PT95580B - Processo para a preparacao de material biologico modificado - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 95.580 tí
REQUERENTE: IMUTRAN LIMITED., britânica, industrial, em 21 Holborn Viaduct, London EC1A 2DY INGLATERRA
EPÍGRAFE:
PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE MATERIAL BI0L0GIC0 MODIFICADO
INVENTORES: DAVID JAMES GRAHAM WHITE; ALAN FREDERICK
WILLIAMS
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.
Reino Unido, em 12 de Outubro de 1989, sob o No.8922987.6 e em 6 de Agosto de 1990, sob o No.9017198.4 inp; mcc r;·
R f 16735
ÍMUTRAM LIMITED
PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE MATERIAL BIOLÓGICO MODIFICADO
MEMÓRIA DESCRITIVA
Resumo
Convencionalmente, o tecido animal de uma espécie pode ser transplantado para uma outra espécie apenas quando as espécies são concordantes; de outro modo, surge rejeição hiperimune, Neste invento, o tecido dador é modificado, por exemplo ao ser transgénico, para expressar ou de outra forma estar em associação com uma ou mais substâncias, referidas como factores de restrição do complemento homólogos CHCRFs), os· quais são activos nas espécies receptoras para evitar a activação completa do complemento e portanto a rejeição» 0 invento baseia—se em parte na descoberta de que a via alternativa de activação do complemento, em vez da via clássica, é responsável pela rejeição hiperaguda de xenoenxertos discordantes=
Este invento está relacionado com material biologicamente compatível para usar em transplantes e com a produção e utilização de tal material»
A substituição de tecido animal Cparticularmente humano) defeituoso ou insuficiente, incluindo orgãos, tornou-se nas quatro últimas décadas uma terapia comum em medicina clínica» As terapias de substituição variam por exemplo desde a utilização de pcdietileno-teraftalato vendido com a marca registada BACRDIM pela DuPont para reparar vasos sanguíneas defeituosos para a utilização da veia safena como enxerto para ultrapassar artérias bloqueadas e para o transplante de um coração de um ser humano para outro» transplante significativo cont os atingir taxas elevadas ds orgãos sofreu um desenvolvimento modernos imune-supressores permitindo de sucessos com custos reiativamente baixos» A procura de transplantes de orgãos tem aumentado rápidamente» Existem agora mais de 2© ©©0 transplantes de orgãos por ano efectuados em todo o mundo» Isto, no entanto, representa apenas aproximadamente 15% das necessidades conforme avaliado pelos critérios correntes. ft razão oferta/procura dos orgãos dadores de todos os tipos não pode ser satisfeita com as fontes existentes» Isto é talvez melhor ilustrado com a procura de transplantes cardíacos» 0 primeiro transplante cardíaco realizado por Barnard em 1967 gerou considerável publicidade» Dentro de um cardíacos em 22 » A desilusão que que no início da splantes por ano a com ciclosporina, de tal modo que a ano, tinham sido efectuados l©í transplantes países por 64 equipas de cirúrgicas diferentes se seguiu aos fracos resultados obtidos fez com década de 7© fossem realizados menos de 3© tran nível mundial» A introdução da imuno-supressão no entanto, revolucionou o transplante cardíaco maior parte dos centros pode prever probabilidades de sucesso dos
transplantes cardíacos superiores a 80% num ano de enxerto Ccs sobrevivência do paciente)« à medida que a especialização aumenta espera-se que esta taxa de sobrevivência aumente ainda mais. 0 sucesso deste processo, certamente, requere que a classe médica e o público em geral esteja informado de que o transplante cardíaco oferece uma alternativa real à morte, de modo a que cada vez mais doentes sejam designados para o processo. Correntemente, são realizados cerca de 2 Ô©€? transplantes cardíacos por ano,
Actualmente, o principal risco de morte no transplante cardíaco é a espera da disponibilidade -de um dador adequado do orgão. Se bem que o coração artificial ofereça um sistema de apoio a curto prazo para estes doentes, exista a necessidade a longo prazo de mais centros de transplante cardíaco e uma maior fonte de dadores. 0 número potencial de indivíduos que podem beneficiar do transplante cardíaco nunca foi cisntificamento estabelecido, mas estimativas publicadas da necessidade de transplantes cardíacos tem variada largamente entre 5© e 25© pessoas por milhão por ano dependendo dos critérios de selecção, idade uo recipiente, doença e oucros» Llualquer que possa ser o número, é já bem claro que as opções correntes de fontes dadoras são incapazes ds ir ao encontro das necessidades. Comentários semlhantes podem ser feitos para o transplante de rim e fígado e parece provável que se o transplante de pâncreas ou de Ilhéus de células de Langerhans se tornar um processo terapêutico largamente aceite para o tratamento de diabetes, a rejeição deste tecido também será preocupante.
Existem outras desvantagens relativas à terapia corrente por transplante. Nem sempre se dá o caso dos orgãos dadores servirem para □ transplante, não tanto por muitos dadores de orgãos serem eles próprios vítimas de algum acidente ípor exemplo, um acidente de viação) que causou a morte por danificação de ϊ
outro orgão diferente do que está a ser trans-plsntadoçj no entanto, pode haver danificação adicional ou dificuldade associada ao orgão a ser transplantado.
Ainda, devido à disponibilidade imprevisível de orgãos de dadores, a cirúrgia de transplantes muitas vezes não pode ser marcada como uma operação de rotina envolvendo reserva de sala com muita antecedência» Também muito frequentemente, as equipas cirúrgicas e administradores hospitalares têm de reagir no momento em que é identificado um dador de orgãos e trabalhar fora dos horários normais, adicionando assim dificuldades administrativas e de pessoal»
No caso dos transplantes de coração, fígado e pulmão, se se encontrar rejeição geralmente não é possível faaer novo transplante a. menos gue por sorte fique disponível um outro dador adequado dentro de um curto espaço de tempo»
Para além das dificuldades médicas referidas, a prática corrente de transplantes pode nalguns casos envolver dificuldades sociais. Em primeiro lugar, pode haver objecções religiosas para
remoção de orgãos | de | po t «n u ã -=a i s |
culturas que creem | na | reencarnaç |
dificuldades éticas | e | SQCI315 na |
seres humanos mortos nalguns países em dadores de , particularmente por ser necessário consentimento » Finalmente, o aparecimento de trocas comerciais rins vivos está a causar preocupação, particular— mente em certas países do terceira mundo e será socialmente desejável suprimir tais negócios»
A cirúrgia de transplante convencional, conforme descrita atrás com as suas- desvantagens, envolve o transplante de um animal ds uma espécie particular (geralmente humana) para um
outro ds mesma espécie» Tais transplantes são designados alo-enxertos (allograft“). Devido às dificuldades com a fonte convencional de aio-enxertos, como foi referido atrás, focou-ss a atenção na possibilidade de usar xeno-enxertos í!!xenograf t“ > em transplantes» Xeno-transplante é o termo genérico vulgarmente usado para a implantação de tecidos, incluindo células e orgãos, envolvendo diferentes espécies»
Já houve vários- exemplos do uso com êxito de xeno-enxertos em esquemas de substituições terapêuticas» For exemplo, nos últimos anos usou-se tecido de porco para substituição de valvas aórticas, pele de porco para cobrir pacientes com queimaduras graves s veia umbilical de vaca como enxerto de veia para substituição» Todos estes xeno-enxertos têm no entanto um ponto em comums eles proporcionam apenas uma substituição mecânica. 0 tecido usado é biológicamente não funcional» 0 motivo para isto é que os processos imunes existentes no homem destroem imediatamente ídentro de minutos ou horas) a integridade celular dos tecidos da maior parte das espécies» Tais xeno-enxertos são conhecidos como xeno-enxertos discordantes» ft ferocidade desta associada» fts-sim, o tecido de do homem, pode sobreviver no xeno-enxerto é conhecido como destruição está filogenèticamente chimpanzé, que á um primata próximo homem quase cosmo um a 1 o-enxerto; tal xeno-enxer to concordante»
Se hem que possa ser pensado que os xeno-enxertos concordantes possam proporcionar a resposta para as dificuldades
com alo-enxerto, na | prática este não | é provavelmente o | caso «Os |
chimpanzés são muito | mais pequenos do | que o homem e os | orgãos |
geralmente não são | suficientemente grandes para funcionarem no | ||
homem» No caso dos | rins isto· pode ser | u1trapassado pelo | trans- |
plante de dois rins | de chimpanzé para | substituir um rim | humano |
deficiente;, mas para o fígado e coração isto não é claramente uma possibilidade. Ainda, os chimpanzés reproduzem-se lentamente na natureza e fracamente am cativeiro e a pedidos de chimpanzés como animais experimentais <particularmente na área do Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS)> significa que novamente a oferta é inferior à procura. Pode haver ainda alguma dificuldade social com a aceitação pelo público de outros prrimatas como dadores de xeno-enxertos.
