DE19607367A1

DE19607367A1 - Herstellung von transgenem Geflügel durch Gentransfer mit p95-spezifischen Genfähren

Info

Publication number: DE19607367A1
Application number: DE1996107367
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Johann Prof Schneider; Johannes Nimpf
Original assignee: Progen Biotechnik GmbH
Current assignee: Progen Biotechnik GmbH
Priority date: 1996-02-27
Filing date: 1996-02-27
Publication date: 1997-08-28

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteinkonjugate und DNA-Protein-Komplexe, die als Gentransfersysteme geeignet sind, sowie ein Verfahren zur Herstellung von transgenem Ge flügel

Die Entwicklung von Techniken zur Erzeugung transgener Tiere, die fremde und/oder manipulierte Gene in ihrer Keimbahn tra gen, ist sowohl für die Grundlagenforschung als auch für kom merzielle Zwecke von größter Bedeutung. Zahlreiche Experimente zur Untersuchung der Expression und Funktion von Genen, zur Wirksamkeit genetischer Kontrollelemente und zur Erzeugung von Tiermodellen für menschliche Krankheiten wurden bisher an transgenen Tieren, insbesondere an der Maus, durchgeführt. Durch selektive Deletion bestimmter Gene und die Bestimmung des resultierenden Phänotyps der Maus konnten wertvolle Er kenntnisse hinsichtlich der Funktion von Genen gewonnen wer den, die mit üblichen biochemischen oder molekularbiologischen Techniken nicht erreichbar gewesen wären.

Zur Erzeugung transgener Säugetiere gibt es mehrere Methoden, die heute in breitem Umfang angewandt werden:

i) Mikroinjektion von DNA in den Pronucleus der Eizelle,
ii) Transfektion embryonischer Stammzellen und deren Wieder einführung in Blastulae und
iii) Infektion des Embryos durch retrovirale Vektoren, welche ein interessierendes Gen enthalten.

Die Manipulation der Keimbahn von Vögeln, insbesondere von Hühnern, wäre sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die Geflügelindustrie von höchster Bedeutung. Auf diese Weise könnte Geflügel erzeugt werden, das gegenüber Krankheiten resistent ist oder eine verbesserte Nahrungsverwertung und Wachstumsrate aufweist. Weiterhin könnten transgene Vögel als Bioreaktoren verwendet werden, um Biomoleküle und Polypeptide wie etwa Immunglobuline, Wachstumsfaktoren oder Enzyme zu erzeugen, die dann auf einfache Weise aus den Eiern aufgerei nigt werden können. Eine andere wichtige Anwendungsmöglichkeit für transgenes Geflügel in der Lebensmittelindustrie ist die Erzeugung von Eiern mit geringem Cholesteringehalt.

Trotz dieser großen potentiellen Anwendungsmöglichkeiten konn ten bisher nur geringe Erfolge bei der Herstellung von trans genem Geflügel erreicht werden. Der Gentransfer wurde nämlich bisher sehr stark durch Probleme behindert, die mit der in vitro-Manipulation und Kultivierung des frühen Hühnerembryos in Zusammenhang stehen und auf das Reproduktions- und Embryo nalentwicklungssystem bei Vögeln zurückzuführen sind. Das Dot ter enthaltende Ei wird nämlich direkt nach der Ovulation be fruchtet und die Embryonalentwicklung beginnt im Eileiter während der Ausbildung des Eis. Der Vogelembryo wäre direkt nach der Oviposition leicht zugänglich, doch zu diesem Zeit punkt besteht das Blastoderm aus etwa 60.000 Zellen, die in zwei Schichten organisiert sind (Stern (1990), Development 109, 667-682; Kochav et al. (1980) , Dev.Biol. 79, 296-308). Dies hat zur Folge, daß die DNA-Mikroinjektion in männliche Pronuklei in befruchteten Eiern im Einzellenstadium nur mit größten Schwierigkeiten möglich ist. Dennoch wurde diese Pro zedur vor kurzem erfolgreich zur Erzeugung transgener Vögel durch Keimbahntransmission der fremden DNA angewendet (Love et al. (1994), Bio Technology 12, 60-63). Für dieses Verfahren muß jedoch ein kompliziertes ex vivo-System in Wirtsschalen für die gesamte Dauer der embryonischen Entwicklung vor dem Schlüpfen angewendet werden (Ono et al. (1994), Dev.Biol. 161, 126-130; Perry (1988), Nature 331, 70-72), wodurch es für eine Anwendung in großem Umfang relativ ungeeignet ist. Weiterhin muß dieses Verfahren auch noch erst in anderen Labors erfolg reich reproduziert werden.

