KR100317106B1 - 수정된 생물학적 물질 - Google Patents

Abstract

전통적으로 한종으로 부터 얻어진 동물 조직은 종이 콘코던트한 경우에만 다른 종에 이식될 수 있다 : 그렇지 않으면 초면역 거부반응 (hyperimmune rejection)이 일어난다. 본 발명에서 공여체 조직을 수정하였다. 예를들면 수용체종에서 보체의 완전한 활성을 막기위하여 즉 거부반응을 방지하기위해 활성화되는 동종보체억제인자로서 불리우는 하나이상의 물질과 관련되거나 또는 트란스제닉하게 발현되도록 함에 의해 수정되었다. 본 발명은 부분적으로 초급성 이종이식편 거부반응이 고전경로에 의해서라기 보다 보체 활성의 부경로에 의해 발생한다는 생각에 근거를 두었다.

Description

수정된 생물학적 물질{MODIFIED BIOLOGICAL MATERIAL}

본 발명은 이식장기에 사용될 수 있는 생물학적으로 적합한(compatible) 물질에 관한 것으로서 특히 이들물질의 사용 및 생산에 관한 것이다.

장기를 포함하여 병든 동물(특히 사람) 조직의 교체(replacement)는 지난 40여년에 걸쳐 임상의학 분야에서는 일반적인 처방으로 이용 되고있다. 이와같은 교체처방(replacement therapies)의 예로서는 미국 듀퐁사에서 다크론(DACRON)이란 상표를 부착하여 판매하고 있는 손상된 혈관을 치료하는 데 사용되고 있는 폴리에틸렌테레프탈레이트, 동맥경화에 대한 자가이식편(autograft)으로서 사용되고있는 복재정맥(saphenous vein) 그리고 심장이식 등 다양하다.

장기이식술은 현대의 면역억제제(immunosuppressants)와 함께 상당한 발전을 하여서 극히 저렴한 비용으로 행해질 수 있는 정도까지 되었다. 또한, 장기이식술의 필요성도 급속히 증가되고 있다. 매년 전세계적으로 행해지는장기이식은 20,000건이 넘고 있다. 그러나, 이것은 현재의 기준으로 추산되는 필요량의 약 15% 정도만 시행되고 있는 것이다. 모든 종류의 장기의 공급과 수요의 비율을 현재의 공급수준으로는 충족시킬 수 없다. 이와같은 현상은 심장이식에 필요한 심장이 매우 많이 요구되기 때문이다. 1967년 바나드(Barnard)에 의해 행해진 최초의 심장이식은 상당한 반향을 불러 일으켰다. 일년동안 22개국 64개의 서로 다른 수술팀이 101회의 심장 이식을 수행하였다. 이식 결과가 좋지않아서 세계적으로 1970년대까지는 년간 30회 보다도 적게 수행되었다. 그러나, 시클로스포린(cyclosporin)이라는 면역억제제를 도입하여 심장이식술에 일대 혁명을 일으켰으며, 이로 인하여 심장이식술에 있어서 년간 80%이상의 성공율을 기대할 수 있게 되었다.(환자의 생존율에 있어서도 동일함). 전문지식이 축척됨에 따라서 생존율도 더욱 증가 될 것으로 기대된다. 이와같은 장기이식술의 성공으로 인하여 의학자와 일반인들은 심장이식술이 죽음을 극복할 수 있는 또하나의 대처방안이라는 것을 알게되었으며 더욱 많은 환자들이 이 방법을 이용하고있다. 현재는 한해에 2000번의 심장 이식수술이 시행되고 있다.

오늘날 심장이식에 있어서 가장 큰 위험은 유효한 공여 장기를 기다리는 동안일 것이다. 인공심장은 이 환자들에게 단기간의 보조장치로 제공될 수 있지만 장기적으로는 보다 많은 심장이식 센타와 장기 공급이 필요하다. 심장이식의 혜택을 입을 가능성이 있는 개개인의 수는 과학적으로 정확하게 알 수 없지만 문헌에 의하면 심장 이식이 필요한 사람의 수는 판단기준의 선택, 수여자의 나이, 질병 등등에 의존하지만 년간 백만명당 50에서 250명 정도 된다. 여하튼 현재의 실정은 장기 공여자의 수가 필요한 수여자의 수를 만족시킬 수 없다. 신장 및 간 이식에도 실정은 마찬가지이며 췌장 또는 랑겔한스샘(Islet of Langerhans)의 세포 이식은 이 조직이 손상된 당뇨 치료에 널리 인정되는 치료술이 되고 있으며 중요한 관심분야가 될 것이다.

현재 사용되고있는 이식치료법에는 또다른 문제점들이 있다. 공여장기가 이식술에 사용되기에 항상 적합한 것은 아닐 뿐 아니라, 이것은 이식될 장기 이외의 어떤 다른 장기의 손상에 의해 사망을 초래하는 사고에 의한 스스로의 희생에 의한 것은 아니다. 그러나, 이식될 장기에 어떤 부수적인 손상이나, 이식될 장기와 연관된 어려운 장애가 있을 수 있다.

더우기, 공여자로 부터 제공된 장기(organ)의 이용 가능성은 예측할 수 없기 때문에 흔히 이식외과의사들은 수술시간을 일정하게 계획할 수 없다. 또한 외과의사팀이나 외과병동관리인들(hospital administrators)은 공여장기가 식별되는 순간에 작업을 해야하므로 대부분의 경우 잔업시간에 일을 해야하는 개인적인 어려움이 있다.

심장, 간및 폐장 이식을 할 때, 거부반응(rejection)이 일어날 경우 즉시 다른 적당한 공여체가 사용되지 않는다면, 대개의 경우 재이식하는 것이 불가능하다.

상기한 의학적인 어려움 외에도, 현재의 이식술은 어떤경우 사회적인 문제점(social difficulties)이 발생한다. 첫번째 문제는, 공여체로부터 장기를 제거하는 것에 대한 종교적인 반발인데 이것은 특히 윤회설을 믿는 문화권에서 문제가 되고있다. 물론, 죽은 사람으로 부터 장기를 제거하는 것에 대한 다른 도덕적 및 사회적 어려움들도 있는 데 어떤나라에서는 가족의 동의(consent)가 요구되기도 한다. 마지막으로, 신장장기를 상업적으로 판매하는 행위가 있어서 많은 관심의 대상이 되고 있는데 특히 제 3 국에서 이런 현상이 일어나고 있으며, 이와같은 장기판매는 제지하는 것이 사회적으로 바람직할 것이다.

종래의 이식외과술은 위에서 설명한 바와 같은 문제점들을 가지고 있으며,특정종의 동물로부터 다른종의 동물로 이식될 수 있다(일반적으로 사람). 이와같은 이식술을 동종이계이식(allograft)이라 한다. 위에서 설명한 바와 같은 종래의 타가이식술이 가지고 있는 문제점들 때문에 이식술에 있어서 이종이식편(xenografts)의 이용 가능성에 관심이 모아지고 있다. 이종이식(xenografting)이란 서로 다른 종(species)의 세포, 기관, 조직을 이식하는것에 대한 유전학적 용어이다.

임상교체 실험(therapeutic replacement experiments)에서, 이종이식을 이용하여 성공한 사례가 이미 여러 경우 알려져 있다. 예로서, 최근에 대동맥관(aortic valve) 교체에 돼지의 조직을 사용한 경우, 정맥이식편으로서 소의 배꼽정맥을 사용한 경우가 있다. 그러나, 이와같은 이종이식의 경우는 모두 공통점이 있다. 이들은 단지 물리적인 교체(mechanical replacement)에 지나지 않는다. 사용된 조직은 생물학적 기능이 없다(non-functional). 이것은 사람의 면역반응이 대부분의 다른종에서 유래된 조직세포 결합(integrity)을 즉시(몇분 또는 몇시간 이내) 파괴하기 때문이다. 이와같은 이종이식편을 디스코던트한 이종이식(discordant xenograft)이라 한다.

이와같은 파괴의 가속화는 계통 발생학과 연관되어있다. 사람과 가장 비슷한 영장류 동물인 침팬지의 조직은 동종이계이식(allograft)과 비슷하게 많은 경우에 있어서 사람에게 이식되었을 때 생존할 수 있다. 이와같은 이종이식편을 콘코던트한 이종이식(concordant xenograft)이라 한다.

이와같은 '콘코던트한 이종이식(concordant xenograft)' 현상으로 동종이계이식이 가지고 있는 문제점에 대한 해답을 알 수 있으리라 생각되지만 실제로는 그렇지 않다. 침팬지는 사람보다 훨씬 작아서 침팬치의 장기는 보통 인체내에서 작동할 수 있을 정도로 크지 않다. 콩팥의 경우에는 환자의 신장을 교체하기 위하여 두개의 침팬지 신장을 이식하여서 이와같은 문제가 극복될 수 있지만, 간이나 심장의 경우에는 이것은 분명히 불가능하다. 더군다나, 침팬치는 원래 느리게 생육하기 때문에 실험동물로서 침팬지의 필요성은 더욱 더 커지고 있는 실정이다 (특히, 후천성 면역결핍증(AIDS)에 대한 연구가 가속화되고 있는 현재의 실정에서는 더욱 더 그러하다). 따라서, 이종이식편 공여체로서 다른영장류 동물의 사용이 대중적으로 받아들여 지는 데에는 다소의 사회적인 어려움이 있을 수 있다.

때문에 디스코던트한 이종이식(discordant xenografts)에 다시 관심이 모아지고 있다. 디스코던트한 이종이식편이 이식된 수용체에서 급속히 파괴되는 이유는 아직까지 규명되지 않은 수용체 종(recipient species)의 항체에대한 항원이 수용체 종에서 자연적으로 생성되기 때문인 것으로 일반적으로 알려져있다 [숀스 등(Shons et al), Europ. Surg. Res. 5권, 26-36페이지, 1973년]. 이들 항체는 공여종으로 부터 어떤 면역학적 도전(immunological challenge)을 받지않은 개체에서도 존재하는 것이 발견되어지기 때문에 '지연발생적으로 생기는 것(naturally occuring)' 으로 알려져 있다.

초급성 항체 매개성 거부반응(hyperacute antibody-mediated rejection)인 것으로 알려져 있는 장기이식의 급속거부현상은 문헌에 잘 정리되어있다. (동종이계형) 신장 이식술이 일반적으로 사용되었던 1960년대 초반에, 수술도중에 이식된 신장이 수용체에서 거부되는 현상이 종종 발생하였다. 심장이식수술을 하는 동안에 수용체와 공여장기의 관이 서로 봉합되면 대개의 경우 곧 신장은 붉게되고 단단해 진다. 이와같은 이식신장의 경우 거의 즉시 소변이 생성된다. 수술 진행 도중에 이식편(graft)이 파괴되는 거부현상(초급성거부현상)이 일어날 때 파괴과정 (destructive processes)은 처음 몇분에 시작되거나 또는 이식술이 끝난 후에 일어나거나 한다. 이와같은 현상이 발생되면 신장은 푸른게 되고 누덕누덕기운것(patchy) 같이 된 다음 충혈되어진다(congested). 또한 장기의 견고성(consistancy)도 변한다. 대개의 경우, 이식편은 수종성(oedematous)이 되고, 소변도 생성되지 않게 된다음 새로 이식된 신장은 즉시 제거된다. 수용체에 이미 생성되어 있는 순환항체(circulating antibody)와 공여신장에 있는 항원사이에 체액성 면역반응(humorally-mediated immunological response)이 관여하고 있다는 것이 분명해지고 있다. 동종이계형 이식술을 할 때에 발생하는 위와 같은 거부현상을 피하기 위한 유일한 방법은 이식하기 전에 공여세포에 대한 항체가 수용체에 존재하는지의 여부를 검토하는 것이다. 항체반응검사[교차적합(cross match)으로 알려져 있음]에 대한 지식이 증가함에 따라서, 수용체에 있는 항체가 공여체의 항원과 반응한다는 일반적인 생각이 사실과 다르다는 것이 분명하게 되었고, 동종의 개체 사이의 이식이 일어났을 때의 초급성이식편의 파괴는 티-웜 양성반응(T-warm positive cross-match)으로 알려져있는 특정종류의 항체의 존재에 국한되며, 이들 특정종류의 항체는 면역글로불린 G(immunoglobuline G; IgG)의 분류에 속한다는 것이 거의 확실시 되었다. 더우기 이들 항체가 존재하게 되는 것은 이미 존재하는 면역과정, 이전에 했던 수혈, 임신 또는 가장 일반적으로는 이전의 잘못된 이식장기 때문이다.

