DE69027535T2

DE69027535T2 - Modifiziertes biologisches material

Info

Publication number: DE69027535T2
Application number: DE69027535T
Authority: DE
Inventors: David J G White; Alan Frederick Williams
Original assignee: Imutran Ltd
Current assignee: Imutran Ltd
Priority date: 1989-10-12
Filing date: 1990-10-12
Publication date: 1996-11-28
Anticipated expiration: 2010-10-13
Also published as: PT95580A; AU6539290A; FI921618A0; ATE139562T1; PT95580B; NZ248153A; HK48497A; GR940300004T1; NO921438L; IE903649A1; US6495735B1; EP0709459A3; CA2067235A1; PT101896A; RO109863B1; JPH05503074A; CN1051199A; NO303502B1; NZ235657A; CN1491624A

Description

Diese Erfindung betrifft ein biologisch kompatibles Material zur Verwendung in Transplantaten und die Herstellung und Verwendung eines solchen Materials.
Der Austausch von verbrauchtem oder schadhaftem tierischen (insbesondere menschlichen) Gewebe, einschließlich Organen, ist in den letzten vier Jahrzehnten zur alltäglichen Therapie in der klinischen Medizin geworden. Diese Austauschtherapien reichen zum Beispiel von der Verwendung des Polyethylenteraphthalats, das von DuPont unter dem Handelsbezeichnung DACRON vertrieben wird, zur Reparatur schadhafter Blutgefäße bis zur Verwendung der Vena saphena als Autoplastik zur Umgehung blockierter Arterien und bis zur Transplantation eines Herzens von einem Menschen zum anderen.
Die Organtransplantation hat sich wesentlich mit den modernen Immunsuppressiva weiterentwickelt, welche die Erzielung hoher Erfolgsraten bei verhältnismäßig geringen Kosten ermöglichen. Die Nachfrage nach einer Organtransplantation ist rasch gestiegen. Gegenwärtig werden mehr als 20000 Organtranspiantationen weltweit pro Jahr ausgeführt. Dies stellt jedoch nur etwa 15 % des nach gegenwärtigen Kriterien geschätzten Bedarfs dar. Das Verhältnis von Versorgung zu Nachfrage bei Spenderorganen aller Arten kann mit den bestehenden Quellen nicht erfüllt werden. Dies zeigt sich am besten bei der Nachfrage nach einer Herztransplantation. Die erste Herztransplantation von Barnard im Jahr 1967 löste ein beachtliches Medieninteresse aus. Innerhalb eines Jahres wurden 101 Herztransplantationen in 22 läändern von 64 verschiedenen Chirurgenteams durchgeführt. Enttäuschung folgte den schlechten erzielten Ergebnissen, so daß in den frühen Siebziger Jahren weniger als 30 Transplantate pro Jahr weltweit durchgeführt wurden. Die Einführung der Cyclosporin-Immunsuppression jedoch hat die Herztransplantation revolutioniert, so daß die meisten Institute nun bei der Herztransplantation Erfolgsraten von mehr als 80% bei einem Jahr Transplantat (und Überleben des Patienten) erwarten können. Es ist aus gutem Grund zu erwarten, daß diese Überlebensrate mit zunehmender Fachkenntnis weiter steigt. Der Erfolg dieses Verfahrens erhöht natürlich die Nachfrage, so daß der Ärztestand und die allgemeine Öffentlichkeit sich immer stärker bewußt werden, daß die Herztransplantation eine echte Alternative zum Tod bildet, so daß immer mehr Patienten für das Verfahren überwiesen werden. Gegenwärtig werden mehr als 2000 Herztransplantationen pro Jahr ausgeführt.
Heute ist das größte Sterberisiko bei der Herztransplantation die Wartezeit, bis ein geeignetes Spenderorgan zur Verfügung steht. Während das künstliche Herz eine kurzfristige Versorgungseinrichtung für diese Patienten bietet, bestehen langfristige Nachfragen nach mehr Herztransplantationsinstituten und eine größere Spenderversorgung. Die mögliche Anzahl von Patienten, die aus einer Herztransplantation Nutzen ziehen könnten, wurde niemals wissenschaftlich ermittelt, aber veröffentlichte Schätzungen des Bedarfs an einer Herztransplantationen liegen in einem weiten Bereich von 50 bis 250 Menschen pro Million pro Jahr, abhängig von den Selektionskriterien, dem Alter des Empfangers, der Erkrankung usw. Unabhängig von der tatsächlichen Zahl ist es bereits ziemlich klar, daß die gegenwärtigen Spenderversorgungsmöglichkeiten den Bedarf nicht stillen können. Ähnliche Bemerkungen treffen auf die Nieren- und Lebertransplantation zu, und es scheint wahrscheinlich, daß, sobald die Bauchspeicheldrüsen- oder Langerhans-Inseln-Zellentransplantation ein allgemein anerkanntes therapeutisches Verfahren zur Behandlung von Diabetes wird, eine Knappheit dieses Gewebes ebenso eine wichtige Überlegung wird.
Bei der gegenwärtigen Transplantationstherapie gibt es weitere Nachteile. Es ist bei weitem nicht immer der Fall, daß Spenderorgane zur Verwendung in einer Transplantation geeignet sind, nicht zuletzt, weil viele Organspender selbst Opfer eines Unfalls (z.B. eines Verkehrsunfalls) sind, wobei der Tod durch Verletzung eines Organs eingetreten ist, das nicht jenes ist, welches transplantiert werden soll; es kann jedoch eine zusätzliche Verletzung oder eine damit verbundene Schwierigkeit bei dem zu transplantierenden Organ vorliegen.
Ferner kann wegen der nicht vorhersagbaren Verfügbarkeit der Organe von Spendern die Transplantationschirurgie häufig nicht als Routineoperation geplant werden, wozu auch das rechtzeitige Buchen des Operationssaals gehört. Allzu häufig müssen Ärzteteams und Spitalsverwalter sofort reagieren, wenn ein Spenderorgan identifiziert ist, und zu unsozialen Zeiten arbeiten, wodurch die administrativen und personellen Schwierigkeiten vergrößert werden.
Wenn bei einem Herz-, Leber- und Lungentransplantat eine Abstoßung eintritt, ist es für gewöhnlich nicht möglich, eine Retransplantation vorzunehmen, wenn nicht zufällig ein weiterer geeigneter Spender innerhalb einer kurzen Zeitspanne zur Verfügung steht.
Abgesehen von den obengenannten medizinischen Schwierigkeiten kann die gegenwärtige Praxis der Transplantation in einigen Fällen mit sozialen Schwierigkeiten verbunden sein. An erster Stelle können religiöse Einwände gegen das Entfernen von Organen bei möglichen Spendern bestehen, insbesondere bei jenen Kulturen, die an die Wiedergeburt glauben. Es gibt natürlich andere ethische und soziale Schwierigkeiten, die bei der Entfernung von Organgen von toten Menschen auftreten, insbesondere, da in einigen Ländern eine Zustimmung erforderlich ist. Schließlich gibt das Auftreten eines kommerziellen Handels mit lebenden Nierenspendern Grund zur Sorge, insbesondere in bestimmten Ländern der Dritten Welt, und es wäre vom sozialen Standpunkt aus wünschenswert, einen derartigen Handel zu unterbinden oder einzuschränken.
Die herkömmliche Transplantationschirurgie, die zuvor mit ihren Nachteilen umrissen wurde, umfaßt die Transplantation von einem Tier einer bestimmten Gattung (im allgemeinen vom Menschen) zu einem anderen derselben Gattung. Solche Transplantationen werden Allotransplantat genannt. Wegen der Schwierigkeiten bei der herkömmlichen Allotransplantatversorgung, wie zuvor beschrieben, hat sich das Interesse auf die Möglichkeit der Verwendung von Xenotransplantaten in der Transplantation gerichtet. Die Xenotransplantation ist die generische Bezeichnung, die allgemein für die Implantation von Geweben, einschließlich von Zellen und Organen, über die Gattungsgrenzen hinweg verwendet wird.
Es gibt bereits einige Beispiele für die erfolgreiche Verwendung von Xenotransplantaten in therapeutischen Ersatzschemen. Zum Beispiel wurde in den letzten Jahren Schweinegewebe für den Ersatz der Aortenklappe, Schweinehaut zur Abdeckung von Patienten mit schweren Verbrennungen und die Nabelvene der Kuh als Venenplastik verwendet. Alle diese Xenotransplantate haben jedoch eines gemeinsam: sie liefern nur einen mechanischen Ersatz. Das verwendete Gewebe ist biologisch nicht funktionell. Der Grund dafür liegt darin, daß die Immunverfahren, die beim Menschen existieren, die zelluläre Integrität der Gewebe der meisten Gattungen sofort (innerhalb von Minuten oder Stunden) zerstören. Derartige Xenotransplantate werden als diskordante Xenotransplantate bezeichnet.
Die Stärke dieser Zerstörung steht mit der Entwicklungsgeschichte in Zusammenhang. So kann Gewebe vom Schimpansen, der ein dem Menschen nahe verwandter Primate ist, im Menschen annähernd in derselben Weise überleben wie ein Allotransplantat; eine solches Xenotransplantat ist als konkordantes Xenotransplantat bekannt.
Nun könnte man denken, daß konkordante Xenotransplantate eine Antwort auf die Schwierigkeiten mit Allotransplantaten geben könnten, aber in der Praxis ist dies wahrscheinlich nicht der Fall. Schimpansen sind viel kleiner als der Mensch, und Organe von Schimpansen sind im allgemeinen nicht groß genug, um beim Menschen zu funktionieren. Bei Nieren kann dies überwunden werden, indem zwei Schimpansennieren als Ersatz für eine insuffiziente menschliche Niere transplantiert werden, aber bei der Leber und beim Herz ist dies eindeutig keine Möglichkeit. Ferner vermehren sich Schimpansen in der Natur langsam und in der Gefangenschaft kaum, und die Nachfrage nach Schimpansen als Versuchstiere (insbesondere in der gegenwärtigen Ära der Erforschung des Erworbenen Immunmangelsyndroms (AIDS) bedeutet, noch einmal gesagt, daß die Nachfrage die Versorgung übertrifft. Zusätzlich kann es eine gewisse soziale Schwierigkeit bei der öffentlichen Akzeptanz der Verwendung von anderen Primaten als Xenotransplantatspender geben.
Das Interesse hat sich daher wieder auf die diskordanten Xenotransplantate gerichtet. Es wird allgemein angenommen, daß der Grund, warum diskordante Xenxotransplantate so rasch versagen, die Gegenwart von "natürlich vorkommenden" Antikörpern in der Empfängergattung gegen bisher noch undefinierte Antigene der Spendergattung ist (Shons et al. (Europ. Surg. Reg. 5 26-36 (1973)). Die Antikörper werden als "natürlich vorkommend" bezeichnet, da sie bei Individuen festgestellt werden, die noch keine immonologische Exposition von der Spendergattung erfahren haben.
Die rasche Abstoßung - die als hyperakute, antikörpervermittelte Abstoßung bekannt ist - eines Organtransplantats ist gut dokumentiert. In den frühen Sechziger Jahren, als (Allotransplantat-) Nierentransplantationen zur Routinebehandlung wurden, wurde beobachtet, daß transplantierte Nieren gelegentlich vom Empfänger noch während der Operation abgestoßen wurden. Während einer Transplantatoperation wird die Niere in der Regel kurz nachdem die Gefäße des Empfängers und Spenders zusammengenäht sind, rot und fest in der Konsistenz. Solche Transplantate erzeugen häufig sofort Harn. Bei der Form von Abstoßung, wo das Transplantat zerstört wird, während der Patient noch auf dem Operationstisch liegt (der hyperakuten Abstoßung), beginnen die Zerstörungsprozesse etwa in den ersten wenigen Minuten nach der Transplantation. Wenn dies eintritt, wird die Niere bläulich und fleckig und dann verstopft. Ebenso ändert sich die Konsistenz des Organs. In der Regel wird das Transplantat ödematös, es kommt zu keiner Haruproduktion und die soeben transplantierte Niere wird dann sofort entfernt. Es wurde klar, daß eine humoral vermittelte, immunologische Antwort zwischen bereits gebildeten zirkulierenden Antikörpern in dem Empfänger und Antigenen in der Spenderniere beteiligt sind. Die einzige Möglichkeit, diesen Vorfall bei der Allotransplantation zu vermeiden, ist die Feststellung vor der Transplantation, daß keine Antikörper im Empfänger gegen die Spenderzellen vorhanden sind. Mit zunehmender Kenntnis über die Testung auf solche Antikörper (die als Kreuzprobe bekannt ist), wurde klar, daß diese Verallgemeinerung, daß ein Antikörper im Empfänger gegen Antigene im Spender reagiert, nicht wahr ist, und daß eine hyperakute Transplantatszerstörung, wenn sie Transplantate zwischen Individuen derselben Gattung betrifft, auf die Gegenwart spezifischer Arten von Antikörpern beschränkt ist, die als T-warme positive Kreuzprobe bekannt sind; und mit höchster Wahrscheinlichkeit gehören diese Antikörper zu der IgG-Unterklasse. Ferner ist die Gegenwart dieser Antikörper immer das Ergebnis eines zuvor bestehenden Immunsierungsverfahrens entweder als Ergebnis vorangehender Bluttransfusionen oder als Ergebnis einer Schwangerschaft oder, was häufiger der Fall ist, als Ergebnis eines früheren Transplantats, das versagt hat.
Der Mechanismus der hyperakuten Xenotransplantatabstoßung wurde weitgehend als dem Mechanismus der hyperakuten Allotransplantatabstoßung sehr ähnlich eingestuft, wie zuvor erklärt wurde. Die Literatur über den Mechanismus der Xenotransplantatabstoßung ist sehr umfangreich und geht etwa 83 Jahre zurück. Während dieser Zeit scheinen nur drei Veröffentlichungen einen Mechanismus für die Xenotransplantatabstoßung vorgeschlagen zu haben, bei dem nicht Antikörper beteiligt sind. Der Vorschlag war, daß der alternative Weg der Komplementaktivierung bei der Xenotransplantatabstoßung beteiligt sei (obwohl eine derartige Terminologie nicht unbedingt verwendet wurde). Der Vorschlag erschien das erste Mal 1976 in einer Arbeit von Schilling et al. (Surgery, Gynaecology and Obstetrics 142 29-32 (1976)). Der Vorschlag wurde 1988 und 1989 von Miyagawa et al. (Transplantation 46(6) 825-830 (1988) und Transplantation Proceeedings 21(1) 520-521 (1989)) wiederholt (dieselben Daten wurden zweimal veröffentlicht). Die Ergebnisse waren jedoch nicht überzeugend, da beide Experimente im wesentlichen denselben Fehler aufwiesen. Das gewählte Modell wird von den Autoren als ein Xenotransplantatmodell beschrieben, bei dem keine gattungskreuzenden Antikörper bestehen. Es scheint nun, daß die Tests, die für den Nachweis von gattungskreuzenden Antikörpern verwendet wurden, unzulänglich waren, und daß die Schlüsse, die in diesen Arbeiten gezogen wurden, auf unzulänglichen Daten beruhten.
