JPH05503074A - 改質生物学的材料 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 改質生物学的材料 本発明は、移植に用いるための生物学的に適合する材料及びこのような材料の製 造法と使用法に関する。 欠損した又は不完全な動物（特にヒト）の器官を含めた組織の補充はこの４０年 間にわたって臨床医学における一般的な療法になっている。これらの補充療法は 、例えばデュポン（ＤｕＰｏｎｔ）によって商標ＤＡＣＲＯＮで販売されている ポリエチレンテレフタレートの不完全血管の修復への使用から、閉塞動脈をバイ パスするため及び−人の人から他の人への心臓移植のための自家移植片としての 伏在静脈の使用までの範囲である。 器官移植は、比較的安い費用での高い成功率の達成を可能にする近代的な免疫抑 制剤によって、著しい発展を遂げている。器官移植の要望は急激に増大している 。現在、世界で年間２０．０００件を越える器官移植が行われている。しかし、 これは現在の判断基準によって評価したニーズの約１５％を表すにすぎない。あ らゆる種類のドナー器官の供給／需要比は既存供給源から満たされることはでき ない。このことは心臓移植の需要によって最も良く説明されると思われる。１９ ６７年のパーナート（Ｂａｒｎａｒｄ）による最初の心臓移植はかなり新聞で報 道された。１年以内に、１０１件の心臓移植が２２力国において異なる６４手術 チームによって実施された。得られた芳しくない結果には幻滅が伴い、１９７０ 年代初期には世界で年間３０件に満たない移植が実施されたにすぎない。しかし 、シクロスポリン免疫抑制剤の導入は心臓移植に大変革をもたらし、現在では大 抵のセンターが１年間移植組織の８０％を越える心臓移植成功率（及び患者生存 率）を期待することができる。専門技術が獲得されるにつれて、この生存率がさ らに上昇することが妥当に期待される。この処置の成功は、当然、需要をさらに 高め、医学専門家と一般大衆は心臓移植が実際に死に代わる手段であることをま すます知るようになり、ますます多くの患者がこの処置を望むようになる。現在 、年間２．０００件を越える心臓移植が実施されている。 今日では、心臓移植における最大の死亡危険性は適当なドナー器官が入手可能に 成るのを待つ間である。人工心臓はこれらの患者に短期間のサポート装置を提供 するが、より多（の心臓移植センターとより大きいドナー供給とが長期間型まれ ている。心臓移植から恩恵を受ける個人の考えられる数は決して科学的には確認 されていないが、心臓移植のニーズの発表された推定値は選択基準、受容者の年 齢、疾患等にに依存して大ざっばに年間１００万人につき５０〜２５０人の範囲 であった。実際の数字が如何なるものであっても、現在のドナー供給のオプショ ンが要求を満たすことができないことは、極めて明らかである。腎臓移植と肝臓 移植に関しても同様な考察をすることができ、膵臓又はランゲルハンス島の移植 が糖尿病治療のための広（受は入れられる治療方法に成るならば、この組織の不 足も重要な関心事になると思われる。 現在の移植療法には他の欠点も存在する。特に、多くの器官のドナー自体が移植 される器官以外の器官への損傷によって死亡した、何らかの事故（例えば、交通 事故）の犠牲者であるために、ドナー器官が移植への使用に適するとは必ずしも 限らず、また移植されるべき器官への付加的損傷又は付随する問題が存在するこ ともある。 さらに、ドナーからの器官の予想できない入手性のために、移植手術は予め上演 時間を定められた手術を含むルーチン手術として予定することがしばしばできな い。あまりにも頻繁に、手術チームと病院管理者はドナー器官が確認された瞬間 に反応し、労働時間外の時間に働かなければならず、それによって経営上及び個 人的な困難さが増大している。 心臓、肝臓及び肺の移植の場合には、拒絶が生ずるならば、別の適当なドナーが 偶然にも短時間内に入手可能にならないかぎり、再移植は通常不可能である。 上記の医学的困難さを別として、現在の移植の実際は社会的困難さを含む場合が ある。第一に、可能なドナーから器官を取り出すことに対する宗教的異議が、特 に生まれ変わりを信じる文化において存在する。特に国によっては同意が必要で ある場合に、死者から器官を取り出すことに対して生ずる倫理的及び社会的困難 さが当然存在する。最後に、生活腎臓ドナーの商取引の出現は、特に第三世界の 国において、懸念を生じており、このような取引を抑制又は減することが社会的 に望ましい。 その欠点に関して上述したような、通常の移植手術は特定の種の１動物（一般に ヒト）から同じ種の他の動物への移植を含む。このような移植は同種移植と呼ば れる。上述したような、通常の同種移植組織供給に関する困難さのために、移植 に異種移植組織を用いることの可能性に注目が集中している。異種移植は細胞及 び器官を含めた組織の、種間の障壁を越えての、移植に一般に用いられる包括的 な用語である。 治療的補充スケジュールにおける異種移植組織の成功した使用の幾つかの例が既 に存在する。例えば、最近では大動脈弁置換へのブタ組織の使用、重度火傷患者 のカバーへのブタ皮膚及び置換静脈移植片としてのつ／Ｉｆ静脈の使用が実証さ れている。しかし、これらの異種移植片の全てが共通して１問題を有している： すなわち、これらは機械的な置換を形成するにすぎない。使用組織は生物学的に 非機能的である。これに対する理由は、ヒトに存在する免疫プロセスが直ちに（ 数分間又は数時間内に）大抵の種からの組織の細胞的完全性を破壊するからであ る。このような異種移植片は不調和異種移植片として知られる。 この破壊の残忍性は系統発生的に関連する。従って、ヒトに密接に関係する霊長 類であるチンパンジーからの組織は同種移植片と殆ど同様にヒトの中で生き残る ことができる：このような異種移植片は調和異種移植片として知られる。 調和異種移植片は同種移植片に伴う困難さに対する答えを与えると考えられるが 、実際には事実は恐らくこの通りではない。チンパンジーはヒトよりも非常に小 さく、チンパンジー器官は一般に、ヒトにおいて機能するほど充分に大きくはな い。腎臓の場合には、このことは欠陥ヒト腎臓の置換に２個のチンパンジー腎臓 を移植することによって解決されるが、肝臓と心臓に関しては、これは明らかに 不可能である。さらに、チンパンジーは本来緩慢に繁殖し、捕られれ状態では繁 殖が不充分であるので、実験動物としてのチンパンジーの需要［特に、後天的免 疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の研究の現在の領域では］は、依然として需要が供給 を上回っていることを意味する。さらに、異種移植片ドナーとしての他の霊長類 の使用の公衆による受け入れには若干の社会的困難さが存在する。 それ故、不調和異種移植片が再び注目されている。不調和異種移植片がこのよう に迅速に失敗する理由はドナ一種の未確認抗原に対するレシピエンド種における 「自然生成」抗体の存在であると一般に考えられている［ションズ（ＳｈｏｎＳ ）等のヨーロブ、サージ、レス、（Ｅｕｒｏｐ、Ｓｕｒｇ、Ｒｅｓ、）５　２６ 〜３６　（１９７３）］。抗体はドナ一種からの免疫学的チャレンジを受けてい ない個人に存在することが発見されているので、「自然生成」と呼ばれる。 器官移植片の一超過敏な抗体−仲介拒絶として知られる一急激な拒絶は充分に知 られている。腎臓移植（同種移植）がルーチン治療になった１９６０年代初期に は、移植腎臓が時には、手術のまだ進行中に、レシピエンドによって拒絶される ことが観察された。移植手術中に、ドナーとレシピエンドとの血管が一緒に縫合 された直後に、腎臓は一般に赤色になり、稠度が硬くなる。このような移植はし ばしば、殆ど直ちに尿を生ずる。患者がまだ手術台上であるときに移植片が破壊 される拒絶の形態（超過敏拒絶）では、移植後の最初の数分間かそこらで破壊プ ロセスが開始する。これが生ずると、腎臓は青みを帯び、不調和になり、うっ血 する。器官の稠度も変化する。一般に、移植片は浮腫状になり、尿産生は生じず 、新たに移植された腎臓は直ちに摘出される。レシピエンド中に予め形成された 循環抗体とドナー腎臓中の抗原との間の体液仲介免疫反応が関係することは明ら かになっている。同種移植における免疫反応を避ける唯一つの方法は、レシピエ ンド中にドナー細胞に対する抗体が存在しないことを、移植前にチェックするこ とである。このような抗体検査（交差適合試験）の知識が増大するにつれて、レ シピエンド中の抗体がドナー中の抗原に対して反応するという一般化が事実では なく、同種の固体間の移植に関する場合に、超過敏な移植片破壊がＴ−温暖陽性 交差−適合として知られる特定の種類の抗体の存在に限定され、これらの抗体が 殆ど確実にＩｇＧサブクラスに属することが明らかになっている。さらに、これ らの抗体の存在は以前の輸血の結果として又は妊娠の結果として又は、最も一般 的には、失敗した以前の移植の結果としての既存免疫化処置に常に由来する。 超過敏異種移植片拒絶の機構は、上述したように、超過敏同種移植片拒絶の機構 と大体同じであると主として考えられている。異種移植片拒絶の機構に関する文 献は約８３年間に潮って、広範囲である。この期間中、抗体が関与しない異種移 植片拒絶機構を示唆したと思われるのは３刊行物にすぎない。補体活性化の代替 え経路が異種移植片拒絶（このような用語を必ずしも用いていないが）に関与す ることが示唆されている。この示唆はシリング（Ｓｃｈ　ｉ　１１　ｉｎｇ）等 による論文［サージエリ−、シネコロジー　アンド　オブステトリクス（Ｓｕｒ ｇｅ−３２（１９７６）］に初めて出現した。この示唆は１９８８年と１９８９ 年に（同じデータを２回発表）、ミャガワ（Ｍ　ｉ　ｙ　ａ　ｇ　ａｗａ）等に よって再びなされた［トランスプランテーション（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔ　 １ｏｎ）４６　（６）８２５−８３０　（１９８８）とトランスプランテーショ ン　プロシーディング（工ｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ ｇ）２１　（１）５２０−５２１　（１９８９）］。しかし、これらの実験は両 方とも同じ誤りを有していたため、結果は決定的ではなかった。選択されたモデ ルは異種移植片モデルであると著者によって主張されているが、交差種抗体が存 在しなかった。しかし、現在では、交差種抗体の検出に用いられた検定法が不充 分であること、及びこれらの論文に引用された推論が不充分なデータに基づくも のであったことが考えられる。 