BR112017008251B1

BR112017008251B1 - Usos de um tecido de um porco transgênico que compreende um gene a(1,3) galactosiltransferase, cmah e ß4galnt2 interrompido e de um produto relacionado com a pele, e, métodos para preparação de um material de transplante para xenoenxerto, para produção de um composto de interesse e para produzir um reagente de cultura de células

Info

Publication number: BR112017008251B1
Application number: BR112017008251-9A
Authority: BR
Inventors: Joseph A. Tector
Original assignee: Indiana University Research And Technology Corporation
Priority date: 2014-10-22
Filing date: 2015-10-21
Publication date: 2022-02-22
Also published as: JP2021045134A; EP3220925A4; WO2016065046A1; EP3220925B1; BR112017008251A2; JP2017536814A; WO2016065046A9; EP4129308A1; JP2023109993A; KR102659529B1; EP3220925A1; KR20170074941A; US20170311579A1; CN116059250A; KR20240055155A; CN107106607A; CA2965550A1

Abstract

O pedido provê métodos para melhorar um sintoma relacionado com a rejeição, para reduzir a separação prematura e métodos para produção de um composto de interesse com um perfil de epítopo alterado. São fornecidos porcos knockout com um gene ou genes interrompidos, e órgãos, tecidos e células porcinas a partir dos mesmos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório U.S. n°: 62/067.129, depositado em 22 de outubro de 2014, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.

INCORPORAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] A listagem de sequências em formato de texto apresentada aqui é incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.

DECLARAÇÃO REFERENTE A PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO COM PATROCÍNIO DO GOVERNO FEDERAL

[003] Não aplicável.

CAMPO DA INVENÇÃO

[004] A presente invenção refere-se geralmente ao campo de xenotransplante e modificação genética para desenvolver porcos transgênicos, Petição 870210107986, de 22/11/2021, pág. 10/22 órgãos, tecido ou células transgênicos porcinos adequados para transplante em um ser humano, particularmente porcos transgênicos com uma propensão reduzida a causar trombocitopenia, uma resposta de rejeição hiperaguda (HAR) ou captação de plaquetas.

FUNDAMENTOS

[005] Sabe-se bem que os transplantes de um animal para outro animal da mesma espécie, tal como de humano para humano, são uma opção de tratamento de rotina para muitas doenças graves, incluindo doenças nos rins, coração, pulmão, fígado e outros órgãos e danos na pele, como queimadura grave. No entanto, sabe-se bem que não existem órgãos adequados suficientes disponíveis para transplante para satisfazer demandas clínicas atuais ou esperadas para transplantes de órgãos. Aproximadamente 100.000 pacientes estão na lista de transplante de rim, e eles permanecem na lista de espera uma média de quase cinco anos antes de receber um transplante ou morrer. Em pacientes com insuficiência renal, a diálise aumenta o tempo que o paciente pode esperar por um transplante. Mais de 18.000 pacientes estão na lista de espera de transplante de fígado da UNOS, mas menos de 7.000 transplantes são realizados anualmente nos Estados Unidos. Não existe um sistema comparável à diálise disponível para doentes com doença hepática ou insuficiência hepática.

[006] Xenotransplante, o transplante de órgãos, tecidos ou células de um animal para outro animal de uma espécie diferente, como o transplante de um órgão de porco para um receptor humano, tem potencial para reduzir a escassez de órgãos disponíveis para transplante, potencialmente ajudando milhares de pessoas em todo o mundo. No entanto, o xenotransplante que usa tecido de porco padrão não modificado em um humano ou outro primata é acompanhado por uma rejeição severa do tecido transplantado. A rejeição pode ser uma rejeição hiperaguda, uma rejeição aguda, uma rejeição crônica, pode envolver coagulopatia de trombocitopenia limitante de sobrevivência ou pode ser uma reação de xenoenxerto humoral aguda (AHXR). A resposta de rejeição hiperaguda humana aos anticorpos de porco presentes no tecido transplantado é tão forte que o tecido de transplante é tipicamente danificado pelo sistema imunológico humano dentro de minutos ou horas de transplante para o ser humano. Além disso, diferentes mecanismos de rejeição podem predominar em um modo preferido de órgão. Ver Demetris et al. 1998 “Antibody-mediated Rejection of Human Orthotopic Liver Allografts. A study of liver transplantation across ABO blood group barriers”, Am J. Pathol 132:489-502; Nakamura et al 1993 “Liver allograft rejection in sensitized recipients. Observations in a Clinically Relevant Small Animal Model” Am J. Pathol. 142:1383-91; Furuya et al 1992. “Preformed Lymphocytotoxic Antibodies: the Effects of Class, Titer and Specificity on Liver v Heart Allografts” Hepatology16:1415-22; Tector et al 2001. “Rejection of Pig Liver Xenografts in Patients with Liver Failure: Implications for Xenotransplantation”, Liver Transpl pp.82-9; aqui incorporados por referência na sua totalidade. Por exemplo, o desenvolvimento precoce de coagulopatia trombocitopênica é um fator importante na morte de receptores primatas não humanos após xenotransplante de um fígado de porco. No entanto, se a rejeição de xenoenxerto mediada por anticorpos (AMXR, AMR) for evitada, receptores primatas não humanos (NHP) de rins de porco não desenvolvem trombocitopenia significativa nem apresentam manifestações clínicas de coagulopatia. Ver, por exemplo, Ekser et al. 2012 “Genetically Engineered Pig to Baboon Liver Xenotransplantation: Histopathology of Xenografts and Native Organs” PLoS ONE pp e29720; Knosalla et al 2009, “Renal and Cardia Endothelial Heterogeneity Impact Acute Vascular Rejection in Pig to Baboon Xenotransplantation”, Am J Transplant 1006-16; Shimizu et al 2012. “Pathologic Characteristics of Transplanted Kidney Xenografts”, J. Am. Soc. Nephrology 225-35; aqui incorporados por referência na sua totalidade.

[007] Além da necessidade de órgãos, tecidos e células para transplante, há uma escassez de sangue seguro para transfusão. Onze milhões de transfusões de sangue utilizando glóbulos vermelhos humanos compactados (RBC) são administradas nos Estados Unidos todos os anos (National Blood Data Source, 1998). O suprimento de sangue dos Estados Unidos é cronicamente inadequado. Em 2001, foi antecipado que os bancos de sangue dos EUA obteriam cerca de 250.000 unidades a menos do que o idealmente desejado. Os funcionários rotineiramente preveem uma escassez nacional crítica durante os meses de verão, quando os doadores regulares de sangue saem de férias e os estudantes universitários também saem dos grandes centros urbanos. Como a nação possui um sistema robusto e competitivo de coleta e distribuição de sangue, a escassez periódica geralmente não resulta em mortes, mas as cirurgias eletivas podem precisar ser adiadas e as necessidades não críticas não são atendidas. Como o sangue normalmente doado só pode ser armazenado por cerca de 42 dias e menos de 5% dos doadores elegíveis doam sangue, condições climáticas severas, como tempestades de neve ou furacões, muitas vezes resultam em reservas de sangue perigosamente baixas.

[008] Não só o sangue humano é um recurso escasso, mas também vem com um risco potencial para o receptor. Apesar dos processos de triagem viral, o sangue humano doado não é 100% seguro (FDA, Resumo Anual de Mortes Reportado ao FDA após a Coleta e Transfusão de Sangue, FY2013). A incidência de Hepatite C e HIV na população em geral exige testes dispendiosos e difíceis de produtos de sangue doados. Devido à dificuldade e aos custos de assegurar que o sangue humano está livre de quaisquer microorganismos infecciosos, seria altamente desejável desenvolver uma fonte de glóbulos vermelhos e outros produtos de transfusão que seriam ilimitados em quantidade e livres de agentes infecciosos.

[009] As células de porco expressam α(1,3) galactosiltransferase (αGal) e hidroxilase de ácido citidina monofosfato-N-acetilneuramínico (CMAH), que não são encontradas em células humanas. As células de porco também expressam β1,4 N-acetilgalactosaminiltransferase porcina (β4GalNT2); pensa-se que muitos seres humanos expressam uma forma de β4GalNT2 (Morton et al (1970) Vox Sang 19:472-482). A enzima αGal catalisa a formação de resíduos de galactose-α1,3-galactose (αGal) em glicoproteínas. CMAH converte o ácido N-acetilneuramínico de ácido siálico (Neu5Ac) em ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc). β1,4 N- acetilgalactosaminiltransferase porcina (β4GalNT2) catalisa a adição terminal de N-acetilgalactosamina a uma amina de lactose modificada com ácido siálico para render antígenos tipo Sda incluindo, mas não se limitando a, Sda, e GalNAc β1,4[Neu5Ac α2,3] Gal β1-4GlcNAc β1-3 Gal, também conhecido como o antígeno do grupo sanguíneo CAD ou CT (Blanchard et al (1983) JBC 258:7691-7695). β4GalNT2 porcina pode catalisar a formação de glicanos adicionais também. Anticorpos para os epítopos de Neu5Gc, αGal e Sda estão presentes no sangue humano antes da implantação do tecido e estão envolvidos na rejeição intensa e imediata mediada por anticorpos do tecido implantado. Anticorpos para epítopos adicionais de β4GalNT2 (tipo Sda) podem também estar presentes no sangue do paciente e podem contribuir para a rejeição mediada por anticorpos do tecido implantado.

[0010] Muitas estratégias têm sido usadas para abordar a resposta de rejeição incluindo a remoção dos genes que codificam α(1,3) galactosiltransferase e CMAH para impedir a expressão das enzimas, a modificação dos genes que codificam α(1,3) galactosiltransferase e CMAH para reduzir ou limitar a expressão das enzimas, ou de outra forma limitar a resposta de rejeição. A Patente U.S. 7.795.493 de Phelps et al descreve um método para a produção de um porco que não possui qualquer expressão de αGal funcional. Por exemplo, a patente U.S. 7.547.816 de Day et al descreve um porco knockout com expressão diminuída de α(1,3) galactosiltransferase em comparação com porcos de tipo selvagem. Embora os porcos de Day possam ter uma expressão diminuída de α(1,3) galactosiltransferase, os epítopos antigênicos de Neu5Gc permanecem presentes e os glicolipídios dos porcos de Day têm epítopos antigênicos de αGal. Infelizmente, embora o porco GTKO possa ter anticorpos anti-α-Gal reduzidos como uma barreira ao xenotransplante, estudos que usam xenoenxertos cardíacos e renais GTKO em babuínos mostram que os órgãos GTKO ainda desencadeiam uma resposta imunogênica, resultando em rejeição ou danos ao órgão transplantado. Babuínos transplantados com rins GTKO e tratados com dois diferentes regimes imunossupressores morreram dentro de 16 dias da cirurgia. Chen et al concluíram que “o esgotamento genético dos antígenos Gal não fornece um benefício importante na sobrevivência do xenoenxerto” (Chen et al., (2005) Nature Med 11(12):1295-1298. A Patente U.S. 7.560.538 de Koike et al e as Patentes U.S. 7.166.378 e 8.034.330 de Zhu et al descrevem métodos para fabricar órgãos porcinos para transplante que são menos susceptíveis de estarem sujeitos à rejeição de xenoenxerto retardada e rejeição hiperaguda, respectivamente. As patentes de Zhu discutem a redução da atividade de CMAH ou epítopos em células porcinas. No entanto, Basnet et al examinaram a resposta citotóxica do soro humano às células de rato CMAH -/-. Basnet et al concluíram que “a resposta imune mediada por Ab anti-Neu5Gc pode estar significativamente envolvida na perda de enxerto no transplante de células xenogênicas, mas não no transplante de órgãos” (Basnet et al., 2010 Xenotransplantation 17(6):440-448). A Patente U.S. 6.166.288 de Diamond et al descreve métodos de preparação de órgãos, tecidos ou células para xenotransplante em seres humanos com rejeição reduzida do material de xenotransplante. A Patente U.S. 6.166.288 descreve porcos transgênicos que expressam um gene fucosiltransferase que codifica uma enzima que supostamente remove certos antígenos xenorreativos de órgãos, tecidos e células porcinos. A Patente U.S. 6.166.288 não fornece porcos transgênicos com alterações em três genes porcinos.