Die meisten Maßnahmen, die gegenwärtigen im Experiment ergriffen werden, um die Abstoßung bei Xenotransplantaten zu vermeiden oder zu verringern, beinhalten die chemotherapeutische Beeinflussung des Immunsystems des Empfängers, weitgehend auf einer nicht spezifischen Basis wie zum Beispiel mit Cyclosporin A und anderen Immunsuppressiva, durch Plasmaphorese, durch Behandlung mit dem Kobragiftfaktor, Staphylococcus Protein A-Absorption des Antikörpers und so weiter. Dieser Weg ist natürlich die Folge der Chemotherapie, die Allotransplantate unterstützt.
Die Erfindung wählt einen radikal anderen Weg: anstatt das Immunsystem des Empfängers nichtspezifisch zu beeinflussen, ermöglicht die Erfindung die gleichzeitige Verabreichung von Material, das die Wirkung hat, daß ein Spendertransplantat von bestimmten Komponenten des Immunsystems des Empfängers als eigen angesehen wird. In besonders bevorzugten Ausführungsbeispielen wird das Spendergewebe selbst modifiziert, um in gewisser Hinsicht dem Empfänger immunologisch als eigen zu erscheinen.
Es wurde auch entdeckt, daß die hyperakute Xenotransplantatabstoßung nicht unbedingt antikörpervermittelt ist. Dies ergibt sich aus zwei Beobachtungen. Erstens wird die hyperakute Abstoßung in Abwesenheit von Antikörper aber in Gegenwart von Komplement beobachtet; zweitens wird in Gegenwart von Antikörper aber in Abwesenheit von Komplement keine hyperakute Abstoßung beobachtet.
Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß die Komplementaktivierung bei der hyperakuten Zerstörung eines Xenotransplantats vorherrschend ist, ob eine solche Aktivierung nun durch die Bindung von geeigneten Antikörpermolekülen unterstützt wird oder nicht. Die Aktivierung des alternativen Weges des Komplements kann von einer Reihe von Zellprodukten ausgelöst werden. Diese Produkte sind nicht auffremde eindringende Zellen wie Bakterien oder Xenotransplantate beschränkt, sondern sind auf vielen Zellen vorhanden. Daher können im Prinzip viele Zellen eines Individuums den alternativen Weg des Komplements aktivieren, wodurch eine massive Autoimmunzerstörung verursacht wird. Das dies nicht geschieht, ist auf die Existenz einer Reihe von Proteinen zurückzuführen, die das Komplement nach unten regulieren und in Serum und an der Oberfläche der Zellen von Natur aus vorkommen. Diese Moleküle (die hierin als "homologe Komplementrestriktionsfaktoren" bezeichnet werden), verhindern die vollständige Aktivierung des eigenen Komplements, entweder durch den klassischen oder alternativen Weg, durch die Produkte der eigenen Zellen, wodurch die eigene Autoimmunzerstörung verhindert wird. Die Funktionsweise solcher Moleküle wird auf elegante Weise bei der paroxysmalen nächtlichen Hämoglubinurie veranschaulicht. Bei dieser Erkrankung fehlt der Membrananker von mindestens einem dieser Moleküle (Zerfallsbeschleunigungsfaktor). Daher wird das Protein nicht in der Erythrozyten-Zellmembran gehalten und löst sich von der Zelle, wodurch der alternative Weg des Komplements aktiviert wird, und wird dann aufgelöst, was Hämoglobinurie verursacht.
Gemaß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine verpflanzbare tierische Zelle oder ein Gewebe einer Spendergattung zur Verwendung in der Medizin bereitgestellt, wobei die Zelle oder das Gewebe mit einem oder mehreren homologen Komplementrestriktionsfaktoren verbunden ist, die bei einer Empfängergattung verwendet werden können, um die vollständige Aktivierung des Komplements zu verhindern, und wobei die Spendergattung in bezug auf die Empfängergattung eine nicht übereinstimmende Gattung ist.
Die vorliegende Erfindung kann in einem Verfahren zur Transplantation von tierischem Gewebe in einen Empfänger verwendet werden, wobei das Gewebe von einem Spender einer anderen Gattung als jener des Empfängers abgeleitet wird, wobei die Spendergattung eine diskordante Gattung in bezug auf den Empfänger ist, wobei das Verfahren die Transplantation des Gewebes in den Empfänger und die Bereitstellung eines oder mehrerer homologer Komplementrestriktionsfaktoren in Verbindung mit dem transplantierten Gewebe umfaßt, die in der Empfängergattung aktiv sind, um die vollständige Komplementaktivierung zu verhindern.
Das Wort "gewebe", wie in dieser Beschreibung verwendet, bezeichnet jedes biologische Material, das transplantiert werden kann und umfaßt Organe (insbesondere die lebenswichtigen inneren Organe wie das Herz, die Lunge, die Leber, die Niere, die Bauchspeicheldrüse und die Schilddrüse), Hornhaut, Haut, Blutgefaße und anderes Bindegewebe, Zellen, einschließlich von Blut- und hämatopoetischen Zellen, Langerhans-Inseln, Gehirnzellen und Zellen endocriner und anderer Organe und Körperflüssigkeiten (wie PPF), die alle Kandidaten für die Transplantation von einer Gattung zur anderen sein können.
Eine "diskordante Gattung" ist eine Gattung, von welcher ein (im allgemeinen vascularisiertes) Xenotransplantat in dem Empfänger für gewöhnlich eine hyperakute Abstoßung hervorrufen würde, das heißt, eine Abstoßung innerhalb von Minuten oder Stunden und nicht Tagen (Calne Transplant Proc 2:550, 1970). Derartige hyperakute Abstoßungen sind dem Fachmann gut bekannt und können in weniger als 24 Stunden, unter 6 Stunden oder sogar unter einer Stunde nach der Transplantation stattfinden.
Das Komplement und seine Aktivierung sind nun allgemein bekannt und sind in Roitt, Essential Immunology (5. Ausgabe, 1984) Blackwell Scientific Publications, Oxford, beschrieben. Die Aktivität, die dem Komplement (C') zugeschrieben wird, hängt von der Wirkung von neun Proteinkomponenten (C1 bis C9) ab, die der Reihe nach wirken, von welchen das erste aus drei Hauptunterfraktionen besteht, die als C1q, C1r und C1s bezeichnet werden. Das Komplement kann durch den klassischen oder alternativen Weg aktiviert werden, die beide nun kurz beschrieben werden.
Im klassischen Weg bindet Antikörper an C1, dessen C1s Untereinheit Esteraseaktivität erwirbt und die Aktivierung und Übertragung zu Stellen an der Membran oder dem Immunkomplex von zuerst C4 und dann C2 herbeiführt. Dieser Komplex besitzt "C3-Convertase"-Aktivität und spaltet C3 in Lösung, um ein kleines Peptidfragment C3a zu erzeugen und ein Restmolekül C3b, die äußerst unterschiedliche Funktionen aufweisen. C3a hat Anaphylatoxinaktivität und spielt keine weitere Rolle in der Komplementaktivierungskaskade. C3b ist membrangebunden und kann eine Immunadhärenz des Antigen-Antikörper-C3b-Komplexes verursachen, wodurch die anschließende Phagozytose erleichtert wird.
Im alternativen Weg wird die C3-Convertaseaktivität von C3bB ausgeübt, dessen Aktivierung durch exogene Mittel ausgelöst werden kann, insbesondere durch mikrobielle Polysaccharide wie Endotoxin, die unabhängig von Antikörper wirken. Die Convertase wird durch die Wirkung von Faktor D auf einen Komplex aus C3b und Faktor B gebildet. Dies bildet eine positive Rückkopplungsschleife, in der das Abbauprodukt von C3 (C3b) mithilft, mehr Spaltungsenzym zu bilden.
Sowohl im klassischen als auch im alternativen Weg wird der C3b-Spiegel durch die Wirkung eines C3b-Inaktivators (Faktor I) aufrechterhalten. C3b vereint sich leicht mit Faktor H zur Bildung eines Komplexes, der durch Faktor 1 abgebaut wird und seine hämolytischen und Immunadhärenzeigenschaften verliert.
Der klassische und alternative Weg sind nach der C3-Stufe gleich. C5 wird zu C5a und C5b-Fragmenten gespalten. C5a hat Anaphylatoxinaktivität und führt zur Chemotaxis von Polymorphen. C5b bindet als Komplex mit C6 und C7 zur Bildung einer wärmestabilen Stelle an der Membran, welche die letzten Komponenten C8 und C9 zur Erzeugung des Membranangriffskomplexes (MAC) verbindet. Dies ist eine ringförmige Struktur, die in die Membran eingesetzt wird und aus dieser vorragt, die einen durch die Membran hindurchgehenden Kanal bildet, der für Elektrolyte und Wasser vollständig durchlässig ist. Aufgrund des hohen inneren osmotischen Kolloiddrucks kommt es zu einem Nettozufluß von Natriumionen und Wasser, was zu einer Zellyse führt.
Homologe Komplementrestriktionsfaktoren (HCRFs), die in der vorliegenden Erfindung zweckdienlich sind, können im allgemeinen bei jedem Teil der Komplementaktivierungskaskade eingreifen. Ein HCFR kann nur bei jenem Teil eingreifen, der den klassischen Weg bildet, oder nur bei jenem Teil, der den alternativen Weg bildet oder kann, was häufiger der Fall ist, bei jenem Teil eingreifen, der bei dem klassischen und alternativen Weg gleich ist. Es wird bevorzugt, daß der HCRF-Regulator bei dem gemeinsamen Teil des Weges eingreift. Der HCRF kann mit einem natürlichen HCRF identisch sein oder einfach die passende Funktion haben. Synthetische und halbsynthetische HCRFs, einschließlich jener, die durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden, und in jeder Art hergestellte Varianten, sind in dem Begriff HCRF enthalten.
Wie zuvor erwähnt, sind homologe Komplementrestriktionsfaktoren Substanzen, welche die Wirkung der Komplementkaskade derart regulieren, daß deren lytische Aktivität verringert oder verhindert wird; sie werden vom tierischen Körper zur Kennzeichnung von Gewebe als eigenes verwendet, um eine Autoimmunreaktion zu verhindern. In dieser Erfindung ist es im Prinzip für den HCRF möglich, entweder membrangebunden oder frei in Serum zu sein, obwohl in der Praxis bevorzugt wird, daß der HCRF an den Zellen des Xenotransplantatgewebes membrangebunden ist. Auf diese Weise ist es für den HCRF leichter, mit dem Transplantatsgewebe "verbunden" zu sein. Zu bevorzugten HCRFs zählen mutmaßliche Zellmembranfaktoren einschließlich des C3b/C4b-Rezeptors (CR1), C3.dg Rezeptors (CR2), Zerfallsbeschleunigungsfaktors (DAF), C3b-Inaktivators und Membrancofaktorproteins (MCP). Zu mutmaßlichen Serum-HCRFs zählen Faktor H, Zerfallsbeschleunigungsfaktor (DAF) und C4-Bindungsprotein (C4bp). Diese HCRFs regulieren alle die Aktivität des Komplements durch Beeinflussung in der C3-Stufe nach unten. Ein homologer Restriktionsfaktor (HRF), der bei C8 blockiert, ist ebenso ein mutmaßlicher Membranfaktor.
Viele aber nicht alle der Gene für geeignete HCRFs sind in der RCA- (Regulator der Komplementaktivierung) Stelle angeordnet, die bei Bande q32 von Chromosom 1 kartiert (Rey-Campos et al. J. Exp. Med. 167 664-669 (1988)).
Obwohl es eine gewisse Verwirrung bei der Nomenklatur und Position von HCRFs gab, werden die Faktoren C4BP, CR1, DAF und Faktor H von Rey-Campos etal. (Loc. cit.) und in ihrer früheren Studie (J. Exp. Med. 166 246-252 (1987)) identifiziert. Membrancofaktorprotein (MCP) wird von vielen Forschern als Synonym für C4-Bindungsprotein (C4bp) behandelt, und es kann sein, daß diese beiden Faktoren entweder verwandt oder identisch sind. Rother und Till ("The Complement System", Springer-Verlag, Berlin (1988)) geben einen Überblick über die Regulierungsfaktoren der C3-Convertase in Abschnitt 1.2.3.2; sie setzen das C4-Bindungsprotein (C4bp) mit dem Zerfallsbeschleunigungsfaktor und Faktor H mit dem B&sub1;H-Protein und dem C3b-Inaktivatorbeschleuniger gleich. Zweifellos wird sich die Nomenklatur, Lekalisierung und Charakterisierung von HCRFs weiterentwickeln, aber es versteht sich, daß die vorliegende Erfindung die Verwendung aller HCRFs in Betracht zieht, wie dies Eignung und Präferenz gebieten.
Andere Verweisstellen auf HCRFs sind die folgenden: Faktor 1 (früher auch als C3b-Inaktivator oder KAF bekannt): Tamura & Nelson (J. Immunol. 99 582-589 (1967));
Faktor H: Pangburn et al. (J. Exp. Med. 146 257-270 (1977));
C4-Bindungsprotein: Fujita et al. (J. Exp. Med. 148 1044-1051(1978));
DAF (auch als CD55 bekannt): Nicholson-Weller et al. (J. Immunol. 129 184 (1982));
Membrancofaktorprotein (MCP; auch als CD46 bekannt und erstmals als gp45-70 beschrieben und ferner als gp 66/56 bekannt: Seya et al. (J. Exp. Med. 163 837-855 (1986));
CR1 (auch als CD35 bekannt): Medof et al. (J. Exp. Med. 156 1739-1754 20 (1982)) und Ross et al. (3. Immunol. 129 2051-2060 (1982));
CR2 (auch als CD21, 3d/EBV-Rezeptor und p140 bekannt): Iida et al. (J. Exp. Med. 158 1021-1033 (1983)) und Weis et al. (PNAS 81 881-885 (1984)).
Die Gewebeverteilung einiger der RCA-Proteine ist wie folgt:
CR1: Membran (eingeschränkt): Erythrozyten, Monozyten; die meisten B- 25 und einige T-Zellen; polymorphonucleare Leukozyten; Follikel-Dendritzellen;
glomerulare Podozyten;
CR2: Membran (eingeschränkt): die meisten B-Zellen, Follikel-Dendritzellen; einige Epithelzellen und einige T-Zellinien;
MCP: Membran (umfassend): alle peripheren Blutzellen (außer 30 Erythrozyten); Epithel-, Endothel- und Fibroblastzellstämme; Trophoblast und Sperma;
DAF: Membran (umfassend): alle peripheren Blutzellen; Epithel-, Endothel- und Fibroblastzellstämme; Trophoblast und Sperma;
C4bp: Plasma: Lebersynthese; und
H: Plasma: Lebersynthese; Fibroblast- und Monozytenzellinien.