異種移植片拒絶を回避又は軽減するために現在、実験的に採られている大抵の手 段は、例えばシクロスポリンＡ及びその他の免疫抑制剤によって、プラズマフエ レーゼによって、抗体のコブラ毒因子、ブドウ球菌属蛋白質Ａ吸収による処理等 によって、主として非特異的基準で、レシピエンド免疫系に化学療法的に干渉す ることを含む。このアプローチは当然、同種移植片を支持する化学療法の結果と して生じたものである。 本発明は根本的に異なるアプローチを用いる：すなわち、レシピエンド免疫系の 非特異的干渉の代わりに、本発明はレシピエンド免疫系のある一定の要素によっ て自己と見なされるドナー移植片の効果を有する物質の同時投与を可能にする。 特に好ましい実施態様では、ドナー組織自体を改質して、ある点においてレシピ エンドに対して免疫的に自己（ｓ　ｅ　ｌ　ｆ）であると思われるようにする。 超過敏異種移植片拒絶が必ずしも抗体−仲介でないことも発見されている。この ことは２つの観察に起因する。第一に、抗体の不存在下、補体の存在下で超過敏 拒絶が観察される：第二に、抗体の存在下、補体の不存在下で超過敏拒絶が観察 されない。 本発明は、補体活性化が、適当な抗体分子の結合によって助成される又は助成さ れないのいずれであっても、異種移植片の超過敏破壊において顕著であるという 発見に基づく。代替え経路の補体活性化は多様な細胞産生物によって誘導されう る。これらの産生物は例えば細菌又は異種移植片のような外部からの侵入細胞に 限定されず、多（の細胞上に存在する。従って、原則として、個体の多くの細胞 が代替え経路の補体を活性化して、大規模な自己免疫破壊を生ずる。これが起こ らないことは、血清中及び細胞上に自然に存在する、多くの補体負調節（ｄ。 ｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔ　ｉｎｇ）蛋白質の存在による。これらの分子［ここでは 「相同的（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）補体制限因子と呼ぶ」は古典経路又は自己細 胞産生物による代替え経路のいずれかによって自己補体の完全活性化を阻止して 、自己（ｓ　ｅ　ｌ　ｆ）の自己免疫破壊を防止する。このような分子の機能は 発作性夜間血色素尿症において科学的精密さで説明される。この疾患では、上記 分子の少な（とも１つの膜アンカー（ａｎｃｈｏｒ）（腐食促進因子）が存在し ない。従って、蛋白質が赤血球細胞膜内に保留されず、細胞から離れ、補体の代 替え経路を活性化し、その後溶解して、発作性夜間血色素尿症を生ずる。 本発明の第１態様によると、レシピエンドとは異なる種であり、レシピエンドに 対して不調和種であるドナ一種に由来する動物組織をレシピエンドに移植する方 法を提供する、この方法は組織をレシピエンドに移植し、移植組織と共に、レシ ピエンド種において補体完全活性化を阻止するために活性である１種以上の相同 的補体制限因子を供給することを含む。 本明細書で用いる「組織」なる用語は、器官（特に、心臓、肺、肝臓と腎臓、膵 臓及び甲状腺のような重要な内部器官）、角膜、皮膚、血管、その他の結合組織 、血液細胞と造血細胞、ランゲルハンス島、脳細胞、内分泌腺及びその他の器官 からの細胞を含めた細胞並びに体液（例えばＰＰＰ）（これらの全てが１つの種 から他の種への移植の候補でありうる）を含む、移植可能な生物学的な材料を意 味する。 「不調和種」とは、それからのレシピエンドへの（一般に血管新生した）異種移 植片が通常超過敏拒絶、すなわち、数日間ではなく、数分間もしくは数時間内過 敏拒絶は当該技術分野に熟練した人に周知であり、移植後２４時間足らずに、６ 時間足らずに或いは１時間足らずにさえも生ずる。 補体とその活性化は現在周知であり、ロイット（Ｒｏ　ｉ　ｔ　ｔ）のエッセン シャル　イムノロジー（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ’Ｓ’）（第 ５版、１９８４）、ブラックウェル　サイエンティフィック出版（Ｂｌ　ａｃｋ ｗｅ　１１Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、オックスフォ ードに述べられている。補体（Ｃ゛）に帰せられる活性は配列中で作用する９蛋 白質成分（０１〜Ｃ９）の作用に依存し、この中の最初の成分はＣ１ｑＳＣ１ｒ 及びＣ１ｓと呼ばれる３主要サブフラクシヨンから成る。補体は古典経路又は代 替え経路によって活性化される、この両級路を次に簡単に説明する。 古典経路では、抗体が０１に結合し、これのＣ１ｓがエステラーゼ活性を得て、 活性化をもたらし、最初にＣ４の、次に０２の膜又は免疫複合体上の部位に移る 。 この複合体はｒＣ３コンバーターゼ」活性を有し、溶液中で０３を分解して、全 （異なる機能を有する小ペプチドフラグメントＣ３ａと残留分子Ｃ３ｂを生ずる 。 Ｃ３ａはアナフィラトキシン活性を有し、補体増幅カスケードにもはや関係しな い。Ｃ３ｂは膜に結合し、抗原−抗体−Ｃ３ｂ複合体の免疫粘着を生じ、このよ うにして次の食作用を促進する。 代替え経路では、Ｃ３コンバーターゼ活性はＣ３ｂＢによって発揮され、Ｃ３ｂ Ｂの活性化は外因性作用剤、特に例えば抗体に関係なく作用するエンドトキシン のような微生物多糖類によって誘発されつる。コンバーターゼはＣ３ｂと因子Ｂ との複合体に対する因子りの作用によって形成される。これは有効なフィードバ ック回路を形成し、この経路で０３分解生成物（Ｃ３ｂ）が開裂酵素のより多く の形成を助ける。 古典経路と代替え経路の両方では、Ｃ３ｂレベルがＣ３ｂイナクチベータ−（因 子Ｉ）によって維持される。Ｃ３ｂは容易に因子Ｆと結合して、複合体を形成し 、これは因子■によって分解されて、その溶血性と免疫粘着性とを失う。 古典経路と代替え経路はＣ３段階後は共通する。Ｃ５は分解されて、Ｃ５ａとＣ ５ｂフラグメントを生ずる。Ｃ５ａはアナフイラトキシン活性を有し、多形の走 化性を生ずる。Ｃ５ｂはＣ６及びＣ７と複合体として結合して、膜上に熱安定性 部位を形成し、膜は最終成分Ｃ８と０９とを補充して、膜侵襲複合体（ＭＡＣ） を形成する。これは膜に挿入されて、膜から突出する環状構造体であり、電解質 と水とに対して完全に透過性であるトランスメンブランチヤンネルを形成する。 内部のコロイド浸透圧が高いために、ナトリウムイオンと水の正味流入が生じて 、細胞溶解をもたらす。 本発明に有用な相同的補体制限因子（ＨＣＲＦ）は一般に、補体活性化カスケー ドの如何なる部分にも干渉することができる。ＨＣＲＦは古典経路を構成する部 分に単独で干渉することができる、又は代替え経路を構成する部分に単独で干渉 することができる、或いはさらに一般的には古典経路と代替え経路の両方に共通 する部分に干渉することができる。ＨＣＲＦレギュレーターが経路の共通部分に 干渉することが好ましい。ＨＣＲＦは天然ＨＣＲＦに同じでありうる、又は単純 に適当な機能を有する。組換え体ＤＮＡテクノロジーによって製造されたもの及 び製造された変異体を含めた合成及び半合成ＨＣＲＦは、ＨＣＲＦなる用語に含 まれる。 上述したように、相同的補体制限因子は補体カスケードの作用をその溶解活性を 減する又は阻止するように調節する物質であり：これらは動物体が自己免疫反応 を避けるように組織を自己として標識するために用いられる。本発明では、ＨＣ ＲＦが膜に結合する又は血清中に遊離するのいずれでも原則として可能であるが 、実際にはＨＣＲＦが異種移植組織の細胞に膜結合することが好ましい。このよ うにして、ＨＣＲＦが移植組織に「会合する」ことが容易である。好ましいＨＣ ＲＦには、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体（ＣＲ１）　、Ｃ３ｄｇ受容体（ＣＲ２）　、 腐食促進因子（ＤＡＦ）　、Ｃ３ｂイナクチベーター及び膜補因子蛋白質（ＭＣ Ｐ）を含む推定膜因子がある。推定血清ＨＣＲＦは因子Ｆ１腐食促進因子（ＤＡ Ｆ）及びＣ４結合蛋白質（Ｃ４ｂｐ）を含む。これらのＨＣＲＦは全て、Ｃ３段 階における干渉によって補体活性を負調節する。Ｃ８においてブロックする相同 的制限因子（ＨＲＦ）も推定膜因子である。 適当なＨＣＲＦのための遺伝子の、全てではないが、多くはＲＣＡ　（補体活性 化のレギュレーター）座に存在し、この座は染色体１の帯ｑ３２に位置づけられ ＨＣＲＦの命名と位置に関しては若干の混乱があるが、因子Ｃ４ＢＰ、ＣＲＩ、 ＤＡＦ及び因子Ｈはレイーキャンプス（Ｒｅｙ−Ｃａｍｐｕｓ）等（上記引用文 中）によって、及び彼らの以前の研究［ジェイ６イクスブ　メト、１６６．２４ ６−２５２頁（１９８７）］において確認されている。膜補因子蛋白質（ＭＣＰ ）は研究者によってはＣ４結合蛋白質（Ｃ４ｂｐ）と同義語として扱われており 、これらの２因子が関係する又は同じであることが考えられる。ロザー（Ｒｏｔ ｈｅｒ）とチル（Ｔｉｌｌ）［ｒ補体系（Ｔｈｅ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　５ｙ ｓｔ　ｅｍ）　Ｊ　、ン、プリンゲル出版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−’Ｙ’ｅｒｌｏ ｇ）、ベルリン（１９８８）］はセクション１．　２．　３．　２においてＣ３ コンバーターゼの制限因子を考察している。彼らはＣ４結合蛋白質（Ｃ４ｂｐ） を腐食促進因子を同等と考え、因子ＨをＢ、Ｈ−蛋白質及びＣ３ｂイナクチベー ターアクセレーターと同等と考えている。疑いなく、ＨＣＲＦの命名、位置及び 特性化は発展し続けるが、本発明は全てのＨＣＲＦの使用を適合性と優先性が指 示するものと考えることを理解すべきである。 ＨＣＲＦに関する他の参考文献を下記に挙げる。 因子Ｉ　（以前にＣ３ｂアナクチベーター又はＫＡＦとしても知られる）：１０ ４４−１０５１　（１９７８）； ＤＡＦ　（ＣＤ５５としても知られる）・ニコルソンーウエラー（Ｎｉｃｈｏｌ ｓｏｎ　−Ｗｅ　］　Ｉ　ｅ　ｒ）等、ジエイ　イムツル、１２９．１８４　（ １９８２）＋膜補因子蛋白質（ＭＣＰ；ＣＤ４６としても知られ、ｇｐ４５−７ ０として最初に述べられ、さらにｇｐ６６１５６としても知られる）：セヤ（Ｓ 　ｅ　ｙ　ａ）等、ジェイ、イムツル、１２９．２０５１−２０６０　（１９８ ２）：ＣＲ２（ＣＤ２１．３ｄ／ＥＢＶ受容体及びｐ１４０として知られる）： イイダ４）。 