상기한 바와 같이, 초급성 이종이식 거부반응의 기작은 초급성 동종이계거부반응의 기작과 아주 비슷한 것으로 생각되어져 왔다. 이종이식거부반응의 기작에 대한 문헌상의 기록은 약 83년을 거슬러 올라간다. 이 기간동안에 항체가 관여하지 않는 이종이식 거부반응의 기작에 대해서는 단지 3가지 논문만이 제시되고 있다. 이것은 보체활성의 또다른 경로가 이종이식거부반응에 관여되어 있다는 것을 나타내주었다 (비록 이와 같은 용어를 사용하지는 않았지만 ). 이러한 제한은 1976년도에 쉴링 등(Schilling et al)의 논문(Surgery, Gynaecology and Obstetrics, 142권, 29-32 페이지, 1976)에 처음으로 나타났으며, 1988년도와 1989년도에 미야가와 등(Miyagawa et al, Trans-plantation, 46(6)권, 825-830 페이지, 1988 그리고 Transplantation Proceedings 21(1)권, 520-521 페이지, 1989)에 의해 동일한 이론이 주장되었다. 그러나, 결과는 위의 두실험이 실질적으로 동일한 결점이 있었기 때문에 결정적이지 못하였다. 사용된 모델은 교차종(cross-species) 항체가 존재하지않는 이종이식 모델이 사용되었다고 실험가들은 주장하지만, 교차종 항체를 검출하는데 사용된 분석방법이 부적당하였다는 것이 밝혀졌으며 따라서 이들 논문에서 이끌어낸 결론은 잘못된 결과에 기초를 두고 있다는 것이 밝혀졌다.

이종이식을 할 때 일어나는 거부반응을 줄이거나 피하기 위하여 현재 실험적으로 이용되는 방법은 수용체의 면역계를 간섭하는 것이다. 예컨데, 시클로스포린 A(cyclosporin A) 및 다른 면역억제제(immunosuppressants)와 주로 비특이적인 방법으로 화학임상적으로 작용하는 플라스마포레시스(plasmaphoreses)나, 코브라의 독이나, 스터필로콕커스 프로테인 에이(Staphylococcus protein A)를 처리하거나 하는 등이다. 이와같은 처방은 당연히 동종이계이식술에도 사용되는 화학요법이기도하다.

본 발명은 종래의 방법과는 완전히 다른 방법을 채택한 것이다. 즉, 수용체의 면역계와 비특이적으로 작용하는 물질을 사용하는 대신, 수용체의 면역계의 어떤 성분(components)에 의해 공여이식편(donor graft)이 '자신'으로 인식되도록 하는 물질을 같이 투여하는 것이다. 예를들면 수용체에 자신(self)인 것으로 면역학적으로 나타나도록 하기위해 공여조직을 변형한 것이다.

초급성 이종이식거부반응(hyperacute xenograft rejection)이 반드시 항체에 의해 일어나는 것은 아니라는 것이 또한 밝혀졌다. 이것은 두가지 관찰에 의해 밝혀졌는 데, 첫번째는 항체가 없더라도 보체가 있으면 초급성거부반응(hyperacute rejection)은 관찰된다. 둘째, 항체가 있더라도 보체가 없으면, 초급성거부반응은 관찰되지않는다.

본 발명은 어떤 항체 분자의 결합에 의해 활성이 촉진되는지, 그렇지 않은지에 관계없이 이종이식편의 초급성파괴(hyperacute destruction)에는 보체의 활성이 중요하다는 생각에 근거한다. 보체의 또다른 경로의 활성은 여러가지 세포 생성물에 의해 유도될 수 있다. 이들 생성물은 세균이나 이종이식편과 같은 외래침입 세포(foreign-invading cells)에 국한되는 것이 아니라 많은세포들에도 존재한다. 그래서, 원칙적으로 한개체의 많은 세포들은 보체반응의 또다른 경로를 활성화 해서 광대한 자가면역(auto-immune) 파괴를 초래할 수 있다. 정상적인 상태에서 이것이 일어나지 않는 것은 혈청이나 세포표면에 자연적으로 존재하는 수많은 보체억제단백질(complement restriction factors) 때문이다. 이들 분자들[여기서는 '동종보체 억제인자(homologous complement factors)']은 자기 세포(self cells)의 생산물에 의해 고전적 경로(classical pathway) 또는 부경로(alternative pathway)에 의해 보체의 활성화를 방지하여 자기세포의 자가 면역 파괴(autoimmune destruction)를 방지한다. 이들 분자의 기작은 패록시말 녹터날 해모글로비누리아(paroxysmal nocturnal haemoglobinuria)에서 잘 나타난다. 이 질병에서는 이들 분자들[부패 촉진 인자(decay accelerating factor)]이 막부착점(membrane anchor)을 하나도 가지지 못한다. 그래서 단백질이 적혈구 세포막(erythrocyte cell membrane)에 부착되지 못하고 세포로 부터 떨어져 나온 뒤 보체의 부경로를 활성화하고 용해되어 해모글로비누리아(haemoglobinuria)를 일으킨다.

발명의 첫번째 목적은 동물조직을 수용체에 이식하는 방법에 관한 것으로서 여기서 사용되는 조직은 수용체와 다른 종인 공여체의 조직이다. 또한 이 때의 공여종(donor species)은 수용체와 디스코던트한 종(discordant species)이며, 이 방법은 조직을 수용체에 이식하고 이식된 조직과 관련하여 수용체종에 활성을 띄는 하나 이상의 보체 억제 인자를 제공하여 보체의 활성을 막는 단계로 구성되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 '조직(tissue)'이란 용어는 장기(특히 심장, 폐, 간장, 신장, 췌장 및 갑상선과 같은 내장), 각막, 피부, 혈관 및 다른 결합조직, 혈액 및 헤마토포이에틱 세포(haematopoietic cell)를 포함한 세포, 란겔한스 샘, 뇌세포 및 내분비선 및 다른 장기의 세포, 체액(PPF와 같은)을 포함한 이식될 수 있는 생물학적 물질(biological material)을 의미하며 이들 모두는 어떤 종으로 부터 다른 종으로 이식될 수 있다는 것이다.

'디스코던트한 종(discordant species)'은 수용체에 들어가서 보통은 관맥화(vascularised) 되어진 이종 이식편(xenograft)에 수분 또는 수시간 내에 거부반응이 일어나는 초급성 거부반응을 일으키는 종(species)이다 [ 케인(Calne), Transplant Proc., 2권, 550 페이지,1970). 이와같은 초급성 거부반응은 이 분야의 전문가들에게는 잘 알려져 있는 사실로서 이식 (transpl-antation) 후 24시간, 6시간 이내에 발생하며 심지어는 한시간 내로 발생할 수도 있다.

보체 및 보체활성(complement and its activation)은 현재 잘 알려져 있으며 옥스포드 블랙웰 과학 출판사에서 발행된 로이트의 필수 면역학(Roitt, Essential Immunology, Blackwell Scientific Publications, 5ed, 1984)에 잘 설명되어 있다. 보체(C')에 의한 활성은 연속적으로 작용하는 9가지 단백질 성분(protein component)의 작용에 달려있으며 이들 중 첫째 성분은 C1q, C1r, C1s라 불리우는 3가지 주요 소단편(sub-fraction)으로 구성된다.

보체는 고전경로(classical pathway) 또는 부경로(alternative pathway)에 의해 활성화되어질 수있으며 이 두 경로를 간단히 설명하면 다음과 같다.

고전경로에서는 항체가 C1 에 결합되면 C1 의 C1s 소단위가 에스테라제 활성을 띠게되어 활성화 되고 막 부위 또는 처음에는 C4, 그 다음에는 C2 면역 복합체 (immune complex)로 옮긴다. 이들 복합체는 ' C3-전환효소 (C3-Convertase)' 활성을 가지고 용액중에서 C3 을 절단하여 아주 특징적인 기능을 가지는 작은 펩티드 절편(peptide fragment)인 C3a와 잔기분자 C3b를 생산한다. C3a는 아나필라톡신(anaphylatoxin) 활성을 가지며 보체 증폭 케스케이드(complementamplication cascade)에는 더 이상 작용하지 않는다. C3b는 막에 결합되어져 있고 항원-항체-C3b 복합체의 면역접착(immune adherence)을 초래하여 식균작용 (phagocytosis)을 촉진할 수 있다.

부경로에서는 C3-전환효소 활성이 C3b에 의해서 일어나고 이들의 활성은 외부인자 특히 항체에 독립적으로 작용하는 내생독소(endotoxin)와 같은 미생물 다당체(microbial polysaccharide)에 의해 개시될 수도 있다. 전환효소(Convertase)는 C3b와 B인자의 복합체에 D인자가 작용하여 형성된다. 이것은 포지티브 피드백 루프(positive feedback loop)를 형성하고, 여기서 C3 분해 생성물(C3b)는 더 많은 절단효소가 형성되도록 돕는다.

고전경로와 부경로 모두에서 C3b 수준은 C3b 불활성제(inactivator, I인자)의 활성에 의해 일정하게 유지된다. C3b 는 H 인자와 쉽게 결합하며 I 인자에 의해 분해되어 용혈성 (haemolytic properties) 및 면역 부착성(immune adherence properties)을 상실하는 복합체를 형성한다. 고전경로와 부경로는 C3 단계 이후로는 동일하다. C5 는 절단되어 C5a와 C5b 절편(fragments)를 형성한다. C5a 는 아낙프락톡신(anaphylatoxin) 활성을 가지고 다형체(polymorphs)에 대한 케모택시스(chemotaxis)를 일으킨다. C5b 는 C6 및 C7과 결합하여 복합체를 형성하여 막에 열적안정 부위(thermostable site)를 형성하여서 최종 성분인 C8 및 C9 와 결합하여 막 공격 복합체(membrane attack complex; MAC)를 형성한다. 이 복합체는 일부는 막 내로 삽입되고 일부는 돌출된 고리모양을 하고 있으며 전해질이나 물에 완전히 스며들 수 있는 막내의 도관(transmembrane channel)을 형성한다. 높은 내부 콜로이드 삼투압(high internal colloid osmotic pressure) 때문에 나트륨 이온과 물이 유입되고 세포용해가 일어난다.

본 발명에 유용한 동종 보체 억제인자(homologous complement restriction factors; HCRFs)는 보체활성 케스케이드중 어떤 단계를 방해할 수 있다. 동종 보체 억제 인자(HCRF)는 고전 경로중의 어떤 단계를 단독으로 방해하거나 부경로중의 어떤 단계를 단독으로 방해하기도 하지만, 많은 경우에 있어서 고전경로와 부경로에 공통된 어떤 단계를 방해한다. 동종보체 억제인자 조절자(HCRF regulator)는 경로상의 공통된 단계를 방해하는 것이 바람직하다. HCRF는 천연 HCRF와 동일하거나 단지 비슷한 기능을 가지는 것일 수 있다. 재조합 DNA 기술(recombinant DNA technology)로 만들어진 것 및 그 변형체들을 포함한 합성 및 반합성 HCRFs는 모두 HCRF란 용어에 포함된다.

위에서 언급한 바와 같이 동종보체억제인자들(homologous complement restriction factors)은 보체의 용해활성(lytic activity)을 막거나 줄이는 방법으로 보체 케스케이드의 작용을 조절하는 물질이다; 즉 이들은 자가면역작용을 피하기 위하여 조직을 자신 (self)의 것으로 식별되도록 생체(animal body)에 사용된다. 비록 실제 사용하는 데에는 HCRF가 이종이식조직 세포의 막에 결합되어 있는 것이 바람직하지만 본 발명에서의 HCRF는 막에 결합되어져 있던지 혈청에 자유로이 있든지 원칙적으로 가능하다. 그래서 HCRF가 이종이식조직과 연관되어져 있는 것이 더 쉽다. 바람직한 HCRFs는 C3b/C4b 리셉터 (CR1), C3.dg 리셉터 (CR2)를 포함하는 세포막인자 (cell membrane factors), 부패촉진인자(DAF), C3b 불활성화제 및 막보조인자 단백질(C3b inactivator and membrane cofactor protein; MCP) 이다.혈청 HCRFs는 H인자, 부패촉진인자(DAF) 및 C4 결합단백질(C4 binding protein; C4bp)를 포함한다. 이들 HCRFs는 모두 C4단계에서의 방해작용에 의해 보체 활성을 저하시킨다(down-regulate). C8을 제지하는 동종억제인자도 또한 추정되는 막인자이다.

