抗原表面上的局部区域，如PD-1多肽、PD-1多肽片段，所述位点能够与抗体的一个或多个抗原结合区结合并且在能够引发免疫应答的动物，如哺乳动物(例如人)中具有抗原性或免疫原性活性。具有免疫原性活性的表位是在动物中引发抗体应答的多肽的一部分。具有抗原活性的表位是抗体所结合的多肽的一部分，如通过本领域中熟知的任何方法(包括例如通过免疫测定)所测定。抗原表位不一定是免疫原性的。表位通常由分子如氨基酸或糖侧链的化学活性表面基团组成，并且具有特异性三维结构特征，以及特异性电荷特征。抗体表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中的氨基酸的连续序列形成。构象表位由氨基酸形成，所述氨基酸在蛋白质序列中是不连续的，但在将蛋白质折叠成其三维结构时聚集在一起。当蛋白质的三维结构处于改变的构象时，如在活化或结合另一种蛋白质或配体后，形成诱导的表位。在某些实施方案中，PD-1表位是PD-1多肽的三维表面特征。在其它实施方案中，PD-1表位是PD-1多肽的线性特征。通常，抗原具有若干或许多不同的表位，并且可与许多不同的抗体反应。
当两种抗体在三维空间中识别相同、重叠或相邻的表位时，抗体与参考抗体结合“表位”、“基本上相同的表位”或“相同的表位”。用于确定两种抗体是否与三维空间中的相同、重叠或相邻表位结合的最广泛使用且快速的方法是竞争测定，其可例如使用标记的抗原或标记的抗体以多种不同的形式配置。在一些测定中，抗原被固定在96孔板上，活在细胞表面上表达，并且使用放射性、荧光或酶标记测量未标记的抗体阻断标记的抗体的结合的能力。
“表位作图”是鉴别抗体在其靶抗原上的结合位点或表位的过程。“表位分区”是基于它们所识别的表位对抗体进行分组的过程。更特别地，表位分区包括使用与基于其表位识别特性聚类抗体和鉴别具有不同结合特异性的抗体的计算方法组合的竞争测定用于区分不同抗体的表位识别特性的方法和系统。
“PD-1介导的疾病”、“PD-1介导的病症”和“PD-1介导的疾患”可互换使用并且是指完全或部分由PD-1信号传导引起或是PD-1信号传导的结果的任何疾病、病症或疾患，和/或可替代地其中希望模拟或增强PD-1信号传导(例如，体外或体内作用)的任何疾病、病症或疾患。
“有效量”通常是足以降低症状的严重程度和/或频率、消除症状和/或潜伏病因、防止症状和/或它们的潜伏病因出现和/或改善或修复由疾病、病症或疾患(包括例如，类风湿性关节炎、银屑病、克罗恩氏病、多发性硬化症、特应性皮炎、狼疮或斯耶格伦氏综合征)引起或与所述疾病、病症或疾患相关的损伤的量。在一些实施方案中，有效量是治疗有效量或预防有效量。
如本文所用的术语“治疗有效量”是指足以降低和/或改善给定疾病、病症或疾患和/或与其相关的症状(例如，类风湿性关节炎、银屑病、克罗恩氏病、多发性硬化症、特应性皮炎、狼疮或斯耶格伦氏综合征)的严重程度和/或持续时间的剂(例如，本文提供的抗体或本文所述的任何其它剂)的量。本公开的物质/分子/剂的“治疗有效量”(例如，抗PD-1抗体)可根据诸如疾病状态、个体的年龄、性别和体重以及所述物质/分子/剂在个体中引发所需应答的能力的因素而变化。治疗有效量涵盖其中治疗有益作用胜过所述物质/分子/剂的任何毒性或有害作用的量。在某些实施方案中，术语“治疗有效量”是指可有效“治疗”对象或哺乳动物的疾病、病症或疾患的抗体或其它剂(例如，药物)的量。
“预防有效量”是当施用至对象时将具有预期预防作用，例如预防、延迟疾病、病症、疾患或相关症状(例如，类风湿性关节炎、银屑病、克罗恩氏病、多发性硬化症、狼疮或斯耶格伦氏综合征)的发作(或复发)或降低所述疾病、病症、疾患或相关症状发作(或复发)的可能性的药物组合物的量。通常但不一定，因为预防剂量是在疾病、病症或疾患之前或在疾病、病症或疾患的早期阶段用于对象，所以预防有效量可小于治疗有效量。完全的治疗性或预防性作用不一定通过施用一次剂量而出现，而可能仅在施用一系列剂量之后出现。因此，可以一次或多次施用来施用治疗或预防有效量。
“慢性”施用是指以连续模式(例如，持续一段时间，如数天、数周、数月或数年)施用剂而不是急性模式，以维持初始治疗作用(活性)持续延长的时间段。“间歇”施用是并非不中断连续进行，而是在本质上是循环的治疗。
如本文所用的“载体”包括在所采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。通常生理学上可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学上可接受的载体的实例包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐以及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(例如，少于约10个氨基酸残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖以及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂类，如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)以及PLURONICSTM。术语“载体”还可指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全))、赋形剂或媒介物。此类载体(包括药物载体)可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用组合物(例如，药物组合物)时，水是示例性载体。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂(例如，药物赋形剂)包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物还可含有少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可呈溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂等形式。口服组合物(包括制剂)可包含标准载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于Remington和Gennaro,Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版1990)中。组合物(包括药物化合物)可含有例如呈分离或纯化形式的抗PD-1抗体以及适量的载体。
如本文所用的术语“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的监管机构批准的或在美国药典、欧洲药典或其它普遍认可的药典中列出的，用于在动物体内并且更具体地在人体内使用。
如本文所用的“多克隆抗体”是指在对具有许多表位的蛋白质的免疫原性应答中产生的抗体群体，并且因此包括针对蛋白质内的相同或不同表位的多种不同的抗体。用于产生多克隆抗体的方法是本领域中已知的(参见例如，Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑,第5版2002))。
“分离的核酸”是核酸，例如RNA、DNA或混合核酸，其基本上与天然地伴随天然序列的其它基因组DNA序列以及蛋白质或复合物如核糖体和聚合酶分离。“分离的”核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源中的其它核酸分子分离的核酸分子。此外，“分离的”核酸分子(诸如cDNA分子)可在通过重组技术产生时基本上不含其它细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品。在一个具体实施方案中，分离或纯化编码如本文所述的抗体的一种或多种核酸分子。所述术语包括已从其天然存在的环境中除去的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或由异源系统生物合成的类似物。基本上纯的分子可包括分子的分离形式。
如本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指具有任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物、或可通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸及其类似物。如本文所用的“寡核苷酸”是指短的、通常单链的合成多核苷酸，所述多核苷酸的长度通常但不必少于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并非相互排斥的。对于多核苷酸的以上描述同样地并且完全地适用于寡核苷酸。产生本公开的抗PD-1抗体的细胞可包括亲本杂交瘤细胞，以及其中已经引入编码所述抗体的核酸的细菌和真核宿主细胞。合适的宿主细胞在下文公开。
除非另外指定，否则本文公开的任何单链多核苷酸序列的左手端是5’端；双链多核苷酸序列的左手方向被称为5’方向。5'至3'添加初生RNA转录物的方向称为转录方向；在具有与RNA转录物相同的序列的DNA链上5'至RNA转录物的5'端的序列区域称为“上游序列”；在具有与RNA转录物相同的序列的DNA链上3'至RNA转录物的3'端的序列区域称为“下游序列”。
术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指降低疾病、病症、疾患或相关症状(例如，类风湿性关节炎、银屑病、克罗恩氏病、多发性硬化症、狼疮或斯耶格伦氏综合征)的发作(或复发)的可能性。
术语“预防剂”是指可完全地或部分地抑制对象中PD-1介导的疾病和/或与其相关的症状的发展、复发、发作或扩散的任何剂。在某些实施方案中，术语“预防剂”是指如本文所述的抗PD-1抗体。
如本文所用，“预防有效的血清滴度”是对象(例如人)中完全地或部分地抑制所述对象中PD-1介导的疾病、病症或疾患和/或与其相关的症状的发展、复发、发作或扩散的PD-1抗体(例如，如本文所述的PD-1抗体)的血清滴度。
在某些实施方案中，“治疗有效的血清滴度”是对象(例如人)中降低所述对象中PD-1介导的疾病、病症或疾患的严重程度、持续时间和/或与PD-1介导的疾病、病症或疾患相关的症状的PD-1抗体(例如，如本文所述的PD-1抗体)的血清滴度。
术语“重组抗体”是指通过重组方法制备、表达、产生或分离的抗体。重组抗体可以是使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；从重组组合抗体文库分离的抗体；从动物(例如小鼠或牛)分离的抗体，所述动物针对人免疫球蛋白为转基因和/或转染色体(参见例如，Taylor等人,1992,Nucl.Acids Res.20:6287-95)；或通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组抗体可具有可变区和恒定区，包括源自人种系免疫球蛋白序列的那些(参见Kabat等人，同上)。然而，在某些实施方案中，此类重组抗体可经受体外诱变(或者，当使用针对人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，因此在重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然来源于人种系VH和VL序列或与其相关、但可能不天然存在于体内人抗体种系组库中的序列。
术语“血清滴度”是指在对象中来自多个样品(例如，在多个时间点)或在至少10个、至少20个、至少40个对象、直至约100、1000个或更多个对象的群体中的平均血清滴度。
术语“副作用”涵盖治疗(例如，预防或治疗剂)的不想要的和/或不利的作用。不想要的作用不一定是不利的。来自治疗(例如，预防或治疗剂)的不利作用可能是有害的、令人不舒服的或有风险的。副作用的实例包括腹泻、咳嗽、胃肠炎、气喘、恶心、呕吐、厌食、腹部绞痛、发烧、疼痛、体重减轻、脱水、脱发、呼吸困难、失眠、头晕、粘膜炎、神经和肌肉作用、疲劳、口干、食欲不振、施用部位的皮疹或肿胀、流感样症状，如发烧、发冷和疲劳、消化道问题和过敏反应。患者所经历的另外不希望的作用很多并且是本领域中已知的。许多描述于Physician’s Desk Reference(第68版2014)中。
术语“对象”和“患者”可互换使用。如本文所用，在某些实施方案中，对象是哺乳动物，如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如，猴和人)。在具体实施方案中，对象是人。在一个实施方案中，对象是患有PD-1介导的疾病、病症或疾患的哺乳动物(例如，人)。在另一个实施方案中，对象是处于发展PD-1介导的疾病、病症或疾患的风险的哺乳动物(例如人)。
“基本上全部”是指至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或约100％。
术语“治疗剂”是指可用于治疗、预防或减轻疾病、病症或疾患，包括治疗、预防或减轻PD-1介导的一种或多种疾病、病症或疾患和/或与其相关的症状的一种或多种症状的任何剂。在某些实施方案中，治疗剂是指如本文所述的抗PD-1抗体。
术语“疗法”是指可用于预防、管理、治疗和/或改善PD-1介导的疾病、病症或疾患的任何方案、方法和/或剂。在某些实施方案中，术语“疗法(therapies)”和“疗法(therapy)”是指本领域技术人员(例如医务人员)已知的可用于预防、管理、治疗和/或改善PD-1介导的疾病、病症或疾患的生物疗法、支持疗法和/或其它疗法。
术语“可检测探针”是指提供可检测信号的组合物。所述术语包括但不限于经由其活性提供可检测信号的任何荧光团、发色团、放射性标记、酶、抗体或抗体片段等。
术语“可检测剂”是指可用于确定样品或对象中所需分子(如本文所述的抗PD-1抗体)的存在(existence)或存在(presence)的物质。可检测剂可以是能够被可视化的物质或者以其它方式(例如，通过定量)能够被确定和/或测量的物质。
术语“诊断剂”是指施用于对象的有助于疾病、病症或疾患的诊断的物质。此类物质可用于揭示、精确定位和/或限定引起疾病的过程的定位。在某些实施方案中，诊断剂包括当施用于对象或与来自对象的样品接触时有助于诊断PD-1介导的疾病的与如本文所述的抗PD-1抗体缀合的物质。
在关于核酸分子使用时，术语“编码核酸”或其语法等效物是指处于其天然状态的核酸分子，或当通过本领域技术人员熟知的方法操作时可转录以产生mRNA的核酸分子，所述mRNA然后翻译成多肽和/或其片段。反义链是这种核酸分子的补体，并且编码序列可从其中推断出。
术语“赋形剂”是指通常用作稀释剂、媒介物、防腐剂、粘合剂或稳定剂的惰性物质，并且包括但不限于蛋白质(例如，血清白蛋白等)、氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸等)、脂肪酸和磷脂(例如，烷基磺酸酯、辛酸酯等)、表面活性剂(例如，SDS、聚山梨醇酯、非离子表面活性剂等)、糖类(例如，蔗糖、麦芽糖、海藻糖等)和多元醇(例如，甘露醇、山梨糖醇等)。还参见Remington和Gennaro,Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版1990)，其特此以引用的方式整体并入。
在肽或多肽的上下文中，如本文所用的术语“片段”是指包含少于全长氨基酸序列的肽或多肽。这种片段可例如由氨基末端的截短、羧基末端的截短和/或来自氨基酸序列的残基的内部缺失而产生。例如，片段可由替代RNA剪接或由体内蛋白酶活性产生。在某些实施方案中，PD-1片段或抗PD-1抗体片段包括多肽，所述多肽包含PD-1多肽或抗PD-1抗体的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少30个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少550个、至少600个、至少650个、至少700个、至少750个、至少800个、至少850个、至少900个或至少950个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，PD-1多肽或抗PD-1抗体的片段保留所述多肽或抗体的至少1种、至少2种、至少3种或更多种功能。
术语“管理(manage)”、“管理(managing)”和“管理(management)”是指对象源自治疗(例如，预防或治疗剂)的有益作用，所述有益作用不会产生疾病的治愈。在某些实施方案中，向对象施用一种或多种疗法(例如，预防或治疗剂，如本文提供的抗体)以“管理”PD-1介导的疾病、其一种或多种症状，以便预防疾病的进展或恶化。
术语“约”和“大约”是指给定值或范围的20％以内、15％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内或更小。
“施用(Administer)”或“施用(administration)”是指将存在于体外的物质(例如，如本文所述的抗PD-1抗体)注射或以其它方式物理递送至患者体内的行为，如通过粘膜、皮内、静脉内、肌肉内递送和/或本文所述或本领域中已知的任何其它物理递送方法。当正在治疗疾病、病症、疾患或其症状时，所述物质的施用通常在所述疾病、病症、疾患或其症状发作后发生。当正在预防疾病、病症、疾患或其症状时，所述物质的施用通常在所述疾病、病症、疾患或其症状发作之前发生。
在多肽的上下文中，如本文所用的术语“类似物”是指与PD-1多肽、PD-1多肽的片段或抗PD-1抗体具有相似或相同的功能、但不一定包含PD-1多肽、PD-1多肽的片段或抗PD-1抗体的相似或相同的氨基酸序列或具有PD-1多肽、PD-1多肽的片段或抗PD-1抗体的相似或相同结构的多肽。具有相似氨基酸序列的多肽是指满足以下中的至少一者的多肽：(a)具有与本文提供的PD-1多肽、PD-1多肽的片段或抗PD-1抗体的氨基酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列的多肽；(b)由在严格条件下与编码本文所述的PD-1多肽、PD-1多肽的片段或抗PD-1抗体(或其VH或VL区)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的至少5个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少15个氨基酸残基、至少20个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基、至少30个氨基酸残基、至少40个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基、至少60个氨基酸残基、至少70个氨基酸残基、至少80个氨基酸残基、至少90个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基、至少125个氨基酸残基或至少150个氨基酸残基的多肽(参见例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2001)；和Maniatis等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1982))；或(c)由与编码本文所述的PD-1多肽、PD-1多肽的片段或抗PD-1抗体(或其VH或VL区)的核苷酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列编码的多肽。本文提供的与PD-1多肽、PD-1多肽的片段或抗PD-1抗体具有相似结构的多肽是指具有本文提供的PD-1多肽、PD-1多肽的片段或抗PD-1抗体的相似二级、三级或四级结构的多肽。多肽的结构可通过本领域技术人员已知的方法来测定，包括但不限于X射线晶体学、核磁共振以及晶体电子显微镜法。
在多肽的上下文中，如本文所用的术语“衍生物”是指包含PD-1多肽、PD-1多肽的片段或结合至PD-1多肽的抗体的氨基酸序列的多肽，所述多肽已经通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加而改变。如本文所用的术语“衍生物”还指已例如通过将任何类型的分子共价连接至多肽而进行化学修饰的PD-1多肽、PD-1多肽的片段或结合至PD-1多肽的抗体。例如但不限于，PD-1多肽、PD-1多肽的片段或抗PD-1抗体可例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团进行的衍生化、蛋白水解裂解、化学裂解、制剂、衣霉素的代谢合成、与细胞配体或其它蛋白质的连接等进行化学修饰。所述衍生物以不同于天然存在或起始肽或多肽(无论是附接的分子的类型还是位置)的方式进行修饰。衍生物还包括缺失天然存在于肽或多肽上的一个或多个化学基团。此外，PD-1多肽、PD-1多肽的片段或抗PD-1抗体的衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。多肽衍生物具有与本文提供的PD-1多肽、PD-1多肽的片段或抗PD-1抗体相似或相同的功能。
术语“组合物”意图涵盖含有任选指定量的指定成分(例如，本文提供的抗体)的产物。
4.3组合物以及制备所述组合物的方法
本文提供了管理、预防或治疗对象的免疫病症的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的结合至PD-1多肽、PD-1多肽片段、PD-1肽或PD-1表位的抗体。
在所述方法的某些实施方案中，本文提供的抗体结合至人和/或食蟹猴PD-1。在一个实施方案中，所述PD-1抗体结合至人PD-1。在一个实施方案中，所述PD-1抗体结合至食蟹猴PD-1。在一个实施方案中，所述PD-1抗体结合至人PD-1和食蟹猴PD-1。在其它实施方案中，本文提供的抗体不结合至啮齿动物PD-1。
在所述方法的一些实施方案中，所述抗PD-1抗体结合至PD-1的细胞外结构域(ECD)。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体结合至PD-1的ECD中的表位，所述表位不同于PD-L1结合位点。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体结合至PD-1的ECD中的表位，所述表位不同于PD-L2结合位点。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体结合至PD-1的ECD中的表位，所述表位不同于PD-L1和PD-L2结合位点。
在所述方法的其它实施方案中，所述抗体竞争性地阻断本文提供的抗PD-1抗体与PD-1多肽的结合。
在所述方法的另一个实施方案中，所述抗体与本文提供的抗PD-1抗体竞争结合至PD-1多肽。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体不阻断PD-L1与PD-1多肽的结合。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体不阻断PD-L2与PD-1多肽的结合。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体不阻断PD-L1或PD-L2与PD-1多肽的结合。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体不与PD-L1竞争结合至PD-1多肽。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体不与PD-L2竞争结合至PD-1多肽。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体不与PD-L1或PD-L2竞争结合至PD-1多肽。
在某些实施方案中，所述抗体不抑制PD-L1与PD-1的结合。在其它实施方案中，所述抗体不抑制PD-L2与PD-1的结合。在具体实施方案中，所述抗体不抑制PD-L1与PD-1的结合以及PD-L2与PD-1的结合。
本文提供的抗PD-1抗体也可例如与诊断剂或可检测试剂缀合或重组融合。还提供了包含抗PD-1抗体的组合物。
4.3.1抗PD-1抗体
在一个实施方案中，本公开提供了可在本文中用作治疗剂的抗PD-1抗体。在另一个实施方案中，本公开提供了可在本文中用作诊断剂的抗PD-1抗体。示例性抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、双特异性和异缀合物抗体，以及其具有改进的亲和力或其它性质的变体。
在一些实施方案中，本文提供了结合至PD-1的抗体，所述PD-1包括PD-1多肽、PD-1多肽片段、PD-1肽或PD-1表位。在某些实施方案中，本文提供的抗体结合至人和/或食蟹猴PD-1。在其它实施方案中，本文提供的抗体不结合至啮齿动物PD-1(例如，小鼠PD-1)。在一个实施方案中，本文提供的抗体结合至人PD-1。在另一个实施方案中，本文提供的抗体结合至食蟹猴PD-1。在另一个实施方案中，本文提供的抗体结合至人PD-1和食蟹猴PD-1。在一些实施方案中，本文提供的抗体结合至人PD-1并且不结合至啮齿动物PD-1(例如，小鼠PD-1)。在一些实施方案中，本文提供的抗体结合至食蟹猴PD-1并且不结合至啮齿动物PD-1(例如，小鼠PD-1)。在一些实施方案中，本文提供的抗体结合至人PD-1、结合至食蟹猴PD-1，并且不结合至啮齿动物PD-1(例如，小鼠PD-1)。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体不阻断PD-L1与PD-1多肽的结合。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体不阻断PD-L2与PD-1多肽的结合。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体不阻断PD-L1或PD-L2与PD-1多肽的结合。在其它实施方案中，所述抗PD-1抗体是结合PD-1的人源化抗体(例如，包含人恒定区)，所述PD-1包括PD-1多肽、PD-1多肽片段、PD-1肽或PD-1表位。
在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含本文提供的任一种鼠单克隆抗体的VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在一些实施方案中，所述VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3如由IMGT编号系统所定义。在其它实施方案中，所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3如由Kabat编号系统所定义。在某些实施方案中，所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3如由AbM编号系统所定义。在其它实施方案中，所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3如由Chothia系统所定义。在其它实施方案中，所述VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3如由Contact编号系统所定义。因此，在一些实施方案中，本文提供的分离的抗体或其功能片段包含来自以下的一个、两个和/或三个重链CDR和/或一个、两个和/或三个轻链CDR：(a)抗体PD1AB-1，(b)抗体PD1AB-2，(c)抗体PD1AB-3，(d)抗体PD1AB-4，(e)抗体PD1AB-5，或(f)抗体PD1AB-6，如表1-2中所示。
表1.VL CDR氨基酸序列
表2.VH CDR氨基酸序列
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含六个CDR或由其组成，例如，表1-2中鉴别的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在一些实施方案中，本文提供的抗体可包含少于6个CDR。在一些实施方案中，所述抗体包含一个、两个、三个、四个或五个CDR或由其组成，所述CDR选自由表1-2中鉴别的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VLCDR2和/或VL CDR3组成的组。在一些实施方案中，所述抗体包含一个、两个、三个、四个或五个CDR或由其组成，所述CDR选自由单克隆抗体的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VLCDR2和/或VL CDR3组成的组，所述单克隆抗体选自由以下组成的组：本文描述的(a)抗体PD1AB-1，(b)抗体PD1AB-2，(c)抗体PD1AB-3，(d)抗体PD1AB-4，(e)抗体PD1AB-5，以及(f)抗体PD1AB-6。因此，在一些实施方案中，所述抗体包含表1-2中鉴别的VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3中的任一者的一个、两个、三个、四个或五个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含表2中列出的一个或多个(例如，一个、两个或三个)VH CDR。在其它实施方案中，本文提供的抗体包含表1中列出的一个或多个(例如，一个、两个或三个)VL CDR。在其它实施方案中，本文提供的抗体包含表2中列出的一个或多个(例如，一个、两个或三个)VH CDR和表1中列出的一个或多个VL CDR。因此，在一些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH CDR1。在一些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR2。在一些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3。在一些实施方案中，所述抗体包含独立地选自如表2中描绘的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3氨基酸序列中的任一个的VH CDR1和/或VH CDR2和/或VH CDR3。在一些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:1和7中的任一个的氨基酸序列的VL CDR1。在另一个实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL CDR2。在一些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗体包含独立地选自如表1中描绘的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3氨基酸序列中的任一个的VL CDR1和/或VL CDR2和/或VL CDR3。
在某些实施方案中，本文提供的抗体包含VH区，所述VH区包含：(1)具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3；以及VL区，所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL CDR2；以及(3)具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的VL CDR3。
在某些实施方案中，本文提供的抗体包含VH区，所述VH区包含：(1)具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3；以及VL区，所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL CDR2；以及(3)具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的VL CDR3。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含VH区，所述VH区包含：(1)具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR2；以及(3)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3。
在其它实施方案中，本文提供的抗体包含VL区，所述VL区包含：(1)具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL CDR2；以及(3)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL CDR3。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含VL区，所述VL区包含：(1)具有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL CDR2；以及(3)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL CDR3。
本文还描述了包含表1-2中列出的一个或多个(例如，一个、两个或三个)VH CDR和一个或多个(例如，一个、两个或三个)VL CDR的抗体。特别地，本文提供了包含VH CDR1(SEQID NO:4)和VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)的抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQID NO:4)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ IDNO:5)和VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ IDNO:5)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VLCDR2(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQID NO:5)和VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ IDNO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR1(SEQID NO:1或7)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ IDNO:6)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR2(SEQ IDNO:2)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VLCDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在一个实施方案中，所述抗体包含VHCDR1(SEQ ID NO:4)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)以及VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ IDNO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在一个实施方案中，所述抗体包含VHCDR2(SEQ ID NO:5)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR2(SEQ IDNO:2)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VLCDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VHCDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR1(SEQ IDNO:1或7)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在其它实施方案中，所述抗体包含VHCDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR3(SEQ IDNO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQID NO:5)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VLCDR2(SEQ ID NO:2)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VHCDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ IDNO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VHCDR2(SEQ ID NO:5)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQID NO:3)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQID NO:1或7)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VLCDR1(SEQ ID NO:1或7)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)、VL CDR2(SEQ IDNO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含表1-2中列出的VHCDR和VL CDR的任何组合。
在另一方面，本文公开的CDR包括源自相关抗体的组的共有序列(参见，例如，表1-2)。如本文所述，“共有序列”是指具有在给定氨基酸序列内变化的许多序列和可变氨基酸中共有的保守氨基酸的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的分离的抗体或其功能片段还包含来自以下的一个、两个、三个和/或四个重链FR和/或一个、两个、三个和/或四个轻链FR：(a)抗体PD1AB-1，(b)抗体PD1AB-2，(c)抗体PD1AB-3，(d)抗体PD1AB-4，(e)抗体PD1AB-5，或(f)抗体PD1AB-6，如表3-4中所示。
表3.VL FR氨基酸序列
表4.VH FR氨基酸序列
在某些实施方案中，本文提供的分离的抗体或其功能片段还包含来自以下的一个、两个、三个和/或四个重链FR：(a)抗体PD1AB-1，(b)抗体PD1AB-2，(c)抗体PD1AB-3，(d)抗体PD1AB-4，(e)抗体PD1AB-5，或(f)抗体PD1AB-6，如表4中所示。在一些实施方案中，所述抗体重链FR来自抗体PD1AB-1。在一些实施方案中，所述抗体重链FR来自抗体PD1AB-2。在其它实施方案中，所述抗体重链FR来自抗体PD1AB-3。在某些实施方案中，所述抗体重链FR来自抗体PD1AB-4。在其它实施方案中，所述抗体重链FR来自抗体PD1AB-5。在另一个实施方案中，所述抗体重链FR来自抗体PD1AB-6。
在一些实施方案中，本文提供的分离的抗体或其功能片段还包含来自以下的一个、两个、三个和/或四个轻链FR：(a)抗体PD1AB-1，(b)抗体PD1AB-2，(c)抗体PD1AB-3，(d)抗体PD1AB-4，(e)抗体PD1AB-5，或(f)抗体PD1AB-6，如表3中所示。在一些实施方案中，所述抗体轻链FR来自抗体PD1AB-1。在一些实施方案中，所述抗体轻链FR来自抗体PD1AB-2。在其它实施方案中，所述抗体轻链FR来自抗体PD1AB-3。在某些实施方案中，所述抗体轻链FR来自抗体PD1AB-4。在其它实施方案中，所述抗体轻链FR来自抗体PD1AB-5。在另一个实施方案中，所述抗体轻链FR来自抗体PD1AB-6。
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其片段包含VH区，所述VH区包含：(1)具有选自由SEQ ID NO:19和24组成的组的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有选自由SEQ ID NO:21和23组成的组的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH FR4。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其片段包含VH区，所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH FR4。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其片段包含VH区，所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH FR4。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其片段包含VH区，所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH FR4。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其片段包含VH区，所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQID NO:22的氨基酸序列的VH FR4。在具体实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。
因此，在一些实施方案中，人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有选自由SEQ IDNO:19和24组成的组的氨基酸序列的VH FR1。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH FR1。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH FR1。在一些实施方案中，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2。在一些实施方案中，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有选自由SEQ ID NO:21和23组成的组的氨基酸序列的VH FR3。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH FR3。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH FR3。在其它实施方案中，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH FR4。
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其片段包含VL区，所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有选自由SEQ ID NO:16和18组成的组的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在其它实施方案中，所述VL区包括含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。
因此，在一些实施方案中，所述人源化抗体包含VL区，所述VL区包含具有SEQ IDNO:14的氨基酸序列的VL FR1。在某些实施方案中，所述人源化抗体包含VL区，所述VL区包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL FR2。在其它实施方案中，所述人源化抗体包含VL区，所述VL区包含具有选自由SEQ ID NO:16和18组成的组的氨基酸序列的VL FR3。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含VL区，所述VL区包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL FR3。在其它实施方案中，所述人源化抗体包含VL区，所述VL区包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL FR3。在其它实施方案中，所述人源化抗体包含VL区，所述VL区包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其片段包含VH区和VL区，其中所述VH区包含：(1)具有选自由SEQ ID NO:19和24组成的组的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有选自由SEQ ID NO:21和23组成的组的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH FR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有选自由SEQ ID NO:16和18组成的组的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ IDNO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在一些实施方案中，抗体或其片段包含VH区和VL区，其中所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VHFR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在一些实施方案中，抗体或其片段包含VH区和VL区，其中所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VHFR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在一些实施方案中，抗体或其片段包含VH区和VL区，其中所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VHFR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在一些实施方案中，抗体或其片段包含VH区和VL区，其中所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VHFR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在一些实施方案中，抗体或其片段包含VH区和VL区，其中所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VHFR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在一些实施方案中，抗体或其片段包含VH区和VL区，其中所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VHFR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在一些实施方案中，抗体或其片段包含VH区和VL区，其中所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VHFR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在一些实施方案中，抗体或其片段包含VH区和VL区，其中所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VHFR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
本文还描述了包含表3-4中列出的一个或多个(例如，一个、两个、三个或四个)VHFR和一个或多个(例如，一个、两个、三个或四个)VL FR的抗体。特别地，本文提供了包含VHFR1(SEQ ID NO:19或24)和VL FR1(SEQ ID NO:14)的抗体。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)和VL FR1(SEQ ID NO:14)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VHFR3(SEQ ID NO:21)和VL FR1(SEQ ID NO:14)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQID NO:22)和VL FR1(SEQ ID NO:14)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ IDNO:22)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)和VL FR1(SEQ ID NO:14)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VHFR2(SEQ ID NO:20)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)和VL FR1(SEQ ID NO:14)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)和VL FR2(SEQ IDNO:15)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ IDNO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VLFR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VLFR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VHFR2(SEQ ID NO:20)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VLFR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VHFR2(SEQ ID NO:20)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ IDNO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ IDNO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VLFR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VHFR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)和VL FR1(SEQID NO:14)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ IDNO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VHFR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ IDNO:22)和VL FR1(SEQ ID NO:14)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR4(SEQ IDNO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ IDNO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR1(SEQ ID NO:14)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR1(SEQ ID NO:14)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ IDNO:20)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VHFR2(SEQ ID NO:20)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR3(SEQ IDNO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ IDNO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VLFR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VHFR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ IDNO:21)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VLFR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VHFR3(SEQ ID NO:21)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ IDNO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VLFR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ IDNO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR4(SEQID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ IDNO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR2(SEQID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VLFR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VHFR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ IDNO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQID NO:22)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VLFR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VLFR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ IDNO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VLFR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VHFR2(SEQ ID NO:20)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ IDNO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR1(SEQ IDNO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR2(SEQID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VHFR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VLFR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VLFR1(SEQ ID NO:14)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VHFR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR2(SEQID NO:15)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ IDNO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VHFR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ IDNO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VLFR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VHFR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ IDNO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VLFR2(SEQ ID NO:15)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VHFR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ IDNO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VHFR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ IDNO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VHFR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VHFR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ IDNO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VHFR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ IDNO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ IDNO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VLFR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQID NO:20)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR1(SEQID NO:14)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VLFR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VHFR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR3(SEQID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VLFR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ IDNO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR4(SEQ IDNO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VLFR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ IDNO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VHFR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ IDNO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ IDNO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ IDNO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VLFR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VHFR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ IDNO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VLFR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VHFR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VL FR1(SEQID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VLFR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ IDNO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ IDNO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ IDNO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VLFR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ IDNO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VLFR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ IDNO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VHFR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ IDNO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ IDNO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VLFR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VHFR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ IDNO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ IDNO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VHFR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ IDNO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VLFR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VHFR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ IDNO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VHFR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ IDNO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ IDNO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ IDNO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VLFR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VHFR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ IDNO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VLFR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ IDNO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VLFR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VHFR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VLFR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQID NO:14)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VLFR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VHFR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ IDNO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VLFR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ IDNO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VLFR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VHFR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ IDNO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含表3-4中列出的VH FR(SEQ ID NO:19-24)和VL FR(SEQ IDNO:14-18)的任何组合。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含VH区或VH结构域。在其它实施方案中，本文提供的抗体包含VL区或VL结构域。在某些实施方案中，本文提供的抗体具有(i)VH结构域或VH区；和/或(ii)VL结构域或VL区的组合。在其它实施方案中，本文提供的抗体具有选自由表5-6中列出的SEQ ID NO:8-13组成的组的(i)VH结构域或VH区；和/或(ii)VL结构域或VL区的组合。在其它实施方案中，本文提供的抗体具有如表5-6中列出的抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的(i)VH结构域或VH区；和/或(ii)VL结构域或VL区的组合。