A atenção centrou-se novamente nos xeno-enxertos discordantes» Tem sido pensamento generalizado que a razão pela, qual os xeno-enxertos discordantes falham tão rápidamente é a existência na espécie recipiente de anticorpos naturais contra antigénios indefinidos da espécie dadora CShons et al CEurop. Surq, Res, 5 26-36 <1973))« Os anticorpos são designados naturais por se encontrarem em indivíduos que nunca foram expostos ã espéc i e dadora«
A rejeição rápida - conhecida como rejeição hiperaguda mediada por anticorpos - de um enxerto ds orgão esta bem documentada. No princípio da década de 6ô quando o transplante de rim (ao-enxerto) se tornou um tratamento de rotina, observou-se que os rins transplantados eram ocasionalmente rejeitados pelo recipiente enquanto a operação estava a decorrer. Durante uma operação de transplante, o rim regra geral torna-se vermelho e de consistência rija após os vasos do dador serem suturados. Tais transplantes muitas vezes produzem urina quase imediatamente. Na forma de rejeição em que o enxerto é destruído enquanto o doente ainda está na mesa de operações <rejeição hiperaguda) os processos destrutivos começaro nos primeiros minutas ou quase após o transplante, Quando isto ocorre, o rim torna-se azulado e malhado e depois congestionado. A consistência do orgão é também alterada. Como regra, o enxerto torna-se edematoso, não se dá produção
de urina e α rim rscsntemente transplantado é então imediatamente removido» Tornou-se claro que está envolvida a resposta imunológica mediada pela via humoral entre anticorpos circulantes pré—formados no recipiente e antigéníos no rim dador» A única maneira de evitar a sua ocorrência no transplante ds enxertos é testar antes do transplante a existência de anticorpos no recipiente contra as células dadoras, Com o aumento dos conhecimentos dos testes de diagnóstico para tais anticorpos (conhecido como jogo cruzado) tornou-se claro que esta generalização ds que o anticorpo no recipiente reage contra antigéníos no dador não é verdadeira e que a destruição hiperaguda de enxertos, quando transplantes entre indivíduos da mesma espécie está restringida à existência de séries específicas de anticorpos conhecidos como T-warm positive cross-match”5 e quase certamente estes anticorpos pertencem à subclasse de IgG» Ainda, a presença destes anticorpos resulta sempre da um processo de imunização pré—existente quer como resultado de transfusões sanguíneas .anteriores ou como resultado de gravidez ou, mais vulgarmente, como resultado de um transplante anterior sem êxito, tem sido rej eição hiperaguda literatura sobre o extensa, indo até mecanismo para a rejeiç largamente pensado como :o hiperaguda de xeno-enxertos sendo o mesmo mecanismo da de alo-enxertos, como mecanismo ds rejeição alguns So anos azrás» λ descrito atrás» A de xeno-enxerto é urante este tempo, apenas três publicações sugeriram um mecanismo para a rejeição de xeno-enxerto que não envolve anticorpos» A sugestão foi que a via alternativa, ds activação do complemento estivesse implicada na rejeição de xeno-enxertos (se bem que não usando necessáriamente esta terminologia). A sugestão surgiu pela primeira vez em 1976 num artigo publicado por Schilling et al» (Surqery, Synaeco1oqy and Qfastectics 142 29-32 (1976))» Foi feita a sugestão de que em
1988 e 1989 (os mesmos resultados foram publicados duas vezes >
I t
por Miyagawa et al» CTransp1antation 46 (6) 825-330
Transplantatíon FToceedinqs 21 Cl) 520—521 CÍ989>>« No os resultados não eram conclusivos» pois ambas as ex sofriam substancialmenteeí do mesmo defeito, 0 modelo foi reivindicado pelos autores como sendo um modelo de
<1988) e en t an co , periências escolhido xeno—enxerto em que os anticorpos contra diferentes espécies não existiam» No entanto, parece agora que os ensaias usados para detectar anticorpos contra espécies diferentes foram inadequados e que as deduções tiradas destes artigos se basearam em dados inadequaoos
A maior parte das medidas tomadas actualmente para evitar ou reduzir a rejeição em xeno—enxerto envolve interferência quimioterapêutica com o sistema imune do recipiente, largamente numa base inespecífica por exempla com ciclosporina A e outros imunonsuprsssorBS, por plasmaforese, por tratamento comfactor de veneno de cobra, adsorção do anticorpo com proteína A de Staphy1ococcus s outros» Esta abordagem naturalmente segue-se à quimioterapia- que suporta os alo-enxertosEst-s invento adopta uma abordagem radicalmente diferente: em vez de interferir inespecíficamente com o sistema imune do recipiente, o invento permite a coadministração ds amterial que tem o efeito do enxerto do dador ser encarado como próprio por certos componentes do sistema imune do recipiente» Em realizações particularmente preferidas, o próprio tecido dador á modificado para se parecer imunológicamente com o recipiente em certos aspec tos»
Também se descobriu que a rejeição hiperaguda de xeno-enxerto não é necessáriamente mediada por anticorpos» ísto surge de duas observações» Primeiro, na ausência de anticorpo mas na presença de complemento, observa—se rejeição hiperaguda; em >
segundo lugar, na presença de anticorpo mas na ausência de complemento, não se observa rejeição hiperaguda.
□ invento baseia—se na descoberta de a activação do um complemento ser preeminente na destruição hiperaguda de Keno-enxertc, quer tal activação seja ou não auxiliada pela ligação de moléculas de anticorpo adequadas» A activação da via alternativa do complemento pode ser induzida por uma variedade de produtos celulares» Estes produtos não estão restringidos a células invasoras estranhas tais caro bactérias ou xeno—enxerto mas existem em muitas células» Assim, em principio, muitas células de um indivíduo podem activar a via alternativa do complemento, causando destruição auto-imune massiva» □ facto de isto não acontecer é devido à existência de uma série ds proteínas que regulam negativamente o complemento presentes naturalmente no soro e na superfície das células» Estas moléculas Caqui referidas como “factores homólogos de restrição do complemento”> evitam a. activação completa do próprio complemento quer pela via clássica quer pela via alternativa pelos produtos das próprias células, evitando assim a destruição -auto-imune do próprio indivíduo» O funcionamento de tais moléculas é elegantemente ilustrado em hemoglobinúria nocturna paroxisroal» Nesta doença, a ancoragem membranar de pelo menos uma destas moléculas (factor de aceleração do decaimento) está ausente» Assim, a proteína não é retida na membrana celular dos eritrócitos e descola-se da célula, o que activa a via alternativa» do complemento e é então lisada causando hemoqlobinúria.
De acordo com um primeiro aspecto do presente invento, é proporcionado um método de transplante de tecido animal para um recipiente, em que o tecido deriva de um dador de uma espécie diferente da do recipiente, a espécie dadora sendo uma espécie discordante relativsmente -ao recipiente, o método compreendendo f t
Offi transplante do tecido para o recipiente e administrando associação com o tecido do enxerto o-o ou mais factores homólogos de restrição do complemento activos na espécie recipiente para evitar a activação completa do complementou
A palavra tecido” conforme aqui usado nesta especificação significa qualquer material biológico que é capaz de ser transplantado e inclui orgSos íespecialmente os orgãos vitais internos tais como coração, pulmão,, fígado e rim,, pâncreas e tiróide) cárnea., pele, vasos sanguíneos e outro tecido conjuntivo, as células incluindo sangue e células hematopoiéticas, Ilhéus de Lanqerhans, células do cérebro e células- de orgãos endócrinos e de outros
Jo corpo (tais como F‘S-*F), todos eles podem ser candidatos ao transplante de uma espécie para outra.
Uma. “espécie discordante'·' é uma espécie da qual um xeno-enxerto (geralmente vascularizado) ao ser transferido para o recipiente dá origem normalmente a uma rejeição hiperaguda, ou seja rejeição dentro de minutos ou horas e não dias (Calne Transp1ant Froc 2s550, 19701» Tais rejeições hiperagudas são bem conhecidas dos familiarizados com a matéria e podem ter lugar em 24 horas, h horas ou mesmo uma hora após o transplante» complemento e a sua activação são agora bem conhecidos e estão descritos em Roitt, Essential Immunoloqy CFifth Edition, 19841 Blackwell Scientific Publications, Oxford» A actividade atribuída ao complemento CC?} depende da acção coordenada de nove consponentes proteicos (Ci a C9) actuando em sequência, dos quais o primeiro consiste em três subfracções principais designadas Cíq, Cír e Cis» 0 complemento pode ser activado pela via clássica ou alternativa, ambas serão em seguida brevemente descritas» t
Ma via clássica, α anticorpo liga-se a Cl, cuja subunidade Cís adquire actividade de estearase e efectua a activação e transferência para sítios da membrana ou complexo imune primeiro C4 e depois C2»Este complexo tem actividade de 11 C3—c on ver ia.ses< e divide C3 em solução para produzir um fragmento peptídica pequeno C3a e uma molécula residual C3b, as quais têm funções bem distintas» C3a tem actividade de anafilatoxina e não desempenha outro papel na cascada de sctivagão do complemento» C3b está ligada à membrana a pode causar aderência imune do complexo antigénio-anticorpo~C3b facilitando assim subsequente fagocitose»
Na via alternativa, a actividade ds canvertase de C3 é desempenhada por C3bB, cuja activação pode ser induzida por agentes extrínsecos, em particular polissacáridos microbianos tais como endotoxina, actuando independentemente do anticorpo» convertase é formada pela acção de Factor D num complexo de c3b Factor B. Isto forma uma ansa de resposta positiva, na qual produto da cisão de clivagem»
CC3b) ajuda formar maií enzima de
Em ambas a;
.as clássica s alternativa, o nível de C3b é mantido pela acção de um incativador de C3b (Factor 1) combina-se rápidamente com o Factor H para formar um complexo que é clivado pelo Factor I e perde propriedades hemolíticas e de aderência imune» fts vias clássica e alternativa são comuns após a fase C3« CS é dividido para dar os fragmentos C5a ε C5b» C5a tem actividade de anafilotoxina e dá origem a quimiotaxia dos polimorfonucleares» CSb liga-se como um complexo com Có e C7 para formar um sítio termostável na membrana que recruta os componentes finais CS e C9 para gerar o complexo de ataque à membrana (MAC)» Este é uma estrutura anular inserida na membrana e projectando-se a partir dela, o que forma um canal transmembranar totalmente permeável aos electrólitos e água» Devido à elevada
C3b
I t
pressão osmótica interna de colóides, verifica-se uoi influxo de iões sódio e áqua, conduzindo â lise celular» □s factores homólogos de restrição do complemento (HCRFs) úteis no presente invento podem -em geral interferir com qualquer parte da cascada de activação do complemento» Um HCRF pode interferir apenas com parte do que constituía via clássica ou apenas com a parte que constitui a via alternativa, ou mais geralmente pode interferir com a parte que è comum a ambas as vias clássica e alternativa» De preferência o regulador HCRF interfere com a parte comum da via» 0 HCRF pode ser idêntico a um HCRF natural ou simplesmente ter a função adequada. HCRFs sintéticos e hemi-sintéticos, incluindo os preparados por tecnologia de DMA recombinante e variantes, estão incluídos no termo HCRF»
Tal como foi mencionado trás, os factores homólogo de restrição do complemento são substâncias cascada do complemento de modo a reduzir que regulam a ou evitar a sua ção da actividade lítica?. eles são usados pelo animal para marcar o tecido como próprio para evitar a reacção auto-imune. Neste invento é possível em principio para o HCRF estar ligado a membranas ou estar livre no soro, se bem que na prática seja preferido fer o
HCRh ligado a membranas nas células do tecido do xenoenxerto» Deste modo, é mais fácil para o HCRF estar em associação com51 o tecido do enxerto» HCRFs preferidos incluem factores putativos da membrana celular incluindo o receptor C3b/C4b (CRI), o receptor C3»dg (CR2), factor de caeleração do decaimento ÍDAF), Inactivador C3b e proteína cofactor ds membrana (MCP). HCRFs putativos do soro incluem Factor H, factor de aceleração do decaimento (DAF) e proteína de ligação a C4 íC4bp). Estes HCRFs regulam todos de modo negativo a actividade do complemento por interferência na fase C3» 0 factor homólogo de restrição (HRF), que bloqueia em
CS, é também um factor de membrana putativo»
I ι
Muitas, mas não todas os genes para HCRFs estão situados no locus RCA (regulador tía activação do complemento), o qual mapeia na banda q32 do cromossoma 1 CRey-Campos et al. 3« Exp. Med. Í67 664—6ó9 (1988)).