In bezug auf die Proteine, die an der homologen Restriktion auf dem Niveau des Membranangriffskomplexes beteiligt sind, deren Verwendung auch in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird, gibt es eine allgemeine Übereinstimmung (aber bisher keinen Beweis) in der Form einer Proteinsequenz, daß die folgenden (oder etwa) 65kDa Proteine identisch sind:
C8-Bindungsproteine (Schönermark et al., J. Immunol. 136 1772 (1986));
homologer Restriktionsfaktor (HRF) (Zalman et al. Immunology 83 6975 (1986)); und
MAC-Hemmprotein (MIP) (Watts et al. (1988)).
Das CBbp/HRF/MIP-Protein ist an der Zelloberfläche durch einen Glycolipidanker befestigt, wie auch CD59 und DAF: von diesen Proteinen ist bekannt, daß sie funktionell bei der paroxysmalen nächtlichen Hämoglubinurie fehlen.
Ein 18-20 KDA Protein ist ebenso auf dem MAC-Niveau beteiligt. Von den folgenden wird angenommen, daß sie identisch sind (aber dies möglicherweise nicht sind):
P-18 (Sugita et al. (J. Biochem 104 633 (1988)));
HRF-20 (Okada et al. (Intl. Immunol. 1 (1989)));
CO59 (Davies et al. (J. Exp. Med. (Sept.1989))); und
Membraninhibitor der reaktiven Lyse (MIRL) (Hologuin et al. J Clin. Invest 84 7 (1989))).
Der Beweis für die mutmaßliche Identität dieser Proteine ist, daß die Protein- und/oder cDNA-Sequenzen für DC59 und HRF-20 als identisch nachgewiesen wurden: wahrscheinlich sind sie auch dieselben wie bei P-18/MIRL. Es ist zu beachten, daß eine gewisse Homologie der CD59/HRF.20-Sequenz mit jener des murinen LY-6 Antigens besteht, das an der T-Zell-Aktivierung beteiligt ist (Gronx et al.(J. Immunol. 142 3013 (1989))).
Sp.40-40 ist auch an der MAC-Regulierung beteiligt (Kivszbaum et al., EMBO 8, 711 (1989)).
Es wird bevorzugt, daß die HCRF in die Komplementaktivierung in der C3-Stufe eingreifen. Sowohl MCP als auch DAF blockieren die positive Rückkopplungsschleife in dem alternativen Weg der C3-Aktivierung und diese stellen bevorzugte HCRF dar.
Der HCRF wird in Verbindung mit dem transplantierten Gewebe bereitgestellt. Dies bedeutet, daß der HCRF derart verabreicht wird, daß das Transplantatsgewebe als eigen gekennzeichnet ist, aber anderes Fremdmaterial, wie eindringende Bakterien, bezeichnenderweise nicht so gekennzeichnet sind. Es könnte möglich sein, einen oder mehr geeignete HCRFs einfach parenteral, aber für das Transplantatgewebe lokal zu verabreichen. In der Praxis jedoch kann dies wegen der Schwierigkeit, eine richtige Lekalisierung des HCRF beim Transplantatgewebe herbeizuführen, und wegen der weiteren Schwierigkeit, daß der HCRF auch wiederholt an den Empfänger verabreicht werden muß, nachdem die Transplantation erfolgt ist, nicht bevorzugt sein; dies kann jedoch durch die Verwendung von speziellen pharmazeutischen Abgabesystemen überwunden werden.
Es ist im allgemeinen viel praktischer, den HCRF derart bereitzustellen, daß er in die Zellmembran des Spendergewebes integriert ist. Obwohl es einige gutartige Infektionen des transplantierten Gewebes geben könnte, die eine geeignete Expression verursachen, ist der bei weitem bevorzugteste Weg, diesen Zweck damit zu erreichen, daß das Spendergewebe dahingehend transgen ist, daß es Nucleinsäure enthält und exprimiert, die für einen oder mehr HCRFs kodiert, die in der Empfängergattung aktiv sind, wenn sie in den Empfänger transplantiert werden. Ein derartiges transgenes Gewebe kann damit fortfahren, einen HCRF unbegrenzt zu exprimieren. Der HCRF kann genetisch von der Empfängergattung oder weniger bevorzugt von einer eng verwandten Gattung abgeleitet werden, bei welcher konkordante Xenotransplantate möglich sein können.
Obwohl das transgene Spendergewebe im Prinzip von einer Zellkultur stammen kann, wird bevorzugt, daß das Spendergewebe von einem transgenen Tier stammt. Das transgene Tier sollte den HCRF vorzugsweise in mindestens dem zu transpiantierenden Gewebe exprimieren (oder exprimieren können). Aber selbst das ist nicht wesentlich, da es möglich sein kann, den HCRF durch ein Bindemittel (wie einen hybriden monoklonalen Antikörper (Milstein & Cuello Nature 305 537 (1983)) oder einen Rezeptor an die Zellmembrane des Spendergewebes zu binden.
Die Empfängergattung ist vorwiegend der Mensch, aber nicht ausschließlich. Andere Primaten können geeignete Empfänger sein, wie auch andere Gattungen, wenn Wirtschaftlichkeit und Ethik dies zulassen.
Die Spendergattung kann jede geeignete Gattung sein, die sich von der Empfängergattung unterscheidet und die, unter Berücksichtigung der Physiologie der Empfängergattung, imstande ist, ein geeignetes Gewebe für die Transplantation zu liefern. Bei menschlichen Empfängern wird angenommen, daß Schweinespender geeignet sind, aber andere Gattungen können geeignet sein.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird die Verwendung einer tierischen Zelle oder eines Gewebes geschaffen, das von einer Spendergattung abgeleitet ist, und von einem oder mehreren homologen Komplementrestriktionsfaktoren (HCRF), die in einer Empfängergattung verwendet werden können, um die vollständige Aktivierung des Komplements zu verhindern; wobei die Spendergattung in bezug auf die Empfängergattung eine nicht übereinstimmende Gattung ist; bei der Herstellung eines Gewebes, das in die Empfängergattung ohne hyperakute Abstoßung verpflanzbar ist.
Ein transgenes Tier kann erzeugt werden, das transplantierbares Gewebe besitzt, das, wenn es in mindestens eine nicht übereinstimmende Gattung transplantiert oder deren Immunsystem ausgesetzt wird, zu keiner Xenotransplantatabstoßung führt. Eine nicht übereinstimmende Gattung ist jene, die für gewöhnlich ein Xenotransplantat von dem Tier hyperakut abstoßen würde.
Das transgene Tier kann Zellen aufweisen, die zur Expression eines homologen Komplementrestriktionsfaktors einer anderen Gattung imstande sind. Der homologe Komplementrestriktionsfaktor ist im allgemeinen in einer Gattung aktiv, die in bezug auf die Gattung des transgenen Tiers diskordant ist. Die Zellen können aus einem bestimmten Gewebe sein, wobei die Präferenzen wie mit Bezugnahme auf den ersten Aspekt der Erfindung beschrieben wurde, sind, oder aus mehr als einem oder allen Geweben, in welchem Fall das Tier ein Spender von mehr als einem Gewebe wird. Ein solches transgenes Tier kann als eine Sammlung nicht transformierter (im Sinne von nicht proliferativen) Zellen angesehen werden.
Eine nicht transformierte, tierische Zelle kann erzeugt werden, die imstande ist, einen oder mehr homologe Komplementrestriktionsfaktoren zu erzeugen, die in einer Gattung aktiv sind, die in bezug auf die tierische Zelle diskordant ist.
Rekombinante DNA kann erzeugt werden, die DNA, welche für mindestens einen homologen Komplementrestriktionsfaktor kodiert und eine oder mehr Sequenzen umfaßt, so daß die kodierende DNA von einer nicht transformierten, tierischen Zelle exprimiert werden kann. Die tierische Zelle kann eine Zelle eines transgenen Tiers sein, das genetisch das Konstrukt enthält. Als Alternative kann die Zelle ein kultiviertes Organ oder anderes Gewebe wie eine Langerhans-Insel sein.
Es kann ein genetisches Konstrukt erzeugt werden, das zur Eingliederung in das genetische Material eines Tieres geeignet ist, um ein transgenes Tier zu erzeugen, wobei das Konstrukt DNA, die für zumindest einen homologen Komplementrestriktionsfaktor kodiert, und eine oder mehr Sequenzen enthält, so daß die kodierende DNA in zumindest einigen Zellen eines transgenen Tieres exprimiert werden kann, in welchen das Konstrukt genetisch eingegliedert wird. Ein derartiges genetisches Konstrukt kann die Form eines Minichromosoms aufweisen, das als YAC bekannt ist. Wie zuvor ist der homologe Komplementrestriktionsfaktor im allgemeinen in einer Gattung aktiv, die in bezug auf die Gattung des transgenen Tiers diskordant ist.
Ein transgenes Tier kann durch ein Verfahren erzeugt werden, das die Eingliederung von DNA in ein genetisches Material eines Tieres umfaßt, die zumindest für einen homologen Komplementrestriktionsfaktor kodiert, sowie einer oder mehrerer Sequenzen, so daß die kodierende DNA in zumindest einigen Zellen des transgenen Tieres exprimiert werden kann.
Verfahren zur Erzeugung transgener Tiere werden immer stärker verbreitet und die genauen Schritte, die ausgeführt werden müssen, können die für gewöhnlich in der Technik verwendeten sein. Zum Beispiel offenbart WO-A-8800239 die im Prinzip erforderlichen Schritte, um ein transgenes Tier zu erhalten.
Das eigentliche Verfahren der Eingliederung des Konstrukts in die Zellen des transgenen Tieres kann durch Mikroinjektion, spermavermittelte Eingliederung oder jedes andere geeignete Verfahren erfolgen. Die vorbereitende genetische Manipulation kann in einem Prokaryoten ausgeführt werden, wie allgemein bevorzugt ist.
DNA, die für HCRFs kodiert, ist entweder in der cDNA-Form verfügbar oder kann unter Verwendung herkömmlicher Klonierungstechniken abgeleitet werden. Die DNA, die für den Zerfallsbeschleunigungsfaktor (DAF) kodiert, ist wahrscheinlich am besten charakterisiert und wurde von Medof et al. (PNAS 84 2007-2011 (1987)) beschrieben. Eine physische Karte des RNA-Genclusters findet man in Rey-Campos et al. (1988) (loc. cit.). Varianten von DAF und deren Herstellung durch rekombinante DNA-Technologie sind in EP-A-0244267 offenbart; solche Varianten können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Wegen der besseren Charakterisierung der Genetik von DAF und der bekannten Sequenz der cDNA, die für DAF kodiert, stellt DAF einen bevorzugten homologen Komplementrestriktionsfaktor dar.
Bevorzugte Merkmale der vorliegenden Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen enthalten.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. In den Beispielen wird auf die Zeichnungen Bezug genommen, in welchen:
Figur 1A bis 1E aufeinanderfolgende EKG-Kurven für das Herz eines Kaninchens zeigen, das in neugeborene Schweine gemäß Beispiel 1 transplantiert wurde;
Figur 2 das Ergebnis eines Radioimmuntests zeigt, das darauf hinweist, daß die in Beispiel 1 verwendeten Schweine keine wesentlichen Mengen von Antispezies-Antikörper hatten;
Figur 3 bestimmte Stufen der Proteinelektrophorese zeigt, wie in Beispiel 4 verwendet wird;
Figur 4 bestimmte Stufen der zweidimensionalen Kreuzelektrophorese zeigt, wie in Beispiel 4 verwendet wird;
Figur 5 die "2D-Rockets" zeigt, die sich aus Beispiel 4 ergeben;
Figur 6 das Ergebnis eines Chromfreisetzungszellysetests von Beispiel 5 zeigt;
Figur 7 Titer von lytischen Anti-Hamster-Antikörpern von einer Empfängerratte eines Herztransplantats vom Hamster vor der Transplantation (Tag 0) und am Tag 5, 7 und 9 nach der Transplantation, wie in Beispiel 6 beschrieben zeigt;
Figur 8 graphisch die OD von G200 Fraktionen zeigt; das Histogramm zeigt Titer in jeder Fraktion von lytischen Anti-Hamster-Antikörpern von einer Empfängerratte eines Hamsterherzens, wie in Beispiel 6 beschrieben;
Figur 9 einen Southern-Blot von DNA zeigt, die von T5-, b10- und DB3-Zellinien extrahiert wurde, wie in Beispiel 7 beschrieben;
Figur 10 &sup5;¹Cr-Freisetzungszahlen zeigt, die darauf hinweisen, daß die menschliche T5-Zellinie vom Komplement des Kaninchens aber nicht vom menschlichen Komplement in Gegenwart von Anti-Mensch-Antikörpern des Schweins aufgelöst wird, wie in Beispiel 7 beschrieben;
Figur 11 Freisetzungszahlen zeigt, die auf ein Versagen von menschlichen Antikörpern hinweist, die menschliche T5-Zellinie entweder mit menschlichem oder Kaninchen-Komplement aufzulösen, wie in Beispiel 7 beschrieben;
Figur 12 &sup5;¹Cr-Freisetzungszahlen zeigt, die darauf hinweisen, daß menschliche Antikorper ein Maus-Maus-Hybridom (DB3) in Gegenwart sowohl des Kaninchen-Komplements als auch des menschliche Komplements auflösen können, wie in Beispiel 7 beschrieben;
Figur 13 die &sup5;¹Cr-Freisetzung zeigt, die veranschaulicht, daß die Mensch-Maus-Hybridzellinie B10 von menschlichen Antikörpern in Gegenwart von Kaninchen-Komplement aufgelöst wird, aber von menschlichen Antikörpern in Gegenwart von menschlichem Komplement nicht aufgelöst wird, wie in Beispiel 7 beschrieben;
Figur 14 die Aufnahme von ³H-Adenin (in Zahlungen pro Minute) durch CHO-Zellen zeigt, was zeigt, daß diese Zellen durch immunes Rattenserum in Gegenwart von menschlichem Komplement oder Kaninchen-Komplement getötet werden, wie in Beispiel 8 beschrieben;
Figur 15 die Aufnahme von ³H-Adenin in Zahlungen pro Minute durch CHO-Zellen zeigt, die mit menschlichem MCP transfektiert sind, was zeigt, daß diese Zellen durch immunes Rattenserum in Gegenwart von Kaninchen-Komplement getötet werden, aber durch dieses immune Rattenserum in Gegenwart von menschlichem Komplement nicht getötet werden, wie in Beispiel 8 beschrieben;
Figur 16 "2D-Rockets" zeigt, die zeigen, daß unter den mit Bezug auf Figur 15 beschriebenen Umstanden die C3-Komponente des menschlichen Komplements nicht zur Bildung von C3b gespalten wird, wie in Beispiel 8 beschrieben;
Figur 17 &sup5;¹Cr zeigt, die darauf hinweisen, daß 3T3 Maus-Fibroblasten durch natürlich vorkommende Antikörper in Gegenwart von menschlichem Komplement aufgelöst werden, und welche die schützende Wirkung der Expression von menschlichem MCP durch die Mauszellen zeigen; und
Figur 18 eine Slot-Blot Analyse von DNA der zweiten Generation transgener Mäuse unter Verwendung von markierter MCP cDNA (oben) oder markierter DAF cDNA als Sonde zeigt.