在某些实施方案中，本文提供的抗体包含VH区，所述VH区包含：(1)具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3；以及VL区，所述VL区选自由表5中列出的SEQ ID NO:8-10组成的组。在一些实施方案中，所述VL区具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述VL区具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL区具有SEQID NO:10的氨基酸序列。
在其它实施方案中，本文提供的抗体包含VH区，所述VH区选自由表6中列出的SEQID NO:11-13组成的组；以及VL区，所述VL区包含：(1)具有选自由SEQ ID NO:1和7组成的组的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含VH区，所述VH区选自由表6中列出的SEQ ID NO:11-13组成的组；以及VL区，所述VL区包含：(1)具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL CDR2；以及(3)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL CDR3。在其它实施方案中，本文提供的抗体包含VH区，所述VH区选自由表6中列出的SEQ ID NO:11-13组成的组；以及VL区，所述VL区包含：(1)具有SEQID NO:7的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL CDR2；以及(3)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方案中，所述VH区具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH区具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH区具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
表5.VL结构域氨基酸序列
表6.VH结构域氨基酸序列
本文还提供了编码抗PD-1抗体的免疫球蛋白重链、轻链、VH区、VL区、VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3的分离的核酸分子，所述抗PD-1抗体结合至PD-1多肽、PD-1多肽片段、PD-1肽或PD-1表位。抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5和PD1AB-6中的任一者的VL区和VH区的示例性核酸序列示于表7-8中。
表7.VL核酸序列
表8.VH核酸序列
在一些实施方案中，本文提供的抗体具有PD1AB-1的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:11的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:8的VL氨基酸序列。
在其它实施方案中，本文提供的抗体具有PD1AB-2的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:11的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:9的VL氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的抗体具有PD1AB-3的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:12的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:10的VL氨基酸序列。
在其它实施方案中，本文提供的抗体具有PD1AB-4的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:12的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:9的VL氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的抗体具有PD1AB-5的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:13的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:9的VL氨基酸序列。
在其它实施方案中，本文提供的抗体具有PD1AB-6的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:13的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:8的VL氨基酸序列。
在某些实施方案中，本文所述的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体或其抗原结合片段包含轻链和重链，其中所述轻链包含具有以下氨基酸序列的恒定区：
在其它实施方案中，本文所述的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体或其抗原结合片段包含轻链和重链，其中所述重链包含具有以下氨基酸序列的人IgG1Fc区：
在一些实施方案中，本文所述的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体或其抗原结合片段包含轻链和重链，其中所述重链不包含具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的人IgG1Fc区。
在某些实施方案中，本文所述的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体或其抗原结合片段包含轻链和重链，其中所述重链包含具有以下氨基酸序列的人IgG1-K322A Fc区：
在一些实施方案中，本文所述的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体或其抗原结合片段包含轻链和重链，其中所述重链包含具有以下氨基酸序列的人IgG4Fc区：
在另一个实施方案中，本文所述的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体或其抗原结合片段包含轻链和重链，其中所述重链包含具有以下氨基酸序列的人IgG4P Fc区：
在另一个实施方案中，本文所述的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体或其抗原结合片段包含轻链和重链，其中所述重链包含具有以下氨基酸序列的人IgG4PE Fc区：
在一些实施方案中，本文所述的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体或其抗原结合片段包含轻链和重链，其中所述重链不包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的人IgG4PE Fc区。
在另一个实施方案中，本文所述的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体或其抗原结合片段包含轻链和重链，其中所述轻链包含具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的恒定区；并且所述重链包含具有选自由SEQ ID NO:36-40组成的组的氨基酸序列的Fc区。
在某些实施方案中，本文提供的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体包含轻链和重链，其中所述轻链包含如下的氨基酸序列：
在一些实施方案中，本文提供的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体包含轻链和重链，其中所述重链包含如下的氨基酸序列：
在其它实施方案中，本文提供的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体包含轻链和重链，其中所述重链包含如下的氨基酸序列：
在另一个实施方案中，本文提供的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体包含轻链和重链，其中所述重链包含如下的氨基酸序列：
在另一个实施方案中，本文提供的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体包含轻链和重链，其中所述重链包含如下的氨基酸序列：
在一个特定实施方案中，本文提供的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体包含轻链和重链，其中(i)所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；并且(ii)所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在另一个特定实施方案中，本文提供的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体包含轻链和重链，其中(i)所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；并且(ii)所述重链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在另一个特定实施方案中，本文提供的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体包含轻链和重链，其中(i)所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；并且(ii)所述重链包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
在另一个特定实施方案中，本文提供的特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)的抗体包含轻链和重链，其中(i)所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；并且(ii)所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
在另一方面，提供了与例示的抗体或功能片段中的一者竞争结合至PD-1的抗体。此类抗体还可与本文所例示的抗体中的一种结合至相同表位或重叠表位。预期与所例示的抗体竞争或结合至相同表位的抗体和片段显示类似的功能性质。所例示的抗原结合蛋白和片段包括具有VH区和VL区以及本文提供的CDR的那些，包括表1-6中的那些。因此，作为一个具体实例，所提供的抗体包括与包含以下的抗体竞争的那些抗体：(a)针对表1-2中列出的抗体列出的1、2、3、4、5或全部6个CDR；(b)选自针对表5-6中列出的抗体列出的VH区和VL区的VH和VL；或(c)包含如针对表5-6中列出的抗体指定的VH和VL的两条轻链和两条重链。在一些实施方案中，所述抗体是PD1AB-1。在一些实施方案中，所述抗体是PD1AB-2。在一些实施方案中，所述抗体是PD1AB-3。在一些实施方案中，所述抗体是PD1AB-4。在一些实施方案中，所述抗体是PD1AB-5。在一些实施方案中，所述抗体是PD1AB-6。
在另一方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段结合至人PD-1或食蟹猴PD-1的区，包括表位。例如，在一些实施方案中，本文提供的抗体结合至人PD-1的区(SEQ ID NO:42)，所述区包含人PD-1的氨基酸残基33至109。在另一方面，本文提供的抗体结合至人PD-1的特定表位。
在某些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ IDNO:42的氨基酸序列内的残基100-109(SEQ ID NO:43)中的至少一个。在一些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的残基100-105(SEQ ID NO:44)中的至少一个。
在特定实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的至少一个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。在一些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的至少一个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在一些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的两个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在其它实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的三个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在某些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的四个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的五个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的六个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的七个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的八个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在某些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的九个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在其它实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的所有十个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
在另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQID NO:42的氨基酸序列内的N33。在另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的T51。在一个特定实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的S57。在一个具体实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的L100。在一些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N102。在其它实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的G103。在另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的R104。在另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的G103和R104。在另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的D105。在一些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的H107。在某些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的S109。还考虑了上述氨基酸PD-1结合位点中的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个的任何组合。
在一方面，本文描述了特异性地结合至PD-1并且可调节PD-1活性和/或表达(例如，活化PD-1信号传导和/或抑制PD-1表达)的抗体。在某些实施方案中，本文提供了PD-1激动剂，其是本文提供的抗体，所述抗体特异性地结合至人PD-1的ECD并且活化(例如，部分活化)至少一种PD-1活性(例如，抑制细胞因子产生)。在某些实施方案中，本文提供的PD-1激动剂是本文提供的抗体，所述抗体特异性地结合至人PD-1的ECD并且下调PD-1表达。在某些实施方案中，本文描述了抗体，所述抗体特异性地结合至PD-1并且(a)减弱T细胞活性，例如，如通过细胞因子产生的抑制所确定；和/或(b)下调细胞中的PD-1表达。在某些实施方案中，本文描述了抗体，所述抗体特异性地结合至PD-1并且(a)减弱T细胞活性，例如，如通过细胞因子产生的抑制所确定；(b)下调细胞中的PD-1表达；和/或(c)不抑制PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合。在某些实施方案中，特异性地结合至PD-1的抗体结合至人PD-1的ECD，或其人PD-1的ECD的表位。在某些实施方案中，所述抗体特异性地结合至人PD-1的ECD的表位，所述表位不同于PD-L1结合位点。在某些实施方案中，所述抗体特异性地结合至人PD-1的ECD的表位，所述表位不同于PD-L2结合位点。在某些实施方案中，所述抗体特异性地结合至人PD-1的ECD的表位，所述表位不同于PD-L1和PD-L2结合位点。在某些实施方案中，所述抗体不抑制PD-L1与PD-1的结合。在其它实施方案中，所述抗体不抑制PD-L2与PD-1的结合。在具体实施方案中，所述抗体不抑制PD-L1与PD-1的结合以及PD-L2与PD-1的结合。
PD-1活性可涉及PD-1的任何活性，如本领域中已知或描述的那些活性。PD-1活性和PD-1信号传导在本文中可互换使用。在某些方面，PD-1活性由PD-1配体(例如，PD-L1)与PD-1的结合诱导。PD-1的表达水平可通过本文描述或本领域技术人员已知的方法(例如，蛋白质印迹、ELISA、免疫组织化学或流式细胞术)进行评估。在某些实施方案中，本文描述了特异性地结合至PD-1并降低PD-1表达的抗体。在某些实施方案中，本文描述了特异性地结合至PD-1并减弱T细胞活性的抗体。在某些实施方案中，本文描述了特异性地结合至PD-1并抑制细胞因子产生的抗体。在某些实施方案中，本文描述了特异性地结合至PD-1并活化(例如，部分活化)PD-1信号传导的抗体。在某些实施方案中，特异性地结合至PD-1的抗体结合至人PD-1的ECD，或其人PD-1的ECD的表位。在某些实施方案中，所述抗体特异性地结合至人PD-1的ECD的表位，所述表位不同于PD-L1结合位点。在某些实施方案中，所述抗体特异性地结合至人PD-1的ECD的表位，所述表位不同于PD-L2结合位点。在某些实施方案中，所述抗体特异性地结合至人PD-1的ECD的表位，所述表位不同于PD-L1和PD-L2结合位点。在某些实施方案中，所述抗体不抑制PD-L1与PD-1的结合。在其它实施方案中，所述抗体不抑制PD-L2与PD-1的结合。在具体实施方案中，所述抗体不抑制PD-L1与PD-1的结合以及PD-L2与PD-1的结合。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体减弱(例如，部分减弱)T细胞活性。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约10％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约15％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约20％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约25％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约30％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约35％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约40％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约45％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约50％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约55％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约60％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约65％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约70％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约75％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约80％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约85％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约90％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约95％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约98％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约99％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞活性减弱至少约100％。在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体可使T细胞活性减弱(例如，部分减弱)至少约25％至约65％。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估T细胞活性减弱。在一些实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法评估T细胞活性减弱。在某些实施方案中，T细胞活性减弱是相对于在无任何抗PD-1抗体的刺激存在下的T细胞活性。在某些实施方案中，T细胞活性减弱是相对于在用不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)刺激存在下的T细胞活性。
在一个实施方案中，T细胞活性的减弱通过T细胞增殖的抑制来指示。在具体的实施方案中，T细胞增殖是CD4+T细胞增殖。在某些实施方案中，T细胞增殖是CD8+T细胞增殖。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约10％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约15％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约20％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约25％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约30％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约35％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约40％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约45％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约50％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约55％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约60％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约65％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约70％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约75％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约80％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约85％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约90％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约95％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约98％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约99％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞增殖抑制至少约100％。在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体可使T细胞增殖抑制(例如，部分抑制)至少约25％至约65％。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估T细胞增殖。在一些实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法评估T细胞增殖。在某些实施方案中，T细胞增殖是相对于在无任何抗PD-1抗体的刺激存在下的T细胞增殖。在某些实施方案中，T细胞增殖是相对于在用不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)刺激存在下的T细胞增殖。
在某些实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并抑制CD4+T细胞增殖。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约5％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约15％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约20％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约30％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约35％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约45％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约50％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约60％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约75％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约80％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约90％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约95％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD4+T细胞增殖抑制至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估CD4+T细胞增殖的抑制。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，胸苷掺入测定、MTT测定或细胞增殖生物标志物测定)评估CD4+T细胞增殖的抑制。在一个具体实施方案中，通过胸苷掺入测定评估CD4+T细胞增殖的抑制。在另一个实施方案中，通过MTT测定评估CD4+T细胞增殖的抑制。在另一个实施方案中，通过细胞增殖生物标志物测定评估CD4+T细胞增殖的抑制。在一个具体实施方案中，CD4+T细胞增殖相对于在无任何抗PD-1抗体的刺激存在下的CD4+T细胞增殖被抑制。在其它实施方案中，CD4+T细胞增殖相对于在用不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)刺激存在下的CD4+T细胞增殖被抑制。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)抑制CD4+T细胞增殖。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD4+T细胞增殖，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，胸苷掺入测定、MTT测定或细胞增殖生物标志物测定)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过胸苷掺入测定评估EC50。在另一个实施方案中，通过MTT测定评估EC50。在另一个实施方案中，通过细胞增殖生物标志物测定评估EC50。
在某些实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并抑制CD8+T细胞增殖。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约5％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约15％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约20％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约30％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约35％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约45％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约50％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约60％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约75％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约80％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约90％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约95％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD8+T细胞增殖抑制至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估CD8+T细胞增殖的抑制。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，胸苷掺入测定、MTT测定或细胞增殖生物标志物测定)评估CD8+T细胞增殖的抑制。在一个具体实施方案中，通过胸苷掺入测定评估CD8+T细胞增殖的抑制。在另一个实施方案中，通过MTT测定评估CD8+T细胞增殖的抑制。在另一个实施方案中，通过细胞增殖生物标志物测定评估CD8+T细胞增殖的抑制。在一个具体实施方案中，CD8+T细胞增殖相对于在无任何抗PD-1抗体的刺激存在下的CD8+T细胞增殖被抑制。在其它实施方案中，CD8+T细胞增殖相对于在用不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)刺激存在下的CD8+T细胞增殖被抑制。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)抑制CD8+T细胞增殖。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制CD8+T细胞增殖，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，胸苷掺入测定、MTT测定或细胞增殖生物标志物测定)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过胸苷掺入测定评估EC50。在另一个实施方案中，通过MTT测定评估EC50。在另一个实施方案中，通过细胞增殖生物标志物测定评估EC50。
在一个实施方案中，T细胞活性的减弱通过T细胞表面上不是PD-1受体的抑制性受体(例如，LAG-3、CTLA-4或TIM-3)的表达上调来指示。在一些实施方案中，所述抑制性受体是选自由LAG-3、CTLA-4或TIM-3或其任何组合组成的组。在一个实施方案中，所述抑制性受体是LAG-3。在另一个实施方案中，所述抑制性受体是CTLA-4。在另一个实施方案中，所述抑制性受体是TIM-3。在某些实施方案中，所述抑制性受体是LAG-3和CTLA-4。在一些实施方案中，所述抑制性受体是LAG-3和TIM-3。在其它实施方案中，所述抑制性受体是CTLA-4和TIM-3。在其它实施方案中，所述抑制性受体是LAG-3、CTLA-4或TIM-3。
在某些实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并上调LAG-3受体的表达。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约5％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约15％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约20％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约30％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约35％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约45％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约50％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约60％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约75％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约80％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约90％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约95％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使LAG-3表达上调至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估LAG-3表达的上调。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估LAG-3表达的上调。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估LAG-3表达的上调。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估LAG-3表达的上调。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估LAG-3表达的上调。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估LAG-3表达的上调。在一个具体实施方案中，LAG-3表达相对于在无任何抗PD-1抗体的刺激存在下的LAG-3表达上调。在其它实施方案中，LAG-3表达相对于在用不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)刺激存在下的LAG-3表达上调。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)上调LAG-3表达。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调LAG-3表达，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估EC50。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估EC50。
在某些实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并上调CTLA-4受体的表达。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约5％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约15％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约20％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约30％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约35％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约45％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约50％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约60％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约75％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约80％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约90％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约95％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CTLA-4表达上调至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估CTLA-4表达的上调。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估CTLA-4表达的上调。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估CTLA-4表达的上调。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估CTLA-4表达的上调。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估CTLA-4表达的上调。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估CTLA-4表达的上调。在一个具体实施方案中，CTLA-4表达相对于在无任何抗PD-1抗体的刺激存在下的CTLA-4表达上调。在其它实施方案中，CTLA-4表达相对于在用不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)刺激存在下的CTLA-4表达上调。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)上调CTLA-4表达。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调CTLA-4表达，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估EC50。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估EC50。
在某些实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并上调TIM-3受体的表达。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约5％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约15％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约20％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约30％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约35％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约45％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约50％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约60％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约75％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约80％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约90％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约95％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TIM-3表达上调至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估TIM-3表达的上调。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估TIM-3表达的上调。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估TIM-3表达的上调。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估TIM-3表达的上调。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估TIM-3表达的上调。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估TIM-3表达的上调。在一个具体实施方案中，TIM-3表达相对于在无任何抗PD-1抗体的刺激存在下的TIM-3表达上调。在其它实施方案中，TIM-3表达相对于在用不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)刺激存在下的TIM-3表达上调。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)上调TIM-3表达。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调TIM-3表达，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估EC50。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估EC50。
在一个实施方案中，T细胞活性的减弱通过T细胞回忆应答的抑制来指示。在一些实施方案中，T细胞回忆应答通过CD4+T细胞增殖来测量。在其它实施方案中，T细胞回忆应答通过CD25上调来测量。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约10％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约15％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约20％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约25％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约30％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约35％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约40％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约45％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约50％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约55％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约60％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约65％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约70％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约75％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约80％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约85％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约90％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约95％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约98％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约99％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞回忆应答抑制至少约100％。在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体可使T细胞回忆应答抑制(例如，部分抑制)至少约25％至约65％。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估T细胞回忆应答。在一些实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，CD4+T细胞增殖测定或CD25上调测定)评估T细胞回忆应答。在某些实施方案中，所述T细胞回忆应答是相对于在无任何抗PD-1抗体的刺激存在下的T细胞回忆应答。在某些实施方案中，所述T细胞回忆应答是相对于在用不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)刺激存在下的T细胞回忆应答。
在一些实施方案中，T细胞活性的减弱通过T细胞活化标志物的下调来指示。在一个实施方案中，所述T细胞活化生物标志物是CD25。在另一个实施方案中，所述T细胞活化生物标志物是CD69。
在某些实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并下调CD25的表达。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约5％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约15％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约20％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约30％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约35％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约45％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约50％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约60％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约75％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约80％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约90％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约95％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25表达下调至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估CD25表达的下调。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估CD25表达的下调。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估CD25表达的下调。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估CD25表达的下调。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估CD25表达的下调。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估CD25表达的下调。在一个具体实施方案中，CD25表达相对于在无任何抗PD-1抗体的刺激存在下的CD25表达下调。在其它实施方案中，CD25表达相对于在用不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)刺激存在下的CD25表达下调。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)下调CD25表达。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD25表达，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估EC50。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估EC50。