Vor kurzem wurde gezeigt, daß pluripotente Zellen, die aus einem Blastoderm der Stufe X, das aus gelegten Eiern isoliert wird, vereinzelt wurden, zu in der Keimbahn chimären Hühnern führten, wenn sie in durch Gammastrahlung geschwächte Empfän gerembryos injiziert wurden (Carsience et al. (1993), Develop ment 117, 669-675). Dieses Verfahren wurde als geeignete Me thode zur Manipulation des Hühnergenoms vorgeschlagen (Etches et al. (1993), Poultry Sci. 72, 882-889). Jedoch wird erst die zukünftige Entwicklung zeigen, ob das Verfahren tatsächlich zur Erzeugung transgener Vögel geeignet ist.

Zur Zeit besteht die einzige praktisch durchführbare Möglich keit zur Erzeugung transgener Vögel darin, das Vogelblastoderm mittels Injektion rekombinanter Retroviren durch die Eier schale zu infizieren (Salter et al. (1986), Virology 157, 236- 240; Bosselman et al. (1989), Science 243, 533-535) . Mit dieser Technik werden jedoch retrovirale Sequenzen in das Vogelgenom eingeführt, was aus mehreren Gründen von Nachteil ist. Erstens können retrovirale Sequenzen das Expessionsmuster des trans genen Organismus stark beeinflussen, wodurch die Erzeugung transgener Tiere mit kontrollierter Expression des Fremdgens erschwert wird. Zweitens beinhaltet die Einführung retrovira ler Sequenzen das Risiko der Erzeugung rekombinanter Organis men mit Wildtyp-Viren. Drittens dürfte die Verwendung von Retroviren in der kommerziellen Geflügelhaltung von der Öf fentlichkeit nur sehr schlecht akzeptiert werden, da gerade sehr große Anstrengungen zur Eliminierung solcher Viren aus kommerziell gehaltenem Geflügel unternommen werden (Perry und Sang (1993), Transgenic Res. 2, 125-133).

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe be stand somit darin, ein Gentransfersystem zur Erzeugung trans gener Tiere, insbesondere transgener Vögel, bereitzustellen, bei dem die Nachteile des Standes der Technik mindestens teil weise vermieden werden. Insbesondere soll das Gentransfersy stem die Erzeugung von transgenem Geflügel auf einfache Weise mit hoher Effizienz ermöglichen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch Bereitstellung eines Gentrans fersystems, das auf dem Transfer von Nucleinsäuren in eine Zielzelle mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose beruht. Dieses System eignet sich generell zum Transfer von Nuclein säuren in Zellen und insbesondere zum Transfer von DNA in die Eizellen von Hühnern und anderen eierlegenden Spezies, um transgene Tiere herzustellen.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Kon jugat, umfassend

a) einen Liganden für einen Rezeptor der LDL-Rezeptorfamilie und
b) einen Nucleinsäure-Carrier.

Das erfindungsgemäße Konjugat eignet sich hervorragend als Genfähre zur Einschleusung von fremden Nucleinsäuren in eine Zelle. Die Ligandenkomponente des Konjugats bindet dabei an einen Rezeptor auf der Zielzelle, wodurch eine Rezeptor-ver mittelte Endozytose des Konjugats sowie einer damit assoziier ten Nucleinsäure in die Zielzelle bewirkt werden kann. Die Nucleinsäure-Carrier-Komponente des Konjugats bildet mit einer Nucleinsäure, insbesondere einem DNA-Molekül, welches in die Zielzelle eingeführt werden soll, einen unter physiologischen Bedingungen im wesentlichen stabilen Komplex. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Konjugats gelingt insbesondere die Ein schleusung fremder Nucleinsäuren in Eizellen von Vögeln und insbesondere Hühnern, wodurch die Herstellung von keimbahn transformierten transgenen Vögeln auf einfache Weise möglich wird.

Die Ligandenkomponente des Konjugats wird vorzugsweise so ausgewählt, daß sie an den Hühnereizellenrezeptor p95 bzw. an ein Analogon dieses Rezeptors in anderen Vogelspezies bindefä hig ist. Besonders bevorzugt wird ein möglichst selektiv an p95 bzw. ein Analogon davon bindefähiger Ligand verwendet. p95 ist an der Oberfläche wachsender Hühnereizellen lokalisiert und vermittelt die Aufnahme von VLDL und Vitellogenin (VTG) aus dem Blutstrom, die mehr als zwei Drittel der Tromkenmasse der vollständig entwickelten Eizelle bilden. Die Klonierung und rekombinante Expression des Hühnereizellenrezeptors p95 ist in der internationalen Patentanmeldung WO95/15379 beschrieben, auf deren Offenbarung hier ausdrücklich Bezug genommen wird.