Se bem que tenha havido alguma confusão com a nomenclatura e localização de HCRFs, os factores C4BP, CRI, DAF e Factor H foram identificados- por Rey Campus et al (loc. cif.) e nos seus estudos anteriores (3. Exp. Med. 166 246-252 (19S7)). A proteína cofactor de membrana CMCP) foi tratada por alguns investigadorascorno sinónima da proteína de ligação a C4 (C4bp) e pode ser que estes dois factores estejam relacionados ou sejam idênticos. Rother e Till (The Complement System”, Springe?—Verlag, Berlim (1988)) reviram os factores reguladores da convertase de C3 na secção 1 »2.3.25 eles identificama proteína de ligação a C4 (C4b-p) com o factor de aceleração do decaimento e o Factor H com a proteína B^H e o Acelerador do Inactivador de C3b» Independentemente da nomenclatura, a localização e caracterização dos HCRFs continuarás evoluir mas deve entender-se que o presente invento inclui a utilização de todos os HCRFs conforme adequado e preferido.
Outras referências
HCRTs são as seguintes:
Factor 1 (também anteriormente conhecido como inactivador de C3b ou KAF)s
Tamura & Nelson C3» Immunol. 99 582-589 (1967)5
Factor Hs Pangburn et al (3 C 1977)5 hxp. Med. 146 2b'
27©
Proteína de ligação a C4s Fujita et al» <3. Exp. Med 148 1044-1051 (1978))s
DAF (também conhecido como CDS5); Micholson-Weller et aln ÍO» Immunol» 129 184 (1982))^
Proteína Cofactor de Membrana (MCPg também conhecido como CD46 e primeiro descrito como gp45-7O s ainda conhecido como gp66/565; Seya et al (J. Exp. Med» Í63 .OtTTcr z ·’ OOi \ \ „
O·-?/ Ot-AJ \ 17 2ÍÒ,’ / s
Ckí (também conhecido cí Med. 156 Í739-Í754 (1981 129 2051-206$ <1982)5?
imo CD355 ?
: 5 5 ? e Ros
Medof et al, (J, Exp« : et al ÍJ» Immunol»
CR2 (também conhecido como CD21, receptor 3d/EBV e pl405s lida et al CJ= Exo. Med. 158 1021-1033 (19835) e Weis st al» (PMAS 81 881-885 (198455.
A distribuição nos tecidos de algumas das proteínas RCA são as seguintes?
CRI s Membrana (limitado); eritrócitos? monócitos; a maior parte das células B e 7? leucócitos polimorfonuc1eares ? cêlu1as foiicu1ar-dend £ tricas 5 podóc i tos g1omeru1ares s
CR2s Membrana (limitado); a maior parte das células S? células folicular-dendítricas? algumas células epitelisis e algumas linhas de células T?
MCPs Membrana (larga); todas as células do sangue periférico (excepto eritrócitos)5 linhas ds células epiteliais, endoteli-ais e fibrotoIastos5 trofoblastos e esperma 5 ϊ I
DAFs Membrana (largo): todas as células do sangue periférico? linhas de células epiteliais? endoteliais e fibroblastos? trofoblasto-s ε esperma?
C4bps Plasmas síntese do fígado? e
Hs Plasmas síntese do fígado? linhas celulares de fibroblastos e ds monócitos»
Tal como par as proteínas envolvidas na restrição homóloga ção d asinvento 5 forma de
ao nível do complexo | * de araque | às membranas5 a | utilisa- |
quais está também | contemplado | por meio do | presente |
existe acordo geral | (mas ainda | nenhuma prova) | sobre a |
uma sequência protei | ca a que as | proteínas de 65 | kD-a que |
tou se seguem tt »
Proteínas de j. iwuno 1 a 1 o o ligação a C8 (Schonermark et 1772 i1986) ) s
Factor homólogo de restrição (HRt) (Zalman et al Immunoloqy 83 6975 C198ó)>? s
Proteína inibidora de MAU CM1P) (Watts st al (1988))
A proteína CSbp/HFRZMIP está ligada à superfície celular por meio de uma âncora glicolipidica, tal como está CDS9 e DAFs sabe-se que estas proteínas estão funcionalmente ausentes na hemoglobinúria nocturna paroxismal.
Uma proteína de 18-20 KDa está também implicada no nível de MAC» Pensa—se que as que ss seguem sejam id@nt.icas (mas podem não ser) f
I
P-18 CSugita et -al (J. Biochem. 104 633 C1988555?
HFR-20 COkada et al (Intl. Immunol. í (19885)5?
C059 (Davies st al (J. Exo, Med. (Set. 19885 5 5 ?
Inibidor membranar da lise reactiva CRIHL) (Hoioguin et al J.* Cl in» Invést. 84 7 (19895 5 5 .
A evidência para a identidade putativa destas proteínas é a observação de as sequências de proteína e/ou cDNA para CD59 e HRF-20 serem idênticassprovávelmente elas são as mesmas de ρ-18/MIRL sequência envolvido . Deve-se notar que existe alguma homologia entre de CD59/HRF»20 e a do antigénio LY-6, o qual e na activação das células T (Gronx et al □. Immunol.
3013 (1989555.
SP-40.40 está (Kivssbaum et al EHBO 8, também envolvido na 711 (198Ύ 5 5 .
regulação de MAC
Prefere-se que HCRF interfira com s activação do complemento na fase C3. MCP e DAF bloqueiam ambos a ansa de retrocontrole positivo na via alternativa da activação de C3 e estes constituem HCRFs preferidos
HCRF é administrado em associação com o tecido do enxerta. Isto significa que o HCRF é administrado de forma a que o tecido do enxerto seja marcado como próprio, mas sem que outro material estranho, como sejam bactérias invasoras, sejam significativamente marcadas» Pode ser possível administrar simplesmente por via parenteral, mas- localmente no tecido do enxerto, um ou mais HCRFs adequados» No entanto na prática isto pode não ser
- Í7 preferido devido à dificuldade na localização adequada do HCRF no tecido do enxerto e devido ainda à dificuldade do HCRF poder ter de ser repetidamente administrado a um recipiente após o enxerto ter sido efectuad-05 no entanto, isto poderá ser ultrapassado pela utilização de sistemas farmacêuticos de libertação especializados.
De ubi modo geral será muito mais conveniente administrar o HCRF de forma a que este seja integrado na membrana celular do tecido dador. Se bem que possa haver algumas infecções do tecido transplantado que possam causar expressão adequada, de longe a via mais preferida para atingir este- fim é que o tecido dador seja transgénico por conter e expressar ácido nucleico codificador de um ou mais HCRFs activos na espécie recipiente quando transplantado para o recipiente. Tal tecido transgénico pode continuar a expressar indefinidamente um HCRF. 0 HCRF pode derivar geneticamente da espécie recipiente ou menos preferido de uma espécie estreitamente relacionada para a qual sejam possíveis xenoen xertos concor-dan tes«
Se bem que em principio o tecido dador transgénico possa derivar de uma cultura de células, é preferível que o tecido dador derive de um animal transgénico. 0 animal transgénico deverá expressar íou ser capaz de expressar) o HCRF pelo menos no tecido a ser transplantado, de preferência. No entanto, mesmo isto não é essencial uma vez que pode ser possível ligar o HCRF a membranas celulares do tecido dador através ds algum agente de ligação (como seja anticorpo monoclonal (Milstein & Cuello Nature 305 537 (1983)) ou receptor híbrido.
A espécie recipiente será principalmente humana, mas não exclusivamente» Outros primatas podem ser recipientes
adequados, tal como possa® ser outras espécies desde que a ecónomia s ética o permita®»
A espécie dadora pode ser qualquer espécie adequada que seja diferente da espécie recipiente e que, tendo em consideração a fisiologia da espécie recipiente é capas de proporcionar tecido adequado para o transplante» Para os recipientes humanos, espera-se que os dadores suínos seja® adequados, mas poderá servir qualquer outra espécie»
De acordo com um segundo aspecto do invento, são proporcionadas tecidos ou células animais transplantáveis de uma espécie dadora, as células ou tecido estando associadas a um ou mais factores. homólogos de restrição do complemento activos na espécie recipiente pretendida para evitar activação completa do campiemento, a espécie dadora sendo uma espécie discordante relativamente à espécie recipiente»
De acordo com um terceiro aspecto do invento é proporcionado um animal transgénico tendo tecido transplantâvel, o qual não dá origem a rejeição de xeno-enxerto no transplante ou exposição ao sistema imune de pelo menos uma espécie discordante» Uma espécie discordante é uma que normalmente rejeitaria de forma hiperaguda um xeno-enxerto do animal» □ invento engloba pois a utilização de tecido animal derivado de uma espécie dadora e um ou. mais factores homólogos de restrição do complemento numa espécie recipiente, em que a espécie dadora é uma espécie discordante relativamente à espécie recipiente, na preparação de tecido transplantâvel para a espécie recipiente» t
De acordo com um quarto aspecto do invento, ê proporcionado um -animal transgénico tendo células capazes de expressar um factor homólogo de restrição do complemento de uma outra espécie. 0 factor homólogo ds restrição do complemento será geralmente activo numa espécie que seja discordante relativamente à espécie do animal transgénico. As células podem ser de um tecido- particular, pref erencíalmente como descrito relativamente ao primeiro aspecto do invento, ou de mais ds um ou todos os tecidos, neste caso o animal pode tornar-se um dador de roais de um tecido. Tal animal transgénico pode ser encarado como uma colecção de células não transformadas íno sen tido de não prol iterativas 5 .
De acordo com um quinto aspecto do invento, é proporcionada uma célula animal não transformada capaz ds expressar um ou mais factores homólogos de restrição do complemento activos numa espécie que é discoradante relativamente à célula animal.
, é proporciode pelo menos uma ou mais expresso por pode ser uma incorporou a pode ser um um Ilhéu de
De acordo com um sexto aspecto do invento nado DNA recombinante compreendendo DNA codificadorum factor homólogo de restrição do complemento e sequências para permitir que o DNA codificador seja uma célula animal não transformada. A célula animal célula de um animal transgénicoque genéticamente construção. Como alternativa, em lugar da célula orgão em cultura ou outro tecida como seja
Lanqerhans.