在某些实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并下调CD69的表达。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约5％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约15％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约20％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约30％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约35％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约45％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约50％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约60％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约75％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约80％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约90％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约95％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD69表达下调至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估CD69表达的下调。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估CD69表达的下调。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估CD69表达的下调。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估CD69表达的下调。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估CD69表达的下调。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估CD69表达的下调。在一个具体实施方案中，CD69表达相对于在无任何抗PD-1抗体的刺激存在下的CD69表达下调。在其它实施方案中，CD69表达相对于在用不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)刺激存在下的CD69表达下调。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)下调CD69表达。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调CD69表达，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估EC50。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估EC50。
在一些实施方案中，T细胞活性的减弱通过调控性T细胞生物标志物的上调来指示。在一个实施方案中，所述调控性T细胞生物标志物是Foxp3。
在某些实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并上调Foxp3的表达。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约5％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约15％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约20％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约30％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约35％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约45％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约50％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约60％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约75％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约80％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约90％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约95％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使Foxp3表达上调至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估Foxp3表达的上调。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估Foxp3表达的上调。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估Foxp3表达的上调。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估Foxp3表达的上调。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估Foxp3表达的上调。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估Foxp3表达的上调。在一个具体实施方案中，Foxp3表达相对于在无任何抗PD-1抗体的刺激存在下的Foxp3表达上调。在其它实施方案中，Foxp3表达相对于在用不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)刺激存在下的FOXP3表达上调。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)上调Foxp3表达。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体上调Foxp3表达，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估EC50。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估EC50。
在一个实施方案中，T细胞活性的减弱通过T细胞耗竭的增加来指示。在某些实施方案中，T细胞耗竭的增加通过IL-7Rhi T细胞的减少来测量。在一些实施方案中，T细胞耗竭的增加通过IL-7Rlo T细胞的增加来测量。在其它实施方案中，T细胞耗竭的增加通过LAG-3表达的增加来测量。在其它实施方案中，T细胞耗竭的增加通过CTLA-4表达的增加来测量。在其它实施方案中，T细胞耗竭的增加通过TIM-3表达的增加来测量。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约10％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约15％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约20％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约25％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约30％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约35％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约40％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约45％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约50％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约55％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约60％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约65％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约70％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约75％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约80％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约85％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约90％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约95％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约98％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约99％。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使T细胞耗竭增加至少约100％。在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体可使T细胞回忆应答抑制(例如，部分抑制)至少约25％至约65％。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估T细胞耗竭。在一些实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，IL-7Rhi T细胞流式细胞术；IL-7Rlo T细胞流式细胞术；LAG-3表达流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹、RT-PCR；CTLA-4表达流式细胞术；蛋白质印迹；RNA印迹、RT-PCR；或TIM-3表达流式细胞术；蛋白质印迹、RNA印迹、RT-PCR)评估T细胞耗竭。在某些实施方案中，所述T细胞耗竭是相对于在无任何抗PD-1抗体的刺激存在下的T细胞耗竭。在某些实施方案中，所述T细胞耗竭是相对于在用不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)刺激存在下的T细胞耗竭。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。在其它实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在其它实施方案中，T细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞。
在某些实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7RhiT细胞减少至少约5％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约15％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约20％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约30％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约35％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约45％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约50％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约60％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约75％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约80％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约90％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约95％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rhi T细胞减少至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估IL-7Rhi T细胞的减少。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估IL-7Rhi T细胞的减少。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估IL-7Rhi T细胞的减少。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估IL-7Rhi T细胞的减少。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估IL-7Rhi T细胞的减少。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估IL-7Rhi T细胞的减少。在一个具体实施方案中，IL-7Rhi T细胞相对于在无任何抗PD-1抗体的刺激存在下的IL-7Rhi T细胞减少。在其它实施方案中，IL-7Rhi T细胞相对于在用不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)刺激存在下的IL-7Rhi T细胞减少。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。在其它实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在其它实施方案中，T细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)使IL-7Rhi T细胞减少。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7RhiT细胞减少，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rhi T细胞减少，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估EC50。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估EC50。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。在其它实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在其它实施方案中，T细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞。
在某些实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7RloT细胞增加至少约5％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约15％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约20％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约30％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约35％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约45％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约50％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约60％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约75％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约80％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约90％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约95％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-7Rlo T细胞增加至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估IL-7Rlo T细胞的增加。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估IL-7Rlo T细胞的增加。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估IL-7Rlo T细胞的增加。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估IL-7Rlo T细胞的增加。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估IL-7Rlo T细胞的增加。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估IL-7Rlo T细胞的增加。在一个具体实施方案中，IL-7Rlo T细胞相对于在无任何抗PD-1抗体的刺激存在下的IL-7Rlo T细胞增加。在其它实施方案中，IL-7Rlo T细胞相对于在用不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)刺激存在下的IL-7Rlo T细胞增加。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。在其它实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在其它实施方案中，T细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)使IL-7Rlo T细胞增加。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7RloT细胞增加，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使IL-7Rlo T细胞增加，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估EC50。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估EC50。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。在其它实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在其它实施方案中，T细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞。
在一个实施方案中，T细胞活性的减弱通过调控性T细胞的增加来指示。在一些实施方案中，T细胞活性的减弱通过Foxp3+调控性T细胞的增加来指示。在一些实施方案中，T细胞活性的减弱通过CD25+Foxp3+调控性T细胞的增加来指示。
在某些实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约5％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约15％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约20％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约30％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约35％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约45％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约50％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约60％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约75％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约80％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约90％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约95％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估CD25+Foxp3+调控性T细胞的增加。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估CD25+Foxp3+调控性T细胞的增加。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估CD25+Foxp3+调控性T细胞的增加。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估CD25+Foxp3+调控性T细胞的增加。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估CD25+Foxp3+调控性T细胞的增加。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估CD25+Foxp3+调控性T细胞的增加。在一个具体实施方案中，CD25+Foxp3+调控性T细胞相对于在无任何抗PD-1抗体的刺激存在下的CD25+Foxp3+调控性T细胞增加。在其它实施方案中，CD25+Foxp3+调控性T细胞相对于在用不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)刺激存在下的CD25+Foxp3+调控性T细胞增加。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体使CD25+Foxp3+调控性T细胞增加，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估EC50。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估EC50。
在一个实施方案中，T细胞活性的减弱通过细胞因子分泌的抑制来指示。在一些实施方案中，所述细胞因子是选自由IL-2、IL-17、IFN-γ或其任何组合组成的组。在某些实施方案中，所述细胞因子选自由以下组成的组：IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α。在某些实施方案中，所述细胞因子是IL-1。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-2。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-6。在另一个实施方案中，所述细胞因子是IL-12。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-17。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-22。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-23。在一些实施方案中，所述细胞因子是GM-CSF。在其它实施方案中，所述细胞因子是IFN-γ。在其它实施方案中，所述细胞因子是TNF-α。在某些实施方案中，所述细胞因子是IL-2和IL-17。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-2和IFN-γ。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-17和IFN-γ。在其它实施方案中，所述细胞因子是IL-2、IL-17和IFN-γ。
在具体实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并抑制IL-2分泌(例如，来自细胞，例如T细胞)。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约5％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约15％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约20％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约30％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约35％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约45％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约50％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约60％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约75％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约80％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约90％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约95％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-2分泌抑制至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估IL-2分泌的抑制。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，MesoScaleTM发现(MSD)多重测定)评估IL-2分泌的抑制。在一个具体实施方案中，IL-2分泌相对于在抗PD-1抗体不存在下的IL-2分泌被抑制。在其它实施方案中，IL-2分泌相对于在不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)存在下的IL-2分泌被抑制。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)抑制IL-2分泌。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-2分泌，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，MSD多重测定)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过MSD多重测定评估EC50。
在具体实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并抑制IL-17分泌(例如，来自细胞，例如T细胞)。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约5％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约10％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约15％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约20％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约25％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约30％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约35％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约40％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约45％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约50％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约55％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约60％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约65％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约70％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约75％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约80％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约85％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约90％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约95％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约98％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-17分泌抑制至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估IL-17分泌的抑制。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，MSD多重测定)评估IL-17分泌的抑制。在一个具体实施方案中，IL-17分泌相对于在抗PD-1抗体不存在下的IL-17分泌被抑制。在其它实施方案中，IL-17分泌相对于在不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)存在下的IL-17分泌被抑制。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)抑制IL-17分泌。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至多约50nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至多约40nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至多约20nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至多约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至多约5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至多约1nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至多约0.75nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至多约0.5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至多约0.1nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至多约0.05nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至多约0.005nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至多约0.001nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至少约50nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至少约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至少约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至少约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至少约5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至少约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至少约0.5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至少约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至少约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至少约0.005nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-17分泌，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，MSD多重测定)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过MSD多重测定评估EC50。
在具体实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并抑制IFN-γ分泌(例如，来自细胞，例如T细胞)。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约5％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约10％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约15％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约20％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约25％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约30％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约35％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约40％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约45％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约50％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约55％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约60％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约65％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约70％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约75％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约80％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约85％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约90％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约95％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约98％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IFN-γ分泌抑制至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估IFN-γ分泌的抑制。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，MSD多重测定)评估IFN-γ分泌的抑制。在一个具体实施方案中，IFN-γ分泌相对于在抗PD-1抗体不存在下的IFN-γ分泌被抑制。在其它实施方案中，IFN-γ分泌相对于在不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)存在下的IFN-γ分泌被抑制。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)抑制IFN-γ分泌。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至多约50nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至多约40nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至多约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至多约20nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至多约10nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至多约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至多约1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至多约0.75nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至多约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至多约0.05nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至多约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至多约0.005nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至多约0.001nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至少约50nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至少约40nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至少约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至少约20nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至少约10nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至少约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至少约1nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至少约0.75nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至少约0.5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至少约0.1nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至少约0.05nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至少约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至少约0.005nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IFN-γ分泌，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，MSD多重测定)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过MSD多重测定评估EC50。
在具体实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并抑制IL-1分泌(例如，来自细胞，例如T细胞)。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约5％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约15％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约20％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约30％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约35％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约45％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约50％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约60％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约75％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约80％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约90％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约95％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-1分泌抑制至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估IL-1分泌的抑制。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，MSD多重测定)评估IL-1分泌的抑制。在一个具体实施方案中，IL-1分泌相对于在抗PD-1抗体不存在下的IL-1分泌被抑制。在其它实施方案中，IL-1分泌相对于在不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)存在下的IL-1分泌被抑制。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)抑制IL-1分泌。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-1分泌，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，MSD多重测定)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过MSD多重测定评估EC50。
在具体实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并抑制IL-6分泌(例如，来自细胞，例如T细胞)。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约5％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约15％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约20％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约30％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约35％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约45％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约50％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约60％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约75％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约80％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约90％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约95％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-6分泌抑制至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估IL-6分泌的抑制。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，MSD多重测定)评估IL-6分泌的抑制。在一个具体实施方案中，IL-6分泌相对于在抗PD-1抗体不存在下的IL-6分泌被抑制。在其它实施方案中，IL-6分泌相对于在不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)存在下的IL-6分泌被抑制。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)抑制IL-6分泌。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-6分泌，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，MSD多重测定)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过MSD多重测定评估EC50。
在具体实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并抑制IL-12分泌(例如，来自细胞，例如T细胞)。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约5％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约15％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约20％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约30％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约35％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约45％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约50％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约60％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约75％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约80％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约90％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约95％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-12分泌抑制至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估IL-12分泌的抑制。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，MSD多重测定)评估IL-12分泌的抑制。在一个具体实施方案中，IL-12分泌相对于在抗PD-1抗体不存在下的IL-12分泌被抑制。在其它实施方案中，IL-12分泌相对于在不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)存在下的IL-12分泌被抑制。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)抑制IL-12分泌。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-12分泌，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，MSD多重测定)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过MSD多重测定评估EC50。
在具体实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并抑制IL-22分泌(例如，来自细胞，例如T细胞)。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约5％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约15％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约20％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约30％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约35％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约45％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约50％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约60％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约75％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约80％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约90％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约95％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-22分泌抑制至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估IL-22分泌的抑制。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，MSD多重测定)评估IL-22分泌的抑制。在一个具体实施方案中，IL-22分泌相对于在抗PD-1抗体不存在下的IL-22分泌被抑制。在其它实施方案中，IL-22分泌相对于在不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)存在下的IL-22分泌被抑制。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)抑制IL-22分泌。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-22分泌，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，MSD多重测定)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过MSD多重测定评估EC50。
在具体实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并抑制IL-23分泌(例如，来自细胞，例如T细胞)。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约5％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约15％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约20％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约30％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约35％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约45％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约50％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约60％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约75％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约80％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约90％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约95％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使IL-23分泌抑制至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估IL-23分泌的抑制。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，MSD多重测定)评估IL-23分泌的抑制。在一个具体实施方案中，IL-23分泌相对于在抗PD-1抗体不存在下的IL-23分泌被抑制。在其它实施方案中，IL-23分泌相对于在不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)存在下的IL-23分泌被抑制。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)抑制IL-23分泌。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制IL-23分泌，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，MSD多重测定)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过MSD多重测定评估EC50。