[0011] A Patente U.S. 6.572.867 de Schwarz et al fornece composições imunossupressoras para a redução dos níveis plasmáticos de anticorpos anti-(αGal(1,3)Gal) em um primata. As terapias imunossupressoras são conhecidas nas técnicas de transplante. Os regimes medicamentosos imunossupressores aumentam o risco de infecção, pois atenuam as respostas imunes do paciente, exigem medicamentos de manutenção caros, podem incluir fármacos que interagem com outros medicamentos e podem causar efeitos colaterais adicionais, como ganho de peso.

[0012] O progresso neste campo é criticamente dependente do desenvolvimento de porcos geneticamente modificados com modificações que reduzam a resposta de rejeição. Infelizmente, o desenvolvimento de porcos transgênicos homozigóticos é um processo lento, que requer um período de três anos usando métodos tradicionais de recombinação homóloga em fibroblastos fetais seguida de transferência nuclear de células somáticas (SCNT) e depois criação de animais transgênicos heterozigóticos para produzir um porco transgênico homozigótico. O desenvolvimento de novos porcos transgênicos para xenotransplante foi dificultado pela falta de células- tronco pluripotentes, confiando em vez disso no fibroblasto fetal como a célula em que a engenharia genética foi realizada.

[0013] Existe, portanto, uma necessidade na técnica de um método melhorado, simples, replicável, eficiente e padronizado para produzir porcos knockout triplo (αGal, β4GalNT2, CMAH) com reduzida αGal, epítopos tipo Sda e Neu5Gc como fonte de material de transplante para órgãos, tecido, sangue e células para receptores de transplante humano.

BREVE SUMÁRIO

[0014] A presente descrição refere-se em geral a métodos para fabricar órgãos, tecidos ou células porcinos com expressão de α(1,3)galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 reduzida para transplante para um humano.

[0015] É fornecido um porco transgênico compreendendo um gene α(1,3)-galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 interrompido no genoma nuclear de pelo menos uma célula do porco. A expressão de α(1,3)- galactosiltransferase, CMAH e β 1,4 N-acetilgalactosaminiltransferase no porco transgênico está diminuída em comparação com a expressão em um porco de tipo selvagem. É fornecido um órgão, tecido, produto de transfusão ou célula de porco obtido a partir do porco transgênico triplo. Um órgão, tecido, produto de transfusão ou célula porcino(a) pode ser selecionado(a) do grupo que consiste em pele, coração, fígado, rins, pulmão, pâncreas, tireoide, intestino delgado, sangue e componentes dos mesmos. Em um aspecto, quando tecido do porco transgênico triplo é transplantado para um humano, um sintoma relacionado à rejeição é melhorado quando comparado com quando um tecido de um porco de tipo selvagem é transplantado para um humano. Em um aspecto, o sintoma relacionado à rejeição é selecionado do grupo que compreende um sintoma relacionado à resposta de rejeição celular, um sintoma relacionado à resposta de rejeição humoral, um sintoma relacionado à rejeição hiperaguda, um sintoma relacionado à rejeição da reação de xenoenxerto humoral aguda e um sintoma relacionado à resposta de rejeição vascular aguda. Em um aspecto, quando um órgão, tecido, produto de transfusão ou célula do porco transgênico triplo é transplantado para um humano, a trombocitopenia é diminuída em comparação com quando um órgão, tecido, produto de transfusão ou célula de um porco de tipo selvagem é transplantado para um humano. Em um aspecto, quando um fígado do porco transgênico triplo é exposto a plaquetas humanas, o fígado apresenta uma captação reduzida de plaquetas humanas em comparação com quando um fígado de um porco de tipo selvagem é exposto a plaquetas humanas. Em um aspecto, quando um rim do porco transgênico triplo é transplantado para um humano, um sintoma relacionado à rejeição é diminuído quando comparado com quando um rim de um porco de tipo selvagem é transplantado para um humano.

[0016] Em uma modalidade, um produto relacionado à pele obtido a partir de um porco transgênico triplo compreendendo um gene α(1,3)- galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 interrompido no genoma nuclear de pelo menos uma célula do porco e em que a expressão de α(1,3)- galactosiltransferase, CMAH e β1,4 N-acetilgalactosaminiltransferase está diminuída em comparação com um porco de tipo selvagem. Em um aspecto do pedido, o produto relacionado à pele apresenta uma separação prematura reduzida de uma ferida, particularmente de uma ferida de pele humana.

[0017] São fornecidos métodos para a preparação de material de transplante para xenotransplante em um ser humano. Os métodos compreendem fornecer um porco transgênico triplo do pedido como uma fonte do material de transplante e em que o material de transplante é selecionado do grupo que consiste em órgãos, tecidos, produtos de transfusão e células e em que o material de transplante tem níveis reduzidos de αGal, antígenos tipo Sda e antígenos Neu5Gc.

[0018] São fornecidos porcos transgênicos triplos compreendendo um gene α(1,3)-galactosiltransferase, CMAH e β1,4GalNT2 interrompido no genoma nuclear de pelo menos uma célula do porco. Em uma modalidade, a interrupção do gene α(1,3)-galactosiltransferase é selecionada do grupo de interrupções que inclui, mas não se limita a uma deleção de três pares de bases adjacente a uma substituição de G por A, uma deleção de um único par de bases, uma inserção de um único par de bases, uma inserção de dois pares de bases, uma deleção de seis pares de bases, uma deleção de dez pares de bases, uma deleção de sete pares de bases, uma inserção de oito pares de bases para uma deleção de cinco pares de bases, uma inserção de cinco pares de bases, uma deleção de onze pares de bases, e uma deleção de dezoito pares de bases; a interrupção do gene CMAH é selecionada do grupo de interrupções que inclui, mas não se limita a uma inserção de quatro pares de bases, uma deleção de um par de bases, uma deleção de dois pares de bases, uma deleção de três pares de bases, uma inserção de quatro pares de bases, uma deleção de cinco pares de bases, uma deleção de oito pares de bases, uma deleção de onze pares de bases, uma deleção de doze pares de bases, uma inserção de um único par de bases, uma inserção de dois pares de bases para uma deleção de um único par de bases, uma inserção de doze pares de bases para uma deleção de sessenta e seis pares de bases, uma inserção de quatro pares de bases para uma deleção de três pares de bases; e uma deleção de cinco pares de bases/substituição de um par de bases, e a interrupção do gene β4GalNT2 é selecionada do grupo de interrupções que inclui, mas não se limita a uma inserção de um par de bases, uma deleção de doze pares de bases/substituição de um par de bases, uma deleção de doze pares de bases, uma deleção de quatorze pares de bases, uma deleção de cinco pares de bases e uma deleção de 271 pares de bases/inserção de 1 par de bases. Em uma modalidade, a interrupção do gene α(1,3)-galactosiltransferase é selecionada do grupo de interrupções que inclui uma deleção de cinco pares de bases e uma deleção de sete pares de bases, a interrupção do gene CMAH é selecionada do grupo de interrupções que inclui uma deleção de doze pares de bases e uma deleção de três pares de bases/inserção de quatro pares de bases, a interrupção do gene β4GalNT2 é selecionada do grupo de interrupções que inclui uma inserção de um par de bases, uma deleção de doze pares de bases e uma deleção de cinco pares de bases. Em uma modalidade, a interrupção do gene α(1,3)-galactosiltransferase é selecionada do grupo de interrupções que inclui uma deleção de onze pares de bases e uma deleção de dezoito pares de bases, a interrupção do gene CMAH é selecionada do grupo de interrupções que inclui uma deleção de sessenta e seis pares de bases/inserção de doze pares de bases e uma deleção de cinco pares de bases/substituição de um par de bases, e a interrupção do gene β4GalNT2 é selecionada do grupo de interrupções que inclui uma deleção de quatorze pares de bases, uma deleção de doze pares de bases/substituição de um par de bases e uma deleção de 271 pares de bases/inserção de 1 par de bases. A expressão de α(1,3)- galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 funcional no porco transgênico triplo está diminuída em comparação com um porco de tipo selvagem. Quando tecido do porco transgênico triplo é transplantado para um humano, uma síndrome relacionada à rejeição hiperaguda é melhorada quando comparado com quando um tecido de um porco de tipo selvagem é transplantado para um humano.

[0019] São fornecidos métodos para aumentar a duração do período entre o momento em que um indivíduo humano é identificado como um indivíduo com necessidade de um transplante de órgão humano e quando o transplante de órgão humano ocorre. Os métodos envolvem fornecer um órgão de um porco transgênico triplo compreendendo genes α(1,3)- galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 interrompidos em que a expressão de α(1,3)-galactosiltransferase, CMAH e β1,4 N- acetilgalactosaminiltransferase é diminuída em comparação com um porco de tipo selvagem e afixar cirurgicamente um órgão do porco transgênico triplo ao indivíduo humano de maneira terapeuticamente eficaz. Em um aspecto, o órgão é afixado cirurgicamente internamente ao indivíduo humano. Em um aspecto, o órgão é afixado cirurgicamente externamente ao indivíduo humano. O órgão pode ser afixado direta ou indiretamente ao indivíduo.

[0020] São fornecidos métodos para aumentar a duração do período entre o momento em que um indivíduo humano é identificado como um indivíduo com necessidade de um transplante de fígado humano e quando o transplante de fígado humano ocorre. Os métodos envolvem fornecer um órgão de um porco transgênico triplo compreendendo genes α(1,3)- galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 interrompidos em que a expressão de α(1,3)-galactosiltransferase, CMAH e β1,4 N- acetilgalactosaminiltransferase é diminuída em comparação com um porco de tipo selvagem e afixar cirurgicamente um fígado do porco transgênico triplo ao indivíduo humano de maneira terapeuticamente eficaz. Em um aspecto, o fígado é afixado cirurgicamente internamente ao indivíduo humano. Em um aspecto, o fígado é afixado cirurgicamente externamente ao indivíduo humano. O fígado pode ser afixado direta ou indiretamente ao indivíduo.

