JP2001514005A - 卵中でのタンパク質の産生 - Google Patents
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Abstract
Description
の送達のための発現系;該組換えタンパク質を含有する卵および該組換えタンパ
ク質を産生するトランスジェニック非ヒト産卵性動物に関する。
有するタンパク質の改良された産生を可能にしている。残念ながら、組換えタン
パク質の産生のためのこれまでの方法の多くは、タンパク質の大スケールでの産
生および精製のための高コストのために利用できないものである。
プの一つである。抗体(または免疫グロブリン)は、種々の疾患および病原体の
治療および診断の両方で有用な極めて特異的な手段である。簡単に説明すると、
完全な抗体または免疫グロブリン分子は2本の重(H)鎖および2本の軽(L)
鎖からなり、それぞれカルボキシ末端側に定常領域およびアミノ末端側に可変領
域を有している。幾つかの定常領域アイソタイプ、すなわち、軽鎖に対して2つ
(カッパおよびラムダ)および重鎖に対して5つ(アルファ、ガンマ、デルタ、
イプシロンおよびミュー)のアイソタイプがヒト免疫グロブリンにおいて同定さ
れている。名前が示しているように、可変領域の配列は各免疫グロブリン分子で
変化する。可変領域は抗原結合部位を有し、それゆえ免疫グロブリン分子の抗原
特異性を決定する。
抗体を用いるのが望ましい。しかしながら、実際的かつ倫理的な考慮から、ヒト
源から大量のヒト抗体を産生することは可能ではなかった。血清や母乳からのヒ
トIgが有効であることが示されているが、ヒト製品のコストが高いことと供給
が限られていることから広く応用することが阻まれている。非ヒト抗体調製物に
対する免疫応答を低下させるため、キメラ抗体やヒト化抗体が調製されている。
キメラ抗体は、抗体の定常領域がヒト抗体に由来し、可変領域が免疫した一般的
には非ヒトの宿主に由来するように遺伝子組換えにより製造される。可変領域は
、通常、所望の抗原で免疫した齧歯類から単離した抗体に由来する。
いう結果となる腸内感染は大きな公衆衛生問題となっており、開発途上国では1
0億以上の疾患の発現および数百万に及ぶ年間死者数となっている。ロタウイル
スは、開発国および開発途上国の両方で幼児や年少の子供での感染性胃腸炎の一
つの主要な原因である。腸管毒産生性の(enterotoxigenic)大腸菌(ETEC )は他の主要な病因であり、毎年6億以上の下痢のケースを引き起こしている。
ETEC疾患は、汚染された食物や水を摂取することにより開始される。細菌は
上部小腸に移動およびコロニー形成し、熱安定性および/または熱不安定性のエ
ンテロトキシンを産生する。両タイプの病原体は、粘膜表面を標的とした抗体処
置に対して感受性であるに違いない。
は卵中での組換えタンパク質の製造方法であって、該タンパク質の発現および卵
中への該タンパク質の送達に適した条件下で該タンパク質を産卵性哺乳動物で発
現させることを含む方法を提供する。
換えタンパク質を発現するのに必要な制御領域のDNA配列を含む発現系を用い
て動物で発現させ、卵中に送達できる。組換えタンパク質が通常、卵中には蓄積
しない場合には、発現系はまた該タンパク質を産卵性動物の卵へ標的または送達
することのできる第二のDNA配列を含むであろう。
伝子に由来する制御領域をコードしていてよい。または、この第二のDNA配列
は、卵上の受容体と結合しうるタンパク質またはペプチドをコードしていてよく
、その結果、組換えタンパク質の卵中への取り込みとなるものであってよい。 本発明者らは、免疫グロブリンタンパク質が産卵性哺乳動物で発現され、卵中
へ移動しうることを示した。とりわけ、本発明者らは、ヒト免疫グロブリンタン
パク質からの定常領域がトリ卵母細胞に結合することができ、卵黄内に取り込ま
れ得ることを見出した。
る。好ましい態様において、本発明は鶏卵でのヒト化抗体の製造に関する。 本明細書において使用する「ヒト化抗体」なる語は、ヒト定常領域を含む免疫
グロブリンまたは抗体分子を意味する。ヒト化抗体はキメラ抗体であってよく、
ニワトリやマウスなどの非ヒト種からの可変領域を含んでいてよい。この抗体は
また非キメラであってよく、ヒト可変領域を含んでいてよい。「抗体」および「
免疫グロブリン」なる語は、本明細書において相互に同じ意味で用いられる。
(iii)抗体を発現させるのに充分な制御領域を含む、組換え抗体を卵中へ送達 するための発現系を提供する。好ましくは、定常領域はヒト免疫グロブリンから
のものである。
いう本発明者らによる知見は、所定の組換えタンパク質(b)に結合した、卵へ
の結合および卵中への取り込みを可能とする免疫グロブリンタンパク質の充分な
部分(a)を含む融合タンパク質を調製することにより、組換えタンパク質を卵
中に送達することを可能にする。従って、本発明は、卵に結合し、その結果組換
えタンパク質の取り込みとなるのに充分な免疫グロブリン分子の部分をコードす
る第二のDNA配列(b)に作動可能に連結した、組換えタンパク質をコードす
る第一のDNA配列(a)を含む、組換えタンパク質を卵中に送達するための発
現系を提供する。特別の態様において、第二のDNA配列は免疫グロブリン定常
領域をコードする遺伝子からのものである。
つの態様において、発現系を直接、産卵性動物中に導入し、そこで組換えタンパ
ク質を発現させ、卵中へ送達させる。 他の態様では、発現系を培養中の宿主細胞へトランスフェクションする。この
宿主細胞を産卵性動物に注射することができ、そこで組換えタンパク質は分泌さ
れるであろう。宿主細胞は産卵性動物と同じ種のものであるのが好ましい。特別
の態様において、宿主細胞はトリ細胞株である。組換えタンパク質が抗体である
場合は、トリ細胞株はリンパ細胞株であるのが好ましく、さらに好ましくはDT
40やv−rel形質転換B細胞株などの不死化B細胞株である。
るタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質として発現するトランスジェニ
ック産卵性動物を調製することにより、発現ベクターを卵中へ送達させることが
できる。好ましくは動物は家禽類であり、組換えタンパク質はヒト化抗体などの
抗体である。
患の診断、予防および治療などにおける、該卵調製物のすべての使用を包含する