Als Rezeptor-Liganden geeignet sind daher insbesondere Lipo proteine, Eigelbvorläuferproteine, heterologe Rezeptor-binde fähige Proteine oder Fragmente solcher Proteine, welche die Fähigkeit zur Rezeptorbindung, insbesondere an p95, aufweisen. Vorzugsweise ist die Ligandenkomponente des erfindungsgemäßen Konjugats ein Lipoprotein, Protein oder Peptid, welches ausge wählt ist aus der Gruppe umfassend VLDL, Apolipoprotein B, Apolipoprotein E, Lipoproteinlipase, α₂-Macroglobulin, Preg nancy Zone Protein, Vitellogenin, Plasminaktivator-Plasmin aktivatorinhibitor 1-Komplex, Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A, 39 kD Rezeptor-assoziiertes Protein (RAP), Riboflavin-bin dendes Protein, Rous-Sarcomavirus-Hüllprotein, Lactoferrin Vesikular-Stomatitisvirus-Oberflächenepitop oder Rezeptor bindende Fragmente der zuvor genannten Substanzen.

Besonders bevorzugt als Liganden sind einerseits die Eigelb- Vorläuferproteine VLDL, Vitellogenin und Riboflavin-bindendes Protein, die auf bekannte Weise aus mit Östrogen behandelten Hähnen gewonnen werden können (George et al. (1987), J.Biol. Chem. 262, 16838-16847; MacLachlan et al. (1994), J.Biol.Chem. 269, 24127-24132; Stifani et al. (1988), Biochem.J. 250, 467- 475). Andererseits können auch kleine Proteine mit hoher Affi nität für p95 verwendet werden, insbesondere das Rezeptor assoziierte Protein RAP (Hiesberger et al. (1995), J.Biol. Chem. 270, 18219-18226), Lactoferrin (Hiesberger et al. (1995), Supra) und Apolipoprotein-E (Steyrer et al. (1990), J.Biol.Chem. 265, 19575-19581) . Diese Proteine können auf ein fache Weise aus natürlichen Quellen, z. B. Kuhmilch für Lacto ferrin, Kaninchen-β-VLDL für Apo E, oder als rekombinante Proteine in Bakterien gewonnen werden. Weiterhin können auch kleine Peptide verwendet werden, welche die Binderegionen der oben genannten Proteine enthalten (Mahley (1988), Science 240, 622-630; Warshawsky et al. (1994), J.Biol.Chem. 269, 3325-3330; Hüttinger et al. (1988), Clin.Biochem. 21, 87-92).

Alternativ kann das erfindungsgemäße Konjugat als Ligandenkom ponente auch einen mit dem Rezeptor bindefähigen Antikörper bzw. ein Fragment eines solchen Antikörpers enthalten. Beson ders bevorzugt sind einzelkettige Antikörperfragmente, welche an die Ligandenbindedomäne von p95 mit hoher Affinität binden. Ein derartiges Antikörperfragment, welches alle bekannten physiologischen Liganden vom Rezeptor verdrängt und auf ein fache Weise in großen Mengen durch rekombinante DNA-Technolo gie, z. B. aus dem Überstand von Phagen-infizierten Bakterien hergestellt werden kann, ist bei Hodits et al. (1995), J.Biol. Chem. 270, 24078-24085 beschrieben.

Die Nucleinsäure-Carrier-Komponente des erfindungsgemäßen Konjugats ist eine Substanz, welche in der Lage ist, mit einer Nucleinsäure einen unter physiologischen Bedingungen im we sentlichen stabilen Komplex zu bilden, der durch Rezeptor vermittelte Endozytose in eine Zielzelle eingeschleust werden kann. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Nucleinsäure-Carrier ein Nucleinsäure-komplexierendes Polykation, insbesondere ein Polypeptid, welches eine Vielzahl von positiven Ladungen trägt. Besonders bevorzugt ist der Nucleinsäure-Carrier in dieser Ausführungsform der Erfindung ein Poly-L-Lysin.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann auch ein viraler Nucleinsäure-Carrier verwendet werden. Ein solcher viraler Nucleinsäure-Carrier umfaßt vorzugsweise ein leeres Viruspartikel, welches zur Aufnahme von Nucleinsäuren in der Lage ist. Besonders bevorzugt umfaßt der Nucleinsäure-Carrier ein leeres Viruspartikel von Adeno-assoziiertem Virus (AAV).