在具体实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并抑制GM-CSF分泌(例如，来自细胞，例如T细胞)。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约5％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约15％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约20％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约30％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约35％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约45％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约50％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约60％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约75％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约80％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约90％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约95％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使GM-CSF分泌抑制至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估GM-CSF分泌的抑制。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，MSD多重测定)评估GM-CSF分泌的抑制。在一个具体实施方案中，GM-CSF分泌相对于在抗PD-1抗体不存在下的GM-CSF分泌被抑制。在其它实施方案中，GM-CSF分泌相对于在不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)存在下的GM-CSF分泌被抑制。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)抑制GM-CSF分泌。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制GM-CSF分泌，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，MSD多重测定)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过MSD多重测定评估EC50。
在具体实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并抑制TNF-α分泌(例如，来自细胞，例如T细胞)。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约5％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约15％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约20％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约30％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约35％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约45％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约50％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约60％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约75％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约80％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约90％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约95％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使TNF-α分泌抑制至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估TNF-α分泌的抑制。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，MSD多重测定)评估TNF-α分泌的抑制。在一个具体实施方案中，TNF-α分泌相对于在抗PD-1抗体不存在下的TNF-α分泌被抑制。在其它实施方案中，TNF-α分泌相对于在不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)存在下的TNF-α分泌被抑制。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)抑制TNF-α分泌。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制TNF-α分泌，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，MSD多重测定)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过MSD多重测定评估EC50。
在具体实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)特异性地结合至PD-1并下调PD-1表达(例如，细胞中，例如T细胞中)。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约5％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约10％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约15％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约20％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约25％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约30％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约35％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约40％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约45％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约50％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约55％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约60％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约65％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约70％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约75％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约80％。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约85％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约90％。在其它实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约95％。在一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约98％。在另一个实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约99％。在具体实施方案中，本文提供的抗体特异性地结合至PD-1并使PD-1表达下调至少约25％或35％，任选地至约75％。在一些实施方案中，通过本文描述的方法评估PD-1表达的下调。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估PD-1表达的下调。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估PD-1表达的下调。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估PD-1表达的下调。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估PD-1表达的下调。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估PD-1表达的下调。在一个具体实施方案中，PD-1表达相对于在抗PD-1抗体不存在下的PD-1表达下调而下调。在其它实施方案中，PD-1表达相对于在不相关的抗体(例如，不特异性地结合至PD-1的抗体)存在下的PD-1表达下调而下调。
在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体(例如，抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者或其抗原结合片段，或包含抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的CDR的抗体)下调PD-1表达。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至多约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至多约40nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至多约30nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至多约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至多约10nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至多约5nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至多约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至多约0.75nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至多约0.5nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至多约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至多约0.05nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至多约0.01nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至多约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至多约0.001nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至少约50nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至少约40nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至少约30nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至少约20nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至少约5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至少约1nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至少约0.75nM。在其它实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至少约0.5nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至少约0.1nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至少约0.05nM。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至少约0.01nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至少约0.005nM。在一个实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体下调PD-1表达，EC50为至少约0.001nM。在具体实施方案中，通过本文描述的方法评估EC50。在其它实施方案中，通过本领域技术人员已知的其它方法(例如，流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹或RT-PCR)评估EC50。在一个具体实施方案中，通过流式细胞术评估EC50。在另一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RNA印迹评估EC50。在另一个实施方案中，通过RT-PCR评估EC50。
在所述方法的某些实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后4小时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后6小时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后8小时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后10小时发生。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后12小时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后14小时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后16小时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后18小时发生。在一个实施方案中，所述下调早在所述接触后20小时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后22小时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在所述接触后24小时发生。在一些实施方案中，所述接触是与所述抗体接触。在其它实施方案中，所述接触是与其抗原结合片段。
在一些实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调先于细胞因子抑制。在一个实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后4小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后6小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后8小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后10小时发生，并且先于细胞因子抑制。在一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后12小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后14小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后16小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后18小时发生，并且先于细胞因子抑制。在一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后20小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后22小时发生，并且先于细胞因子抑制。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后24小时发生，并且先于细胞因子抑制。
在其它实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调与细胞因子抑制同时发生。在一个实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后4小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后6小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后8小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后10小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后12小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后14小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后16小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后18小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后20小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后22小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后24小时发生，并且与细胞因子抑制同时发生。
在其它实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调是在细胞因子抑制之后。在一个实施方案中，T细胞表面上PD-1表达的下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后4小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后6小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后8小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后10小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后12小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后14小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后16小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后18小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后20小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后22小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。在另一个实施方案中，所述下调早在与所述抗体或其抗原结合片段接触后24小时发生，并且是在细胞因子抑制之后。
4.3.1.1多克隆抗体
本公开的抗体可包含多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。可例如通过一次或多次注射免疫剂并且如果需要注射佐剂来在哺乳动物中产生多克隆抗体。通常，免疫剂和/或佐剂将通过多次皮下或腹膜内注射被注射到哺乳动物中。免疫剂可包括PD-1多肽或其融合蛋白。将免疫剂与进行免疫的哺乳动物中已知具有免疫原性的蛋白质结合或用蛋白质和一种或多种佐剂免疫哺乳动物可能是有用的。此类免疫原性蛋白质的实例包括但不限于匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可使用的佐剂的实例包括Ribi、CpG、聚1C、弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰基脂质A、合成海藻糖二霉菌酸酯)。免疫方案可由本领域的技术人员选择而无需过多实验。然后可将哺乳动物放血，并测定血清的PD-1抗体滴度。如果需要，可对哺乳动物进行加强直至抗体滴度增加或平稳。另外或可替代地，可从免疫的动物获得淋巴细胞以用于从杂交瘤融合和制备单克隆抗体，如下文所述。
4.3.1.2单克隆抗体
本公开的抗体也可以是单克隆抗体。单克隆抗体可使用由Kohler等人,1975,Nature 256:495-97首次描述的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法制备(参见例如，美国专利号4,816,567)。
在杂交瘤方法中，使小鼠或其它适当的宿主动物(如仓鼠)如上文所述进行免疫以引发产生或能够产生将特异性地结合至用于免疫的多肽的抗体的淋巴细胞。可替代地，淋巴细胞可被体外免疫。在免疫之后，分离淋巴细胞，并且然后使用适合的融合剂(如聚乙二醇)与骨髓瘤细胞系融合从而形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice 59-103(1986))。
将因此制备的杂交瘤细胞接种并生长在合适的培养基中，所述培养基在某些实施方案中含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(还称为融合配偶体)的生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的选择性培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，其阻止缺乏HGPRT的细胞的生长。
示例性融合配偶体骨髓瘤细胞是有效融合、支持所选择的抗体产生细胞的稳定高水平抗体产生、并且对针对未融合的亲本细胞而选择的选择性培养基敏感的那些骨髓瘤细胞。示例性骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，如SP-2和衍生物，例如，可从美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)获得的X63-Ag8-653细胞，以及源自可从Salk Institute CellDistribution Center(San Diego,CA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些。也已经描述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于产生人单克隆抗体(Kozbor,1984,Immunol.133:3001-05；和Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63(1987))。
测定杂交瘤细胞生长所处的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。通过免疫沉淀或通过体外结合测定(如RIA或ELISA)来测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可例如通过Munson等人,1980,Anal.Biochem.107:220-39中描述的斯卡查德(Scatchard)分析来测定。
一旦鉴别了产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，就可通过有限稀释程序而将所述克隆进行亚克隆并且通过标准方法使其生长(Goding，同上)。用于这一目的的合适培养基包括例如DMEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中体内生长为腹水瘤，例如通过将细胞腹膜内(i.p.)注射至小鼠中。
将由亚克隆分泌的单克隆抗体通过常规抗体纯化程序(例如像，亲和色谱(例如使用蛋白A或蛋白G-琼脂糖凝胶)或离子交换色谱、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、渗析等)而从培养基、腹水液或血清适当地分离。
编码单克隆抗体的DNA容易分离并且使用常规程序(例如，使用能够特异性结合至编码鼠科抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)来测序。杂交瘤细胞可充当这种DNA的来源。一旦分离，就可将DNA置于表达载体中，然后转染至否则不产生抗体蛋白的宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的文献综述包括Skerra等人,1993,Curr.Opinion in Immunol.5:256-62和Plückthun,1992,Immunol.Revs.130:151-88。
在一些实施方案中，结合PD-1表位的抗体包含VH结构域的氨基酸序列和/或VL结构域的氨基酸序列，所述氨基酸序列由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与(1)编码本文所述的VH和/或VL结构域中的任一者的核苷酸序列的补体在严格条件下(例如，在约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与过滤器结合的DNA杂交，然后在约50℃-65℃下在0.2X SSC/0.1％SDS中进行一次或多次洗涤)、在高度严格条件下(例如，在约45℃下在6X SSC中与过滤器结合的核酸杂交，然后在约68℃下在0.1X SSC/0.2％SDS中进行一次或多次洗涤)或在本领域技术人员已知的其它严格杂交条件下杂交。参见例如，Current Protocols in Molecular Biology第I卷,6.3.1-6.3.6和2.10.3(Ausubel等人编辑,1989)。
在一些实施方案中，结合PD-1表位的抗体包含VH CDR的氨基酸序列或VL CDR的氨基酸序列，所述氨基酸序列由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与编码在表1-2中描绘的VHCDR和/或VL CDR中的任一者的核苷酸序列的补体在严格条件下(例如，在约45℃下在6XSSC中与过滤器结合的DNA杂交，然后在约50℃-65℃下在0.2X SSC/0.1％SDS中进行一次或多次洗涤)、在高度严格条件下(例如，在约45℃下在6X SSC中与过滤器结合的核酸杂交，然后在约68℃下在0.1X SSC/0.2％SDS中进行一次或多次洗涤)或在本领域技术人员已知的其它严格杂交条件(参见例如，Ausubel等人，同上)下杂交。
在另一实施方案中，单克隆抗体或抗体片段可从使用例如在Antibody Phage Display:Methods and Protocols(O’Brien和Aitken编辑,2002)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离。原则上，通过筛选含有噬菌体的噬菌体文库来选择合成抗体克隆，所述噬菌体展示与噬菌体外壳蛋白融合的抗体可变区(Fv)的各种片段。针对所需抗原筛选此类噬菌体文库。表达能够结合至所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至所述抗原，并且因此与文库中的非结合克隆分离。然后从抗原洗脱结合克隆，并且可通过另外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。
可变结构域可在噬菌体上作为单链Fv(scFv)片段(其中VH和VL通过短的柔性肽共价连接)或作为Fab片段(其中它们各自与恒定结构域融合并且非共价地相互作用)功能性地展示，如例如Winter等人,1994,Ann.Rev.Immunol.12:433-55中所描述。
可通过PCR单独克隆VH和VL基因的所有谱系，并在噬菌体文库中随机重组，然后可如Winter等人，同上中所描述搜索抗原结合克隆。来自免疫的来源的文库提供对免疫原具有高亲和力的抗体而无需构建杂交瘤。或者，可在没有任何免疫的情况下克隆天然组库以提供针对广泛范围的非自身抗原和还有自身抗原的人抗体的单一来源，如由Griffiths等人,1993,EMBO J 12:725-34描述。最后，天然文库也可通过以下方式合成制备：从干细胞克隆未重排的V基因区段，以及使用含有随机序列的PCR引物以编码高度可变的CDR3区及在体外实现重排，如例如Hoogenboom和Winter,1992,J.Mol.Biol.227:381-88所描述。
文库的筛选可通过本领域中已知的各种技术来完成。例如，PD-1(例如，PD-1多肽、片段或表位)可用于包被吸附板的孔，在附着于吸附板的宿主细胞上表达或用于细胞分选中，与生物素缀合以用于用链霉抗生物素蛋白包被的珠粒捕获，或用于淘选展示文库的任何其它方法中。可通过使用如Bass等人,1990,Proteins 8:309-14和WO 92/09690中描述的长洗涤和单价噬菌体展示以及使用如Marks等人,1992,Biotechnol.10:779-83中描述的低包被密度的抗原来促进具有缓慢解离动力学(例如，良好结合亲和力)的抗体的选择。
抗PD-1抗体可通过以下方式来获得：设计合适的抗原筛选程序以选择目标噬菌体克隆，然后使用来自目标噬菌体克隆的VH和/或VL序列(例如，Fv序列)或来自所述VH和VL序列的各种CDR序列以及Kabat等人，同上中描述的合适的恒定区(例如，Fc)序列构建全长抗PD-1抗体克隆。
在另一个实施方案中，通过使用如Bowers等人,2011,Proc Natl Acad SciUSA.108:20455-60中描述的方法，例如SHM-XHLTM平台(AnaptysBio,San Diego,CA)产生抗PD-1抗体。简言之，在这种方法中，在作为起始文库的哺乳动物细胞系(例如，HEK293)中构建完整人IgG文库。选择显示与靶肽或表位结合的免疫球蛋白的哺乳动物细胞(例如，通过FACS分选)，然后在体外再生活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)触发的体细胞超突变以扩展最初选择的抗体汇集物的多样性。在通过将哺乳动物细胞表面展示与体外体细胞超突变结合进行几轮亲和力成熟后，产生了高亲和力、高特异性抗PD-1抗体。可用于产生抗体文库和/或抗体亲和力成熟的其它方法公开于例如美国专利号8,685,897和8,603,930以及美国公布号2014/0170705、2014/0094392、2012/0028301、2011/0183855和2009/0075378中，其各自以引用的方式并入本文。
4.3.1.3抗体片段
本公开提供了与PD-1结合的抗体和抗体片段。在某些情况下，使用抗体片段而不是完整抗体是有利的。较小尺寸的片段允许快速清除，并且可产生对细胞、组织或器官的改进的接近。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人,2003,Nature Med.9:129-34。
已经开发了各种技术用于产生抗体片段。传统上，这些片段经由完整抗体的蛋白水解消化而产生(参见例如，Morimoto等人,1992,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-17；以及Brennan等人,1985,Science 229:81-83)。然而，现在可由重组宿主细胞直接产生这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌或酵母细胞中表达并且从其分泌，从而允许产生大量的这些片段。抗体片段可从以上所讨论的抗体噬菌体文库分离。或者，Fab’-SH片段可直接从大肠杆菌中回收并且化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carter等人,1992,Bio/Technology 10:163-67)。根据另一种方法，F(ab’)2片段可直接从重组宿主细胞培养物中分离。包含拯救受体结合表位残基的具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段描述于例如美国专利号5,869,046中。用于产生抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是清楚的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)(参见例如，WO 93/16185；美国专利号5,571,894和5,587,458)。Fv和scFv具有完整的组合位点，所述组合位点没有恒定区；因此，它们可能适合于在体内使用期间减少的非特异性结合。可构建scFv融合蛋白以在scFv的氨基或羧基末端产生效应蛋白的融合(参见，例如，Borrebaeck编辑，同上)。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如，如上文引用的参考文献中所描述。此类线性抗体可以是单特异性的或多特异性的，如双特异性的。
较小的抗体来源的结合结构是单独的可变结构域(V结构域)，也称为单可变结构域抗体(sdAb)。某些类型的生物(骆驼科动物和软骨鱼类)具有作为其免疫系统的一部分安装在Fc等效结构域结构上的高亲和力单一V样结构域。(Woolven等人,1999,Immunogenetics 50:98-101；和Streltsov等人,2004,Proc Natl Acad Sci USA.101:12444-49)。V样结构域(在骆驼科动物中称为VhH，并且在鲨鱼中称为V-NAR)通常展示长表面环，其允许穿透靶抗原的空腔。它们还通过掩蔽疏水性表面贴片来稳定分离的VH结构域。
这些VhH和V-NAR域已被用于工程化sdAb。已经使用来自噬菌体文库和其它方法的选择对人V结构域变体进行了工程化，所述方法已经产生稳定的、高结合VL-和VH-来源的结构域。
本文提供的抗体包括但不限于免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，含有结合至PD-1表位的抗原结合位点的分子。本文提供的免疫球蛋白分子可具有免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
抗体的变体和衍生物包括保留结合至PD-1表位的能力的抗体功能片段。示例性功能片段包括Fab片段(例如，含有抗原结合结构域并包含轻链和通过二硫键桥接的重链的一部分的抗体片段)；Fab’(例如，包含Fab和通过铰链区的重链的另一部分的含有单个抗原结合结构域的抗体片段)；F(ab’)2(例如，通过重链铰链区中的链间二硫键连接的两个Fab’分子；所述Fab’分子可针对相同或不同的表位)；双特异性Fab(例如，具有两个抗原结合结构域的Fab分子，所述结构域各自可针对不同的表位)；包含可变区的单链，也称为scFv(例如，通过10-25个氨基酸的链连接在一起的抗体的单一轻链和重链的可变抗原结合决定区)；二硫键连接的Fv或dsFv(例如，通过二硫键连接在一起的抗体的单一轻链和重链的可变抗原结合决定区)；骆驼化VH(例如，抗体的单一重链的可变抗原结合决定区，其中VH界面处的一些氨基酸是在天然存在的骆驼抗体的重链中发现的那些)；双特异性scFv(例如，具有两个抗原结合结构域的scFv或dsFv分子，所述结构域各自可针对不同的表位)；双抗体(例如，当第一scFv的VH结构域与第二scFv的VL结构域组装并且第一scFv的VL结构域与第二scFv的VH结构域组装时形成的二聚化scFv；双抗体的两个抗原结合区可针对相同或不同的表位)；以及三抗体(例如，以类似于双抗体的方式形成的三聚化scFv，但其中三个抗原结合结构域在单一复合物中产生；三个抗原结合结构域可针对相同或不同的表位)。
4.3.1.4人源化抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗体可以是结合至PD-1(包括人和/或食蟹猴PD-1)的人源化抗体。例如，本公开的人源化抗体可包含如表1-2中所示的一个或多个CDR。用于人源化非人抗体的各种方法是本领域中已知的。例如，人源化抗体可具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化可例如按照Jones等人,1986,Nature 321:522-25；Riechmann等人,1988,Nature 332:323-27；以及Verhoeyen等人,1988,Science 239:1534-36)的方法，通过用高变区序列取代人抗体的相应序列来进行。
在一些情况下，通过CDR移植构建人源化抗体，其中将亲本非人抗体(例如啮齿动物)的六个CDR的氨基酸序列移植到人抗体框架上。例如，Padlan等人确定CDR中仅约三分之一的残基实际上与抗原接触，并将这些称为“特异性决定残基”或SDR(Padlan等人,1995,FASEB J.9:133-39)。在SDR移植技术中，仅将SDR残基移植到人抗体框架上(参见，例如，Kashmiri等人,2005,Methods 36:25-34)。
待用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择对降低抗原性来说可以是非常重要的。例如，根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选非人(例如啮齿动物)抗体的可变结构域的序列。可选择最接近啮齿动物的序列的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims等人,1993,J.Immunol.151:2296-308；和Chothia等人,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。另一种方法使用源自轻链或重链的特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89；和Presta等人,1993,J.Immunol.151:2623-32)。在一些情况下，所述框架源自自最丰富的人亚类VL6亚组I(VL6I)和VH亚组III(VHIII)的共有序列。在另一种方法中，人种系基因用作框架区的来源。
在基于CDR的比较的替代范例中(称为超人源化)，FR同源性是不相关的。所述方法包括比较非人序列与功能性人种系基因组库。然后选择编码与鼠序列相同或密切相关的规范结构的那些基因。接下来，在与非人抗体共享规范结构的基因内，选择CDR内具有最高同源性的那些作为FR供体。最后，将非人CDR移植到这些FR上(参见例如，Tan等人,2002,J.Immunol.169:1119-25)。
通常进一步希望，抗体被人源化成保留它们对抗原的亲和力和其它有利的生物性质。为实现这一目标，根据一种方法，利用亲本序列和人源化序列的三维模型通过亲本序列和各种概念上人源化的产物的分析方法制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常可用并且是本领域的技术人员熟悉的。计算机程序可用，所述程序说明并展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。这些包括例如WAM(Whitelegg和Rees,2000,ProteinEng.13:819-24)、Modeller(Sali和Blundell,1993,J.Mol.Biol.234:779-815)以及SwissPDB Viewer(Guex和Peitsch,1997,Electrophoresis 18:2714-23)。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，例如分析可影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可从接受者和输入序列中选择并组合FR残基，以使得实现所需的抗体特征，诸如增加的对靶抗原的亲和力。通常，高变区残基直接且最实质上地参与影响抗原结合。
抗体人源化的另一种方法是基于称为人序列含量(HSC)的抗体人性的量度。这种方法将小鼠序列与人种系基因的组库进行比较，并将差异评分为HSC。然后通过最大化它的HSC而不是利用全局同一性措施来人源化靶序列以产生多种不同的人源化变体(Lazar等人,2007,Mol.Immunol.44:1986-98)。
除了上述方法之外，经验方法可用于产生和选择人源化抗体。这些方法包括基于产生人源化变体的较大文库和使用富集技术或高通量筛选技术选择最佳克隆的方法。抗体变体可从噬菌体、核糖体和酵母展示文库中分离，以及通过细菌菌落筛选分离(参见例如，Hoogenboom,2005,Nat.Biotechnol.23:1105-16；Dufner等人,2006,TrendsBiotechnol.24:523-29；Feldhaus等人,2003,Nat.Biotechnol.21:163-70；以及Schlapschy等人,2004,Protein Eng.Des.Sel.17:847-60)。
在FR文库方法中，在FR中的特定位置引入残基变体的集合，随后筛选文库以选择最佳支持移植CDR的FR。待取代的残基可包括被鉴别为可能有助于CDR结构的一些或所有“Vernier”残基(参见例如，Foote和Winter,1992,J.Mol.Biol.224:487-99)，或来自Baca等人(1997,J.Biol.Chem.272:10678-84)鉴别的更有限的靶残基集合。
在FR改组中，将整个FR与非人CDR组合，而不是产生所选残基变体的组合文库(参见，例如，Dall’Acqua等人,2005,Methods 36:43-60)。可在两步方法(首先人源化VL、随后VH)中筛选文库的结合。或者，可使用一步FR改组方法。这种方法已被证明比两步筛选更有效，因为所得抗体表现出改善的生物化学和物理化学性质，包括增强的表达、增加的亲和力和热稳定性(参见，例如，Damschroder等人,2007,Mol.Immunol.44:3049-60)。
“人工程化(humaneering)”方法是基于必需最小特异性决定簇(MSD)的实验鉴别，并且是基于将非人类片段顺序置换为人FR的文库并评估结合。它以非人VH和VL链的CDR3的区开始，并逐渐将非人抗体的其它区置换为人FR，包括VH和VL的CDR1和CDR2。这种方法通常导致表位保留和来自具有不同人V区段CDR的多个亚类的抗体的鉴别。人工程化允许分离与人种系基因抗体91％-96％同源的抗体(参见，例如，Alfenito,Cambridge HealthtechInstitute’s Third Annual PEGS,The Protein Engineering Summit,2007)。
“人工程化”方法涉及通过对抗体的氨基酸序列进行特异性变化来改变非人抗体或抗体片段，如小鼠或嵌合抗体或抗体片段，以便产生具有降低的免疫原性的修饰的抗体，所述抗体尽管如此仍然保留了原始非人抗体的理想结合性质。通常，所述技术涉及将非人(例如小鼠)抗体的氨基酸残基分类为“低风险”、“中等风险”或“高风险”残基。使用全全局风险/回报计算进行分类，所述全局风险/回报计算评价进行特定取代的预测益处(例如，对于人中的免疫原性)与取代将影响所得抗体的折叠的风险。可通过比对来自非人抗体的可变区的氨基酸序列与具有特定或共有人抗体序列的相应区来选择在非人(例如，小鼠)抗体序列的给定位置(例如，低或中等风险)处待取代的特定人氨基酸残基。根据比对，非人序列中的低或中等风险位置处的氨基酸残基可取代人抗体序列中的相应残基。用于制备人工程化蛋白质的技术更详细地描述于Studnicka等人,1994,Protein Engineering7:805-14；美国专利号5,766,886；5,770,196；5,821,123；和5,869,619；以及PCT公布WO 93/11794中。
4.3.1.5人抗体
可通过将选自人来源的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列与已知的人恒定结构域序列组合来构建人抗PD-1抗体。或者，可通过杂交瘤方法来制备本公开的人单克隆抗PD-1抗体。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已经例如由Kozbor,1984,J.Immunol.133:3001-05；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63(1987)；以及Boerner等人,1991,J.Immunol.147:86-95进行了描述。
还有可能产生在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下在免疫之后能够产生人抗体的全谱的转基因动物(例如，小鼠)。表达人抗体组库的转基因小鼠已用于产生针对多种潜在药物靶标的高亲和力人序列单克隆抗体(参见例如，Jakobovits,A.,1995,Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561-66；Brüggemann和Taussing,1997,Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455-58；美国专利号6,075,181和6,150,584；以及Lonberg等人,2005,Nature Biotechnol.23:1117-25)。
或者，可通过人B淋巴细胞的永生化来制备人抗体，从而产生针对靶抗原的抗体(例如，此类B淋巴细胞可从个体中回收或者可在体外进行免疫)(参见例如，Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(1985)；Boerner等人,1991,J.Immunol.147(1):86-95；以及美国专利号5,750,373)。
基因改组也可用于从非人(例如啮齿动物)抗体产生人抗体，其中所述人抗体具有相似的对起始非人抗体的亲和力和特异性。根据这种方法(其也称为“表位印迹”或“导向选择”)，通过如本文所述的噬菌体展示技术获得的非人抗体片段的重链或轻链可变区被人V结构域基因的组库置换，从而产生非人链/人链scFv或Fab嵌合体的群体。用抗原选择导致分离非人链/人链嵌合scFv或Fab，其中人链恢复在除去初级噬菌体展示克隆中的相应非人链时被破坏的抗原结合位点(例如，所述表位指导(标记)人链配偶体的选择)。当重复所述过程以置换剩余的非人链时，获得人抗体(参见例如，PCT WO 93/06213；和Osbourn等人,2005,Methods 36:61-68)。与通过CDR移植的非人抗体的传统人源化不同，这种技术提供完全人抗体，所述抗体不具有非人起源的FR或CDR残基。导向选择以使小鼠抗体针对细胞表面抗原人源化的实例包括存在于卵巢癌细胞上的叶酸结合蛋白(参见，例如，Figini等人,1998,Cancer Res.58:991-96)和在肝细胞癌上高度表达的CD147(参见，例如，Bao等人,2005,Cancer Biol.Ther.4:1374-80)。
导向选择方法的潜在缺点是对一个抗体链进行改组同时保持另一个不变可能导致表位漂移。为了维持由非人抗体识别的表位，可应用CDR保留(参见，例如，Klimka等人,2000,Br.J.Cancer.83:252-60；以及Beiboer等人,2000,J.Mol.Biol.296:833-49。在这种方法中，通常保留非人VH CDR3，因为这一CDR可位于抗原结合位点的中心，并且可以是抗体的用于抗原识别的最重要的区。然而，在一些情况下，可保留非人抗体的VH CDR3和VL CDR3以及VH CDR2、VL CDR2和VL CDR1。
4.3.1.6双特异性抗体
双特异性抗体是具有针对至少两种不同抗原的结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体是人或人源化抗体。在某些实施方案中，一种结合特异性是针对PD-1，并且另一种是针对任何其它抗原。在一些实施方案中，一种结合特异性是针对PD-1，并且另一种是针对表达PD-1的细胞上表达的另一种表面抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合至PD-1的两个不同表位。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域中已知的，如通过共表达两个免疫球蛋白重链-轻链对，其中两个重链具有不同的特异性(参见，例如，Milstein和Cuello,1983,Nature 305:537-40)。关于产生双特异性抗体的进一步细节，参见，例如，Bispecific Antibodies(Kontermann编辑,2011)。
4.3.1.7多价抗体
与二价抗体相比，多价抗体可被表达抗体所结合的抗原的细胞更快地内化(和/或分解代谢)。本公开的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(其不具有IgM类)(例如，四价抗体)，所述多价抗体可易于通过编码抗体的多肽链的核酸的重组表达来产生。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。在某些实施方案中，所述二聚化结构域包含Fc区或铰链区，或由其组成。在此情形中，所述抗体将包含Fc区和在Fc区氨基末端的三个或更多个抗原结合位点。在某些实施方案中，多价抗体包含三个至约八个抗原结合位点(或由其组成)。在一个这样的实施方案中，多价抗体包含四个抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体包含至少一条多肽链(例如，两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，所述多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2表示氨基酸或多肽，并且n是0或1。例如，所述多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体还可包含至少两个(例如，四个)轻链可变结构域多肽。本文中的多价抗体可例如包含约两条至约八条轻链可变结构域多肽。在此涵盖的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，并且任选地进一步包含CL结构域。
4.3.1.8Fc工程化
可能希望通过Fc工程化来修饰本文提供的抗PD-1抗体。在某些实施方案中，对抗体的Fc区的修饰导致抗体的效应子功能的降低或消除。在某些实施方案中，效应子功能是ADCC、ADCP和/或CDC。在一些实施方案中，效应子功能是ADCC。在其它实施方案中，效应子功能是ADCP。在其它实施方案中，效应子功能是CDC。在一个实施方案中，效应子功能是ADCC和ADCP。在一个实施方案中，效应子功能是ADCC和CDC。在一个实施方案中，效应子功能是ADCP和CDC。在一个实施方案中，效应子功能是ADCC、ADCP和CDC。这可通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。例如，使用位置233-236处的IgG2残基和位置327、330和331处的IgG4残基取代到人IgG1中显示极大地减少了ADCC和CDC(参见，例如，Armour等人,1999,Eur.J.Immunol.29(8):2613-24；以及Shields等人,2001,J.Biol.Chem.276(9):6591-604)。其它Fc变体在本文其它地方提供。
为了增加抗体的血清半衰期，可例如将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)中，例如，如在美国专利号5,739,277中所描述。术语“补救受体结合表位”是指引起IgG分子的体内血清半衰期的增加的IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位。
4.3.1.9替代结合剂
本公开包括与本文公开的抗PD-1抗体特异性地结合至相同表位的非免疫球蛋白结合剂。在一些实施方案中，非免疫球蛋白结合剂被鉴别为在竞争性结合测定中置换本公开的抗PD-1抗体或被本公开的抗PD-1抗体置换的剂。这些替代结合剂可包括，例如，本领域已知的任何工程化的蛋白质支架。此类支架可包含如表1-2中所示的一个或多个CDR。此类支架包括例如基于脂质运载蛋白支架的anticalin，其是特征在于支持形成配体结合位点的四个高变环的刚性β-桶的蛋白质结构。可通过环区域中的靶向随机诱变与功能展示和导向选择的组合来工程化新的结合特异性(参见，例如，Skerra,2008,FEBS J.275:2677-83)。其它合适的支架可包括例如基于人纤连蛋白III的第十细胞外结构域的adnectin或单体(参见例如，Koide和Koide,2007,Methods Mol.Biol.352:95-109)；基于葡萄球菌蛋白A的Z结构域的亲和体(参见例如，Nygren等人,2008,FEBS J.275:2668-76)；基于锚蛋白重复蛋白的DARPin(参见例如，Stumpp等人,2008,Drug.Discov.Today 13:695-701)；基于人Fyn蛋白激酶的SH3结构域的fynomer(参见例如，Grabulovski等人,2007,J.Biol.Chem.282:3196-204)；基于来自嗜酸硫化裂片菌(Sulfolobus acidolarius)的Sac7d的affitin(参见例如，Krehenbrink等人,2008,J.Mol.Biol.383:1058-68)；基于人y-B-晶体蛋白的affilin(参见例如，Ebersbach等人,2007,J.Mol.Biol.372:172-85)；基于膜受体蛋白的A结构域的avimer(参见例如，Silverman等人,2005,Biotechnol.23:1556-61)；富含半胱氨酸的打结素(knottin)肽(参见例如，Kolmar,2008,FEBS J.275:2684-90)；以及工程化的Kunitz型抑制剂(参见例如，Nixon和Wood,2006,Curr.Opin.Drug.Discov.Dev.9:261-68)。关于综述，参见例如Gebauer和Skerra,2009,Curr.Opin.Chem.Biol.13:245-55。
4.3.2抗体变体
在一些实施方案中，考虑了结合至PD-1或本文描述的抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学性质，包括但不限于特异性、热稳定性、表达水平、效应子功能、糖基化、降低的免疫原性或溶解度。因此，除了本文提供的抗PD-1抗体之外，预期可制备抗PD-1抗体变体。例如，可通过将适当的核苷酸变化引入编码DNA中和/或通过合成所需的抗体或多肽来制备抗PD-1抗体变体。本领域技术人员了解氨基酸改变可改变抗PD-1抗体的翻译后过程，如改变糖基化位点的数量或位置或改变膜锚定特征。
在一些实施方案中，本文提供的抗体例如通过任何类型的分子与抗体的共价连接进行化学修饰。抗体衍生物可包括已经例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其它蛋白质连接等进行化学修饰的抗体。可通过已知技术，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等来进行任何多种化学修饰。另外，抗体可含有一种或多种非经典氨基酸。
变体可以是编码抗体或多肽的一个或多个密码子的取代、缺失或插入，其导致与天然序列抗体或多肽相比氨基酸序列的变化。氨基酸取代可以是用具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸(如用丝氨酸取代亮氨酸，例如保守氨基酸取代)的结果。插入或缺失可任选地在约1至5个氨基酸的范围内。在某些实施方案中，所述取代、缺失或插入包括相对于原始分子少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，取代是在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行的保守氨基酸取代。允许的变化可通过系统地进行序列中氨基酸的插入、缺失或取代并测试所得变体的通过全长或成熟天然序列所表现的活性来确定。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内的氨基末端和/或羧基末端融合、以及具有单一或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N-或C-末端与酶(例如，对于针对抗原的酶前药疗法)或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
抗体的生物性质的实质性修饰通过选择取代来实现，所述取代对维持(a)取代区域中的多肽主链的结构，例如呈薄片或螺旋构象；(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性；或(c)侧链体积的影响显著不同。或者，可进行保守性(例如，在具有相似性质和/或侧链的氨基酸组内)取代，以保持或不显著改变性质。氨基酸可根据其侧链的性质的相似性进行分组(参见例如，Lehninger,Biochemistry 73-75(第2版1975))：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；以及(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。