ＲＣＡ蛋白質の一部の組織分布は次の通りである：ＣＲＩ：膜（限定）、赤血球 ：単球；大抵のＢ細胞と一部のＴ細胞：多形核白血球：濾胞−樹状細胞；糸球体 有足細胞。 ＣＲ２：膜（限定）：大抵のＢ細胞、濾胞−樹状細胞：一部の上皮細胞及び若干 のＴ細胞ライン： ＭＣＲ：膜（広範囲）：全での末梢血液細胞（赤血球以外）；上皮細胞、内皮細 胞及び繊維芽細胞系統：栄養芽層及び精子：ＤＡＦ　＋膜（広範囲）：全での末 梢血液細胞：上皮細胞、内皮細胞及び繊維芽細胞系統：栄養芽層及び精子： Ｃ４ｂｐ：血漿：肝臓合成；及び Ｈ：血漿：肝臓合成；繊維芽細胞及び単球細胞ライン。 その使用も本発明によって考えられる膜侵襲複合体のレベルでの相同的制限に関 係する蛋白質に関して、下記６５ｋＤａ　（又はそこら）の蛋白質が同じである という蛋白質配列としての一般的同意（但しまだ証拠はない）が存在する・６９ ７５　（１９８６）］　：及び ＭＡＣ阻害蛋白質（ＭＩＰ）［ワラトス（Ｗａｔｔｓ）等、（１９８８）コ。 ＣＤ５９／ＨＲＦ／ＭＩＰ蛋白質は、ＣＤ５９及びＤＡＦと同様に糖脂質アンカ ーによりて細胞表面に付着する：これらの蛋白質は発作性夜間血色素尿症には機 能的に存在しないことが知られている。 １８−２０ｋＤａ蛋白質もＭＡＣレベルに関係する。下記は同じであると考えら れる（但し同じでないこともありうる）：ｐ−１８［スギタ（Ｓｕｇｉｔａ）等 、ンエイ　バイオケム、（Ｊ、Ｂｉｏｃｈ年９月）：及び 反応性溶解の膜インヒビター（ＭＩＲＬ）［ホロギン（Ｈｏｌｏｇｕｉｎ）等、 ジエイ、’）Ｕン、　インベスト、（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、）　８４． ７（１９８９）］。 これらの蛋白質の推定存在（ｐｕｔａｔｉｖｅ　１ｄｅｎｔｉｔｙ）の証拠はＣ Ｄ５９とＨＲＦ−２０との蛋白質及び／又はｃＤＮＡ塩基配列が同じであると判 明していることである：おそらく、これらはｐ−１８／ＭｒＲＬとも同じである と考えられる。ＣＤ５９／ＨＲＦ−２０塩基配列と、Ｔ−細胞活性化に関係する ネズミＬＹ−６抗原の塩基配列との幾らかの相同関係が存在することを注目すべ きである［グロンクス（Ｇｒｏｎｘ）等、ジェイ、イムツル、１４２．３０１３ 　（１９８８）　コ。 ５Ｐ−４０，４０もＭＡＣ調節に関係する［キブスバウム（Ｋｉｖｓｚｂａｕｍ ）等、ＥＭＢＯ８，７１１（１９８９）コ。 ＨＣＲＦが０３段階で補体活性化に干渉することが好ましい。ＭＣＰとＤＡＦの 両方はＣ３活性化の代替え経路での有効フィードバック回路をブロックし、これ らは好ましいＨＣＲＦを構成する。 ＨＣＲＦは移植組織と共に供給される。このことは、移植組織が自己として標識 されるが、例えば侵入細菌のような他の外来物はこのように有意には標識されな いようなやり方で、ＨＣＲＦが投与されることを意味する。単純に非経口的に、 但し移植組織に対して局所的に、１種以上の適当なＨＣＲＦを投与することが可 能である。しかし、実際には、これは好ましくない、この理由はＨＣＲＦを移植 組織に充分に局在化することが困難であり、移植が行われた後にＨＣＲＦをレシ ピエンドに反復投与しなければならないという他の困難さがあるからである：し かし、これは専門医による薬剤学的投与系の使用によって克服することができた 。 ＨＣＲＦをドナー組織上の細胞膜に結合させるように、ＨＣＲＦを供給すること が一般に非常に便利である。適当な表現を生ずる、移植組織の良性な感染症が生 ずることがあるが、この目的を達成するための最も好ましいルートは、ドナー組 織がレシピエンドに移植されたときにレンビエ〉ト種中で活性な１種以上のＨＣ ＲＦをフードする核酸を含み、表現する点で、ドナー組織がトランス・】ア、ニ ックであることである。このようなＩ・ランス′）Σニラ２組織はＨＣＲＦを無 限に表１．１．綺ける。ＨＣＲＦは発生的にレシピエンド種に又（式こねより好 ましくな（は、調和異種移植片が可能であるよ・）な密接に関連する種に由来し 、うる。 原則とし、で、ｌ・ランスノエニックドナー組織は細胞培賞がら得られるが、ド ナー組織が１ランスゲニツク動物から得られる二とが好ましル。トラ〕、・スケ ニック動物はｉｌ）なくとも被＃植組繊において、優先的に、ＨＣＲＦを表現す る筈である（又は表現することが可能である）。しかし、ＨＣＲＦを何らかの結 合剤（例λば、ハイブリ、ｌトモツクローナル抗体）によって「ミルスタインと ☆エロ（ＭｉＩ　ｓ　ｔ　ｅ　ｉｎ＆Ｃｕｅ　Ｉ　ｌｏ）　、夫℃Ｌ九二（Ｎａ 　ｔ　ｃ＋　ｒ　ｅ−）　３０５−１５．３７（１９８３）］又は受容体によっ てドナー組織の細胞膜に結△することが可能であるので、これも重要ではない。 レシピエンド種は王としてヒトであるが、排他的ではない。経済及び倫理が許す 場合には他の種も可能であるので、他の霊長類が適当なレシピエンドである。 ドナ一種はし／ピエンｌ一種とは異なり、し／ビュント種の生理学を考慮した場 合に、移植のために適当な組織を提供しうる、如何なる適当な種でもありうる。 ヒトレ／ビエントに対しては、ブタドナーが適切であると考えられるが、他の種 が適切である場合もある。 本発明の第２繋様によると、予定し、ビエント種において補体の完全活性化を阻 止するために活性な１種以上の相同的補体制限因子と会合した、レシピエンド種 に対し５て不調和種であるドナ一種の移植可能な動物細胞又は組織を提供する。 本発明の第３１１１！様では、少なくとも１種の不調和種への移植時に又はこれ の免疫系への！！露時に異種移植片拒絶を生じないような、移植可能な組織を有 するトランスジェニック動物を提供する。不調和種は、動物がらの異種移植片を 通常、超過敏に拒絶する種である。 それ故、本発明はレシピエンド種に対して不調和種であるドナ一種に由来する動 物組織及びレシピエンド種において活性な１種以上の相同的補体制限因子のレシ ピエンド種へ移植可能な組織製造への使用を含む。 本発明の第４９様では、他の種の相同的補体制限因子を表現しうる細胞を有する トランスジェニック動物を提供する。相同的補体制限因子はトランスジェニック 動物の種に対して不調和である種において一般に活性である。細胞は、本発明の 第１態様に関連して述べたような選択性で、１種の特定組織の細胞であるか、又 は２種以上もしくは全ての組織の細胞であり、この場合には動物は２つ以上の組 織のドナーになりうる。このようなトランスジェニック動物は非形質転換（非増 殖性の意味で）細胞の集合（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）と見なされる。 本発明の第５態様によると、動物細胞に関して不調和である種において活性な、 １種以上の相同的補体制限因子を表現しつる非形質転換動物細胞を提供する。 本発明の第６実施態様では、少な（とも１種の相同的補体制限因子をコードする ＤＮＡと、コーディングＤＮＡの非形質転換動物細胞による表現を可能にする１ つ以上の塩基配列とを含む組換え体ＤＮＡを提供する。動物細胞は発生的にこの 構成体を含むトランスジェニック動物の細胞でありうる。代替え手段として、細 胞は培養器官又は例えばランゲルハンス島のような他の器官でありうる。 本発明の第７態様では、動物の遺伝材料に加えてトランスジェニック動物を製造 するために適した遺伝的構成体を提供する、この構成体は少なくとも１種の相同 的補体制限因子をコードするＤＮＡと、この構成体を発生的に含むトランスジェ ニック動物の少なくとも幾つかの細胞におけるコーディングＤＮＡの表現を可能 にする１つ以上の塩基配列とを含む。このような遺伝的構成体はＹＡＣとして知 られる微小染色体の形状でありうる。上記のように、相同的補体制限因子は一般 に、トランスジェニック動物の種に対して不調和である種において活性である。 本発明の第８態様では、動物の遺伝材料に少なくとも１種の相同的補体制限因子 をコードするＤＮＡと、トランスジェニック動物の少なくとも幾つかの細胞にお けるコーディングＤＮＡの表現を可能にする１つ以上の塩基配列とを加えること を含む、トランスジェニック動物の製造方法を提供する。 トランスジェニック動物の製造方法は一般にますます普及しており、行われる詳 細な工程は当該技術分野で現在通常用いられているような工程である。例えば、 国際特許第Ａ３８００２３９号はトランスジェニック動物の構成に原則として必 要な工程を開示する。 トランスジェニック動物の細胞中への構成体の実際の編入方法はミクロ注射によ る、精子仲介編入又は他の適当な方法による。予備的な遺伝操作を一般的に好ま しい原核生物において実施されつる。 ＨＣＲＦをコードするＤ　Ｎ　ＡはｃＤＮＡ形で入手可能であるか、又は通常の クローニング方法を用いて演鐸される。腐食促進因子（ＤＡＦ）をコードするＤ ＮＡは恐らく最も良く特性化されたＤＮＡであり、メドフ等によって述べられて いる［ＰＮＡＳ、旦Ａ、２００７−２０１１　（１９８７）コ。ＲＣＡ遺伝子ク ラスターの物理的地図はレイ−キャンポス等（１９８８）に記載されている（上 記引用文献）。ＤＡＦの変異体と、組換え体ＤＮＡテクノロジーによるそれらの 製造方法はヨーロッパ特許第Ａ０２４４２６７号に開示されており；このような 変異体は本発明に使用可能である。 ＤＡＦの遺伝学とＤＡＦをコードするｃＤＮＡの既知塩基配列とをさらに良く特 性化するために、ＤＡＦは好ましい相同的補体制限因子を構成する。 本発明の第２〜第７態様の他の好ましい特徴は第１態様の特徴に必要な変更を加 えたものである。 本発明を次に下記実施例によって説明する。実施例においては図面を参照する。 図ＩＡ〜ＩＥは実施例１によってブタ新生児へ移植したウサギ心臓の連続的ＥＣ Ｇトレースを示す。 図２は実施例１に用いたブタが有意な量の航程抗体を有しないことを実証する、 ラジオイムノアッセイの結果を示す： 図３は実施例４に用いた、蛋白質電気泳動のある一定の段階を示す：図４は実施 例４に用いた、二次元交差電気泳動のある一定の段階を示す。 図５は実施例４から生ずるｒ２Ｄ−ロケット」を示す：図６は実施例５における クロム放出細胞溶解アッセイの結果を示す：図７は実施例６に述べるような、移 植前（０日）及び移植後５．７及び９日目のハムスター心臓移植片のラットレン ピエントからの溶解抗ハムスター抗体の力価を説明する。 