。卵調製物は直接用いることができ、または組換えタンパク質をさらに卵から単
離および精製することができる。
本発明はまた、動物の卵中に病原体に特異的な組換え抗体を調製することによ
り、病原体を含まない卵を調製するのに用いることができる。従って、本発明は
、特定の病原体を含まない卵の製造方法であって、 (a)該病原体に特異的な抗体を産卵性動物中に導入し、ついで (b)該動物に産卵させ、その際、該卵は実質的に該病原体を含まない ことを含む方法を提供する。
。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は本発明の好ましい態様を示す
ものではあるが、この詳細な説明から当業者には種々の変更および修飾が本発明
の範囲内で明らかであろうから、説明のためにのみ提供されたものであることが
理解されるべきである。
した条件下で該タンパク質を産卵性哺乳動物中で発現させることを含む、組換え
タンパク質を卵中で製造する方法を提供する。 タンパク質はいかなるタンパク質であってもよいが、抗体、サイトカイン、ホ
ルモン、酵素、ワクチンおよび診断応用のための抗原、および治療用ペプチドを
含む。
であってよい。好ましくは、卵はニワトリ、七面鳥またはアヒルなどの家禽類か
らのものである。組換えタンパク質源として卵を使用することは、昨今の動物保
護規制との適合性、安価さ、便利さ、無菌性、卵黄の分画および抗体などのタン
パク質の精製の技術を利用できることを含む、相当の利点を提供する。1個の卵
からは約100mgの抗体を産生することができ、1年に250個の卵を生む1
羽のメンドリからは25gのIgを産生することができ、10,000羽のメン ドリからなる小集団からは毎年25kgの免疫グロブリンを産生することができ
る。卵は室温で数週間貯蔵できる。
せ、卵中に移動させうることを示した。 とりわけ、本発明者らは、ニワトリに直接注射したときか(実施例1)または
組換えIgGまたはIgAを発現する細胞株をニワトリに注射したとき(実施例
2および3)のいずれかのときに、ヒト免疫グロブリン(Ig)GおよびIgA
を鶏卵中に移動させうることを示した。さらに、本発明者らは、家禽類の卵中へ
のIgの結合および取り込みに関与する免疫グロブリンの部分が、免疫グロブリ
ンタンパク質のFcドメイン中のCH2−CH3領域に存在することを決定した
。本発明者らはさらに、家禽類の卵上のFc受容体は、マウスでの母胎関門(ma
ternofetal barrier)を通過するIgGの輸送、母IgGのトランスサイトーシ
スおよび血清Igレベルの制御において何らかの役割を果たしている哺乳動物F
c受容体ネオネート(Fc Receptor neonate)のホモログであると思われること を決定した(実施例4)。
(iii)抗体を発現させるのに充分な制御領域を含む、組換え抗体を卵中へ送達 するための発現系を提供する。
細書中での定義において、ヒト化抗体は少なくともヒト定常領域を含む。定常領
域は、カッパおよびラムダ軽鎖およびアルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンお
よびミュー重鎖遺伝子を含むいかなる公知の定常領域からも選択することができ
る。可変領域は、ヒトのものであるか、または家禽類、ヒツジ、マウスまたはウ
シなどの非ヒトのものであってよい。可変領域と定常領域とが異なる種に由来す
るものであるならば、その抗体は「キメラ抗体」と呼ばれる。キメラ抗体は、Mo
rrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851-6859, 1984(参照のため本明細書
中に引用する)に記載されているような当該技術分野で知られた技術を用いて調
製できる。
菌、ウイルス、毒素、アレルゲン、並びに腫瘍結合抗原を含む疾患特異的抗原か
ら選択されてよい。所望の抗原特異性を有する可変領域をコードする可変領域遺
伝子は、所望の抗原特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マから得ることができる。所望の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマ
もまた、当該技術分野で知られた技術を用いて調製できる。簡単に説明すると、
動物(ニワトリ、マウスまたはウサギなど)を所望の抗原で免疫し、該抗体を産
生するリンパ球を得る。このリンパ球をミエローマ細胞などの不死化細胞と融合
させてハイブリドーマを調製することにより不死化する。所望の抗体を産生する
ハイブリドーマは、当該技術分野で知られた技術(たとえば、KohlerおよびMils
tein, Nature 256: 495-497, 1975を参照)を用いて選択することができる。つ いで、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの知られた技術を用いてハイブリド
ーマから所望の可変領域遺伝子を単離することができる。
また調製できる。 ヒト定常領域をコードするDNA配列は、利用できる入手源から得るか、また
はヒト定常領域を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株から上記技術を用
いて単離することができる。
A配列を含む組換え発現ベクターを調製することができる。これらベクターは、
さらに、プロモーター、エンハンサーおよび終止配列などの発現調節または制御
配列を含むであろう。好ましい制御配列は免疫グロブリン遺伝子からのものであ
るが、ウイルスからのものなどの別の制御領域を用いることもできる。ベクター
は、プラスミド、ウイルス、レトロウイルス、およびアデノウイルスを含む様々
なベクターから選択できる。
た発現ベクターもまた調製できる。所望の抗原特異性を有する抗体を調製するた
め、所望の可変領域DNA配列を該前以て生成したベクター中に挿入することが
できる。それゆえ、該前以て生成したベクターは、所望のヒト化抗体の調製を容
易にするものである。
該卵中に輸送されることを示した。さらに、本発明者らは、鶏卵へのIgの結合
および取り込みに関与する免疫グロブリンの部分が、FcドメインのCH2−C
H3領域中に含まれることを決定した。本発明者らによるこの知見は、所望のタ
ンパク質を卵への結合に充分な免疫グロブリンの配列に結合させることにより、