或者，天然存在的残基可基于常见的侧链性质分成组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代需要将这些类别中的一类的成员更换成另一类别。此类取代的残基也可引入保守性取代位点或引入剩余的(非保守性)位点中。因此，在一个实施方案中，结合至PD-1表位的抗体或其片段包含与本文提供的鼠单克隆抗体的氨基酸序列至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，结合至PD-1表位的抗体或其片段包含与表1-6中描绘的氨基酸序列至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，结合至PD-1表位的抗体或其片段包含与表2中描绘的VH CDR氨基酸序列和/或表1中描绘的VL CDR氨基酸序列至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的VH CDR和/或VL CDR氨基酸序列。可使用本领域中已知的方法进行变化，所述方法如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变。定点诱变(参见，例如，Carter,1986,Biochem J.237:1-7；和Zoller等人,1982,Nucl.Acids Res.10:6487-500)、盒式诱变(参见，例如，Wells等人,1985,Gene34:315-23)或其它已知技术可在克隆的DNA上进行以产生抗PD-1抗体变体DNA。
不参与维持抗PD-1抗体的适当构象的任何半胱氨酸残基还可被例如另一种氨基酸(如丙氨酸或丝氨酸)取代以便改进分子的氧化稳定性并且防止异常交联。相反，可将半胱氨酸键添加至抗PD-1抗体以改进它的稳定性(例如，在抗体是如Fv片段的抗体片段的情况下)。
在一些实施方案中，本公开的抗PD-1抗体分子是“脱免疫化”抗体。“脱免疫化”抗PD-1抗体是源自人源化或嵌合抗PD-1抗体的抗体，与相应的原始未脱免疫化的抗体相比，所述抗体具有其氨基酸序列的一个或多个改变，从而导致抗体的免疫原性降低。用于产生此类抗体突变体的程序之一涉及鉴别和除去抗体分子的T细胞表位。在第一步骤中，抗体分子的免疫原性可通过几种方法确定，例如，通过体外测定T细胞表位或计算机预测此类表位，如本领域中已知的。一旦鉴别了T细胞表位功能的关键残基，就可进行突变以消除免疫原性并保留抗体活性。关于综述，参见例如，Jones等人,2009,Methods in MolecularBiology 525:405-23。
4.3.2.1体外亲和力成熟
在一些实施方案中，与亲本抗体相比具有改进的性质(如亲和力、稳定性或表达水平)的抗体变体可通过体外亲和力成熟来制备。与天然原型一样，体外亲和力成熟是基于突变和选择的原理。抗体文库在生物体(例如，噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞)的表面上展示为Fab、scFv或V结构域片段，或者与它们的编码mRNA或DNA缔合(例如，共价或非共价)。所展示的抗体的亲和力选择允许分离携带编码抗体的遗传信息的生物或复合物。使用诸如噬菌体展示的展示方法进行两轮或三轮突变和选择通常产生具有低纳摩尔范围的亲和力的抗体片段。亲和力成熟的抗体可对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。
噬菌体展示是用于展示和选择抗体的普遍方法。抗体作为与噬菌体外壳蛋白的融合物展示在Fd或M13噬菌体的表面上。选择涉及暴露于抗原以允许噬菌体展示的抗体结合其靶标，其是称为“淘选”的过程。回收与抗原结合的噬菌体并用于感染细菌以产生噬菌体用于其它轮次的选择。关于综述，参见例如Hoogenboom,2002,Methods.Mol.Biol.178:1-37；以及Bradbury和Marks,2004,J.Immunol.Methods 290:29-49。
在酵母展示系统中(参见，例如，Boder等人,1997,Nat.Biotech.15:553–57；以及Chao等人,2006,Nat.Protocols 1:755-68)，抗体可展示为单链可变融合体(scFv)，其中重链和轻链通过柔性接头连接。scFv与酵母凝集素蛋白Aga2p的粘附亚基融合，所述酵母凝集素蛋白Aga2p通过与Aga1p的二硫键连接至酵母细胞壁。经由Aga2p展示蛋白质可使蛋白质突出远离细胞表面，从而最大限度地减少与酵母细胞壁上的其它分子的潜在相互作用。磁性分离和流式细胞术用于筛选文库以选择具有改进的亲和力或稳定性的抗体。通过用生物素化抗原标记酵母和与荧光团缀合的第二试剂如链霉抗生物素蛋白来确定与目标可溶性抗原的结合。可通过对scFv侧翼的血凝素或c-Myc表位标签进的免疫荧光标记来测量抗体的表面表达的变化。已经显示表达与展示的蛋白质的稳定性相关，并且因此可针对改进的稳定性以及亲和力选择抗体(参见，例如，Shusta等人,1999,J.Mol.Biol.292:949-56)。酵母展示的另一个优点是展示的蛋白质在真核酵母细胞的内质网中折叠，从而利用内质网分子伴侣和质量控制机制。一旦成熟完成，抗体亲和力就可方便地“滴定”，同时展示在酵母表面上，从而消除对每个克隆的表达和纯化的需要。酵母表面展示的理论限制是可能比其它展示方法更小的功能文库大小；然而，最近的方法使用酵母细胞的交配系统来产生估计大小为1014的组合多样性(参见例如，美国专利公布2003/0186374；和Blaise等人,2004,Gene342:211-18)。
在核糖体展示中，产生抗体-核糖体-mRNA(ARM)复合物用于在无细胞系统中进行选择。编码特定抗体文库的DNA文库与缺少终止密码子的间隔区序列遗传融合。当翻译时，此间隔区序列仍然连接至肽基tRNA并占据核糖体通道，并且因此允许目标蛋白质突出核糖体并折叠。所得到的mRNA、核糖体和蛋白质的复合物可与表面结合的配体结合，从而允许通过与配体的亲和捕获同时分离抗体及其编码mRNA。然后将核糖体结合的mRNA逆转录回cDNA中，其然后可经历诱变并用于下一轮选择(参见，例如，Fukuda等人,2006,Nucleic AcidsRes.34:e127)。在mRNA展示中，使用嘌呤霉素作为衔接子分子建立抗体与mRNA之间的共价键(Wilson等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:3750-55)。
由于这些方法完全在体外进行，因此与其它选择技术相比，它们提供两个主要优点。首先，文库的多样性不受细菌细胞的转化效率限制，而仅受试管中存在的核糖体和不同mRNA分子的数量限制。其次，在每轮选择后可例如通过非校对聚合酶容易地引入随机突变，因为在任何多样化步骤之后不必转化文库。
在哺乳动物细胞展示系统中(参见，例如，Bowers等人,2011,Proc Natl Acad SciUSA.108:20455-60)，基于与预先组合的D(J)区连接的种系序列V基因区段构建完整的人IgG文库。将用于重链和轻链的全长V区与人重链和轻链恒定区组装并转染到哺乳动物细胞系(例如HEK293)中。使转染的文库扩增并针对链霉抗生物素蛋白(SA)偶联的磁珠进行几轮负选择，然后针对用生物素化的靶蛋白、肽片段或表位包被的SA偶联的磁珠进行一轮正选择。将正选择的细胞扩增，且然后通过多轮FACS进行分选以分离展示特异性地结合至所述靶蛋白、肽片段或表位的抗体的单细胞克隆。将来自这些单细胞克隆的重链和轻链对用AID再转染以进一步成熟。几轮哺乳动物细胞展示与AID触发的体细胞超突变结合，从而产生高特异性、高亲和力抗体。
还可以靶向方式或经由随机引入将多样性引入抗体文库的CDR或整个V基因中。前者方法包括经由高或低水平的诱变顺序地靶向抗体的所有CDR或靶向体细胞超突变的分离的热点(参见，例如，Ho等人,2005,J.Biol.Chem.280:607-17)或疑似在实验基础或结构原因上影响亲和力的残基。在一个具体实施方案中，体细胞超突变通过AID触发的体细胞超突变进行，例如使用SHM-XELTM平台(AnaptysBio,San Diego,CA)。可使用大肠杆菌突变体菌株、使用DNA聚合酶的易错复制(参见，例如，Hawkins等人,1992,J.Mol.Biol.226:889-96)或RNA复制酶在整个V基因中引入随机突变。还可通过经由DNA改组或类似技术置换天然多样化的区域来引入多样性(参见，例如，Lu等人,2003,J.Biol.Chem.278:43496-507；美国专利号5,565,332和6,989,250)。替代技术延伸到框架区残基中的靶高变环(参见，例如，Bond等人,2005,J.Mol.Biol.348:699-709)在CDR中使用环缺失和插入或使用基于杂交的多样化(参见例如，美国专利公布号2004/0005709)。在CDR中产生多样性的另外方法公开于例如美国专利号7,985,840中。可用于产生抗体文库和/或抗体亲和力成熟的其它方法公开于例如美国专利号8,685,897和8,603,930以及美国公布号2014/0170705、2014/0094392、2012/0028301、2011/0183855和2009/0075378中，其各自以引用的方式并入本文。
文库的筛选可通过本领域中已知的各种技术来完成。例如，PD-1可固定到固体载体、柱、针或纤维素/聚(偏二氟乙烯)膜/其它过滤器上，在附着于吸附板的宿主细胞上表达或用于细胞分选中，与生物素缀合以用于用链霉抗生物素蛋白包被的珠粒捕获，或用于淘选展示文库的任何其它方法中。
关于体外亲和力成熟方法的综述，参见，例如，Hoogenboom,2005,NatureBiotechnology 23:1105-16；Quiroz和Sinclair,2010,Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51；以及其中的参考文献。
4.3.2.2抗PD-1抗体的修饰
抗PD-1抗体的共价修饰包括在本公开的范围内。共价修饰包括使抗PD-1抗体的靶向氨基酸残基与能够与选择的侧链或抗PD-1抗体的N-或C-末端残基反应的有机衍生剂反应。其它修饰包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺化为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基；脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(参见例如，Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties 79-86(1983))；N-末端胺的乙酰化以及任何C-末端羧基的酰胺化。
包括在本公开范围内的抗PD-1抗体的其它类型的共价修饰包括改变抗体或多肽的天然糖基化模式(参见例如，Beck等人,2008,Curr.Pharm.Biotechnol.9:482-501；和Walsh,2010,Drug Discov.Today 15:773-80)，以及将抗体以例如美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；或4,179,337中所述的方式连接至多种非蛋白质聚合物中的一种(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯)。
还可修饰本公开的抗PD-1抗体以形成嵌合分子，所述嵌合分子包含与另一种异源多肽或氨基酸序列，例如，表位标签(参见例如，Terpe,2003,Appl.Microbiol.Biotechnol.60:523-33)或IgG分子的Fc区(参见例如，Aruffo,Antibody Fusion Proteins 221-42(Chamow和Ashkenazi编辑,1999))融合的抗PD-1抗体。
本文还提供了融合蛋白，所述融合蛋白包含本文提供的抗体，所述抗体结合至PD-1抗原和异源多肽。在一些实施方案中，与抗体融合的异源多肽可用于使抗体靶向具有细胞表面表达的PD-1的细胞。
本文还提供了结合至PD-1抗原的抗体组。在具体实施方案中，所述抗体组具有不同的缔合速率、不同的解离速率、对PD-1抗原的不同亲和力和/或对PD-1抗原的不同特异性。在一些实施方案中，所述组包含约10、约25、约50、约75、约100、约125、约150、约175、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950或约1000种抗体或更多，或由其组成。例如，可在96孔或384孔板中使用抗体组用于诸如ELISA的测定。
4.3.3抗PD-1抗体的制备
可通过培养用含有抗PD-1抗体编码核酸的载体转化或转染的细胞来产生抗PD-1抗体。编码本公开的抗体的多肽组分的多核苷酸序列可使用标准重组技术获得。可从产生抗体的细胞如杂交瘤细胞中分离所需的多核苷酸序列并进行测序。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，就将编码多肽的序列插入能够在宿主细胞中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域中可获得和已知的许多载体可用于本公开的目的。适当载体的选择将主要取决于待插入载体中的核酸的大小和待用所述载体转化的特定宿主细胞。适用于表达本公开的抗体的宿主细胞包括原核生物如古细菌和真细菌，包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物；真核微生物如丝状真菌或酵母；无脊椎动物细胞如昆虫或植物细胞；以及脊椎动物细胞如哺乳动物宿主细胞系。将宿主细胞用上述表达载体转化并在被调节为适合诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。使用本领域中已知的标准蛋白质纯化方法纯化由宿主细胞产生的抗体。
用于抗体产生(包括载体构建、表达和纯化)的方法进一步描述于Plückthun等人,Antibody Engineering:Producing antibodies in Escherichia coli:From PCR to fermentation 203-52(McCafferty等人编辑,1996)；Kwong和Rader,E.coli Expressionand Purification of Fab Antibody Fragments,Current Protocols in Protein Science(2009)；Tachibana和Takekoshi,Production of Antibody Fab Fragments inEscherischia coli,Antibody Expression and Production(Al-Rubeai编辑,2011)；以及Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An编辑,2009)。
当然，预期可采用本领域中熟知的替代方法来制备抗PD-1抗体。例如，适当的氨基酸序列或其部分可通过使用固相技术的直接肽合成来产生(参见例如，Stewart等人,Solid-Phase Peptide Synthesis(1969)；以及Merrifield,1963,J.Am.Chem.Soc.85:2149-54)。可使用人工技术或通过自动化进行体外蛋白质合成。抗PD-1抗体的不同部分可单独化学合成并使用化学或酶促方法组合以产生所需的抗PD-1抗体。或者，可从工程化为表达抗体的转基因动物的细胞或体液(如乳)中纯化抗体，例如，如美国专利号5,545,807和5,827,690中所公开。
4.3.4免疫缀合物
本公开还提供了缀合物，所述缀合物包含通过合成接头与一种或多种非抗体剂共价结合的本公开的抗PD-1抗体中的任一种。
在一些实施方案中，本文提供的抗体与例如诊断或可检测分子缀合或重组融合。所述缀合的或重组融合的抗体可用于例如监测或预测PD-1介导的疾病的发作、发展、进展和/或严重程度。
此类诊断和检测可例如通过将抗体偶联至可检测的物质来完成，所述可检测的物质包括但不限于：各种酶，如但不限于，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，如但不限于，链霉抗生物素蛋白/生物素或抗生物素蛋白/生物素；荧光物质，如但不限于，伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质，如但不限于，鲁米诺；生物发光物质，如但不限于，荧光素酶、荧光素或水母发光蛋白；化学发光物质，如但不限于基于吖啶的化合物或HALOTAG；放射性物质，如但不限于，碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga和67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn或117Sn；使用不同的正电子放射断层造影术的正电子发射金属；以及非放射性顺磁金属离子。
本文还描述了与异源蛋白质或多肽(或其片段，例如，与约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100个氨基酸的多肽)重组融合或化学缀合(共价或非共价缀合以产生融合蛋白的抗体，以及其用途。特别地，本文提供了融合蛋白，所述融合蛋白包含本文提供的抗体的抗原结合片段(例如，Fab片段、Fc片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR)和异源蛋白质、多肽或肽。在一个实施方案中，所述抗体与其融合的异源蛋白质、多肽或肽可用于使抗体靶向特定细胞类型，如表达PD-1的细胞。例如，与由特定细胞类型表达的细胞表面受体结合的抗体可与本文提供的修饰的抗体融合或缀合。
此外，本文提供的抗体可与标记物或“标签”序列(如肽)融合，以促进纯化。在具体实施方案中，所述标记物或标签氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体(参见例如，QIAGEN,Inc.)中提供的标签等，其中许多标记物可商购获得。例如，如Gentz等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-24中所描述，六组氨酸提供融合蛋白的方便纯化。用于纯化的其它肽标签包括但不限于：对应于源自流感血凝素蛋白的表位的血凝素“HA”标签(Wilson等人,1984,Cell 37:767-78)以及“FLAG”标签。
用于将部分(包括多肽)融合或缀合至抗体的方法是已知的(参见例如，Arnon等人,Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 243-56(Reisfeld等人编辑,1985)；Hellstrom等人,Antibodies for Drug Delivery,Controlled Drug Delivery 623-53(Robinson等人编辑,第2版1987)；Thorpe,Antibody Carriers of Cytotoxic Agents inCancer Therapy:A Review,Monoclonal Antibodies:Biological and Clinical Applications 475-506(Pinchera等人编辑,1985)；Analysis,Results,and FutureProspective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in CancerTherapy,Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy 303-16(Baldwin等人编辑,1985)；Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.62:119-58；美国专利号5,336,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851；5,723,125；5,783,181；5,908,626；5,844,095；以及5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；EP 394,827；PCT公布WO 91/06570、WO 96/04388、WO 96/22024、WO97/34631和WO99/04813；Ashkenazi等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:10535-39；Traunecker等人,1988,Nature,331:84-86；Zheng等人,1995,J.Immunol.154:5590-600；以及Vil等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:11337-41)。
可例如通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的技术来产生融合蛋白。DNA改组可用于改变如本文提供的抗PD-1抗体的活性，包括例如具有更高亲和力和更低解离速率的抗体(参见例如，美国专利号5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；和5,837,458；Patten等人,1997,Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson等人,1999,J.Mol.Biol.287:265-76；以及Lorenzo和Blasco,1998,Biotechniques 24(2):308-13)。抗体或者所编码的抗体可通过在重组之前通过易错PCR、随机核苷酸插入或其它方法进行随机诱变而改变。编码本文提供的抗体的多核苷酸可与一种或多种异源分子的一个或多个组分、基序、区段、部分、结构域、片段等进行重组。
本文提供的抗体还可与二级抗体缀合以形成抗体异缀合物，如例如美国专利号4,676,980中所描述。
如本文提供的结合至PD-1的抗体还可连接至特别有用于靶抗原的免疫测定或纯化的固体载体。此类固体载体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
接头可以是促进缀合剂在细胞中的释放的“可裂解接头”，但本文也考虑了不可裂解的接头。用于本公开的缀合物的接头包括但不限于酸不稳定接头(例如，腙接头)、含二硫化物的接头、肽酶敏感性接头(例如，包含氨基酸，例如缬氨酸和/或瓜氨酸如瓜氨酸-缬氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸的肽接头)、光不稳定接头、二甲基接头(参见例如，Chari等人,1992,Cancer Res.52:127-31；和美国专利号5,208,020)、硫醚接头或被设计用于逃避多药转运蛋白介导的抗性的亲水性接头(参见例如，Kovtun等人,2010,Cancer Res.70:2528-37)。
抗体和剂的缀合物可使用多种双功能蛋白偶联剂制备，所述偶联剂如BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。本公开进一步考虑，抗体和剂的缀合物可使用如本领域中公开的任何合适的方法来制备(参见例如，Bioconjugate Techniques(Hermanson编辑,第2版2008))。
抗体和剂的常规缀合策略一直是基于涉及Lys残基的ε-氨基或Cys残基的硫醇基的随机缀合化学，其产生异源缀合物。最近开发的技术允许与抗体的位点特异性缀合，从而产生均匀负载并避免具有改变的抗原结合或药代动力学的缀合物亚群。这些包括“thiomab”的工程化，thiomab在重链和轻链上的位置处包含半胱氨酸取代，所述取代提供反应性硫醇基并且不破坏免疫球蛋白折叠和组装或改变抗原结合(参见例如，Junutula等人,2008,J.Immunol.Meth.332:41-52；和Junutula等人,2008,Nature Biotechnol.26:925-32)。在另一种方法中，通过将终止密码子UGA从终止重新编码至硒代半胱氨酸插入来将硒代半胱氨酸共翻译插入抗体序列中，从而允许在其它天然氨基酸存在下在硒代半胱氨酸的亲核硒醇基团处的位点特异性共价缀合(参见例如，Hofer等人,2008,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:12451-56；以及Hofer等人,2009,Biochemistry 48(50):12047-57)。
4.4使用抗体及其组合物的方法
本文提供了治疗对象的免疫病症的方法。在某些实施方案中，所述方法包括以有效治疗所述免疫病症的量向所述对象施用本文提供的PD-1结合蛋白。本文还提供了管理对象的免疫病症的方法。在某些实施方案中，所述方法包括以有效管理所述免疫病症的量向所述对象施用本文提供的PD-1结合蛋白。本文还提供了预防对象的免疫病症的方法。在某些实施方案中，所述方法包括以有效预防所述免疫病症的量向所述对象施用本文提供的PD-1结合蛋白。在一些实施方案中，所述对象患有免疫病症。在其它实施方案中，所述对象处于患有免疫病症的风险。在一个实施方案中，所述对象是有需要的对象。在一个具体实施方案中，所述PD-1结合蛋白是本文提供的PD-1抗体。在某些实施方案中，所述PD-1结合蛋白是本文提供的PD-1抗体的抗原结合片段。
在本文提供的各种方法的一些实施方案中，免疫病症是炎性疾病。在一个实施方案中，所述炎性疾病是葡萄膜炎。在本文提供的各种方法的具体实施方案中，所述免疫病症是自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、克罗恩氏病、银屑病、银屑病性关节炎、多发性硬化、狼疮、强直性脊柱炎、I型糖尿病、斯耶格伦氏综合征、溃疡性结肠炎、视神经脊髓炎、乳糜泻、硬皮病以及颞动脉炎。在一些实施方案中，狼疮是SLE、CLE或狼疮性肾炎。在本文提供的各种方法的其它实施方案中，所述免疫病症是过敏性疾病，包括例如特应性皮炎、超敏性血管炎和过敏症，例如过敏性哮喘、过敏性鼻炎(枯草热)、荨麻疹(urticaria)(荨麻疹(hives))和过敏反应。在某些实施方案中，所述超敏性疾病是T细胞超敏性疾病。
在本文提供的各种方法的一些实施方案中，所述免疫病症是自身免疫性疾病。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是克罗恩氏病。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是银屑病。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是多发性硬化症。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是强直性脊柱炎。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是I型糖尿病。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是斯耶格伦氏综合征。在另一实施方案中，所述自身免疫性疾病是溃疡性结肠炎。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是视神经脊髓炎。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是乳糜泻。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是颞动脉炎。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是硬皮病。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是SLE。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是CLE。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是狼疮性肾炎。
在一些实施方案中，所述免疫病症是超敏性疾病。在某些实施方案中，所述超敏性疾病是T细胞超敏性疾病。在一个实施方案中，所述免疫病症是特应性皮炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是超敏性血管炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是过敏症。在一个实施方案中，所述免疫病症是过敏性哮喘。在另一个实施方案中，所述免疫病症是过敏性鼻炎(枯草热)。在另一个实施方案中，所述免疫病症是荨麻疹(荨麻疹)。在某些实施方案中，所述免疫病症是过敏反应。
当关于对象的免疫病症使用时，术语“T细胞超敏性”是指瞬时或慢性异常高水平的T细胞效应子功能。在某些实施方案中，T细胞效应子功能包括TH2细胞因子的分泌。示例性TH2细胞因子包括但不限于IL-2、IL-4、IL-9、IL-13、IL-31和TSLP。在一个实施方案中，TH2细胞因子是IL-2。在另一个实施方案中，TH2细胞因子是IL-4。在另一个实施方案中，TH2细胞因子是IL-9。在另一个实施方案中，TH2细胞因子是IL-13。在一个实施方案中，TH2细胞因子是IL-31。在另一个实施方案中，TH2细胞因子是TSLP。在一些实施方案中，所述对象患有瞬时或慢性异常高水平的两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种不同的TH2细胞因子。在一些实施方案中，所述对象具有瞬时或慢性异常高水平的两种、三种、四种、五种或六种选自由IL-2、IL-4、IL-9、IL-13、IL-31和TSLP组成的组的细胞因子。
在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用结合至PD-1的抗体，所述PD-1包括PD-1多肽、PD-1多肽片段、PD-1肽或PD-1表位。在某些实施方案中，所述抗体结合至人和/或食蟹猴PD-1。在其它实施方案中，所述抗体不结合至啮齿动物PD-1(例如，小鼠PD-1)。在一个实施方案中，抗体结合至人PD-1。在另一个实施方案中，抗体结合至食蟹猴PD-1。在另一个实施方案中，所述抗体结合至人PD-1和食蟹猴PD-1。在一些实施方案中，所述抗体结合至人PD-1并且不结合至啮齿动物PD-1(例如，小鼠PD-1)。在一些实施方案中，所述抗体结合至食蟹猴PD-1并且不结合至啮齿动物PD-1(例如，小鼠PD-1)。在一些实施方案中，所述抗体结合至人PD-1、结合至食蟹猴PD-1，并且不结合至啮齿动物PD-1(例如，小鼠PD-1)。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体不阻断PD-L1与PD-1多肽的结合。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体不阻断PD-L2与PD-1多肽的结合。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体不阻断PD-L1或PD-L2与PD-1多肽的结合。在其它实施方案中，所述抗PD-1抗体是结合PD-1的人源化抗体(例如，包含人恒定区)，所述PD-1包括PD-1多肽、PD-1多肽片段、PD-1肽或PD-1表位。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含本文提供的任一种鼠单克隆抗体的VH区、VL区、VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3，如表1-6中描绘的氨基酸序列。因此，在一些实施方案中，本文提供的分离的抗体或其功能片段包含来自以下的一个、两个和/或三个重链CDR和/或一个、两个和/或三个轻链CDR：(a)抗体PD1AB-1，(b)抗体PD1AB-2，(c)抗体PD1AB-3，(d)抗体PD1AB-4，(e)抗体PD1AB-5，或(f)抗体PD1AB-6，如表1-2中所示。
在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用抗体，所述抗体包含六个CDR或由其组成，例如，表1-2中鉴别的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VLCDR3。在一些实施方案中，所述抗体可包含少于6个CDR。在一些实施方案中，所述抗体包含一个、两个、三个、四个或五个CDR或由其组成，所述CDR选自由表1-2中鉴别的VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3组成的组。在一些实施方案中，所述抗体包含一个、两个、三个、四个或五个CDR或由其组成，所述CDR选自由单克隆抗体的VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3组成的组，所述单克隆抗体选自由以下组成的组：本文描述的(a)抗体PD1AB-1，(b)抗体PD1AB-2，(c)抗体PD1AB-3，(d)抗体PD1AB-4，(e)抗体PD1AB-5，以及(f)抗体PD1AB-6。因此，在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用抗体，所述抗体包含表1-2中鉴别的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3中的任一者的一个、两个、三个、四个或五个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用抗体，所述抗体包含表2中列出的一个或多个(例如，一个、两个或三个)VH CDR。在其它实施方案中，所述抗体包含表1中列出的一个或多个(例如，一个、两个或三个)VL CDR。在其它实施方案中，所述抗体包含表2中列出的一个或多个(例如，一个、两个或三个)VH CDR和表1中列出的一个或多个VL CDR。因此，在一些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH CDR1。在一些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR2。在一些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3。在一些实施方案中，所述抗体包含独立地选自如表2中描绘的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3氨基酸序列中的任一个的VH CDR1和/或VH CDR2和/或VH CDR3。在一些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:1和7中的任一个的氨基酸序列的VL CDR1。在另一个实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL CDR2。在一些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗体包含独立地选自如表1中描绘的VL CDR1、VLCDR2、VL CDR3氨基酸序列中的任一个的VL CDR1和/或VL CDR2和/或VL CDR3。
在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用包含VH区的抗体，所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VHCDR2；(3)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3；以及VL区，所述VL区包含：(1)具有SEQID NO:1的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL CDR2；以及(3)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL CDR3。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR2；(3)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3；以及VL区，所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL CDR2；以及(3)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR2；以及(3)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL CDR2；以及(3)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL CDR2；以及(3)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL CDR3。
在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用抗体，所述抗体包含表1-2中列出的一个或多个(例如，一个、两个或三个)VH CDR和一个或多个(例如，一个、两个或三个)VL CDR。在特定实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)和VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)和VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)和VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)和VLCDR2(SEQ ID NO:2)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VLCDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VLCDR2(SEQ ID NO:2)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)以及VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VLCDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VHCDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR3(SEQ IDNO:3)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VHCDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VHCDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VL CDR2(SEQ IDNO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQID NO:1或7)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ IDNO:4)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VL CDR3(SEQ IDNO:3)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VHCDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ IDNO:1或7)和VL CDR2(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ IDNO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)和VLCDR3(SEQ ID NO:3)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ IDNO:1或7)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VH CDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR1(SEQ ID NO:4)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ IDNO:3)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR2(SEQ ID NO:5)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQ ID NO:3)。在其它实施方案中，所述抗体包含VHCDR3(SEQ ID NO:6)、VL CDR1(SEQ ID NO:1或7)、VL CDR2(SEQ ID NO:2)和VL CDR3(SEQID NO:3)。在另一个实施方案中，所述抗体包含表1-2中列出的VH CDR和VL CDR的任何组合。
在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用包含本文公开的CDR的抗体，所述CDR包括含源自相关抗体组的共有序列(参见例如，表1-2)。
在其它实施方案中，本文提供的各种方法包括施用抗体(或其功能片段)，所述抗体或其功能片段还包含来自以下的一个、两个、三个和/或四个重链FR和/或一个、两个、三个和/或四个轻链FR：(a)抗体PD1AB-1，(b)抗体PD1AB-2，(c)抗体PD1AB-3，(d)抗体PD1AB-4，(e)抗体PD1AB-5，或(f)抗体PD1AB-6，如表3-4中所示。
在某些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用抗体(或其功能片段)，所述抗体或其功能片段还包含来自以下的一个、两个、三个和/或四个重链FR：(a)抗体PD1AB-1，(b)抗体PD1AB-2，(c)抗体PD1AB-3，(d)抗体PD1AB-4，(e)抗体PD1AB-5，或(f)抗体PD1AB-6，如表4中所示。在一些实施方案中，所述抗体重链FR来自抗体PD1AB-1。在一些实施方案中，所述抗体重链FR来自抗体PD1AB-2。在其它实施方案中，所述抗体重链FR来自抗体PD1AB-3。在某些实施方案中，所述抗体重链FR来自抗体PD1AB-4。在其它实施方案中，所述抗体重链FR来自抗体PD1AB-5。在另一个实施方案中，所述抗体重链FR来自抗体PD1AB-6。
在其它实施方案中，本文提供的各种方法包括施用抗体(或其功能片段)，所述抗体或其功能片段还包含来自以下的一个、两个、三个和/或四个轻链FR：(a)抗体PD1AB-1，(b)抗体PD1AB-2，(c)抗体PD1AB-3，(d)抗体PD1AB-4，(e)抗体PD1AB-5，或(f)抗体PD1AB-6，如表3中所示。在一些实施方案中，所述抗体轻链FR来自抗体PD1AB-1。在一些实施方案中，所述抗体轻链FR来自抗体PD1AB-2。在其它实施方案中，所述抗体轻链FR来自抗体PD1AB-3。在某些实施方案中，所述抗体轻链FR来自抗体PD1AB-4。在其它实施方案中，所述抗体轻链FR来自抗体PD1AB-5。在另一个实施方案中，所述抗体轻链FR来自抗体PD1AB-6。
在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用包含VH区的抗体，所述VH区包含或还包含：(1)具有选自由SEQ ID NO:19和24组成的组的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有选自由SEQ ID NO:21和23组成的组的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH FR4。在某些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含或还包含：(1)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VHFR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH FR4。在某些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含或还包含：(1)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH FR4。在某些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含或还包含：(1)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH FR4。在某些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含或还包含：(1)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的VH FR4。在具体实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。
因此，在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用人源化抗体，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有选自由SEQ ID NO:19和24组成的组的氨基酸序列的VHFR1。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH FR1。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有SEQID NO:24的氨基酸序列的VH FR1。在一些实施方案中，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2。在一些实施方案中，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有选自由SEQ ID NO:21和23组成的组的氨基酸序列的VH FR3。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH FR3。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH FR3。在其它实施方案中，所述人源化抗体包含VH区，所述VH区包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH FR4。
在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用包含VL区的抗体，所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有选自由SEQ ID NO:16和18组成的组的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述VL区包含：(1)具有SEQ IDNO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQID NO:16的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在其它实施方案中，所述VL区包括含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。
因此，在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用人源化抗体，所述人源化抗体包含VL区，所述VL区包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1。在某些实施方案中，所述人源化抗体包含VL区，所述VL区包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL FR2。在其它实施方案中，所述人源化抗体包含VL区，所述VL区包含具有选自由SEQ ID NO:16和18组成的组的氨基酸序列的VL FR3。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含VL区，所述VL区包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL FR3。在其它实施方案中，所述人源化抗体包含VL区，所述VL区包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL FR3。在其它实施方案中，所述人源化抗体包含VL区，所述VL区包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。
在其它实施方案中，本文提供的各种方法包括施用包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含：(1)具有选自由SEQ ID NO:19和24组成的组的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有选自由SEQ ID NO:21和23组成的组的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH FR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有选自由SEQ ID NO:16和18组成的组的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在某些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的VH FR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VLFR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的VH FR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VLFR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在其它实施方案中，本文提供的各种方法包括施用包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的VH FR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VLFR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的VH FR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VLFR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在某些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的VH FR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VLFR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的VH FR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VLFR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在其它实施方案中，本文提供的各种方法包括施用包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的VH FR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VLFR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在某些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH FR1；(2)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH FR2；(3)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH FR3；和/或(4)具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的VH FR4；并且其中所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL FR1；(2)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL FR2；(3)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL FR3；和/或(4)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL FR4。在一些实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VLFR4。在其它实施方案中，所述抗体包含VH区，所述VH区包含所有四种上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4；以及VL区，所述VL区包含所有四种上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在某些实施方案中，本文提供的方法包括施用抗体，所述抗体包含表3-4中列出的一个或多个(例如，一个、两个、三个或四个)VH FR和一个或多个(例如，一个、两个、三个或四个)VL FR。特别地，在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)和VLFR1(SEQ ID NO:14)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)和VLFR2(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)和VLFR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)和VLFR1(SEQ ID NO:14)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)和VL FR3(SEQID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)和VL FR4(SEQID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21)和VL FR1(SEQ IDNO:14)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR1(SEQ ID NO:14)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)和VLFR1(SEQ ID NO:14)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VHFR2(SEQ ID NO:20)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQID NO:21或23)和VL FR1(SEQ ID NO:14)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VLFR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VHFR1(SEQ ID NO:19或24)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR1(SEQID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ IDNO:20)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR2(SEQID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ IDNO:20)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VLFR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VLFR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VHFR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)、VLFR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VHFR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ IDNO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ IDNO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)和VL FR1(SEQ ID NO:14)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ IDNO:21)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR1(SEQ ID NO:14)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR3(SEQ IDNO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR1(SEQ ID NO:14)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VHFR4(SEQ ID NO:22)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VHFR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR1(SEQ ID NO:14)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VHFR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VLFR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VHFR2(SEQ ID NO:20)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR2(SEQ IDNO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VLFR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ IDNO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQID NO:21)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VLFR3(SEQ ID NO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR3(SEQID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQID NO:19或24)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VLFR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VHFR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ IDNO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VHFR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ IDNO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ IDNO:21)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VLFR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR2(SEQ ID NO:15)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VLFR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VHFR4(SEQ ID 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FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ IDNO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VHFR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ IDNO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ IDNO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VLFR1(SEQ ID NO:14)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ IDNO:21或23)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VHFR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR3(SEQID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VLFR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ IDNO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ IDNO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VLFR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在一些实施方案中，所述抗体包含VHFR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ IDNO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ IDNO:22)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VLFR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR3(SEQ ID NO:16或18)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VLFR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ IDNO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR2(SEQID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VLFR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VHFR2(SEQ ID NO:20)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在其它实施方案中，所述抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:19或24)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VLFR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQID NO:17)。在一个实施方案中，所述抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:20)、VH FR3(SEQ ID NO:21或23)、VH FR4(SEQ ID NO:22)、VL FR1(SEQ ID NO:14)、VL FR2(SEQ ID NO:15)、VL FR3(SEQ ID NO:16或18)和VL FR4(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述抗体包含表3-4中列出的VH FR(SEQ ID NO:19-24)和VL FR(SEQ ID NO:14-18)的任何组合。