図８はＧ２００フラクシヨンのＯＤをグラフによって示す：このヒストグラムは 実施例６に述べるような、ハムスター心臓のラットレシピエンドからの溶解抗ハ ムスター抗体の各フラクションにおける力価を説明する；図９は実施例７に述べ るような、Ｔ５、ｂｌＯ及びＤＢ３細胞ラインから抽出されたＤＮＡのサザンプ ロットを示す：図１０は実施例７に述べるように、ブタ抗ヒト抗体の存在下でヒ ト補体ではなく、ウサギ補体によってＴ５ヒト細胞ラインが溶解することを実証 する、５１（：ｒ放出図を示す： 図１１は実施例７に述べるように、ヒト抗体がヒト又はウサギ補体のいずれかを 含むＴ５ヒト細胞ラインを溶解できないことを実証する、放出図を示す：図１２ は実施例７に述べるような、ウサギ補体又はヒト補体の存在下でのマウス−マウ ス　ハイブリドーマ（ＤＢ３）をヒト抗体が溶解しうろことを実証する、５１Ｃ ｒ放出図を示す： 図１３は実施例７に述べるように、ヒト−マウス　ハイブリッド細胞ラインＢ１ ０がウサギ補体の存在下でヒト抗体によって溶解するが、ヒト補体の存在下では ヒト抗体によって溶解しないことを実証する、ｆｉｔＣｒ放出を示す：図１４は ＣＨＯ細胞による３Ｈアデニンの摂取（カウント／分間）を示し、これらの細胞 が、実施例８に述べるように、ヒト補体又はウサギ補体の存在下で免疫ラット血 清によって殺されることを示す；図１５はヒトＭＣＰをトランスフェクトされた ＣＨＯ細胞による３Ｈアデニンの摂取（カウント／分間）を示し、これらの細胞 が、実施例８に述べるように、ウサギ補体の存在下で免疫ラット血清によって殺 されるが、ヒト補体の存在下では免疫ラット血清によって殺されないことを示す ；図１６は、図１５に関して述べた環境下で、ヒト補体のＧ３成分が実施例８に 述べるように、開裂されず、Ｃ３ｂを形成しないことを実証するｒ２Ｄロケット 」を示す： 図１７は、ヒト補体の存在下で自然生成抗体による３Ｔ３マウス繊維芽細胞の溶 解と、マウス細胞によるヒトＭＣＰの表現の保護効果とを実証する、ｆｉｔＣｒ 放出図を示す：及び 図１８は、プローブとして標識ＭＣＰ　ｃＤＮＡ（上部）又は標識ＤＡＦ　ｃＤ Ａを用いる第２世代トランスジェニックマウスのＤＮＡスロット　プロット分析 を示す。 一般に、動物は免疫グロブリンの循環なしには生存しえない。免疫グロブリンは 抗原刺激に反応してリンパ球によって産生ずる。しかし、新生任期の初期には、 受動的に移入された母親の免疫グロブリンがこの自己産生抗体の一時的代替え物 として作用する。この受動的に移入された免疫グロブリンは、早期に免疫経験を する子に対して保護を与える。哺乳動物では、母親の免疫グロブリンのこの受動 的移入は通常、経胎盤的に及び初乳を介して生ずる。しかし、幾つかの種では、 胎盤の構造は母親の抗体がこの経路によって移入されないような構造である。ブ タはこのような種の１つである。母親の抗体の全ては初乳から得られる。従って 、新しく生まれた成孔前のブタは、原則として、免疫グロブリンを含まない。　 大型の白ブタを誕生時に入手し、成孔させずに熱水で暖めた木製ケージに入れた 。 各分娩（ｆａｒｒｏｗｉｎｇ）からの２匹のブタを各実験に用いた。これらのブ タは誕生時に約１ｋｇの体重であった。 約３００ｇ体重のニューシーラント白ウサギの我子をドナーとして用いた。これ らのドナーはヒブノールとジアゼパムによって麻酔し、胸部を開き、１９ゲージ 針を用いて大静脈に挿管した。低ａ（＋４℃）カルジオプレギア（トークスＮｏ 、２）を心臓が拍動を停止し、カルジオブレギアによって潅流されるまで注入し た。注射器によって直接低温カルジオプレギアを外部から注入して冷却も行った 。次に、ウサギ心臓を標準外科方法を用いて摘出し、＋４℃のカルジオブレギア 溶液中に必要になるまで保存した。ウサギ心臓は虚血性損傷を非常に受けやすい ことが分かっているので、これらの予防処置が必要であると判明している。 レシピエンドのブタは最初にハロタン１０２吸入によって麻酔した。次に、静脈 内バタフライ（２３ゲージ）針を乳房静脈に挿入し、静脈内ケタミンによって麻 酔を維持した。ブタは同時に生理食塩水の静注によって水和状態に維持した。 血清とＥＤＴＡ血液サンプルを移植前に抽出した。 頚動脈に端部対側面（６−０ブロレン）に吻合し、肺動脈を頚静脈に吻合した。 他の全ての心臓血管を結紮した。心臓はクランプの除去後数分間内に拍動を開始 した。ジアスコープ／ＥＣＧモニターによって心拍数を終始モニターした。ブタ 頚部は実験中閉鎖せず、心臓は粘着性フィルムによるカバーリングによって湿っ た状態に維持した。 ＥＣＧ結果は図ＩＡ〜ＩＥに示す。図ＩＡに示すトレースは移植直後の正常心臓 拍動を示す。機能不全（ｆａｉｌｕｒｅ）は約２０分後に開始しく図ＩＢ）、１ 時間以内に（図ＩＤ）、心臓拍動は検出されなくなり、超過敏拒絶を実証した。 それ故、この実施例は不調和異種移植片の超過敏拒絶が抗体の不存在下でも起こ ることを実証する。 ウサギ抗ブタＩｇＧをダビース（［）ａｖｉｅｓ）とハワード（Ｈｏｗａｒｄ） によって改良された（発表されず）、グリーンウッド（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ）等 、バイオケミカル　ジャーナル、旦旦、１１４−１２３　（１９６３）の方法に よって放射性ヨウ素化した。 下記物質をポリスチレン管（ＬＰ２　６ｃｍＸ１ｃｍ）中に迅速に連続的に加え る： 蛋白質（１ｍｇ／ｍ＋濃度）２５−５０ｕｌＮａ１２５１　（１００ｍＣｉ／ｍ １）３−４ｕｌクロラミン−Ｔ　（＊４ｍｇ１５ｍ１　：　０．５Ｍ）　１０ｕ ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）＊使用前に新たに製造しなければなら ない上記成分を絶えず撹拌しながら３０秒間混合した。次に、下記成分を迅速に 加えた： ＤＬ−チロシン（リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，５０，５ｍｌ中の飽和溶液） ５０μ！ ２％ＢＳＡ／ＰＢＳ／アジド３００μ１次に、標識された蛋白質を非反応ヨウ素 から、ＰＢＳ／アジド中に作成したセファデックスＧ−２５中等級の小カラム８ ｃｍｘ１．Ｏｃｍを用いて分離する。 作成した０２５カラムに、ヨウ素化反応混合物を定量的に移入し、ＰＢＳ／アジ ドによって溶離した。６滴フラクションをポリスチレン管中に回収する。蛋白質 と（＋　２５　）　）ヨウ化物との両ピークが溶離されるまで、カラムを溶離し 、全フラクション中の放射能を測定する。 蛋白質中に含まれる放射能は次のように算出する：蛋白質中の放射能カウント＝ オリジナル総カウント−ヨウ化物ピーク中のカウント 放射性標識１ｇＧ（今後「アイソトープ」と呼ぶ）は、下記のように、新生仔ブ タ中の（ブタ）抗体の分析に用いる：社料 ＰＢＳ十０．０１％アジド　−オックスオイド（Ｏｘｏｉｄ）ＰＢＳ／Ｂ５Ａｌ ％　−ＢＳＡ−ジグ７　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）アイソトープ　−１２−１８ｘｌＯ ’カウント／分を有するウサギ抗ブタＩｇＧ全分子 心臓不活性化血清（５６℃、３０分） 凝固防止血液サンプル 方迭 １、ＰＢＳ中ウサギ赤血球の１％懸濁液を製造し、試験管に１００μ！量を加え た。赤血球をボタン状になるまで回転させ、上澄みを捨てる。 ２、成体ブタ（正の対照）、新生仔ブタ（試験サンプル）又はウサギ（負の対照 ）からのＰＢＳ／ＢＳＡ中に不活性化血清の連続希釈物を製造した。０．０２５ ｍ■量を赤血球ボタンに２通りに加えた。試験管を４℃において４時間インキュ ベートした。 ３、インキュベーション後に、試験管をＰＢＳ／ＢＳＡ中で３回洗浄し、アイソ トープＯ，Ｑ５ｍｌを各試験管に加え、−晩４℃においてインキュベートした。 ４、試験管を３回再洗浄し、ガンマ−カウンターで１分間計数を実施した。 ５、結果を力価に対してカウント数／分としてプロットする。 結果を図２に示す。ウサギ血清は負の対照として用い、成体（すなわち、成孔） ブタを正の対照として用いた。成孔前ブタ２のブタ抗体レベルは負の対照のレベ ルに匹敵する。 バーゲル（Ｂｕｒｇｅｒ）等［ヨール、ジエイ、イムツル、（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、）１６．７−１１　（１９８６）］によって述べられている系統か らの補体欠損モルモットに実施例１のウサギ−ブタ異種移植片に関して述べた方 法と本質的に同じ方法を用いて心臓を移植した。ラットはエーテル吸入によって 麻酔し、心臓をカルジオブレギアによって冷却してから、既述したように摘出し た。 モルモットを静脈内ヴアリウムと筋肉内ヒブノールとによって麻酔した。心臓を 既述したように、頚部に移植した。対照のモルモット、すなわち、正常補体レベ ルのモルモットに対しては、移植片拒絶が数分以内に生じ、頚部閉鎖を不必要に した。実験動物では、頚部を閉鎖し、心臓を１日２回触診によって監視した。 術後数時間は正常ＥＣＧが観察され、超過敏拒絶が生じないことを示した。 グラバ−（Ｇｒａｂｅｒ）とウィリアムス（Ｗｉ　１１　ｉ　ａｍｓ）の方法［ ぴイーオチム　バイオフィズ、アクタ、（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ ｃｔａ。 ’）１０，１９３　（１９５３）］に従って、アガロースゲル１ヲ８ｘ８ｃｍガ ラスプレート上に注入した（図３）。ゲル混合物１０ｍ１が必要であり、これは ２％アガロース５ｍｌとヴエロナール緩衝液（ＶＢ）５ｍｌから構成された。（ ＶＢは７５ｍＭ　Ｎａバルビトン、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＮａＮ５． ｐ）Ｉρ５である）。アガロースとＶＢは使用直前に６０℃において混合した。 ゲルをレベルプラットフォーム上に注入し、冷却した。硬化したときに、ゲルは １％アガロースから成り、約１．５ｍｍの深さを有した。 直径３ｍｍの孔３をゲルの１端部から約１ｃｍにカットした。各孔は被処理サン プル約８μｌを含有可能であった。サンプルは着色のための充分なブロムフェノ ールブルーの添加以外に特定の製剤を含まなかった。サンプルの塗布後に、ゲル を細心に電気泳動タンクのプラットフォームに乗せた。次に、〜’Ｂ（ランニン グ緩衝液）に浸した綿ガーゼで孔に密接するゲルの縁に沿って押圧し、別のガー ゼでアガロースの対立縁を押圧した。（ガーゼの端が緩衝液タンク中に浸漬する ことが重要である）１３次に、２５〜３０ｍＡの電流をアルブミン（ブロムフェ ノール結合によって目視可能）が正（陽極）ガーゼに達するまでゲルに通した。 このプロセスは約２時間半〜３時間を要する。２種以上のゲルを同時に、平行し て処理する場合には、印加電流はそれに応じて増加しなければならず、２種ゲル は５０ｍＡを要し、３種ゲルは７５ｍＡを要する、等である。 ゛ブロムフェノールブルーによって目視可能になった、アルブミンマーカー９の 移動によって示唆される電気泳動終了時に、ゲルを電気泳動タンクから取り出し た。 Ｂ２−迭ｊり１魯★ｌひ１ （Ａ　）からの電気泳動蛋白質を含むストリップ１１（図４）をカットして、新 しいガラズブ１ノ〜ト１３の１端に置いた。可視化蛋白質に対する約１％抗血清 を含む、２％アガロ・−ス　ＶＢの１１混合物１５をプレート上に注入し、硬化 させた。抗血清をアガロース／ＶＢＳ混合物に、これが約５０℃の温変に冷却さ れたときに加えた。 次に、ロケットプレートを上述したように電気泳動させ、１次元ストリップを含 むゲルの端部は綿ガーゼを介して負の電極（陰極）１７に結合し、反対端部は陽 極１９に結合する。ゲルをゲルのサイズに依存する電流で一晩電気泳動させた、 各８ｃｍ長さのゲルには１０ｍＡが必要であり、１６ｃｍ長さのゲルは２０ｍＡ を必要とする、等である。 蛋白質は１次元電気泳動によって分離し、定量され、２次元電気泳動によって可 視化される、次に、可視化のための染色を説明する。 このはうほうは通常の免疫電気泳動又はロケットと同じである。染色すべきゲル を、水で予め湿らせた、１層の繊維を含まないＰＯ８ＴＬＩＰ（商標）ベーパー ［アトラード　エバンス社（Ａｄｌａｒｄ　Ｅｖａｎｓ＆Ｃｏ、）コでカバーし た。次に、これを６層の吸収性ベーパータオルでカバーした。この集積体を１時 間かけて潰し、その後全水分を除去し、プロセスを繰り返した。 第２回潰し後に、ゲルを温風下で乾燥させ、ＰＢＳ中に少なくとも１時間浸けて 非沈降蛋白質を除去した。ゲルを再び乾燥させ、０．５％Ｗ／Ｖクーマシーブリ リアントブルーＧ２５．４５％Ｈ７○、４５％メタノール、１０％酢酸の溶液中 で１０分間染色した。 ゲルを２０％メタノール、６％酢酸中で、下地が透明になるまで連続洗浄して、 脱色した。最後に温風下で乾燥させた。 図５は乾燥ゲルの再現である。ロケット１は正常ヒト血清（ＨＨ３）５０μｌ＋ １０ｍＭＥＧＴ、Ａを含むＶＨ３２５μＺを含む負の対照である。ＥＤＴＡはカ ルシウムを除去するキレータ−である：カルシウムは古典経路補体活性化に重要 であるので、ＥＤＴＡの存在は補体が代替え経路のみによって活性化されうるこ とを保証する。左手（大きい）ピークはＣ３であり、右手（小さい）ピークはＣ ３ｂ１（活性化Ｃ３の分解生成物）である。そわ故、対照では、少量のＣ３ｂ１ は補体活性化がごく軽度であることを示す。 ロケット２では、７５％ブタ赤血球（Ｖ　／　Ｖ　）を緩衝液カクテルに加えた 。Ｃ３ｂ１レベルの恐らく有意ではない僅かな増加が生じるので、これはブタ赤 血球が、活性化するとしても、ごく僅かに代替え経路によってヒト補体を活性化 することを示唆する。この低反応性の理由は明らかではない。 ロケット３と４では、７５％ブタリンパ球（Ｖ／Ｖ）又は７５％ブタ腎臓細胞を 、それぞれ緩衝液カクテルに加えた。各場合に、Ｃ３ｂ１レベルの適当な増加が 生じる、ブタリンパ球によるヒト補体活性化を示唆する。 ブタ補体、ウサギ我子補体又はヒト補体のいずれかの存在下でのヒト血清二件介 細胞溶解を、クロム放出アッセイを用いて監視した。 材料 リンパ球分離媒質　−フローラプス（Ｆｌｏｗｌａｂｓ）ＲＰＭ１１６４０＋１ ０％不活性化ＦＣ８ＰＢＳ　（アンドなし）　−オクスオイド■孔ブレート　− ステリリン（３１ｅｒｉｌｉｎ）ウサギ我子補体リンパ球−血清−ｊａｂ−又は ヒトもしくはブタ補体（ＲＰ〜１１中で希釈１＋７） 熱は血清を不活性化する（５６℃、３０分）方法 １、ＰＢＳ中で１１に希釈した脱フィブリン化ブタ全血を同量のフィコールハイ バーク（Ｆ　ｉ　ｃｏ　］　ｌ　Ｈｙｐａｑｕｅ）リンパ球分離媒質上に積層し た。 試験管を２０℃において３０分間１２００ｇで開店させた。 ２、界面に生じたブタリンパ球を取り出し、ＰＢＳ中で１回洗浄した。ボタンを ＲＰＭ１１６４０中に再懸濁させ、細胞カウントを２ｘｌＯ’／ｍ＋に調節した 。 ３、”Ｃｒ２００μＣｉを細胞の２Ｘ１０’ペレツトに加え、室温において１５ 時間インキュベートした。 ４　標識細胞を５分間、９００ｇにおいて２回洗浄し、ＲＰＭＩ中で最終細胞カ ウント１ｘｌＯ’／ｍｌを与えるように調節した。 ５２通りの連続希釈物としての試験下の不活性化血清０．Ｑ５ｍｌ量を対照と共 にプレートアウトした。希釈補体を０．Ｑ５ｍｌ量で該等孔に加え、次に標識細 胞０．０５ｍ１を加えた。プレートをＣＯ２オーブン中で３０℃において１時間 インキュベートする。 ６、インキュベーション後に、プレートを２０℃、９００ｇにおいて１５分間回 転させて、細胞を沈降させた。上澄み１００μｌを標識試験管中に取り出し、ガ ンマ−カウンターで１分間計数を実施した。 ７、結果を力価に対してオリジナル標識細胞のカウントの％としてプロットする 。 対照 完全放出対照（ＦＲＣ）　−細胞５０μｉ’＋Ｈ２Ｏ１００μｌ＋０．１％＋Ｔ 負の対照　−細胞５０μｆ＋ＲＰＭＩ　１００μ！補体対照（ＣＣ）　−細胞５ ０μ！＋希釈補体５０μｚ＋ＲＰＭＩ　５０μ！結果 結果は図６に示す。ブタリンパ球が非ブタ（すなわち、ウサギ又はヒト）補体の 存在下でのみヒト血清によって溶解され、ブタ補体の存在下では溶解されないこ とが分かる。干渉は、ブタ細胞上に存在する１種以上の相同的補体制限因子がブ タ補体の作用を上首尾に負調節するが、ヒト又はウサギ補体の作用を負調節しな いことである。 実施例に の実施例の目的は抗体が超過敏拒絶を生じうることを実証することである。 本出願が根拠とする概念は、超過敏拒絶が抗移植片抗体の不存在下で生ずるが機 能的補体を必要とするという観察の結果として生じた。これは新規な観察である ので、抗体が異種移植片拒絶を生ずることを本式に実証する文献では実験が存在 しない。自然生成抗体の存在下ではこれらの抗体が関係するのか否かを判断する ことが困難であり、このような実験の実施は容易ではない。この実施例では、調 和異種移植片を適当な特異性を有する抗体の注入によって不調和異種移植片に変 えることによって抗体の役割を実証した。この研究に用いたレシピエンドはＰＶ Ｇ種系統（ＲＴＩＣ）の雄ラット［パンチング　アンド　キングダム（Ｂａｎｔ ｉｎｇ　＆　Ｋｉｎｇｄｏｍ）、英国、オキソン、パイセスターコ生後３〜６カ 月、体重２５０−３００ｇであった。心臓ドナーはパンチング　アンド　キング ダムから入手される、体重１００〜１５０ｇのシリア　ハムスターであった。心 臓移植はヘロンの方法（実施例１における上記引用文献中）に従って実施した。 ハムスターの心臓をラットの頚部に移植して、カフ（ｃｕｆｆ）方法によって大 動脈を頚動脈に吻合し、肺動脈を頚静脈に吻合した。他の全ての心臓血管を結紮 した。心臓は血管クランプの除去後数分間内に拍動を開始し、外部触診によって 監視した。全ての手術はハロタンと酸素の吸入によって麻酔した動物に対して実 施した。 抗ハムスター溶解抗体レベルを下記のように測定した：１％ハムスター赤血球溶 液５０μｌを連続的に予め希釈した試験血清５０μｌに加えた。ウサギ乳層補体 ［セラ　ラブ（Ｓｅｒａ　Ｌａｂ）、クララレイ　ダウン、サセックス］の１／ ７希釈物５０μ！を加えて、３７℃において１時間インキュベートした。補体固 定希釈剤７５０μｌを加え、遠心分離した（ベックマン、ＭＩＣＲＯＦＵＧＥ、 １３０００ｒｐｍ、４分間）、この後に上澄み中の○Ｄ４，５を測定した。［Ｍ ＩＣＲＯＦＵＧＥなる用語は商標である］。正の対照と負の対照はそれぞれ、細 胞の１％溶液に加えるＣＦＤと蒸留水であった。０Ｄ４１５読取りの結果をＸ軸 上の血清力価に対してプロットした。図７から明らかであるように、ラットへの ハムスター心臓の移植は非常に高い力価の溶解抗ハムスター抗体を産生ずるラッ トを生ずる。これらのラットの一部からの血清を標準カラムクロマトグラフィ一 方法を用いてセファデックスＧ２０Ｏｒファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃ　１ａ ＧＢＬｔｄ、）、ロンドン］上のカラムクロマトグラフィーによってそれらの成 分蛋白質フラクションに分離した［「生物学的材料の分離、精製及び特性化にお けるセファデックスの使用（Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆ　５ＥＰＨＡＤＥＸ　ｉｎ　 ｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎ、ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａ ｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ） 、力４１７−４８４　（ジー、エイ、ケルカット（Ｇ、Ａ、Ｋｕｒｋｅｔ）編集 、アカデミツクプレス　ロンドンおよびニューヨーク、１９７０］。（ＳＥＦＡ ＤＥＸなる用語は商標である）。カラムから回収される各７ｍｌフラクションを 、上述のように、溶解抗ハムスター抗体に関して分析した。図８は、これらの抗 体が心臓移植の結果として誘導されたという事実にも拘わらず、航程活性が殆ど 排他的にＩｇＭフラクションに存在することを実証する。活性の検定後に、ｃＸ 限外フィルター（ファルマシア）を用いて、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度に濃縮して、 使用するまで一７０℃に保存した。 赤血球溶解とは対照的に、異種移植片を破壊するそれらの能力を試験するために 、ハムスター心臓を特定の実験を受けたことないラットの頚部に移植した。 ハムスター心臓の拍動が確認されるや否や、溶解抗ハムスター抗体を含む、ニー ト血清２ｍｌ又は精製免疫グロブリン０．５ｍｇのいずれかをラット静脈内に注 入した。非分離血清とＩｇＧｏ、５ｍｇの両方は１５分間以内にハムスター心臓 移植片の破壊を一致して生じた。ＩｇＧ注入からの結果は移植片破壊を生ずる幾 つかの標本の結果と不一致であったが、他の標本では移植片は拍動を続けた。０ ２００カラムからのアルブミンを対照として注入した場合には、心臓移植片は常 に生残し、このモデルの標準時間（３日間）後に拒絶された。このことは移植片 へのこの抗体の結合がその超過敏破壊を誘導しうることを実証する。 実施例７ 本出願に今まで述べたデータは、異種移植片破壊が代替え経路又は抗体仲介補体 活性化（古典経路）のいずれかによる補体活性化に関連することを実証した。 さらに、異種移植片ターゲットの表面上の補体レギュレーターは異種補体ではな く相同的補体による破壊から異種移植片を保護することができる。両補体活性化 経路に共通した決定的な活性化工程は補体成分Ｃ３の開裂である。