いかなる組換えタンパク質をも卵中で製造することを可能にする。
ク質の取り込みとなるのに充分な免疫グロブリンタンパク質の部分をコードする
第二のDNA配列(ii)に作動可能に連結した、組換えタンパク質をコードする
第一のDNA配列(i)を含む、組換えタンパク質を卵中に送達するための発現 系を提供する。
なる語は、卵上の受容体に結合することができ、その結果、卵中に輸送されうる
、免疫グロブリンからのアミノ酸配列を含む。該「部分」は、卵上のFc受容体
に結合するものが好ましく、さらに好ましくはトリのFcRnである。
のである。好ましくは、第二のDNA配列は、免疫グロブリンの定常領域ドメイ
ンのCH2−CH3領域の部分をコードする。 組換えタンパク質は、免疫グロブリンタンパク質との融合タンパク質として調
製されるであろう。組換えタンパク質は、当該技術分野で知られた技術を用いて
融合タンパク質から遊離させることができる。
ンサーおよび終止配列などの必要な制御配列を含むであろう。発現系はウイルス
系または非ウイルス系のベクターであってよく、当該技術分野で知られた技術を
用いて構築することができる。ファージミドは、プラスミドかまたはバクテリオ
ファージベクターのいずれとしても用いることができるので、有用なベクターの
一例である。他のベクターの例としては、バクテリオファージ、バキュロウイル
スおよびレトロウイルス、DNAウイルスなどのウイルス、リポソームおよび他
の組換えベクターが挙げられる。ベクターはまた、真核宿主系、好ましくはトリ
の宿主系で使用するための要素を含んでいてよい。 当業者であれば、本発明が、ビテロゲニンやアポリポタンパク質Bなどの卵特
異的な受容体に結合しうる他のタンパク質またはペプチドを用いた組換えタンパ
ク質の製造方法を包含することを認識するであろう。
導入することができる。 一つの態様において、発現系を産卵性動物中に直接導入する。 従って、本発明は、組換えタンパク質を卵中で製造する方法であって、 (a)発現系を産卵性動物中に導入し、その際、該発現系は、動物の卵への該組
換えタンパク質の送達を容易にしうる第二のDNA配列(ii)に作動可能に連結
した、該組換えタンパク質をコードする第一のDNA配列(i)を含み、 (b)該動物に産卵させ、 (c)該組換えタンパク質を含有する卵を得、ついで任意に (d)該組換えタンパク質を該卵から単離する ことを含む方法を提供する。
ンパク質の取り込みとなるに充分な免疫グロブリンタンパク質の部分をコードす
る。さらに好ましくは、第二のDNA配列は、免疫グロブリンの定常領域ドメイ
ンのCH2−CH3領域の部分をコードする。
リンの可変領域をコードする第二のDNA配列および(iii)抗体を発現させる のに充分な制御領域を含み、 (b)該動物に産卵させ、 (c)該組換え抗体を含有する卵を得、ついで任意に (d)該組換えタンパク質を該卵から単離する ことを含む方法を提供する。
様々な方法のいずれによっても行うことができる。そのような方法は、一般に、
Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, コールド・スプリング
ス・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク(1989、1992)、Ausubel ら、Current Protocols in Molecular Biology,ジョン・ウィリー・アンド・サ ンズ、ボルチモア、メリーランド(1989)、Changら、Somatic Gene Therap
y,CRCプレス、アン・アーバー、ミシガン(1995)、Vegaら、Gene Targe
ting, CRCプレス、アン・アーバー、ミシガン(1995)、Vectors: A Sur
vey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,バターワース、ボストン、
マサチューセッツ(1988)およびGilboaら(1986)に記載されており、
たとえば、安定なまたは一過性のトランスフェクション、リポフェクチン、エレ
クトロポレーションおよび組換えウイルスベクターによる感染が挙げられる。
染特性のために一層高い効率が得られる。さらに、ウイルスは非常に特殊化され
ており、一般に特定の細胞型で感染および増殖する。それゆえ、その天然の特異
性を利用してベクターをインビボまたは組織内または細胞の混合培地で特定の細
胞型にターゲティングすることができる。ウイルスベクターはまた、特定の受容
体またはリガンドで修飾して、受容体を媒体にした事象により標的特異性を変え
ることもできる。
ターに付加することができる。そのような特性としては、たとえば、組換えウイ
ルスに感染した細胞に対して陰性選択するのに用いることのできるマーカーが挙
げられる。そのような陰性選択マーカーの例は、抗ウイルス剤ガンシクロビアに
対する感受性を付与する上記TK遺伝子である。それゆえ、陰性選択は感染を制
御しうる手段である、なぜなら陰性選択は抗生物質の添加により誘導性の自殺を
もたらすからである。そのような保護は、たとえば変化した形態のウイルスベク
ターまたは配列を生成する変異が生じたときに、細胞の形質転換が起こらないこ
とを確実にする。発現を特定の細胞型に限定する特性もまた、含めることができ
る。そのような特性としては、たとえば、所望の細胞型に特異的なプロモーター
や制御要素が挙げられる。
ーの他の例である、なぜなら、それは側方感染(lateral infection)やターゲ ティング特異性などの利点を提供するからである。側方感染は、たとえばレトロ
ウイルスのライフサイクルに内在するものであり、1個の感染細胞が多くの子孫
ウイルスが発芽分離し隣接細胞に感染していくプロセスである。その結果は、広
い領域が速やかに感染されることであり、その大部分は最初のウイルス粒子によ
って最初は感染されていなかったものである。このことは、感染因子が娘子孫を
通してのみ広がっていく垂直型の感染とは対照的である。側方的に(laterally )広がっていけないウイルスベクターもまた製造することができる。この特徴は
、所望とする目的が特定遺伝子を局在化された数の標的細胞にのみ導入すること
である場合に有用である。
機能するように構築することができる。前者の場合、ウイルスのゲノムがすべて