Das erfindungsgemäße Konjugat zwischen Rezeptorligand und Nucleinsäure-Carrier kann einerseits durch chemische Kopplung beider Komponenten hergestellt werden. Diese chemische Kopp lung kann nach an sich bekannten Methoden, z. B. nach der Car bodiimidmethode unter Verwendung von 1-Ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid als Kopplungs reagenz erfolgen. Andererseits kann der Ligand mit dem Nucleinsäure-Carrier auch eine genetische Fusion bilden. Der artige genetische Fusionen zwischen dem Rezeptorliganden und dem Nucleinsäure-Carrier können beispielsweise durch rekom binante DNA-Methoden, z. B. durch Verknüpfung einer für RAP, Lactoferrin, Apolipoprotein E oder ein Rezeptor-bindefähiges Antikörperfragment kodierenden DNA-Sequenz mit einer für Poly lysin oder einem viralen Capsidprotein kodierenden DNA-Sequenz und Expression des resultierenden Konstrukts in einer geeigne ten Wirtszelle ohne weiteres hergestellt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Komplex eines erfindungsgemäßen Konjugats aus Rezeptor-Ligand und Nucleisäure-Carrier mit einer Nucleinsäure. Vorzugsweise ist dieser Komplex unter physiologischen Bedingungen im we sentlichen stabil. Die Nucleinsäure dieses Komplexes ist vor zugsweise eine doppelsträngige DNA, die in linearer oder zir kulärer Form vorliegen kann. Die Herstellung des Komplexes kann durch Inkubation des Konjugats mit einer Nucleinsäure unter solchen Bedingungen erfolgen, bei denen eine Komplexbil dung zwischen der Nucleinsäure-Carrier-Komponente des Konju gats und der Nucleinsäure stattfindet. Unter "Komplexbildung" im Sinne der vorliegenden Erfindung kann entweder eine direk te, z. B. ionische Wechselwirkung zwischen Carrier und Nuclein säure wie im Falle eines Polylysin-Carriers oder eine Verkap selung wie im Falle eines viralen Carriers zu verstehen sein.

Das Mengenverhältnis zwischen Konjugat und Nucleinsäure kann in weiten Bereichen variiert werden. Der Fachmann kann das optimale Verhältnis für eine bestimmte Nucleinsäure durch einfache in vitro Versuche ermitteln. Die Nucleinsäure ist vorzugsweise eine doppelsträngige DNA, die in linearer oder/und zirkulärer Form vorliegen kann.

Das erfindungsgemäße Konjugat oder der erfindungsgemäße Kon jugat-Nucleinsäure-Komplex kann als Genfähre zur Einschleusung von Nucleinsäuren in eine Zelle verwendet werden, an deren Oberfläche zweckmäßigerweise ein Rezeptor der LDL-Rezeptorfa milie, vorzugsweise der p95-Rezeptor lokalisiert ist. Auf diese Weise kann einerseits ein Gentransfer in in vitro kulti vierte Zellen, z. B. in mit p95 transfizierten COS-Zellen (Bujo et al. (1994), EMBO J. 13, 5165-5175) durchgeführt werden. Auf diese Weise kann bei Verwendung von nachweisbaren Reporterge nen wie etwa dem Beta-Galactosidasegen oder dem Luciferasegen und bei Verwendung unterschiedlicher Mengenverhältnisse von Konjugat und Nucleinsäure eine Optimierung der Gentransfer effizienz erreicht werden.

Andererseits eignet sich das Verfahren auch natürlich zur Herstellung transgener Tiere, z. B. transgener Vögel und ins besondere transgener Hühner. Hierzu können die Konjugat-Nu cleinsäure-Komplexe in den Blutkreislauf von Legehennen inji ziert werden, von wo sie dann über Rezeptor-vermittelte Endo zytose in die wachsende Eizelle gelangen. In frühen Stadien der Embryonalentwicklung internalisieren die Zellen der Bla stenschicht Eigelb direkt in ihr Zytoplasma. Noch dazu ist die Eizelle die der Zirkulation am besten zugängliche Zelle im Vogel. In späteren Stadien wird Eigelbmaterial in den Blut strom des sich entwickelnden Embryos durch Zellen des Dotter sackendoderms mobilisiert. Eine mit Eigelbkomponenten assozi ierte DNA wird von den sich schnell teilenden Zellen des frü hen Blastoderms aufgenommen und in das Genom von einigen die ser Zellen stabil inkorporiert. Da manche dieser Zellen Vor läufer von Keimzellen sind, können auf diese Weise chimäre Tiere mit Gonaden erzeugt werden, die eine Mischung von trans genen und normalen Zygoten enthalten. Wenn der Anteil der transgenen Gameten hoch genug ist, gelingt die Ausbrütung einer F1 Generationen von transgenen Tieren.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Ver fahren zur Erzeugung transgener Zellen, wobei

(a) man einen Konjugat-Nucleinsäure-Komplex mit Zellen, an deren Oberfläche ein Rezeptor der LDL-Rezeptorfamilie lokalisiert ist, unter solchen Bedingungen in Kontakt bringt, daß eine Internalisierung der Nucleinsäure in die Zellen erfolgt, und
(b) solche Zellen identifiziert, in denen die eingeführte Nucleinsäure exprimiert wird.