De acordo com um sétimo aspecto do invento, ê proporcionada uma construção genética adequada à incorporação do material genético de um animal para produzir um animal transgénico, a construçãocompreendendo DNA codificador de pelo menos um factor homólogo de restrição do complemento e uma ou mais
sequências para permitir que o DNA codificador seja expresso cecu peio menos algumas células de um animal transgénico genéticamente incorporando a construção» Tal construção genética pode ser na forma de um mínicromossoma conhecido como VAC. Como atrás, o factor homólogo de restrição do complemento será geralmente activo numa espécie que é discordante relativamente à espécie do animal transgénico.
De acordo com um oitavo aspecto do presente invento, è proporcionado um método de preparação de um animal transgénico, o método sendo caracterizado peia incorporação num animal d© material genético consistindo em DNA codificador de pelo menos um factor homólogo de restrição do complemento e uma ou mais sequências para permitir que o DNA codificador seja expresso em pelo menos algumas células do animal transgénico.
Os métodos para a produção de animais transgénicos am geral estão a tornar-se cada vez mais conhecidos e os- passos detalhados a realizar podem ser os convencionalmente usados. Por exemplo, WD-A-6800237 descreve os passos em princípio necessários para construir um animal transgénico.
método de incorporação da construção nas células do animal transgénico pode ser por raieroinjseção, por incorporação mediada por esperma ou qualquer outro método adequado. A manipulação genética preliminar pode ser realizada num procariota, conforme é normalmente preferido.
DiMA codificador de HCRFs está disponível na forma de cDNA ou pode ser deduzido usando técnicas de clonagem convencionais. 0 DNA codificador do factor de aceleração do decaimento
ÍDAF) é provávelmente o melhor caracterizado e foi descrito por
Medof st al (PNAS 84 2007-2011 {1987)5. Um mapa físico do grupo cit. ) í-Y:«
da ganes RCA é dado por Key-Campos et al variantes de DAF e a sua preparação por U binante estão descritas em EP-A-8244267?, <19881 ecnologia de DMA recorotais variantes podam ser usadas no presente invento,
Devido à melhor caracterização da genética de DAF e ao facto de se conhecer a sequência de cDNA codificadora de DAF, DAF constitui um factor homólogo de restrição do complemento preferido.
Outras características preferidas do segundo ao sétimo aspecto do invento são como para o primeiro aspecto, mutatis mutandis, invento será agora iltsstrado pelos exemplos que se seguem. Nos exemplos, é feita referenciai -aos desenhos em ques
F Σ íáLíriAS ί A a um coração de recem—nascido
IE mostram traçados sucessivos de EoG para coelho transplantado para porcos s de acordo com o Exemplo i §
FIGURA 2 mostra o resultada de um radiaimunoensaia indicando que os porcos usados no exemplo 1 não têm quantidades significativas de anticorpos anti-espéciej
FIGURA 3 mostra certas fases da electroforese de proteínas, conforme usado no Exemplo 4?
FIGURA 4 mostra certas fases da electroforese bidimensional cruzada, como usado no Exemplo 4;
FItóURA 5 mostra 4;
D-Rockets resultantes do Exemplo
I
FIGURA 6 mostra o resultado de um ensaio de celular por libertação de crómio no Exemplo 5, ise
FISURA 7 ilustra os títulos de anticorpos líticos anti-hamster de um rato recipiente de um enxerto de coração de hamster, pré—transplantado <dia 0> e dias 5, 7 e 9 após o transplante, como descrito no Exemplo ó;
FIGURA 8 mostra grãficamente DQs das fracções de G2O0; o histograma ilustra os títulos em cada uma das fracções dos anticorpos liticos anti—hamster de um rato recipiente de um coração de hamster, como descrito no Exemplo 65
FIGURA 9 | mostra uma | transferência Southern de DiMA | |
extraído | das linhas | celulares T | 5, biO e DBS, como |
descrito | no Exemplo | ||
FIGURA 1í | 5 mostra os | valores de | ΚΓ£ >ϊ libertação de '“''''Cr |
indicadores de que a linha de células humanas T5 é lisada pelo complemento de coelho mas não pelo complemento humano na presença de anticorpos ds coelho anti-humano, como descrito no Exemplo 75
FIGURA íl mostra os números ds libertação de Cr, indicadores da incapacidade dos anticorpos humanas para lisar a linha ds células humanas T5 com complemento humano ou com complemento de coelho, como descrito no Exemolo 7=
FIGURA 12 mostra, os números de libertação de
5í br os quais demonstram que os anticorpos humanos podem lisar um hibridoma ratinho—ratinho (DB3> na presença de
COiflO
complemento de ratinho ou ds complemento humano, descrito no Exemplo 7 5
FIGURA 13 mostra a libertação ds Cr, ilustrando linha celular híbrida humano-ratinho Bi® é 1isado anticorpos humanos na presença de complemento de c que a pelos oelho mas não é 1isado pelos anticorpos humanos na presença de complemento humano, como descrito no Exemplo 7?
FIGURA 14 mostra a incorporação de *H adenina Cem contagens por minuto) por células CHO, mostrando que estas células são mortas por soro imune de rato na presença de complemento humano ou. de complemento de coelho, como descrito no Exemplo 85
FIGURA 15 mostra a incorporação de '~’H adenina em contagens por minuto por células CHO transfectatías com MCP humano, mostrando que estas células são mortas por soro imune de rato na presença de complemento ds coelho mas não são mortas por estes soro imune da rato na presença de complemento humano, como escrito no Exemplo 8?
FIGURA 16 mostra 2D rockets mostrando que, nas circunstâncias descritas em relação à Figura 15, o componente C3 do complemento humano não é clivado para formar C3b, como descrito no Exempla 85 rIGURA 17 mostra os valores de libertação de Cr, indicando que os fibroblastos de murganho 3T3 são lisados por anticorpos naturais na presença de complemento humano e o efeito protector da expressão de MCP humano pelas células de ratinho? e
FIGURA IS mostra uma análise de “slot blot de DNA de uma segunda geração de ratinhos transgênicos usando como sonda cDNA de MCP marcado (superior) ou cDNA da D AF ma r c ad o.
EXEMPLO 1
Rejeição de xenoenxertos tem lugar na ausência de qu-sisqu.gr anticorpos anti-espéc is
Em geral, os animais não podem sobreviver sem imuníglofaulinas circulantes» Estas são produzidas por linfócitos como resposta a estímulos antigénicos» Ma vida neonatal inicial, no entanto, a imunoglohulina materna transferida passivaraente actua como um substituto temporário deste anticorpo auto-produzido» Esta imunoglobulina transferida passivaments confere protecção ao bebé enquanto a experiência imune inicial ê adquirida» Nos mamíferos esta transferência passiva ocorre geralmente via placenta ε via colostro. No entanto, nalgumas espécies, a estrutura da placenta ê tal que o anticorpo materno não pode ser transferido por esta via» □ porco é uma destas espécies» Assim, os leitões recém-nascidos em principio não têm imunoglobulina»
Porcos grandes grandes foram retirados à nascença e colocados numa, gaiola de madeira aquecidos por garrafas com água quente sem poderem mamar» Tiraram-se dois porcos ds cada ninhada para cada experiência, Estes animais pesavam aproximadamente í kg quando nasceram»
Coelhos brancos bébés da Nova. Zelândia, pesando aproximadamente 30Θ g foram usados como dadores» Estes dadores foram anestesiados com hipnol e diazepam, o tórax fcd aberto e uma veia cava canulada por meio de uma agulha de 19 gauge» Fez-se a infusão de cardioplegia ÍThomas N2 2) fria ( + 4°C) até o coração parar de bater e ter ficada perfundido com cardioplegia» O arrefecimento foi também aplicado externamente com cardioplegia fria directamente com uma seringa» 0 coração dos coelhos foi então removido usando técnicas cirúrgicas convencionais e
•*•4*0 até ssr necessário.
guardado em solução ds cardioplegia a
Encontrou· de coelho se serem necessárias estas precauções devido ao coração ser altamente susceptível aos danos isouémicos.
Os porcos recipientes foram anestesiados inicialmente por inalação de Halothane/@2« Uma agulha sm borboleta (23= gauge) intravenosa foi então inserida numa veia mamária» sendo a anestesia mantida por cetamina intravenosa» □ porco foi simultãneamente mantido hidratado com soro fisiológico intravenoso» A mostras de soro e de sanque em EDTA foram retiradas antes do transplante.
coração de coelho foi transplantado para o pescoço de porcos seguindo o método de Heron (Acta Patho1» Hicrobiol» Scand» 79 366-372 (1971)>» A aorta foi anastomisada extremo com lado <6-0 prolene} à artéria carótida e a artéria pulmonar anastamisada á veia jugular» Todos os outros vasos cardíacos foram ligados» Os corações começaram a bater dentro de alguns minutos após a remoção das pinças» 0 batimento cardíaco foi controlado = de um monitor diascope/EC6. 0 pescoço do porco não foi durante as experiências, os corações foram mantidos humedecidos cobrindo-os com película aderente» através fechado
Os resultados de fc.CS estão a a 1E« 0 traçado apresentado na Figura um coração normal imedíatamente após começa a falhar cerca de vinte minutos dentro de uma hora (Figura í D) não se presentados nas Figuras IA ÍA mostra um batimento de o transplante» 0 coração mais tarde- (Figura 13) e detecta batimento cardíaco, evidenciando rejeição hiperaguda.
Este exemplo demonstra portanto que a rejeição hiperaguda do xenoenxerto discordante tem lugar anticorpos» mesmo na ausência de
EXEMPLO 2
Os porcos recém-nascidos usados no Exemplo i não têm anticorpos antx espécie
IqB de coelho anti-porco foi marcada radioactivamente com iodo pelo método de Greenwood et al, Biochemical Journal 89 114-123 (1963) modificado por Davies e Howard (não publicado)»
A um tubo de polistireno (LP2 6 cm x 1 cm) adicionou-se sucessi vaffiente s
25-50 μΐ de proteína (numa concentração de í mg/ml) í^'5
3-4 μΐ de Na I (I00 mui/ml) μΐ de cloramina-T <Ã4 mg/5 ml; 0,5M) tampão fosfato de sódio (pH 7,5) $ deve ser preparada de fresco antes ds usar
Misturou-se estes componentes durante 30 segundos com agitação contínua» Em seguida adicionou-se rápidamente o seguints ” μΐ de DL-tirosina (sol» sat» em 0,5 ml de tampão fosfato de sódio pH 7,5)»
300 μΐ de 27« BSA/PBS/azida
A proteína marcada foi então separada do iodo que não reagiu, pela utilização de uma pequena coluna de 8 cm x 1,0 cm de meio Sephadex 8-25 gau médio feita em PBS/azida. A mistura de reacção de iodinação foi quantitativamente transferida para a coluna de 825 preparada e eiuida com PBS/azida» Colheram-se fracções de seis gotas para tubos de polistireno CLP2)» A coluna
•foi eluid-a até os picos de proteína e ds iodo í1^!} terem sido eiuidos e medida a radioactividade em todas as fracções.