在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用包含VH区或VH结构域的抗体。在其它实施方案中，所述抗体包含VL区或VL结构域。在某些实施方案中，所述抗体具有(i)VH结构域或VH区；和/或(ii)VL结构域或VL区的组合。可用于所述方法的抗体的示例性VH区、VH结构域、VL区和VL结构域在本文其它地方阐述。在一些实施方案中，所述抗体具有选自由表5-6中列出的SEQ ID NO:8-13组成的组的(i)VH结构域或VH区；和/或(ii)VL结构域或VL区的组合。在其它实施方案中，本文提供的抗体具有如表5-6中列出的抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的(i)VH结构域或VH区；和/或(ii)VL结构域或VL区的组合。
在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用包含VH区的抗体，所述VH区包含：(1)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VHCDR2；和(3)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3；以及VL区，所述VL区选自由表5中列出的SEQ ID NO:8-10组成的组。在一些实施方案中，所述VL区具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述VL区具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL区具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在其它实施方案中，本文提供的各种方法包括施用抗体，所述抗体包含VH区，所述VH区选自由表6中列出的SEQ ID NO:11-13组成的组；以及VL区，所述VL区包含：(1)具有选自由SEQ ID NO:1和7组成的组的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL CDR3。在其它实施方案中，本文提供的各种方法包括施用抗体，所述抗体包含VH区，所述VH区选自由表6中列出的SEQ ID NO:11-13组成的组；以及VL区，所述VL区包含：(1)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL CDR2；以及(3)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL CDR3。在其它实施方案中，本文提供的各种方法包括施用抗体，所述抗体包含VH区，所述VH区选自由表6中列出的SEQ ID NO:11-13组成的组；以及VL区，所述VL区包含：(1)具有SEQID NO:7的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL CDR2；以及(3)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方案中，所述VH区具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH区具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH区具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用抗体，所述抗体包含PD1AB-1的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:11的VH氨基酸序列和SEQ IDNO:8的VL氨基酸序列。在其它实施方案中，所述抗体具有PD1AB-2的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:11的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:9的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体具有PD1AB-3的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:12的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:10的VL氨基酸序列。在其它实施方案中，所述抗体具有PD1AB-4的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:12的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:9的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体具有PD1AB-5的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:13的VH氨基酸序列和SEQID NO:9的VL氨基酸序列。在其它实施方案中，所述抗体具有PD1AB-6的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:13的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:8的VL氨基酸序列。在某些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用包含轻链和重链的抗体，所述抗体特异性地结合至PD-1多肽(例如，PD-1、例如人PD-1的ECD)，其中所述轻链包含具有SEQ IDNO:41的氨基酸序列的恒定区。在其它实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，其中所述重链包含具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的人IgG1Fc区。在一些实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，其中所述重链不包含具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的人IgG1Fc区。在某些实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，其中所述重链包含具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的人IgG1-K322A Fc区。在一些实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，其中所述重链包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的人IgG4Fc区。在另一个实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，其中所述重链包含具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的人IgG4P Fc区。在另一个实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，其中所述重链包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的人IgG4PE Fc区。在一些实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，其中所述重链不包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的人IgG4PE Fc区。在另一个实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，其中所述轻链包含具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的恒定区；并且所述重链包含具有选自由SEQ ID NO:36-40组成的组的氨基酸序列的Fc区。
在一些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用包含轻链和重链的抗体，其中所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，其中所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，其中所述重链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，其中所述重链包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，其中所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，其中(i)所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；并且(ii)所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在另一个特定实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，其中(i)所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；并且(ii)所述重链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在另一个特定实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，其中(i)所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；并且(ii)所述重链包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在另一个特定实施方案中，所述抗体包含轻链和重链，其中(i)所述轻链包含SEQID NO:31的氨基酸序列；并且(ii)所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本文提供的各种方法包括施用抗体，所述抗体与示例性抗体或功能片段中的一者竞争结合至本文提供的PD-1。此类抗体还可与本文所例示的抗体中的一种结合至相同表位或重叠表位。预期与所例示的抗体竞争或结合至相同表位的抗体和片段显示类似的功能性质。所例示的抗原结合蛋白和片段包括具有VH区和VL区以及本文提供的CDR的那些，包括表1-6中的那些。因此，作为一个具体实例，可用于本文提供的方法中的抗体包括与包含以下的抗体竞争的那些抗体：(a)针对表1-2中列出的抗体列出的1、2、3、4、5或全部6个CDR；(b)选自针对表5-6中列出的抗体列出的VH区和VL区的VH和VL；或(c)包含如针对表5-6中列出的抗体指定的VH和VL的两条轻链和两条重链。在一些实施方案中，所述抗体是PD1AB-1。在一些实施方案中，所述抗体是PD1AB-2。在一些实施方案中，所述抗体是PD1AB-3。在一些实施方案中，所述抗体是PD1AB-4。在一些实施方案中，所述抗体是PD1AB-5。在一些实施方案中，所述抗体是PD1AB-6。
因此，本文提供了一种治疗对象的免疫病症的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-1。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-2。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-4。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-5。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-6。本文还提供了一种治疗对象的免疫病症的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的抗PD-1抗体的抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗原结合片段是PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6抗体的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-1的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-2的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-3的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-4的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-5的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-6的片段。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-1的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-1的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-1的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-1的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-2的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-2的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-2的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-2的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-3的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-3的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-3的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-3的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-4的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-4的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-4的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-4的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-5的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-5的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-5的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-5的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-6的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-6的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-6的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-6的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含SEQID NO:8的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含SEQID NO:13的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及重链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及重链，所述重链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含人IgG1恒定区。在一个具体实施方案中，所述IgG1恒定区包含K322A取代。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-6-K3(PD1AB-6-K322A)。在一些实施方案中，所述对象患有免疫病症。在其它实施方案中，所述对象处于患有免疫病症的风险。在本文提供的方法的某些实施方案中，所述方法产生对象的免疫病症的一种或多种症状的缓解。在一个实施方案中，所述对象是有需要的对象。在一些实施方案中，所述免疫病症是炎性疾病。在一个实施方案中，所述免疫病症是葡萄膜炎。在某些实施方案中，所述免疫病症是自身免疫性疾病。在一个实施方案中，所述免疫病症是类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是克罗恩氏病。在另一个实施方案中，所述免疫病症是银屑病。在另一个实施方案中，所述免疫病症是银屑病性关节炎。在其它实施方案中，所述免疫病症是多发性硬化。在另一个实施方案中，所述免疫病症是强直性脊柱炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是1型糖尿病。在另一个实施方案中，所述免疫病症是斯耶格伦氏综合征。在一个实施方案中，所述免疫病症是溃疡性结肠炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是视神经脊髓炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是乳糜泻。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方案中，所述免疫病症是SLE。在另一个实施方案中，所述免疫病症是CLE。在另一个实施方案中，所述免疫病症是狼疮性肾炎。在一个实施方案中，所述免疫病症是颞动脉炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是硬皮病。在一些实施方案中，所述免疫病症是超敏性疾病。在某些实施方案中，所述超敏性疾病是T细胞超敏性疾病。在一个实施方案中，所述免疫病症是特应性皮炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是超敏性血管炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是过敏症。在一个实施方案中，所述免疫病症是过敏性哮喘。在另一个实施方案中，所述免疫病症是过敏性鼻炎(枯草热)。在另一个实施方案中，所述免疫病症是荨麻疹(荨麻疹)。在某些实施方案中，所述免疫病症是过敏反应。
本文还提供了一种管理对象的免疫病症的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-1。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-2。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-4。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-5。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-6。本文还提供了一种管理对象的免疫病症的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的抗PD-1抗体的抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗原结合片段是PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6抗体的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-1的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-2的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-3的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-4的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-5的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-6的片段。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-1的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-1的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-1的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-1的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-2的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-2的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-2的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-2的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-3的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-3的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-3的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-3的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-4的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-4的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-4的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-4的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-5的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-5的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-5的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-5的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-6的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-6的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-6的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-6的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQID NO:41的氨基酸序列；以及重链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及重链，所述重链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含人IgG1恒定区。在一个具体实施方案中，所述IgG1恒定区包含K322A取代。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-6-K3(PD1AB-6-K322A)。在一些实施方案中，所述对象患有免疫病症。在其它实施方案中，所述对象处于患有免疫病症的风险。在本文提供的方法的某些实施方案中，所述方法产生对象的免疫病症的一种或多种症状的缓解。在一个实施方案中，所述对象是有需要的对象。在一些实施方案中，所述免疫病症是炎性疾病。在一个实施方案中，所述免疫病症是葡萄膜炎。在某些实施方案中，所述免疫病症是自身免疫性疾病。在一个实施方案中，所述免疫病症是类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是克罗恩氏病。在另一个实施方案中，所述免疫病症是银屑病。在另一个实施方案中，所述免疫病症是银屑病性关节炎。在其它实施方案中，所述免疫病症是多发性硬化。在另一个实施方案中，所述免疫病症是强直性脊柱炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是1型糖尿病。在另一个实施方案中，所述免疫病症是斯耶格伦氏综合征。在一个实施方案中，所述免疫病症是溃疡性结肠炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是视神经脊髓炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是乳糜泻。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方案中，所述免疫病症是SLE。在另一个实施方案中，所述免疫病症是CLE。在另一个实施方案中，所述免疫病症是狼疮性肾炎。在一个实施方案中，所述免疫病症是颞动脉炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是硬皮病。在一些实施方案中，所述免疫病症是超敏性疾病。在某些实施方案中，所述超敏性疾病是T细胞超敏性疾病。在一个实施方案中，所述免疫病症是特应性皮炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是超敏性血管炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是过敏症。在一个实施方案中，所述免疫病症是过敏性哮喘。在另一个实施方案中，所述免疫病症是过敏性鼻炎(枯草热)。在另一个实施方案中，所述免疫病症是荨麻疹(荨麻疹)。在某些实施方案中，所述免疫病症是过敏反应。
本文还提供了一种预防对象的免疫病症的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-1。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-2。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-4。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-5。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-6。本文还提供了一种预防对象的免疫病症的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的抗PD-1抗体的抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗原结合片段是PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6抗体的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-1的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-2的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-3的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-4的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-5的片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体片段是PD1AB-6的片段。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-1的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-1的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-1的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-1的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-2的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-2的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-2的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-2的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-3的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-3的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-3的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-3的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-4的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-4的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-4的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-4的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-5的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-5的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-5的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-5的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-6的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-6的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含PD1AB-6的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含PD1AB-6的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VL包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列，并且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQID NO:41的氨基酸序列；以及重链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及重链，所述重链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含人IgG1恒定区。在一个具体实施方案中，所述IgG1恒定区包含K322A取代。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体是PD1AB-6-K3(PD1AB-6-K322A)。在一些实施方案中，所述对象患有免疫病症。在其它实施方案中，所述对象处于患有免疫病症的风险。在本文提供的方法的某些实施方案中，所述方法产生对象的免疫病症的一种或多种症状的缓解。在一个实施方案中，所述对象是有需要的对象。在一些实施方案中，所述免疫病症是炎性疾病。在一个实施方案中，所述免疫病症是葡萄膜炎。在某些实施方案中，所述免疫病症是自身免疫性疾病。在一个实施方案中，所述免疫病症是类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是克罗恩氏病。在另一个实施方案中，所述免疫病症是银屑病。在另一个实施方案中，所述免疫病症是银屑病性关节炎。在其它实施方案中，所述免疫病症是多发性硬化。在另一个实施方案中，所述免疫病症是强直性脊柱炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是1型糖尿病。在另一个实施方案中，所述免疫病症是斯耶格伦氏综合征。在一个实施方案中，所述免疫病症是溃疡性结肠炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是视神经脊髓炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是乳糜泻。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是狼疮。在一个实施方案中，所述免疫病症是SLE。在另一个实施方案中，所述免疫病症是CLE。在另一个实施方案中，所述免疫病症是狼疮性肾炎。在一个实施方案中，所述免疫病症是颞动脉炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是硬皮病。在一些实施方案中，所述免疫病症是超敏性疾病。在某些实施方案中，所述超敏性疾病是T细胞超敏性疾病。在一个实施方案中，所述免疫病症是特应性皮炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是超敏性血管炎。在另一个实施方案中，所述免疫病症是过敏症。在一个实施方案中，所述免疫病症是过敏性哮喘。在另一个实施方案中，所述免疫病症是过敏性鼻炎(枯草热)。在另一个实施方案中，所述免疫病症是荨麻疹(荨麻疹)。在某些实施方案中，所述免疫病症是过敏反应。
在另一个实施方案中，本文提供的各种方法包括施用本文所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合至人PD-1或食蟹猴PD-1的区，包括表位。例如，在一些实施方案中，所述抗体结合至人PD-1的区(SEQ ID NO:42)，所述区包含人PD-1的氨基酸残基33至109。在另一方面，抗体结合至人PD-1的特定表位。
在某些实施方案中，本文提供的各种方法包括施用抗体或其抗原结合片段，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的残基100-109(SEQ ID NO:43)中的至少一个。在一些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的残基100-105(SEQ ID NO:44)中的至少一个。在特定实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的至少一个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。在一些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的至少一个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。在一些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的两个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。在其它实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的三个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。在某些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的四个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。在一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的五个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。在另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的六个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。在另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的七个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。在另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的八个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。在某些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的九个或更多个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。在其它实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的所有十个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。在另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33。在另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的T51。在一个特定实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的S57。在一个具体实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的L100。在一些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N102。在其它实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的G103。在另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ IDNO:42的氨基酸序列内的R104。在另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的G103和R104。在另一个实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的D105。在一些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的H107。在某些实施方案中，当与PD-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的S109。还考虑了上述氨基酸PD-1结合位点中的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个的任何组合。
在本文提供的各种方法的一些实施方案中，PD-1结合蛋白(例如，如本文所述的抗PD-1抗体)以有效治疗T细胞超敏性的量施用。在本文提供的各种方法的一些实施方案中，PD-1结合蛋白(例如，如本文所述的抗PD-1抗体)以有效降低不希望的或异常升高的血清/血浆促炎性细胞因子水平的量施用。在本文提供的各种方法的一些实施方案中，PD-1结合蛋白(例如，如本文所述的抗PD-1抗体)以有效活化对象中的PD-1信号传导的量施用。
在本文提供的各种方法的一些实施方案中，PD-1结合蛋白(例如，如本文所述的抗PD-1抗体)以有效下调对象中的PD-1表达的量施用。在本文提供的各种方法的一些实施方案中，PD-1结合蛋白(例如，如本文所述的抗PD-1抗体)以有效减弱对象中的T细胞活性的量施用。在一些实施方案中，治疗作用通过(a)减弱T细胞活性；和/或(b)下调PD-1表达来测量。在某些实施方案中，治疗作用通过减弱T细胞活性来测量。在其它实施方案中，治疗作用通过下调PD-1表达来测量。在一些实施方案中，治疗作用通过(a)减弱T细胞活性；和(b)下调PD-1表达来测量。在某些实施方案中，T细胞活性的减弱通过抑制细胞因子的分泌来测量。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ或其组合。在一个实施方案中，T细胞活性的减弱通过抑制IL-1的分泌来测量。在一些实施方案中，T细胞活性的减弱通过抑制IL-2的分泌来测量。在另一个实施方案中，T细胞活性的减弱通过抑制IL-6的分泌来测量。在另一个实施方案中，T细胞活性的减弱通过抑制IL-12的分泌来测量。在另一个实施方案中，T细胞活性的减弱通过抑制IL-17的分泌来测量。在一个实施方案中，T细胞活性的减弱通过抑制IL-22的分泌来测量。在一些实施方案中，T细胞活性的减弱通过抑制IL-23的分泌来测量。在另一个实施方案中，T细胞活性的减弱通过抑制GM-CSF的分泌来测量。在另一个实施方案中，T细胞活性的减弱通过抑制TNF-α的分泌来测量。在另一个实施方案中，T细胞活性的减弱通过抑制IFN-γ的分泌来测量。在某些实施方案中，T细胞活性的减弱通过T细胞增殖的抑制来测量。在一些实施方案中，T细胞增殖的抑制是CD4+T细胞增殖的抑制。在其它实施方案中，T细胞增殖的抑制是CD8+T细胞增殖的抑制。在另一个实施方案中，T细胞活性的减弱通过T细胞活化标志物的下调来测量。在一个实施方案中，所述T细胞活化标志物是CD25。在另一个实施方案中，所述T细胞活化标志物是CD69。在另一个实施方案中，T细胞活性的减弱通过调控性T细胞生物标志物的上调来测量。在一个实施方案中，所述调控性T细胞生物标志物是Foxp3。在另一个实施方案中，T细胞活性的减弱通过调控性T细胞数量的增加来测量。在一个实施方案中，所述调控性T细胞是诱导型Foxp3+调控性T细胞。在一个实施方案中，所述调控性T细胞是诱导型CD25+Foxp3+调控性T细胞。
在某些实施方案中，T细胞活性的减弱通过T细胞表面上抑制性受体的表达的上调来测量，其中所述抑制性受体不是PD-1。在一些实施方案中，所述抑制性受体是选自由LAG-3、CTLA-4和TIM-3或其任何组合组成的组。在一个实施方案中，所述抑制性受体是LAG-3。在另一个实施方案中，所述抑制性受体是CTLA-4。在另一个实施方案中，所述抑制性受体是TIM-3。
在某些实施方案中，T细胞活性的减弱通过T细胞回忆应答的抑制来测量。在一个实施方案中，T细胞回忆应答通过CD4+T细胞增殖的减少来测量。在另一个实施方案中，T细胞回忆应答通过CD25上调的抑制来测量。在另一个实施方案中，T细胞回忆应答通过CD4+T细胞增殖的减少和CD25上调的抑制来测量。
在一些实施方案中，T细胞活性的减弱通过T细胞耗竭的增加来测量。在一个实施方案中，T细胞耗竭的增加通过IL-7Rhi T细胞的减少来测量。在另一个实施方案中，T细胞耗竭的增加通过IL-7Rlo T细胞的增加来测量。在另一个实施方案中，T细胞耗竭的增加通过IL-7Rhi T细胞的减少和IL-7Rlo T细胞的增加来测量。在一个实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。在某些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在其它实施方案中，T细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞。
此外，抗PD-1抗体或其片段可施用于表达所述抗体与其交叉反应的PD-1的非人哺乳动物(例如灵长类动物)以用于兽医学目的或作为人疾病的动物模型。关于后者，此类动物模型可适用于评价本公开的抗体的治疗功效(例如，测试施用的剂量和时程)。
在本文提供的各种方法的某些实施方案中，向对象施用治疗或预防有效量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。抗PD-1抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量是约0.005至约1,000mg/天、约0.01至约500mg/天、约0.01至约250mg/天、约0.01至约100mg/天、约0.1至约100mg/天、约0.5至约100mg/天、约1至约100mg/天、约0.01至约50mg/天、约0.1至约50mg/天、约0.5至约50mg/天、约1至约50mg/天、约0.02至约25mg/天、或约0.05至约10mg/天。
在某些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量是每天约0.1、约0.2、约0.5、约1、约2、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约40、约45、约50、约60、约70、约80、约90、约100或约150mg。
在一个实施方案中，对于本文所述的疾患，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的推荐每日剂量范围在约0.5mg至约50mg/天的范围内，优选作为单一每天一次剂量或以1天内的分次剂量给予。在一些实施方案中，剂量在约1mg至约50mg/每天的范围内。在其它实施方案中，剂量在约0.5至约5mg/每天的范围内。每天的特定剂量包括0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mg/天。
在一个具体实施方案中，推荐的起始剂量可以是0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25或50mg/天。在另一个实施方案中，推荐的起始剂量可以是0.5、1、2、3、4或5mg/天。剂量可逐步增大至15、20、25、30、35、40、45和50mg/天。
在某些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量是约0.001至约100mg/kg/天、约0.01至约50mg/kg/天、约0.01至约25mg/kg/天、约0.01至约10mg/kg/天、约0.01至约9mg/kg/天、约0.01至约8mg/kg/天、约0.01至约7mg/kg/天、约0.01至约6mg/kg/天、约0.01至约5mg/kg/天、约0.01至约4mg/kg/天、约0.01至约3mg/kg/天、约0.01至约2mg/kg/天或约0.01至约1mg/kg/天。
所施用的剂量还可以除mg/kg/天以外的单位表达。例如，用于肠胃外施用的剂量可表达为mg/m2/天。本领域的普通技术人员将容易地知道如何针对对象的给定身高或体重或两者将剂量从mg/kg/天转换为mg/m2/天(参见，www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm)。例如，对于65kg的人，1mg/kg/天的剂量大约等于38mg/m2/天。
在某些实施方案中，所施用的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的量足以提供稳态下抗体的在约0.001至约500μM、约0.002至约200μM、约0.005至约100μM、约0.01至约50μM、约1至约50μM、约0.02至约25μM、约0.05至约20μM、约0.1至约20μM、约0.5至约20μM或约1至约20μM范围内的血浆浓度。
在其它实施方案中，所施用的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的量足以提供稳态下抗体的在约5至约100nM、约5至约50nM、约0至约100nM、约10至约50nM或约50至约100nM范围内的血浆浓度。
如本文所用，术语“稳态下的血浆浓度”是在施用本文提供的抗PD-1抗体或其抗原结合片段(例如PD1AB-6-K3)一段时间后达到的浓度。一旦达到稳态，在抗体的血浆浓度的时间依赖性曲线上就存在较小的峰和谷。
在某些实施方案中，所施用的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的量足以提供所述抗体的在约0.001至约500μM、约0.002至约200μM、约0.005至约100μM、约0.01至约50μM、约1至约50μM、约0.02至约25μM、约0.05至约20μM、约0.1至约20μM、约0.5至约20μM或约1至约20μM范围内的最大血浆浓度(峰值浓度)。
在某些实施方案中，所施用的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的量足以提供所述抗体的在约0.001至约500μM、约0.002至约200μM、约0.005至约100μM、约0.01至约50μM、约1至约50μM、约0.01至约25μM、约0.01至约20μM、约0.02至约20μM、约0.02至约20μM或约0.01至约20μM范围内的最小血浆浓度(谷值浓度)。
在某些实施方案中，所施用的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的量足以提供所述抗体的在约100至约100,000ng*hr/mL、约1,000至约50,000ng*hr/mL、约5,000至约25,000ng*hr/mL或约5,000至约10,000ng*hr/mL范围内的曲线下面积(AUC)。
本文提供的抗PD-1抗体或其抗原结合片段(例如PD1AB-6-K3)可每日一次(QD)施用，或分成多个每日剂量，如每日两次(BID)、每日三次(TID)和每日四次(QID)。此外，施用可以是连续的(例如，连续数天内每日施用，或每天施用)、间歇性的，例如，在周期中(例如，包括数天、数周或数月的停药期)。如本文所用，术语“每日”旨在意指治疗性抗体如PD1AB-6-K3每日施用一次或多于一次持续一段时间。术语“连续”旨在意指治疗性抗体如PD1AB-6-K3在至少10天至52周的无中断期内每日施用。如本文所用，术语“间歇”或“间歇地”旨在意指以规则的或不规则的间隔停止和开始。例如，抗体如PD1AB-6-K3的间歇施用是每周施用一至六天、按周期施用(例如连续两至八周的每日施用，然后是达一周的不施用停药期)或隔日施用。如本文所用，术语“周期性”旨在意指抗体如PD1AB-6-K3每日或连续施用，但具有停药期。
在一些实施方案中，施用频率在约每日剂量至约每月剂量的范围内。在某些实施方案中，施用是每天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每隔一天一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次。在一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3每天一次施用。在一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3每天两次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3每天三次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3每天四次施用。