この開裂はＣ ３コンバーターゼ、Ｃ４ｂ２ａ　（古典経路Ｃ３コンバーターゼ）、又はコンバ ーターゼＣ３ｂＢｂ　（代替え経路コンバーターゼ）によって生ずる。これらの 酵素はＣ３−Ｃ３ｂを開裂し、Ｃ３ｂは次に代替え経路に関係して、さらに多く の０３コンバーターザを形成する（フィードバック回路）。この結果、補体系は 「異種」ターゲット上へのＣ３ｂ付着を迅速に増幅することができる。しかし、 Ｃ３ｂの多くは異種ターゲットと充分に相互作用することができず、流体相中に 留まり、ホストの細胞に無差別に結合しうる。これらの細胞を補体の無差別結合 によるアタックから保護するために、流体相中の又は自己組織に結合した補体成 分を不活化するために制御蛋白質が開発されている。Ｃ３制御に関係する糖蛋白 質は発生的に全てが、ＲＣＡ　（補体活性レギュレーター）座と呼ばれるヒト染 色体１の１領域内に関係する。この例では、融合方法によりヒト染色体１を獲得 し、それらの表面にＲＣＡ座の蛋白質を表現するマウス細胞が、異種移植片破壊 のインビトロアッセイにおいて、あたかもヒト細胞であり、マウス細胞ではない かのごとく挙動することを実証する。 細胞ライン Ｔ５は、バード（Ｂ　ｉ　ｒ　ｄ）等の方法によって製造された、イブスタイン 　パル（Ｅｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒ）ウィルス形賞転換扁桃Ｂ細胞ラインである ［ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）２８旦、３００−３０１１　。ＢＩＯはマウス黒 色腫細胞ラインＸ６３−ＡＣ３，６５３とヒトＢリンポプラストイド（Ｉｙｍｐ ｈｏｂＩａｓｔｏｉｄ）ライン（ＢＬＬ）との融合に由来するハイブリドーマを 産生ずるヒト抗−破傷風モツクローナル抗体である［キールネイ（キールネイ） 等、ジェイ、イムツル、１２３．１５４８−１５５０　（１９７９）コ。Ｔ５と ＢＩＯ細胞ラインは、ＭＲＣＭＩＴＩグループ（バブラハム、ケンブリッジ）の エムエスン−カーター（ＭＳ　ＣＣａｒｔｅｒ）とエヌ　シー　フッフスージョ ーンズ（Ｎ　ＣＨｕｇｈｅｓ−Ｊｏｎｅｓ）博士から入手可能である。ＤＢＳは 抗プロゲステロンモノクローナル抗体を産生ずるマウスハイブリドーマ細胞ライ ンである［ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）等、ネイチャー、２９５．４１５−４１７　 （１９８２）］。ヒト染色体１に対して特異的である下記オリゴヌクレオチドブ ライマーが得られた：　（５’−ＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＡＣＡＴＴＧＴＧＴ− ３°）［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１］及び（５’　−ＧＡＧＡＴＡＧＴＧＴＧＡＴ ＣＴＧＡＧＧＣ−３’　）［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２］　；：れらは、それぞれ 、ヒト染色体１上にあると知られているヒト抗トロンビン２　（Ａｒ１）遺伝子 の上流プライマーと下流プライマーである［ウー（Ｗｕ）等、ヌクル、アシトス 　レス（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１７　６４３３（１９８９）］。オリ ゴヌクレオチドは当該技術分野に熟練したヒトに周知である方法によって合成す ることができる。 高分子量ゲノムＤＮＡはヘルマン（Ｈｅｒｒｍａｎｎ）とフリシャラフ（Ｆｒｉ ｓｃｈａｕｆ）の方法を用いて製造した［メソトス　エンザイモル、（Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）１５２　１８０−１８３（１９８７）］。要約する と、各細胞ラインからの１００ｘｌＯ’細胞をＴＮＥ　（１００ｍＭ　Ｔｒｉ　 ５ｐＨ７，５，１００ｍＭ　ＮａＣ］、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　１％サルコシル） ５ｍｌによって溶解して、新鮮なブロティナーゼＫ（１００マイクログラム／ｍ １）によって処理した。標本をフェノール（水飽和及び０．１ＭＴｒｉ　ｓ、ｐ Ｈ８に対して平衡化）、フェノールクロロホルム（１：Ｌ　ｖ／ｖ）及び次にク ロロホルムイソアミルアルコール（２４：Ｌ　ｖ／ｖ）によって抽出した。ＤＮ Ａをエタノール沈降によって得て、ＮａＣ１中で１００ｍＭにしたＴＥ（１０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，０１１ｍＭ　ＥＤＴＡ）と４℃におけるＴＥ単独に対し て透析した。単離ＤＮＡを０５％アガロースゲル上で分析し、濃度を２６０ｎｍ における光学密度によって測定した。各細胞ラインのポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）をサイキ（Ｓａｉｋｉ）等［サイエンス、２３９．４８．７−４９１　（ １９８８）コが述べているように実施した。ゲノムＤＮＡ５００ｎｇ、各プライ マー１．２ｎｇ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ［サーモス　アクアティカス（Ｔ ｈ　ｅ　ｒｍｏ　５ａｑｕａｔ　１ｃｕｓタイプ３コ　［カムビオ社（Ｃａｍｂ ｉｏ　Ｌｔｄ、Ｌ英国、ケンブリッジ］を含む１００μ！量中に、緩衝液を用い て酵素を供給した。 ヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）［ベーリンガー　マンハイム　ジアグノスチックス アンド　バイオケミカルス社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｄｉ ａｇｎｏｓｉｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｌｔｄ、）、英国、 サセックスコは各２ｍＭの濃度であった。ＤＮＡをプログラム可能なサーマルコ ントロラー（ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）Ｅシネチック　リサーチ インストルメンテイション社（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｒ ｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｌｔｄ、）、英国、サセックス、ダンモウコを用いて、 ３０サイクルに増幅し、９３℃で１分間変性し、５５℃で１分間アニーリングし 、７２℃で２分間延伸（ｅｘｔｅｎｓ　１ｏｎ）した。反応生成物１０ｔｔｌ！ をＴｒｉＳ硼酸ＥＤＴＡ緩衝液中で処理される２％アガロースゲル上で直接分析 した。生成物サイズはＨｉｎｃＩＩ消化ファージＸ−１７４−ｒｆ　ＤＮＡ　［ ファルマシアＬＫＢ　バイオテクノロジー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏ　ｌ　ｏｇｙ）　、スウェーデン、アブサラ］との比較によって 測定した。 培養Ｔ５、ＢＩＯ及びＤＢ３を抗ＤＡＦ　（腐食促進因子）モノクローナル抗体 ［キノシタ（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ）等、ジエイ、イクスブ、メト、（Ｊ、Ｅｘｐ 。 Ｍｅｄ、）　、１６２．７５−９２　（１９８５）］とフルオレセイン標識第２ 抗体とによって処理した。細胞（１ｘｌＯ’）をマウス抗ＤＡＦモノクローナル 抗体ｌＡｌ０　ｒ１０％ＦＣ８０，１％アジド中、ＩｇＧ２ａ　１０μｇ／ｍｌ コと反応させた。ｌＡｌ０　［キノシタ等、ジェイ、イムツル、１３６．３３９ ０〜３３９５　（１９８６）］　＋Ｌ　米国　ニューヨーク、ニューヨーク大学 メディカルセンターのエム　ダビツ（Ｍ、　Ｄａｖ　ｉ　ｓ）博士から入手した 。ブランク対照はバッファー単独であった。氷上で２時間インキュベートした後 に細胞を３回洗浄し、１／１００ＦＩＴＣ結合ヤギＦ　（ａｂ’　）　２抗マウ スＴＧ（重鎮及び軽鎖、アフィニティ精製及びヒトＩＧ吸収）［タボ　イムノケ ミカルス社（Ｔａｇｏ　１ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｆｃａｌｓ　Ｉｎｃ、）米国、カ リフォルニア州、ベーリンガム］を含む緩衝液１００μ！中に再腎濁し、水上で １時間インキュベートした。一部の細胞は染色対照としての第２抗体のみと共に インキュベートした。ＤＢＳはマウスＩｇＧ分泌細胞ラインであるので、ＤＢＳ 細胞を染色する場合に生ずる抗ＩｇＧ反応性を除去するために、等量のＤＢ３細 胞によって予め吸収されたＦＩＴＣ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ２Ａ　［１／４０ 、ザ　バインディング　サイト社（Ｔｈｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ　Ｌｔｄ 、）、英国、バーミンガム］又はヤギ抗マウスＩＧも用いた。全ての細胞を徹底 的に洗浄し、緩衝液２００μｌ中に再懸濁させた。蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣ ８）分析のためのベクトン　ジキンソン（Ｂｅｃｋｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ）ＦＡＣ８−８Ｔ、ＡＲ装置を用いてＤＡＦ陽性細胞を検出した［ＦＡＣ８＝Ｓ ＴＡＲなる表現は商標であるコ。 ＰＣＲ方法を用いて、３種類の培養細胞ライン、Ｔ５（ヒト）、Ｂ１０（ヒト− マウス）及びＤＢＳ　（マウス−マウス）におけるヒト染色体１の存在を検出し た。図９は、増幅後にＴ５とＢＩＯの両方が４９５塩基対のバンドサイズを有す るが、ＤＢＳ　（すなわち、マウス−マウス　ハイブリッド）は全（バンドを有 さないことを示す。ＡＴＳプライマーを用いるＰＣＲ産物は５７２塩基対（対立 遺伝子１）と４９６塩基対（対立遺伝子２）のサイズである２対立遺伝子から成 ることが報告されている（ウー等、上記引用文献）。Ｔ５とＢＩＯゲノムＤＮＡ 中に見い出されるバンドは対立遺伝子２に相当する。このことはヒト　マウス　 ハイブリッド細胞ラインＢ１０はヒト染色体１を含有することを示す。 