Vorzugsweise ist an der Oberfläche der Zellen der Hühnerei zellen Rezeptor p95 lokalisiert. Durch das erfindungsgemäße Verfahren können fremde Nucleinsäuren in eine in vitro kulti vierte Zelle oder auch in eine Embryonalzelle eines Tiers, insbesondere in eine Embryonalzelle einer eierlegenden Spe zies, z. B. in eine Hühnerembryonalzelle eingeschleust werden.

Schließlich betrifft die Erfindung auch eine transgene Zelle bzw. ein transgenes Tier, die durch ein Verfahren wie zuvor definiert erzeugt wurden. Auch Keimzellen dieses transgenen Tieres bzw. die aus diesen Keimzellen erhältlichen Nachkommen sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Das transgene Tier oder ein Nachkomme davon können als Biore aktor zur Herstellung rekombinanter Polypeptide in Eiern ver wendet werden. Außerdem kann das transgene Tier oder ein Nach komme davon zur Erzeugung cholesterinarmer Eier verwendet werden. Hierzu wird in die Keimbahn eine Nucleinsäure einge schleust, deren Expression eine Reduzierung des Cholesterin stoffwechsels oder/und eine Verringerung der Cholesterinauf nahme in das Ei bewirken kann.

Die Steuerung des Cholesteringehalts von Eiern kann beispiels weise dadurch erfolgen, daß transgene Hühner erzeugt werden, die variante Formen von p95 enthalten, die eine geringere Affinität für VLDL aufweisen und gegebenenfalls andere Ligan den präferent erkennen. Auf diese Weise kann die VLDL-Endozy those und somit der Cholesteringehalt des Eis reduziert wer den. Geeignete Varianten von p95 weisen Mutationen insbeson dere in einer oder mehreren der Ligandenbindedomänen (Lokali sierung vgl. WO 95/15379) auf. Alternativ oder zusätzlich können variante Formen von p95 erzeugt werden, die eine ver ringerte Fähigkeit zur Internalisierung von Liganden, insbe sondere VLDL, aufweisen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von RO-Hühnern (Bujo et al. (1995), Proc.Natl.Acad. Sci. USA 92, 9905-9909) zur Herstellung transgener Hühner, die Eier mit verringerten Cholesteringehalt erzeugen. RO-Hühner ("restricted ovulators"), sind Hühner, die keine Eier legen und einen Defekt im p95-Rezeptor aufweisen. Die Zucht dieser Hühner kann mittels heterozygoter Trägerhähne erfolgen. In derartige RO-Hühner kann eine variante Form des p95-Gens ein gebracht werden, durch welche die Eiablage wieder in Gang kommt. Vorzugsweise wird hierbei eine solche variante Form von p95 - wie zuvor erläutert - verwendet, die eine geringere Cholesterinaufnahme als die native Form von p95 bewirkt. Die Einführung des varianten p95-Gens erfolgt vorzugsweise als Bolusinfektion einer Genfähre, die eine für einen varianten p95 kodierende DNA enthält. Zur Keimbahntransformation ist dabei nicht - wie in der bisher erläuterten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung - eine Rezeptor-vermittelte Endozy tose von Nukleinsäuren erforderlich. Eine eventuell geringere Transformationseffizienz kann durch die Selektion auf Eiablage wieder ausgeglichen werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Erzeugung transgener Zellen, dadurch gekenn zeichnet, daß man in die Embryonalzelle einer eierlegenden Spezies, die ein defektes Oocytenrezeptorgen enthält, ein variantes Oocytenrezeptorgen einschleust, wobei des variante Oocytenrezeptorgen für einen Oocytenrezeptor kodiert, der (a) eine im Vergleich zum defekten Oocytenrezeptor höhere Aufnahme von Lipoproteinen in die Zelle gestattet, so daß die Fähigkeit zur Eiablage wieder hergestellt wird, und (b) eine im Ver gleich zum Wildtyp-Rezeptor geringere Aufnahme von Lipoprotei nen gestattet, so daß ein Ei mit verringertem Cholesteringe halt resultiert.