の必要な遺伝子、制御配列およびパッケージングシグナルを保持して新たなウイ
ルスタンパク質やRNAを合成できるようにウイルスのゲノムを修飾させる。一
旦、これら分子が合成されたら宿主細胞はRNAを新たなウイルス粒子にパッケ
ージングし、これら新たなウイルス粒子が次回の感染を担うことができる。ウイ
ルスのゲノムはまた、所望の組換え遺伝子をコードおよび発現するように操作さ
れる。非感染性ウイルスベクターの場合は、ウイルスのゲノムは通常、RNAを
ウイルス粒子中に被包するのに必要なウイルスパッケージングシグナルを破壊す
べく変異される。そのようなシグナルがなければ、形成された粒子はすべてゲノ
ムを含まず、それゆえその後の感染を進めることができない。特定のタイプのベ
クターは、意図した適用に依存するであろう。実際のベクターは、当該技術分野
で知られているか容易に入手可能であり、あるいはよく知られた方法を用いて当
業者により構築することが可能である。
ポソームなどのトランスフェクションビヒクルをも用いることができる。そのよ
うなトランスフェクションビヒクルは当業者により知られている。 第二の態様において、本発明の発現系で形質転換した宿主細胞を産卵性動物中
に導入することにより組換えタンパク質を卵中に送達することができる。形質転
換した細胞株は、組換えタンパク質を分泌し、組換えタンパク質は卵中へ輸送さ
れるであろう。好ましくは、宿主細胞はトリの細胞株、とりわけ多分化能性の胚
細胞株、生殖細胞に運命付けされた(committed)細胞株または体細胞組織およ び生殖細胞に寄与しうる細胞株である。
入し、その際、該トリ細胞株は、(i)該組換えタンパク質をコードする第一の DNA配列および(ii)該タンパク質を動物の卵へ送達するのを容易にする第二
のDNA配列を含み、 (b)該組換えタンパク質を含有する卵を得、ついで任意に (c)該組換えタンパク質を該卵から単離する ことを含む方法を提供する。
する。トリ細胞株は産卵するメンドリに注射してよい。抗体はメンドリ中でイン
ビボで産生され、卵の卵黄に送達され、卵黄から得ることができるであろう。
その際、該トリ細胞株は、(i)免疫グロブリン定常領域をコードする第一のD NA配列、(ii)免疫グロブリン可変領域をコードする第二のDNA配列および
(iii)該抗体を発現させるのに充分な制御領域を含む発現系で形質転換されて おり、 (b)該組換え抗体を含有する卵を得、ついで任意に (c)該組換え抗体を該卵から単離する ことを含む方法を提供する。
ク質を分泌し、該組換えタンパク質が卵中に輸送されるトランスジェニック動物
を調製することにより、産卵性動物において製造することができる。従って、本
発明は、組換えタンパク質を産卵性動物の卵中で製造する方法であって、 (a)その体細胞または生殖細胞が、該組換えタンパク質を卵中へ送達するのを
容易にする第二のDNA配列(ii)に作動可能に連結した、該組換えタンパク質
をコードする第一のDNA配列(i)を含む発現系を含有するトランスジェニッ ク産卵性動物を調製し、 (b)該動物から卵を得、ついで (c)任意に該組換えタンパク質を該卵から単離する ことを含む方法を提供する。
組換えタンパク質を卵中に取り込ませるのを可能にするに充分な免疫グロブリン
タンパク質の部分をコードする。さらに好ましくは、第二のDNA配列は、免疫
グロブリンの定常領域ドメインのCH2−CH3領域の部分をコードする。
するトランスジェニック家禽類を調製することにより、家禽類で調製できる。従
って、本発明は、組換え抗体を産卵性動物の卵中で製造する方法であって、 (a)その体細胞または生殖細胞が、(i)免疫グロブリン定常領域をコードす る第一のDNA配列、(ii)免疫グロブリン可変領域をコードする第二のDNA
配列および(iii)該抗体を発現させるのに充分な制御領域を含む発現系を含有 するトランスジェニック産卵性動物を調製し、ついで (b)該動物から卵を得る ことを含む方法を提供する。
ェクション、エレクトロポレーション、精子トランスフェクション、リポソーム
融合およびマイクロプロジェクタイルボンバードメント(microprojectile bomb
ardment)を含む、当該技術分野で知られた技術を用いて胚(家禽類の胚など) 中に挿入することができる。ついで、発現系を含有する胚を代理卵殻(surrogat
e shell)に移す。トランスジーンを有する動物を性的成熟まで生育させ、組換 えタンパク質の存在を成熟した動物の卵中で分析することができる。 本発明はまた、本明細書に記載したトランスジェニック産卵性動物をも包含す
る。
使用をも包含する。卵は可食性の食物源であるため、組換えタンパク質は該卵か
ら単離または精製する必要がない。組換えタンパク質を含有する卵は、直接摂食
することもできるし、または摂食前に調理したり調理法(オムレツ、ミルクセー
キ、焼き料理品など)の中に入れ込むこともできる。
ることができる。たとえば、ヒト化抗体を当該技術分野で知られた技術(たとえ
ば、米国特許第5,420,253号を参照)を用いて鶏卵から除去することがで
きる。抗体は一般に卵の卵黄中に含まれるので、抗体を得るために卵黄を卵の残
りから分離させる。抗体または他の組換えタンパク質を含有する卵黄調製物は、
貯蔵のために凍結乾燥することができる。凍結乾燥調製物は、使用のときに再構
成する。
は検出するために用いることができる。疾患の治療のためには、抗体を単独か、
他の化合物に結合させるか、または他の化合物ととともに投与する。抗体は、そ
れが結合したときに疾患状態または感染した細胞の破壊を容易にするために毒素
に結合してよい。そのような結合抗体はイムノトキシンとして知られており、当
該技術分野で知られた技術(Thorpeら、Monoclonal Antibodies in Clinical Me
dicine、アカデミックプレス、p.168−190,1982)を用いて調製で
きる。
できる。医薬組成物は、タンパク質または抗体を生物学的に適合しうる担体また
は希釈剤中、またはリポソームなどの担体系中に含んでいてよい。タンパク質ま
たは抗体組成物は、注射、経口投与、吸入、経皮適用または直腸投与などの通常
の仕方で投与できる。投与経路に依存して、活性化合物を酵素、酸または抗体を
不活化する他の自然条件の作用から保護するために所定の物質にコーティングす