Ｄ　Ａ　Ｆの存在のＦＡＣ３分析は、ヒトＴ５細胞の過半量（８５，７％）は抗 ＤＡＦモノクローナル抗体によって陽性に染色されることを示した。同様なレベ ル（８３１％）の陽性細胞がマウス／ヒト　ハイブリッドＢＩＯ細胞中に発見さ れた。マウス−マウス　ハイブリッドＤＢ３細胞は抗ＤＡＦ処理標本と非処理標 本の両方に対して同じ染色パターンを示した。しかし、この抗マウスＩｇＧ反応 性は、（１）ＦＩＴＣ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ２ａを用いた場合に、又は（２ ）上記ヤギ抗マウスＩｇＧがＤＢ３細胞によって予め吸収された場合には除去さ れた。この結果は、特異的抗ＤＡＦモノクローンナル抗体によって検出されるよ うに、ヒト−マウス　ハイブリッド細胞ラインＢＩＯが細胞膜表面上にヒトＤＡ Ｆを表現することを実証する。表現レベルはヒト細胞ラインＴ５の表現レベルと 同じである。マウス−マウス　ハイブリドーマ細胞ラインはヒトＤＡＦを表現し ない。 これらの細胞ラインに対して、上記実施例５で述べたように、クロム放出細胞毒 性細胞溶解試験を実施した。図１０は、ブタ抗ヒト抗体をＴ５ヒト細胞ラインと 共にインキュベートした場合に、ウサギ補体の添加が溶解を生ずるが、ヒト補体 を添加した場合には、溶解が生じないことを示す、この理由は、当然、Ｔ５細胞 ラインがヒトＨＣＲＦを有するからである。ヒト抗体をヒト細胞ラインに用いる 場合には、ヒト補体又はウサギ補体のいずれによっても溶解は生じず、自己抗体 が生じないことを示す。クロム放出方法は、ウサギ補体のヒト細胞による代替え 経路活性化の有意なレベルの検出を可能にするほど長い、インキュベーション持 続を可能にしない（図１１）。しかし、ヒト抗体をＤＢ３マウス−マウス　ハイ ブリドーマ細胞ラインと共にインキュベートする場合には（図１２）、細胞溶解 はウサギ補体及びヒト補体の両方によって達成され、このことは実際にヒト補体 がこのような方法で機能しうろことを実証する。ヒト染色体を有し、少なくとも ＤＡＦを有することが分かっているＢＩＯヒト−マウス　ハイブリッドを用いる 場合には、ウサギ補体は細胞ライン溶解を生じるが、ヒト補体は細胞ライン溶解 を生ずることができない（図１３）。これの説明は、マウス−ヒト　ハイブリッ ド上に染色体１を有することによって表現されるヒトＨＣＲＦがヒト補体の活性 を阻害することである。 実施例８ 前記実施例は、染色体１を有することが異種移植片細胞の破壊を阻止しうろこと を実証する。これはマウス細胞を異種移植片破壊から保護するのはＣＲＡ座であ るという強い環境証拠であるが、この実施例では、非ヒト細胞ラインをヒトＭＣ Ｐによってトランスフェクションし、ヒトもしくはウサギ補体に暴露させること の効果を実証する。 ルプリン（Ｌｕｂｒｊｎ）等［ジェイ、イクスプ　メト、１６８　１８１−１９ ４　（１９８８）］が詳述しているように、ｃＤＮＡはＭＣＰに対して産生する 。 トランスフェクトされた細胞ラインの構成はウールブリッジ（Ｕｈｌｂｒｉｇｇ ｅ）等が述べる方法［ブロク　ナトル　アカド　サイ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　］ Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、８５．５６４９−５６５３　（１９８８）］によって表 現プラスミド５ＦＦＶ、ｎｅｏを用いて実施した。これはフレンド膵臓フォーカ スを形成するウィルス５°長末端繰り返し配列（ＳＦＦＶ、ＬＴＲ）を含む［ク ラ０３７−５０４１　（１９８３）］。細胞ラインは米国、メリーランド州、ロ ックビルのアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション　１２３０１　パー クラーン　ドライブから入手された。使用細胞ラインはＣＨＯ−ＫＩ　（ＡＴＣ ＣＣＣＬ　６１）とＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５８）であった。遺 伝子の表現はＭＣＰに対するモノクローナル抗体［アンドリュウス（Ａｎｄｒｅ ｗｓ）等、アン　ハム、ジ不ト、（Ａｎｎ、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、）４９．３ｌ −３９（１９８５）］と、ＦＡＣ８分析とを用いて、既述したように、確認した 。ある場合には、標準方法を用いてＦＡＣ８での細胞分類（ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔ ｉｎｇ）によってＭＣＰの高レベル表現に関して細胞ラインを選択した。 この実施例はＭＣＰによってＣＨ○細胞をトランスフェクトする効果を説明する 。これらの細胞ラインは単層として成長するので、細胞溶解はデ　ボッ（ｄｅよ うな、末端アデニン摂取アッセイによって評価した。要約すると、このアッセイ は平底滅菌９６孔プレート中での補体及び抗体と共にの細胞培養物のインキュベ ーションを含むものであった。この実験インキュベーション期間の終了時に、細 胞生存度を培養物が放射性アデニンを吸収する可能性によって評価する。生存細 胞はアデニンを吸収するが、死亡細胞はアデニンを吸収しない；従って、生存細 胞は高カウントを有し、死亡細胞は低カウントを有する。 多くの形質転換細胞に共通して、ＣＨＯは自然生成抗体及び補体の代替え経路の 作用に対して非感受性である。しかし、これらの細胞は、実施例６で述べたよう にハムスター心臓異種移植片破壊を実証されたように生ずる抗体に対しては感受 性である。ＣＨＯ細胞はハムスターから誘導されるので、これらの細胞はヒト及 びウサギの両補体を含むＣＨ○細胞を殺した（図１４）。ＣＨＯ細胞をヒトＭＣ Ｐによってトランスフェクトする場合に、細胞はウサギ補体の存在下でのみ溶解 しつる。ヒト補体はハムスター細胞表面上のヒトＭＣＰの存在によって阻害され た（図１５）。細胞が殺されないことが実際にはＣ３コンバーターゼの欠損によ ることの証拠は、上記実施例４に述べたようなロケット免疫電気泳動によるＣＨ ○細胞インキュベーション後のヒトＣ３の分解の分析によって与えられる。理解 されるように、補体制御のみのレベルを越えては分解が生じない（図１６）。 上記データは非ヒト細胞の表面上の遺伝子工学補体負の調節蛋白質がこれらの細 胞を、共通特徴として補体の０３成分の開裂を必要とする、超過敏な異種移植片 破壊機構から保護することを確証する。 実施例９ 実施例８の方法に従って、３Ｔ３マウス線維芽細胞をＭＣＰをコードするｃＤＮ Ａ（ＭＣＰクローンに５．２３）によってトランスフェクトした。５１（：、を 実施例５に述べられているように細胞に加えた。次に細胞１量をヒト熱不活性化 補体１量と、ヒト補体から抗マウス抗体を除去するためにマウス膵臓細胞によっ て４℃において予め吸収させたヒト補体１量と共にインキュベートした。この混 合物と補体による連続希釈物とをプレートアウトした。クロム放出アッセイの一 般的条件と特徴は実施例５に述べる通りである。クローンに５．２３の結果を図 １７に示す、図１７は対照として逆配向で導入されるＭＣＰ（この場合には、転 写されない）の効果をも示す。正確に転写されたＭＣＰ　ｃＤＮＡは比較的低レ ベルの５１（ｒ放出によって実証されるように、細胞を溶解から阻止するが、非 転写ｃＤＮＡは比較的高いレベルの５１（：ｒ放出によって実証されるように、 有意な保護を与えない。 実施例１０ 上記実施例８に述べた結果と同様な結果がＤＡＦに対するｃＤＮＡによってトラ ンスフェクトしたＬＬ／２１０（マウス白血病細胞ライン）によって得られる。 ルプリン（Ｌｕｂｌｉｎ）とアトキンソン（Ａｔｋｉｎｓｏｎ）［アン、レブ工 Ｌ））ｂ、７．３５−５８　（１９８９）］に述べられているようにＤＡＦに対 して産生された。 実施例１１ ＭＣＰに対するｃＤＮＡを調製し、上記実施例８におけるように５ＦＦＶ、ｎＣ Ｏに結合させた。 このＤＮＡ標本を用いて、ビー、ホーガン（Ｂ、Ｈｏｇａｎ）等が「マウス胚の 操作、実験室マニュアル（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙ ｏ、ＡＩ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）Ｊ、コールド　スプリングハー バ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ）（１９８６）に述べているように、トランスジェニック　マウスを製造 した。１０〜１５匹の（ＣＢＡＸＢＩＯ）ｆ−ユ雌マウス、生後３−４週間、を 、妊娠雌ウマからの血清ゴナドトロピン［フォリゴン（Ｆｏ　１１　ｉ　ｇｏｎ ）とり、て商業的に供給］５単位の腹腔内注入と４８時間後のヒト妊婦尿からの 絨毛膜ゴナドトロピン［コルロン（Ｃｈｏｒｕｌｏｎ）として商業的に供給コ５ 単位の腹腔内注入とによって誘導して、排卵過剰にした。コルロン注入日に、こ れらの雌を（ＣＢΔλ工］追ΣＴ」−雄と交尾させ、翌日膣プラグを有する雌を 頚脱臼によって殺し、受精卵をそれらの卵管から単離した。 このようにして単離された３００〜４００個の卵はノマルスキー（Ｎｏｍａｒｓ ｋｉ）示差干渉コントラストオブチンクス下で４００倍率において明確に目視可 能な生殖核２個を含んだ。２個の生殖核の１つに０５〜２ｎｇ／μｌの濃度範囲 内のＭＣＰ　ｃＤＮＡトランスンーンジーンｒａｎｓｇｅｎｅ）を含むＤＮＡ標 本の約２０００コピーを注入した。 このミクロ注入に耐えて生き残る卵を、前賓精管切除雄と交尾させ、偽妊娠した （ＣＢＡＸＢ］、０）Ｆ１雌（すなわち、これらの雌は排卵し、これらの雌のホ ルモン状態は妊娠雌のホルモン状態であるが、これらの雌の卵細胞は受精してい ない）の卵管に再移植した。約２０個のミクロ注入卵をミクロ注入の同日に又は 翌日の卵が２卵期であるときに麻酔下の各偽妊娠雌の卵管に移した。正常妊娠が 後で生じ、１０匹の母親から１７匹のマウスが生まれた。仔のスクリーニングを スロット　プロット及び／又はサザン　プロットによって（実施例８参照）、及 びＰＣＲ，尾皮膚細胞からのＤＮＡの分析によっても、トランスジーンを識別す る３２ｐ標識プローブ及びプライマーを用いて実施した。仔の１匹、雄はＭＣＰ ＤＮＡ塩基配列に対してトランスジェニックであることが実証された。 実施例１２ 実施例１０に述べたような、ＤＡＦに対するｃＤＮＡをＭＣＰに対するｅＤＮＡ の代わりに用いたこと以外は、実施例１１の方法を繰り返した。１０匹の母親か ら２３匹の仔が生まれた。