BEISPIEL 1

Xenotransplantatabstoßung findet in Abwesenheit von Antispezies-Antikörpern statt

Im allgemeinen können Tiere nicht überleben, ohne Immunglobuline zu zirkulieren Diese werden von Lymphozyten als Antwort auf antigene Reize erzeugt. Im frühen neonatalen Leben dient jedoch passiv übertragenes mütterliches Immunglobulin als vorübergehender Ersatz für diesen selbstproduzierten Antikörper. Dieses passiv übertragene Immunglobulin bietet dem Jungen Schutz, während frühe Immunerfahrung gesammelt wird. Bei Säugetieren erfolgt diese passive Übertragung des mütterlichen Immunglobulins sowohl über die Plazenta als auch über die Vormilch. Bei einigen wenigen Gattungen jedoch ist die Struktur der Plazenta derart, daß kein mütterlicher Antikörper über diesen Weg übertragen werden kann. Das Schwein ist eine solche Gattung. Jeder mütterliche Antikörper wird aus der Vormilch erhalten. Daher sind neugeborene, noch nicht gesäugte Schweine im Prinzip frei von Immunglobulin.
Große weiße Schweine wurden nach der Geburt in einen Holzkäfig gebracht, mit Warmwasserflaschen gewärmt, ohne daß sie saugen konnten. Für jedes Experiment wurden zwei Schweine von jedem Wurf genommen. Diese Tiere wogen zum Zeitpunkt der Geburt etwa 1 kg.
Neugeborene weiße Neuseeland-Kaninchen, die etwa 300 g wogen, wurden als Spender verwendet. Diese Spender wurden mit Hypnol und Diazepam anästhesiert, die Brust wurde geöffnet und in eine Vena cava mit einer 19-Gauge Nadel eine Kanüle eingeführt. Kalte (+4ºC) Kardioplegie Thomas Nr. 2) wurde infundiert, bis das Herz aufhörte zu schlagen und mit Kardioplegie perfundiert war. Die Kühlung erfolgte auch von außen mit kalter Kardioplegie direkt von einer Spritze. Das Herz des Kaninchens wurde dann unter Anwendung chirurgischer Standardtechniken entfernt und in einer Kardioplegielösung bei +4ºC bis zur Verwendung gelagert. Es erwies sich als notwendig, diese Vorsichtsmaßnahmen zu ergreifen, da sich das Herz des Kaninchens als äußerst anfällig für einen ischämischen Schaden erwies.
Die Empfängerschweine wurden zunächst durch Inhalation von Halothan/02 anästhesiert. Eine intravenöse Flügelkanüle (Gauge 23) wurde dann in eine Milchvene eingesetzt und die Anästhesie durch intravenöses Ketamin aufrechterhalten. Das Schwein wurde gleichzeitig mit intravenöser Kochsalzlösung hydriert gehalten. Vor der Transplantation wurden Serum- und EDTA-Blutproben entnommen.
Das Kaninchenherz wurde in den Hals der Schweine nach der Methode von Heron (Acta Pathol. Microbiol. Scand 79 366-372 (1971)) transplantiert. Bei der Aorta wurde eine End-zu-Seit-Anastomose (6-0 Prolin) an die Halsschlagader vorgenommen und bei der Lungenschlagader eine Anastomose an die Jugularvene. Alle anderen Herzgefäße wurden abgebunden. Die Herzen begannen innerhalb weniger Minuten nach Entfernung der Klammern zu schlagen. Die Herzfrequenz wurde ständig über einen Diaskop/EKG-Monitor aufgezeichnet. Der Schweinehals wurde während der Versuche nicht geschlossen, die Herzen wurden feucht gehalten, indem sie mit einem Haftfilm bedeckt wurden.
Die EKG-Ergebnisse sind in den Figuren 1A bis 1E dargestellt. Die in Figur 1A dargestellte Kurve zeigt einen normalen Herzschlag unmittelbar nach der Transplantation. Ein Versagen beginnt etwa zwanzig Minuten später (Figur 1B) und innerhalb einer Stunde Figur 1D gibt es keinen nachweisbaren Herzschlag, was ein Beweis für eine hyperakute Abstoßung ist.
Dieses Beispiel zeigt daher, daß die hyperakute Abstoßung eines diskordanten Xenotransplantats selbst bei fehlenden Antikörpern stattfindet.