ることができる。組成物は、治療学的有効量のタンパク質または抗体を含み、所
望の結果を達成するのに必要な投与量および期間にて提供されるであろう。
ができる。インビボ診断では、抗体は上記の適当な医薬調合物中で調製されるで
あろう。抗体はまた、一般にその検出が可能となるように検出可能なマーカーで
標識する。使用できる検出可能なマーカーとしては、種々の酵素、蛍光物質、発
光物質および放射性物質が挙げられる。適当な酵素の例としては、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、ビオチン、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、
またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適当な蛍光物質の例としては
、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ロ
ーダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドま
たはフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の例としては、ルミノールが挙げ
られる。適当な放射性物質の例としては、S−35、Cu−64、Ga−67、
Zr−89、Ru−97、Tc−99m、Rh−105、Pd−109、In−
111、I−123、I−125、I131、Re−186、Au−198、A
u−199、Pb−203、At−211、Pb−212およびBi212が挙
げられる。抗体はまた、標識し、あるいはリガンド結合ペアの一方のパートナー
に結合させることができる。代表例としては、アビジン−ビオチンおよびリボフ
ラビン−リボフラビン結合タンパク質が挙げられる。上記抗体を上記代表的な標
識に結合または標識する方法は容易に利用できる。
原体を検出するのに用いることができる。これら方法は、抗体と、病原体または
疾患に特異的なタンパク質の抗原決定基との間の結合相互作用に依存する。その
ような方法の例としては、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ(
たとえば、ELISA)、免疫蛍光、免疫沈降、ラテックス凝集、血球凝集、お
よび酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ELISA)などの組織化学的試験、およ
びウエスタンブロッティングが挙げられる。
は新生児や子供の疾患の主要な病因であるので)などの腸内感染を治療するのに
用いることができる。これら病原体またはその一部に特異的な可変領域を含む抗
体を調製できる。 本発明はまた、病原体不含の卵を調製するのに用いることができる。たとえば
、特定の病原体に対して特異的な抗体を産卵性動物中で産生させ、卵へ輸送させ
ることができ、該抗体は卵中で該特定の病原体を中和するであろう。一つの態様
において、抗体は抗サルモネラ抗体であり、サルモネラ不含の卵を調製するのに
用いることができる。
あって、 (a)該病原体に特異的な抗体を産卵性動物中に導入し、ついで (b)該動物に産卵させ、その際、卵は実質的に該病原体を含まない ことを含む方法に関する。
定するため、3羽のHyline SCTMメンドリにそれぞれ10μgの精製hIgGを 注射し、卵黄および卵白中のその存在をELISAにより評価した。ヒトIgG
はまず卵黄中に第2日目に検出され、89ng/mlまでのピークレベルが第5
日目に検出された(図1)。薄い卵白抽出物中ではhIgGは検出されず、その
濃度が3.12ng/ml未満(ELISAアッセイの検出限界)であることを 示していた。
卵黄中に第2日目に検出され、33ng/mlまでのピークレベルが第5日目に
検出されたが(図2A)、これはhIgGで記録したピークレベルよりも有意に
低かった(繰返し測定分析、P<0.01)。hIgGは卵白で検出されなかっ たが、hIgAは検出された。ヒトIgAはまず卵白抽出物中で第1日目から検
出され、約8ng/ml卵白にて第2〜8日目に一定に保持された(図2B)。
、ヒト/マウスキメラ抗体を産生するトランスフェクション細胞株を確立するの
に用いた。細胞を8%(v/v)ウシ胎仔血清(BCS)および2%(v/v)ニワト
リ血清(CS)を含有するIMDMTM(Gibco BRL)中で1〜10×106細胞/
mlでの培養で維持した。細胞(1×107)を、最適エレクトロポレーション 条件下(200V、960μFおよび1000ミリ秒パルス)でのBio-Radエレ クトロポレーターを用いたエレクトロポレーションにより、各20μgの線状化
重鎖(キメラ抗ダンシルガンマ1)および軽鎖(ヒトカッパを有するキメラ抗ダ
ンシル軽鎖)でトランスフェクションした。細胞を96ウエルマイクロタイター
皿中、上記培地にて2日間維持し(2.5×104細胞/ウエル)、その後、3μ
g/mlのミコフェノール酸、7.5μg/mlのヒポキサンチンおよび125 μg/mlのキサンチンを含有する選択培地を加えた。生存したコロニーを、ダ
ンシル−BSAコーティングマイクロタイタープレートおよび検出試薬としての
アルカリホスファターゼ結合抗ヒトカッパを用いた酵素結合抗体免疫吸着アッセ
イ(ELISA)によりスクリーニングした。ついで、強い陽性のコロニーをさ
らに特徴付けるために一層大きな皿に移動させた。これら拡張されたコロニーか
らの細胞を、35S−メチオニンの存在下で一夜増殖させて標識した。一夜増殖さ
せた後、培養上澄み液および細胞質溶解液を調製し、内容物をウサギ抗ヒトIg
およびStaphA(IgSorb)を用いて免疫沈降させた。試料を還元なし
で5%ポリアクリルアミドゲル上、および還元後に12%ゲル上で分析した。バ
ンドの位置をオートラジオグラフィーにより決定した。ついで、所望のキメラ抗
体を産生したコロニーからの細胞を1〜106細胞/mlにて培地に維持した。
細胞株、TAOD7.4を、10%ウシ胎仔血清(FBS)を含有するOpti −MEMTM(Gibco BRL,バーリントン)中で1×106細胞/mlの濃度にて培
養維持した。細胞を300×gで5分間遠心して回収し、培地を除去した。細胞