[0021] São fornecidos métodos para aumentar a duração do período entre o momento em que um indivíduo humano é identificado como um indivíduo com necessidade de um transplante de rim humano e quando o transplante de rim humano ocorre. Os métodos envolvem fornecer um rim de um porco transgênico triplo compreendendo genes α(1,3)- galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 interrompidos em que a expressão de α(1,3)-galactosiltransferase, CMAH e β1,4 N- acetilgalactosaminiltransferase é diminuída em comparação com um porco de tipo selvagem e afixar cirurgicamente um rim do porco transgênico triplo ao indivíduo humano de maneira terapeuticamente eficaz. Em um aspecto, o rim é afixado cirurgicamente internamente ao indivíduo humano. Em um aspecto, o rim é afixado cirurgicamente externamente ao indivíduo humano. O rim pode ser afixado direta ou indiretamente ao indivíduo.

[0022] São fornecidos métodos para reduzir a separação prematura de um produto relacionado à pele de um indivíduo humano. Os métodos envolvem as etapas de fornecimento de um porco transgênico triplo compreendendo genes α(1,3)-galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 interrompidos e preparação de um produto relacionado à pele a partir do porco transgênico triplo. A expressão de α(1,3)-galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 no porco transgênico triplo está diminuída em comparação com um porco de tipo selvagem.

[0023] São fornecidos métodos para melhorar um sintoma relacionado à rejeição hiperaguda. Os métodos envolvem o transplante de material de transplante porcino com um nível reduzido de antígenos αGal, antígenos tipo Sda e antígenos Neu5Gc para um indivíduo. Um sintoma relacionado à rejeição hiperaguda é melhorado em comparação com quando material de transplante porcino de um porco de tipo selvagem é transplantado para um humano.

[0024] É fornecido um reagente de cultura celular que apresenta um perfil de epítopo alterado. O reagente de cultura celular é isolado a partir de um porco transgênico triplo compreendendo genes α(1,3)- galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 interrompidos. A expressão de α(1,3)-galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 no porco transgênico triplo está diminuída em comparação com um porco de tipo selvagem. O reagente de cultura celular é selecionado do grupo que compreende meios de cultura celular, soro de cultura celular, aditivos de culturas celulares e células isoladas capazes de proliferação. Em um aspecto, o reagente de cultura celular é isolado de um porco transgênico triplo em que a interrupção do gene α(1,3)- galactosiltransferase é selecionada do grupo de interrupções que consiste em uma deleção de cinco pares de bases, uma deleção de sete pares de bases ou uma inserção de um único par de bases na posição indicada, a interrupção do gene CMAH é selecionada do grupo de interrupções que consiste em uma deleção de doze pares de bases, uma deleção de três pares de bases/inserção de quatro pares de bases, uma deleção de sete pares de bases e uma deleção de onze pares de bases, e a interrupção do gene β4GalNT2 é selecionada do grupo de interrupções que consiste em uma inserção de um único par de bases no sítio indicado, uma deleção de doze pares de bases e uma deleção de cinco pares de bases. Em um aspecto, o reagente de cultura celular é isolado de um porco transgênico triplo em que a interrupção do gene α(1,3)- galactosiltransferase é selecionada do grupo de interrupções que inclui uma deleção de onze pares de bases e uma deleção de dezoito pares de bases, a interrupção do gene CMAH é selecionada do grupo de interrupções que inclui uma deleção de sessenta e seis pares de bases/inserção de doze pares de bases e uma deleção de cinco pares de bases/substituição de um par de bases, e a interrupção do gene β4GalNT2 é selecionada do grupo de interrupções que inclui uma deleção de quatorze pares de bases, uma deleção de doze pares de bases/substituição de 1 par de bases e uma deleção de 271 pares de bases/inserção de 1 par de bases.

[0025] São fornecidos métodos para produzir um composto de interesse com um perfil de epítopo alterado. O método envolve as etapas de fornecimento de um reagente de cultura celular que apresenta um perfil de epítopo alterado e incubação de uma célula isolada capaz de expressar o composto de interesse com o reagente de cultura celular que apresenta um perfil de epítopo alterado. O reagente de cultura celular com um perfil de epítopo alterado é isolado de um porco transgênico triplo compreendendo genes α(1,3)-galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 interrompidos. A expressão de α(1,3)-galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 no porco transgênico triplo está diminuída em comparação com um porco de tipo selvagem. O nível de epítopos Neu5Gc, alphaGal e tipo Sda no composto de interesse é menor que o nível de epítopos Neu5Gc, alphaGal e tipo Sda no composto de interesse quando o composto de interesse é produzido a partir de uma célula isolada incubada com um reagente de cultura celular isolado de um porco de tipo selvagem. Em uma modalidade, o composto de interesse é selecionado do grupo que compreende glicolipídios e glicoproteínas. Em vários aspectos, o composto de interesse é uma glicoproteína selecionada do grupo de glicoproteínas que compreende anticorpos, fatores de crescimento, citocinas, hormônios e fatores de coagulação. Em uma modalidade, a interrupção do gene α(1,3)-galactosiltransferase é selecionada do grupo de interrupções que consiste em uma deleção de cinco pares de bases, uma deleção de sete pares de bases ou uma inserção de um único par de bases na posição indicada, a interrupção do gene CMAH é selecionada do grupo de interrupções que consiste em uma deleção de doze pares de bases, uma deleção de três pares de bases/inserção de quatro pares de bases, uma deleção de sete pares de bases e uma deleção de onze pares de bases, e a interrupção do gene β4GalNT2 é selecionada do grupo de interrupções que consiste em uma inserção de um único par de bases no sítio indicado, uma deleção de doze pares de bases e uma deleção de cinco pares de bases. Em uma modalidade, a interrupção do gene α(1,3)-galactosiltransferase é selecionada do grupo de interrupções que inclui uma deleção de onze pares de bases e uma deleção de dezoito pares de bases, a interrupção do gene CMAH é selecionada do grupo de interrupções que inclui uma deleção de sessenta e seis pares de bases/inserção de doze pares de bases e uma deleção de cinco pares de bases/substituição de um par de bases, e a interrupção do gene β4GalNT2 é selecionada do grupo de interrupções que inclui uma deleção de quatorze pares de bases, uma deleção de doze pares de bases/substituição de um par de bases e uma deleção de 271 pares de bases/inserção de 1 par de bases.

[0026] São fornecidos materiais de transplante porcinos para transplante em um ser humano. Os lipídios e as proteínas do material de transplante porcino têm um nível reduzido de epítopos αGal, e o material de transplante tem um nível reduzido de epítopos Neu5Gc e tipo Sda.

[0027] São fornecidos porcos transgênicos compreendendo um gene α1,3-galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 interrompido no genoma nuclear de pelo menos uma célula do porco, em que a expressão de α1,3- galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 está diminuída em comparação com um porco de tipo selvagem e em que a ligação de VVL é reduzida.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0028] A Figura 1 ilustra um esquema das alterações de sequência no porco knockout exemplificativo (identificador de isolado de porco 47-1). O painel A apresenta porções das sequências nucleotídicas do gene α1,3 galactosiltransferase (GGTA-1) de tipo selvagem (wt) e interrompido. Uma porção da sequência nucleotídica de GGTA-1 de tipo selvagem (WT) é mostrada na linha superior. A mesma região da sequência nucleotídica de GGTA-1 alterada de um porco transgênico triplo é mostrada nas duas linhas inferiores, cada uma das quais fornece a sequência alterada de um alelo de GGTA-1. As sequências nucleotídicas de GGTA-1 interrompido de um porco transgênico triplo exemplificativo são deleções de cinco pares de bases e sete pares de bases. Os traços indicam a porção da sequência nucleotídica em que os nucleotídeos eliminados ocorreriam na sequência de tipo selvagem.

[0029] O Painel B apresenta porções de genes CMAH de tipo selvagem e interrompidos para um porco transgênico triplo exemplificativo. Uma porção do gene CMAH do tipo selvagem (wt) é mostrada na linha superior. As sequências nucleotídicas de ambos os alelos das regiões comparáveis a partir do mesmo porco transgênico triplo são mostradas abaixo da sequência de tipo selvagem. As sequências de CMAH interrompido do porco transgênico triplo incluem uma deleção de doze pares de bases e uma deleção de três pares de bases/inserção de quatro pares de bases. Os traços indicam a região da sequência nucleotídica em que as deleções ocorreram.

[0030] O Painel C apresenta porções de genes β4GalNT2 de tipo selvagem e interrompidos para um porco transgênico triplo exemplificativo. Uma porção do gene β4GalNT2 do tipo selvagem (wt) é mostrada na linha superior. As sequências nucleotídicas das regiões comparáveis a partir do mesmo porco transgênico triplo exemplificativo são mostradas abaixo da sequência de tipo selvagem. Como mostrado, as sequências de β4GalNT2 interrompido do porco transgênico triplo incluem uma inserção de um único par de bases, uma deleção de doze pares de bases e uma deleção de cinco pares de bases. Ao contrário das sequências de GGTA1 e CMAH, foram detectados três alelos diferentes. É possível que a sequência de β4GalNT2 ocorra em mais do que um locus distinto no genoma porcino. Os traços indicam a região da sequência nucleotídica em que as deleções de β4GalNT2 ocorreram.

[0031] A Figura 2 ilustra um gráfico de dados de citometria de fluxo obtidos a partir de células de monócitos de sangue periférico (PBMC) do porco transgênico duplo CMAH/αGal (CMAH, painel superior) ou do porco transgênico triplo CMAH/αGal/β4GalNT2 (B4, painel inferior). As células eram não coradas (células apenas, curvas brancas) ou coradas com aglutinina Dolichus biflorus conjugada com FITC (DBA-FITC, curva preta sólida). DBA se liga a α-N-acetilgalactosamina contendo glicanos ou glicanos tipo Sda produzidos por β4GalNT2. No painel superior, o perfil de PBMC de porcos knockout duplos (CMAH/αGal) com a sequência de β4GalNT2 de tipo selvagem (CMAH) após incubação com DBA (curva preta) é distintamente deslocado do perfil de células não coradas do porco transgênico duplo CMAH/αGal (curva branca). No painel inferior o perfil de PMBC de porcos transgênicos triplos com sequências de β4GalNT2 (B4) interrompido após incubação com DBA cobre predominantemente o perfil das células não coradas do porco transgênico triplo CMAH/αGal/β4GalNT2 (regiões de curvas brancas e pretas que se sobrepõem são representadas como cinza). A alteração limitada no perfil de células tratadas com DBA-FITC indica uma falta de ligação de DBA às PBMC do porco transgênico triplo e a ocorrência reduzida de antígenos tipo Sda em células do porco transgênico triplo.