전부는 아니지만 적합한 HCRFs의 유전자의 많은 부위가 보체활성조절인자 (regulator of complement activation; RCA) 부위에 위치해 있으며 염색체 지도상에서 염색체 1의 q32 부위에 나타난다 [레이-캄포스 등 (Rey-Campos et.al.), J. Exp. Med., 167권, 664-669페이지, 1988).

비록 HCRFs의 부위(location)와 명칭(nomenclature)에 다소의 혼동이 있다하더라도 C4bp, CR1, DAF 인자들과 H인자는 레이-캠프스 등[Rey-Campos et. al.(loc. cit.)]에 의해 그들의 초기 연구(J. Exp. Med.,166권,246-252페이지,1987)에 분류되어있다. 막보조인자 단백질(membrane cofactor protein; MCP)은 어떤 연구자들에게는 C4 결합단백질(C4 binding protein; C4bp)과 동의어로서 취급되고 이들 두 인자들은 서로 관련이 있는 것이거나 동일한 것일 수 있다. 로더와 틸(Rother and Till)의 '보체계(The Complement System)', 스프링거-벨로그, 베를린, 1988) 제1장 2.3.2에서 C3전환효소의 조절인자들에 대해 잘 설명되어 있다;이들은 C4결합 단백질(C4bp)을 부패촉진인자와 동일시하고 H인자를 B,H-단백질 및 C3b 불활성제 촉진제(inactivator accelerator)와 동일시한다. HCRFs의 명칭,위치 및 특징에 관하여 계속해서 연구가 진행되고 있음은 의심의 여지가 없지만 본 발명에서는 모든 HCRFs를 적당하고 바람직하게 진술하려고 했음을 밝히는 바이다.

HCRFs에 대한 다른 참고문헌은 다음과 같다:

I인자(이전에는 C3b 불활성제 또는 KAF로 알려져 있었음): 타무라 및

넬슨(Tamura and Nelson, J. Immunol, 99권, 582-589페이지, 1967);

H인자: 팡번 등(Pangburn et.al., J. Exp. Med., 146권, 257-270페이지, 1977);

C4 결합단백질: 후지타 등(Fujita et. al., J. Exp. Med., 148권, 1044-1051페이지, 1978);

디에에프(DAF; DM55로 알려져 있기도함): 니콜슨-웰라 등(Nicholson-Weller et. al., J. Immunol., 129권, 184페이지, 1982);

막보조인자단백질(MCP; 또환 CD46으로서도 알려져 있으며 처음에는 gp45-70으로서 기술되어 졌으며 gp66/56으로서 더 잘 알려져 있음):

세야 등(Seya et.al., J. Exp. Med., 163권, 837-855페이지, 1986);

CR1(CD35로도 알려져 있음): 매도프 등(Medof et.al.,J. Exp., Med., 156권, 1739-1754페이지, 1982) 및 로스 등(Ross et.al., J. Immunol, 129권, 2051-2061페이지, 1982);

CR2(CD21, 3d/EBV 리셉터 및 P140으로도 알려져 있음): 이다 등(Iida et. al., J. Exp. Med., 158권, 1021-1033페이지, 1983) 및 웨이스 등(Weis et. al., PANS, 81권, 881-885페이지, 1984).

어떤 RCA단백질의 조직분포(tissue distribution)는 다음과 같다:

CR1: 막(제한적임)/적혈구/단핵 백혈구(monocytes)/대부분의 B세포 및 어떤T세포/다형핵 백혈구(polynorphonuclear leucocytes)/사구체 족세포(glomerularr podocytes)/여포성 균낭세포(follicular dentritic cells); CR2: 막(제한적임)/대부분의 B세포/여포성 균낭세포(follicular dentritic cells)/어떤 상피세포/소수의 T세포;

MCP: 막(광범위함)/모든 말초혈액세포(적혈구 제외)(all peripheral blood cells)/상피세포/내피세포(endothelial)/결체조직모세포(fibroblast cell)/트로포블라스트 및 정자;

DAF: 막(광범위함)/모든 말초혈액 세포/상피세포/내피세포/결체조직 모세포/트로포블라스트(tropoblast) 및 정자;

C4bp: 혈장(plasma)/간합성(liver synthesis); 및

H: 혈장(plasma)/간 합성(liver synthesis)/결체조직 모세포 및 단핵성 세포(monocyte cell lines).

막공격 복합체의 수준까지 동종억제에 관여하고 이들의 용도가 또한 본 발명에 의해 연구되어진 단백질에 대하여 단백질의 아미노산 서열의 형태가 약 65KD이며 이들 단백질은 하기의 단백질과 동일하다는 일반적인 견해가 있다(아직 증거는 없음):

C8결합 단백질(쇼내르마크, J. Immunol, 136권, 1772페이지, 1986);

동종제한 인자(HRF)(잘만 등, Immunology, 83권, 6975페이지, 1986); 및

MAC-억제 단백질(MAC-inhibiting protein; MIP) (왓트 등, 1988).

C8bp/HRF/MIP 단백질은 CD59 또는 DAF가 그러한 것처럼 당지질(glycolipid)앵코(anchor)에 의해 세표표면에 부착한다. 이들 단백질들은 기능적으로는 패록시말 녹터날 해모글로비누리아(paroxysmal nocturnal haemoglobinuria)에 없는 것으로 알려져 있다.

18-20 KDa 단백질이 MAC 레벨에 또한 연관되어 있다. 이들과 동일한 것으로 생각되는 것들에는 다음과 같은 것이 있다(동일하지 않을 수도 있음):

P-18(수지타 등, J. Bichem, 104권, 633페이지,1988);

HRF-20(오카다 등, Intl. Immuno., 1권, 1989);

CO59(다비스 등, J. Exp. Med., Sept. 1989); 및

반작용 용해의 막저해제(membrane inhibitor of reactive lysis;

MIRL)(호로킨 등, J. Clin. Invest, 84권, 7페이지, 1989);

이들 단백질이 동일한 것이라는 것에 대한 증저는 CD59 및 HRF-20의 단백질서열 및/또는 CDNA 서열이 동일하다는 것이다. 또한 아마도 이들은 P-18 / MIRL과도 동일할 것이다. CD59/HRF-20 서열은 T 세포 활성에 관여하는 쥐의 LY-6항체의 것과 어떤 상동(homology)성이 있다는 것을 알아야한다.(그론스 등, J. Immunol., 142권, 3013페이지, 1989).

SP-40.40은 MAC 조절에도 관여한다(키브츠바움 등, EMBO, 8권, 711페이지, 1989).

C3단계에서 보체 활성을 방해하는 것은 바람직하다. MCP와 DAF는 모두 C3활성의 부경로에서 포지티브 피드백 루프를 차단하며 이들은 바람직한 HCRFs를 구성한다.

HCRF는 이식된 조직과 관련하여 제공된다. 이것은 침입세균과 같은 다른 외부물질은 표시되지 않지만 이식조직은 자기로서 표시되어지는 것과 같은 방식으로 투여되어진다는 것을 의미한다. 하나 이상의 적당한 HCRFs는 이식조직에 국부적으로 투여되는 것이 아니라 단지 전체적으로(parenterally) 투여되는 것만이 가능할 것이다. 그러나 실제에 있어서는 이식조직에 HCRF가 적당한 위치의 차지가 어렵고 이식이 일어난 후 HCRF가 수용체에서 반복적으로 투여되어야 할지도 모른다는 데에 더 큰 어려움이 있기때문에 별로 바람직하지 못하다. 그러나 이같은 문제점은 특별한 약제투여방법(specialist pharmaceutical delivery system)을 사용하므로서 극복될 수 있다.

일반적으로는 공여조직의 세포막에 부착시킨(integrated) 방법으로 HCRF를 제공하는 것이 훨씬 더 편리할 것이다. 비록 적당하게 발현될 수 있는 이식된 조직의 양성 감염(benign infections)이 있을 수 있다하더라도 이와 같은 목적을 이루는 가장 바람직한 경로는 수용체에 이식되어졌을 때 수용체종(recipient species)에서 하나 이상의 HCRFs를 코딩(coding)하는 핵산을 발현하는 트란스제닉한 공여조직(transgenic donor tissue)을 이식하는 것이다. 이와같은 트란스제닉한 조직(transgenic tissue)은 HCRF를 무한정하게 계속해서 발현할 수도 있다. HCRF는 수용체종으로부터 유전적으로 유도될 수도 있고 콘코던트한 이종이식편(concordant xenografts)은 가능한 밀접하게 관련된 종으로 부터도 다소 덜 바람직하지만 유도될 수도 있다.

원칙적으로 트란스제닉한 공여조직은 세포배양에서 얻을 수 있다 하더라도공여조직을 트란스제닉한 동물로 부터 얻는 것이 바람직하다. 트란스제닉한 동물은 이식되어진 조직에서 최소한이라도 HCRF를 발현해야 한다(또는 발현할 수 있다). 그러나 반드시 필요하지는 않다 하더라도 하이브리드 모노크로날항체(hybrid monoclonal antibody)와 같은(밀스테민 및 구엘로, Nature, 305권, 537페이지, 1983) 어떤 결합제나 리셉터(receptor)에 의해 공여조직의 세포막에 HCRF가 결합하는 것이 가능할 수 있다. 수용체종은 절대적이지는 않지만 주로 사람이다. 다른 영장류 동물(primates)이 수용체로서 적당하게 사용될 수 있다. 또한 경제적 및 도덕 윤리적으로 허용되는 다른 종들도 사용될 수 있다.

공여종은 수용체종의 생리(physiology)적인 성질을 고려 할 때 이식을 위해 적당한 조직을 제공할 수 있다면 수용체종과 다른 적당한 종이면 된다. 수용체가 사람인 경우 다른 여러가지 종들이 공여조직을 제공하는 데 적당한 종으로서 사용될 수 있지만 돼지 공여체(pig donors)가 가장 적당하다고 생각된다.

본 발명의 두번째 목적은 공여종의 이식될 수 있는 동물세포 또는 조직 보체활성을 막기위하여 수용체종에서 활성을 띠는 동종보체억제인자를 하나이상 가지고 있는 조직이나 세포 수용체종에대하여 디스코던트한 종(discordant species) 또는 공여종을 제공하는 것이다.

본 발명의 세번째 목적은 디스코던트한 종의 면역계(immuno system)에 노출되거나 이들 종으로 이식될 때 이종이식거부반응(xenograft rejection)을 일으키지 않는 이식될 수 있는 조직을 가진 트란스제닉한 동물을 제공하는 것이다. 디스코던트한 종이란 보통 동물로 부터 초급성적으로 거부되는 종을 말한다.

그래서 본 발명은 수용체 종으로 이식될 수 있는 조직을 준비함에 있어서 공여종으로 부터 유도된 동물조직을 사용하는 경우와 공여종이 수용체에 대하여 디스코던트한 경우에 수용체종에서 활성을 띠는 보체억제인자를 하나이상 사용하는 경우를 모두 포함한다.

본 발명의 네번째 목적은 다른종의 보체억제인자를 발현할 수 있는 세포를 가지고 있는 트란스제닉한 동물을 제공하는 것이다. 보체억제 인자는 트란스제닉한 동물의 종에 대하여 디스코던트한 종에서 보통활성을 띨 것이다. 첫번째 목적과 관련하여 설명되어진 경우에서 처럼 바람직하기로는 세포는 한 개의 특정조직일 수도 있고 하나이상이거나 모든조직일 수도 있으며 이경우 동물은 한개 이상의 조직의 공여체가 될 수 있다. 이와같은 트란스제닉한 동물은 비형질전환세포 (nontransformed cells)의 총체로 간주될 수 있다.

본 발명의 다섯번째 목적은 동물세포에 대해 디스코던트한 종에서 활성을 띠는 하나이상의 보체억제인자를 발현할 수 있는 비형질전환세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 여섯번째 목적은 적어도 한개의 보체억제인자를 코딩하는 DNA와 코딩 DNA가 비형질전환동물세포에 의해서 발현될 수 있도록하는 하나이상의 유선 서열로 구성된 재조합 DNA를 제공하는 것이다. 동물세포는 유전적으로 재조합 DNA를 도입할 수 있는(incorporating) 트란스제닉한 동물세포일 수 있다. 또 다른 방법으로서는 세포는 랑겔한스샘과 같은 다른 조직이거나 배양된 장기일 수도 있다.