をダルベッコリン酸緩衝食塩水(PBS、Gibco BRL、バーリントン、オンタリ オ)中で5×107細胞/mlの濃度で再浮遊させた。100μlのPBS中の 合計5×106細胞をHyline SCTMメンドリの太腿と体壁との間の領域に皮下注射
し、腫瘍の発生を毎日モニターした。注射前にメンドリの体重を測定し、ついで
体重の変動を1週間に2回モニターした。
抗体をガンマYolkTM調製キット(Pharmacia Biotech、モーガン・ブールバ ード、ケベック)により精製した。精製した卵黄抗体を炭酸緩衝液、pH9.6 に再懸濁し、キメラヒト抗ダンシルガンマ3の存在についてサンドイッチ抗体E
LISAにより分析した。ImmulonTM96−ウエルマイクロタイタープレートを 炭酸緩衝液、pH9.6中のヤギ抗ヒトIgG(H+L)(Jackson Immunoresea
rch、ウエスト・グルーブ、ペンシルベニア、米国)の5μg/ml溶液(50 μl)で4℃にて一夜コーティングした。一夜インキュベーション後、コーティ
ング混合物を廃棄し、プレートをPBSで3回洗浄した。ついで、100μlの
ブロック緩衝液(3%(w/v)ウシ血清アルブミンを含有するPBS)を加える ことによりプレートを室温にて1時間ブロックした。ついで、ブロック緩衝液を
廃棄し、プレートをPBSで3回洗浄した。個々の卵黄抗体調製物または系列希
釈標準(Cromopure Human IgG、Jackson Immunoresearch、ウエスト・グルーブ 、ペンシルベニア、米国)(50μl)を各ウエルに分配し、プレートを4℃で
一夜インキュベートした。一夜インキュベーション後、試験溶液を廃棄し、プレ
ートをPBSで3回洗浄した。ブロック緩衝液中で125ng/mlの濃度の西
洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgG(H+L)(Jackson Immunore
search、ウエスト・グルーブ、ペンシルベニア、米国)(50UL)をプレート
のウエルに加え、室温で2時間インキュベートした。ついで、ペルオキシダーゼ
コンジュゲートを廃棄し、プレートをPBSで3回洗浄した。ついで、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ基質(0.05%(w/v)o−フェニレンジアミン二塩酸塩お
よび0.05%(v/v)30%過酸化水素を含有する酢酸アンモニウム−クエン酸
緩衝液(pH5.0))を各ウエルに加え、プレートを暗所、室温にて30分間 インキュベートした。硫酸(5M溶液を50μl)を各ウエルに加え、プレート
を卓上シェーカーで10分間穏やかに振盪させた。ついで、492nmを有する
Titertek MultiskanTM PLUS ELISAプレートリーダーを用いて発色を評価した。
黄の存在下での吸光度は緩衝液のみを含有する陰性対照ウエルの吸光度と異なる
ことはなく、卵黄がアッセイに干渉しないことを示していた。492nmの吸光
度とヒト免疫グロブリン(hIg)のlog10濃度との間の回帰係数は0.9 9であり、式y=1.1683x−0.0185が吸光度とhIgの濃度との間の
関係を正確に記載していることを示していた。
の影響をさらに調べた。下記グラフに示すように、吸光度はアッセイの標準のす
べての濃度において卵黄の存在によって変わることはなかった。注射していない
メンドリからの卵黄抽出物の吸光度は1.56ng/ml未満の標準の吸光度と 等しく、1.56ng/ml未満のヒトIgの濃度は検出できないことを示して いた。
表2に示す。このメンドリは、第1日目にヒトIgG3(TAOD7.4)でト ランスフェクションした500万の細胞を注射していた。腫瘍は第11日目まで
は小結節に留まっており、この時点で腫瘍の周辺領域で出血が生じた。第13日
目および第15日目に産まれた卵では卵黄中での沈積が顕著であったが、その後
の卵ではhIgは検出できなかった。
あった。卵黄からのヒト免疫グロブリンの回収は約15%であった(データは示
していない)。
ー形成して体細胞キメラを生成するであろうことを示していた。このメンドリか
らの卵黄中のhIgの濃度を調べたところ、ヒト免疫グロブリンが遺伝子操作し
たDT40細胞中でインビボで産生され、卵黄中に封鎖されることが示されてい
る。卵黄1個は約10〜15mlであり、アッセイでのhIgの回収は約15%
であったので、約625ngのhIgがメンドリ#9185によって第13日目
に産まれた卵中に沈積することが予想される。 これらのデータは、ヒト免疫グロブリンを鶏卵中で大スケールで産生する技術
を開発する理論的根拠を提供している。
した。DT40−IgG3細胞を注射した8羽のうち3羽は注射部位に腫瘍を生
成し、細胞のうちのいくつかまたはすべてが静脈内送達されるのではなく皮下注
射されたことを示していた。注射部位に腫瘍を生成したメンドリからの卵は、卵
黄中に非常にわずかのrhIgG3しか有せず、薄い卵白中では認められなかっ
た(データは示していない)。rhIgG3はまず、残りの5羽のメンドリで第
7日目に卵黄中で検出された(図3Aおよび3B)。これらメンドリのうちの4
羽でのrhIgG3の最大沈積は、卵1ml当たり33ngであり、第10日目
に産まれた卵で認められた。これらメンドリの1羽(トリ6、図3B)は第10
日目または第11日目に卵を産まず、第12日目に産まれた卵は0.3μg/m l卵黄のrhIgG3を含有していた。このメンドリは第13日目および第14
日目には卵を産まず、第15日目および第16日目に産まれた卵ではrhIgG
3は検出されなかった。
く、DT40−IgG3細胞を注射したすべてのメンドリで第6日目までに卵黄
中で検出され、卵黄中での最大レベルのニワトリ抗rhIgG3は第9日目まで
に観察された(データは示していない)。DT40−IgG3細胞を静脈内注射
したすべてのメンドリを第17日目に安楽死させた。剖検では注射したいずれの
トリにも内部の腫瘍は観察されなかった。DT40−IgG3細胞が白血病とし
て維持されているか否かを決定するため、血液試料をトリから採取し、DT40
−IgG3細胞の存在の継続について光学顕微鏡および免疫蛍光染色の両方で評
価した。注射部位で腫瘍を生成したメンドリから採取した血液試料ではDT40
−IgG3細胞は観察されなかったが、これら腫瘍からの細胞は培養で首尾良く
再確立され、rhIgG3を産生し続けることが示された(データは示していな