[0032] A Figura 3 apresenta resultados de análise de epítopo de PBMCs de uma variedade de porcos. O painel A apresenta resultados de citometria de fluxo de experimentos realizados com PBMCs de porcos de tipo selvagem (WT) e transgênico triplo (GGTA1-/-, CMAH-/-, B4GalNT2-/-). As contagens de células são mostradas no eixo geométrico y; a fluorescência é mostrada no eixo geométrico x.

[0033] Os gráficos da extrema esquerda representam dados de um controle negativo (branco) e células incubadas com lectina IB4 (escuro). O IB4 interage com os carboidratos ligados à alfa galactose criados pelo produto gênico de GGTA1. As curvas com sobreposição entre os resultados de controle (negativo) e experimental (positivo) são mostradas com cinza. As células de tipo selvagem incubadas com IB4 mostram um pico separado distinto de células de tipo selvagem não coradas. As células do porco transgênico triplo incubadas com IB4 não apresentam nenhum segundo pico significativo, indicativo de carboidratos ligados a αGal significativamente reduzidos.

[0034] Os gráficos centrais representam dados de um controle negativo (branco) e células incubadas com anticorpo HD (escuro). O controle negativo era um anticorpo irrelevante de controle do isótipo. O anticorpo HD interage com o carboidrato de Neu5Gc produzido pelo produto do gene CMAH. As curvas com sobreposição entre os resultados de controle (negativo) e experimental (positivo) são mostradas com cinza. As células de tipo selvagem incubadas com anticorpo HD mostram um pico separado distinto das células de tipo selvagem tratadas com um anticorpo não relacionado. As células do porco transgênico triplo incubadas com anticorpo HD não apresentam nenhum segundo pico significativo, indicativo de níveis de epítopo Neu5Gc significativamente reduzidos.

[0035] Os gráficos da extrema esquerda representam dados de um controle negativo (branco) e células incubadas com lectina DBA (escuro). A lectina DBA interage com a estrutura de carboidrato produzida pelo produto gênico de β4GalNT2. As curvas com sobreposição entre os resultados de controle (negativo) e experimental (positivo) são mostradas com cinza. As células de tipo selvagem incubadas com DBA mostram um pico separado distinto de células de tipo selvagem não coradas. As células do porco transgênico triplo incubadas com DBA não apresentam nenhum segundo pico significativo, indicativo de carboidratos significativamente reduzidos produzidos pelo produto gênico de β4GalNT2.

[0036] O painel B apresenta um gráfico de dispersão de resultados obtidos a partir de experimentos de citometria de fluxo para avaliar a ligação relativa de IgG humana (eixo geométrico X) e IgM (eixo geométrico Y) no soro de 44 seres humanos únicos a PBMCs de vários tipos de porcos. Os resultados com PBMC de porcos de tipo selvagem (WT) são mostrados com quadrados abertos, os resultados de porcos transgênicos únicos de αGal (GGTA1-/-) interrompido são mostrados com triângulos, os resultados de porcos transgênicos duplos de CMAH/ αGal (GGTA1-/- e CMAH-/-) interrompidos são mostrados com círculos vazios, e resultados de porcos transgênicos triplos de CMAH/αGal/B4GalNT2 (GGTA1-/- e CMAH-/- e β4GalNT2-/-) interrompidos são mostrados com círculos sólidos. Os resultados de porcos transgênicos triplos de CMAH/αGal/B4GalNT2 (GGTA1-/- e CMAH-/- e β4GalNT2-/-) interrompidos são aglomerados em níveis baixos de ligação de IgM e IgG; alguns pontos de dados indicam uma ligação de IgG moderada a células transgênicas triplas.

[0037] A Figura 4 apresenta um gráfico de dispersão de resultados obtidos a partir de experimentos de citometria de fluxo para avaliar a ligação relativa de IgG de macaco Rhesus (eixo geométrico X) e IgM (eixo geométrico Y) no soro de macacos Rhesus, babuínos e humanos a PBMCs de vários tipos de porcos. Os resultados com PBMC de porcos transgênicos únicos de αGal (GGTA1-/-) interrompido são mostrados no eixo geométrico x, os resultados de porcos transgênicos duplos de CMAH/ GGTA1-/- (GGTA1-/- e CMAH-/-) interrompidos são mostrados com círculos vazios, e resultados de porcos transgênicos triplos de CMAH/ GGTA1-/- /B4GalNT2 (GGTA1-/- e CMAH-/- e β4GalNT2-/-) interrompidos são mostrados com círculos sólidos. CMAH/ GGTA1-/- e CMAH/ GGTA1-/-/β4GalNT2 estão no eixo geométrico y. A ligação abaixo da linha indica que a ligação às células de porco no eixo geométrico x é mais antigênica do que as células de porco no eixo geométrico y. Os soros de humano (topo), de babuíno (médio) e de macaco rhesus (fundo) foram testados com as células de porco. Os resultados de IgM são mostrados à esquerda; os resultados de IgG são mostrados à direita.

[0038] A Figura 5 fornece séries de resultados de citometria de fluxo indicando o nível de ligação do anticorpo IgG a glóbulos vermelhos (RBC). Múltiplos tipos de glóbulos vermelhos foram avaliados contra três soros humanos. Os resultados dos soros A humanos encontram-se na coluna da esquerda, no soro humano O 1 na coluna média e no soro humano O 2 na coluna direita. Os resultados de glóbulos vermelhos de B4Gal/CMAH/Gal knockout triplo (B4G triplo KO) estão na linha superior. Os resultados de glóbulos vermelhos de O 1 humano estão na segunda fila. Os resultados de glóbulos vermelhos de O 2 humano estão na terceira fila. Os resultados de glóbulos vermelhos de A humano estão na quarta fila. Glóbulos vermelhos de tipo selvagem porcinos estão na fila inferior. Estão presentes picos significativos múltiplos quando glóbulos vermelhos porcinos de tipo selvagem são avaliados com soros humano A e humano O 1; estão presentes picos menores múltiplos quando os glóbulos vermelhos porcinos de tipo selvagem são avaliados com soros humanos O 2. No traço de glóbulos vermelhos humanos A e dois soros humanos O, existem picos significativos. No entanto, os glóbulos vermelhos A humanos e soros humanos A mostram apenas um pico sobreposto. Como esperado, ambos glóbulos vermelhos humanos O mostram apenas um único pico sobreposto quando testados contra todos os três soros. Os glóbulos vermelhos knockout triplos B4Gal/CMAH/Gal mostram apenas um único pico sobreposto quando testados contra os três soros, semelhantes aos glóbulos vermelhos humanos O.

[0039] A Figura 6 fornece um resumo de dados obtidos a partir de comparações de citometria de fluxo de ligação de anticorpo humano a vários glóbulos vermelhos de suínos e humanos. Soros de 74 humanos foram incubados com glóbulos vermelhos humanos e de porco. São mostrados dados de glóbulos vermelhos de suínos de tipo selvagem (W), animais sem GGTA1 e CMAH (glóbulos vermelhos de CMAH) ou GGTA1/CMAH/β4GalNT2 (glóbulos vermelhos de B4G) e glóbulos vermelhos alogênicos humanos (h). O painel A mostra um resumo de ligação de IgG a vários glóbulos vermelhos. Os dados representam uma intensidade de fluorescência mediana normalizada (MFI) e desvio padrão para IgG. Soros A, B, O e AB humanos foram utilizados. As comparações intergrupos de ligação de anticorpo foram realizadas usando medições repetidas de ANOVA de uma via e teste de comparação múltipla de Tukey. A ligação do anticorpo humano aos vários glóbulos vermelhos foi máxima em células de tipo selvagem e diminuiu à medida que cada gene produtor de glicano foi inativado. Os glóbulos vermelhos knockout triplos (B4G) se aproximaram mais dos níveis de ligação de anticorpo vistos nos glóbulos vermelhos alogênicos (h). O painel B mostra um resumo de ligação de IgM a vários glóbulos vermelhos. Os dados representam uma intensidade de fluorescência mediana normalizada (MFI) e desvio padrão para IgM. A tendência de tipo selvagem > knockout duplo > knockout triplo ~ humano foi observada tanto para IgG quanto IgM. No Painel C, a citometria de fluxo foi usada para revelar os efeitos da inativação dos genes GGTA1, CMAH e β4GalNT2 na expressão de glicanos reativos a α-Gal, Neu5Gc e DBA. Os resultados de glóbulos vermelhos de tipo selvagem (W) porcinos, glóbulos vermelhos de knockout duplo (D) de CMAH/αGal, glóbulos vermelhos de transgênicos triplos (T) de CMAH/αGal/βGalNT2 e glóbulos vermelhos de grupo sanguíneo humano O são mostrados na figura. Os resultados da citometria de fluxo indicam perda de estruturas antigênicas com cada interrupção de gene. No Painel D, os dados foram plotados para exibir o MFI individual de cada amostra de soro humano ao examinar a ligação de anticorpo aos glóbulos vermelhos humanos no eixo geométrico x e o MFI individual de cada amostra de soro humano ao examinar a ligação de anticorpo aos glóbulos vermelhos de suínos knockout triplos (B4G) no eixo geométrico y. Os pontos de dados que caem abaixo da linha diagonal nos gráficos representam menos ligação às células knockout triplas de porco do que às células O do grupo sanguíneo humano. O grupo sanguíneo humano O é considerado um doador universal; os glóbulos vermelhos do grupo humano transfundido O sofrem destruição humoral limitada.