본 발명의 일곱번째 목적은 트란스제닉한 동물을 만들기 위하여 동물의 유전자에 도입될 수 있는 유전조작물질(genetic construction)을 제공하는 것인데 이때의 유전조작물질은 적어도 한개의 보체억제인자를 코딩하는 DNA와 이 코딩 DNA가 유전적으로 유전조작물질을 도입할 수 있는 트란스제닉한 동물의 어떤 세포에서 발현될 수 있도록 하는 하나이상의 유전 서열로 구성되어져 있다. 이와같은 유전조작물질은 YAC라고 알려져있는 소염색체(mini-chromosome)의 형태일 수 있다. 위에서와 같이 보체억제인자는 트란스제닉한 동물의 종에 대하여 디스코던트한 종에서 일반적으로 활성을 띨 것이다.

본 발명의 여덟번째 목적은 트란스제닉한 동물을 제조하는 방법 적어도 한개의 보체억제인자를 코딩하는 DNA와 트란스제닉한 동물의 어떤 세포에서 코딩 DNA가 발현될 수 있도록하는 하나이상의 유전서열로 구성된 유전조작물질을 동물의 유전자에 도입하는 방법을 제공하는 것이다.

트란스제닉한 동물을 생성하는 방법들은 일반적으로 더욱 보편화되고 있으며 사용되는 자세한 단계들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 있는 것이다. 예를들면 WO-A-8800239에서는 트란스제닉한 동물을 조작하는 데 필요한 단계들을 기술하고 있다.

유전조작물질을 트란스제닉한 동물의 세포내로 도입하는 데 실제 사용되는 방법은 미량주사법 (microinjection), 정자 매개 도입법 ( sperm-mediated incorporation) 및 다른 적당한 방법이 사용된다. 유전자조작을 미리 원핵생물(procaryotes)에서 예비적으로 행해보는 것이 더욱 바람직하다.

HCRF를 코딩하는 DNA는 cDNA형태로 사용될 수도 있고 통상적으로 클로닝 기술(cloning technology)을 사용해서도 추정될 수 있다. 부패촉진인자를 코딩하는DNA 가 아마도 가장 잘 특정지워졌으며 메도프 등 ( Medof et.al., PNAS, 84권, 2007-2011페이지, 1987)이 잘 설명한 바 있다. RCA 유전자 클러스트(cluster)의 물리적지도(physical map)는 레이-캄포스 등(Rey-Campos et. al.,1988(loc.cit.))에 의해 알려졌다. DAF의 변형체(variants)와 재조합 DNA 기술에 의한 이들의 제조방법이 유럽특허 제 0244267(EP-A-0244267)에 기술되어 있는 데 본 발명에서는 이와같은 변형체가 사용될 수도 있다.

DAF의 유전적 성질들이 잘 특징지워져 있고, DAF를 코딩하는 cDNA의 서열이 알려져 있기 때문에 DAF는 바람직한 보체억제인자의 구성요인이 된다.

본 발명의 두번째내지 일곱번째 목적의 또 다른 바람직한 면은 첫번째 목적의 경우에서 처럼 준용된다.

도 1A-1E는 실시예 1에 따라서 갓 태어난 돼지에 이식된 토끼의 심장에 대한 연속적인 ECG 추적을 보여준다;

도 2는 실시예 1에서 사용된 돼지들이 항종항체(antispecies antibody)를 가지고 있지 않다는 것을 나타내는 방사면역분석(radioimmunoassay)의 결과이다;

도 3은 실시예 4에서 사용된 단백질전기영동(protein electrophoresis)의 어떤 단계를 나타낸다;

도 4는 실시예 4에서 사용된 2차원 교차전기영동(two-dimensional crossed electrophorsis)의 어떤 단계를 나타낸다;

도 5는 실시예 4의 결과인 '2D-로켓(2D-Rockets)'을 보여준다;

도 6은 실시예 5에서 사용한 크롬 방출세포용해분석법(chromium release cell lysis assay)의 결과를 나타낸다;

도 7은 실시예 6에서 설명된 바와 같이 이식 전(0일)과 이식후 5,7 및 9일에 햄스터(hamster) 심장 이식편을 이식받는 수용체인 쥐로부터 측정된 용혈성 항-햄스터 양(titres)을 나타내는 것이다;

도 8은 G200분획의 ODs값을 그림으로 나타낸 것이다. 즉 실시예 6에서 설명된 바와 같이 햄스터의 심장을 이식받은 쥐로 부터 용혈성 항-햄스터 항체의 각 분획에 대한 양을 도시하는 분포도이다;

도 9은 실시예 7에서 설명된 바와 같이 T5,b10및 DB3 세포계(cell lines)에서 추출된 DNA의 서든 블럿(southern blot)을 나타낸다;

도 10은 실시예 7에서 설명된 바와 같이 돼지에게 사람에 대한 항체(anti-human antibodies)가 있는 상태에서는 사람의 보체에 의해서가 아니라 토끼의 보체에 의해서 T5 사람 세포계(T5 human cell line)가 용해되어 진다는 것을 보여주는 51Cr 방출 형태 (release figures)를 나타내는 것이다;

도 11은 실시예 7에서 설명된 바와 같이 사람이나 토끼의 보체 중 어느 하나를 가지고 있는 T5 사람세포계(T5 human cell lines)를 사람의 항체가 용해할 수 없다는 것을 보여주는 51Cr의 방출 형태를 나타낸 것이다;

도 12는 실시예 7 에서 설명된 바 와 같이 사람의 보체와 토끼의 보체가 모두 있는 상태에서 사람의 항체가 생쥐-생쥐 융합세포(DB3)를 용해할 수 있다는 것을 나타내는 51Cr 방출형태를 나타낸 것이다.

도 13은 실시예 7에서 설명된 바와 같이 사람과 생쥐의 하이브리드 세포계(human-mouse hybrid cell line)인 B10이 토끼의 보체가 있는 상태에서는 사람의 항체에 의해 용해되지만 사람의 보체가 있는 상태에서는 사람의 항체에 의해 용해되지 않는다는 것을 보여주는 51Cr 방출 형태를 나타낸 것이다;

도 14는 실시예 8에서 설명된 바와 같이 CHO 세포(CHO cells)가 사람의 보체나 토끼의 보체가 있는 상태에서 쥐의 면역 혈청에 의해 죽는다는 것을 보여주는 CHO세포에 의한 3H-아데닌(3H adenine)의 흡수량(uptake; 분당 측정됨)을 나타낸것이다;

도 15는 실시예 8에서 설명된 바와 같이 사람의 MCP로 형질이입된 (transfected) CHO 세포가 사람의 보체가 있는 상태에서는 쥐의 면역혈청에 의해 죽지않지만 토끼의 보체가 있는 상태에서는 쥐의 면역혈청에 의해 죽는다는 것을 보여주는 사람의 MCP로 형질이입된 CHO세포에 의한 3H-아데닌의 흡수량을 나타낸 것이다;

도 16은 도 15와 관련되어 설명된 경우로서 실시예 8에서 설명된 바와 같이 사람 보체계의 C3성분은 절단되어 C3b를 형성하지 않는 다는 것을 보여주는 '2-D 로켓'을 나타내는 것이다;

도 17는 생쥐의 결체조직 모세포(mouse fibroblasts)인 3T3이 사람의 보체가 있는 상태에서는 자연적으로 생기는 항체에 의해 용해 되어진다는 것과 생쥐세포에 의한 사람 MCP의 발현의 보호효과를 보여주는 51Cr방출형태를 나타내는 것이다;

도 18은 프루브(probe)로서 표식된(labelled) DAF cDNA나 표식된 MCP cDNA를 사용하여 트란스제닉한 쥐의 2세대의 DNA에 대한 슬럿 블럿 분석(slot blot analysis)을 나타낸 것이다.

발명의 하기의 실시예에 의해 더 잘 나타나진다. 실시예에 나타난 그림은 다음과 같다:

실시예 1

이종이식 거부반응은 어떤 항종항체가 없는 상태에서 발생한다

일반적으로 동물은 순환면역글로불린(circulating immunoglobulins)이 없으면 살 수 없다. 순환 면역 글로불린은 항원적 자극(antigenic stimuli)에 반응하여 림프구(lymphocyte)에 의해 생성된다. 그러나 초기 신생아 시기에는 수동적으로 전달된 모체의 면역 글로불린이 항체의 자체 생산을 위해 일시적으로 사용된다. 이와같이 수동적으로 전달된 면역 글로불린은 초기의 면역적 경험(immune experience)이 획득되는 동안 어린 생명체에 방어기전을 제공한다. 포유동물에 있어서 모체의 면역 글로불린의 수동적인 전달은 대개의 경우 태반을 통해서나 초유(colostrum)에 의해 전달된다. 그러나 어떤 소수의 종에 있어서는 태반의 구조가 모체의 항체가 이 경로에 의해 전달될 수 없도록 되어 있다. 돼지가 그런 종중의 하나이다. 이들은 모체의 항체가 초유에 의해 얻어진다. 그래서 갓 태어나서 어미의 젖을 먹지않은 돼지는 면역 글로불린이 없는 상태이다.

크고 흰 돼지를 출생시 취해서 젖을 먹이지 않고 뜨거운 물이든 통에 의해 따뜻하게 된 나무우리에 두었다. 한 배의 돼지새끼중 두마리가 각 실험에 사용되었다. 이들 돼지는 출생시 약 1kg이었다.

중량이 약 300gr되는 갓 태어난 뉴질랜드산 흰 토끼가 공여체로 사용되어졌다. 이들 토끼를 하이프놀(hypnol)과 디아제팜(diazepam)으로 마취시킨 뒤 복부를 복개하여 19게이지의 주사바늘로 대동맥에 삽입하였다(cannulated). 냉장된 카디오플레기아(cold +4℃ cardioplegia; 토마스 2호)를 심장 박동이 멈추고 카디오플레기아로 가득채워질 때까지 주입하였다. 냉각은 시린지로 찬 카디오플레기아를 외부에서 직접 냉각하였다. 그 다음 토끼의 심장을 일반적으로 사용되는 외과술(surgical techniques)로 제거하여 다음에 사용될때까지 +4℃ 의 심장보관용용액(cardioplegia solution)에 저장해두었다. 토끼의 심장은 지혈손상(ischaemic damage)에 상당히 예민하기 때문에 미리 조심을 할 필요가 있다.

수용체 돼지는 처음에는 할로탄/02 흡입으로 마취시켰고, 유선정맥(mammary vein)에 케타민(ketamin)을 정맥주사하여 마취상태를 계속 유지시켰다. 돼지에게계속하여 정맥주사로서 생리식염수를 넣어주어 탈수현상이 일어나지 않도록 하였다. 혈청(serum)과 EDTA혈액(EDTA blood) 샘플(sample)을 미리 이식시켰다.

헤론(Heron)의 방법 (Acta pathol. Microbiol. Scand. 79권, 366-372 페이지, (1971))을 사용한 후, 토끼의 심장이 돼지의 경부(neck)로 이식되어졌다. 대동맥(aorta)이 경동맥(carotid artery)에 가로로(6-0 prolene) 봉합되어졌고, 간동맥(pulmonary artery)이 경정맥(jugular vein)에 봉합되어졌다. 그 외의 다른 모든 혈관들도 이어졌다. 클램프(clamps)가 제거된 뒤 몇분 이내에 심장은 다시 박동하기 시작했다. 심장의 박동속도 (heart rate)는 디아스코프/ECG 모니터 (diascope/ECG monitor)로 철저히 관찰되어졌다. 실험을 하는동안, 돼지의 경부(pig neck)는 봉합되지 않았으며, 심장은 클링필름(cling film)으로 덮어서 건조되는 것을 방지하였다.

ECG 결과를 제 1A에서 1E에 표시하였다. 제 1A에서 나타난 추적(trace)결과에 의하면 정상적인 심장은 이식술이 끝난후 곧 박동을 한다는 것을 보여준다. 비정상적인 현상은 수십분 후에 (제 1D 도) 일어나며, 심장박동이 일어나지않는 데, 이것은 초급성 거부반응(hyperacute rejection)이 일어난다는 것을 입증하는 것이다.

그러므로, 본 실시예는 항체가 없는 상태에서도 디스코던트한 이종이식편 (xenograft)의 초급성 거부반응(hyperacute rejection)이 일어난다는 것을 입증해준다.

실시예2

실시예 1에 사용된 갓 태어난 돼지(neonatal pigs)는 항종항체(antispecies antibody)를 가지고 있지않다

토끼에 있는 항 돼지 면역 글로블린 G (Rabbit anti-pig IgG)가 그린우드등 (Greenwood et al)의 방법(Biochemical Journal 89권, 114-123페이지,1963) 및 데이비스 와 하워드 (davis and howard)에 의해 변형된 방법 (발표되지는 않았음)에 의해서 방사선 분석되어졌다(radioiodionated).