い)。注射部位に腫瘍を生成しなかったメンドリでは、DT40−IgG3細胞
と形態的に類似する細胞のクラスターが希釈血液試料中に観察された(図4A)
。これらは、細胞内hIgGについての免疫組織化学染色によりDT40−Ig
G3細胞であることが確認された。
hIgA)を分泌する、トランスフェクションしたDT40細胞株、DT40−
hIgAを製造した。rhIgAを産生するトランスフェクションしたB細胞の
集団を有するメンドリがrhIgAを卵中に輸送することを示すため、107の DT40−hIgA細胞を8羽のHyline SCTMメンドリに静脈内注射した。DT 4−hIgA細胞を注射したメンドリのうち5羽が注射部位に腫瘍を生成した。
卵白中へのrhIgAの低レベルの沈積が注射したすべてのメンドリで検出され
たが、腫瘍を生成したメンドリの卵黄ではrhIgAの非常にわずかの沈積しか
検出されなかった(データは示していない)。注射部位に腫瘍生成の兆候を示さ
なかった3羽のメンドリは、第9日目までに20ng/ml卵黄までのrhIg
Aを沈積した。
c配列を解明することを試みるため、修飾rhIgGのパネルを調製した。Ig
Gを卵黄中に輸送することを担う発生中のトリ卵母細胞の細胞膜上のFc受容体
が哺乳動物のFcRnのホモログであると思われることを報告したのは本発明者
らが最初である。FcRnは、マウスにおいて母胎関門を通過するIgGの輸送
、母IgGのトランスサイトーシスおよび血清IgGレベルの制御において役割
を果たしている主要組織適合複合体(MHC)クラスI関連受容体である。ホモ
ログがヒトにおいても見出されており、同じ役割を果たしていると思われる。
CH1−H−CH2−CH3として表すことにする。ここでVは可変領域であり
、CH は各重鎖ドメインであり、Hはヒンジ領域である。
うにしてメンドリに注射した。 1.野性型のIgGは陽性対照として用いた。 2.V−CH3(すなわち、CH1からCH2まで(これを含む)を欠如)。 3.V−CH1−H−CH3(すなわち、CH2ドメインを欠如)。 4.V−CH1−H−CHJ2−*CH3(すなわち、CH2−CH3境界での 部位特異的変異であり、rhIgGのFcRnへの結合不能という結果となる)
。NB.検出せず。 5.**V−CH1−H−CH2−CH3**(すなわち、補体を活性化できないか
または殆どの知られたFc受容体と結合できないがFcRnへの結合能は維持し
ている脱グリコシル化rhIgG)。NB.検出せず。 6.V−αCH1−H−CH2−CH3(すなわち、受容体への結合に影響を及
ぼすことなくCH2−CH3境界から遠位の領域を交換することができることを
示すため、CH1定常ドメインをIgA CH1ドメインと交換した)。
H−CH2*−CH3は卵黄試料で検出されなかった。**V−CH1−H−CH 2−CH3**およびV−αCH1−H−CH2−CH3は、対照の野性型hIg
Gと同じくらい効率よく沈積した。
リ卵母細胞の細胞膜を通過できないことを示している。さらに、FcRnと相互
作用することが知られているCH2−CH3境界アミノ酸残基に部位特異的変異
が存在するときも、rhIgGはトリ卵母細胞の細胞膜を通過できない。しかし
ながら、CH2−CH3ドメイン間の境界は、FcγI−IIIを含む他のFc
受容体と結合することが示されている。脱グリコシル化rhIgGである**V−
CH1−H−CH2−CH3**は、卵母細胞受容体の性質を確認するために選択
した。なぜなら、IgGの脱グリコシル化は補体活性化および殆どのFc受容体
への結合を妨げるが、FcRnへの結合は妨げないからである。脱グリコシル化
rhIgGは野性型hIgGと同じくらい効率的に卵黄中に沈積するので、これ
ら実験の他の知見とあわせてFcRnのトリホモログがトリ卵母細胞の細胞膜を
通過するIgGの輸送を担っていると思われる。これら知見は、FcRnへの結
合に必要な配列を含めることにより、トランスジェニックメンドリモデルで産生
するために治療用抗体の操作を最適化すること並びに所望のタンパク質を卵黄中
に沈積させることを可能にするに違いない。
調製することができる。トランスジェニックニワトリを製造するため、ステージ
X(40b)の胚をバードプリマスロック(Barred Plymouth Rock)メンドリに
より産まれたインキュベートしていない卵から得ることができる。胞胚葉細胞を
細胞間マトリックスの酵素消化により回収し、DNAをBrazolotらおよびFraser
らによって記載されているようにリポフェクチン試薬を用いて浮遊細胞中に導入
する。ついで、浮遊細胞は、Carscienceらによって記載されているように、ホワ
イトレグホンメンドリによって産まれた卵中の放射線照射した(irradiated)ス
テージXのレシピエント胚中に注入されるであろう。注入の4日後、注入した胚
を代理の卵殻(109、109b)に移し、これは孵化率を注入胚の約10%か
ら注入胚の約40%に上昇させる(CochranおよびEtches、未刊行)。孵化時に キメラは、ドナー(バードプリマスロック)由来の黒色綿毛およびレシピエント
(ホワイトレグホン)由来の黄色の綿毛の存在により認識することができる。ド
ナー細胞の導入の形跡を示さない幼鳥は破棄する。鶏冠組織および血液をそれぞ
れ孵化の日および4週齢で取り出し、組換えタンパク質(キメラ抗体など)の産
生をコードするDNA配列の存在がPCRにより決定されるであろう。組換えタ
ンパク質の存在は、4週齢で取り出した血液試料で行うELISAにより評価さ
れるであろう。トランスジーンを有するニワトリは、性的成熟まで生育されるで
あろう。発生中の卵中での組換えタンパク質の沈積は、メスキメラにより産まれ
た卵の卵黄からの抽出物で行うELISAにより評価されるであろう。オスおよ
びメスの両キメラはつがわされ、その結果の子孫はPCRによりスクリーニング
して構築物を含むものが同定されるであろう。
リンパ系でコロニー形成する場合にはキメラで達成されるであろうことに注意す
べきである。構築物が生殖細胞中に導入されている場合には、キメラ抗体の産生
をコードするDNA配列がメンデル遺伝特性として導入されているニワトリの株
が得られるであろう。しかしながら、生殖細胞の伝達が存在しない場合でも、本
発明者らはニワトリにおいて抗体産生に関する有意で新たな情報を得ることであ
ろう。