BEISPIEL 2

Die in Beispiel 1 verwendeten neugeborenen Schweine haben keine Antispezies-Antikörper

Anti-Schwein-IgG des Kaninchens wurde nach der Methode von Greenwood et al., Biochemical Journal 89 114-123 (1963), modifiziert von Davies und Howard (nicht veröffenflicht), radiojodiert.
Folgendes wird in ein Polystyrolröhrchen (LP2 6 cm × 1 cm) in rascher Folge eingebracht:
25-50 µl Protein (bei einer Konzentration von 1 mg/ml)
3-4 µl Na¹²&sup5;I (100 mCi/ml)
10 µl Chloramin-T (*4 mg/5 ml; 0,5 M)
Natriumphosphatpuffer (pH 7,5)
* muß vor der Verwendung frisch zubereitet werden.
Diese Komponenten wurden unter fortgesetztem Rühren 30 Sekunden vermischt. Dann wurde folgendes rasch zugegeben:
50 µl DL-Tyrosin (gesättigte Lösung in 0,5 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,5)
300 µl 2% BSA/PBS/Azid
Das markierte Protein wird danri von dem nicht reagierten Jod unter Verwendung einer kleinen Säule von 8 cm × 1,0 cm mittelgradigem Sephadex G-25, zubereitet in PBS/Azid, getrennt. Die Jodierungsreaktionsmischung wird quantitativ zu der vorbereiteten G25-Säule geleitet und mit PBS/Azid eluiert. Sechs Tropffraktionen werden in Polystyrolröhrchen (LP2) gesammelt. Die Säule wird eluiert, bis sowohl die Protein- als auch die (¹²&sup5;I)-Jodpeks eluiert sind, und die Radioaktivität wird in allen Fraktionen gemessen.
Die in dem Protein enthaltene Radioaktivität kann somit berechnet werden:
Radioaktive Zählungen im Protein = ursprüngliche Gesamtzählungen - Zählungen in Jodpeaks
Das radiomarkierte IgG (das nun als "Isotop" bezeichnet wird) wird dann in einem Test auf (Schweine) Antikörper beim neugeborenen Schwein wie folgt verwendet:

Materialien

PBS + 0,01% Azid - Oxoid
PBS/BSA 1 % - BSA-Sigma
Isotop - Kaninchen Anti-Schwein-IgG, ganzes Molekül mit 12-18 × 10³ Zahlungen/min.
Hitzeinaktivierte Seren (56ºC, 30 min)
Antikoagulierte Blutproben.

Methode

1. Es wurde eine 1 % Suspension von Erythrozyten des Kaninchens in PBS hergestellt und 100 µl Mengen den Röhrchen zugegeben. Die Zellen wurden zu einem Knopf gesponnen und der Überstand verworfen.
2. Reihenverdünnungen inaktivierter Seren wurden in PBS/BSA vom erwachsenen Schwein (positive Kontrolle), neugeborenen Schwein (Testprobe) oder Kaninchen (negative Kontrolle) hergestellt. 0,025 ml Mengen wurden den Erythrozyten-Knöpfen in zweifacher Ausführung zugegeben. Die Röhrchen wurden bei 4ºC 4 Stunden inkubiert.
3. Nach der Inkubation wurden die Röhrchen dreimal in PBS/BSA gewaschen, 0,05 ml Isotop wurden dann jedem Röhrchen zugegeben und über Nacht bei 4ºC inkubiert.
4. Die Röhrchen wurden dreimal wieder gewaschen, und 1 min Zahlungen wurden auf einem Gammazähler durchgeführt.
5. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Zahlungen/min gegenüber dem Titer dargestellt.
Die Ergebnisse sind in Figur 2 dargestellt. Das Kaninchenserum wurde als negative Kontrolle verwendet und das Serum des erwachsenen (das heißt, gesäugten) Schweins wurde als positive Kontrolle verwendet. Es ist ersichtlich, daß der Wert des Schweine-Antikörpers in dem noch nicht gesäugten Schwein 2 mit jenem der negativen Kontrolle vergleichbar ist.

BEISPIEL 3

Darstellung der Relevanz des Komplements C3 für die Zerstörung des Xenotransplantats

Meerschweinchen mit Komplementmangel, die von dem Stamm erhalten wurden, der von Burger et al. (Eur. J. Immunol. 16 7-11 (1986)) beschrieben ist, wurden unter Anwendung von im wesentlichen derselben Technik wie bei den Kaninchen-Schwein-Xenotransplantation in Beispiel 1 beschrieben, Herzen transplantiert. Ratten wurden durch Etherinhalation anästhesiert und Herzen mit Kardioplegie gekühlt und wie zuvor beschrieben exzidiert.
Meerschweinchenspender wurden mit intravenösem Valium und intramuskulärem Hypnol anästhesiert. Die Herzen wurden wie zuvor beschrieben in den Hals implantiert. Bei Kontroll-Meerschweinchen, das heißt, jenen mit normalen Komplementwerten, fand eine Transplantatabstoßung normalerweise innerhalb weniger Minuten statt, wodurch es nicht notwendig war, den Hals zu schließen. Bei Versuchstieren wurde der Hals geschlossen und die Herzen durch zweimal tägliches Palpieren überwacht. Einige Stunden nach dem chirurgischen Eingriff wurden normale EKGs beobachtet, was auf keine hyperakute Abstoßung hinweist.

BEISPIEL 4

A. Schweinelymphozyten und Nierenzellen aktivieren menschliches Komplement über den alternativen Weg

Nach der Technik von Grabar und Williams (Biochim. Biophys. Acta 10 193 (1953)) wurden Agarosegele 1 auf 8 × 8 cm Glasplatten gegossen (Figur 3). 10 ml Gelmischung war erforderlich, und diese bestand aus 5 ml 2% Agarose und 5 ml Veronalpuffer (VB). (VB ist 75 mM Na-Barbital, 10 mM EDTA, 10 mM NaN&sub3;, pH 8,5). Die Agarose und VB wurden bei 60ºC unmittelbar vor der Verwendung vermischt. Die Gele wurden auf eine ebene Plattform gegossen und abgekühlt. Nach dem Härten bestand das Gel aus 1 % Agarose und wies eine Tiefe von etwa 1,5 mm auf.
Vertiefungen 3 mit einem Durchmesser von 3 mm wurden im Abstand von etwa 1 cm zu einem Rand des Gels geschnitten. Jede Vertiefung konnte etwa 8 µl der Probe aufnehmen, die wandern gelassen werden sollte. Die Probe wurde nicht besonders vorbereitet, außer daß ausreichend Bromphenol-Blau zur Färbung zugegeben wurde. Nach dem Auftragen der Probe wurde das Gel sorgfältig auf die Plattform des Elektrophoresebehälters gebracht. In VB (dem Trennpuffer) getränkte Baumwolltampons wurden sanft gegen den Rand des Geis in der Nähe der Vertiefungen gepreßt, und ein weiterer Tampon wurde gegen den gegenüberliegenden Rand der Agarose gepreßt. (Es ist wichtig sicherzustellen, daß die Enden der Tampons in die Pufferbehälter eintauchen). Dann wurde ein Strom von 25-30 mA durch das Gel geleitet, bis das Albumin (das mit gebundenem Bromphenol sichtbar gemacht wurde) den positiven (Anoden-) Tampon erreichte. Das Verfahren dauert etwa 2,5 bis 3 Stunden. Wenn zwei oder mehr Gele gleichzeitig und parallel wandern gelassen werden, muß der angelegte Strom entsprechend erhöht werden, so daß zwei Gele 50 mA erfordern und drei Gele 75 mA und so weiter.
Nach Beendigung der Elektrophorese, die durch die Wanderung eines Eiweißmarkers 9 angezeigt wird, der mit Bromphenol-Blau sichtbar gemacht wurde, wurde das Gel aus dem Elektrophoresebehälter entfernt.

B. 2-Dimensionale Kreuzimmunelektrophorese (2-D Rockets)

Streifen 11 (Fig. 4), welche die elektrophoretisch getrennten Proteine von (A) enthielten, wurden geschnitten und an ein Ende einer neuen Glasplatte 13 gelegt. Eine 1:1 Mischung 15 aus 2% Agarose:VB, die etwa 1% Antiserum zu dem Protein, das sichtbar gemacht werden sollte, enthielt, wurde dann auf die Platte gegossen und härten gelassen. Das Antiserum wurde der Agarose/VBS-Mischung zugegeben, als diese auf eine Temperatur von etwa 50ºC abgekühlt war.
Die Rocketplatte wurde dann wie oben beschrieben einer Elektrophorese unterzogen, wobei das Ende des Gels, das die Streifen der 1. Dimension enthielt, über ein Baumwolltampon mit einer negativen Elektrode (Kathode) 17 verbunden war und das gegenüberliegende Ende mit einer Anode 19 verbunden war. Die Gele wurden über Nacht bei einem Strom, der von der Größe der Gele abhing, einer Elektrophorese unterzogen; 10 mA sind für jede Länge von 8 cm des Geis erforderlich, so daß ein Gel mit 16 cm Länge 20 mA Strom erfordert und so weiter.
Die Proteine werden durch die Elektrophorese in die erste Dimension getrennt und durch Elektrophorese in der zweiten Dimension quantifiziert und sichtbar gemacht, wobei die Färbung zur Sichtbarmachung nun beschrieben wird.

C. Pressen und Färben von Gelen

Dieses Verfahren ist sowohl für die herkömmliche Immunelektrophorese als auch für Rockets gleich. Das Gel, das gefärbt werden soll, wurde mit 1 Lege faserfreiem POSTLIP- (Schutzmarke) Papier (Adlard Evans & Co) bedeckt, das mit Wasser vorgefeuchtet war. Dieses wurde dann mit 6 Legen saugfähigen Papiertüchern bedeckt. Die Anordnung wurde 1 Stunde gepreßt, wonach das gesamte Papier entfernt und das Verfahren wiederholt wurde.
Nach dem zweiten Pressen wurde das Gel unter einem Warmluftstrom getrocknet und dann mindestens 1 Stunde in PBS eingeweicht, um das nicht ausgefällte Protein zu entfernen. Das Gel wurde dann wieder getrocknet und 10 Minuten in einer Lösung von 0,5% Gew/Vol Coomasie-Brillantblau G250, 45% H&sub2;O, 45% Methanol, 10% Essigsäure gefärbt.
Das Gel wurde durch kontinuierliches Waschen in 20% Methanol, 6% Essigsäure entfärbt, bis der Hintergrund klar war. Dann wurde es abschließend unter Warmluft getrocknet.
Figur 5 ist eine Reproduktion des trockenen Gels. Rocket 1 ist eine negative Kontrolle, die 50 µl normales Humanserum (HHS) plus 25 µl VBS einschließlich 10 mM EGTA enthält. EGTA ist ein Chelatbildner, der Kalzium entfernt; Kalzium ist für den klassischen Weg der Komplementaktivierung wesentlich, und daher garantiert das Vorhandensein von EGTA, daß Komplement nur über den alternativen Weg aktiviert werden kann. Der linke (größere) Peak ist C3 und der rechte (kleinere) Peak ist C3bi, ein Zerfallsprodukt von aktiviertem C3. In der Kontrolle zeigt daher die geringe Menge an C3bi nur ein geringes Maß an Komplementaktivierung an.
In Rocket 2 wurden 75% Schweine-Erythrozyten (Vol/Vol) der Puffermischung zugegeben. Es gibt einen leichten, aber wahrscheinlich nicht signifikanten Anstieg im C3bi-Wert, was anzeigt, daß Schweine-Erythrozyten nur geringfügig, wenn überhaupt, menschliches Komplement über den alternativen Weg aktivieren. Der Grund für diese schwache Reaktion ist nicht klar.
In Rocket 3 und 4 wurden 75% Schweine-Lymphozyten (Vol/Vol) bzw. 75% Schweine-Nierenzellen (Vol/Vol) der Puffermischung zugefügt. In jedem Fall kam es zu einem deutlichen Anstieg im C3bi-Wert, was auf die Aktivierung von menschlichem Komplement durch die Schweine-Lymphozyten hinweist.

BEISPIEL 5

Schweine-Lymphozyten werden von menschlichen Antikörpern in Gegenwart von Schweine-Komplement nicht aufgelöst. aber werden in Gegenwart von Kaninchen- oder menschlichem Komplement aufgelöst

Ein Chromfreisetzungstest wurde verwendet, um die Zellyse zu zeigen, die durch Humanserum in Gegenwart von entweder Schweine-Komplement, Komplement von neugeborenem Kaninchen oder menschlichem Komplement vermittelt wird.