하기의 시약을 빠르게 연속적으로 폴리스티렌 튜브(polystylene tube)(LP2 6cm x 1cm)에 첨가되어진다.

단백질 25 - 50 l ( 1mg/ml 농도 )

Na125I 3 - 4 l (100 mCi/ml)

클로라민-T (chloramine-T) 10 ul (4 mg/5ml : 0.5 M)

인산나트륨완충용액 (sodium phosphate buffer)

* 반드시 사용하기 전에 새로 제조된 것이어야 한다.

이들 성분들을 계속해서 흔들어 주면서 30초동안 혼합한 뒤 다음의 시약을 빨리 첨가한다:

DL-티로신(DL-tyrosine) 50 ml (인산 나트륨 완충용액(pH7.5) 0.5ml에

녹아 있는 것).

2%/BSA/PBS/아지드(azide) 300ml

PBS/아지드(azide)에 세파덱스 G-25가 층이져(grade) 채워진 8cm x 1.0cm의컬럼(column)을 사용해서 반응되지 않은 요오드로 부터 표식된 단백질을 분리하였다. 요오드 반응 혼합물을 미리 준비된 G25 컬럼에 정량적으로 옮기고 PBS/아지드로 용출시켰다(eluted). 폴리스티렌 튜브(CP2)에 6방울의 분획(fractions)을 모았다. 단백질과 요오드 피이크(125I peaks)가 용출되고 모든 분획에서 방사능이 측정될 때까지 컬럼을 용출시켰다.

단백질에 들어간 방사능은 다음과 같은 방법으로 측정될 수 있다:

단백질에서의 방사능 카운터 = 처음의 총카운트-요오드 피이크에서의 카운트

방사능 표식된 면역 글로불린(radiolabelled IgG)('동위원소(isotope)'로 함)가 아래와 같이 갓 태어난 돼지에 있는 (돼지)항체의 분석에 사용되어졌다:

시료

PBS+0.01%아지드(azide) [옥소이드(Oxoid)]

PBS/BSB 1% [DSA-시그마(Sigma)]

동위체(isotope)-토끼 항-돼지 면역 글로불린 G(rabbit anti-pig IgG)

전체분자 12-18x103 counts/min.

열에 의해 불활성화 된 혈청(56℃,30분)

응고가 방지된 혈액 샘플(Anticoagulated blood samples)

방법

1. PBS에 토끼의 적혈구 세포가 현탁된 1% 현탁액을 제조하여 튜브에 10ml

첨가하였다. 상층액이 제거될 때까지 세포를 회전시켰다.

2. 성장한 돼지(포지티브-콘트롤)로 부터 얻은 혈청을 불활성 시켜 단계

별로 PBS/BSA에 희석한 희석액을 제조하였다. 0.025ml의 양을 붉은 세포

버튼들(red cell buttons)에 첨가한다. 튜브들은 4℃에서 4시간 동안

배양된다.

3. 배양 튜브들을 PBS/BSA로 깨끗이 3번 세척한 후 동위원소 0.05ml를 각

튜브에 첨가하고 4℃에서 밤새도록 배양시킨다.

4. 튜브들을 다시 세번 세척하고 감마 카운터(gamma counter)로 1분 마다

잰다.

5. 결과는 희석배수에 대한 분당 카운트(counts)의 수로서 도식화한다.

제 2 도에 결과를 나타내었다. 토끼 혈청은 네가티브 콘트롤 ( negative control)을 위해서 다자란 돼지(수유된) 혈청은 포지티브 콘트롤(positive control)을 위해 사용된다. 미리 수유된 돼지 2 의 돼지 항체 수준을 네가티브 콘드롤의 수준과 비교하였다.

실시예 3

보체 C3의 이종이식 파괴에 대한 관련성의 증거

버거 등[(Buger et. al.), Eur. J. Immunol, 16권, 7-11 페이지, 1986]에 의해 설명된 종에 근거를 둔 보체가 결핍된 모르모트가 실시예 1의 토끼에서 돼지로의 이종이식에서 설명한 것과 같은 방법으로 심장을 이식받았다. 쥐들은 에테르 흡입과 심정지법 (cardioplegia)에 의해 냉각하여 마취를 시키고 전에 설명한 바와 똑같이 시행하였다. 모르모트 공여체는 정맥주사(intravenous valium)와 피하근육 하이프놀(intramuscular hypnol)로 마취시켰다. 심장은 전에 설명한 것처럼 경부에 이식하였다. 정상적인 보체를 가진 모르모트는 수분 내에 이식 거부반응이 일어나므로 경부를 봉합할 필요가 없다. 실험동물들의 경부를 봉합하고 이식된 심장은 하루에 두번씩 촉진(palpation)에 의해 감시된다. 정상적인 ECGs가 수술후 여러시간 동안 관찰 되었으며 초급성 거부반응이 일어나지 않았다.

실시예 4

A. 돼지 림프구와 신장 세포는 부경로에 의해 사람의 보체를 활성화 시킨다.

그라바와 윌리암스[(Grabar and williams), Biochim. Biophys. Acta, 10권, 193페이지, 1953)의 기술에 의거하여 아가로우즈 젤(agarose gel) 1을 8x8 cm 유리판 위에 붓는다. 젤 혼합물 10ml가 필요하며 이것은 2% 아가로우즈 10ml와 베로날 버퍼(veronal buffer; VB) 5ml로 구성되어 있다. (VB는 75mM 바비톤 나트륨(Na barbitone), 10mM EDTA, 10mM NaN3, pH 8.5이다.) 아가로우즈와 VB는 사용하기전 60℃에서 같이 혼합되었다. 젤들을 붓고 냉각한다. 굳으면 젤은 1% 아가로우즈로 구성되며 두께가 1.5mm가 된다.

직경 3mm인 웰(wells) 3은 젤의 한쪽 끝의 약 1cm를 자른다. 각각의 웰은 실험을 수행하기위해 약 8 l의 시료를 포함시키다. 시료는 색을 띠게하기 위해 브로모페놀 블루(bromophenol blue)를 첨가하는 것 외에 특별히 준비할 것은 없다. 시료가 준비되면 젤을 전기영동 탱크의 플랫폼에 위치시킨다. VB(사용 버퍼)속에 담겨진 솜 심지(cotton wicks)는 웰에 가장 가까운 젤의 한쪽끝을 따라 부드럽게 가압되고 다른 심지는 아가로우즈의 반대편 끝에서 가압된다. (버퍼속에 심지의 끝이 잠겨있는가를 확인해야한다.) 브로모페놀로 표식된 알부민(albumin)이 양극 심지로 도달될 때까지 25-30mA의 전류가 흐른다. 이 공정은 2시간 반에서 3시간 정도 걸린다. 만일 둘 또는 그 이상의 젤이 동시에, 평행하게 이용된다면 흐르는 전류가 증가하게 되며 젤이 두개인 경우 50mA 그리고 세개인 경우 75mA 등등이 요구된다.

브로모 페놀 블루로 표식된 알부민 마커(albumin maker) 9의 이동에 의해 전기영동이 완결되었다는 것을 알게되면 젤을 전기영동 탱크에서 제거한다.

B. 2차 교차 면역전기영동(2-Dimensional Crossed Immunoelectrophoresis; 2-D Rockets)

(A)의 과정에 의하여 전기영동된 단백질이 함유된 스트립(strips) 11(제 4)을 자르고 새로운 유리판 13의 한쪽 끝에 놓는다. 표식된 단백질에 대하여 약 1%항혈청을 함유한 2% 아가로우즈와 VB의 1:1 혼합물 15를 판에 붓고 굳도록 둔다. 이것이 약 50℃의 온도로 냉각될 때 아가로우즈/VBS 혼합물에 항혈청을 첨가한다. 솜 심지를 통하여 음극 17 쪽으로 연결되는 1차 스트립을 포함하는 젤의 끝에서 양극 19에 연결되는 반대쪽 끝으로 위에서 설명한 바와 같이 로켓 판(rocket plate)은 전기영동된다. 젤은 젤의 크기에 의존하는 전류하에서 밤새 전기영동된다; 젤의 길이 8cm당 10mA가 필요하여서 길이가 16cm가 되면 20mA의 전류가 필요하다.

단백질들은 일차 (first dimension)로 전기영동되어 분리되고 이차(second dimension)로 전기영동되어 표식되고 계량된다. 표식 목적을 위한 염색은 하기되어 있다.

C. 젤의 짓누름과 염색

이 과정은 전형적인 면역전기영동 또는 로켓에 대해 같다. 염색된 젤은 미리 물에 적신 무섬유 POSTLIP(상표) 종이(Adlard Evans & Co)로 한 층을 덮는다. 그리고 나서 흡수성 종이 타월(absorbent paper towellling)로 6층으로 덮는다. 이것들을 1시간동안 짓누른 후 모든 종이를 제거하고 공정을 반복한다.

두번째 짓누른 후 젤은 흐르는 따뜻한 공기에 말리고 비침전성 단백질을 제거하기 위해 적어도 1 시간 동안 PBS에 담근다. 젤을 다시 건조시키고 0.5% w/v 쿠마시 브릴리언트 블루 G250(coomasie brilliant blue G250), 45% H2O, 45% 메탄올, 10% 초산의 용액 속에서 10분동안 염색시킨다. 젤은 20% 메탄올, 6% 초산으로 연속 세척에 의해 탈색된다. 그리고 다시 따뜻한 공기로 건조시킨다.

제 5 도는 건조 젤을 재생한 것이다. 로켓 1은 50 l 의 보통의 사람 혈청(HHS) 더하기 10mM EGTA가 포함한 25 l의 VBS가 함유된 네가티브 콘트롤이다. EGTA는 칼슘을 제거하는 키일레이트제이다; 칼슘은 고전적 경로의 보체 활성에 필수적이어서 EGTA가 존재한다는 것은 보체가 부경로에 의해서만 활성화 된다는 것을 확인시켜준다. 왼쪽(보다 큰) 피이크(peak)는 C3이며 오른쪽(보다 작은) 피이크는 활성화된 C3가 쪼개지면서 발생하는 C3bi이다. 그러므로 콘트롤에서 C3bi의 양이 적다는 것은 보체활성이 적어진다는 것을 나타낸다.

로켓 2의 경우는 75% 돼지 적혈구(v/v)가 버퍼용액에 첨가된 것이다. C3bi의 수준이 많은 정도는 아니지만 약간 증가하며 이것에 의해 돼지 적혈구가 사람의 보체를 단지 약간만 부경로에 의해 활성화시킨다는 것을 알 수 있다. 이런 반응에 대한 이유는 명확하지 않다.

로켓 3과 4의 경우는 75% 림프구(v/v) 또는 75% 돼지 신장 세포(v/v) 각각이 버퍼 용액에 첨가된 것이다. 각각의 경우 C3bi의 수준이 상당히 증가하였으며 이것으로서 돼지 적혈구에 의해 사람의 보체가 활성화된다는 것을 알 수 있다.

실시예 5

돼지 림프구는 돼지 보체의 존재하에서 사람의 항체에 의해 용해되지 않지만 토끼 또는 사람의 보체 존재하에서 용해된다.

크롬 방출 분석법(chromium release assay)은 돼지 보체, 어린 토끼 보체 또는 사람의 보체의 존재하에서 사람의 혈청에 의해 일어나는 세포의 용해를 감시하는 데 이용된다.

시료

림프구 분리 매체-플로우랩(Flowlab)

RPMI 1640+10% inact. FCS

PBS[아지드(azide)가 없는]-옥소이드(Oxoid)

V 웰드 플레이트(V welled plates)-스테릴린(Sterilin)

어린 토끼 보체(comp) 림프구(lymph)-혈청-lab-또는 인간 또는 돼지

보체(RPM1에서 1+7을 희석)

열적 불활성 혈청(56℃, 30분)

방법

1. PBS에서 1:1로 희석된 탈섬유화된(defibrinated) 돼지 혈액은 피콜 하이파크 림프구 분리 매체(Ficoll Hypaque lymphocyte separation medium) 위에서 층이 분리된다. 튜브들은 1200g, 20℃에서 30분간 회전된다.

2. 계면에 발생하는 돼지 림프구는 제거되고 PBS 로 한번 씻는다. 버튼은 RPM1 1640에서 재부유되고 세포 카운트(cell count)는 2x107/ml로 조절된다.

3. 51Cr 200 Ci가 2x107 세포 펠릿(pellet of cell)에 첨가되고 상온에서 1.5시간 동안 배양된다.