[0040] A Figura 7 fornece resultados da análise de imunoglobulina usando espectrometria de massa quantitativa para medir a abundância de isótipos de anticorpos individuais. O Painel 7A é um esquema que descreve a abordagem bioquímica usada para avaliar a ligação de IgG e IgM aos glóbulos vermelhos. Foram avaliados glóbulos vermelhos de suínos de tipo selvagem, suínos deficientes GGTA1/CMAH (D), suínos GGTA/CMAH/β4GalNT2 (T) e glóbulos vermelhos de humanos autólogos (H). Os detalhes do processo são descritos em qualquer outra parte aqui. Um gel representativo mostrando material eluído a partir de glóbulos vermelhos é mostrado no Painel B. Marcadores de peso molecular (Mw), soro de partida bruto (S) e IgG humana purificada foram carregados para comparação. Outros controles incluíram glóbulos vermelhos não tratados (pista 1 todas as amostras) e glóbulos vermelhos que foram lavados com ácido, mas não incubados com soro (pista 2 todas as amostras). O material foi removido por evaporação instantânea de glóbulos vermelhos tratados com soro por incubação com baixo pH durante 2 ou 3 minutos (pistas 3 e 4 respectivamente, todas as amostras). A única ponta de seta marca uma proteína migrando com um tamanho semelhante à albumina. Embora os glóbulos vermelhos humanos autólogos tenham liberado menos desta proteína do que as células suínas, esse resultado não foi reproduzido em outros experimentos. As pontas de setas duplas indicam uma proteína migrando com um tamanho semelhante ao IgG (pistas 3 e 4). A intensidade da faixa de cadeia pesada de IgG variou entre os diferentes glóbulos vermelhos. A incubação de células a pH baixo durante dois ou três minutos liberou níveis de proteína semelhantes. Para quantificar a quantidade de anticorpo liberado das células, foram coletadas fatias de gel que abrangem o tamanho aproximado da cadeia pesada de imunoglobulina nas amostras de eluição de dois minutos, incubadas com tripsina e avaliadas por espectrometria de massa (ver abaixo aqui). Três pontas de seta observam uma proteína que migra com um tamanho idêntico à hemoglobina. A presença de hemoglobina no sobrenadante de amostras livres de soro indicou que a lise de glóbulos vermelhos ocorreu durante as manipulações. As variações entre as pistas 1 e 2 para todos os tipos de glóbulos vermelhos sugerem a lise acelerada de lavagem com ácido e liberam quantidades crescentes de hemoglobina das células. Polipeptídeos desconhecidos, marcados por um *, que migraram como um duplo ligeiramente acima das cadeias leves de imunoglobulina foram liberados a partir de glóbulos vermelhos mesmo na ausência de soro.

[0041] O painel C mostra os níveis relativos de IgM e IgG que eluíram de cada tipo de glóbulo vermelho após incubação com alíquotas separadas do mesmo soro como determinado por espectroscopia de massa. As AUC das análises de espectrometria de massa foram todas normalizadas para os valores obtidos para a ligação total de IgG ou IgM aos glóbulos vermelhos humanos autólogos para cada soro. O anticorpo total foi calculado para IgG por soma da AUC para cada isótipo. São mostrados os resultados de glóbulos vermelhos de porco de tipo selvagem (W), glóbulos vermelhos de porco knockout triplo (B) e glóbulos vermelhos humanos autólogos (A). Os glóbulos vermelhos humanos autólogos são do mesmo indivíduo do qual o soro testado foi obtido.

[0042] A Figura 8 fornece cromatogramas de espectroscopia de massa representativa de peptídeos derivados de imunoglobulina. A abundância relativa é mostrada no eixo geométrico y. O tempo em minutos (min) é mostrado no eixo geométrico x. Cromatogramas como esse foram usados para calcular a AUC.

[0043] A Figura 9 apresenta o monitoramento e o destino da análise de citometria de fluxo. Foram incubados três soros humanos com glóbulos vermelhos de porcos de tipo selvagem (W), glóbulos vermelhos humanos autólogos (A) e glóbulos vermelhos de porcos deficientes (T) de GGTA1/CMAH/β4GalNT2. Após incubação com os anticorpos secundários fluorescentes para relatar imunoglobulina humana ligada, as células foram analisadas por citometria de fluxo. Usou-se dispersão direta (FSC, eixo geométrico x) e dispersão lateral (SSC, eixo geométrico y) para identificar os glóbulos vermelhos. Ovais pretos representam portas usadas para selecionar glóbulos vermelhos para análise. As porcentagens mostradas ao lado de cada porta representam a fração de eventos totais que residiram dentro da porta. Os soros humanos interromperam os glóbulos vermelhos de suínos de tipo selvagem como visto por um aumento nos detritos e a redução nos glóbulos vermelhos que caem nas regiões fechadas. A antigenicidade elevada dos glóbulos vermelhos de tipo selvagem e a consequente destruição celular podem ter contribuído para a qualidade do histograma das amostras de tipo selvagem (W) em alguns experimentos.

[0044] A Figura 10 representa os valores de área sob a curva (AUC) obtidos para cada isótipo de IgG como determinado por espectrometria de massa. A AUC é mostrada no eixo geométrico y; os isótipos IgG e o tipo de glóbulo vermelho são mostrados no eixo geométrico x. São mostrados os resultados de glóbulos vermelhos de sangue de porco knockout triplo (TKO), glóbulos vermelhos autólogos humanos (Human Auto) e glóbulos vermelhos de porco de tipo selvagem (WT).

[0045] A Figura 11 representa os resultados de citometria de fluxo obtidos a partir de monócitos de sangue periférico (PBMC) obtidos a partir de porcos knockout triplo de tipo selvagem (WT) ou Gal/CMAH/β4GalNT2 (B4G). São mostrados PBMC a partir de dois isolados de porco (58-1 e 59-2). IB4 é ligado por αGal; na presença de expressão de αGal reduzida, a ligação de IB4 é reduzida. Neu5Gc é um epítopo produzido pelo produto do gene CMAH. DBA é uma lectina ligada pelo produto β4GalNT2. O histograma cinza mostra resultados de controle negativo. Dois picos estão claramente presentes para as células de tipo selvagem com cada um dos IB4, DBA e Neu5Gc. Para os dois isolados de porco knockout triplo, o segundo pico é eliminado ou deslocado para se sobrepor com o controle negativo, indicando uma ligação reduzida.

[0046] A Figura 12 fornece resultados de citometria de fluxo obtidos a partir de células endoteliais aórticas (AEC) ou células endoteliais renais imortalizadas (iREC) após coloração com lectina. Os tipos de células indicados foram incubados com IB4, Neu5Gc, DBA, PNA, Jacalin ou VVL. A coluna da esquerda mostra os resultados obtidos a partir de AEC de tipo selvagem (WT/AEC), a segunda coluna mostra os resultados obtidos a partir de porcos com αGal interrompido (GAL/AEC), a coluna do meio mostra os resultados obtidos a partir de porcos CMAH/αGal (CMAH/AEC), a quarta coluna mostra os resultados obtidos a partir de porcos knockout triplos CMAH/αGal/β4GalNT2 (B4G/AEC), a quinta coluna mostra os resultados obtidos a partir de células endoteliais renais imortalizadas de tipo selvagem, a sexta coluna mostra os resultados obtidos de GGTA1/CMAH/β4GalNT2 e células endoteliais renais imortalizadas interrompidas por antígeno SLA. Os histogramas cinzentos não são controles negativos da lectina. A linha preta sólida representa a ligação da lectina. Observa-se a ausência de um segundo pico de IB4 em células interrompidas com Gal, a ausência de um segundo pico de Neu5Gc em células interrompidas com CMAH e a ausência de um segundo pico de DBA em células interrompidas com β4GalNT2. Os segundos picos de PNA e Jacalin ocorrem nas células dos porcos knockout simples, duplos e triplos. No AEC knockout triplo e no β4GalNT2/SLA knockout triplo, o antígeno Sla interrompeu iRMEC, o segundo pico VVL desloca substancialmente. Embora não esteja ligado pelo mecanismo, o reconhecimento reduzido da lectina VVL de um antígeno nas células knockout triplas pode contribuir para os resultados surpreendentes obtidos a partir de células e porcos knockout triplos CMAH/αGal/β4GalNT2.

[0047] A Figura 13 apresenta porções de genes β4GalNT2, GGTA1 e CMAH de tipo selvagem e interrompidos em porcos transgênicos triplos exemplificativos. A porção sublinhada de cada sequência de tipo selvagem indica a região alvo de Crispr. A figura mostra interrupções de sequência de múltiplos porcos transgênicos triplos (identificadores de isolados de porco 542, 58-1 e 59-2). São mostradas três variações de β4GalNT2, uma deleção de 14 nucleotídeos, uma deleção de 12 nucleotídeos/substituição de 1 um nucleotídeo e uma deleção de 271 nucleotídeos/inserção de 1 nucleotídeo. A terceira mutação de β4GalNT2 representada é uma deleção de 271 nucleotídeos/inserção de 1 nucleotídeo em que as barras duplas (//) demarcam a deleção. São mostradas duas variações de αGal (GGTA1), uma deleção de 11 nucleotídeos (nt) e uma deleção de 18 nucleotídeos (nt). São mostradas duas variações de CMAH, uma deleção de 66 nucleotídeos/inserção de 12 nucleotídeos e uma deleção de 5 nucleotídeos/substituição de 1 nucleotídeo.

[0048] A Figura 14 apresenta dados obtidos a partir de células transgênicas triplas de porcos transgênicos triplos (porcos deficientes em αGal/B4GalNT2/CMAH) avaliados com soros humanos múltiplos em um teste de cruzamento clínico humano. O gráfico superior mostra os resultados de 31 soros humanos com um PRA = 0; o gráfico inferior mostra os resultados de 19 soros humanos com um PRA>80. Os resultados de IgM e IgG na ausência de DTT são indicados com uma barra sólida; os resultados de IgG após tratamento com DTT são indicados por uma barra vazia. A pontuação de citotoxicidade é mostrada no eixo geométrico y. As pontuações de citotoxicidade de 1 são candidatas muito boas para o alotransplante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0049] O presente pedido fornece porcos transgênicos e órgãos, tecidos e células porcinos para transplante para um humano que não expressam os produtos codificados do genoma de porco codificado indicados e métodos para fabricar e usar os mesmos. Em uma modalidade, o pedido fornece um porco transgênico triplo compreendendo genes α(1,3)- galactosiltransferase, β4GalNT2 e hidroxilase de ácido citidina monofosfato- N-acetilneuramínico interrompidos, em que a expressão de α(1,3)- galactosiltransferase funcional, β4GalNT2 e hidroxilase de ácido citidina monofosfato-N-acetilneuramínico no porco knockout diminui quando comparado a um porco de tipo selvagem.

I. Em geral

[0050] No relatório descritivo e nas reivindicações, os termos “incluindo” e “compreendendo” são termos abertos e devem ser interpretados como significando “incluindo, mas não se limitando a ...” Esses termos englobam os termos mais restritivos “consistindo essencialmente em” e “consiste em”.

[0051] Como usado aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referências no plural, a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Da mesma forma, os termos “um” (ou “uma”), “um(a) ou mais” e “pelo menos um(a)” podem ser usados intercambiavelmente aqui. Deve-se observar também que os termos “compreendendo”, “incluindo” e “tendo” podem ser usados de forma intercambiável.

[0052] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm os mesmos significados que os entendidos vulgarmente na técnica à qual pertence esta invenção. Todas as publicações e patentes especificamente aqui mencionadas são incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins, incluindo descrever e divulgar os produtos químicos, instrumentos, análises estatísticas e metodologias que são relatados nas publicações que podem ser usadas em conexão com a invenção. Todas as referências citadas neste relatório descritivo devem ser tomadas como indicativas do nível de especialização na técnica. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem o direito de antecipar tal descrição em virtude da invenção anterior.

II. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS

[0053] São fornecidos animais transgênicos adequados para uso em xenotransplantes e métodos de produção de mamíferos adequados para uso em xenotransplante. Especificamente, a presente invenção descreve a produção de porcos transgênicos triplos com diminuição da expressão de alfa 1,3 galactosiltransferase (αGal), β 1,4 N-acetilgalactosaminiltransferase (β4GalNT2) e hidroxilase de ácido citidina monofosfato-N-acetilneuramínico (CMAH).

[0054] Em modalidades da presente invenção, porcos e órgãos, tecidos, e células porcinas dos mesmos são fornecidos em que os genes αGal, β4GalNT2 e CMAH são menos ativos, de modo que os produtos αGal, β4GalNT2 e CMAH resultantes não geram mais níveis de tipo selvagem de epítopos de α1,3-galactosil, epítopos tipo Sda ou Neu5Gc em uma superfície celular, glicoproteína ou glicolipídio. Em uma modalidade alternativa os genes αGal, β4GalNT2 e CMAH são inativados de tal modo que não ocorre transcrição do gene. Em várias modalidades foram fabricados porcos knockout triplos de αGal/B4GalNT2/CMAH. Métodos para fabricar porcos transgênicos e os desafios para tal são discutidos em Galli et al 2010 Xenotransplantation 17(6) p.397-410. Métodos e culturas celulares da invenção são adicionalmente detalhados abaixo.

[0055] O termo “mamífero transgênico” refere-se a um mamífero transgênico em que um dado gene foi alterado, removido ou interrompido. Deve-se enfatizar que o termo pretende incluir todas as gerações da progênie. Assim, o animal fundador e todos os seus descendentes F1, F2, F3 e assim por diante são incluídos, independentemente de a progênie ter sido gerada por transferência nuclear de células somáticas (SCNT) do animal fundador ou de um animal progenitor ou por métodos reprodutivos tradicionais. Por “transgênico único” entende-se um mamífero transgênico em que um gene foi alterado, removido ou interrompido. Por “transgênico duplo” entende-se um mamífero transgênico em que dois genes foram alterados, removidos ou interrompidos. Por “transgênico triplo” entende-se um mamífero transgênico em que três genes foram alterados, removidos ou interrompidos. Por “transgênico quádruplo” entende-se um mamífero transgênico em que quatro genes foram alterados, removidos ou interrompidos.

[0056] Em princípio, os animais transgênicos podem ter uma ou ambas as cópias da sequência gênica de interesse interrompida. No caso em que apenas uma cópia ou alelo da sequência de ácido nucleico de interesse é interrompida, o animal knockout é denominado um “animal transgênico heterozigótico”. O termo mutação “nula” engloba ambos os casos em que as duas cópias de uma sequência de nucleotídeos de interesse são interrompidas de forma diferente, mas para as quais as interrupções se sobrepõem de modo que algum material genético foi removido de ambos os alelos e casos em que ambos os alelos da sequência de nucleotídeo de interesse compartilham a mesma interrupção. Em várias modalidades, podem ocorrer interrupções dos três genes de interesse em pelo menos uma célula do animal transgênico, pelo menos uma pluralidade de células do animal, pelo menos metade das células do animal, pelo menos uma maioria de células do animal, pelo menos uma supermaioria das células do animal, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% das células do animal.

[0057] O termo “quimera”, “mosaico” ou “mamífero quimérico” refere-se a um mamífero transgênico com um knockout em algumas das suas células contendo o genoma. Uma quimera tem pelo menos uma célula com uma sequência gênica inalterada, pelo menos várias células com uma sequência gênica inalterada ou uma pluralidade de células com uma sequência inalterada.

[0058] O termo “heterozigoto” ou “mamífero heterozigótico” refere- se a um mamífero transgênico com uma interrupção em um de um par de cromossomos em todas as suas células contendo o genoma.

[0059] O termo “homozigoto” ou “mamífero homozigótico” refere-se a um mamífero transgênico com uma interrupção em ambos os membros de um par de cromossomos em todas as suas células contendo o genoma. Uma “alteração homozigótica” refere-se a uma alteração em ambos os membros de um par de cromossomos.

[0060] Um “mamífero não humano” do pedido inclui mamíferos tais como roedores, ovelhas, cães, ovinos tais como ovelhas, bovinos tais como bovinos de corte e vacas leiteiras e suínos tais como porcos e leitões. Embora o pedido forneça um animal não humano típico (porcos), outros animais podem, de modo similar, ser geneticamente modificados.

[0061] Uma “mutação” é uma alteração detectável no material genético no animal que é transmitida à progênie do animal. Uma mutação é normalmente uma alteração em um ou mais desoxirribonucleotídeos, tal como, por exemplo, adição, inserção, deleção, inversão ou substituição de nucleotídeos.

[0062] Por “porco” entende-se qualquer porco conhecido na técnica incluindo, mas não se limitando a um porco selvagem, porco doméstico, miniporco, um porco Sus scrofa, um porco Sus scrofa domesticus, bem como porcos criados. Sem limitação, o porco pode ser selecionado do grupo que compreende porcos Landrace, Yorkshire, Hampshire, Duroc, Meishan Chinês, White Chester, Berkshire Goettingen, Landrace/York White Chester, Yucatan, Bama Xiang Zhu, Wuzhishan, Xi Shuang Banna e Pietrain. Os órgãos, tecidos, células ou produtos de transfusão porcinos são órgãos, tecidos, tecidos animais desvitalizados, células ou produtos de transfusão de um porco.

[0063] O gene alfa 1,3 galactosiltransferase (αGal, GGTA, GGT1, GT, αGT, GGTA1, GGTA-1) codifica uma enzima (GT, αGal, α1,3 galactosiltransferase). O transcrito de Ensemble ENSSSCG00000005518 inclui a sequência nucleotídica GGTA1 porcina. A α1,3 galactosiltransferase funcional catalisa a formação de resíduos galactose-α1,3-galactose (αGal,Gal,Gal, gal1,3gal, gal1-3gal) em glicoproteínas. O resíduo de galactose-α1,3-galactose (αGal) é um epítopo ou antígeno antigênico reconhecido pelo sistema imunológico humano. A remoção de αGal do material de órgão transgênico não elimina a resposta imunológica humana ao transplante de material estranho, sugerindo um envolvimento de anticorpos adicionais na resposta imunológica rápida ao xenotransplante. (Mohiudden et al (2014), Am J. Transplantation 14:488-489 e Mohiudden et al 2014 Xenotransplantation 21:35-45). As interrupções do gene αGal que resultam na expressão diminuída de αGal funcional podem incluir, mas não estão limitadas a uma deleção de 3 pares de bases adjacente a uma substituição de G por A, uma deleção de um único par de bases, uma inserção de um único par de bases, uma inserção de dois pares de bases, uma deleção de seis pares de bases, uma deleção de dez pares de bases, uma deleção de sete pares de bases, uma inserção de oito pares de bases para uma deleção de cinco pares de bases, uma inserção de cinco pares de bases, uma deleção de onze pares de bases e uma deleção de dezoito pares de bases (ver Tabela 1). A sequência alvo de Crispr está no éxon 3 do gene, próximo do códon de início.

[0064] O gene hidroxilase de ácido citidina monofosfato-N- acetilneuramínico (gene hidroxilase CMP-Neu5Ac, CMAH) codifica uma enzima (CMAH). O CMAH funcional catalisa a conversão de ácido N- acetilneuramínico de ácido siálico (Neu5Ac) em ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc). O resíduo de Neu5Gc é um epítopo ou antígeno antigênico reconhecido pelo sistema imunológico humano. A base de dados de Ensembl Gene: ENSSSCG00000001099 inclui a sequência de nucleotídeos de CMAH porcino, e a área alvo de Crispr está perto do éxon 6. As interrupções do gene CMAH que resultam na expressão diminuída de CMAH funcional podem incluir, mas não se limitam a uma inserção de quatro pares de bases, uma deleção de um par de bases, uma deleção de dois pares de bases, uma deleção de três pares de bases, uma deleção de vinte pares de bases, uma deleção de cinco pares de bases, uma deleção de oito pares de bases, uma deleção de onze pares de bases, uma deleção de doze pares de bases, uma inserção de um único par de bases, uma inserção de dois pares de bases para uma deleção de um único par de bases, uma deleção de três pares de bases para uma inserção de quatro pares de bases, uma deleção de sessenta e seis pares de bases/inserção de doze pares de bases, e uma deleção de cinco pares de bases/substituição de 1 par de bases (ver Tabela 1).

[0065] O gene β1,4 N-acetilgalactosaminiltransferase (B4GalNT2, β4GalNT2, B1,4GalNT2, β1,4GalNT2) codifica a β1,4 N- acetilgalactosaminiltransferase 2 glicosiltransferase (B4GalNT2). O B4GalNT2 funcional produz glicanos tipo Sda (Dall’Olio et al (2014) Biochemica Biophysica Acta 1840:443-453 e Blanchard et al (1983) JBC 258:7691-7685). Considera-se que a B4GalNT2 é expressada na maioria dos humanos; trabalhos anteriores sugerem que apenas 5% dos humanos não expressam B4GalNT2 funcional. A interrupção de β4GalNT2 em células de porco diminui significativamente a correspondência cruzada em mais de 5% das amostras humanas testadas; esse resultado foi inesperado. Glicanos tipo Sda -podem incluir Sda e glicanos similares relacionados ao tipo de sangue ou determinação do grupo sanguíneo e inibição do câncer gastrointestinal. A entrada da base de dados Ensembl ENSSSCG00000030269 inclui as sequências de aminoácidos e cDNA de β4GalNT2. β4GalNT2 porcino genômico abrange vários éxons através de aproximadamente 40000 pares de bases e pode ocorrer em múltiplos loci. A região alvo CrispR utilizada nesse experimento é encontrada no éxon 2 e é CTGTATCGAGGAACACGCTT. As interrupções do gene β4GalNT2 que resultam na expressão diminuída de β4GalNT2 funcional podem incluir, mas não se limitam a uma inserção de um par de bases, uma deleção de doze pares de bases, uma deleção de cinco pares de bases, uma deleção de quatorze pares de bases, uma deleção de doze pares de bases/substituição de um par de bases, uma deleção de 271 pares de bases/inserção de um par de bases. Tabela 1. Exemplos de interrupções de genes de interesse em porcos viáveis com produto de gene funcional diminuído

[0066] A frase “gene interrompido” pretende abranger a inserção, interrupção ou deleção de uma sequência nucleotídica de interesse em que o gene interrompido codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos alterada que difere da sequência de aminoácidos da sequência endógena, codifica um polipeptídeo tendo menos resíduos de aminoácidos do que a sequência de aminoácidos endógena ou não codifica um polipeptídeo embora a sequência nucleotídica de tipo selvagem de interesse codifique um polipeptídeo.