A radioactividade incorporada na proteína pode ser calculada assims contagens radioactivas em proteína - contagens totais originais - contagens dos picos de iodo
A IgG marcada radioactivamente (referida agora como “isótopo”) foi então usada num ensaio para anticorpos (porco) no porco recém-nascido, como se segues
Materiais
PBS + 0,017, Azida - Dxoid
PBS/BSA 17. - BSA-Sigma
Isótopo - molécula completa de IgS de coelho anti-porco com 12-18 t;
x 10' contagens/min.
Soros inactivados pelo calor (56°C 3© mins)
Amostras de sangue anticoaguladas»
Método
1. Preparou-se uma suspensão a 1% de glóbulos vermelhos de coelho em PBS e adicionou-se quantidades de 100 μΐ aos tubos» As células foram centrifugadas e rejeitado o sobrenãaante.
2. Prepararam-se diluições seriadas de soros inactivados em PBS/BSA de porco adulta (testemunha positiva), porco recem-nascido (amostra a testar) ou de coelho (testemunha negativa), quantidades de 0,025 ml foram adicionadas aos
sedimentos de glóbulos vermelhos em duplicado. Os tubos foram incubados a 4°C durante 4 horas.
3» Após incubação os tubos foram lavados tr'ê's vezes em PBS/BSA @s05 ml de Isótopo foram então adicionados a cada um dos tubos ε seguiu-se incubação durante a noite a 4*C.
4. Os tubos foram novamente lavados tr>âs vezes e feitas contagens de í min num contador gama.
5. Os resultados estão apresentados como o número de contagens/min em função do titulo.
Os reultados estão apresentados na Figura 2. 0 soro de coelho foi usado como testemunha negativa e soro de porco adulto íie amamentado) como testemunha positiva. Pode-se observar que o nível ds anticorpos de porco no porco 2 antes de amamentado é comparável ao da testemunha negativa.
EXEMPLO 3
Demonstração da importância de C3 do complemento na destruição de xeno-enxerto
Cobaias deficientes em complemento derivadas da estirpe descrita por Burger et isal CEur. □. Immuno1 16 7-lí C1986)) receberam transplantes de corações usando essencialmente a mesma técnica descrita para os xeno-enxerto coelho-para-porco no Exemplo í. Os ratos foram anestesiados por inalação ds éter e os corações arrefecidos com cardioplegia e removidos como anteriormente descrito. Dadores cobaios foram anestesiados intravenoso e ftipnol intramuscular= Qs corações foram no pescoço como anteriormente descrito. Para cobaios com valium implantados testemunha,
i.e. os possuidores ds níveis normais ds complemento, a rejeição de enxertos normalmente decorre dentro de poucos minutos, tornando assim desnecessário fechar o pescoço» Era animais experimentais o pescoço foi por pa1pação. vár ias horas» fechado e os corações controlados duas vezes ao dia Após cirúrgia observaram-se ECGs normais durante não indicando rejeição hiperaguda.
EXEMPLO 4
A. Linfócitos de porco e células de- rim activam c omp1emento humano pela via alternativa
Seguindo a técnica de Grabar s Williams (Biochira.
Biophys, Ac ta 10 19-5 Clvo3)), placas de vidro de 8 x 8 cra :olocaram-se géis dia agarose en?
-oi necessário 10 ml de mistura de gel e esta consistiu era 5 ral de agarose a 2% e 5 ml de tampão veronal CVB). (VB é 75 raií Ma barbitona, 10 mM EDTA, 10 mM Nah!7, pH 8,5.) A agarose e VB foram misturados a 60°C imediatamente antes de usar. Os géis foram vertidos e -arrefecidos numa plataforma nivelada» Quando pronto o gel consistiu era 1¾ de agarose e tinha um espessura de aproximadamente 1,5 mm,
A cerca de 1 cra do fira do gel cortaram-se cavidades com 3 mm de diâmetro» Cada uma das cavidades pode conter aproximadamente S ul da amostra a analisar» A amostra não teve preparação especial além da adição de -azul de hromofenol numa quantidade suficiente para o corar» Após aplicação da amostra o gel foi cuidadosamente colocado na plataforma do tanque de electroforese, Mechas de algodão embebidas em VB (tampão de migração) foram então suavemente comprimidas ao longo da aresta do gel mais perto das cavidades a uma outra mecha foi comprimida contra a aresta oposta da agarose» Cé importante assegurar que os extremos das mechas mergulham nos reservatórios de tampão,5Fez-se então passar
uma corrente de 25-30 mft através do gel até a albumina (visualizada cont azul de bromoíenol) atingir a aresta positiva (ânodo)» 0 processo leva cerca de duas horas s meia a três horas . Se se tiver de correr dois ou mais géis simultSneamente e em paralelo então a corrente aplicada deve .aumentar da acordo de modo a que dois géis necessitem de 50 mA e três necessitem de 75 mA, e assim sucessίvamente« conforme indicado visualizado com azul de e 1 ec troforese« zada ( “2—D rockets )
No final da electroforese, migração de um marcador de albumina 9 bromofenol, o gel foi removido da tina
6, Imunoelectroforese bidimensional cru.
pela
Tiras il (Figura 4) contendo as proteínas sujeitas a electroforese de ίA)s foram cortadas e colocadas num extremo de uma nova placa de vidro 13» Uma mistura de 1 s 1 15 de 27» agarosesVB contendo cerca de 17 de anti-soro contra a proteína a ser visualizada foi então vertido sobre a placa e deixado solidificar» Q anti-soro foi adicionado ã mistura de agarose/VBS quando esta tinha arrefecido até uma temperatura de aproximadamente 50 °C»
A placa de “rocket foi então sujeita a electroforese como descrita atrás, cora o extrema do gel contendo as tiras da primeira dimensão ligadas através de uma mecha de algodão a eléctrodo negativo (cátodo) 17 e o extremo oposto ligado a 'ânodo 19» Os géis foram submetidos a electrof orese durante um um a
noite a uma corrente dependente do tamanho dos géis, ê necessário 10 mft para cada 8 cm de comprimento de gel de forma que um gel de 16 cm de comprimento necessita de 20 mft de corrente e assim suc ess i vamen te»
As proteínas são separadas por electroforese na primei™ ra dimensão e quantificadas e visualizadas por electroforese na segunda dimensão, a coloração para fins de visualização será a seguir descrita.
C. C-ompressão e coloração dos géis
Este processo é o mesmo para a imunoelectroforese convencional e para a. de “rockets. 0 gel a ser corado foi coberto 1 camada de papel POSTLIP (Marca Registada) sem fibras (Adlard Evans & Co) ,, préviamenta humedecido com água. Isto foi então coberto com 6 camadas de papel de toalhas absorventes» A montagem foi comprimida durante í hora, após o que todo o papel foi removido e o processo repetido»
Após uma segunda compressão o gel foi seco sob uma corrente de ar quente e depois embebido em PBS durante pelo menos í hora para remover a proteína não precipitada» 0 gel foi então seco novamente e corada durante í© minutos numa solução de 0,5% p/v de azul coomassie brilhante G250, 45% de H^O, 45% metanol, jL.
1©% de á.cido acético» □ gel foi descorado por agitação contínua em 20% de metanol, 6% de ácido acético até o fundo estar claro» 0 gel foi finalmente seco sob ar quente»
A Figura 5 é uma reprodução do gel seco. 0 rocket 1 è uma testemunha negativa contendo 50 μΐ de soro humano normal ÍHHS) mais 25 μΐ de MBS incluindo 10 mM EGTA. 0 EGTA é um quelator que remove cálcio? o cálcio é essencial para a activação da via clássica do complemento s portanto a presença de EGTA assegura que o complemento pode apenas ser activado pela via alternativa. 0 pico esquerdo ímaior) é C3 ε o pico direita (mais
pequeno? £ C3bx, um testsmunha, por tanto, um pequena quantidade
Na Rockst” oorco (v/v) à mistura produto da clivagem de C3 activado» Na
-a pequena quantidade de C3bi indica apenas da activação do complemento.
2, foram adicionados 75% de eritrócitos de de tampões. Existe um aumenta ligeiro, mas não significativo, do nível de C3bi, indicando assim que os eritrócitos de porco activam o complemento humano peia via alternativa apenas marginalmente ou nem sequer o activam» Desconhece—se a razão desta fraca resposta»
Nos Rockets 3 e 4, 75a de linfócitDs ds porco Cv/v) ou 75% de células de rim ds porco (v/v), respectivamente, foram adicionados á mistura tampão» Em ambos os casos houve um aumento apreciável no nível de C3bi, indicando activação de complemento humano pelos linfócitos de porco»
EXEMPLO 5
Os linfócitos de porco não são Usados por anticorpos- humanos na presença de complemento ds porco, mas são lisados na presença de
Complemento de coelho ou humano
Usou-se um ensaio de libertação ds crómio para controlar a lise ds células mediada por sorohumano na presença de complemento de porco, complemento de coelho bébé ou complemento humano»
Mater i a i s
Meio de separação de linfócitos - Flowlabs
RPMI 164© + 10% FCS inactivado
PBB (sem azida) —Qxoid
Placas cosi cavidades era forma de V - Sterilin
Linfa comp de coelho béhé - Sera-lab - ou complemento humano ou de porco (dilui 1+7 em RPMI)
Soro inactivado pelo calor C5òc‘C 30 mins!
Mètudo
Sangue comlpleto desfibrinizado de porco, diluído a 1s1 em PBS foi colocado sobre igual volume de meio de separação de linfócitos Ficoll Hypaque. Os tubos foram centrifugados a 1200 q durante 30 mins a 20°C«
2. Os linfócitos de porco resultantes na interface foram foram removidos e lavados uma vez em PBS. 0 sedimento foi ressuspenso em RPMI ί64€* e a contagem de células ajustada a 2 K 10Z/ml„
7
3. 200 u.Ci de ' Cr foram adicionados a um sedimento de 2 x 10' células e incubados à temperatura ambiente durante 1,5 horas.
4. fts células marcadas foram lavadas duas vezes a 900 g durante para utilizações de 5 min e ajustadas para dar uma contagem ds células final de 1 x em RPMI.
5» Quantidades de 0,05 ml de soros inactivados a testar como diluições seriadas em duplicado, juntamente com testemunhas, foram distribuídas. Adicionou-se complemento diluidoaos poços importantes em quantidades de 0,05 ml seguido de 0,05 ml de células marcadas. As placas foram incubadas durante i hora a 30°C numa estufa de CCU.