4. 표식된 세포들은(labelled cells) 5분의 사용을 위해 900g에서 두번 세척하고 RPM1 에서 마지막 세포 카운트(cell count)가 1x106/ml가 되도록 조정한다.

5. 일련의 희석된 것들로 시험중인 불활성 혈청 0.05ml는 콘트롤과 더불어 판 바깥으로 밀려나간다. 희석 보체는 관련된 웰에 0.05ml 첨가되고 다음 표식된 세포에 첨가하였다. 판들은 CO2 오븐(oven)에서 30℃로 1시간 동안 배양된다.

6. 배양한 후 판들은 900g, 20℃에서 쎌을 침강시키기 위해 15분간 회전된다. 100 l의 상층액이 튜브로부터 제거하고 감마 카운터(gamma counter)로 1 분 카운트(counts)를 수행한다.

7. 결과들은 희석배수에 따른 원래 표식된 쎌에 대한 %로서 그림을 그린다.

콘트롤(control)

완전 방출 콘트롤(FRC; Full realease control) - 50 ls 쎌(cells) +

100 ls H2O + 0.1% + 트윈(Tween)

네가티브 콘트롤(negative control) - 50 ls 쎌(cells) + 100 ls RPM1

보체 콘트롤(CC)-50 ls 쎌 + 50 ls 희석 보체(dil'd. comp.) + 50 ls

RPM1

결과

결과들을 제 6 도에 표시하였다. 돼지 림프구는 돼지가 아닌 즉 토끼 또는 사람의 보체가 존재하는 경우만 사람의 혈청에 의해 용해되며 돼지 보체의 존재하에서는 용해되지 않는다는 것을 알 수 있다. 이것으로 미루어 볼 때 하나 또는 그 이상의 동종보체억제인자(homologous complement restriction factors)가 돼지 세포에 존재한다면 돼지 보체의 활성을 성공적으로 억제할 수 있지만 사람 또는 토끼 보체의 경우는 활성을 억제할 수 없다는 것을 추론할 수 있었다.

실시예 6

이 실시예의 목적은 항체가 초급성 거부반응을 일으킬 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 이 응용은 항이식 항체(anti-graft antibodies)가 없는 경우에 초급성 거부반응이 발생하지만 이 반응은 기능적인 보체가 필요하다는 관찰의 결과에 그 기초를 두고 있다. 이것은 개념적인 관찰로서 항체가 이종이식 거부반응을 일으킨다는 것에 대한 증거 실험이 문헌에 없다. 자연적으로 생기는 항체의 존재하에서 이 항체들이 어떤 역활을 하는지 그렇지 않은지를 결정하기 매우 어렵기 때문에 그런 실험은 수행하기 어렵다. 이 실시예에서는 적절한 특정 항체의 주입에 의해 콘코던트한(concordant) 이종이식편을 디스코던트한(dicordant) 이종이식편으로 바꿈에 의해 항체의 역활을 알아보았다. 이 연구에 이용된 수용체는 무게가 250-300g 정도되는 3-6개월 사이의 PVG종의 수컷 쥐[영국, 옥손., 비세스터, 밴팅 및 킹덤(Banting & Kingdom, Bicester, Oxon., UK)]이다. 심장 공여체는 100-150g 정도의 밴팅 및 킹덤(Banting & Kingdom)의 시리아 햄스터(Syrian hamsters)이다. 심장이식은 헤론(Heron)의 방법(실시예 1의 loc. cit.)을 따라 수행하였다. 햄스터 심장은 커프 기술(cuff technique)에 의해 대동맥과 경동맥 (carotid artery) 그리고 폐동맥(pulmonary artery)과 경부 동맥(jugular vein)을 연결하여 쥐의 경부로 이식되었다. 모든 다른 혈관은 묶었다. 혈관 클램프(vascular clamps)를 푼 수분 후 심장이 뛰기 시작하였고 외부 촉진(external palpation)에 의해 감시된다. 모든 작동은 할로탄(halothane)과 산소의 흡입에 의해 동물이 마취된 상태에서 수행한다.

항-햄스터 용해성 항체(anti-hamster lytic antibody) 수준은 다음과 같이 측정되었다; 1% 햄스터 적혈구 용액(hamster erythrocyte solution) 50 l를 순차적으로 희석된 시험 혈청 50 l에 첨가한다. 7개의 희석된 어린 토끼 보체[서섹스, 크롤리 다운, 세라 랩(Sera Lab, Crawley Down, Sussex)]중 1의 50 l를 첨가하고 37oC에서 1시간동안 배양한다. 보체 고정 희석액(fixation diluent) 750 l를 첨가하고 상층액의 OD415를 측정한후 원심분리[벡크만 마이크로퓨지(Beckman MICROFUGE), 4분간 13000rpm]시킨다. [ 마이크로퓨지(MICROFUGE)라는 말은 상표이다.] 포지티브와 네가티브 콘트롤 (positive and negative control)은 1% 세포 용액들 각각에 첨가되는 CFD와 증류수이다. OD415의 결과들을 혈청 적정을 x축으로하여 그림으로 표시하였다. 제 7 도를 보면 알 수 있듯이 햄스터 심장을 쥐에 이식하면 쥐에서 고 수준의 용해성 항-햄스터 항체가 생성된다. 이들 쥐들중 몇몇의 쥐에서 얻은 혈청들은 표준 컬럼 크로마토그라프 기술(standard column chromatography)을 이용하여 세파덱스(SEPHADEX) G200[런던, 파르마시아 GB 사(Pharmacia GB Ltd, London])으로 컬럼 크로마토그라프에 의해 성분 단백질편들(component protein fractions)을 분리하였다[컬링(Curling),'생물학적 물질의 분리, 정제 그리고 특성화에 있어서 세파덱스의 이용', 커쿠트 편집(G.A. Kerkut Ed.), 아카데미 출판사, 런던과 뉴욕, 1970; 컬링, Exp. in Physiol. and Biochem., 3권, 417-484, 1970]. (세파덱스라는 말은 상표이다.) 컬럼으로부터 포집된 각 7ml 분획은 위에서 언급한 바와같이 용해성 항-햄스터 활성을 조사하기 위해 분석되었다. 제 8 도는 이들 항체들이 심장 이식의 결과로서 유도되었다는 사실에도 불구하고 항종(anti-species) 활성은 IgM 부분에만 거의 전적으로 존재한다는 것을 보여준다. 활성을 분석한후 각 시편들(fractions)은 CX10 한외 여과(ultrafiltes)[파르마시아(Pharmacia)]를 이용하여 0.5mg/ml의 농도로 농축되어 사용할 때까지 -70℃에서 보관한다.

레드 새포(red cell)를 용해하는 것과는 반대로 이종이식편을 파괴하는 능력을 시험하기위해 햄스터 심장을 신생 쥐의 경부에 이식하였다. 햄스터의 심장이 뛰기시작하자마자 깨끗한 혈청(neat serum) 2ml 또는 용해성 항-햄스터 항체를 함유한 정제된 면역 글로불린(immunoglobulin) 0.5mg을 쥐들에 주입하였다. 분리되지 않은 혈청 그리고 0.5mg의 IgM 은 햄스터 심장 이식편을 15분안에 파괴시켰다. IgG의 주입에 의한 결과들은 어떤 제조품과 불일치하여 이식이 실패하였으며 반면에 다른 것들은 이식편이 계속 박동을 하였다. G200 컬럼으로 부터 나온 알부민이 콘트롤(control)로서 주입될 때 심장 이식편들은 항상 생존하였으며 이 모델에 대하여 3일의 시간 후에 거부반응이 일어났다. 이것은 이 항체의 이식편에 대한 결합이초급성파괴를 일으킨다는 증거를 보여준다.

실시예 7

이 때까지의 실험 결과는 이종이식편의 파괴가 부경로나 항체-매개성 보체 활성화 반응(고전적 경로)에 의한 보체 활성화 때문에 일어나는 것임을 밝혀주고 있다. 더우기 이종이식편의 표면에 보체 조절자(regulator)가 있게되면 동종의 보체(homologous complement)에 의한 파괴는 일어나지 않지만 이종의 보체(heterologous complement)에 의한 파괴는 방지되지 않는다. 두가지 보체 활성화 경로에 공통된 중요한 활성화(critical activation step)는 보체성분 C3의 분해이다. C3의 분해는 C3전환효소인 C4b2a(고전적경로에 있어서의 C3전환효소) 또는 C3bBb(부경로에 있어서의 C3전환효소)에 의해 일어난다. 이들 효소는 C3를 분해하여 C3b를 만들고 C3은 다시 부경로에 관여하여 더 많은 C3전환효소를 형성한다(피이드백 루프). 결과적으로 보체계는 외부물질(foreign)에 C3b가 축적되는 것을 빨리 증폭시킬 수 있다. 그러나 많은양의 C3b가 외부물질에 작용하지 못하고 액상(fluid phase )으로 존재해서 숙주세포와 결합한다. C3b가 숙주세포에 결합하여 공격하는 것으로부터 숙주세포를 보호하기 위하여 액상으로 있는 보체성분이든지 자기조직(self tissue)에 결합되어져 있는 보체성분이든지 간에 이들 보체성분을 불활성화시키기 위해서는 조절 단백질(control proteins)이 관여한다. C3조절에 관여하는 이들 당단백질들(glycoproteins)은 RCA(보체활성조절인자) 부위라 불리우는 사람의 염색체 1 영역내에서 유전적으로 연관되어있다. 본 실시예에서는 융합기술(fusion techniques)에 의해 사람의 염색체 1이 획득되어 그들세포의 표면에 RCA부위의 단백질이 발현되는 생쥐세포는 비록 그들이 생쥐 세포가 아니라 사람 세포였다 하더라도 시험관 상의 분석에서는(in vitroassay) 이종이식편파괴(xenograft destruction) 현상을 나타낸다는 것이 관찰되었다.

세포계(cell lines)

T5는 버드 등의 기술에 의해(Nature, 289권, 300-301페이지, 1981) 엡스테인 바 바이러스에 의해 형질전환된 편도선 B-세포계(Epstein Barr virus-transformed tonsil B-cell line)이다. B10은 생쥐의 골수세포계 X63-AG8.653과 사람의 B림프아구성 세포계(human B lymphololastoid line; BLL)를 세포융합해서 유도된 융합세포(hybridoma)를 생산하는 사람의 항-파상풍 단일 클론성 항체(human anti-tetanus monoclonal antibody)이다.[키에르니 등,(J. Immunol., 123권, 1548-1550페이지, 1979)] T5 및 B10 세포계는 캠브리지, 바브라함(Babraham, Cambridge)에 있는 MRC MITI 그룸의 카터(MsC Carter)씨와 엔 C 휴즈-존스 박사(Dr N C Hughes-Jones)로 부터도 얻을 수 있다. DB3은 항-프로게스테론 단일클론성 항체(anti-progesterone monoclonal antibody)를 생산하는 생쥐의 융합 세포계(mouse hybridoma cell ilne) 이다. (라이트 등, Nature, 295 권, 415-417페이지, 1982) 사람의 염색체 1에 대해 특이적인 하기의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (oligonucleotide primers)가 얻어졌다:

5'-CCACAGGTGTAACATTGTGT-3' [Seq ID No:1] 그리고

5'-GAGATAGTGTGATCTGAGGC-3' [Seq ID No:2]

사람의 염색체 1에 있는 것으로 알려져 있는 사람의 안티트롬빈 2 ( humanantithrombin 2; AT3 ) 유전자의 업스트림 (upstream) 그리고 다운스트림 (downstream) 프라이머(primers)들이 각각 있다. 위의 올리고뉴클레오타이드는 본 발명이 속하는 기술분야의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 합성될 수도 있다.