[0067] O presente relatório descritivo fornece um animal transgênico com expressão reduzida de genes αGal, β4GalNT2 e CMAH funcionais. O animal pode ser qualquer mamífero adequado para xenotransplante. Em uma modalidade específica, o animal é um porco. “CMAH/αGAL knockout duplos”, “CMAH/αGAL DKO”, “CMAH/αGal”, “CMAH/αGal DKO”, “CMAH-/-/GAL-/-”, “αGal/CMAH DKOs”, “αGAL/CMAH knockout duplos”, “GGTA1/CMAH DKO”, “GT1/CMAH DKO”, “GGTA1-/-/CMAH-/-”, “GGT1-/-/CMAH-/-”, “CMAH/GGTA DKO”, “GT/CMAH-KO”, “GGTA1/CMAH KO”, “DKO (αGal/CMAH)”, “DKO (αGAL & CMAH)”, “CMAH-/αGal-”, “αGal-/CMAH-”, “CMAH-/αGAL-” e variantes dos mesmos referem-se a animais, células ou tecidos transgênicos sem expressão de alfa 1,3 galactosiltransferase e hidroxilase de ácido citidina monofosfato N-acetilneuramínico. Um produto ou porco knockout triplo pode ser criado em um plano de fundo de tipo selvagem ou em um plano de fundo CMAH/αGal knockout duplo. “CMAH/αGAL/B4GalNT2 knockout triplos”, “CMAH/αGAL/β4GalNT2 knockout triplos’, “CMAH/αGAL/B4GalNT2 TKO”, “CMAH/αGal/β4GalNT2”, “CMAH/αGal/B4GalNT2 TKO”, “CMAH-/-/GAL-/- /B4GalNT2-/-”, “αGal/CMAH/β4GalNT2 TKOs”, “αGAL/CMAH/β4Gal knockout triplos”, “GGTA1/CMAH/B4GalNT2 TKO”, “GT1/CMAH/β4GalNT2 TKO”, “GGTA1-/-/CMAH-/- /β4GalNT2-/-”, “GGT1-/-/CMAH-/- / β4GalNT2-/- “, “CMAH/GGTA/β4GalNT2 TKO”, “GT/CMAH/β4GalNT2-KO”, “GGTA1/CMAH/β4GalNT2 KO”, “TKO (αGal/CMAH/β4GalNT2)”, “TKO (αGAL , CMAH, β4GalNT2)”, “CMAH- /αGal-/β4GalNT2-”, “αGal-/CMAH-/β4GalNT2-”, “CMAH-/αGAL- β4GalNT2-” e variantes dos mesmos referem-se a animais, células ou tecidos transgênicos sem expressão de alfa 1,3 galactosiltransferase, hidroxilase de ácido citidina monofosfato N-acetilneuramínico e β4GalNT2.

[0068] Material de transplante transgênico O material de transplante abrange órgãos, tecido, produtos de transfusão e/ou células de um animal para uso como xenoenxertos. O material de transplante para uso como xenoenxertos pode ser isolado a partir de animais transgênicos com expressão diminuída de αGal, β4GalNT2 e CMAH. O material de transplante transgênico de porcos transgênicos ou knockout pode ser isolado a partir de um animal transgênico pré-natal, neonatal, imaturo ou totalmente maduro. O material de transplante pode ser usado como substituição temporária ou permanente de órgãos para um indivíduo humano que necessite de um transplante de órgão. Qualquer órgão porcino pode ser usado incluindo, mas não se limitando a cérebro, coração, pulmões, olhos, estômago, pâncreas, rins, fígado, intestinos, útero, bexiga, pele, cabelo, unhas, orelhas, glândulas, nariz, boca, lábios, baço, gengivas, dentes, língua, glândulas salivares, amígdalas, faringe, esôfago, intestino grosso, intestino delgado, reto, ânus, tireoide, timo, ossos, cartilagem, tendões, ligamentos, cápsula suprarrenal, músculos esqueléticos, músculos lisos, vasos sanguíneos, sangue, medula espinhal, traqueia, ureteres, uretra, hipotálamo, pituitária, piloro, glândulas suprarrenais, ovários, ovidutos, útero, vagina, glândulas mamárias, testículos, vesículas seminais, pênis, linfa, gânglios linfáticos e vasos linfáticos.

[0069] Em uma outra modalidade, o pedido fornece tecidos não humanos que são úteis para xenotransplante. Em várias modalidades, o tecido não humano é tecido porcino de um porco transgênico triplo de αGal/CMAH/β4GalNT2. Qualquer tecido porcino pode ser usado incluindo, mas não se limitando a epitélio, tecido conjuntivo, sangue, osso, cartilagem, músculo, nervo, adenoide, adiposo, areolar, marrom adiposo, músculo esponjoso, cartilaginoso, cavernoso, condroide, cromafina, dartoico, elástico, epitelial, gorduroso, fibro-hialino, fibroso, Gamgee, gelatinoso, granulado, linfoide associado ao intestino, musculoesquelético, vascular de Haller, indiferente, intersticial, de cobertura, ilítico, linfático, linfoide, mesenquimal, mesonérgico, multilocular adiposo, tecido timo, mucoso conectivo, mieloide, nasal macio, nefrogênico, nodal, osteoide, ósseo, osteogênico, medula óssea, retiforme, periapical, reticular, músculo liso, tecido hematopoiético e subcutâneo duro, tecidos animais desvitalizados incluindo válvulas cardíacas, pele e tendões e pele vital porcina.

[0070] Outra modalidade fornece células e linhagens celulares de animais transgênicos triplos porcinos com expressão reduzida ou diminuída de αGal, B4GalNT2 e CMAH. Em uma modalidade essas células ou linhagens celulares podem ser usadas para xenotransplante. Células de qualquer tecido ou órgão porcino podem ser usadas incluindo, mas não se limitando a: células epiteliais, células fibroblásticas, células neurais, queratinócitos, células hematopoiéticas, melanócitos, condrócitos, linfócitos (B e T), macrófagos, monócitos, células mononucleares, células musculares cardíacas, outras células musculares, células granulosas, células do cumulus, células epidérmicas, células endoteliais, células Islet de Langerhans, células secretoras de insulina pancreática, células ósseas, células precursoras de osso, células estaminais neuronais, células estaminais primordiais, hepatócitos, células endoteliais aórticas, células endoteliais microvasculares, fibroblastos, células estreladas do fígado, células do músculo liso aórtico, miócitos cardíacos, neurônios, células de Kupferr, células de músculo liso, células de Schwann, eritrócitos, plaquetas, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos, adipócitos, condrócitos, células de ilhotas pancreáticas, células de tireoide, células de timo, células da paratiroide, células parótidas, células gliais, astrócitos, glóbulos vermelhos, glóbulos brancos, macrófagos, células somáticas, células pituitárias, células adrenais, células ciliadas, células de bexiga, células de rim, células de retina, células de haste, células de cone, células de coração, células de marcapasso, células de baço, células apresentadoras de antígeno, células de memória, células T, células B, células plasmáticas, células musculares, células ovarianas, células uterinas, células de próstata, células epiteliais vaginais, células de esperma, células testiculares, células germinativas, células de ovo, células de leydig, células peritubulares, células de sertoli, células de luteína, células cervicais, células endometriais, células mamárias, células foliculares, células mucosas, células ciliadas, células epiteliais não queratinizadas, células epiteliais queratinizadas, células pulmonares, células caliciformes, células epiteliais colunares, células dopaminérgicas, células epiteliais escamosas, osteócitos, osteoblastos, osteoclastos, medula óssea, células-tronco embrionárias, fibroblastos e fibroblastos fetais.

[0071] Os derivados não viáveis incluem tecidos desprovidos de células viáveis por tratamento enzimático ou químico, estes derivados de tecidos podem ser adicionalmente processados através de reticulação ou outros tratamentos químicos antes do uso em transplante. Em uma modalidade preferida, os derivados incluem matriz extracelular derivada de uma variedade de tecidos, incluindo tecidos de submucosa de pele, osso, urinário, bexiga ou órgão. Além disso, são fornecidos tendões, articulações e ossos desprovidos de tecido viável incluindo, mas não limitados a válvulas cardíacas e outros tecidos não viáveis como dispositivos médicos. Em uma modalidade, são fornecidos o soro ou meio adequado para cultura celular e isolado a partir de um porco transgênico da invenção. São também fornecidos componentes de órgãos, tecidos ou células transgênicos porcinos. Os componentes podem também ser modificados por quaisquer meios conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a reticulação e reticulação de aldeído. Os componentes podem variar dependendo do órgão ou tecido maior do qual o componente é obtido. Os componentes da pele podem incluir, mas não são limitados a pele descascada, colágeno, células epiteliais, fibroblastos e derme. Os componentes ósseos podem incluir, mas não são limitados a colágeno e matriz extracelular. Os componentes cardíacos podem incluir, mas não são limitados a válvulas e tecido de válvula.

[0072] “Xenotransplante” engloba qualquer procedimento que envolva o transplante, implante ou infusão de células, tecidos ou órgãos em um indivíduo receptor de uma espécie diferente. O xenotransplante no qual o receptor é um ser humano é particularmente considerado. Dessa forma, o xenotransplante inclui, mas não se limita a xenotransplante vascularizado, xenotransplante parcialmente vascularizado, xenotransplante não vascularizado, xenocurativos, xenobandagens, xenoestruturas e xenotransfusões.

[0073] Em modalidades, são fornecidos reagentes de cultura celular isolados de um porco transgênico compreendendo genes α(1,3)- galactosiltransferase β4GalNT2 e CMAH interrompidos. Os reagentes de cultura celular são reagentes utilizados para cultura de tecidos, cultura de tecidos in vitro, cultura de tecidos microfluídicos, cultura celulares ou outros meios de crescimento de células isoladas ou linhagens celulares. Os reagentes de cultura celular podem incluir, mas não são limitados a meios de cultura celular, soro de cultura celular, um aditivo de cultura celular, uma célula alimentadora e uma célula isolada capaz de proliferação. Por uma “célula isolada capaz de proliferação” entende-se uma célula isolada ou parcialmente isolada de outros tipos celulares ou outras células em que a célula é capaz de proliferar, dividir ou multiplicar em pelo menos uma célula clonal adicional.

[0074] As células cultivadas em cultura podem sintetizar ou incorporar metabolicamente epítopos antigênicos em um composto de interesse produzido pela célula cultivada. Os epítopos antigênicos podem resultar em uma ligação aumentada por anticorpos humanos e uma eficácia diminuída do composto de interesse. Ver Ghaderi et al 2010 Nature Biotechnology 28(8):863-867, aqui incorporado a título de referência, em sua totalidade. O crescimento da célula produtora em um reagente de cultura celular com um perfil de epítopo alterado tal como um nível reduzido de αGal, B4GalNT2 ou Neu5Gc pode reduzir o nível de antígenos de αGal, antígenos de Neu5Gc e/ou antígenos tipo Sda, no composto de interesse. Os compostos de interesse podem incluir, mas não são limitados a glicoproteínas e glicolipídios. As glicoproteínas de interesse podem incluir, mas não são limitadas a um anticorpo, fator de crescimento, citocina, hormônio ou fator de coagulação. Os glicolipídios de interesse podem incluir, mas não são limitados a agentes terapêuticos, antígenos e biotensoativos.