ó. Após incubação as placas foram centrifugadas durante 15 mins
células a 900 q 20°C para sedimentar as células» Removeu-se 100μ1 de sobrenadante para tubos marcados e fizeram-se contagens de '1 min num contador gama.»
Os resultados foram expressos como % da quantidade de células marcadas oriqinais em função do titulo»
Testemunhas
Testemunha de libertação total CFRC) - 50 μΐ de células + 100 μΐ de H.-.O + 05í/» de Tiveen
Testemunha negativa - 50 μΐ de células + 100 μΐ de RPMI
Testemunha do complemento CCC) - 50 μΐ de células + μΐ de comp» diluióo 50 μΐ de RPlíI»
Resul t-ados
Os resultados estão apresentados na Figura ó» Pode-se observar que os linfócitos de porco são lissdos por soro humana apenas na presença cie complemento que não seja de porco (ie coelho ou humano)» A hipótese é que um ou mais factores homólogos de restrição do complemento presentes nas células de porco regulem de modo negativo a acção de complemento de porco mas não a acção de complemento humano ou de coelho»
EXEMPLO 6
A finalidade deste exemplo é demonstrar que os anticorpos podem causar rejeição hiperaguda» 0 conceito eo?
pedido se baseia surge como resultado rejeição hiperaguda pode decorrer na qug este de que a anticorpos da observação ausência de
J
antí-enxerto mas requerem complemente funcional» Devido a isto ser uma nova observação não existem experiências na literatura que demonstrem formalmente que o anticorpo pode causar rejeição de xeno-snxertD. Uma vez que na presença de anticorpos naturais é difícil determinar se estes anticorpos desempenham um papel importante ou não tal experiência não é fácil de realizar» Neste exemplo o papel do anticorpo foi demonstrado tornando um xeno-en-xerto concordante num xeno-enxerto discordante através da infusão de anticorpo da especificidade adequada» Os recipientes usados neste estudo foram ratos macho da estirpe PvQ íRTIC) (Banting & Kingdom, Bicester, Oxon», UK) com 3 a 6 meses de idade pesando 250-300 g» Os dadores de corações foram hamsters Sírios também adquiridos à Banting & Kingdom e pesando entre 100 ε 150 g. 0 transplante de coração foi efectuado de acordo com o método de
Heron (loc, cit» no Exemplo 1). Os corações de hamster foram transplantados para o pescoço de ratos unindo a aorta è artéria carótida e a artéria pulmonar à veia jugular por meio de uma técnica de bainha» Todos os outros vasos foram ligados» Os corações começaram a bater minutos após a libertação das moías vasculares e foram controlados por palpação externa«Todas as operações foram efsctuadas em animais anestesiados pela inalação de alotano e oxigénio»
Os níveis de anticorpos líticos antí-hamster foram medidos como se segues 50 μΐ de uma solução a 1% de eritrócitos de hamster foram adicionados a 50 yl do soro a testar que tinha sido diluido seriadamente» 5ΰ μΐ de uma diluição de 1 em 7 de complemento de coelho bébé (Sera Lab, Crawley Down, Bussex) foram adicionados e incubados durante 1 hora a 37°C» 750 μΐ de diluente da fixação de complemento foram adicionados e centrifugados CBeckman KICROFUSE, 1300 rpm durante 4 minutos) após o que foi medido no sobrenadante. (A palavra MICRDFUBE ê uma marca registada)» As testemunhas positivas e negativas foram CFD e
adicionada áqua destilada a uma solução a IX de células respectivanente. Os resultados das leituras de DU-,,•*t X O foram representados pode ver num rato em função dos títulos de soros no eixo dos x» Como se pela Figura 7, o enxerto de um coração de hamsterresulta na produção pelo rato de títulos muito altos de anticorpos anti-hamster. Qs soros destes ratos foram separados nas suas fracções proteicas componentes por cromatografia em coluna em SEPHADEX S200 (Pharmacia GB Ltd, Londres) usando técnicas crosiatográficas convencionais C!íThe use of SEPHADEXin the ssparation, purification and characterization of biological materiais”, Curling em E x ρ. i n Phy s i o 1.» and Bi oc hem. 3 (1970). (A palvra
SEPHADEX é uma marca registada.) Cada, uma das fracções de 7 ml colhidas da coluna foram testadas quanto á actividade lítica anti-hamster como descrito atrás. A Figura 8 demonstra que apesar destes anticorpos serem induzidos como resultado do transplante cardíaco a actividade anti—espécie reside quase exclusivamente na fracção de Ig“. Após ensaio da actividade, as fracções foram concentradas usando ultrafiltros CXi€5 (Pharmacia) para uma concentração de 0,5 mq/ml e guardadas a -70°C até serem usadas.
enxertado em 15 minutos inconsistentes com algumas
Para testar a sua capacidade para destruir um xeno-enxerto em oposição à simples lise de células vermelhas, corações de hamster foram transplantados para os pescoços de ratos rtaives. Assim que se estabeleceu o batimento cardíaco, 2 ml de soro não diluido ou ¢5,5 mg de imunoglobulina purificada contendo anticorpos líticos anti-hamster foram administrados por infusão intravenosa no rato. Tanto o soro não separado como as 0,5 mg de IgM consistentemente causaram a destruição do coração de hamster Qs resultados da infusão de IgG foram preparações provocando a falha do enxerto enquanto noutros o coração continuou a bater. Quando albumina da coluna 8200 foi infundida como testemunha os enxertos cardíacos sobreviveram sempre e foram rejeitados no tempo normal
X
para este modeles que é de 3 dias» Isto demonstra que a ligação deste anticorpo a um enxerto pode induzir a sua destruição hiperaguda»
EXEMPLO 7
Os resultados até agora apresentados neste pedido de patente têm demonstrado que a destruição de um xeno-enxerto pode envolver activação do complemento pela via alternativa ou pela activação do complemento mediada por anticorpos (via clássica).
Ainda, os reguladores do complemento na superfície do xeno-enxerto alvo podem protegê-lo da destruição por complemento homólogo mas não por complemento heterólogo» 0 passo crítico da activação comum às vias de activação do complemento é a clivagem do componente do corne-l emento C3« Esta clivaqem é efectuada
C3-convertases C4b2a Ca C3-convertase da via clássica) pe i a ou a
Estas convertase C3btíb (CS-convertase da via alternativa). enzimas clivam uo em Coo que, por sua. vez, pode levar a via alternativa a formar mais C3-convertase Cansa de resposta) Como resultado o sistema do complemento é rápidamente capaz de amplificar o depósito de C3b num alvo estranho”» Muito do C3b, no entanto, não interactua com êxito com o alvo estranho e permanece na fase fluída e pode portanto ligar-se indiscriminadamente às células do hospedeiro» Para proteger estas células do ataque pela ligação indiscriminada do complemento, desenvolveram-se proteínas de controle para inactivar os componentes do complementona fase fluída ou ligados aos próprios tecidos» As glicoproteínas que estão envolvidas no controle de C3 estão todas genéticamente associadas dentro de uma região do cromossoma huma.no designada locus RCA (reguladores da activação do complemento)» Neste exemplo demonstramos que as células de ratinho que adquiriram através de técnicas de fusão o cromossoma í humano e expressam proteínas do locus RCA na sua superfície comportam-se num ensaio
in vitro de destruição de xeno-enxerto como se fossem célulashumanas e não células de ratinho.
Linhas celulares
TL é um 1 x>ιna de células H de ami-goaia s-rans-formaos pelo vírus Epstein Barr produzida pela técnica ds Bird et al» (Nature 289 300-301 (1981)). B10 ê um hibridoma produtor de anticorpo monoclonal humana anti-tétana que foi obtida a partir d-a fusão de uma linha 1infoblastóids B humana (BLL) com a linha celular de mielonsa de ratinho X63—AG8.653 (Kierney et al. (3. Immunol„ 123 1548-1550 (1979)). As linhas celulares T5 e B10 foram obtidas -de Ms C. Cárter e Dr N.C» Hugbes-3ones do grupo MRC MITI de Babraham, Cambridge. DBS é uma linha celular d-s hibridoma de ratinho que produz anticorpo monoclonal anti-progesterona (Wright et al. Nature 295 415-417 (1982))= Sintetizaram-se os seguintes oligonucleotídeos iniciadores específicos do cromossoma humano ís (55-CCACAGGTGTAACATTGTGT-35) e Í5?~8A8ATAGTGTGATC7GA8GC~35), estes são, respeotivamente, iniciadores a montante e jusante do gene da antitrombina 32 humana ÍAT3) que se sabe estar no cromossoma í (Wu et al» Nucl Acíds Res. 17 6433 (1989)). Os oligonucleotídeos podem ser sintetizados por técnicas bem conhecidas dos familiarizados com a matéria»
Preparou-se DNA gsnómico de alto peso molecular usando o método de Herrm-snn e Frischauf (Methods Enzy mo 1. Í52 180-183 (1987)). Resumidamente, 100 x 10a células de cada uma das linhas celulares em cultura foram lisadas por 5 ml da TNE (100 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA 1% Sarkosyi) e tratadas com proteinase K fresca (100 mierogramas por ml). A preparação foi extraída com fenol (saturado com água e equilibrada contra 0,1 M Tris, pH 8) extraída com fenol-clorofórmio Císí, v/v) e depois com clorofórmio-ácool isoamílico (24 si v/v). 0 DNA foi obtida por
4© precipitação com etanol e dialisado contra TE <1© mM Tris pH 8,©, í mM EDTA) ajustado a 1Θ© mM NaCl e TE sozinho a 4*C« 0 DNA isolado foi analisado num gel ds ©,57 ds agarose e a concentração determinada por densidade óptica a 26© nm, A reacção em cadeia com polimera.se efectuada como
:ada uma | d&& |
Saiki et | al« |
con tendo | 50© ; |
'S e 2,5 | txn á. d |
al, (Science (1988)), Num volume de 1©©μ1 contende? 5©© ng de DNA genómico, 1,2 ng de cada, um Taq ( Thermos dos iniciadores e
DNA-polimerase aequaticus tipo 3) (Cambio Ltd, Cambridge, UK)
SusseXn UK) foram numa concentrarão de mh cada, 0 usando o tampão fornecido com a enzima» Os nucleotídeos ÍdNTPs) Fs«tt
DNA foi amplificado durante .3© ciclos usando um controlador térmico programável (Senetic Research Instrumentation Ltd, Dunmow, Essex, UfO s desnaturação 93*C 1 minutos emparelhamento 55<!C 1 minutos e extensão 72*C 2 minutos, 1© μΐ do produto de reacção foram analisados directamente por migração num gel de agarose a 2% em tampão Tris ácido bórico EDTA, 0 tamanho do produto foi determinado por comparação com DNA do fago Χ-174-rf digerido com HinoII (Pharmacia LKB Biotschnology, Upsala, Sweden).