고분자량의 제놈성 DNA( genomic DNA )는 허만 및 프리쇼프(Herrmann and Frischauf)의 방법(Methods Enzymol, 152권, 180-183페이지, 1987)을 이용하여 제조되었다. 간단히 설명하면 배양된 세포계로 부터 100x106의 세포를 TNE용액(100mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 1% Sarrkosyl) 5ml로 세포 용해시키고(lysed) 신선한 프로테나제 K(proteinase K)(ml당 100 g)로 처리한 뒤 페놀[물로 포화시키고 pH 8, 0.1M의 트리스용액으로 평형시킨 것임 (equilibrated)], 페놀/클로로포름 (1:1 v/v) 및 클로로포름 이소아밀 알콜 (chlroform isoamyl alcohol; 24:1 v/v)로 정제하였다. 에탄올 침전법으로 DNA를 얻어서 TE용액 ( pH 8.0, Tris 10mM, EDTA 1mM )에서 투석하여(dialysed) 4℃, TE용액에 두었다. 분리된 DNA는 0.5% 아가로우즈 젤(agarose gel)에서 분석하였고 260nm에서의 광학 농도(optical density)로서 DNA의 농도를 결정하였다. 각 세포계의 폴리메라제 연쇄반응 ( polymerase chain reaction; PCR)은 사이커 등이 설명한대로 행하였다( Science, 293권, 487-491페이지, 1988). 제놈 DNA(genomic DNA) 500ng, 각 프라이머 1.2 ng, 택 DNA 폴리메라제(Tag DNA polymerase)(Thermos acquaticus type 3)(영국, 캠브리지, 캠비오 리미티드 제품) 2.5 단위를 택 DNA 폴리메라제 효소에 적합한 완충용액에 넣어 부피가 100ml가 되게 하였다. 뉴클레오티드(dNTPs)(영국, 이스트석쎄스, 루위스, 보헤린저 맨하임 다이아그노스틱 엔드 바이옥메미칼 리미티드 제품)를 각각 2mM농도가 되게 넣어주었다. DNA는 93℃에서 1분동안 변성되었다가(denaturating), 55℃에서 1분동안 어닐링(annealing), 72℃에서 2분동안 합성되도록(extension) 프로그램 가능 열조절장치(programmable thermal controller)(영국, 엑세스, 둔모우, 지네틱리서치 인스트루먼테이션 리미티드 제품)를 사용해서 30회 증폭되었다. 반응생성물 10 l를 2% 아가로우즈 젤에 로딩하여 TBE 완충액 [ 트리스 붕산 EDTA 완충액(Tris boric acid EDTA buffer]에서 전기영동하여 직접 분석하였다. 생성된 DNA의 길이는 HincII로 절단된 박테리오 페이지 X-174-rf DNA(스웨덴, 옵살라, 파르마시아 LKB 바이오테크놀로지사 제품)와 비교해서 결정하였다.

배양한 T5, B10 및 DB3세포를 항-DAF(분해 촉진인자) 단일 클론성 항체 및 형광-결합된 2차 항체(fluorescence conjugated second antibody)로 처리하였다. 세포(1x106)를 생쥐 항-DAF 단일 클론성 항체 IA10(10% FCS, 0.1% azide 100 l에 IgG 2a 10 g/ml를 넣어 만든것임)와 반응시켰다. IA10[키노시타 등(J. Immunol., 136권, 3390-3395, 1986)]은 미국 뉴욕주 뉴욕대학 의학센터 M. 다비쯔 박사로부터 얻었다. 블랭크 콘트롤(blank control)로서는 완충액만 있는 것을 사용하였다. 2시간동안 얼음상태에서 배양한 뒤에 세포를 3번 씻고 재현탁한 뒤, FITC가 결합된 염소의 F(ab')2 항-생쥐 면역 글로불린(FITC-conjugated goat F(ab')2 anti-mouse IG)(미합중국 캘리포니아주 버링감 타고 이뮤노케미칼 리미티드 제품) 100개중 1개가 1시간동안 배양하였다. 어떤 세포는 염색 콘트롤(staining controls)로서 2차항체만 가지고 배양하였다. DB3은 생쥐의 IgG1-분비성 세포계이기 때문에 FITC가 결합된 양의 항-생쥐 IgG2A(영국, 버밍검, 바인딩사이트 리미티드 제품) 40개중 1개 또는 DB3 세포를 동일한 양 미리 흡수한 염소의 항-생쥐 면역 글로불린 G가 DB3 세포를 염색할 때 발생하는 항-IgG1 반응성을 없애기 위해 또한 사용되어졌다. 모든세포를 씻어서 200 l의 완충액에 다시 현탁시켰다. 형광 - 활성 세포 종류 분석 [fluorecence-activated cell sorting (FACS) analysis]에 사용되는 벡톤 디킨슨 FACS-STAR기구를 사용해서 DAF 야성세포가 검출되었다. (FACS-STAR은 상표임.)

3가지 서로다른 종류의 배양세포계인 T5 사람 B10(사람-생쥐) 및 DB3(생쥐-생쥐)에 있어서 사람 염색체 1의 존재여부를 알아보기 위해 PCR 방법이 사용되어졌다. 제 9 도는 DNA가 증폭된 후에 T5와 B10은 모두 495 염기쌍의 위치에 밴드(band)가 나타났으나(즉 495염기쌍의 크기를 가지며) DB3(즉 생쥐-생쥐의 융합세포)은 어느위치에서도 밴드가 나타나지 않는다는 것을 보여주고 있다. AT3 프라이머를 사용한 PCR 생성물들은 572 염기쌍의 크기를 갖는 것(alleles 1)과 496염기쌍의 크기를 갖는 것(alleles 2)의 2가지 유전인자(2 alleles)로 구성되어져 있다고 보고되어져 있다.(위 등, loc. cit.) T5와 B10의 제놈 DNAs에서 발견되는 밴드는 제 2 유전인자(allele 2)와 일치한다. 이것은 사람과 생쥐의 융합세포계(human mouse hybrid cell line)인 B10이 사람의 염색체 1을 포함하고 있다는 것을 나타내주고 있다.

DAF의 존재여부를 알기위한 FACS분석법은 사람의 T5세포의 대다수가(85.7%) 항-DAF 단일 클론성항체(anti-DAF monoclonal antibody)와 포지티브하게 염색되어졌다는 것을 나타내주었다. 생쥐와 사람의 융합세포인 B10세포에서도 비슷한 정도(83.1%)의 포지티브한 세포가 발견되어졌다. 생쥐와 생쥐의 융합세포인 DB3세포는 항-DAF를 처리한 경우와 처리하지 않은 경우에 있어서 동일한 염색 양상(staining patterns)을 나타내주었다. 그러나 만일 (1) FITC가 결합된 양의 항-생쥐 IgG2a가 사용되어졌거나 또는 (2) 상기의 염소의 항-생쥐 IgG가 DB3세포로 미리 흡수되어졌다면 이와같은 항-생쥐 IgG1활성은 제거되어졌다. 결과는 특정 항-DAF 단일 클론성 항체에 의해 검출되어진 것 처럼 사람과 생쥐의 융합세포계인 B10이 세포막 표면에 사람의 DAF를 발현한다는 것을 보여주고 있다. 발현의 정도는 사람의 세포계인 T5에서와 동일하다. 생쥐와 생쥐의 융합세포계(mouse-mouse hybridoma cell line)는 사람의 DAF를 발현하지 않는다.

크롬방출에 의한 세포독성 세포사멸(cytotoxic cell killing)에 대한 연구가 상기의 실시예 5에서 설명된 바와같이 이들 세포계에서도 행해졌다. 제 10 도는 돼지의 항-사람 항체가 T5사람 세포계와 배양될 때 토끼의 보체가 첨가되면 세포 용해가 일어나는 반면 사람의 보체가 첨가되면 세포용해가 일어나지 않는 데 이것은 물론 C5세포계가 사람의 HCRFs를 보유하고 있기 때문일 것이다. 이것은 실시예 5의 결과에 의해서도 확인이 된다. 사람의 항체가 사람의 세포계에 사용될 때에는 사람의 보체에 의해서든지 토끼의 보체에 의해서든지 세포용해는 일어나지 않는 데 이것은 자가 항체가 없다는 것을 나타내는 것이다. 크롬 방출 기술에 의해서는 사람세포에 의해서 토끼의 보체가 활성화 되는 부경로상의 어떤 중요한 단계를 알아내기에 충분할 만큼 오랫동안 계속해서 배양을 할 수 없다.(제 11 도) 그러나 사람의 항체가 생쥐-생쥐 융합세포계(hybridoma cell line)과 배양될 때에는 세포는 사람의 보체나 토끼의 보체에 의해 모두 사멸되는 데 이것은 실제 사람의 보체가 이와같은 분석에 기능을 할 수 있다는 것을 나타내 주는 것이다. 사람의 염색체 1을 가지고 있고 적어도 DAF를 발현하는 것으로 알려져 있는 사람과 쥐의 융합세포인 B10이 사용될 때는 토끼의 보체는 세포용해를 일으키는 반면 사람의 보체는 세포용해를 일으키지 못한다(제 13 도). 이와같은 현상은 생쥐와 사람의 융합세포가 가지고 있는 염색체 1에 의해서 발현된 사람의 HCRFs가 사람의 보체 활성을 억제하기 때문인 것으로 설명된다.

실시예 8

실시예 7은 염색체 1이 있으면 이종이식세포의 파괴를 방지할 수 있다는 것을 보여준다. 실시예 7은 생쥐세포에서 이종이식파괴가 일어나는 것을 방지하는 CRA 부위(CRA locus)가 염색체 1에 있다는 것을 보여주는 강력한 간접적인 증거인 반면 실시예는 이에대한 구체적인 증거를 제공한다. 본 실시예에서는 사람의 MCP를 사람이 아닌 다른 종의 세포주에 이전했을 때의 효과와 사람이나 토끼의 보체에 이들을 노출시켰을 때의 효과를 나타내주고 있다.

MCP에 대한 cDNA가 루블린 등(Lublin et. al.) (J. Exp. Med., 168권, 181-194페이지, 1988)에 의해 자세히 설명한대로 제조되었다. MCP의 형질이 이전된 세포주(transfected cell lines)는 흘브리즈 등(uhlbrigge et. el.)에 의해 설명된 기술(Proc. Natl. Acad. Sci., 85권, 5649-5653페이지, 1988)에 의해 발현 프라스미드 SFFV.neo(expression plasmid SFFV.neo)를 사용하여 만들어졌다. 이것은 바이러스 5'-말단 염기서열(virus 5'-long terminal repeat)을 형성하는 프렌드 비장부위(friend spleen focus)를 포함하고 있다(SFFV.LTR)(클락 및 마크)(Nucl. Acids Res., 120권, 3315-3330 페이지, 1982) 및 (Proc. Natl. Acad. Sci., 80권,5037-5041페이지,1983). 세포주는 미합중국 메릴랜드주 록빌 아메리칸타입 컬춰 콜렉션 12301 파아크론 드라이브(American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA.)로 부터 얻었다. 유전자의 발현은 MCP에 대한 단일 클론성 항체의 사용(앤드류 등, Ann. Hum. Genet., 49권, 31-39페이지, 1985) 및 앞에서 이미 설명한 바 있는 FACS 분석법에 의해서 확인하였다. 어떤 경우에 있어서는 표준기술(Standard technique)을 사용해서 FACS 분석결과에 따라 세포를 선별하여 MCP에 대한 발현정도가 높은 세포주를 선택하였다.

본 실시예는 CHO 세포에 MCP를 형질이전 했을 때의 효과에 대해서도 나타내주고 있다. 이들 세포주(cell lines)는 단층으로(monolayers) 성장하기 때문에 세포의 사멸은 데 보노 등에 의해 설명된 터미날 아데닌 흡수 분석법(terminal adenine uptake assay)(Immunology, 32권, 221-226페이지, 1977)에 의해 추적되어졌다. 이 분석방법을 간단히 설명하면 밑바닥이 평평한 96개의 웰을 가진 멸균된 플레이트(flat-bottomed strile 96 well plates)에서 세포배양액을 보체 및 항체와 함께 배양시킨다. 배양이 끝나면 배양액이 방사능 아데닌(radioactive adenine)을 흡수할 수 있는지의 여부에 의해서 세포의 생존이 추정된다. 살아있는 세포는 아데닌을 흡수하지만 죽은세포는 흡수하지 않을 것이다. 그래서 살아있는 세포는 방사능 카운트가 높게 나타나고 죽은 세포는 낮은 방사능 카운트를 나타낸다.

형질전환된 세포의 많은 경우에 있어서 공통적으로 CHO는 자연적으로 생성되는 항체와 부경로에 의한 보체활성에는 민감하지 않지만 실시예 6에서 설명된 바와같이 햄스터(hamster; 쥐의 일종)의 심장 이종이식파괴를 초래하는 항체에 대해서는 민갑하다. CHO세포는 햄스터로 부터 유도된 것이기 때문에 이들 항체는 사람과 토끼의 보체 모두에 의해 CHO세포를 사멸시켰다(제 14 도). CHO세포가 사람의 MCP에 의해 형질이전되면 세포는 토끼의 보체에 의해서만 세포용해될 수 있다. 햄스터 세포계(hamster cell line)의 표면에 사람의 MCP가 있으므로서 사람의 보체는 활성이 억제된다(제15도 ). 세포가 사멸되지 못하는 것이 C3전환효소의 작용이 일어나지 않기 때문이라는 것에 대한 증거는 CHO 세포 배양 후 사람의 C3분해에 대하여 상기 실시예 4에서 설명한 로켓면역 전기영동법(rocket immuno-electrophoresis)에 의해 분석할 수 있다. 실험에서 알 수 있는 바와 같이 C3 보체의 분해는 콘트롤로 사용한 보체의 수준이상은 일어나지 않는다(제 16도 ).