在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体如PD1AB-6-K3从一天至六个月、从一周至三个月、从一周至四周、从一周至三周或一周至两周每天一次施用。在某些实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3每天一次施用持续一周、两周、三周或四周。在一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3每天一次施用持续一周。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3每天一次施用持续两周。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3每天一次施用持续三周。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3每天一次施用持续四周。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量是约0.001至约50mg/kg、约0.01至约50mg/kg、约0.01至约25mg/kg、约0.01至约10mg/kg、约0.01至约9mg/kg、约0.01至约8mg/kg、约0.01至约7mg/kg、约0.01至约6mg/kg、约0.01至约5mg/kg、约0.01至约4mg/kg、约0.01至约3mg/kg、约0.01至约2mg/kg或约0.01至约1mg/kg。在某些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量是约0.001、约0.003、约0.005、约0.01、约0.03、约0.05、约0.1、约0.3、约0.5、约1、约3、约5、约10、约30或约50mg/kg。在一个实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量是0.001mg/kg。在一个实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量是0.01mg/kg。在一个实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量是0.1mg/kg。在另一个实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量是0.3mg/kg。在另一个实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量是0.5mg/kg。在另一个实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量是1mg/kg。在另一个实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量是3mg/kg。在一个实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量是5mg/kg。在另一个实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量是10mg/kg。在另一个实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量是30mg/kg。在另一个实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量是50mg/kg。
在一些实施方案中，施用频率是每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次。在一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3每周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3每两周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3每三周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3每四周一次施用。
在一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以0.1mg/kg的剂量每周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以0.3mg/kg的剂量每周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以0.5mg/kg的剂量每周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以1mg/kg的剂量每周一次施用。在一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以3mg/kg的剂量每周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以5mg/kg的剂量每周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以10mg/kg的剂量每周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以30mg/kg的剂量每周一次施用。
在一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以0.1mg/kg的剂量每两周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以0.3mg/kg的剂量每两周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以0.5mg/kg的剂量每两周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以1mg/kg的剂量每两周一次施用。在一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以3mg/kg的剂量每两周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以5mg/kg的剂量每两周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以10mg/kg的剂量每两周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以30mg/kg的剂量每两周一次施用。
在一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以0.1mg/kg的剂量每三周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以0.3mg/kg的剂量每三周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以0.5mg/kg的剂量每三周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以1mg/kg的剂量每三周一次施用。在一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以3mg/kg的剂量每三周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以5mg/kg的剂量每三周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以10mg/kg的剂量每三周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以30mg/kg的剂量每三周一次施用。
在一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以0.1mg/kg的剂量每四周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以0.3mg/kg的剂量每四周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以0.5mg/kg的剂量每四周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以1mg/kg的剂量每四周一次施用。在一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以3mg/kg的剂量每四周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以5mg/kg的剂量每四周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以10mg/kg的剂量每四周一次施用。在另一个实施方案中，所述抗体如PD1AB-6-K3以30mg/kg的剂量每四周一次施用。
取决于待治疗的疾病和对象的病状，本文提供的抗体(例如，PD1AB-6-K3)可通过肠胃外(例如，肌内、腹膜内、静脉内、持续静脉内、脑池内注射或输注、皮下注射或植入)、吸入、经鼻、经阴道、经直肠、舌下或局部(例如，透皮或局部)施用途径来施用。在一个实施方案中，施用途径是皮下。在另一个实施方案中，施用途径是静脉内。在另一个实施方案中，施用途径是肌内。在另一个实施方案中，施用途径是腹膜内。在另一个实施方案中，施用途径是持续静脉内。在另一个实施方案中，施用途径是脑池内注射或输注。在另一个实施方案中，施用途径是植入。在另一个实施方案中，施用途径是吸入。在一个实施方案中，施用途径是经鼻。在另一个实施方案中，施用途径是经直肠。在另一个实施方案中，施用途径是舌下。在另一个实施方案中，施用途径是透皮。本文提供的抗PD-1抗体(例如，PD1AB-6-K3)可以合适的剂量单位单独或与适用于每种施用途径的药学上可接受的赋形剂、载体、佐剂和媒介物一起配制。
在本文提供的各种方法的一些实施方案中，所述方法还包括施用治疗有效量的第二活性剂或支持护理疗法。第二活性剂可以是大分子(例如蛋白质)或小分子(例如，合成的无机、有机金属或有机分子)。在一些实施方案中，第二活性剂是小分子，所述小分子可减轻与施用本文提供的抗体相关的副作用。然而，与一些大分子一样，当与本文提供的抗体一起(例如，之前、之后或同时)施用时，许多小分子据信能够提供累加或协同作用。小分子第二活性剂的实例包括但不限于抗癌剂、抗炎剂、免疫抑制剂和类固醇。
4.5药物组合物
在一方面，本公开进一步描述了用于本文提供的各种方法中的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种本公开的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，药物组合物包含1)抗PD-1抗体，和2)药学上可接受的载体。
通过将具有所需纯度的抗体与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂以水溶液或冻干或其它干燥形式的形式混合来制备包含抗体的药物组合物用于储存(参见例如，Remington,Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版1980))。
本公开的抗体可以任何合适的形式配制以递送至靶细胞/组织，例如作为微胶囊或粗乳液(Remington,同上；Park等人,2005,Molecules 10:146-61；Malik等人,2007,Curr.Drug.Deliv.4:141-51)、作为缓释制剂(Putney和Burke,1998,NatureBiotechnol.16:153-57)或呈脂质体形式(Maclean等人,1997,Int.J.Oncol.11:325-32；Kontermann,2006,Curr.Opin.Mol.Ther.8:39-45)。
本文提供的抗体也可截留在例如通过凝聚技术或界面聚合作用制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙酸甲酯)微胶囊)中、胶状药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中或粗乳液中。此类技术公开于例如Remington，同上中。
不同的组合物和递送系统是己知的并且可与如本文所述的结合至PD-1的抗体一起使用，包括但不限于封装在脂质体、微粒、微胶囊中、能够表达所述抗体的重组细胞中、受体介导的内吞作用(参见，例如Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-32)、构建作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸等。在另一个实施方案中，组合物可被提供为受控释放或持续释放系统。在一个实施方案中，可使用泵来实现受控释放或持续释放(参见例如，Langer,同上；Sefton,1987,Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201-40；Buchwald等人,1980,Surgery 88:507-16；以及Saudek等人,1989,N.Engl.J.Med.321:569-74)。在另一个实施方案中，聚合物材料可用于实现预防或治疗剂(例如，如本文所述的结合至PD-1的抗体)或本发明组合物的受控或持续释放(参见例如，Medical Applications of Controlled Release(Langer和Wise编辑,1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance(Smolen和Ball编辑,1984)；Ranger和Peppas,1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61-126；Levy等人,1985,Science 228:190-92；During等人,1989,Ann.Neurol.25:351-56；Howard等人,1989,J.Neurosurg.71:105-12；美国专利号5,679,377；5,916,597；5,912,015；5,989,463；以及5,128,326；PCT公布号WO99/15154和WO99/20253)。持续释放制剂中所用的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方案中，持续释放制剂中所用的聚合物呈惰性、不含可浸出的杂质、储存时稳定、无菌并且可生物降解。
在另一个实施方案中，受控释放或持续释放系统可邻近特定靶组织(例如，鼻通道或肺)放置，由此仅需要全身剂量的一部分(参见例如，Goodson,Medical Applications of Controlled Release第2卷,115-38(1984))。受控释放系统例如由Langer,1990,Science249:1527-33进行了论述。可使用本领域技术人员已知的任何技术来产生包含一种或多种如本文所述的结合至PD-1的抗体的持续释放制剂(参见例如，美国专利号4,526,938、PCT公布号WO 91/05548和WO 96/20698,Ning等人,1996,Radiotherapy&Oncology 39:179-89；Song等人,1995,PDA J.of Pharma.Sci.&Tech.50:372-97；Cleek等人,1997,Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-54；以及Lam等人,1997,Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-60)。
除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管可在本发明的实践或测试中使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但本文描述了合适的方法和材料。
本文引用的所有申请、公布、专利和其它参考文献、GenBank引文和ATCC引文均以引用的方式整体并入。在冲突的情况下，以包括定义在内的本说明书为准。
如本文所用，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数个指示物。因此，例如，提及“肽序列”包括多个这类序列等。
如本文所用，在本文件中通常以范围格式呈现数值。范围格式的使用仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对本发明范围的不灵活限制，除非上下文另有明确说明。因此，范围的使用明确地包括所有可能的子范围、所述范围内的所有单独数值以及包括在此类范围内的所有数值或数值范围、范围内的整数的所有分数值和整数，除非上下文另有明确说明。无论范围的广度如何并且在本专利文件的所有上下文中都适用这种结构。因此，例如，提及90％-100％的范围包括91％-99％、92％-98％、93％-95％、91％-98％、91％-97％、91％-96％、91％-95％、91％-94％、91％-93％等。提及90％-100％的范围还包括91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％等，以及91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％等，92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％等，等等。
此外，提及1-3、3-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-225、225-250的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等。在另一实例中，提及25-250、250-500、500-1,000、1,000-2,500、2,500-5,000、5,000-25,000、25,000-50,000的范围包括此类值内或涵盖此类值的任何数值或范围，例如25、26、27、28、29……250、251、252、253、254……500、501、502、503、504……等。
如本文中还使用的，在本文件中公开了一系列范围。一系列范围的使用包括上限和下限范围的组合以提供另一范围。无论范围的广度如何并且在本专利文件的所有上下文中都适用这种结构。因此，例如，提及一系列范围如5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-75、75-100、100-150包括诸如5-20、5-30、5-40、5-50、5-75、5-100、5-150和10-30、10-40、10-50、10-75、10-100、10-150以及20-40、20-50、20-75、20-100、20-150等的范围。
为简明起见，本文使用某些缩写。一个实例是单字母缩写来表示氨基酸残基。氨基酸及其相应的三字母和单字母缩写是如下：
丙氨酸 Ala (A)
精氨酸 Arg (R)
天冬酰胺 Asn (N)
天冬氨酸 Asp (D)
半胱氨酸 Cys (C)
谷氨酸 Glu (E)
谷氨酰胺 Gln (Q)
甘氨酸 Gly (G)
组氨酸 His (H)
异亮氨酸 Ile (I)
亮氨酸 Leu (L)
赖氨酸 Lys (K)
甲硫氨酸 Met (M)
苯丙氨酸 Phe (F)
脯氨酸 Pro (P)
丝氨酸 Ser (S)
苏氨酸 Thr (T)
色氨酸 Trp (W)
酪氨酸 Tyr (Y)
缬氨酸 Val (V)
本文总体上使用肯定语言来公开本发明以描述许多实施方案。本发明还具体地包括其中特定主题被全部或部分排除的实施方案，如物质或材料、方法步骤和条件、方案、程序、测定或分析。因此，即使本发明通常不就本发明不包括而言表达，但本文仍然公开了未明确包括在本发明中的方面。
已经描述了本发明的多个实施方案。然而，应理解的是，可在不背离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改。因此，以下实施例旨在说明而非限制权利要求中描述的本发明的范围。
5.实施例
本章节(即，第5章节)中的实施例是以说明的方式提供，并且不是作为限制。
5.1实施例1：抗PD-1抗体的产生
5.1.1抗PD-1抗体的产生
最初通过使用人PD-1细胞外结构域(ECD)抗原或CHO-hPD-1转染的细胞的小鼠免疫方法来产生亲本PD-1-IgG1mAb。杂交瘤库的初始表征鉴别产生针对可溶性抗原的抗人PD-1、PD-L1非阻断和PD-L2非阻断抗体(数据未示出)的被称为PD1Sub1的亚克隆，其中通过测量的KD为约6nM。将来自PD1Sub1杂交瘤的小鼠VH和VL基因进行测序，并利用最接近的J区(分别为IgH J6和Igκ J2)用于人CDR移植到最同源的人VH和VL框架基因(分别为IgH1-f和Vκ4-1)的人γ1和κ恒定区中。仅对于人种系HG1VH和VL区，将小鼠CDR3区段分别置于人VH和VL框架种系基因IgH 1-f和Vκ4-1中。
产生在具有稳定AID(活化诱导的脱氨酶)的DeciduousTM构建体中表达CDR-移植或种系HG1抗体的稳定HEK-293c18细胞系用于SHM-XELTM亲和力成熟平台(AnaptysBio,SanDiego,CA)中。在抗体可变结构域中原位产生遗传多样性产生了表达亲本抗体的更高亲和力变体的细胞。使用单体或二聚体hPD-1通过流式细胞术分离这些。多轮亲和纯化和选择产生6个廊道(corridors)和45个克隆。这些克隆的桑格(Sanger)和深度测序以及额外的“计算机SHM”事件产生多轮定向诱变，其将富集突变掺入到VH和VL CDR中。将最高亲和力结合12种突变蛋白针对与PD-1的结合动力学以及与在CHO细胞表面上表达的全长PD-1的结合进一步生物化学地、生物物理学地表征。纯化抗体的功能表征在两种测定中进行：PD-L1竞争结合至细胞表面PD-1和来自活化的人CD4+T细胞的再活化的IL-2产生的抑制活性。
基于这些方法，产生了抗PD-1抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6，如表9中所示。
表9.抗PD-1抗体的表征
5.1.2人PBMC或人全血中的CD4+再活化测定
在从白细胞减少系统(LRS)分离的人PBMC上诱导PD-1表达，其中PHA活化在37℃下48小时。将CD4+T细胞使用CD4分离试剂盒(Miltenyi Biotec,San Diego,CA)从PBMC中纯化，并与固定的抗CD3或抗CD3加滴定的抗PD-1或hIgG1同种型对照抗体一起重新涂铺到96孔中。在24和48小时收集上清液用于IL-2、IFN-γ和IL-17细胞因子测定。所有六种抗PD-1克隆显示相似的抑制EC50，对于IL-2在20-36nM的范围内，对于IFN-γ在34-58nM的范围内，并且对于IL-17在27-41nM的范围内，如表10中所示。
表10.PBMC再活化测定中6种前导抗体的T细胞减弱活性的比较
然后在人全血基质中评估特异性T细胞功能的抑制。将新鲜抽取的和肝素化的人血涂铺到用抗CD3或抗CD3加滴定的抗PD-1或hIgG1同种型对照抗体固定的孔上。针对IL-2(24小时)和IFN-γ/IL-17(48小时)测量在24小时和48小时时收集的血浆。与三种其它测试的抗体克隆相比，PD1AB-6在特异性IL-2(EC50 4.0+0.9nM，n＝4)、IFN-γ(EC50 4.1+2.2nM，n＝2)和IL-17(EC50 3.6+1.2nM，n＝3)抑制中显示增加2-3倍的效力，如表11中所示。
表11.全血测定中4种前导分子的T细胞减弱活性的比较
5.1.3基于细胞的配体结合测定
为了评估配体竞争，实施细胞结合测定以评估鉴别的六种抗体克隆。简言之，将100nM至100pM半对数浓度的各个抗体克隆与10nM DyL650-PD-L1预混合，然后在冰上添加至人PD-1-CHO细胞(2x 105个细胞)45分钟。然后洗涤细胞，之后在BD FACSArrayTM上分析DyL650-PD-L1结合，并在每种浓度下绘制相对于同种型对照抗体的中值荧光强度。如图1A-1B中所示，PD1AB-6以及包括亲本克隆PD1AB-1的其它五种克隆未显示针对DyL650-PD-L1结合的显著竞争直至100nM。相比之下，MDX 4H1(AnaptysBio,San Diego,CA)(一种拮抗剂、配体阻断PD-1抗体)剂量依赖性地阻断标记的PD-L1结合，从而产生结合EC50为约5-10nM。
5.1.4表位作图
通过将与人PD-1细胞外结构域复合的PD1AB-6Fab的晶体结构解析为分辨率来确定PD-1表位。PD-1：PD1AB-6Fab相互作用位点相对于PD-1:PD-L1相互作用位点出现在PD-1的远侧上(图2)，与PD-L1和PD1AB-6不竞争PD-1接合的观察结果一致。PD1AB-6Fab抵靠PD-1β折叠结合，具有与由残基100-105组成的PD-1环形成的显著相互作用(图3)。PD-1上的R104参与与Fab CDR H1上的残基的多重极性相互作用。相邻残基G103也与Fab形成紧密的极性相互作用。R104和G103两者均在小鼠PD-1中突变(分别突变为组氨酸和精氨酸)，从而提供缺乏PD1AB-6与鼠PD-1的结合的结构理论。与PD-1相互作用的PD1AB-6Fab区是CDR H1、H2、H3、L1和L2。PD-1:PD1AB-6Fab相互作用的原子细节描述于表12中。描述了与PD-1表位相互作用的HC和LC残基。缩写如下：HB-氢键、HYD-疏水相互作用、ION-离子相互作用。
表12.PD1AB-6:PD-1相互作用的原子细节
5.1.5 PD1AB-6的变体的产生
产生了PD1AB-6IgG1抗体(PD1AB-6-IgG1)和Fc修饰的IgG4PE抗体(PD1AB-6-4PE)。PD1AB-6-4PE被设计为具有显著更低的Fc介导的效应子功能。CH区，γ4含有两个非标准氨基酸取代S228P和L235E(EU编号系统，Kabat和Wu 1991)。丝氨酸228(IgG4的铰链中的常见氨基酸类型)被改变为脯氨酸(IgG4中不常观察到的氨基酸类型和IgG1中的高度保守的氨基酸)。这种变化显著降低了在IgG4亚类抗体的产生中通常观察到的“半抗体”的水平。亮氨酸235(参与与Fcγ受体的重链相互作用的关键氨基酸之一)被改变为谷氨酸。L235E取代显著降低了γ4链与FcγR的相互作用，从而消除ADCC和Fc-受体介导的表达PD-1的正常细胞的消除。此外，对γ4重链的补体结合的固有缺乏使得PD1AB-6-4PE分子缺乏CDC功能。产生了两种其它变体以最小化对C1q的结合亲和力来降低CDC(图4)。为了产生PD1AB-6-K3，赖氨酸322在PD1AB-6-IgG1中被丙氨酸取代。据报道，K322A取代遏制利妥昔单抗(一种具有人IgG1Fc的嵌合抗体)上的C1q结合(Idusogie等人,2000,J.Immunol.164(8):4178-84)。通过用S228P取代将PD1AB-6-IgG1的Fc-主链转化为IgG4的Fc-主链来产生PD1AB-6-4P。丝氨酸228(IgG4的铰链中的常见氨基酸类型)被改变为脯氨酸(IgG4中不常观察到的氨基酸类型和IgG1中的高度保守的氨基酸)。这种变化显著降低在IgG4亚类抗体的产生中频繁观察到的半抗体的水平。据报道，IgG4抗体具有减弱的ADCC和CDC功能(Overdijk等人,2012,J.Immunol.189(7):3430-38)。所有变化都在CH区中尝试，而可变区中没有变化。PD1AB-6-IgG1的重链和轻链的氨基酸序列分别标记为LC_PD1AB-6-IgG1和HC_PD1AB-6-IgG1(图4)。两种重链变体包括HC_PD1AB-6-IgG1-K322A和HC_PD1AB-6-IgG4P。轻链LC_PD1AB-6-IgG1与三条单独的重链配对以分别产生PD1AB-6-IgG1、PD1AB-6-K3和PD1AB-6-4P。
5.1.6细胞系开发和从瞬时转染制造的抗体
5.1.6.1重链和轻链的分子克隆
IgG LC表达载体pFUSE2ss-CLIg-hk和IgG HC表达载体pFUSEss-CHIg-hG1购自InvivoGen(San Diego,CA)。
将编码LC_PD1AB-6-IgG1的氨基酸序列(图4)转化为密码子优化的基因序列，以用于哺乳动物细胞中的蛋白质表达。将限制酶位点，即5'端的EcoRI和3'端的NheI添加至优化的基因。合成具有EcoRI和NheI位点的优化的LC基因，从而产生插入片段。用EcoRI和NheI消化IgG LC表达载体pFUSE2ss-CLIg-hk，从而产生大约3.5kb的pFUSE2ss-CLIg-hk-EcoRI/NheI片段。将插入片段连接到pFUSE2ss-CLIg-hk-EcoRI/NheI片段中，从而产生pJS-1，其为pFUSE2ss-CLIg-hk-LC_PD1AB-6-IgG1。
将编码HC_PD1AB-6-IgG1、HC_PD1AB-6-IgG1-K322A或HC_PD1AB-6-IgG4P的氨基酸序列(图4)转化为密码子优化的基因序列，以用于哺乳动物细胞中的蛋白质表达。添加限制酶位点5'端的EcoRI，来自终止密码子的恒定区(在pFUSEss-CHIg-hG1中HC序列的3'端之后)至3'端的HpaI。合成具有EcoRI和HpaI位点的优化的基因，从而产生分别含有编码HC_PD1AB-6-IgG1、HC_PD1AB-6-IgG1-K322A和HC_PD1AB-6-IgG4P的基因的插入片段。用EcoRI和HpaI消化IgG HC表达载体pFUSEss-CHIg-hG1，从而产生大约3.4kb的pFUSEss-CHIg-hG1-EcoRI/HpaI片段。将插入片段连接到pFUSEss-CHIg-hG1-EcoRI/HpaI片段中，从而产生pJS-2、pJS-3和pJS-12，它们分别是pFUSEss-CHIg-hG1-HC_PD1AB-6-IgG1、pFUSEss-CHIg-hG1-HC_PD1AB-6-IgG1-K322A和pFUSEss-CHIg-hG1-HC_PD1AB-6-IgG4P。
5.1.6.2蛋白质产生
PD1AB-6-IgG1、PD1AB-6-K3和PD1AB-6-4P的所有三种变体在摇瓶中以实验室规模制造以用于体外和体内功效研究。使用来自Life Technologies(Carlsbad,CA)的FreeStyleTM MAX CHO表达系统以及Expi293TM表达系统在50L生物反应器(50L搅拌槽和50Lwave袋)中制造用于非GLP毒理学研究和另外表征的PD1AB-6-4P和PD1AB-6-K3抗体。FreeStyleTM MAX CHO表达系统用于使用制造商的标准方案瞬时转染CHO-S细胞。使用制造商的标准方案将Expi293TM表达系统用于瞬时转染Expi293细胞。在转染期间，对于每1L培养物1mg的DNA混合物，使用3:2比例的轻链vs.重链。在37℃下将细胞以50万个细胞/mL接种于50L生物反应器中，并生长过夜以达到100万个细胞/mL。然后使用制造商的标准方案转染细胞。在转染后第1天，将1mM丁酸钠加1％v/v的补料培养基(酵母提取液(Yeastolate)、CHOCD EfficientFeedTM A、Glutamax和葡萄糖)添加至生物反应器，并使温度降至32℃。对于50L搅拌槽接种40升细胞加添加剂，并且对于50L wave生物反应器接种25L细胞加添加剂。每天监测细胞活力和滴度，并且当细胞活力降至50％以下时收获批次。使用Vi-CellTM仪器进行活力分析，并使用配备有抗人IgG传感器的Octet RED进行滴度分析，使用纯化的抗体用于标准曲线。使用GE Life Sciences深度过滤和灭菌柱收获细胞和上清液，使用ULTAPrime GF 5μm胶囊用于深度过滤，然后ULTA Pure HC 0.6/0.2μm灭菌胶囊。使用错流过滤将澄清的上清液浓缩5-8倍，将来自GE Life Science的50Kd截留KvickTM Lab SCU用于TFF。在收获时对于每种同种型获得的滴度和最大细胞密度在表13中给出。
表13.补料分批生物反应器(50升)中的生产率
5.1.6.3蛋白质纯化
通过包括蛋白A亲和色谱和低pH病毒灭活、随后IEX相互作用(CaptoTM Adhere&CaptoTM SP ImpRes)色谱步骤的一系列下游纯化步骤进行所产生的材料的纯化。将纯化的抗体通过与(10mM琥珀酸盐pH 5.5，9％蔗糖，0.05％PS20)缓冲液进行缓冲液交换、通过0.2μm过滤器过滤且等分来批量配制。
用被设计以捕获产物并除去工艺相关的杂质的MabSelect SuReTM进行蛋白A亲和色谱。随后的病毒灭活步骤在酸性条件(pH 3.4±0.1，持续45分钟)下进行，然后将灭活汇集物调节至pH 5.5±0.1。在病毒灭活后，阴离子交换器以流通模式用于中间抛光(polishing)步骤，使用CaptoTM Adhere除去杂质如聚集体、DNA、宿主细胞蛋白和内毒素。将产物汇集物调节至pH 6.5±0.1，并且在下一个工艺步骤之前将电导率降低至2mS/cm。阳离子交换器CaptoTM SP ImpRes用作抛光步骤，并且产物在10mS/cm下溶解。然后将抗体在储备溶液(10mM琥珀酸盐，9％蔗糖，0.05％PS20，pH5.5)中缓冲交换并浓缩至20mg/mL。然后将产物汇集物通过0.2μm过滤器过滤并等分。
5.1.7基于细胞的PD-1结合测定
在表达人PD-1和食蟹猴PD-1的CHO细胞(图5A-5B)和原代人PBMC(图6)以及食蟹猴PBMC(图7)上评价PD1AB-6-IgG1结合。
将表达人PD-1和食蟹猴PD-1的CHO细胞与各种浓度的未标记的PD1AB-6-IgG1抗体一起在4℃下孵育30分钟，洗涤，并在4℃下用抗人IgG Fc(eBioscience,San Diego,CA)染色30分钟。人IgG1Fc用作阴性对照。PD1AB-6-IgG1结合至CHO细胞上表达的人PD-1，其中EC50＝0.4nM；并且结合至CHO细胞上表达的食蟹猴PD-1，其中EC50＝0.8nM(图5A-5B)。
用1μg/mL板结合的抗CD3活化人PBMC3天以诱导T细胞上的PD-1表达。将细胞与各种浓度的未标记的PD1AB-6-IgG1抗体一起在4℃下孵育30分钟，洗涤，并在4℃下用抗人IgGFc(eBioscience,San Diego,CA)染色30分钟。人IgG1Fc用作阴性对照。在CD4+T细胞上测定几何MFI。来自2个人健康供体中的1个的数据在图6中示出。
用1μg/mL抗食蟹猴CD3/CD28活化食蟹猴PBMC 2天以诱导T细胞上的PD-1表达。将细胞与各种浓度的未标记的PD1AB-6-IgG1抗体一起在4℃下孵育30分钟，洗涤，并在4℃下用抗人IgG Fc(eBioscience)染色30分钟。人IgG1Fc用作阴性对照。在CD4+T细胞上测定几何MFI。来自2个食蟹猴供体中的1个的数据在图7中示出。
5.1.8 Fc受体结合测定
为了确认变体产生的目的，即降低的FcγR介导的效应子功能，通过两种方法分析FcγR与PD1AB-6-K3和PD1AB-6-4P变体的结合。首先，使用Cisbio检测用置换FcγR测定测试结合(图8A-8D)。将经工程化以表达用铽(Tb)供体染料预标记的特异性FcγR(FcγRI、FcγRIIIa或FcγRIIb)的HEK293细胞与对数浓度范围为10000nM至0.1pM的参考对照或PD1AB-6-IgG1、PD1AB-6-K3和PD1AB-6-4P抗体混合。然后添加第二人-hIgG-d2(受体)以竞争受体结合。测量由Tb-d2接近产生的荧光共振能量转移(FRET)信号的检测，并且其与PD1AB-6变体结合的FcγR成反比。如图8A-8D中所示，PD1AB-6-K3变体显示与FcγRIIIa(CD16)的结合降低，FcγRIIIa是负责ADCC活性的NK细胞上的低亲和力受体。与FcγRI(在粒细胞、树突细胞(DC)或单核细胞上表达)的结合与亲本PD1AB-6-IgG1分子相似。
其次，在基于FACS的结合测定中测试PD1AB-6-K3和PD1AB-6-4P变体两者(图9A-9C)。简言之，将表达FcγRI-CHO或FcγRIIIaV158-CHO的细胞系分离并洗涤，然后与不同浓度的PD1AB-6-K3和PD1AB-6-4P变体在冰上混合1小时。将PD1AB-6变体结合的细胞用标记的PE缀合的F(ab’)2山羊抗人二级抗体在冰上检测另外一小时，洗涤并固定，然后通过FACS进行分析，并且绘制在每种浓度下的平均荧光强度。PD1AB-6-4P变体分别针对FcγRI和FcγRIIIa系返回显著更高的结合EC50(>15X和>21X)(图9A-9C)。
5.1.9体外ADCC测定
在涉及来自健康供体的天然杀伤(NK)细胞和表达PD-1的靶细胞的共培养测定中评价PD1AB-6变体诱导ADCC的能力。将用PD1AB-6变体预处理的靶细胞(NCI-OCI-Ly3)与活化的NK细胞共培养4小时。上清液LDH浓度用于计算特异性裂解。使用Prism计算EC50(nM)。误差条代表实验三次重复。数据是4个个体健康供体的2个代表。如图10A-10B中所示，滴定PD1AB-6-IgG1诱导剂量依赖性ADCC，而PD1AB-6-K3显示降低的ADCC活性。
5.1.10体外CDC测定
使用表达PD-1的CD20+NCI-OCI-Ly3细胞评价PD1AB-6变体诱导CDC的能力。将用抗体预处理的靶细胞(NCI-OCI-Ly3)在补充有5％兔补体的无血清培养基中培养4小时。通过FACS通过7-AAD+细胞测定细胞裂解。数据代表3个独立实验：(i)PD1AB-6-IgG1和抗CD20IgG1的CDC活性；(ii)PD1AB-6-IgG1和PD1AB-6-K3的CDC活性；(iii)PD1AB-6-4P和商业小鼠抗PD-1IgG1抗体的CDC活性。如图11中所示，PD1AB-6-K3始终不诱导CDC(n＝3)。亲本PD1AB-6-IgG1和PD1AB-6-4P也不诱导CDC。这不是由于靶细胞系对补体杀伤的抗性导致的，因为抗CD20IgG1在5％兔补体存在下在NCI-OCI-Ly3细胞上反复诱导剂量依赖性CDC。
5.2实施例2：活性测定
5.2.1人T细胞活化测定
通过两种方法进行PD1AB-6变体对抑制T细胞效应子功能的功能评估。在一种测定中，将外周血单核细胞预活化以表达PD-1并在可溶性PD1AB-6-K3存在下再刺激(图12)。将来自健康供体的外周血单核细胞(PBMC)用有丝分裂原PHA预活化48小时以上调PD-1表达。然后使用抗CD3缀合的(Life Technologies,Carlsbad,CA)在稀释的PD1AB-6变体存在下在100nM至0.1nM最终浓度范围内再刺激这些细胞。在刺激后24小时使用培养物上清液中的IL-2水平测量T细胞活化。如图12中所示，PD1AB-6-K3和两种其它变体在此测定中显示有效的T细胞抑制活性，EC50为5-25nM。
第二种测定用于PD1AB-6-K3在抑制T细胞功能中的直接离体测量(图13)。这通过将新鲜人全血直接涂铺在用抗CD3+/-PD1AB-6-K3共同包被的96孔板中并测量IL-17和IFN-γ水平作为T细胞活化的读出来进行。CTLA4Ig用作这些测定中的阳性对照，并且人IgG Fc片段用作阴性对照。如图13中所示，总的来说，PD1AB-6-K3趋向于比PD1AB-6-4P更好的功效。阴性对照hIgG Fc显示无活性，EC50>100nM。
5.2.2食蟹猴交叉反应性测定
使用用所指示的抗食蟹猴CD3、CD28和PD1AB-6变体活化的新鲜分离的食蟹猴PBMC，与人样品类似地进行功能性食蟹猴与前导PD1AB-6-K3的交叉反应性的测定。CTLA4Ig用作这些测定中的阳性对照，并且hIgG1 Fc用作阴性对照。在48小时后除去培养上清液，以用于使用食蟹猴IL-2 MSD测定来进行细胞因子测定。如表14中所示，这些测定证明PD1AB-6-K3使食蟹猴T细胞细胞因子分泌减弱至与阳性对照CTLA4Ig相当的水平，并且活性与人测定中观察到的活性相当。
表14.食蟹猴PBMC测定中的PD1AB-6-K3活性
5.2.3体外作用机制
与T细胞表面分子(如CD3和CD4)结合的几种抗体导致信号传导和那些分子的表面表达的随后下调。由于PD1AB-6抗体被设计为经由PD-1提供激动剂信号，因此在体外PD1AB-6处理后评价PD-1表达是令人感兴趣的。
5.2.3.1在PD1AB-6处理后PD-1表达下降
将来自不同供体的人PBMC用1μg/mL板结合的抗CD3+0.25μg/mL板结合的抗CD28与不同浓度的可溶性对照IgG1或PD1AB-6-IgG1活化。在孵育4小时至72小时后，将细胞针对CD3、CD45RO和PD-1染色以评估T细胞上的PD-1表达。图14A-14C示出在PD1AB-6-IgG1处理48小时后PD-1在人CD3+T细胞上的表达降低。PD-1表达的分析显示PD1AB-6-IgG1处理导致T细胞表面上的PD-1表达下调(图14A-14B中的一个供体的代表性直方图和图14C中的48小时时、跨三个供体和各种抗体浓度的平均荧光强度的分析)。早在与PD1AB-6-IgG1孵育4小时就观察到PD-1下调。表面PD-1表达的下调可能是由于PD1AB-6经由PD-1诱导的信号传导导致的，并且是通过与在T细胞受体信号传导情况下观察到的机制相似的机制(San Jose等人,2000,Immunity 12(2):161-70)。
5.3实施例3：PD1AB-6变体的物理化学表征
5.3.1结合分析
使用捕获方法在T200上分析纯化的PD1AB-6变体抗体与hPD1抗原的结合。将Fc特异性抗人IgG固定在Fc2上，并将Fc1留空作为参考通道。在抗人IgG上捕获纯化的PD1抗体，并使用从100nM至200pM的两倍稀释系列使内部产生的hPD1抗原(PD1_002)在两个通道上流动以确定结合动力学。所使用的PD-1是作为包涵体的在大肠杆菌中表达并再折叠的人PD-1的细胞外结构域(残基32-160)。使用3M氯化镁在每种抗原浓度之间再生表面。结合动力学的实例以及PD1AB-6-IgG1、PD1AB-6-4P和PD1AB-6-K3的kon、koff和KD的值示于图15A-15C中。所有三种变体具有相似的与PD-1抗原的缔合速率和解离速率，相当的KD值为19-22nM。
5.4实施例4：体外药理学
5.4.1破伤风类毒素抗原(TTX)回忆测定
在用来自健康供体的PBMC(AllCells,LLC,Alameda,CA；San Diego Blood Bank,San Diego,CA；Astarte Biologics LLC,Redmond,WA)进行的TTX回忆测定中使用可溶性PD1AB-6测试PD1AB-6对抗原特异性CD4+T细胞功能的影响。将PBMC与PD1AB-6预孵育1小时，然后用1μg/mL破伤风类毒素梭菌TE(EMD Millipore,San Diego,CA 58223125UG)刺激以诱导破伤风特异性CD4+T细胞活化。在TTX孵育7天后，通过流式细胞术如通过由CellTraceTM紫色低细胞指示的细胞分裂所测量，评估PBMC的CD4+T细胞增殖。LIVE染料(LIVE/可固定的蓝色死细胞染料，Molecular ProbesTM L23105)用于从分析中排除死细胞。在所有三个供体中，PD1AB-6抑制CD4回忆应答，IC50为0.01-0.02μg/mL(图16)。
在单独的实验中，在各种血清浓度下将用PD1AB-6-K3预处理的PBMC与TTX一起孵育7天，并且评价抗原依赖性增殖和活化，如CD25上调所指示。用细胞增殖染料(CellTraceTM紫，Thermo Fisher C34571)标记健康供体PBMC(37℃持续20分钟)。将CellTrace紫色染料标记的PBMC(5x106个细胞/mL)与各种浓度(0.01nM至100nM)的PD1AB-6-K3或PD1AB-6-IgG1一起预孵育1小时，然后用1μg/mL破伤风类毒素刺激以诱导破伤风特异性CD4+T细胞活化。包括同种型匹配的抗RSV IgG1-K322A作为阴性对照，而添加PD-L1Fc作为处理对照以确定单独活化PD-1途径是否会抑制T细胞。用表面标记物对PBMC进行染色以鉴别CD4+/CD8-T细胞，并通过流式细胞术通过经由CellTraceTM紫低细胞检测的细胞分裂来测量T细胞增殖。LIVE/染料(LIVE/可固定的蓝色死细胞染料，Molecular ProbesTML23105)用于从分析中排除死细胞。FACS分析(BD FACS Canto流式细胞仪，软件(Tree Star,Inc))表明，所有经历破伤风类毒素依赖性增殖的CD4+细胞对CD25表达呈阳性，并且大部分表达PD-1。
5.4.2离体全血细胞因子分泌
用来自健康供体和自身免疫疾病(特应性皮炎[AD]、类风湿性关节炎[RA]、银屑病[PS]、克罗恩氏病[CD]、银屑病性关节炎[PsA]以及全身性红斑狼疮[SLE])患者的全血在功能测定中进一步表征PD1AB-6-K3。从健康供体和预筛选的自身免疫性疾病患者获得全血并将全血肝素化(Sanguine Biosciences,Sherman Oaks,CA)。用RPMI-1640培养基稀释肝素化血液，将200μL涂铺到用抗CD3抗体预先包被的CovalinkTM培养板上，并用抗体(PD1AB-6-K3、CTLA-4Ig(阳性对照)或hIgG1Fc(阴性对照))剂量滴定(100nM至0.1nM)所述板。在37℃下48小时后，除去血浆并评估IFN-γ和/或IL-17释放。针对给定自身免疫性疾病，绘制每个供体的计算的IFN-γ或IL-17的EC50。
总之，在正常和疾病全血中，固定的PD1AB-6-K3在阻断T细胞特异性IFN-γ(图17A)和IL-17(图17B)释放方面表现出活性。在正常供体全血中，PD1AB-6-K3(n＝4)对IFN-γ抑制的平均EC50被计算为6.18±10.9nM，而此测定中的阳性对照CTLA4-Ig具有22.5±39.2nM的EC50(数据未示出)。包被的hIgG1Fc(阴性对照)未表现出抑制活性(数据未示出)。
5.4.3对T细胞抑制性受体的细胞表面表达的影响
T细胞抑制性受体是共抑制性分子，所述共抑制性分子不利地干扰T细胞活化和功能。使用流式细胞术以测量在未刺激和刺激的培养条件下LAG-3、CTLA-4和PD-1的细胞表面表达来评价PD1AB-6-K3对T细胞上免疫检查点蛋白的表达的影响。从新鲜的血块黄层包被的全血(Blood Center of New Jersey,NJ；New York Blood Center,NY；BiologicalSpecialty Corp.,Colmar,PA)分离人PBMC。将PMBC(2x106个细胞)用PD1AB-6-K3-、对照人IgG1-或PD-L1Fc-缀合的珠粒(DynabeadTM M-450Epoxy,Invitrogen)在37℃下预处理24小时。然后用抗CD3(0.3μg/mL，R&D系统，MAB100 ARH1113091)或葡萄球菌肠毒素B(SEB)溶液(2μg/mL Millipore，11100-45-1)在37℃下刺激细胞2天(初级刺激)。在未受刺激的条件下(即单独PD1AB-6-K3处理)，LAG-3表达在CD4+记忆T细胞上显著受到抑制，并且存在朝向CD8+记忆T细胞上LAG-3表达的浓度依赖性降低的趋势，而PD-1表面表达在CD4+记忆T细胞和CD8+记忆T细胞中显著降低(表15和16)。抗CD3和SEB刺激的细胞均显示CD4+记忆T细胞上LAG-3表达的显著降低(表15)。在初级刺激条件下，PD1AB-6-K3对LAG-3或CTLA-4的CD8+T细胞表达没有影响(表16)。与下文论述的体内研究类似，PD1AB-6-K3一致地下调受刺激的CD4+和CD8+T细胞中的PD-1表达(参见表15和16)。括号中的数字表示供体的数量；“Tet.”是用破伤风处理的组；“时间”是在“无刺激”组中用PD1AB-6-K3处理的时间或在所有其它组中刺激后的时间；“NE”是没有影响；“n/s”是不显著；通过单因素ANOVA、随后邓尼特多重比较事后检验，相对于培养基对照，*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。
表15.PD1AB-6-K3对初级刺激时CD4+记忆T细胞上的抑制性受体表达的影响。
表16.PD1AB-6-K3对初级刺激时CD8+记忆T细胞上的抑制性受体表达的影响。
为了实现二级刺激，将上述人PBMC用抗CD3(3μg/mL)和抗CD28(1μg/mL)在37℃下预刺激24-48小时，然后用PD1AB-6-K3或人IgG1同种型对照在37℃下处理24小时。然后用抗CD3(3μg/mL)和抗CD28(1μg/mL)再刺激细胞6-24小时。通过流式细胞术(BD LSRFortessaTM流式细胞仪，FACSDivaTM分析软件(BD Bioscience)和Flow Jo分析软件)评价LAG-3和CTLA-4表达。在二级刺激条件下，LAG-3表达在CD4+和CD8+记忆T细胞中增加，并且CTLA-4在CD4+记忆T细胞中增加(数据未示出)。
CD8+T细胞中的T细胞耗竭的特征在于记忆标志物如白细胞介素-7受体(IL-7R)的下调以及抑制性受体的上调(Blackburn等人,2009,Nat.Immunol.U.S.10(1):29-37)。在慢性炎性疾患中，提出PD-1活性通过诱导与例如CD8+T细胞中记忆标志物如IL-7R的下调相关的耗竭的T细胞状态来减弱T细胞炎症性功能。为了评价PD1AB-6-K3对CD8+T细胞耗竭的影响，在CD8+T细胞中测量活化的T细胞上的IL-7Rα(CD127)表达。用抗CD3(R&D系统，MAB100ARH1113091)和抗CD28(eBiosciences，16-0289)抗体与通过CD2的共刺激信号的组合活化CD8+T细胞6天。PD1AB-6-K3在体外测定中减少未耗竭的IL-7Rhi CD8+T细胞并且增加耗竭的IL-7Rlo CD8+T细胞(图18)。在图18中，IgG1代表非特异性人IgG1同种型对照；IgGFc代表非特异性人IgG1Fc片段对照；通过t检验对比无抗体对照(N＝8)，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；剑号代表通过学生t检验与同种型对照相比的p值；这些结果表明，PD1AB-6-K3处理增加如由LAG-3或CTLA-4表达上调或IL-7R表达下调所定义的耗竭的CD8+T细胞的比例。
5.4.4T细胞增殖的抑制
为了评价在不存在来自其它细胞的影响下PD1AB-6-K3对T细胞增殖的影响，将分离的CD4+和CD8+T细胞与顺式(同一珠粒表面上的刺激物和PD1AB-6-K3)或反式(不同珠粒表面上的刺激物和PD1AB-6-K3)结合至珠粒的PD1AB-6-K3一起孵育。通过氚化胸苷掺入测定来测量作用。
在与EasySepTM阴性选择孵育后通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心从新鲜血沉棕黄层(富含白细胞的单位，Blood Center of New Jersey,NJ、New York Blood Center,NY和Biological Specialty Corp.Colmar,PA)富集CD4+和CD8+T细胞。简言之，将2x 108个细胞/ml PBMC与4ml的RobosepTM缓冲液混合，并转移至14-ml聚苯乙烯圆底管中。每管添加EasySepTM人富集混合物(200μl)，将其涡旋并在室温下孵育10分钟。将EasySepTM磁性颗粒(每管300μl)添加，涡旋并在室温下孵育5分钟。向每管中添加RobosepTM缓冲液(5ml)并通过上下吸移充分混合。将管置于银磁体中并在室温下孵育5分钟。拾取磁体和管并以一个连续动作倒置，从而将所需的级分倒入50mL锥形管中。将细胞在1200rpm下旋转5分钟。倒出上清液，并且添加5ml新鲜培养基。在对细胞计数后，取出等分试样用于FACS分析，并且剩余的细胞用于培养。如通过流式细胞术所测定细胞被分离至约95％纯度。将纯化的细胞以1x 105个细胞/孔涂铺在无菌96孔板中的细胞-适当的培养基内(每孔100μl)。
根据制造商的方案(Invitrogen)，将PD1AB-6-K3共价偶联至Dynabead M-450环氧树脂珠粒。简言之，用5μg抗体包被107个珠粒。对于“顺式”构型，将107个珠粒与1μg的抗CD3抗体和2μg的PD1AB-6-K3的混合物偶联。对于“反式”构型，将107个珠粒与1μg的抗CD3抗体或2μg的PD1AB-6-K3偶联。蛋白质与珠粒的共价偶联在0.1mol/L磷酸钠缓冲液中在室温下进行24小时，同时轻轻地倾斜和旋转。将Dynabead重新悬浮于含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)中以获得4x 108个珠粒/ml。
将分离的CD4+或CD8+T细胞(106个细胞)重新悬浮于96孔板中的每孔100μL培养基内。以2:1或8:1的珠粒与细胞比添加100μL的PD1AB-6-K3-缀合的珠粒。将细胞在37℃下在5％CO2下于潮湿孵育箱中孵育。在T细胞处理的第2天和收获前24小时，向每个孔中添加1微居里的3H胸苷(Amersham)，并将细胞在37℃下在5％CO2下于潮湿孵育箱中再次孵育。在与3H-胸苷孵育24小时后，使用细胞收集器(Tomtec)将细胞收获到UniFilterTMGF/C滤板(Perkin Elmer)上，并使板干燥过夜。添加MicroscintTM 20(Packard)(20μL/孔)并使用TopCountTM NXT(Packard)微板闪烁和发光计数器分析板。对每个孔计数1分钟，并使用GraphPadTM Prism绘制每分钟计数(cpm)值。
在CD4+T细胞中：在1:2和1:8的细胞与珠粒比下，对于反式，与抗CD3处理的细胞相比，对于抗CD3/PD1AB-6-K3处理的细胞存在显著增殖抑制(抑制％分别为57±12和55±9[p<0.0001，N＝4]，而顺式构型未显示显著抑制(图19A)。
在CD8+T细胞中：在1:2和1:8的细胞与珠粒比下，对于反式，与抗CD3处理的细胞相比，对于抗CD3/PD1AB-6-K3处理的细胞存在显著增殖抑制(抑制％分别为42±17和37±14[p≤0.05，N＝4]，而顺式构型未显示显著抑制(图19B)。
这些结果表明PD1AB-6-K3在不存在来自其它细胞的影响的情况下抑制抗CD3处理的CD4+和CD8+T细胞的增殖，并且仅在PD1AB-6-K3和抗CD3处于反式构型时发生PD1AB-6-K3对T细胞增殖的抑制作用。
5.4.5CD25+Foxp3+诱导的调控性T细胞的增加
为了评估抗PD-1抗体对调控性T细胞(Treg细胞)产生的影响，诱导从PBMC分离的初始CD4+T细胞分化成诱导的Treg细胞。按照制造商的说明书使用初始CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,Germany)从PBMC中负选择初始CD4T细胞。将初始CD4+T细胞与0至2.5ng/mL TGF-β、10ng/mL IL-2、0.25μg/mL可溶性抗CD28和1μg/mL固定化抗CD3一起培养。以1nM添加可溶性PD1AB-6-IgG1和IgG1Fc同种型。在孵育5天后，收集细胞并针对Foxp3进行染色。
将细胞在4℃下用稀释的表面染色抗体(CD4PerCP、CD25PE、PD-1BV421)染色30分钟，并用300μL的FBS洗涤。将细胞透化并用每管500μL的1X Foxp3固定/透化缓冲液固定，在室温下孵育60分钟。用500μL的透化缓冲液洗涤细胞两次。将细胞在室温下用50μL稀释的Foxp3抗体针对Foxp3在细胞内染色1小时，然后用500μL的透化缓冲液洗涤。将细胞用500μL的FACS缓冲液洗涤一次，并重新悬浮于175μL的FACS缓冲液中。将细胞转移至96孔板以在BDFACSCantoTM流式细胞仪上获取样品。
如图20中所示，PD1AB-6-IgG1在一系列TGF-β浓度范围内增加CD25+Foxp3+诱导的Treg细胞。
5.4.6正常供体和自身免疫性疾病患者中T细胞上免疫检查点蛋白的表达
在来自正常供体和自身免疫性疾病患者(AD、CD、PS、PsA、RA和SLE)的初始细胞与刺激的细胞之间比较PD-1细胞表面表达。在健康供体中，大多数记忆T细胞表达PD-1，而仅少数初始T细胞表达PD-1(数据未示出)。当用10％热灭活的FBS培养时，患者来源的T细胞相较于健康供体PBMC(用5μg/mL植物凝集素(Sigma，61764-1MG)活化之前和之后)表达相似水平的PD-1(数据未示出)。
PD-1和其它检查点抑制蛋白在T细胞表面上的表达可在疾病状态中差异调节，并且通过扩展，对PD1AB-6-K3活性具有影响。在PBMC的离体培养物中评估PD-1和其它免疫检查点蛋白在来自健康对照和自身免疫性疾病患者(AD、RA和PS)的T细胞上的表达。将来自健康和自身免疫性疾病供体(Conversant Biologics)的PBMC(5x105个)在含有10％热灭活的人自体血清(Conversant Biologics)的RPMI(Invitrogen)中培养。PBMC未受刺激(基础条件)或在37℃下用抗CD3(3μg/mL R&D系统，MAB100ARH1113091)和抗CD28(1μg/mL，eBiosciences，16-0289)抗体刺激24小时。将细胞用染料(可固定的蓝色死细胞染料，Molecular ProbesTML23105)染色，且然后用荧光缀合的抗CD4+(APC-Cy7，BD Biosciences 557871)、抗CD8+(PE-Cy5，BD Biosciences 555367)，抗PD-1(BV650，BD Biosciences 564324)、抗PD-L1(BV421，563738)、抗PD-L2(APC，BDBiosciences 557926)、抗LAG-3(FITC eBiosciences 11-2239)、抗CTLA-4(CD152)(BV786，BD Biosciences 563931)和抗TIM-3(PE-Cy7，eBiosciences 25-3109)抗体染色以用于通过流式细胞术(LSRFortessa流式细胞仪，FACSDiva分析软件，BD Biosciences；FlowJoTM分析软件)检测。
在静息CD4+T细胞上，PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、CTLA-4和TIM-3的基线表达在疾病患者和健康对照(HC)之间没有显著差异(表17)。与CD4+T细胞相比，来自AD和PS患者的静息CD8+T细胞显示出显著更低的PD-1和TIM-3表达，而RA患者与健康对照相比没有差异(表17)。
在活化的CD4+T细胞中，PD-1表达在HC和PS患者中与未刺激的细胞相比上调。PS患者的CD4+T细胞中PD-1表达的增加显著高于刺激的HC。在T细胞刺激后PD-L1的诱导表现出与PD-1相似的模式。与HC相比，PS患者CD4+T细胞还显示更高水平的LAG-3、CTLA-4和TIM-3表达的上调。在所有组中T细胞刺激后PD-L2的表达基本上没有变化，而AD样品具有未达到显著性的可变诱导的PD-1和TIM-3表达(表18)。
在活化的CD8+T细胞中，相对于已经在其静息状态下表达PD-1的未刺激的CD8+T细胞，PD-1表达趋于更高；然而，增加的表达未达到显著性。相对于基础未刺激水平下的健康对照显示降低的PD-1水平的所有三个疾病组AD、RA和PS(表17)在刺激的CD8+T细胞上展示更高水平的PD-1，尽管表达仍然等于或低于未受刺激的HC的表达(表18)。与HC、AD和PS患者相比，PD-L1在活化的CD8+T细胞中显著诱导(PD-L1在RA患者中未达到显著性)(表18)。在HC中CD8+T细胞刺激后也诱导PD-L2表达，但在疾病患者(AD、RA或PS)中则不(表18)。
结果表明，AD、RA和PS中的循环CD4+T细胞在活化时可表达PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4和TIM-3，其中PS CD4+T细胞被引发为相对于健康对照的那些表达高水平的PD-1和TIM-3。但是，根据疾病，CD8+T细胞的基础和诱导的在活化后表达PD-1和TIM-3的能力均减弱，这取决于疾病。
表17.来自自身免疫性疾病患者的静息T细胞上免疫检查点蛋白的基线表达
表18.相对于刺激的健康对照，来自自身免疫性疾病患者的刺激的T细胞上免疫检查点蛋白的表达
5.4.7类风湿性关节炎、克罗恩氏病和银屑病疾病组织中PD-1和PD-L1的表达
在类风湿性关节炎患者(n＝5)、克罗恩氏病患者(n＝3)和银屑病患者(n＝3)的较小子集中使用免疫组织化学与它们的正常对应物(n＝3)相比研究了PD-1和PD-L1的表达。
在疾病部位形成组构良好的淋巴滤泡在克罗恩氏病和类风湿性关节炎中是常见的，但在银屑病中不常见，从而表明在疾病进展期间PD-1和PD-L1表达、应答和动态可能在这些慢性适应症之间不同。PD-1和PD-L1表达评分(图25A-25C)显示克罗恩氏病中PD-1(2倍增加)和PD-L1(6倍增加)的显著上调(图25A)以及银屑病中的微小变化(图25C)。
通常，PD-1在存在于有组织的淋巴滤泡内的淋巴细胞中表达，但在弥漫性浸润物中的淋巴细胞中不表达(图21-23，左图)。PD-L1进而更广泛地表达并且存在于淋巴滤泡内的白细胞中(图22，右图)并且还扩散地分布在患病组织中(图23，右图)。PD-L1也由其它细胞类型(如基质成纤维细胞和内皮细胞)在强烈炎症区域中表达。图24，右图示出克罗恩氏病患者(Crohn’s patient)的肠溃疡区域中PD-L1表达的显著上调的细节。大细胞具有与活化的巨噬细胞的形态相容的形态。
图21和22显示出两名RA患者中的代表性IHC染色。如图21中所示，虽然PD-1在RA患者的滑膜中的淋巴聚集体内的淋巴细胞的细胞质中强烈表达(左图)，但是PD-L1的表达很弱并且仅限于淋巴聚集体内的少数大细胞(可能是巨噬细胞/树突细胞)(右图)。如图22中所示，一些淋巴细胞在RA患者的淋巴聚集体内表达细胞质/膜PD-1(左图)。PD-L1在类似位置中的巨噬细胞和/或树突细胞的细胞质和膜中较弱表达。
图23示出克罗恩氏病患者的肠中的代表性IHC染色。如图23中所示，PD-1(左图)的表达局限于克罗恩氏病患者的粘膜(左上)和粘膜下层(下中)的滤泡聚集体内的淋巴细胞。另一方面，PD-L1(右图)由淋巴聚集体和弥漫性粘膜炎性浸润物中的巨噬细胞/树突细胞更广泛地表达。