As células T5, Bl© e DB3 cultivadas foram tratadas com anticorpo monoclonal anti-DAF (factor de acleração do decaimento) (Kinoshita et al. (J, Exp. Med» 162 75-92 1985)) e segundo anticorpo conjugado com fluoreceína» As células (i x i©a) reagiram com o anticorpo monoclonal 1©© μΐ de Í©Z FCS €5,17) de azl Immunol. 136. 339D-3395 (1986) ) York University Medicai Centre negativas foram tampão sózinho.
1AÍ© anti-DAF ílg82a 1© pg/ml em da), 1A1© (Kinoshita. st al, (3, foi obtido do Efr M» Davitz do New , Nsim York USA» As testemunhas
Após incubação durante 2 horas em gelo as células foram lavadas 3 vezes, ressuspsnsss e incubadas em 1©© μΐ de tampão contendo 1 em lô© F(ab5)2 de catara anti-IgG de ratinho (cadeias leve e pesada purificadas por afinidade e adsorvidas com IG humana) conjugado com FITC (Tago Immunochemi cais Inc, Burlingame, Califórnia, USA) durante uma hora em gelo. Algumas células foram incubadas com o segunda anticorpo como testemunhas da coloração. Uma vsz que DB3 è uma linha celular secretora de IgGl de ratinho foram também usados anticorpos de carneiro anti--lgG2A de ratinho conjugados com FITC Cl em 4®, The Binding Site Ltd, Birmingham, UK) ou ΙΘ de cabra anti-ratinha pré-adsorvida com iguais volumes de células DB3 de modo a eliminar a reactividade anti-IgGl que acorra quando da coloração de células DB3» Todas as células foram extensivamente lavadas e ressuspensas em 2®® μΐ de tampão» As células DAF positivas foram detectadas usando um sistema Beckton Dickinson FACS-STAR para análise ds separação de células activada por fluorescãncia (FACS)» CA expressão FACS-STAR é uma marca registada») método PCR foi usado para determinar a presença do cromossoma humano 1 em três linhas de células em cultura diferentes, T5 (humana), Bí® (humana-ratinho) e DB3 Cratinho-ratinho). A Figura 9 mostra que após a -amplificação T5 e Bí® têm uma banda de 495 pares de bases- enquanto DB3 Cie o híbrido ratinho-ratinho) não tem qualquer banda» Foi descrito que os produtos PCR usando iniciadores AT3 consistiram em 2 alelos, com os tamanhos de 572 pares de bases (alelo ί) e 496 pares de bases (alelo 2) Ci4u et al«, loc» cifc.)« As bandas encontradas nos DNAs genómicas de T5 e Bí® correspondem ao alelo 2» Isto demonstra que a linha celular híbrida humano-ratinho Bl® continha o cromossoma í humano»
A análise FACS para a presença de DAF mostrou que a maioria das células T5 humanas (85,7%) deram reacção corada positiva com o anticorpo monoclonal anti-DAF» Um nível semelhante de células positivas (83,1%) foi encontrado nas células híbridas ratinho/humano Bí®» As células híbridas ratinho-ratinho DB3 apresentaram padrSes de coloração idênticos tanto para
preparações tratadas como não tratadas cons anti-DAB» No entanto, esta reactividade anti-Iguí de ratinho foi retirada se Cl) se usou soro de carneiro anti-Iq82a de ratinho conjugado cons FITC ou <25 o soro de cabra anti-IgS de ratinho foi anterior foi pré-adsorvido cons células DB3. Os resultados indicam que a linha celular híbrida ratinho-humana B1B expressam DAF humano na superfície da membrana celular conforme detectado por anticorpos monoclonais específicos anti-BAF» 0 nível de expressão é o mesmo para a linha celular humana T5« Uma linha de células de hibridoma ratinho-ratinho não expressa DAF humano»
Qs estudos de morte por células citotóxicas com libertação de crómio foram efectuados nestas linhas celulares como está descrita na Exemplo 5 atrás» A Figura 1Θ mostra que, quando os anticorpos de porco anti-humano são incubados com a linha de células humanas T5 a adição de complementa de coelho causou a lise enquanto não se dá qualquer lise quando o complemento humano é adicionado pois, certaíssnfce, a linha ds células T5 possuirá HCRFs humanos» Isto é a confirmação dos resultados do Exemplo 5» Quando foram usados os anticorpos humanos na linha de células humanas não se deu qualquer lise com complemento humano ou com complemento de coelho, mostrando que não existem auto-anticorpos» A técnica de libertação de crómio não permite que as incubações continuem o tempo suficiente para se detectar quaisquer níveis significativos de activação pela via alternativa do complemento de coelho pelas células humanas (Figura 11)» No entanto, quando anticorpos humanos são incubados com a linha de células de hibridoma ratinho-ratinho DB3 (Figura 12), a morte celular foi conseguida por complemento de coelho e por complemento humano demonstrando que de facto o complemento humano pode funcionar neste ensaio» Quando o híbrido humano-ratinho Bl«3, possuindo o cromossoma 1 humano e expressando pelo menos DAF, foi usado então o complemento de coelho provocou lise da linha celular enquanto o
complementa humano não consegue causar lise da linha celular (Figura Í3>. A explicação para isto é que os HCRFs sendo expressos devido ã presença do cromossoma 1 no híbrido ratinho-humano inibiram a actividade do complemento humano»
EXEMPLO 8 exemplo anterior demonstra que a presença do cromossoma 1 pode evitar a destruição das células do xerso-enxerto. Se bem que isto seja uma evidência circunstancial forte de que é o locus CRA que protege xeno-enxerto este exempl é demonstrado o efeito humanas com MCP e sua a célula de ratinho da destruição de o proporciona prova formal. Neste exemplo da transfecção de linhas de células não exposição a complemento humano ou de coelho»
Produ am-se cDNAs para
McP como descrito detalhadamente por Lublin et al» C3» Exp» Med. 168 construção de linhas celulares transfectadas o plasmideo de expressão SFFV.neo seguindo a
181-194 (1988)). A foi realizada usando técnica descrita por
Fuhlbrigge et al. (Proc Natl» A-cad. Sei. 85 5649-5653 (1988))» Este contem a repetição terminal longa 5? do virus- Friend formador de focus no baço CSFFV.LTR) (Clark e Mak (Nuc1. Acids Res. 10 3315-333© (198-2)) e (Proc., Natl» Acad» Sei
5037-5041 (1983)))» As linhas celulares foram adquiridas è. American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, As linhas celulares usadas foram CH0-K1 (ATCC CCL 61) e NIH/3T3 (ATCC CRL 1658)» A expressão do gene foi confirmada usando um anticorpo monoclorial contra MCP (Andrews et al« Ann»
Hum. Senet« 49 31-39 (1985)) e análise por FACS como já descrito»
Nalguns casos as linhas celulares foram seleceionadas relativamente a um nível elevado de expressão de MCP por separação analítica de células no FACS usando técnicas convencionais»
Este exemplo ilustra o efeito da transfecção de células CHO com MCP. Devido a estas linhas celulares cresceres em morsoca·insdas, a morte celular foi analisada pelo ensaio de incorporação de adenina terminal como descrito por Bono et al. (Immunoiogy 32 221-226 (1977))=, Resumidamente, este ensaio envolveu a incubação de culturas celulares em placas de 96 cavidades de fundo plano com complemento e anticorpo. No fim do período da incubação experimental, a viabilidade celular foi avaliada pela capacidade da cultura para incorporar adenina radioactiva» As células viáveis incorporam adenina, as células mortas não incorporam = assim as células viáveis têm contagens elevadas e -as células mortas têm contagens baixas»
Tal como acontece com muitas células transformadas, as células CHO são insensíveis aos anticorpos naturais e à acção da via alternativa do complemento. No -entanto, estas células são sensíveis aos anticorpos qus tal como foi demonstrado provocam destruição do xenoenxerto ds coração de Hamster como descrita no Exemplo 6» Uma vez que as células CHO derivam de hamster, estes anticorpos mataram as células CHO com complemento humano e da coelho (Figura 14). Guando as células CHO são transfectadas com MCP humano, as células podem apenas ser lisadas na presença de complemento de coelho,-. 0 complemento humano foi inibido pela presença do MCP humano na superfície da linha celular de hamster (Figura 15). A evidência da ausência de morte celular ser de uma falha da C3-converfcase é proporcionado pelo humano após incubação das células CHO por imunoelectroforese rocket como descrito no Exempla 4 atrás» Como se pode ver, não ocorre clivagem acima dos níveis testemunha de complemento (Figura 16).
facto devida a análise da clivagem do C3 regulação
Estes dados confirmam que proteínas de negativa modificadas por engenharia genética na superfície de
4S -
células não humanas protegerão aquelas células dos mecanismos de destruição hiperaguda ds xeno-enxertos que tem,, como carac ter ística comum, uma necessidade da clivagem complemento.
do componente L-ó do
EXEMPLO 9
Seguindo o processo do Exemplo 3, células 3T3 de fibroblastos de ratinho foram transfectadas com cDNA codificador de MCP CMCP clone K5.23). “Cr foi adicionado às células como descrito no Exemplo 5» Um volume de células foi então incubada com um volume de complemento humano inactivado pelo calor e um volume de complemento humano pré-adsorvido a 4°C com células de baço de ratinho para remover o anticorpo anti-ratinho do complemento humano. Testou-se a mistura e diluições seriadas com complemento. As condições gerais e características do ensaia da libertação de crómio foram como descrito como no Exemplo 5. Os resultados para o clone K5.23 estão apresentados na Figura 17, os quais também mostram, como testemunha, o efeito do cDMA de MCP ser introduzido na orientação contrária (neste caso não sendo transcrito). D cBNA de MCP correctamente transcrito confere protecção è.s células relativamente à moarte celular, conforme
ET·?
evidenciado polo nível relativamente baixo de libertação de Cr3 enquanto o cBNA não transcrito não confere protecção significativa, conforme evidenciada pelo nível relativamente alto de libertação de 51Cr.