Materialien

Lymphozytentrennmedium - Flowlabs
RPMI 1640 + 10% inakt. FCS
PBS (ohne Azid) - Oxoid
Platten mit V-Vertiefungen - Sterilin
Neugeborenes Kaninchen Komp lymph - Sera - Lab - oder menschliches oder Schweine-Komplement (verdünnt 1+7 in RPM1)
Hitzeinaktivierte Seren (56ºC, 30 min)

Methode

1. Defibriniertes Schweine-Vollblut, 1:1 in PBS verdünnt, wurde auf ein gleiches Volumen von Ficoll Hypaque-Lymphozytentrennmedium geschichtet. Die Röhrchen wurden bei 1200 g 20 min bei 20ºC geschleudert.
2. Die erhaltenen Schweine-Lymphozyten an der Grenzfläche wurden entfernt und einmal in PBS gewaschen. Der Knopf wurde in RPM1 1640 resuspendiert und die Zellanzahl auf 2 × 10&sup7;/ml eingestellt.
3. 200 µCi &sup5;¹Cr wurden einem 2 × 10&sup7; Zellenpellet zugegeben und bei Raumtemperatur 1,5 Stunden inkubiert.
4. Markierte Zellen wurden zweimal bei 900 g in 5 minütigen Anwendungen gewaschen und so eingestellt, daß eine endgültige Zellanzahl von 1 × 10&sup6;/ml in RPM1 erhalten wurde.
5. 0,05 ml Mengen inaktivierter Seren unter Test als Serienverdünnungen in zweifacher Ausführung, wurden gemeinsam mit Kontrollen ausgestrichen. Den jeweiligen Vertiefungen wurde verdünntes Komplement in 0,05 ml Mengen und anschließend 0,05 ml markierte Zellen zugegeben. Die Platten werden 1 Stunde bei 30ºC in einem CO&sub2;-Ofen inkubiert.
6. Nach der Inkubation wurden die Platten 15 min bei 900g, 20ºC geschleudert, um die Zellen auszufallen. 100 µl Überstand wird in markierte Röhrchen entfernt und 1 Minuten-Zahlungen werden auf einem Gammazähler ausgeführt.
7. Die Ergebnisse werden als % der Zählung der ursprünglich markierten Zellen gegenüber dem Titer aufgetragen.

Kontrollen

Volle Freisetzungskontrolle (FRC) - 50 µl Zellen + 100 µl H&sub2;O + 0,1 % + Tween
Negative Kontrolle - 50 µl Zellen + 100 µl RPM1
Komplementkontrolle (CC) - 50 µl Zellen + 50 µl verdünntes Komp. + 50 µl RPM1

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in Figur 6 dargestellt. Es ist ersichtlich, daß Schweine-Lymphocyten von Humanserum nur in Gegenwart von nicht-Schwein(d.h., Kaninchen- oder menschlichem) Komplement, aber nicht in Gegenwart von Schweine-Komplement aufgelöst werden. Die Beeinflussung ist, daß ein oder mehrere homologe Komplementrestriktionsfaktoren, die auf den Schweinezellen vorhanden sind, die Wirkung des Schweinekomplements erfolgreich nach unten regulieren, aber nicht die Wirkung von menschlichem oder Kaninchen-Komplement.

BEISPIEL 6

Der Zweck dieses Beispiels ist zu zeigen, daß Antikörper eine hyperakute Abstoßung verursachen kann. Das Konzept, auf dem diese Anmeldung beruht, ist das Ergebnis der Beobachtung, daß eine hyperakute Abstoßung in Abwesenheit von Anti-Transplantats-Antikörpern stattfinden kann, aber ein funktionelles Komplement erfordert. Da dies eine neue Beobachtung ist, gibt es keine Experimente in der Literatur, die formal zeigen, daß Antikörper eine Xenotransplantatabstoßung verursachen kann. Da es in Gegenwart von natürlich auftretendem Antikörper schwierig ist zu bestimmen, ob diese Antikörper eine Rolle spielen oder nicht, ist ein derartiges Experiment nicht leicht durchzuführen. In diesem Beispiel wurde die Rolle des Antikörpers nachgewiesen, indem ein konkordantes Xenotransplantat in ein diskordantes Xenotransplantat durch Infusion von Antikörper mit geeigneter Spezifität umgewandelt wurde. Die Empfanger, die in dieser Studie verwendet wurden, waren männliche Ratten des PVG-Stammes (RT1C) (Banting & Kingdom, Bicester, Oxon., UK) zwischen 3 und 6 Monate alt mit einem Gewicht von 250-300 g. Die Herzspender waren Syrische Hamster, die ebenso von Banting & Kingdom erhalten wurden und zwischen 100 und 150 g wogen. Die Herztransplantation wurde nach der Methode von Heron (loc. cit. in Beispiel 1) durchgeführt. Hamsterherzen wurden in den Hals der Ratten transplantiert, wobei die Aorta mit der Halsschlagader und die Lungenschlagader mit der Jugularvene durch Manschettentechnik verbunden wurde. Alle anderen Gefäße wurden abgebunden. Die Herzen begannen Minuten nach der Entfernung der Gefäßklemmen zu schlagen und wurden durch äußeres Palpieren überwacht. Alle Operationen wurden an Tieren ausgeführt, die durch Inhalation von Halothan und Sauerstoff anästhesiert wurden.
Lytische Anti-Hamster-Antikörperspiegel wurden wie folgt gemessen: 50 µl 1 % Hamster-Erythrozytenlösung wurden 50 µl Testserum hinzugefügt, das serienverdünnt worden war. 50 µl einer 1 in 7 Verdünnung von neugeborenem Kaninchen-Komplement (Sera Lab, Crawley Down, Sussex) wurden hinzugefügt und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. 750 µl Komplementfixierungsverdünnungsmittel wurden hinzugefügt und zentrifugiert (Beckman MICROFUGE, 13000 rpm über 4 Minuten), wonach die OD&sub4;&sub1;&sub5; im Überstand gemessen wurde. (Der Begriff MICROFUGE ist eine Schutzmarke). Positive und negative Kontrollen waren CFD und destilliertes Wasser, das jeweils einer 1 % Zellösung hinzugefügt worden war. Die Ergebnisse der OD&sub4;&sub1;&sub5;-Ablesungen wurden gegenüber der Serumtitrierung auf der X-Achse eingetragen. Wie aus Figur 7 ersichtlich ist, führte die Transplantation eines Hamsterherzens in ein Ratte dazu, daß die Ratte sehr hohe Titer lytischer Anti-Hamster-Antikörper produzierte. Seren von einigen dieser Ratten wurden in ihre Komponentenproteinfraktionen durch Säulenchromatographie auf SEPHADEX G200 (Pharmacia GB Ltd., Lendon) unter Verwendung von Standard-Säulenchromatographietechniken getrennt ("The use of SEPHADEX in the separation, purification and characterisation of biological materials ", Curling in Exp. in Physiol. and Biochem. 3 (1970) 417-484 (G.A., Kerkut, Ed.) Academic Press, London und New York, 1970). ([)er Begriff SEPHADEX ist eine Schutzmarke). Jede der von der Säule gesammelten 7 ml Fraktionen wurde auflytische Anti-Hamster-Aktivität wie zuvor beschrieben getestet. Figur 8 zeigt, daß trotz der Tatsache, daß diese Antikörper als Ergebnis der Herztransplantation induziert wurden, die Antispezies-Aktivität fast ausschließlich in der IgM-Fraktion liegt. Nach dem Testen der Aktivität wurden die Fraktionen unter Verwendung von CX10-Ultrafiltern (Pharmacia) auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml konzentriert und bei -70ºC bis zur Verwendung gelagert.
Um ihre Fähigkeit, ein Xenotransplantat zu zerstören im Gegensatz zu einer ausschließlichen Auflösung der roten Blutkörperchen, wurden Hamsterherzen in die Hälse unbelasteter Ratten transplantiert. Sobald der Hamster-Herzschlag hergestellt war, wurden entweder 2 ml reines Serum oder 0,5 mg gereinigtes Immunglobulin, das lytische Anti-Hamster-Antikörper enthielt, intravenös in die Ratte infundiert. Sowohl das ungetrennte Serum als auch die 0,5 mg IgM verursachten durchwegs eine Zerstörung des Hamster-Herztransplantats innerhalb von 15 Minuten. Die Ergebnisse der Infusion von IgG stimmten bei einigen Zubereitungen nicht überein, wobei ein Versagen des Transplantats herbeigefiihrt wurde, während bei anderen das Transplantat weiter schlug. Als Albumin von der G200 Säule als Kontrolle infundiert wurde, überlebten die Herztransplantate immer und wurden in der für dieses Modell normalen Zeit abgestoßen, die 3 Tage beträgt. Dies zeigt, daß die Bindung dieses Antikörpers an ein Transplantat seine hyperakute Zerstörung herbeiführen kann.

BEISPIEL 7

Die bisher in dieser Anmeldung präsentierten Daten haben gezeigt, daß an der Zerstörung eines Xenotransplantats entweder die Komplementaktivierung über den alternativen Weg oder die antikörpervermittelte Komplementaktivierung (der klassische Weg) beteiligt sein können. Ferner können Komplementregulatoren an der Oberfläche des Xenotransplantatzielorgans dieses vor der Zerstörung durch homologes aber nicht heterologes Komplement schützen. Der kritische Aktivierungsschritt, der beiden Wegen der Komplementaktivierung gemein ist, ist die Spaltung der Komplementkomponente C3. Diese Spaltung wird durch die C3-Convertase, C4b2a (die C3-Convertase des klassischen Weges) oder die Convertase C3bBb (die C3-Convertase des alternativen Weges) herbeigeführt. Diese Enzyme spalten C3 in C3b, das seinerseits den alternativen Weg dafür verwenden kann, um mehr C3-Convertasen zu bilden (die Rückkopplungsschleife). Als Ergebnis kann das Komplementsystem rasch die Ablagerung von C3b auf einem "fremden" Zielorgang erhöhen. Ein Großteil des C3b tritt jedoch in keine erfolgreiche Wechselwirkung mit dem fremden Zielorgan und bleibt in der Fluidphase und kann daher unterschiedslos an die Zellen des Wirts binden. Um diese Zellen vor dem Angriff durch die unterschiedslose Bindung von Komplement zu schützen, haben sich Kontrollproteine zur Inaktivierung der Komplementkomponenten entweder in der Fluidphase oder an eigenes Gewebe gebunden entwickelt. Diese Glycoproteine, die an der Kontrolle von C3 beteiligt sind, sind alle genetisch mit einer Region des menschlichen Chromosoms 1 verbunden, der sogenannten RCA- (Regulatoren der Komplementaktivierung) Stelle. In diesem Beispiel zeigen wir, daß Mauszellen, die durch Fusionstechniken das menschliche Chromosom 1 erworben haben und Proteine der RCA-Stelle an ihrer Oberfläche exprimieren, sich in einem in vitro Test der Xenotransplantatzerstörung verhalten, als wären sie menschliche Zellen und nicht Mauszellen.