본 실시예의 결과는 유전적으로 조작된(genetically engineering) 보체 활성 저해 조절 단백질(complement down-regulatory proteins)이 사람이 아닌 다른 세포(non-human cells)의 표면에 있으면 이들 세포가 보체성분중 C3의 분해에 의해 야기되는 초급성 이종이식편 거부반응의 기작으로부터 보호될 것이라는 것을 확실시해주고 있다.

실시예 9

실시예 8의 과정에 따라서 3T3 생쥐의 피브로블라스트 세포 ( fibroblast cells)가 MCP를 코딩하는 cDNA(MCP 클론 K5.23)로 형질이전 되어졌다. 51Cr이 실시예 5에서 기술된 바와같은 방법으로 세포에 첨가되었다. 그다음 세포와 열에 의해 불활성화된 사람 보체(human heat-inactivated complement) 및 사람의 보체에서 항-생쥐 항체를 제거하기 위해 4℃에서 생쥐의 비장세포 (spleen cell)로 미리 흡수된 사람의 보체를 동일 부피 비율로 넣어서 배양하였다. 혼합 배양액과 일련의 보체 희석액 ( serial dilutions with complement)을 플레이트에 깔았다. 실시예 5에서 설명한 것과 같은 실험조건과 크롬방출분석법이 사용되어졌다. 클론 K5.23에 대한 결과가 제17도 에 나타나 있는 데 제 17도는 또한 콘트롤로서 MCP의 cDNA가 역방향(reverse orientation)으로 도입되었을 때의 효과에 대해서도 보여주고 있다.(이 경우는 유전자의 전사(transcription)가 일어나지 않는다.) 51Cr의 방출양이 상당히 낮은 경우 정확하게 전사된 MCP의 cDNA(correctly transcribed MCP cDNA)는 세포가 사멸되는 것을 방지할 수 있는 반면 51Cr의 방출양이 상당히 높은 경우 전사되지 않은 cDNA(non-transcribed cDNA)는 세포의 사멸을 방지하지 못한다.

실시예 10

상기 실시예 8에서 설명한 바와 비슷한 결과가 DAF에 대한 cDNA로 형질전이된 L1/210 세포(생쥐의 백혈구 세포계)에서도 얻어질 수 있다. cDNA는 루블린 및 아트킨슨(Lublin & Atkinson)(Ann. Rev. Immunol., 7권, 35-38페이지, 1989)에 의해 설명된 방법으로 제조하였다.

실시예 11

MCP의 cDNA가 상기 실시예 8에서와 같이 제조되고 SFFV.neo 플라스미드에 통합되어졌다(ligated).

이와 같이하여 제조된 DNA를 사용하여 콜드 스프링 하버실험실(Cold Spring Harbour Laboratory)의 호간 등(B. Hogan et el)의 실험 매뉴얼(1986)중 쥐의 배 처리부분(Manipulating Mouse Embryo)에서 설명한 것처럼 트란스제닉한 생쥐(transgenic mice)가 생성되었다. 3-4주된 15마리의 (CBAxB10)F1 암컷 쥐들중 10마리가 임신한 암말로 부터 뽑아진 5단위의 혈청 생식선자극호르몬(serum gonadotrophin)[폴리곤(Folligon)으로 상업적으로 공급되는]의 복막내(intraperitonal) 주사에 의해 과배란시키고 48시간 후 임신한 사람의 오줌으로 부터 뽑아진 5단위의 융모막선 생식선자극호르몬(chorionic gonadotrophin)[코룰론(Chorulon)으로 상업적으로 공급되는]의 복막내 주사를 하였다. 암컷들은 코룰론(Chorulon)이 주사되는 날 (CBAxB10)F1 수컷과 교배시키고 다음날 질 플러그(vaginal plug)로 질이 막혀진 암컷들은 경부 이탈(cervical dislocation)에 의해 죽게되고 수정된 난자들은 그들의 수란관으로 부터 분리된다.

이런 방법으로 분리된 400개의 난자중 3개는 400배 확대에 의해 노마스키 미분간섭대조광학기(Nomarski differential interference contrast optics)로 명확히 볼 수 있는 두개의 전핵(pronuclei)을 함유하고 있다. 두개의 전핵중의 하나는 농도 범위가 0.5-2 ng/ l인 MCP cDNA 트란스진(transgene)이 함유된 제조 DNA의 약 2000개의 복제 DNA(2000 copies of DNA preparation)와 같이 주사한다.

미량주사에도 살아남은 난자들은 정관이 절제된 수컷과 전날 밤 교배시킨(CBAxB10)F1 암컷의 수란관으로 주입하였다. 그러므로 이것들은 가임신된(pseudopregnant) 상태이다(즉 이것들은 배란을 하고 호르몬 상태는 임신한 상태이지만 이것들 자신의 난모세포(oocytes)는 수정되지 않았다). 약 30개의 미량 주사된 난자는 마취된 상태에서 미량주사를 한 날 또는 난자가 2-세포 단계(2-cell stage)에 있는 다음 날 임신한 암컷의 수란관으로 전달된다. 후에 수태가 정상적으로 일어났으며 열마리의 어미로 부터 17마리의 쥐가 태어났다. 32P로 표시된(32P-labelled) 프루브(probe)와 트란스진을 인식하는 프라이머(primers)를 이용하는 꼬리 피부 세포(tail skin cells)에서 나온 DNA를 분석하는 슬롯 블롯(slot blot) 및/또한 서던 블롯(Southern blot; 실시예 8을 보라) 그리고 PCR에 의해 새끼를 분리한다. 새끼들 중에 수컷 한마리가 MCP DNA 염기서열에 대해 트란스제닉하다는 것이 판명되었다.

실시예 12

실시예 10에 설명된 것처럼 DAF의 cDNA가 MCP의 cDNA대신에 사용되는 것을 제외하고 실시예 11의 과정을 반복하였다. 23마리의 새끼가 열마리의 어미로 부터 태어났다. 서던 블롯팅(Southern blotting)에 의해 알 수 있듯이 그들 중 DAF에 대해 트란스제닉한 것이 셋(암컷 2, 수컷 1) 얻어졌다.

실시예 13

사람 MCP cDNA 트란스진을 함유한 실시예 11에서 얻어진 수컷 쥐를 키워서 (CBAxB10)F1 암컷과 교배시켰다. 11마리의 새끼가 태어났다. 각 새끼로 부터 얻어진 꼬리 세포 DNA(tail cell DNA)는 트란스진(transgene)이 유전되었는지를 결정하기위해 프루브(probe)로서 표식된 사람의 MCP cDNA를 이용하는 슬롯 블롯(slot blot) 분석에 의해 분리된다. 결과들은 제 18의 상부에 표시하였다. 이것을 보면 새끼 0, 1, 5, 7, 8 그리고 10이 유전되었다는 것을 알 수 있다. (네개의 콘트롤이 시도되었다: 사람 DNA(H); 쥐 DNA(M); 10pg의 표시된 사람 MCP cDNA 와 혼합된 쥐 DNA; 100pg의 표시된 사람 MCP cDNA 와 혼합된 쥐 DNA .)

실시예 14

사람 DAF cDNA 트란스진을 함유한 실시예 12에서 얻어진 수컷 쥐를 키워서 (CBAxB10)F1 암컷과 교배시켰다. 11마리의 새끼가 태어났다. 각 새끼로 부터 얻어진 꼬리 세포 DNA(tail cell DNA)는 트란스진(transgene)이 유전되었는지를 결정하기위해 프루브(probe)로서 표식된 사람의 DAF cDNA를 이용하는 슬롯 블롯(slot blot) 분석에 의해 분리된다. 결과들은 제 18도의 하부에 표시하였다. 이것을 보면 새끼 13.3(암컷)이 유전되었다는 것을 알 수 있다. (네개의 콘트롤이 시도되었다: 사람 DNA(H); 쥐 DNA(M); 10pg의 표시된 사람 DAF cDNA 와 혼합된 쥐 DNA; 100pg의 표시된 사람 DAF cDNA 와 혼합된 쥐 DNA .)

염기서열 리스트(SEQUENCE LISTING)

서열 ID 번호 (SEQ ID NO): 1

서열 형태 : 뉴클레오티드

서열길이 : 20

성질 : 사람의 항 트롬빈 (human antithrombin 2)(AT3)유전자의 업스트림전사개시제(upstream primer)

서열 : CCACAGGTGT AACATTGTG

서열 ID 번호 (SEQ ID NO) : 2

서열 형태 : 뉴클레오티드

서열길이 : 20

성질 : 사람의 항 트롬빈 2 (AT3) 유전자의 다운 스트림 전사개시제 (downstream primer)

서열 : GAGAAGTGT GATCTGAGGC

발명에서 변화와 변경은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와같이 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않고 행해질 수 있다고 이해되어야 한다.

Claims (16)

1. 이식치료에 사용하기 위한, 공여체종의 이식가능한 동물세포 또는 조직으로서,

   상기 세포 또는 조직은, 보체의 완전한 활성을 방지하기 위해 수용체종에 사용될 수 있는 하나 이상의 동종보체억제인자(HCRFs)와 결부(associated)되어 있고,

   상기 공여체종은 수용체종에 대하여 디스코던트(discordant)하며,

   상기 동물은 인간을 제외한 동물인 것을 특징으로 하는 이식에 적합한 동물세포 또는 조직.
2. 제 1항에 있어서, 조직이 장기인 세포 또는 조직.
3. 제 2항에 있어서, 장기가 심장, 폐, 간, 신장, 췌장 및 갑상선인 세포 또는 조직
4. 제 1항에 있어서, 조직이 혈액 또는 조혈세포, 랑게르한스섬, 뇌세포 및 내분비기관(endocrine organ)으로부터 세포인 세포 또는 조직.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, HCRF가 고전적 보체활성화 경로 및 부 보체 활성화 경로 모두에 공통적인 보체활성화 케스캐이드 중 어느 단계를 방해하는 세포 또는 조직.
6. 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, HCRF가 천연 HCRF인 세포 또는 조직.
7. 제 5항에 있어서, HCRF가 C3에서 보체활성화를 조절하는 세포 또는 조직.
8. 제 7항에 있어서 HCRF가

   I인자(이미 C3b 불활성화제 또는 KAF로 알려져 있음);

   H인자;

   C4 결합 단백질;

   DAF(CD55로서도 알려져 있음);

   막실 조인자 단백질(MCP; 또한 CD46으로서 알려져 있으며 처음에는 gp45-70으로서 설명되었고 이후 gp66/56으로서 알려짐)

   CR1(C3b/C4b 리셉터 또는 CD35로서 알려져 있음); 및/또한

   CR2(CD21, C3.dg 리셉터, 3d/EBV 리셉터 및 P140으로 알려짐)이거나 이들의 활성을 갖는 세포 또는 조직.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, HCRF가 염색체 1의 q32위치에 염색체 지도 작성되는 RCA(보체활성 조절인자) 부위에 유전자가 위치한 천연 HCRF의 활성을 갖는 세포 또는 조직.
10. 제 5항에 있어서, HCRF가 C8 및/또는 C9에서 보체활성을 조절하는 세포 또는조직.
11. 제 10항에 있어서, HCRF가

    C8bp(또한 HRF 또는 MIP로 알려져 있음);

    P-18(HRF-20, CD59 또는 MIRL로서도 알려져 있음); 또는 SP40.40

    이거나 이들의 활성을 갖는 세포 또는 조직.
12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, HCRF가 막에 결합되어 있는 세포 또는 조직.
13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, HCRF가 공여체 조직의 세포막에 결합된 상태로 제공되는 세포 또는 조직.
14. 제 13항에 있어서, 수용체에 이식되었을 때 수용체종에서 활성을 띠는 한 개 이상의 HCRFs를 코딩하는 핵산을 가지고 있으며 이들을 발현하는 공여조직이 트란스제닉한(transgenic) 세포 또는 조직.
15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체종이 사람인 세포 또는 조직.
16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 공여체종이 돼지인 세포 또는 조직.