これらの中の３匹（雌２匹、雄１匹）、ＤＡＦに対し てトランスジェニックであり、サザン　プロットによって示すように得られた。 実施例】３ ヒトＭＣＰ　ｃＤＮＡＪランスジーンを含む、実施例１１において得られた雄マ ウスを成熟するまで成長さｆ、（ＣＢＡＸＢＩＯΣＦｌ雌と交尾させた。１１匹 の仔が得られた。各層からの尾細胞ＤＮＡを、プローブとして標識ヒトＭＣＰｃ ＤＮＡを用いて、スロット−プロット分析によってスクリーニングして、トラン スジーンが遺伝されたものであるか否かを決定した。結果は図１８の上部に示す 。仔０．１．５．７．８及び１０は遺伝を受けたことが認められる。（４対照を 用いた：ヒトＤＮＡ　（Ｈ）；？ウスＤＮＡ　（Ｍ）；ヒトＭＣＰ標識ｃ　ＤＮ Ａｌｏｐｇと混合したマウスＤＮＡ及びヒトＭＣＰ標識ｃＤＮＡ　１０ｐｇと混 合したマウスＤＮＡ） 実施例１４ ヒトＤＡＦ　ｃＤＮＡトランスジーンを含む、実施例１２において得られた雄マ ウスを成熟するまで成長させ、（ＣＢＡＸＢＩＯ）Ｆｌ雌と交尾させた。得られ た各層の尾細胞ＤＮＡを、プローブとして標識ヒトＭＣＰｃ１’）ＮＡを用いて 、スロット−プロット分析によってスクリーニングして、トランスノーンが遺伝 されたものであるか否かを決定した。結果は図１８の下部に示す。仔１３．３（ 雌）は遺伝を受けたことが認められる。（４対照を用いた・ヒトＤＮＡ　（Ｈ） ：マウスＤＮＡ　（Ｍ）；ヒトＤＡＦ標識ｃＤＮＡ　１１０１）と混合したマウ ７．ＤＮＡ及びヒトＡＤＦ標識ｃＤＮＡ　１１００ｐと混合したマウスＤ　Ｎ　 Ａ　）浄書（内容に変更なし） 力　価 浄書（内容に変更なし） フラクションＮｏ。 浄ＩＦ（内８に変更なし） Ｔ５ヒト細胞ラインブタ抗ヒト抗体 及びヒトもしくはウサギ補体 力　価 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、１１”ギ又ｔｉ＋″ト補体を含む１ト細胞う仲に対するヒト抗体 ・・１ ヒト補体とウサギ補体マウス吸収 浄ｌｉ（内容に変更なし） ＦＩＧ　１３　Ｂ１０’″ト／”′Ｘ／Ｍ″７°ノ・ドＤＡＦを殺すヒト抗マウ ス抗体＋ヒト補体とウサギ補体（吸収）の比較ＦＩＧ、１４　！１１ｉＪＥ！５ 、ｙｈＭ＋；ｌ−！６ＣＨＯ１ＲＩ１１（７）溶ｊ４浄書（内容に変更なし） ＣＨＯ−ＭＣＰ細胞はラット抗ハムスター抗体ウサギ又はヒト補体１／８を溶解 する 浄書（内容に変更なし） 対照 ＭＣＰと逆ＭＣＰとをトランスフェクトされたマウス線維芽細胞の自然生成抗体 溶解 ヒト抗血清の力価 浄書（内容に変更なし） 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　４年　４月１３日 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ９０１０１５７５ ２、発明の名称 改質生物学的材料 ３、特許出願人 住　所　イギリス国ロンドン　イージー１エイ・２デイーワイ。 ホルポーン・ビアダクト　２１ 名　称　イミュートラン・リミテッド 新大手町ビル　２０６区 １８、少なくとも１種の不調和種への移植時に又は少な（とも１種の不調和種の 免疫系への暴露時に異種移植片拒絶を生じない、移植可能な組織を有するトラン スジェニック動物。 １９　レシピエンド種に対して不調和種であるドナ一種に由来する動物組織と、 レシピエンド種において活性な１種以上の相同的補体制限因子との、レシピエン ド種へ移植可能な組織製造への使用。 ２０、不調和種の相同的補体制限因子を表現しうる細胞を有するトランスジェニ ック動物。 ２１、不死化されていないが、動物細胞に対して不調和である種において活性な １種以上の相同的補体制限因子を表現しつる動物細胞。 ２２、第１種の少なくとも１種の相同的補体制限因子をコードするＤＮＡと、第 ２種の、不死細胞ではない、動物細胞によるコーディングＤＮＡの表現を可能に する１種以上の塩基配列とを含む組換え体ＤＮＡ０２３　動物細胞が発生的に構 成体を含むトランスジェニック動物の細胞である請求項２２記載のＤＮＡ０ ２４、細胞が培養器官又は例えばランゲルハンス種のような他の組織である請求 項２２記載のＤＮＡ。 ２５　動物の遺伝材料に加えて、トランスジェニック動物を製造するために適し た遺伝的構成体であって、不調和種の少なくとも１種の相同的補体制限因子をコ ードするＤ　Ｎ　、Ａと、発生的に構成体を含むトランスジェニック動物の少な くとも一部の細胞によるコーディングＤＮＡの表現を可能にする１種以上の塩基 配列とを含む遺伝的構成体。 ２６、ＹＡＣの形状である請求項２５記載の遺伝的構成体。 ２７　動物の遺伝材料に不調和種の少なくとも１種の相同的補体制限因子をコー ドするＤＮＡと、トランスジェニック動物の少なくとも一部の細胞おけるコーデ ィングＤＮＡの表現を可能にする１つ以上の塩基配列とを加えることを含む、ト ランスジェニック動物の製造方法。 手続補正書坊幻 平成　５年　１月　７日仏ミ

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．レシピエントとは異なる種であり、レシピエントに対して不調和種であるド ナーに由来する動物組織をレシピエントに移植する方法において、レシピエント に組織を移植し、移植組織と共に、補体の完全活性化を阻止するためにレシピエ ント種において活性である１種以上の相同的補体制限因子（ＨＣＲＦ）を供給す ることを含む方法。
2. ２．組織が器官である請求項１記載の方法。
3. ３．器官が心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓又は甲状腺である請求項２記載の方法。
4. ４．組織が血液もしくは造血細胞、ランゲルハンス島、脳細胞又は内分泌器官か らの細胞を含む請求項２記載の方法。
5. ５．ＨＣＲＦが古典経路と代替え経路の両方に共通である、補体活性化カスケー ドの部分に干渉する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. ６．ＨＣＲＦが自然ＨＣＲＦである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. ７．ＨＣＲＦがＣ３において補体活性化を調節する請求項５記載の方法。
8. ８．ＨＣＲＦが下記要素： 因子Ｉ（Ｃ３ｂイナクチベーター又はＫＡＦとしても以前に知られる）；因子Ｈ ； Ｃ４結合蛋白質； ＤＡＦ（ＣＤ５５としても知られる）；膜補因子蛋白質（ＭＣＰ；ＣＤ４６とし ても知られ、最初はｇｂ４５−７０として述べられ、さらにｇｂ６６／５６とし て知られる）；ＣＲ１（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体又はＣＤ３５としても知られる） ；及び／又はＣＲ２（ＣＤ２１、Ｃ３．ｄｇ受容体、３ｄ／ＥＢＶ受容体及びｐ １４０としても知られる） である、又は上記要素の活性を有する請求項７記載の方法。
9. ９．ＨＣＲＦが自然ＨＣＲＦの活性を有し、自然ＨＣＤＦの遺伝子が染色体１の 帯ｑ３２に位置するＲＣＡ（補体活性化のレギュレーター）座に存在する請求項 １〜８のいずれかに記載の方法。
10. １０．ＨＣＲＦがＣ８及び／又はＣ９における補体活性化を調節する請求項５記 載の方法。
11. １１．ＨＣＲＦが下記要素： Ｃ８ｂｐ（ＨＲＦ又はＭＩＰとしても知られる）；ｐ−１８（ＨＲＦ−２０、Ｃ Ｄ５９又はＭＩＲＬとしても知られる）；又はＳＰ４０．４０ である、又は上記要素の活性を有する請求項１０記載の方法。
12. １２．ＨＣＲＦが膜に結合する請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
13. １３．ＨＣＲＦがドナー組織上の細胞膜に結合するように、ＨＣＲＦを供給する 請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. １４．ドナー組織がレシピエントに移植されたときにレシピエント種中で活性で ある１種以上のＨＣＲＦをコードする核酸を含み、表現する点で、ドナー組織が トランスジェニックである請求項１３記載の方法。
15. １５．レシピエント種がヒトである請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
16. １６．ドナー種がブタである請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
17. １７．予定レシピエント種において補体の完全活性化を阻止するために活性な１ 種以上の相同的補体制限因子と会合した、ドナー種の移植可能な動物細胞又は組 織であって、ドナー種がレシピエント種に対して不調和種である動物細胞又は組 織。
18. １８．少なくとも１種の不調和種への移植時に又は少なくとも１種の不調和種の 免疫系への暴露時に異種移植片拒絶を生じない、移植可能な組織を有するトラン スジェニッタ動物。
19. １９．レシピエント種に対して不調和種であるドナー種に由来する動物組織と、 レシピエント種において活性な１種以上の相同的補体制限因子との、レシピエン ト種へ移植可能な組織製造への使用。
20. ２０．他の種の相同的補体制限因子を表現しうる細胞を有するトランスジェニッ ク動物。
21. ２１．動物細胞に対して不調和である種において活性な１種以上の相同的補体制 限因子を表現しうる非形質転換動物細胞。
22. ２２．少なくとも１種の相同的補体制限因子をコードするＤＮＡと、非形質転換 動物細胞によるコーディングＤＮＡの表現を可能にする１種以上の塩基配列とを 含む組換え体ＤＮＡ。
23. ２３．動物細胞が発生的に構成体を含むトランスジェニック動物の細胞である請 求項２２記載のＤＮＡ。
24. ２４．細胞が培養器官又は例えばランゲルハンス種のような他の組織である請求 項２２記載のＤＮＡ。
25. ２５．動物の遺伝材料に加えて、トランスジェニック動物を製造するために適し た遺伝的構成体であって、少なくとも１種の相同的補体制限因子をコードするＤ ＮＡと、発生的に構成体を含むトランスジェニック動物の少なくとも一部の細胞 によるコーディングＤＮＡの表現を可能にする１種以上の塩基配列とを含む遺伝 的構成体。
26. ２６．ＹＡＣの形状である請求項２５記載の遺伝的構成体。
27. ２７．動物の遺伝材料に少なくとも１種の相同的補体制限因子をコードするＤＮ Ａと、トランスジェニック動物の少なくとも一部の細胞におけるコーディングＤ ＮＡの表現を可能にする１つ以上の塩基配列とを加えることを含む、トランスジ ェニック動物の製造方法。