Zellinien

T5 ist eine Epstein Barr-Virus-transformierte Mandel-B-Zellinie, die nach der Technik von Bird et al. (Nature 289 300-301(1981)) hergestellt wurde. B10 ist ein menschliches, monoklonalen Anti-Tetanus-Antikörper produzierendes Hybridom, das aus der Fusion der menschlichen B-Lymphoblastoidlinie (BLL) mit der Maus-Myelom-Zellinie X63-AG8.653 abgeleitet wurde (Kierney et al. (J. Immunol. 123 1548-1550 (1979)). T5 und B10 Zellinien sind von Ms. C. Carter und Dr. N. C. Hughes-Jones von der MRC MITI Group in Babraham, Cambridge, erhältlich. D83 ist eine Maus-Hybridomzellinie, die monoklonalen Anti-Progesteron-Antikörper produziert (Wright et al., Nature 295 415-417 (1982)). Die folgenden Oligonucleotidprimer, die für das menschliche Chromosom 1 spezifisch sind, wurden erworben: (5'-CCACAGGTGTAACATTGTGT-3') [SEQ ID Nr.: 1) und (5'-GAGATAGTGTGATCTGAGGC-3') [SEQ ID Nr.: 2]; diese sind stromaufwärtige bzw. stromabwärtige Primer des menschlichen Antithrombin 2(AT3) Gens, von dem bekannt ist, das es sich auf dem menschlichen Chromosom 1 befindet (Wu et al., Nucl. Acids Res. 17 6433 (1989)). Die Oligonucleotide können durch Techniken synthetisiert werden, die dem Fachmann gut bekannt sind.
Genomische DNA mit hohem Molekulargewicht wurde unter Anwendung der Methode von Herrman und Frischauf (Methods Enzymol. 152 180-183 (1987)) hergestellt. Kurz gesagt, 100× 10¹&sup6; Zellen von jeder kultivierten Zellinie wurden mit 5 ml TNE (100mM Tris, pH 7,5, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 1% Sarkosyl) aufgelöst und mit frischer Proteinase K behandelt (100 Mikrogramm pro ml). Die Zubereitung wurde mit Phenol (wassergesättigt und gegen 0,1 M Tris, pH 8, äquilibriert) , Phenolchloroform (1:1 Vol/Vol) und dann Chloroformisoamylalkohol (24:1(Vol/Vol) extrahiert. DNA wurde durch Ethanolausfällung erhalten und gegen TE (10mM Tris, pH 8,0, 1mM EDTA), das mit 100mM in NaCl hergestellt worden war, und dann nur gegen TE bei 4ºC dialysiert. Isolierte DNA wurde auf 0,5% Agarosegel analysiert und die Konzentration durch die optische Dichte bei 260 nm bestimmt. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) für jede Zellinie wurde nach der Beschreibung von Saiki et al. (Science 239 487-491 (1988)) ausgeführt. In ein Volumen von 100 µl, das 500 ng genomische DNA, 1,2 ng jedes Primers und 2,5 Einheiten Tag DNA-Polymerase Cfhermos aquaticus Typ 3) (Cambio Ltd, Cambridge, UK) enthielt, unter Verwendung des Puffers, der mit dem Enzym geliefert wurde. Die Nudeotide (dNTPs) (Bochringer Mannheim Diagnostics and Biochemicals Ltd, Lewis, East Sussex, UK) hatten jeweils eine Konzentration von 2 mM. DNA wurde in 30 Zyklen unter Verwendung eines programmierbaren Wärmereglers (Genetic Research Instrumentation Ltd, Dunmow, Essex, UK) amplifiziert: Denaturieren, 93ºC, 1 Minute: Schmelzen 55ºC, 1 Minute: und Extension 72ºC, 2 Minuten. 10 µl des Reaktionsprodukts wurden direkt auf einem 2% Agarosegel analysiert, das in einem Tris-Borsäure-EDTA-Puffer wanderte. Die Produktgröße wurde durch Vergleich mit HincII digerierter Phage X-174-rf-DNA (Pharmacia LKB Biotechnology, Upsala, Schweden) bestimmt.
Kultivierte T5-, B10- und DB3-Zellen wurden mit monoklonalem Anti-DAF- (Zerfallsbeschleunigungsfaktor) Antikörper (Kinoshita et al. (J. Exp. Med. 162 75-92 (1985)) und Fluorescein-konjugiertem zweiten Antikörper behandelt. Zellen (1×10&sup6;) wurden mit monoklonalem Maus-Anti-DAF-Antikörper 1A10 (IgG2a 10µg/ml in 100 µl 10% FCS 0,1% Azid) zur Reaktion gebracht. 1A10 ((Kinoshita et al. (J. Immunol. 136 3390-3395 (1986)) wurde von Dr. M. Davitz, New York University Medical Centre, New York, USA, erhalten. Leerkontrollen waren nur Puffer. Nach einer Inkubation über 2 Stunden auf Eis wurden die Zellen dreimal gewaschen, resuspendiert und eine Stunde auf Eis in 100 µl Puffer inkubiert, der 1 in 100 FITC-konjugiertes Ziegen (F(ab')2 Anti-Maus IG (schwere und leichte Ketten, affinitätsgereinigt und an menschliches IG-absorbiert) (Tago Immunochemicals Inc., Burlingame, Kalifornien, USA) enthielt. Einige Zellen wurden nur mit dem zweiten Antikörper als Färbungskontrollen inkubiert. Da DB3 eine IgG1-sezernierende Zellinie der Maus ist, wurden auch FITS-konjugiertes Schaf-Anti-Maus IgG2A (1 in 40, The Binding Site Ltd, Birmingham, UK) oder das Ziegen-Anti-Maus IG, das mit gleichen Volumina DB3-Zellen präabsorbiert war, verwendet, um das Auftreten von Anti-IgC1-Reaktivität beim Färben der D83-Zellen zu verhindern. Alle Zellen wurden gründlich gewaschen und in 200 µl Puffer resuspendiert. DAF-positive Zellen wurden unter Verwendung einer Beckton Dickinson FACS-STAR-Vorrichtung zur Fluoreszenz-aktivieren Zellsortierungs- (FACS-) Analyse nachgewiesen. ([)er Ausdruck FACS-STAR ist eine Schutzmarke).
Die PCR-Methode wurde zur Bestimmung der Gegenwart von menschlichem Chromosom 1 in drei verschiedenen kultivierten Zellinien verwendet, T5 (Mensch), B10 (Mensch-Maus) und D83 (Maus-Maus). Figur 9 zeigt, daß nach der Amplifikation sowohl T5 als auch B10 eine Bandgröße von 495 Basenpaaren aufwiesen, während D83 (d.h., das Maus-Maus-Hybrid) überhaupt keine Bande hatte. Es wurde berichtet, daß PCR-Produkte unter Verwendung von AT3-Primern, aus zwei Allelen bestehen, die eine Größe von 572 Basenpaaren (Allel 1) und 496 Basenpaaren (Allel 2) aufweisen (Wu et al., loc. cit.). Die Banden, die bei T5 und B10 genomischen DNAs gefunden wurden, entsprechen Allel 2. Dies zeigt, daß die Mensch-Maus-Hybrid-Zellinie B10 menschliches Chromosom 1 enthielt.
Die FACS-Analyse auf die Gegenwart von DAF zeigte, daß der Großteil der menschlichen T5-Zellen (85,7%) mit monoklonalem Anti-DAF-Antikörper positiv färbte. Ein ähnlicher Wert (83,1 %) positiver Zellen wurde bei den Maus/Mensch-Hybrid B10-Zellen gefunden. Die Maus-Maus-Hybrid DB3-Zellen zeigten identische Färbungsmuster, sowohl bei den mit Anti-DAF behandelten als auch bei den unbehandelten Zubereitungen. Diese Anti-Maus IgG1-Reaktivität wurde jedoch entfernt, wenn (1) FITC-konjugiertes Schaf-Anti-Maus IgG2 verwendet wurde, oder (2) das obengenannte Anti-Maus IgG mit DB3-Zellen präabsorbiert war. Die Ergebnisse zeigen, daß die Mensch-Maus-Hybrid Zellinie B10 menschlichen DAF auf der Zellmembranoberfläche exprimiert, wie durch spezifische monoklonale Anti-DAF-Antikörper nachgewiesen wurde. Der Expressionswert ist derselbe wie bei der menschlichen Zellinie T5. Eine Maus-Maus-Hybridom-Zellinie exprimiert menschlichen DAF nicht.
An diesen Zellinien wurden Chromfreisetzungs-, zytotoxische Zelltötungsstudien durchgeführt, wie im vorangehenden Beispiel 5 beschrieben wurde. Figur 10 zeigt, daß wenn Schwein-Anti-Mensch-Antikörper mit der menschlichen T5-Zellinie inkubiert werden, die Zugabe von Kaninchen-Komplement eine Lyse herbeiführte, wogegen keine Lyse eintritt, wenn menschliches Komplement zugegeben wird, da die T5-Zellinie natürlich menschliche HCRFs besitzt. Dies bestätigt die Ergebnisse von Beispiel 5. Wenn menschliche Antikörper bei der menschlichen Zellinie verwendet werden, tritt keine Lyse ein, weder mit menschlichem Komplement noch mit Kaninchen-Komplement, was darauf hindeutet, daß keine Autoantikörper vorhanden sind. Die Chromfreisetzungstechnik ermöglicht keine ausreichend lange Fortsetzung der Inkubationen, um signifikante Werte der Aktivierung über den alternativen Weg des Kaninchen-Komplements durch die menschlichen Zellen nachzuweisen (Figur 11). Wenn jedoch menschliche Antikörper mit der DB3 Maus-Maus-Hybridom Zellinie inkubiert werden (Figur 12), wird eine Zelltötung sowohl durch Kaninchen-Komplement als auch durch menschliches Komplement erzielt, was darauf hinweist, daß menschliches Komplement tatsächlich in einem derartigen Test funktionieren kann. Als das B10 Mensch-Maus-Hybrid, welches das menschliche Chromosom 1 enthält und von dem bekannt ist, daß es zumindest DAF exprimiert, verwendet wurde, verursachte Kaninchen-Komplement eine Lyse der Zellinie, während menschliches Komplement bei der Herbeiführung einer Lyse der Zellinie versagte (Figur 13). Die Erklärung dafür ist, daß die menschlichen HCRFs, die aufgrund der Gegenwart von Chromosom 1 auf dem Maus-Mensch-Hybrid exprimiert werden, die Aktivität des menschlichen Komplements gehemmt haben.

BEISPIEL 8

Das vorangehende Beispiel zeigt, daß der Besitz von Chromosom 1 eine Zerstörung der Xenotransplantatszelle verhindern kann. Während es aufgrund der Umstände einen starken Hinweis gibt, daß es sich um die CRA-Stelle handelt, welche die Mauszelle vor einer Xenotransplantatszerstörung schützt, liefert dieses Beispiel einen formalen Beweis. In diesem Beispiel wird die Wirkung einer Transfektion von nicht-menschlichen Zellinien mit menschlichem MCP und des Aussetzens einem menschlichen oder Kaninchen-Komplement gezeigt.
cDNAs wurden für MCP nach der ausführlichen Beschreibung von Lublin et al. (3. Exp. Med. 168 181-194 (1988)) hergestellt. Die Konstruktion transfektierter Zellinien wurde unter Verwendung des Expressionsplasmids SFFV.neo unter Anwendung der von Fuhlbrigge et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 85 5649-5653 (1988)) beschriebenen Technik durchgeführt. Dies enthält die Friend Milz Fokus bildende Virus 5' Langterminal Wiederholung (Friend spleen focus forming virus 5' long terminal repeat) (SFFV.LTR) (Clark und Mak (Nucl. Acids Res. 10 3315-3330 (1982)) und (Proc. Natl. Acad. Sci. 80 5037-5041 (1983)). Zellinien wurden von der American Type Culture Collection 12301 Parkland Drive, Rockville, Maryland, USA, erhalten. Die verwendeten Zellinien waren CHO-K1 (ATCC CCL 61) und NIH/3T3 (ATCC CRL 1658). Die Expression des Gens wurde unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers zu MCP (Andrews et al. Ann. Hum. Genet. 49 31-39 (1985)) und der FACS-Analyse, wie bereits beschrieben, bestimmt. In einigen Fällen wurden die Zellinien nach hohen Expressionswerten von MCP durch Zeilsortierung auf dem FACS unter Verwendung von Standardtechniken ausgewählt.
Dieses Beispiel zeigt die Wirkung der Transfektion von CHO-Zellen mit MCP. Da diese Zellinien als Monoschichten wachsen, wurde die Zelltötung durch den terminalen Adeninaufnahmetest bewertet, wie von de Bono et al. (Immunology 32 221-226 (1977)) beschrieben wurde. Kurz gesagt umfaßt dieser Test die Inkubation von Zellkulturen in sterilen Platten mit flachem Boden und 96 Vertiefungen, mit Komplement und Antikörper. Am Ende der Versuchsinkubationsperiode wird die Zellebensfahigkeit durch die Fähigkeit der Kultur, radioaktives Adenin aufzunehmen, bestimmt. Lebensfähige Zellen nehmen das Adenin auf, tote Zellen nicht; daher habe lebensfähige Zellen hohe Zahlungen und tote Zellen niedere Zählungen.
Gemeinsam mit vielen transformierten Zellen ist CHO gegenüber natürlich auftretenden Antikörpern und der Wirkung des alternativen Komplementweges unempfindlich. Diese Zellen sind jedoch gegenüber jenen Antikörpern empfindlich, die, wie bereits gezeigt wurde, eine Zerstörung des Hamster-Herz-Xenotransplantats verursachen, wie in Beispiel 6 beschrieben wurde. Da CHO-Zellen vom Hamster abgeleitet werden, töteten diese Antikörper die CHO-Zellen mit sowohl menschlichem als auch Kaninchen-Komplement (Figur 14). Wenn CHO-Zellen mit menschlichem MCP transfektiert werden, können die Zellen nur in Gegenwart von Kaninchen-Komplement aufgelöst werden. Menschliches Komplement wurde durch die Gegenwart des menschlichen MCP an der Oberfläche der Hamster-Zellinie gehemmt (Figur 15). Der Beweis, daß das Versagen der zu tötenden Zellen wirklich auf ein Versagen der C3-Convertase zurückzuführen ist, wird durch die Analyse des Abbaus des menschlichen C3 nach einer Inkubation der CHO-Zellen durch die Rocket-Immunelektrophorese, wie zuvor in Beispiel 4 beschrieben, erbracht. Wie ersichtlich ist, tritt kein Abbau über den Kontrollwerten mit nur Komplement ein (Figur 16).
Diese Daten bestätigen, daß das genetische Manipulieren von Komplement nach unten regulierenden Proteinen an der Oberfläche von nicht menschlichen Zellen diese Zellen vor den Mechanismen einer hyperakuten Xenotransplantatzerstörung schützt, die als gemeinsames Merkmal die Spaltung der C3-Komponente des Komplements erfordern.