EXEMPLO Í0
Resultados semlhantes aos descritos no Exemplo 8 atrás podem ser obtidos com células L1/21Ô (uma linha de células
4>
leucémicas de ratinho) transfectadas com o cuWft de DAt-, Os cDNAs foram produzidois para DAF como descrito em Lublin & Atkinson ( Απη» Rev, 1 misuno 1
EXEMPLO ií cDNA codificador de MCP foi preparado e SFFV.neo, como no Exemplo 8 atrás»
Usando esta preparação de DNA produziram-se ratinhos transgénicas como descrito em Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual de B» Hogan et al», Cold Spring Harbour Laboratory (1.986)» Dez a quinze murganhos fêmea (CBftxBl©) fl, com três a quatro semanas de idade, foi induzida superovulação por injecção intraperitoneal de S unidades de gonadotropina sérica de éguas prenhes (fornecido comercialmente como Foi ligar») seguido 48 horas mais tarde da injecção intraperitoneal de 5 unidades de gonadotropina coriónica de urina humana da gravidez (fornecido comercialmente como Chorulon). As fêmeas foram postas a acasalar, no dia da injecção de Chorulon, com machos (CBAxB10>Fl e no dia seguinte as fêmeas com rolhões vaginais foram mortas por deslocamento cervical e- os ovos fertilizados foram isolados a partir dos seus ov i duc tos» trezentos a quatrocentos ovos, isolados deste modo, continham dois pronúcleas claramente visíveis com óptica de contraste por interferência diferencial Nomarski com uma amplificação de 40© x» Um dos dois pronúcleos foi injectado com aproximadamente 2 ©O© cópias da preparação de DNA contendo o transgene de cDNA de MCP em concentrações variando de ©,5 a 2 nq/μΐ»
Os ovos que sobreviveram à microinjecção foram reimplantados nos oviductos de fêmeas (CBAxBí©)Fi que tinham
acasalada na noite anterior com machos castrados e estavam portanto pseudoprenhes <is5 elas tinham ovulado e o seu estado normal era o de gravidez mas os seus próprios oócitos não tinham sido fertilizados)» Aproximadamente 30 ovos microinjactados foram transferidos para os oviductos ds cada uma das fêmeas pseudográvidas, com anestesia, no mesmo dia da microinjecção ou no dia seguinte quando os ovos estavam na fase de 2 células» A gestação normal prosseguiu e nasceram dezassete murganhos de dez mães» 0 despiste da descetíência foi feito por transferência slot e/ou transferência Southern (ver Exemplo 8) s também PCR, análise de DNA de células da pele da cauda, utilizando sondas marcadas com '‘‘P e iniciadores que reconhecem o transgene» Um animal da descendência, um macho, provou ser transgénico para a sequência, de DNA de MCP»
EXEMPLO 12
D processo do Exemplo 11 foi repetido, exceptuando o cDNA codificador de DAF, como descrito no Exemplo 10, ter sido usado em lugar do cDNA de MCP’» Nasceram vinte e três descendentes a partir de dez mães» Foram obtidos três deles (duas fêmeas, um macho), transgênicos para DAF, como se mostra por transferência. Southern.
EXEMPLO 13
U ratinho macho obtido no Exemplo 11, contendo um transgene de cDNA de MCP humano foi deixado a crescer até à maturidade e cruzado com uma fêmea (CBA x BÍ0)FÍ» Resultaram onze ratinhos do cruzamento» DNA de células da cauda de cada um dos ratinhos descendentes foi testado por análise “slot-hlot, usando como sonda cDNA de MCP humano marcado, para determinar se o transgsne foi herdado» Os resultados estão apresentados na parte superior da Figura 18» Pode-se ver que os descendentes 0, 1, 5, 7, 8 e 10 herdaram o carácter» (Foram feitas quatro testemunhas: DNA humano CH) ? DNA de ratinha CM)? DNA de ratinho misturada cam 10 pg de cDNA marcado de MCP humano? e DNA de ratinho misturado com 10-0 pg de cDNA marcado de MCP humano»)
EXEMPLO 14 ratinho macho obtido no Exemplo 12, contendo um transgena de cDNA de DAF humano foi deixado crescer até à maturidadee cruzado com uma fêmea CCBA x B10)F1. Para cada um dos dos descendentes resultantes, DNA de células da cauda foi testada por análise “slot-blot, usando como sonda cDNA marcado de humano, para determinar se o transgene foi ou não herdado resultados estão apresentados na parte inferiopr da Figura 18» Pode-se observar que o descendente 13=3 (uma fêmea) herdou o carácter» (Fizeram-se quatro testemunhas: DNA humano <H>? DNA de ratinho CM), DNA de ratinho misturado com 10 pg de cDNA de DAF humano? e DNA de ratinho misturado com de DAF humano»)
DAF
Os marcado 100 p-g cDNA marcado
1 >· „
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- REIVINDICAÇÕES íê» - Método ds transplante ds tecido animal para um receptor, em que o tecido deriva de um dador de uma espécie sendo a sspécie dadora uma espécie diferente di d i scordan te do receptor,-elativsmente ao receptor, caracterizado por ss efectuar o enxerto do tecido no receptor a se proporcionar juntamente com o tecido enxertado um ou mais factores de restrição do complemento homólogos CHCRFs) activos na sspécie receptora para evitar a activação completa do complemento»25» - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a tecido ser um orqãa»Método de acordo com a reivindicação raracterizado por o orglo ser um coração, pulmão, fígado, pâncreas ou tiróide»4â» - Método de acordo con a reivindicação í, caracterizado por o tecido compreender sangue ou células hematopoiéticas, ilhéus de Langerhans, células do cérebro ou células de orgãos endócrinos»55» - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o HCRF interferir com a parte da cascada de activação do complemento que é comum às vias clássica e alternativa.65. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o HCRF ser é um HCRF natural»75» - Método de acordo com a reivindicação o, caracterizado por o HCRF regular a activação do complemento em C3»Sé» - Método de acordo com a reivindicação /, -izado por o HCRF ser ou ter a actividade des caracteFactor I (também anteriormente conhecido como inactivador de C3b ou KAF);Factor H;Proteína de ligação a C4;DAF (também conhecido como CD555?Proteína Cofactor de Membrana ÍNCP; também conhecido como CD46 e inicialmente descrito como gp45-70 e póster iormen te conhecido como gpésé/56);CRI (também conhecido como receptor de C3b/C4b ouCD35); e/ouCR2 (também conhecido como CD21, receptor de C3»dg, receptor de 3d/EBV e p!40)»7ã„ - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por o HCRF ter a actividade de um HCRF natural cujo gene está situado no local RCA (regulador da activação do complemento), o qual se situa na banda q32 do cromossoma 1»Í0ã» - Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o HCRF regular a activação do complemento em CS e/ou C-9» llã. - Método ds acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o HCRF ser ou ter actividade desC8bp (também conhecido casto HRF ou MIP>s p-18 (também conhecido como HRF-20, CD59 ou MIRL)§ ouSP40.40„12ã.Método de acordo com qualquer uma das reivindi· caçSes 1 a 11, caracterizado por o HbRh estar liqado à membrana, cações 1 a 12 •forma que é i·. ~ Método de acordo com qualquer uma d ? caracterizado por o HCRF ser proporei ntegrado na membrana celular do tecido as reivindionado de tal dador„14ã» - Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o tecido dador ser transgénico por conter s expressar ácido nucleico codificador de uma ou mais HCRFs activos na espécie receptora quando enxertados no receptor.15ã. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações i a 14, caracterizado por a espécie receptora ser a humana.íóã» - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por a espécie dadora ser um porco.animais proceder17â» Processo para a preparação de células ou tecidos enxertáveis de uma espécie dadora, caracterizado por se à associação das células ou tecido com um ou mais receptora pretendida para evitar activação completa do factores de restrição do complemento homólogos activos na espécie complemento, sendo as espécies dadoras de uma espécie discordante relativamente ê. espécie receptora.íSã. - Processo para a preparação de um animal transgénico, caracterizado por compreender a introdução de DNA estranho numa linha original do animal, em que, como resultado da transgénese, o animal tem tecido transplantável, o qual não dá origem a rejeição do xenoenxerto na transplantação para o sistema imune ou exposição ao mesmo de pelo menos uma espécie discordante.19â. - Processo para a preparação de tecido de uma espécie dadora, sendo o tecido enxertável sem rejeição hiperaguda numa espécie receptora, em que a primeira e a segunda espécies estão díscordantemente relacionadas, caracterizado por compreender a extracção de tecido a. partir da espécie dadora e se fazer com que o tecido, quer antes quer depois da extracção, seja associado com um ou mais factore de restrição do complemento homólogos activos na espécie receptora.20ã. - Processo para a preparação de um animal transgénico, caracterizado por compreender a introdução de DNA estranho numa linha original do animal, em que o DNA estranho faz com que o animal tansgênico tenha células capazes de expressarem um factor de restrição do complemento homólogo de uma outra espécie.
- 2íã. - Processo para a preparação de uma célula animal não transformada, caracterizado por compreender a introdução de DNA estranho na célula, ou num antepassado da célula, em que, como resultada da presença de DNA estranho, a célula é capaz de expressar um ou mais íactorres de restrição do complemento homólogos activos numa espécie que é discordante relativamente ã célula animal.22ã« - Processa para. a. preparação de DNA recombinante compreendendo DNA codificador de pelo menos um factor de restrição do complemento homólogo e uma ou mais sequências para permitir que o DNA codificador seja expresso por uma célula animal não transformada, caracterizado por compreender o acoplamento sucessivo de nucleotídeos uns com os outros e/ou a ligação de oligoe/ou poli-núcleotídeos»23â« - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por a célula animal ser uma célula de um animal transgénico tendo a construção genéticamente incorporada»24ã.Process de acorda com a reivindicação caracterizado por a célula ser orgão ou outro tecido em cultura como seja um ilhéu de Lanqerhans.25B„ - Processo para a preparação de uma construção genética adequada à incorporação no material genético ds um animal para produzir um animai transgénico, em que a construção compreende DNA codificador de pelo menos um factor ds restrição do complemento homólogo e uma ou mais sequências para permitir que o DNA codificador seja expresso em pelo menos algumas células animais da um animal transgénico incorporando genéticamente a construção, caracterizado por compreender o acoplamento sucessiva de nucleotídeos uns com os outros e/ou a ligação de oligo- e/ou poli-nucleotídeos»2ós« Processo de acordo com a reivindicação 2o,, caracterizada par ss preparar uma construção genética a qual esta na forma de YAC.27â» - Método para a preparação de um ari ima 1 nica, carcaterizado por compreender a incorporação no transgématerial 'a* genética de um animal, de DNA codificador de pelo menos um factor de restrição do complemento homólogo e uma ou mais sequências para permitir que o DiMA codificador seja expresso em pelo menos algumas células do animal transgénico»
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