Vorzugsweise wird das variante Oocytenrezeptorgen in die Em bryonalzelle eines RO-Huhns eingeschleust.

Schließlich betrifft die Erfindung auch durch das Verfahren erzeugte transgene Zellen und Tiere sowie die Keimzellen und Nachkommen der transgenen Tiere. Die transgenen Tiere bzw. deren Nachkommen können zur Erzeugung cholesterinarmer Eier verwendet werden.

Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch nachfolgende Beispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1 Gewinnung von Rezeptorliganden

Hühner VLDL, Vitellogenin und Riboflavin-bindendes Protein wurden aus mit Östrogenen behandelten Hähnen gewonnen (George, 1987, Supra; MacLachlan, 1994, Supra; Stifani, 1988, Supra) Lactoferrin wurde aus Kuhmilch, Apolipoprotein E aus Kanin chen-β-VLDL und RAP aus rekombinanten Bakterienzellen gewon nen.

Eine Inspektion durch SDS-PAGE identifizierte Proteine von 16 kD (Apoprotein-VLDL-II) und ca. 520 kD (Apoprotein B) in VLDL; ein Triplet bei etwa 220 kDa (Vitellogenin); 27-29 kDa (Ribo flavin-Bindungsprotein); ∼80kDa (Lactoferrin); 36 kDa (Apopro tein E); und 39 kDa (RAP).

Beispiel 2 Herstellung von Rezeptorligand-Nucleinsäure-Carrier Konjugaten

Die in Beispiel 1 isolierten Proteine und Lipoproteine wurden an Poly-L-Lysin unter Verwendung von 1-Ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid nach der von Wu et al. (1989), J.Biol.Chem. 264, 16985-16987 beschriebenen Methode gekoppelt. Die Kopplungsbedingungen wurden variiert, um eine maximale DNA-Bindekapazität des resultierenden Pro tein/Poly-L-Lysin-Komplexes ohne signifikante Verringerung der Affinität an den Rezeptor zu erhalten.

Geeignete Kopplungsbedingungen waren die Verwendung von Poly- L-Lysin mit einem Polymerisierungsgrad von weniger als 20 und einem molaren Verhältnis von 10 : 1 bis 1 : 10 von Poly-L-Lysin zu Ligandenprotein je nach der zu komplexierenden DNA.

Beispiel 3 Herstellung von Konjugat-Nucleinsäure-Komplexen

Die in Beispiel 2 hergestellten Konjugate wurden mit DNA kom plexiert. Die Komplexierung erfolgte bei einem molaren Ver hältnis Phosphat- zu Aminogruppen von 1 : 2 bis 1 : 4 unter Ein satz von 6 µg DNA oder Vielfachen davon in 250 mM Saccharose bei Raumtemperatur oder 4°C. Als DNA wurde Beta-Galactosidase Plasmid-DNA verwendet.

Beispiel 4 Transfer von Konjugat-Nucleinsäure-Komplexen in in vitro kul tivierte Zellen

Es wurde die Aufnahme der in Beispiel 3 hergestellten Konju gat-Nucleinsäure-Komplexe in mit p95 transformierte COS-Zellen (Bujo et al. (1994), Supra) untersucht. Diese Zellen exprimie ren signifikante Mengen des Hühnereizellenrezeptors p95.

Die Zellen wurden in Gegenwart von Konjugat-Nucleinsäure-Kom plexen für zwei Tage bei 37°C inkubiert, um eine Endozytose und Expression des Fremdgens zu ermöglichen. In Kontrollexpe rimenten wurden die Nucleinsäure oder das Konjugat allein zugegeben.

Die Analyse der Zellen erfolgte einerseits durch Verwendung ³²P- oder ¹²⁵I-markierter Protein/DNA-Komplexe und Messung der von den Zellen aufgenommenen Radioaktivität. Weiterhin wurde das Vorhandensein der Plasmide in den Zellen unter Verwendung der PCR-Technik nachgewiesen.

Die Stärke der Expression der DNA in den transfizierten Zellen wurde durch Anfärbung der Zellen mit X-Gal in Gegenwart von Ferricyanid und Ferrocyanid gemessen. Diese Anfärbung ist spe zifisch für exprimierte Beta-Galactosidase, so daß positive Zellen auf einfache Weise durch ihre dunkelblauen Zellkerne identifiziert werden konnten (Bonnerot et al. (1987), Proc. Natl.Acad.Sci USA 84, 6795-6799).

Es wurden die in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse erhalten.