、本発明は開示した実施例に限られるものでないことが理解されねばならない。
それとは反対に、本発明は、添付の請求の範囲の範囲内に含まれる種々の変更お
よび等価な再編を包含することを意図するものである。
のそれぞれを特別かつ個別にその全体において参照のため本明細書中に引用され
るのと同程度にその全体が参照のため本明細書中に引用される。
ラフである。
すグラフである。図2Bは、卵白1ml当たりのhIgAの濃度を時間に対して
示すグラフである。
して示すグラフである。図3Bは、卵黄1ml当たりのrhIgGの最良の沈積
を時間に対して示す。
学顕微鏡像である。図4Bは、メンドリから採取した血液試料中のhIgGの免
疫組織染色を示す。
である。
Claims (28)
- 【請求項1】 (i)組換えタンパク質をコードする第一のDNA配列およ び(ii)該タンパク質の動物の卵への送達を容易にしうる第二のDNA配列を含
む、組換えタンパク質を卵中へ送達するための発現系。 - 【請求項2】 該第二のDNA配列が、卵へ結合しうるタンパク質またはペ
プチドをコードする、請求項1に記載の発現系。 - 【請求項3】 該第二のDNA配列が、卵へ結合しうる免疫グロブリンタン
パク質の部分をコードする、請求項2に記載の発現系。 - 【請求項4】 該免疫グロブリンの該部分が、免疫グロブリンのFcドメイ
ンのCH2−CH3領域からのものである、請求項3に記載の発現系。 - 【請求項5】 該免疫グロブリンの該部分が、該卵上のFc受容体に結合す
る、請求項3に記載の発現系。 - 【請求項6】 該Fc受容体がトリのFc受容体ネオネートである、請求項
5に記載の発現系。 - 【請求項7】 (i)免疫グロブリンの定常領域をコードする第一のDNA 配列、(ii)免疫グロブリンの可変領域をコードする第二のDNA配列および(
iii)抗体を発現させるのに充分な制御領域を含む、組換え抗体を卵中へ送達す るための発現系。 - 【請求項8】 該定常領域がヒト免疫グロブリン遺伝子に由来するものであ
る、請求項7に記載の発現系。 - 【請求項9】 組換えタンパク質を卵中で製造する方法であって、 (a)請求項1ないし6のいずれか一つに記載の発現系を産卵性動物中に導入し
、 (b)該組換えタンパク質を含有する卵を得、ついで任意に (c)該組換えタンパク質を該卵から単離する ことを含む方法。 - 【請求項10】 組換え抗体を卵中で製造するであって、 (a)請求項7または8に記載の発現系を産卵性動物中に導入し、 (b)該組換え抗体を含有する卵を得、ついで任意に (c)該組換えタンパク質を該卵から単離する ことを含む方法。
- 【請求項11】 組換えタンパク質を卵中で製造する方法であって、 (a)組換えタンパク質を分泌する形質転換したトリ細胞株を産卵性動物中に導
入し、その際、該トリ細胞株は請求項1ないし6のいずれか一つに記載の発現系
で形質転換されており、 (b)該組換えタンパク質を含有する卵を得、ついで任意に (c)該組換えタンパク質を該卵から単離する ことを含む方法。 - 【請求項12】 組換え抗体を家禽類の卵中で製造する方法であって、 (a)組換え抗体を分泌する形質転換したトリ細胞株を産卵性の家禽類に導入し
、その際、該トリ細胞株は請求項7または8に記載の発現系で形質転換されてお
り、 (b)該組換え抗体を含有する卵を得、ついで任意に (c)該組換え抗体を該卵から単離する ことを含む方法。 - 【請求項13】 病原体を含まない卵の製造であって、 (a)該病原体に特異的な抗体を産卵性動物中に導入し、ついで (b)該動物に産卵させ、その際、該卵は実質的に該病原体を含まない ことを含む方法。
- 【請求項14】 組換えタンパク質を含有する卵。
- 【請求項15】 請求項9に記載の方法によって製造された組換えタンパク
質を含有する卵。 - 【請求項16】 組換え抗体を含有する卵。
- 【請求項17】 請求項10に記載の方法によって製造された組換え抗体を
含有する卵。 - 【請求項18】 請求項16または17に記載の卵の治療学的有効量を投与
することを含む、動物の免疫方法。 - 【請求項19】 組換え抗体を分泌する形質転換したトリ細胞株。
- 【請求項20】 その生殖細胞および体細胞が、卵中への組換えタンパク質
の送達を容易にする第二のDNA配列(ii)に作動可能に連結した、該組換えタ
ンパク質をコードする第一のDNA配列(i)を含む発現系を含有する、トラン スジェニック産卵性動物。 - 【請求項21】 その生殖細胞および体細胞が、(i)免疫グロブリンの定 常領域をコードする第一のDNA配列および(ii)免疫グロブリンの可変領域を
コードする第二のDNA配列を含む発現系を含有する、トランスジェニック産卵
性動物。 - 【請求項22】 組換えタンパク質を産卵性動物の卵中で製造するであって
、 (a)その体細胞および生殖細胞が、卵中への該組換えタンパク質の送達を容易
にする第二のDNA配列(ii)に作動可能に連結した、該組換えタンパク質をコ
ードする第一のDNA配列(i)を含む発現系を含有するトランスジェニック産 卵性動物を調製し、 (b)該動物から卵を得、ついで (d)任意に、該組換えタンパク質を該卵から単離する ことを含む方法。 - 【請求項23】 該第二のDNAが、卵へ結合しうる免疫グロブリンの部分
をコードする、請求項22に記載の方法。 - 【請求項24】 該免疫グロブリンの該部分が、免疫グロブリンの定常領域
ドメインのCH2−CH3領域からのものである、請求項23に記載の方法。 - 【請求項25】 該免疫グロブリンの該部分が、該卵上のFc受容体に結合
する、請求項23に記載の方法。 - 【請求項26】 該Fc受容体がトリのFc受容体ネオネートである、請求
項23に記載の方法。 - 【請求項27】 組換え抗体を産卵性動物の卵中で製造する方法であって、 (a)その体細胞および生殖細胞が、(i)免疫グロブリンの定常領域をコード する第一のDNA配列、(ii)免疫グロブリンの可変領域をコードする第二のD
NA配列および(iii)抗体を発現させるのに充分な制御領域を含有するトラン スジェニック産卵性動物を調製し、ついで (b)該動物から卵を得る ことを含む方法。 - 【請求項28】 該定常領域がヒト遺伝子に由来するものである、請求項2
7に記載の方法。
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