图24示出克罗恩氏病肠样品的溃疡区域中的代表性IHC染色。如图24中所示，在炎性浸润物扩散而没有卵泡形成的溃疡区域中，存在罕见的PD-1+淋巴细胞(左图)但是丰富的PD-L1+巨噬细胞(右图)。PD-1的表达主要是细胞质的，而PD-L1在上调时主要出现膜质。
图25A-25C示出克罗恩氏病、RA和银屑病患者中的PD-1和PD-L1表达评分。在克罗恩氏病中观察到PD-L1的显著上调(图25A)，但在银屑病中观察到PD-L1表达的微小增加(图25C)。
5.4.8抑制B细胞分化为浆母细胞
使用来自StemCell Technologies(Vancouver,Canada)的EasySepTM人B细胞富集试剂盒从正常人PBMC中纯化CD19+B细胞。使用来自StemCell Technologies的EasySepTM直接人T细胞富集试剂盒(EasySepTM Direct Human T Cell Enrichment Kit)从正常人全血中纯化CD3+T细胞。
根据制造商的方案(Invitrogen,Carlsbad,CA)将人抗CD3抗体UCHT1(BioLegend,San Diego,CA)、PD1AB-6-K3或PD-L1Fc融合蛋白与Dynabead M-450环氧树脂珠粒共价偶联。对于“反式”构型偶联珠粒，将107个珠粒与1μg的抗CD3抗体或2μg的PD1AB-6-K3或PD-L1Fc融合蛋白偶联，以使得每种蛋白质代表仅一种蛋白质类型缀合在单个珠粒上的独特珠粒组。蛋白质与珠粒的共价偶联在0.1mol/L磷酸钠缓冲液中在室温下进行24小时，同时轻轻地倾斜和旋转。将蛋白质偶联的Dynabead离心并重新悬浮于1mL封闭缓冲液(含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH 7.4)中以获得4x 108个珠粒/mL。通过仅在封闭缓冲液中孵育珠粒来制备空珠粒。
在体外B细胞分化共培养系统中培养富集的正常人CD19+B和CD3+T细胞。将CD19+B细胞添加至96孔圆底板的每个孔中(最终细胞计数＝2x105个/孔)。将CD3+T细胞添加至96孔圆底板的每个孔中(最终细胞计数＝1x105个/孔)。将珠粒结合的PD1AB-6-K3、PD-L1Fc融合蛋白或空珠粒以4比1的珠粒与细胞比添加至细胞。
在1小时后，将珠粒结合的人抗CD3抗体UCHT1(2比1的珠粒与细胞比)和重组人IL-21(100ng/mL，ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)添加至每个孔中并在37℃下孵育4天。在第4天，向每个孔中添加另外的重组人IL-21(100ng/mL)并在37℃下孵育2天。
在第6天收获细胞。然后用LIVE/DEAD可固定蓝色死细胞染色剂(ThermoFisherScientific)对细胞进行染色。接下来，用BD PharmigenTM Fc块(BD Bioscience,SanDiego,CA)封闭细胞。在封闭后，根据用于表面标记染色的实验设计添加BD Bioscience流动抗体(CD20-APC、CD38-BV510、IgM-BUV395、CD3-PERCP5.5、CD27-BV786)。立即分析样品或将其置于4℃过夜。使用BD LSRFortessaTM细胞分析仪、FACSDivaTM分析软件(BDBioscience)和分析软件(FlowJo LLC,Ashland,OR)分析所有样品。浆母细胞被定义为总CD19+B细胞群体中的CD20-CD38+B细胞。
在第6天收获上清液，并通过人IgG ELISA试剂盒(Abcam,Cambridge,UK)分析IgG产生。
图33示出来自四个供体的示例性流式细胞术结果，所述结果证明在体外T细胞/B细胞共培养系统中CD20+CD38-活化的B-淋巴细胞分化成CD20-CD38+浆母细胞。
在T细胞受体活化的CD3+T细胞/总B细胞共培养物中，与空珠粒相比，珠粒结合的PD1AB-6-K3诱导浆母细胞数量的平均25.0％减少(p＝0.15)(图34A)、IgG分泌的平均24.4％减少(p＝0.04)(图34B)，但IgM表面表达的平均11.5％增加(p＝0.15)(图34C)。每个供体样品的变化百分比列于以下表22中。
表22.在T细胞受体活化的CD3+T细胞/总B细胞共培养物中PD1AB-6-K3诱导的浆母细胞数量、IgG分泌和IgM表面表达的变化百分比
在并行T细胞受体活化的CD3+T细胞/总B细胞共培养物中，与空珠粒相比，珠粒结合的PD-L1Fc融合蛋白诱导浆母细胞数量的平均43.8％减少(p＝0.02)(图35A)、IgG分泌的平均12.7％减少(p＝0.38)(图35B)，但IgM表面表达的平均0％增加(中值6.7％增加，p＝0.55)(图35C)。每个供体样品的变化百分比列于以下表23中。
表23.在T细胞受体活化的CD3+T细胞/总B细胞共培养物中PD-L1Fc融合蛋白诱导的浆母细胞数量、IgG分泌和IgM表面表达的变化百分比
这些结果证明PD1AB-6-K3在体外CD3+T细胞/总B细胞共培养系统中抑制B细胞分化为浆母细胞和IgG分泌，从而表明PD1AB-6-K3可有效治疗B细胞抗体介导的疾病，如过敏症。
5.5体内药理学
5.5.1异种移植物抗宿主病(GvHD)模型
Xeno-GvHD模型涉及将人PBMC或人T细胞亚群(通过纯化或消减特异性T细胞亚群而分离)转移到免疫缺陷型NSG小鼠品系中。将人PBMC或T细胞转移到免疫缺陷型NSG小鼠中导致人T细胞植入淋巴器官中、可作为细胞因子分泌测量的人T细胞的活化以及人淋巴细胞浸润到各种器官中。在功效研究中，血浆中的T细胞细胞因子水平(IFN-γ、GM-CSF、IL-17和TNF-α)和血液和/或脾脏中的人细胞植入(以人CD45+％测量)被用作初级终点。在一些研究中，进行了淋巴细胞浸润到非淋巴器官中的额外表征，以更好地理解测试分子的生物学。选择这一模型是由于缺乏PD1AB-6-K3与小鼠PD-1的交叉反应性。在所有这些研究中，CTLA4Ig用作模型的阳性对照。
5.5.1.1 PD1AB-6-K3在T细胞活化的人PBMC转移模型中的作用
进行研究以确定PD1AB-6-K3对人T细胞活化的体内功效。将人PBMC转移至NSG敲除小鼠中，并通过细胞因子释放到血浆中以及小鼠的血液和脾脏中的人CD45+淋巴细胞植入来测定T细胞活化。在第0天，通过注射到NSG小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)的尾部中来静脉内施用来自健康供体的二千万个人PBMC(0.1mL)(AllCells Inc.,Alameda,CA)。在第1天，将适当的测试物品(PD1AB-6-K3、PD1AB-6-IgG1、PD1AB-6-4P、CTLA4Ig/阿巴西普阳性对照(Bristol-Myers Squibb)和人IgG1同种型阴性对照(EurekaTherapeutics))以2.5mg/kg腹膜内(IP)施用，每周3次(周一、周三和周五)，在研究I和II中持续28天并且在研究III中持续16天。在28天后，收集小鼠的血液和脾脏以制备血浆和细胞悬浮液。使用Meso ScaleTM Sector Imager 6000经由定制的人Meso ScaleTM 4斑点酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(Meso Scale Diagnostics,Rockville,MD)测量小鼠血浆中人细胞因子GM-CSF、IFN-γ、TNF-α、IL-17的水平。根据标准曲线(5.000至0.3pg/mL)测定细胞因子的血浆水平。功效被表示为与媒介物对照相比的抑制百分比。通过流式细胞术测定人CD45+细胞的增加百分比，在异种-GvHD小鼠模型中评估人CD45+细胞的植入。将100微升每种脾细胞悬浮液或全血样品用抗人CD45-PerCP染色以用于流式细胞术分析(BDFACSCaliburTM,FlowJoTM software,BD Biosciences)。
研究证明，在小鼠血浆中检测到的人淋巴细胞植入(人CD45+细胞)的水平和人细胞因子如GM-CSF、IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-17的水平因供体而不同。PD1AB-6-K3对人CD45+淋巴细胞植入具有最小影响，而CTLA4Ig显著降低植入程度(图26B)。PD1AB-6-K3显示在一项研究中朝向细胞因子的抑制和在使用不同供体的另一项研究中朝向细胞因子(GM-CSF(图26A)、IFN-γ、TNFα、IL-10和IL17[p<0.0001至0.05])的统计上显著抑制的趋势。与预期相反，具有较高细胞因子水平的研究显示出使用PD1AB-6-K3的更多抑制。在两项研究中，PD1AB-6-K3处理显著降低血液和脾脏中CD4+和CD8+T细胞上的PD-1表达(数据未示出)。在从脾脏分离的T细胞中研究的差异基因表达在PD1AB-6-K3(5mg/kg)对比媒介物处理的CD4+或CD8+T细胞之间未显示任何统计学显著差异。然而，与假设的药物作用和途径分析方法相关的特定目标基因的分析揭示了通过PD1AB-6-K3处理显著改变的许多途径和功能基因组(数据未示出)。表19示出来自研究I和研究II的代表性数据。
表19.在人PBMC转移模型中测试PD1AB-6变体的结果的总结
PD1AB-6-K3抑制T细胞细胞因子产生，这与用其它两种变体PD1AB-6-IgG1和PD1AB-6-4P观察到的细胞因子水平的抑制相当，从而表明PD1AB-6活性不是由于补体介导的T效应细胞的消减导致的(表19)。此外，对植入任何测试的PD1AB-6抗体的人CD45+细胞的百分比没有影响，从而进一步支持C1q(补体)依赖性细胞消减未发生的假设(在本研究中可见的对CD45+细胞的PD1AB-6-4P植入的小但统计上显著的抑制未在整个研究中一致地观察到)。可比较剂量的阳性对照CTLA4Ig阻止人细胞的植入，从而导致没有可检测的细胞因子产生。
5.5.1.2 PD1AB-6-K3在T细胞活化的人CD4+T细胞转移模型中的作用
为了特异性地测试PD1AB-6-K3对作为许多自身免疫性疾病的主要介质的CD4+T细胞的影响，通过将纯化的人CD4+T细胞转移到NSG敲除小鼠中来进行研究以确定血浆细胞因子水平以及血液和脾脏中人CD45+细胞的百分比。使用鸟分枝杆菌复合物(MACS)磁分离系统(Miltenyi,Auburn,CA)从人PBMC(AllCells)中纯化CD4+细胞。在第0天将500万个纯化的人CD4+T细胞静脉内(IV)注射到NSG雌性小鼠中，并且一天后，PD1AB-6-K3以2.5mg/kg腹膜内给药，每周3次。在28天后，收集小鼠的血液和脾脏以制备血浆和细胞悬浮液。如先前所论述(参见章节5.5.1.1)进行血浆细胞因子水平和CD45+细胞植入的分析。
与媒介物对照或人IgG1同种型对照相比，PD1AB-6-K3显著抑制人CD45+淋巴细胞植入(>75％)。在PBMC转移模型中未观察到CD45+细胞植入的这种抑制，从而表明来自非CD4+T细胞的信号对PD1AB-6-K3介导的对人CD45+淋巴细胞植入的抑制具有影响。与媒介物对照组相比，每周给予3次2.5mg/kg的PD1AB-6-K3抑制人GM-CSF(98％)、IFNγ(99％)和IL-17(98％)产生(p<0.0001)。在2.5mg/kg单次腹膜内剂量后4小时的Cmax，PD1AB-6-K3的水平在剂量后72小时是5μg/mL，并且可检测长达168小时。表20示出来自这些研究的代表性数据。
表20.在人CD4+T细胞转移模型中测试PD1AB-6变体的结果的总结
图27A-27B和28A-28C示出来自研究V的代表性数据。每周3次腹膜内给予的剂量水平低至0.63mg/kg的PD1AB-6-K3与媒介物处理相比显著抑制血液(84％，p<0.0001，图27A)和脾脏(73％，p<0.0001，图27B)中的CD45+植入，以及GM-CSF、TNF-α和IL-17的血浆水平(86％至98％降低，p<0.0001)(图28A-28C)。这表明CD4+T细胞转移模型中PD1AB-6-K3的最小有效剂量将可能<0.63mg/kg，每周3次。
5.5.1.3 PD1AB-6-K3在T细胞活化的CD8+T细胞消减的人PBMC转移模型中的作用
还在通过转移CD8+T细胞消减的PBMC建立的修饰的异种-GvHD模型中进行了研究，所述模型允许在来自非T细胞的共刺激和存活信号存在下评估PD1AB-6-K3对CD4+T细胞的作用。使用BSL2实验室中的MACS CD8微珠，在新鲜人PBMC(AllCells)中磁性标记CD8+细胞。一旦标记，就将细胞悬浮液上样到磁场上的MACS分离柱上，所述柱保留CD8+细胞；或使用QuaroMACSTM分离器(Miltenyi)进行纯化。收集并汇集呈CD8阴性的未标记细胞。在实验开始时(第0天)，将0.1mL细胞悬浮液(每只动物2千万个CD8+T细胞消减的PBMC)静脉内注射到NSG雌性小鼠的尾静脉中。在研究VI、VII、VIII预防性给药和IX预防性给药中，在第1天开始施用PD1AB-6-K3、PD1AB-6-4P、CTLA4Ig或PD-L1Fc，并且在第16天结束研究。在研究VIII治疗性给药中，在第15天开始施用PD1AB-6-K3、PD1AB-6-4P、CTLA4Ig或PD-L1Fc，并且在第28天结束研究。如先前所论述的那样(参见章节5.5.1.1)进行血浆细胞因子水平和CD45+细胞植入的分析。
基于在CD4+T细胞转移模型中测试的最低剂量，选择每周3次给予的0.63mg/kg的起始剂量水平。在使用PD1AB-6-K3治疗第16天(研究终止)，血液或脾脏中的人CD45+细胞植入没有受到抑制。在研究VI中，两种剂量的PD1AB-6-K3(0.63mg/kg和0.3mg/kg)都表现出GM-CSF(在0.63mg/kg下79％；在0.3mg/kg下71％；p<0.0001)、IFN-γ(在0.63mg/kg下60％；在0.3mg/kg下51％；p<0.05)以及IL-17(在0.63mg/kg下87％；在0.3mg/kg下66％；p<0.01至0.05)的显著抑制。在具有不同供体的另一项研究VII中，测试了每周3次给予的较低剂量0.3和0.15mg/kg(数据未给出)。有一些细胞因子受到抑制(GM-CSF和IL-17在两种剂量下都受到抑制，TNF-α仅在0.15mg/kg情况下受到抑制)，但在任何剂量下IFN-γ都没有受到抑制。然而，CTLA4-Ig治疗在低至0.15mg/kg的剂量下抑制T细胞植入并遏制细胞因子释放。在这两项研究VI和VII中，PD1AB-6-K3在所有测试的剂量下都显著下调CD4+T细胞上的PD-1表达。
以每周一次0.63mg/kg给予的PD1AB-6-K3表现出对GM-CSF(p<0.05)和IL-17(p<0.01)的抑制(研究VIII预防性给药)，但在不同供体PBMC的情况下仅表现出对IL-17的抑制(p<0.05)(研究IX预防性给药)。与每周3次给药的结果类似，每周一次的PD1AB-6-K3治疗对人CD45+细胞的植入没有影响。在研究VIII治疗性给药中，疾病发作后(细胞转移后15天，被认为是治疗性给药)每周3次以1.25mg/kg给予的PD1AB-6-K3或CTLA4-Ig仅抑制GM-CSF，并且被认为在CD8+T细胞消减的人PBMC转移模型中的治疗性给药中无效。在PD1AB-6-K3处理的情况下，脾脏中CD4+T细胞上的人PD-1表达显著降低了46％(p<0.05，数据未给出)。基于所有上述研究的细胞因子抑制结果，每周3次腹膜内给予的0.63mg/kg的PD1AB-6-K3被鉴定为CD8+T细胞消减的人PBMC转移模型中的最小有效剂量。
表21给出来自研究VII-IX的代表性数据。
表21.在人CD8+T细胞消减的PBMC转移模型中测试PD1AB-6变体的结果的总结
如上所示，当将纯化的CD4+T细胞转移到NSG小鼠中时，PD1AB-6-K3治疗降低了总体植入效率，但是当植入PBMC或CD8+T细胞消减的PBMC时，所述PD1AB-6-K3治疗不影响人CD45+淋巴细胞的植入或不改变所植入细胞内的CD4:CD8百分比(表19-21)。这表明与其它细胞类型(主要是CD8+T细胞消减的PBMC中的单核细胞)上的受体的相互作用影响来自PD1AB-6-K3的抑制信号。
5.5.1.4 PD-1表达的下调先于细胞因子抑制
在第0天，将500万个纯化的人CD4+T细胞静脉内注射到NSG雌性小鼠中。在细胞转移后第21天时给予小鼠单剂量的50μg/小鼠的TAPA抗体。收集PK样品直至第7天。在最后一剂药后24小时测量细胞因子水平和PD-1表达。将细胞用抗人CD45和抗人CD4(以区分人CD4+T细胞)和抗PD-1(被证明在PD1AB-6变体存在下能够结合PD-1的eBioscience抗体)染色以测量PD-1表达。图示出CD4+T细胞表面上PD-1的平均荧光强度染色。如图29A-29B中所示，PD-1下调早在单剂PD-1抗体后24小时观察到(图29A)，并且在可检测到细胞因子抑制之前观察到(图29B)。
5.5.1.5功效(细胞因子抑制)与PD-1下调的相关性
在各种研究中绘制了PD-1下调与细胞因子抑制(功效)之间的相关性(图30A-30B)。与PD1AB-6-4P相比，PD1AB-6-K3表现出更大程度地促进PD-1表达的下调以及更大程度地抑制细胞因子的趋势。对于IL-17抑制尤其如此(图30A)。对细胞因子没有表现出抑制作用的PD-L1.Fc也未下调PD-1(图30A-30B)。
5.5.2人PD-1敲入(hPD-1KI)小鼠中的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型
使用PD1AB-6-K3的鼠替代物，在EAE的小鼠模型中进一步测试PD1AB-6-K3的体内功效。这些研究采用在C57BL/6背景下的人PD-1敲入纯合(hPD-1KI)小鼠。对PD1AB-6-K3进行修饰以保留PD-1结合可变区，其中Fc区转变成具有与K322A相当的突变的鼠IgG2a。该分子被称为PD1AB-6-K3muFc，并且充当测试hPD-1KI小鼠中的PD1AB-6-K3活性的替代分子。在由髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽诱导的EAE小鼠模型的两种型式中评估亲本PD1AB-6-IgG1和PD1AB-6-K3muFc的功效，其中百日咳毒素(PTX)或抗CD25施用于雌性hPD-1KI小鼠(MOG-EAE)中。
对于PTX施用型式，在第0天将小鼠用吸入的异氟烷麻醉，并且给予两次皮下(SC)注射各100μL的来自Hooke Laboratories(Lawrence,MA)的在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的MOG肽35-55(MOG)，总计200μL MOG/CFA注射。一次注射在上背部区域上给予，并且第二次注射在下背部区域上给予(每个注射部位100μL)。在免疫后2小时，向每只动物给予第一次腹膜内(IP)施用PTX(于0.1mL中200ng)(Hooke Laboratories)。在24小时后给予第二次腹膜内施用PTX(于0.1mL中200ng)。
对于抗CD25施用型式，将小鼠用吸入的异氟烷麻醉，并在第0天在小鼠的下背部上给予一次皮下注射100μL MOG/CFA。在第6天，将每只小鼠腹膜内注射200μL体积的1mg抗小鼠CD25抗体(Bio X Cell,West Lebanon,NH)。在第7天在上背部区域中给予第二次注射100μL MOG/CFA。
从研究开始后第5天开始，在周一、周三和周五以10mg/kg的剂量腹膜内施用亲本PD1AB-6-IgG1。从研究开始后第5天(预防性处理)或第12天(治疗性处理)开始，在周一、周三和周五以1.25mg/kg、5mg/kg或10mg/kg的剂量腹膜内施用PD1AB-6-K3muFc。
在EAE模型中，其中在注射MOG/CFA、然后2次注射PTX后诱导小鼠罹患慢性EAE，与媒介物组相比，给予PD1AB-6-K3-IgG1或PD1AB-6-K3muFc的治疗组中存在显著死亡率。死亡率与较高的疾病评分无关，并且在抗体注射的几小时内发生。
为了确定具有PTX的MOG-EAE模型中的死亡是否是靶标相关的，基于文献(Ji等人,2011,J Immunol 186(5):2750-56)设计了另外的研究。在具有PTX的MOG-EAE模型中使用大鼠抗小鼠整联蛋白α(极晚期抗原[VLA])-4抗体(EMD Millipore,Billerica,MA)和相应的大鼠同种型对照抗体。与文献一致，与媒介物对照相比，从第5天用抗VLA-4和大鼠同种型对照抗体治疗导致显著的死亡率，死亡发生在抗体注射的几小时内，并且死亡率与疾病评分之间缺乏相关性。这些观察结果与使用PD1AB-6-K3muFc进行的那些治疗相似，揭示死亡率与靶标无关。基于文献(Montero等人,2004,J Autoimmun.23(1):1-7)，对MOG-EAE模型进行修改，用消减抗-CD25作为佐剂替代PTX。
在修改的抗CD25EAE模型中，其中在注射MOG/CFA和抗CD25后诱导小鼠罹患慢性EAE，在媒介物组中临床EAE(如通过体重变化和疾病评分评估)到第11天至第16天时明显，并且在第20天左右达到峰值。由于足部和尾部区域的伤口过多，在第24天和第27天对来自媒介物盐水组的两只动物实施安乐死。在第33天发现同种型对照(小鼠IgG2a，Bio X Cell)5mg/kg组和PD1AB-6-K3muFc5mg/kg组各一只动物死亡。这两只小鼠疾病评分都很高，都为4，并且死亡可能与EAE疾病有关。由于在小鼠IgG2a和PD1AB-6-K3muFc组中均观察到死亡率，所以它似乎不是EAE模型中PD1AB-6-K3施用所特有的有害影响。
与剂量匹配的同种型对照相比，5mg/kg的PD1AB-6-K3muFc在第20天至第31天显著抑制疾病评分(p<0.001-0.05；图31)，并且使疾病评分的AUC显著抑制了40％(p<0.05)。1.25mg/kg的PD1AB-6-K3muFc或鼠IgG2a对疾病评分或疾病评分的AUC没有影响。阳性对照FTY720(芬戈莫德，Cayman Chemicals,Ann Arbor,MI)表现出对第20天直到研究评分的最后一天(第31天；p<0.0001)的EAE疾病评分的显著抑制。为了将PD1AB-6-K3muFc的血清水平与对疾病的影响相关联，在研究结束时收获血清并测量PD1AB-6-K3muFc的水平。极少数动物的PD1AB-6-K3muFc水平高于检测水平(在5mg/kg下10只动物中有4只，并且在1.25mg/kg剂量组中10只动物中只有1只)。所有动物都具有可测量水平的抗药物抗体。与剂量匹配的同种型对照组相比，在用5mg/kg的PD1AB-6-K3muFc治疗后，脾脏和血液的CD4+和CD8+T细胞中人PD-1表达水平有降低的趋势。在MOG-EAE实验终止时(第23天和第34天)，在离体测定中测试脾脏细胞。来自治疗性PD1AB-6-K3muFc组的脾细胞(第23天终止)表现出IFN-γ分泌的显著(p<0.0001)抑制(66％)、具有高可变性(40％)的IL-17抑制的趋势，以及在回忆测定中响应于最高剂量的MOG的显著较低的CD4+T细胞增殖(42％，图32A)。来自第34天的脾细胞在PD1AB-6-K3muFc治疗后未表现出对细胞因子分泌或增殖的任何影响。
总之，体外和体内研究证明PD1AB-6-K3是高亲和力PD-1结合抗体，其如通过抑制促炎性细胞因子分泌和增加T细胞上抑制性受体的表达的能力所测量的，减弱了T细胞活性。PD1AB-6-K3的特异性和活性谱(profile)展示出在自身免疫性疾病环境中成为有益治疗剂的潜力。
6.序列表
本说明书与序列表的计算机可读形式(CRF)副本一起提交。于2017年9月11日创建且大小为50,882字节的名称为10624-385-228_SEQLIST.txt的CRF与序列表的纸质副本相同，并且以引用的方式整体并入本文。
序列表
<110> 细胞基因公司
<120> 使用PD-1结合蛋白治疗免疫病症的方法
<130> 10624-385-228
<140> TBA
<141> 与本申请同一日期
<150> US 62/396,736
<151> 2016-09-19
<160> 44
<170> FastSEQ 用于Windows 4.0版
<210> 1
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Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln
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Tyr Leu Tyr Ser Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Arg
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Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Arg Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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<223> 抗体PD1AB-5和PD1AB-6的VH结构域
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Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Arg Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
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Ala Arg Ser Gly Pro Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Met Asp
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<223> 抗体PD1AB-3的VL FR3
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35
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<223> 抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5和PD1AB-6的VH FR4
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Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<223> 抗体PD1AB-3和PD1AB-4的VH FR3
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Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser
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Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
20 25 30
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35
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体PD1AB-5和PD1AB-6的VH FR1
<400> 24
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Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体PD1AB-1和PD1AB-6的VL
<400> 25
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccggtca aagtgtttta tacagttcaa atcagaagaa cttcttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaagctga agatgtggca gtttattact gtcatcaata cctctactcg 300
tggacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaacgga c 341
<210> 26
<211> 341
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体PD1AB-2、PD1AB-4和PD1AB-5的VL
<400> 26
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaagctga agatgtggca gtttattact gtcatcaata cctctactcg 300
tggacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaacgga c 341
<210> 27
<211> 341
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体PD1AB-3的VL
<400> 27
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccggtca aagtgtttta tacagttcaa atcagaagaa cttcttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcaacc tgcaagctga agatgtggca gtttattact gtcatcaata cctctactcg 300
tggacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaacgga c 341
<210> 28
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体PD1AB-1和PD1AB-2的VH
<400> 28
gaggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggctac agtgaaaatc 60
tcctgcaagg tttctggatt caacattaaa gacacgtata tgcactgggt gcaacaggcc 120
cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaagg attgatcctg cgaatggtga taggaaatat 180
gacccgaagt tccagggcag agtcaccata accgcggaca cgtctacaga cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc tagatcaggc 300
cctgtttatt actacggtag tagctacgtt atggactact ggggtcaagg aaccacagtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 29
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体PD1AB-3和PD1AB-4的VH
<400> 29
gaggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggctac agtgaaaatc 60
tcctgcaagg tttctggatt caacattaaa gacacgtata tgcactgggt gcaacaggcc 120
cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaagg attgatcctg cgaatggtga taggaaatat 180
gacccgaagt tccagggcag agtcaccata accgcggaca cgtctacaaa cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc tagatcaggc 300
cctgtttatt actacggtag tagctacgtt atggactact ggggtcaagg aaccacagtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 30
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体PD1AB-5和PD1AB-6的VH
<400> 30
gaggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggctac agtgaaaatc 60
tcctgcaagg cttctggatt caacattaaa gacacgtata tgcactgggt gcaacaggcc 120
cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaagg attgatcctg cgaatggtga taggaaatat 180
gacccgaagt tccagggcag agtcaccata accgcggaca cgtctacaga cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc tagatcaggc 300
cctgtttatt actacggtag tagctacgtt atggactact ggggtcaagg aaccacagtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 31
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体PD1AB-6-IgG1的轻链
<400> 31
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Gly Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Leu Tyr Ser Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 32
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体PD1AB-6-IgG1的重链
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Arg Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Pro Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 33
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体PD1AB-6-K3的重链
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Arg Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Pro Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 34
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体PD1AB-6-4P的重链
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Arg Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Pro Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
210 215 220
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 35
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体PD1AB-6-4PE的重链
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Arg Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Pro Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
210 215 220
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 36
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 人IgG1的Fc区
<400> 36
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 37
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有K322A取代的人IgG1的Fc区，也称为IgG1-K322A Fc区
<400> 37
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 38
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 人IgG4的Fc区
<400> 38
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 39
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有S228P取代的人IgG4的Fc区，也称为IgG4P Fc区
<400> 39
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 40
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有S228P和L235E取代的人IgG4的Fc区，也称为IgG4PE Fc区
<400> 40
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 41
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体PD1AB-6-IgG1的轻链的恒定区
<400> 41
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 42
<211> 198
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 人PD-1
<400> 42
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly
195
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码用于抗PD-1抗体结合的表位的人PD-1的氨基酸100-109
<400> 43
Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser
1 5 10
<210> 44
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码用于抗PD-1抗体结合的表位的人PD-1的氨基酸100-105
<400> 44
Leu Pro Asn Gly Arg Asp
1 5

Claims (108)

1.一种管理、预防或治疗对象的免疫病症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段：
(a)结合至由抗体识别的人PD-1的表位，所述抗体包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区；或者
(b)与包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区的抗体竞争结合至人PD-1。
2.一种管理、预防或治疗对象的免疫病症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的结合至PD-1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)轻链可变区(VL)，所述VL包含如表1中列出的抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的VL互补决定区1(CDR1)、VL CDR2和VL CDR3；和/或
(b)重链可变区(VH)，所述VH包含如表2中列出的抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的VH互补决定区1(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)轻链可变区(VL)，所述VL还包含如表3中列出的抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的VL框架1(FR1)、VL FR2、VL FR3和VL FR4；和/或
(b)重链可变区(VH)，所述VH还包含如表4中列出的抗体PD1AB-1、PD1AB-2、PD1AB-3、PD1AB-4、PD1AB-5或PD1AB-6中的任一者的VH框架1(FR1)、VH FR2、VH FR3和VH FR4。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ IDNO:1、2和3的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ IDNO:7、2和3的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含VL，所述VL包含SEQID NO:8的氨基酸序列。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含VL，所述VL包含SEQID NO:9的氨基酸序列。
8.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含VL，所述VL包含SEQID NO:10的氨基酸序列。
9.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含VH，所述VH包含SEQID NO:11的氨基酸序列。
10.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含VH，所述VH包含SEQID NO:12的氨基酸序列。
11.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含VH，所述VH包含SEQID NO:13的氨基酸序列。
12.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；以及
(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
13.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及
(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
14.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；以及
(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
15.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；以及
(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
16.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及
(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
17.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；以及
(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
18.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；以及
(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
19.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及
(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
20.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)VL，所述VL包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；以及
(b)VH，所述VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG1Fc区或其变体。
22.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG1-K322A Fc区。
23.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链Fc区，所述重链Fc区包含选自由SEQ ID NO:36-40组成的组的氨基酸序列。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
25.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及
(b)重链Fc区，所述重链Fc区包含选自由SEQ ID NO:36-40组成的组的氨基酸序列。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
27.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
28.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及
(b)重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
29.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
30.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及
(b)重链，所述重链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
31.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
32.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及
(b)重链，所述重链包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
33.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
34.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及
(b)重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中当与PD-1结合时，所述抗体或抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的残基100-109中的至少一个。
36.如权利要求35所述的方法，其中当与PD-1结合时，所述抗体或抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的残基100-105中的至少一个。
37.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中当与PD-1结合时，所述抗体或抗原结合片段结合至选自由以下组成的组的至少一个残基：SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33、T51、S57、L100、N102、G103、R104、D105、H107以及S109。
38.如权利要求37所述的方法，其中当与PD-1结合时，所述抗体或抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N33。
39.如权利要求37所述的方法，其中当与PD-1结合时，所述抗体或抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的T51。
40.如权利要求37所述的方法，其中当与PD-1结合时，所述抗体或抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的S57。
41.如权利要求37所述的方法，其中当与PD-1结合时，所述抗体或抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的L100。
42.如权利要求37所述的方法，其中当与PD-1结合时，所述抗体或抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的N102。
43.如权利要求37所述的方法，其中当与PD-1结合时，所述抗体或抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的G103。
44.如权利要求37所述的方法，其中当与PD-1结合时，所述抗体或抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的R104。
45.如权利要求37所述的方法，其中当与PD-1结合时，所述抗体或抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的D105。
46.如权利要求37所述的方法，其中当与PD-1结合时，所述抗体或抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的H107。
47.如权利要求37所述的方法，其中当与PD-1结合时，所述抗体或抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的S109。
48.如权利要求37所述的方法，其中当与PD-1结合时，所述抗体或抗原结合片段结合至SEQ ID NO:42的氨基酸序列内的G103和R104。
49.如权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段：
(a)减弱T细胞活性；和/或
(b)下调T细胞表面上的PD-1表达。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述的T细胞活性的减弱由细胞因子产生受到的抑制来衡量。
51.如权利要求50所述的方法，其中受所述抗体或其抗原结合片段抑制的细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ或其任何组合。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述细胞因子是IL-1。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述细胞因子是IL-2。
54.如权利要求51所述的方法，其中所述细胞因子是IL-6。
55.如权利要求51所述的方法，其中所述细胞因子是IL-12。
56.如权利要求51所述的方法，其中所述细胞因子是IL-17。
57.如权利要求51所述的方法，其中所述细胞因子是IL-22。
58.如权利要求51所述的方法，其中所述细胞因子是IL-23。
59.如权利要求51所述的方法，其中所述细胞因子是GM-CSF。
60.如权利要求51所述的方法，其中所述细胞因子是TNF-α。
61.如权利要求51所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-γ。
62.如权利要求49至61中任一项所述的方法，其中所述的T细胞活性的减弱由T细胞增殖受到的抑制来衡量。
63.如权利要求49所述的方法，其中所述的T细胞活性的减弱由T细胞表面上抑制性受体的表达的上调来衡量，其中所述抑制性受体不是PD-1。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述抑制性受体选自由以下组成的组：LAG-3、CTLA-4和TIM-3。
65.如权利要求49所述的方法，其中所述的T细胞活性的减弱由T细胞回忆应答受到的抑制来衡量。
66.如权利要求49所述的方法，其中所述的T细胞活性的减弱由T细胞耗竭的增加来衡量。
67.如权利要求49所述的方法，其中所述的T细胞活性的减弱由调控性T细胞的增加来衡量。
68.如权利要求1-67中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合至人PD-1和/或猴PD-1，但不特异性地结合至啮齿动物PD-1。
69.如权利要求1-67中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段具有减弱的ADCC活性和/或减弱的CDC活性。
70.如权利要求49所述的方法，其中T细胞表面上PD-1表达的下调：
(a)早在用所述抗体或其抗原结合片段处理后4小时发生；和/或
(b)与细胞因子抑制同时发生或先于细胞因子抑制。
71.如权利要求68所述的方法，其中与纯化的人PD-1结合的KD是约100pM至约10nM，并且与细胞表面上表达的人PD-1和细胞表面上表达的猴PD-1结合的KD是约100pM至约10nM。
72.如权利要求49所述的方法，其中用于减弱T细胞活性的EC50是约1pM至约10pM、约10pM至约100pM、约100pM至约1nM、约1nM至约10nM或约10nM至约100nM。
73.如权利要求49所述的方法，其中T细胞活性的最大减弱百分比是至少约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
74.如权利要求49所述的方法，其中PD-1表达的最大下调百分比是至少约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
75.如权利要求1-74中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
76.如权利要求1-75中任一项所述的方法，其中所述抗体是人源化抗体、人抗体或嵌合抗体。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述人源化抗体是脱免疫化抗体或复合人抗体。
78.如权利要求1-74中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双抗体、三抗体、四抗体或由抗体片段形成的多特异性抗体。
79.如权利要求1-78中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段缀合至剂。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述剂选自由以下组成的组：放射性同位素、金属螯合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物以及化学发光化合物。
81.如权利要求1-80中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含药学上可接受的载体。
82.如权利要求1-81中任一项所述的方法，其中所述免疫病症是炎性疾病。
83.如权利要求1-81中任一项所述的方法，其中所述免疫病症是超敏性疾病。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述超敏性疾病选自由以下组成的组：过敏症、特应性皮炎和超敏性血管炎。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述超敏性疾病是过敏症。
86.如权利要求84所述的方法，其中所述超敏性疾病是特应性皮炎。
87.如权利要求84所述的方法，其中所述超敏性疾病是超敏性血管炎。
88.如权利要求1-81中任一项所述的方法，其中所述免疫病症是自身免疫性疾病。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、克罗恩氏病、银屑病、银屑病性关节炎、多发性硬化、狼疮、强直性脊柱炎、I型糖尿病、斯耶格伦氏综合征、溃疡性结肠炎、视神经脊髓炎、乳糜泻、硬皮病以及颞动脉炎。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是类风湿性关节炎。
91.如权利要求89所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是克罗恩氏病。
92.如权利要求89所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是银屑病。
93.如权利要求89所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是银屑病性关节炎。
94.如权利要求89所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是多发性硬化。
95.如权利要求89所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是狼疮。
96.如权利要求89所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是强直性脊柱炎。
97.如权利要求89所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是I型糖尿病。
98.如权利要求89所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是斯耶格伦氏综合征。
99.如权利要求89所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是溃疡性结肠炎。
100.如权利要求89所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是视神经脊髓炎。
101.如权利要求89所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是乳糜泻。
102.如权利要求89所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是颞动脉炎。
103.如权利要求89所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是硬皮病。
104.如权利要求95所述的方法，其中所述狼疮是全身性红斑狼疮。
105.如权利要求95所述的方法，其中所述狼疮是皮肤型红斑狼疮。
106.如权利要求95所述的方法，其中所述狼疮是狼疮性肾炎。
107.如权利要求82所述的方法，其中所述炎性疾病是葡萄膜炎。
108.如权利要求1-107中任一项所述的方法，其中所述对象中的免疫细胞表达PD-1。
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