Tabelle 1

Beispiel 5 In vivo Gentransfer in Eizellen

Die in Beispiel 3 hergestellten Konjugat-Nucleinsäure-Komplexe wurden als einzelner Bolus von 100 µg Plasmid-DNA pro Henne in den Blutkreislauf von Legehennen injiziert. Zum Nachweis wurde ³²P markierte DNA verwendet. Weiterhin erfolgte der Nachweis der injizierten DNA durch PCR-Techniken.

Die der Injektion folgend gelegten Eier wurden über einen Zeitraum von 2 Wochen gesammelt. Um den an unterschiedlichen Tagen abgelegten Dotter zu markieren, wurden dem Futter jeden Tag andere fettlösliche Farbstoffe zugesetzt. Die Eier wurden unmittelbar nach dem Legen hartgekocht und der Eidotter ge schnitten, fotografiert und autoradiographisch analysiert. Nadelbiopsien des Dottermaterials aus Bereichen, die den farb stoffmarkierten Ringen entsprachen, wurden für eine quantita tive PCR-Analyse verwendet.

Die Analyse der Eier ergab eine zeitabhängige Verteilung der DNA. Die am Tag nach der Injektion gelegten Eier zeigten die DNA in einem peripheren Ring, in den folgenden 7-8 Tagen wan derten die Ringe zentripetal, und ab dem 8. Tag zeigten die Dier eine Ansammlung von Radioaktivität und PCR-amplifizier barem Material in einer zentralen Region von etwa 5 mm Durch messer.

Beispiel 6 Herstellung transgener Hühner

Eier von Hennen, die gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll behandelt worden waren, wurden gesammelt und für bis zu 72 Stunden inkubiert. Die Embryos wurden dann seziert und zur Anfärbung fixiert. Um das Ausmaß der Transformation von primordialen Keimzellen zu bestimmen, wurde eine doppelte Anfärbung auf Gegenwart von Beta-Galactosidase im Zellkern und mit einem Glycogen-spezifischen histochemischen Marker zum Nachweis der großen Glycogen-positiven Zellen im Keimbogen durchgeführt. Abhängig vom Entwicklungsstadium wurden die Embryos entweder vollständig oder als Schnitte angefärbt. Die Anzahl der Beta-Galactosidase-positiven, Glycogen-positiven Zellen als Prozentsatz der Glycogen-positiven Zellen wurde als Maß für die Wirksamkeit der Keimbahntransformation angenommen.

Aus den Eiern der gemäß dem Protokoll von Beispiel 5 behandel ten Legehennen wurden Küken ausgebrütet. Von den männlichen Küken wurden Blutproben entnommen und durch PCR auf das Vor handensein des eingeführten Fremdgens getestet. Aus den posi tiven Exemplaren wurden im Alter von 24 Wochen Samenproben entnommen und der Prozentsatz der transgenen Samenzellen durch in situ Hybridisierung an Schmierabstrichen von Samenzellen nach der Methode von Lichter et al. (1990), Science 247, 64-69 bestimmt. Hähne mit dem größten Prozentanteil an transgenem Sperma wurden zur Zucht verwendet. Die resultierende Nachkom menschaft wurde auf das Vorhandensein des eingeführten Fremd gens getestet.

Die Keimbahntransformation in männlichen Küken war mit einer Rate von bis zu ca. 5/100 erfolgreich.

Claims

1. Konjugat umfassend

(a) einen Liganden für einen Rezeptor der LDL-Rezeptor familie und
(b) einen Nucleinsäure-Carrier.

2. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Lipoprotein, Eigelb-Vorläuferprotein, ein heterologes Rezeptor-bindefähiges Protein oder ein Rezeptor-bindendes Fragment eines solchen Proteins ist.

3. Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend VLDL, Apolipoprotein B, Apolipoprotein E, Lipoproteinli pase, α₂-Macroglobulin, Pregnancy Zone Protein, Vitelloge nin, Plasminaktivator-Plasminaktivatorinhibitor 1-Kom plex, Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A, 39 kD Rezeptor assoziiertes Protein (RAP), Riboflavin-bindendes Protein, Rous-Sarcomavirus-Hüllprotein, Lactoferrin, Vesikular Stomatitisvirus-Oberflächenepitop oder Rezeptor-bindende Fragmente der zuvor genannten Substanzen.

4. Konjugat nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand VLDL, Vitellogenin, Riboflavin-bindendes Protein, Rezeptor-assoziiertes Protein, Lactoferrin, Apolipoprotein E oder ein Rezeptor-bindendes Fragment der zuvor genannten Substanzen ist.

5. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein mit dem Rezeptor bindefähiger Antikör per oder ein Antikörperfragment ist.