BEISPIEL 9

Nach dem Verfahren von Beispiel 8 wurden 3T3 Maus-Fibroblastzellen mit cDNA transfektiert, die für MCP kodiert (MCP Klon K5.23). &sup5;¹Cr wurde den Zellen wie in Beispiel 5 beschrieben zugegeben. Ein Volumen der Zellen wurde dann mit einem Volumen menschlichem, hitzeinaktiviertem Komplement inkubiert und ein Volumen des menschlichen Komplements bei 4ºC mit Maus-Milzzellen präabsorbiert, um den Anti-Maus-Antikörper von dem menschlichen Komplement zu entfernen. Die Mischung und Serienverdünnungen mit Komplement wurde ausgestrichen. Allgemeine Bedingungen und Merkmale des Chromfreisetzungstests sind wie in Beispiel 5 beschrieben. Die Ergebnisse für Klon K5.23 sind in Figur 17 dargestellt, die auch als Kontrolle die Wirkung der MCP cDNA zeigt, die in die umgekehrte Richtung (in welchem Fall sie nicht transkribiert wird) eingefügt wurde. Korrekt transkribierte MCP cDNA bietet den Zellen Schutz vor der Abtötung, wie durch den verhältnismäßig niederen Wert der &sup5;¹Cr-Freisetzung gezeigt wird, während nicht transkribierte cDNA keinen wesentlichen Schutz bietet, wie durch den verhältnismäßig hohen Wert der &sup5;¹Cr-Freisetzung gezeigt wird.

BEISPIEL 10

Ähnliche Ergebnisse, wie jene, die in dem vorangehenden Beispiel 8 beschrieben sind, können mit L1/210-Zellen (einer leukämischen Maus-Zellinie) erhalten werden, die mit der cDNA für DAF transfektiert sind. cDNAs wurden für DAF erzeugt, wie in Lublin & Atkinson (Ann. Rev. Immunol. 7 35-58 (1989)) beschrieben ist.

BEISPIEL 11

cDNA für MCP wurde hergestellt und wie im vorangehenden Beispiel 8 in SFFV.neo ligiert.
Unter Verwendung dieser DNA-Herstellung wurden transgene Mäuse erhalten, wie in "Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual" von B. Hogan et al., Cold Spring Harbour Laboratory (1986), beschrieben ist. Zehn bis fünfzehn (CBAxB10)f1 weibliche Mäuse, 3-4 Wochen alt, wurden durch intraperitoneale Injektion von 5 Einheiten Serumgonadotropin von trächtigen Stuten (im Handel als Folligon erhältlich) und anschließend nach 48 Stunden durch intraperitoneale Injektion von 5 Einheiten Choriongonadotropin von menschlichem Schwangerschaftsharn (im Handel als Chorulon erhältlich) zur Superovulation veranlaßt. Die Weibchen wurden am Tag der Chorulon-Injektion mit (CBAxB10)F1 Männchen gepaart und am nächsten Tag wurden Weibchen mit Vaginalpropfen durch zervikale Dislokation getötet, und befruchtete Eizellen wurden aus ihren Eileitern isoliert.
Drei- bis vierhundert Eizellen, die auf diese Weise isoliert worden waren, enthielten zwei Pronuklei, die unter der Nomarski Differentialinterferenzkontrastoptik bei 400-facher Vergrößerung deutlich sichtbar waren. Einer der beiden Pronuklei wurde mit etwa 2000 Kopien der DNA-Zubereitung, die das MCP cDNA Transgen enthielt, in Konzentrationen im Bereich von 0,5 bis 2 ng/µl injiziert.
Eizellen, welche die Mikroinjektion überlebten, wurden in die Eileiter von (CBAxB10)F1 Weibchen reimplantiert, welche die vorangehende Nacht mit vasektomisierten Männchen gepaart worden waren und daher scheinträchtig waren (d.h., sie hatten ovuliert und ihr hormonaler Zustand war jener der Trächtigkeit, aber ihre eigenen Oozyten waren nicht befruchtet worden). Etwa 30 mikroinjizierte Eizellen wurden zu den Eileitern jedes pseudoträchtigen Weibchens unter Anästhesie entweder am selben Tag der Mikroinjektion oder am folgenden Tag, als sich die Eizellen in der 2-Zellstufe befanden, übertragen. Es folgte eine normale Trächtigkeit und siebzehn Mäuse wurden von zehn Müttern geboren. Die Durchmusterung der Nachkommenschaft erfolgte durch Slot-Blot und/oder Southern-Blot (siehe Beispiel 8) und auch PCR, Analyse der DNA von Schwanzhautzellen unter Verwendung von ³²P-markierten Sonden und Primern, die das Transgen erkennen. Einer der Nachkommen, ein Männchen, erwies sich als transgen für die MCP DNA Sequenz.

BEISPIEL 12

Das Verfahren von Beispiel 11 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die cDNA für DAF, wie in Beispiel 10 beschrieben, anstelle der cDNA für MCP verwendet wurde. Es wurden dreiundzwanzig Nachkommen von zehn Müttern geboren. Drei von ihnen (zwei Weibchen, ein Männchen), die für DAF transgen waren, wurden erhalten, wie durch Southern-Blotting gezeigt wurde.

BEISPIEL 13

Die männliche Maus, die in Beispiel 11 erhalten wurde, die ein menschliches MCP cDNA Tansgen enthielt, wurde bis zur Reife wachsen gelassen und mit einem (CBAxB10)F1 Weibchen gepaart. Es gab elf Nachkommen. Schwanzzellen DNA von jedem Nachkommen wurde durch Slot-Blot-Analyse unter Verwendung von markierter menschlicher MCP cDNA als Sonde durchmustert, um zu bestimmen, ob das Transgen vererbt worden war. Die Ergebnisse sind im oberen Teil von Figur 18 dargestellt. Es ist ersichtlich, daß die Nachkommen 0, 1, 5, 7, 8 und 10 geerbt hatten. (Es wurden vier Kontrollen durchgeführt: menschliche DNA (H); Maus DNA (M); Maus DNA, vermischt mit 10 pg menschlicher MCP-markierter cDNA; und Maus DNA, vermischt mit 100 pg menschlicher MCP-markierter cDNA).

BEISPIEL 14

Die in Beispiel 12 erhaltene männliche Maus, die ein menschliches DAF cDNA Transgen enthielt, wurde zur Reife wachsen gelassen und mit einem (CBAxB10)F1 Weibchen gepaart. Bei jedem der erhaltenen Nachkommen wurde die Schwanzzellen-DNA durch Slot-Blot-Analyse unter Verwendung von markierter menschlicher DAF cDNA als Sonde durchmustert, um zu bestimmen, ob das Transgen vererbt worden war. Die Ergebnisse sind im unteren Teil von Figur 18 dargestellt. Es ist ersichtlich, daß der Nachkomme 13.3 (ein Weibchen) geerbt hat. (Es wurden vier Kontrollen durchgeführt: menschliche DNA (H); Maus DNA (M); Maus DNA, vermischt mit 10 pg menschlicher DAF-markierter cDNA; und Maus DNA, vermischt mit 100 pg menschlicher DAF-markierter cDNA.

SEQUENZLISTE

SEQ ID Nr.: 1
SEQUENZTYP: Nucleotid
SEQUENZLÄNGE: 20
EIGENSCHAFTEN: Stromaufwärtiger Primer des menschlichen Antithrombin 2 (AT3) Gens
SEQUENZ:
CCACAGGTGT AACATFGTGT
SEQ ID NR.: 2
SEQUENZTYP: Nucleotid
SEQUENZLÄNGE: 20
EIGENSCHAFTEN: Stromabwärtiger Primer des menschlichen Antithrombin 2 (AT3) Gens
SEQUENZ:
GAGATAGTGT GATCTGAGGC

Claims

1. Verpflanzbare tierische Zelle oder ein solches Gewebe einer Spendergattung;

wobei die Zelle oder das Gewebe mit einem oder mehreren homologen Komplementrestriktionsfaktoren verbunden ist, die bei einer Empfängergattung verwendet werden können, um die vollständige Aktivierung des Komplements zu verhindern, und wobei die Spendergattung in bezug auf die Empfangergattung eine nicht übereinstimmende Gattung ist,

zur Verwendung in der Medizin.

2. Zelle oder Gewebe nach Anspruch 1 zur Verwendung in der Transplantationstherapie.

3. Zelle oder Gewebe zur Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Gewebe ein Organ ist.

4. Zelle oder Gewebe zur Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Organ ein Herz, eine Lunge, eine Leber, eine Niere, eine Bauchspeicheldrüse oder Schilddrüse ist.

5. Zelle oder Gewebe zur Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Gewebe Blut oder hämopoetische Zellen, Langerhans-Inseln, Gehirnzellen oder Zellen endocriner Organe umfaßt.

6. Zelle oder Gewebe zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der HCRF jenen Teil der Komplementaktivierungskaskade beeinflußt, der sowohl dem klassischen als auch dem alternativen Weg gemein ist.

7. Zelle oder Gewebe zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der HCRF ein natürlicher HCRF ist.

8. Zelle oder Gewebe zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei der HCRF die Komplementaktivierung bei C3 reguliert.

9. Zelle oder Gewebe zur Verwendung nach Anspruch 8, wobei der HCRF folgendes ist oder dessen Aktivität besitzt:

Faktor I (früher auch als C3b-Inaktivator oder KAF bekannt);

Faktor H;

C4-Bindungsprotein;

DAF (auch als CD55 bekannt);

Membran-Cofaktorprotein (MCP; auch als CD46 bekannt und erstmals als gp45-70 beschrieben und ferner als gp66/56 bekannt);

CR1 (auch als C3b/C4b-Rezeptor oder CD35 bekannt); und/oder

CR2 (auch als CD21, C3.dg-Rezeptor, 3d/EBV-Rezeptor und p140 bekannt).

10. Zelle oder Gewebe zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der HCRF die Aktivität eines natürlichen HCRF besitzt, dessen Gen an dem RCA-(Regulator der Komplementaktivierung)-Ort angeordnet ist, der bei der Bande q32 von Chromosom 1 kartiert ist.

11. Zelle oder Gewebe zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei der HCRF die Komplementaktivierung bei C8 und/oder C9 reguliert.

12. Zelle oder Gewebe zur Verwendung nach Anspruch 11, wobei der HCRF folgendes ist oder dessen Aktivität besitzt:

C8bp (auch als HRF oder MIP bekannt);

P-18 (auch als HRF-20, CD59 oder MIRL bekannt); oder

SP40.40

13. Zelle oder Gewebe zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der HCRF membrangebunden ist.

14. Zelle oder Gewebe zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der HCRF derart vorgesehen ist, daß er in der Zellmembran auf dem Spendergewebe integriert ist.

15. Zelle oder Gewebe zur Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Spendergewebe transgen ist, indem es Nucleinsäure enthält und exprimiert, die für einen oder mehrere HCRF kodiert, die in der Empfängergattung verwendet werden können, wenn sie in den Empfanger verpflanzt werden.

16. Zelle oder Gewebe zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Empfängergattung der Mensch ist.

17. Zelle oder Gewebe zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Empfängergattung das Schwein ist.

18. Verwendung einer tierischen Zelle oder eines Gewebes, das von einer Spendergattung abgeleitet ist, und einem oder mehreren homologen Komplementrestriktionsfaktoren (HCRF), die in einer Empfängergattung verwendet werden können, um die vollständige Aktivierung des Komplements zu verhindern; wobei die Spendergattung in bezug auf die Empfängergattung eine nicht übereinstimmende Gattung ist; bei der Herstellung eines Gewebes, das in die Empfängergattung ohne hyperakute Abstoßung verpflanzbar ist.

19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Spendertier für den oder jeden HCRF transgen ist und die Zellen oder das Gewebe diesen exprimieren.

20. Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, ferner gekennzeichnet durch jedes der besonderen Merkmale der Ansprüche 3 bis 14, 16 und 17.