6. Konjugat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein einzelkettiges Antikörperfragment ist.

7. Konjugat nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand an den Hühnereizellenrezeptor p95 bindefä hig ist.

8. Konjugat nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß der Nucleinsäure-Carrier ein Nucleinsäure-komplexie rendes Polykation ist.

9. Konjugat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Polykation ein mehrfach positiv geladenes Poly peptid, insbesondere Poly-L-Lysin, ist.

10. Konjugat nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß der Nucleinsäure-Carrier ein leeres Viruspartikel umfaßt.

11. Konjugat nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Nucleinsäure-Carrier ein leeres Viruspartikel von Adeno-assoziiertem Virus (AAV) umfaßt.

12. Konjugat nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand mit dem Nucleinsäure-Carrier durch che mische Kopplung verknüpft ist.

13. Konjugat nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand mit dem Nucleinsäure-Carrier eine gene tische Fusion bildet.

14. Komplex eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1-13 und einer Nucleinsäure.

15. Verfahren zur Herstellung eines Komplexes nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Rezeptorligand-Nucleinsäure-Carrier Konjugat nach einem der Ansprüche 1-13 mit einer Nucleinsäure unter Bedingungen inkubiert, bei denen eine Komplexbil dung zwischen der Nucleinsäure-Carrier-Komponente des Konjugats und der Nucleinsäure stattfindet.

16. Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1- 13 oder eines Konjugat-Nucleinsäure-Komplexes nach An spruch 14 als Genfähre zur Einschleusung von Nucleinsäu ren in eine Zelle.

17. Verwendung nach Anspruch 16 zur Herstellung transgener Tiere.

18. Verwendung nach Anspruch 17 zur Herstellung transgener Vögel.

19. Verwendung nach Anspruch 18 zur Herstellung transgener Hühner.

20. Verfahren zur Erzeugung transgener Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) man einen Konjugat-Nucleinsäure-Komplex mit Zellen, an deren Oberfläche ein Rezeptor der LDL-Rezeptorfa milie lokalisiert ist, unter solchen Bedingungen in Kontakt bringt, daß eine Internalisierung der Nucleinsäure in die Zellen erfolgt, und
(b) solche Zellen identifiziert, in denen die einge führte Nucleinsäure exprimiert wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß an der Oberfläche der Zellen der Hühnereizellenrezep tor p95 lokalisiert ist.

22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Nucleinsäure in eine in vitro kultivierte Zelle einschleust.

23. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Nucleinsäure in eine Embryonalzelle einer eierlegenden Spezies einschleust.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man die Nucleinsäure in eine Hühnerembryonalzelle einschleust.

25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß man ein variantes p95-Gen einschleust.

26. Transgene Zelle, erzeugt durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 20-25.

27. Transgenes Tier, erzeugt durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 20-25.

28. Keimzelle eines transgenen Tiers nach Anspruch 27.

29. Nachkomme eines transgenen Tiers nach Anspruch 27.

30. Verwendung eines transgenen Tiers nach Anspruch 27 oder eines Nachkommens davon als Bioreaktor zur Herstellung rekombinanter Polypeptide in Eiern.

31. Verwendung eines transgenen Tiers nach Anspruch 27 oder eines Nachkommens davon zur Erzeugung cholesterinarmer Eier.

32. Verfahren zur Erzeugung transgener Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man in die Embryonalzelle einer eierlegenden Spezies, die ein defektes Oocytenrezeptorgen enthält, ein varian tes Oocytenrezeptorgen einschleust, wobei das variante Oocytenrezeptorgen für einen Oocytenrezeptor kodiert, der (a) eine im Vergleich zum defekten Oocytenrezeptor höhere Aufnahme von Lipoproteinen in die Zelle gestattet, so daß die Fähigkeit zur Eiablage wieder hergestellt wird, und (b) eine im Vergleich zum Wildtyp-Rezeptor geringere Aufnahme von Lipoproteinen gestattet, so daß ein Ei mit verringertem Cholesteringehalt resultiert.

33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß man das variante Oocytenrezeptorgen in die Embryonal zelle eines RO-Huhns einschleust.

34. Transgene Zelle, erzeugt durch ein Verfahren nach An spruch 32 oder 33.

35. Transgenes Tier, erzeugt durch ein Verfahren nach An spruch 32 oder 33.

36. Keimzelle eines transgenen Tiers nach Anspruch 35.

37. Nachkomme eines transgenen Tiers nach Anspruch 35.

38. Verwendung eines transgenen Tiers nach Anspruch 35 oder eines Nachkommens davon zur Erzeugung cholesterinarmer Eier.