[0075] A palavra “fornecer” pretende abranger a preparação, a aquisição, a produção, a fabricação, o fornecimento ou o suprimento. Reconhece-se que os métodos de fornecimento de uma célula podem diferir dos métodos de fornecimento de um indivíduo, os métodos de fornecimento de um órgão podem diferir dos métodos de fornecimento de um porco, os métodos de fornecimento de um rim podem diferir dos métodos de fornecimento de um fígado e os métodos de fornecimento de um órgão podem diferir dos métodos de fornecimento de um material adequado para transfusão.

[0076] A rejeição de transplante ocorre quando tecido, órgãos, células ou material transplantado não são aceitos pelo corpo do receptor. Na rejeição do transplante, o sistema imunológico do receptor ataca o material transplantado. Vários tipos de rejeição de transplante existem e podem ocorrer separadamente ou em conjunto. Os processos de rejeição incluem, mas não se limitam a rejeição hiperaguda (HAR), reação de rejeição de xenoenxerto humoral aguda (AHXR), trombocitopenia, rejeição humoral aguda, rejeição vascular hiperaguda, rejeição mediada por anticorpos e doença de enxerto versus hospedeiro. Por “rejeição hiperaguda” entende-se a rejeição do material ou tecido transplantado que ocorre ou que começa dentro das primeiras 24 horas pós-transplante envolvendo um ou mais mecanismos de rejeição. A rejeição abrange, mas não se limita a “rejeição hiperaguda”, “rejeição humoral”, “rejeição humoral aguda”, “rejeição celular” e “rejeição mediada por anticorpo”. A reação de xenoenxerto humoral aguda (AHXR) é caracterizada por um espectro de patologias incluindo, mas não se limitando a rejeição aguda mediada por anticorpos ocorrendo dentro de dias de transplante, o desenvolvimento de microangiopatia trombótica (TMA), angiopatia microvascular, ligação de IgM e IgG não Gal pré-formada, ativação do complemento, trombose microvascular e trombocitopenia de consumo nas primeiras semanas após o transplante. A trombocitopenia é uma quantidade de plaquetas abaixo da faixa normal de 140.000 a 440.000/μl. Os sintomas relacionados à trombocitopenia incluem, mas não são limitados a hemorragia interna, hemorragia intracraniana, hematúria, hematêmese, gengivas hemorrágicas, distensão abdominal, melena, menstruação prolongada, epistaxe, equimoses, petéquias ou púrpura. A captação de plaquetas humanas por fígados de porco contribui para o desenvolvimento de trombocitopenia em receptores de xenoenxerto. A trombocitopenia pode ocorrer após a reperfusão do órgão xenotransplantado ou após o período pós- reperfusão imediato.

[0077] Em uma outra modalidade, a invenção fornece um método para melhorar um sintoma relacionado à rejeição em um paciente compreendendo o transplante de órgãos, tecido ou células porcinos com expressão reduzida de αGal, β4GalNT2 e Neu5Gc nos órgãos, tecidos ou células porcinos em um humano, em que um ou mais sintomas relacionados à rejeição são melhorados em comparação com quando o tecido de um suíno de tipo selvagem é transplantado para um ser humano. Por “melhorar”, “aprimorar”, “aperfeiçoar”, “intensificar” e “ajudar” pretende-se avanço ou progresso no que é desejável. Também se prevê que a melhoria de um sintoma relacionado à rejeição pode abranger uma diminuição, redução ou atenuação de um sintoma indesejável. É adicionalmente reconhecido que um sintoma relacionado à rejeição pode ser melhorado enquanto outro sintoma relacionado à rejeição é alterado. O segundo sintoma relacionado à rejeição alterado pode ser melhorado ou aumentado. Um segundo sintoma relacionado à rejeição alterado pode ser alterado de uma maneira menos desejável. Os sintomas relacionados à rejeição incluem, mas não são limitados a sintomas relacionados à rejeição hiperaguda e sintomas relacionados à reação de xenoenxerto humoral aguda. Os sintomas relacionados à rejeição podem incluir, mas não são limitados a microangiopatia trombótica (TMA), angiopatia microvascular, ligação de IgM e IgG pré-formada não Gal, ativação do complemento, aglutinação, fibrose, trombose microvascular, trombocitopenia de consumo, coagulopatia de consumo, trombocitopenia profunda, coagulopatia refratária, hemorragia intersticial do enxerto, marcação, cianose, edema, trombose, necrose, formação de trombos de fibrina, coagulação intravascular disseminada sistêmica, deposição de IgM em capilares glomerulares, deposição de IgG em capilares glomerulares, níveis elevados de creatinina, níveis elevados de BUN, infiltrado de células T, infiltração de eosinófilos, células plasmáticas infiltrantes, neutrófilos infiltrantes, arterite, ligação de anticorpos ao endotélio, expressão alterada de ICOS, CTLA-4, BTLA, PD-1, LAG-3 ou TIM-3 e inflamação sistêmica.

[0078] “Sintoma relacionado à rejeição hiperaguda” pretende abranger qualquer sintoma conhecido do campo como relacionado ou causado por rejeição hiperaguda. Reconhece-se que os sintomas relacionados à rejeição hiperaguda podem variar dependendo do tipo de órgão, tecido ou célula que foi transplantado. Os sintomas relacionados à rejeição hiperaguda podem incluir, mas não são limitados a, oclusão trombótica, hemorragia da vasculatura do enxerto, influxo de neutrófilos, isquemia, manchas, cianose, edema, insuficiência de órgãos, redução da função de órgãos, necrose, trombose capilar glomerular, hemólise, febre, coagulação, diminuição da produção biliar, astenia, hipotensão, oligúria, coagulopatia, níveis elevados de aminotransferase sérica, níveis elevados de fosfatase alcalina, icterícia, letargia, acidose e hiperbilirrubenemia e trombocitopenia.

[0079] A trombocitopenia é uma quantidade de plaquetas abaixo da faixa normal de 140.000 a 440.000/μl. Os sintomas relacionados à trombocitopenia incluem, mas não são limitados a hemorragia interna, hemorragia intracraniana, hematúria, hematêmese, gengivas hemorrágicas, distensão abdominal, melena, menstruação prolongada, epistaxe, equimoses, petéquias ou púrpura. A captação de plaquetas humanas por fígados de porco contribui para o desenvolvimento de trombocitopenia em receptores de xenoenxerto.

[0080] As plaquetas, também conhecidas como trombócitos, são fragmentos enucleados de megacariócitos envolvidos na coagulação sanguínea, hemostasia e formação de trombos sanguíneos. As plaquetas humanas são rotineiramente isoladas através de uma variedade de métodos incluindo, mas não se limitando a aférese das plaquetas, plaquetoferese e ultracentrifugação.

[0081] A expressão “captação de plaquetas” pretende abranger a incorporação de uma plaqueta em um fígado ou uma célula hepática. Embora não sendo limitado pelo mecanismo, tal captação pode ocorrer através de um processo fagocítico. A captação de plaquetas pode ser monitorada por qualquer ensaio de monitoração de captação de plaquetas conhecido na técnica. Os ensaios de monitoração da captação de plaquetas incluem, mas não estão limitados a métodos imunológicos, Western blots, imunomanchamento, microscopia, microscopia confocal, microscopia eletrônica de transmissão e isolamento de fagossoma. Reconhece-se que o ensaio de monitoração da captação de plaquetas apropriado pode depender do tipo de marcador usado. A captação de plaquetas pode ser medida como uma porcentagem de plaquetas totais absorvidas, porcentagem de plaquetas totais não absorvidas, uma razão de plaquetas absorvidas para não absorvidas, porcentagem de células que absorvem pelo menos uma plaqueta, porcentagem de células que não absorvem uma plaqueta ou número de plaquetas absorvidas por célula. Reconhece-se que a captação de plaquetas por mais de um tipo de célula pode contribuir para a captação plaquetária total do fígado. A captação total de plaquetas por um fígado animal pode incluir a captação de plaquetas por células endoteliais sinusoidais do fígado, a absorção de plaquetas por células de Kupffer, a captação de plaquetas por LSECs e células de Kupffer e a captação plaquetária por tipos de células adicionais. Reconhece-se que a captação de plaquetas por diferentes tipos de células pode contribuir com frações similares ou díspares da captação total de plaquetas por um fígado. Assim, uma alteração, inibição, redução, diminuição ou baixa da captação plaquetária por um fígado compreende uma alteração, inibição, redução, diminuição ou baixa da captação de plaquetas por um ou mais tipos de células hepáticas.

[0082] Embora não sendo limitado pelo mecanismo, a captação de plaquetas pode ocorrer através de fagocitose por células LSEC e de Kupffer. A fagocitose é caracterizada pela formação de um endossoma que pela fusão de lisossomas contendo enzimas degradativas se torna um fagossoma.

[0083] Qualquer método de avaliação, aferição, análise, medição, quantificação ou determinação de um sintoma relacionado à rejeição conhecido na técnica pode ser usado com as composições e métodos reivindicados. Os métodos de análise de um sintoma relacionado à rejeição podem incluir, mas não estão limitados a avaliações laboratoriais incluindo CBC com contagem de plaquetas, estudos de coagulação, testes de função hepática, citometria de fluxo, imunohistoquímica, critérios de diagnóstico padrão, métodos imunológicos, Western blots, imunomanchamento, microscopia confocal, microscopia eletrônica de transmissão, ensaios de ligação a IgG, ensaios de ligação a IgM, análises de expressão, ensaios de creatinina e isolamento de fagossoma.

[0084] A expressão de um produto gênico diminui quando a expressão total do produto gênico é diminuída, é produzido um produto gênico de um tamanho alterado ou quando o produto gênico apresenta uma funcionalidade alterada. Assim, se um gene expressa uma quantidade de tipo selvagem do produto, mas o produto tem uma atividade enzimática alterada, tamanho alterado, padrão de localização celular alterado, ligação alterada do receptor-ligante ou outra atividade alterada, a expressão desse produto gênico é considerada diminuída. A expressão pode ser analisada por quaisquer meios conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a RT-PCR, Western blots, Northern blots, análise de microssérie, imunoprecipitação, ensaios radiológicos, purificação de polipeptídeos, análise espectrofotométrica, coloração com Coomassie de géis de acrilamida, ELISAs, eletroforese em gel 2-D, hibridização in situ, quimioluminescência, coloração com prata, ensaios enzimáticos, coloração ponceau S, RT-PCR multiplex, ensaios imunohistoquímicos, radioimunoensaio, ensaios colorimétricos, ensaios imunoradiométricos, tomografia por emissão de pósitrons, ensaios fluorométricos de células permeabilizadas, ensaios radioimunossorventes, PCR em tempo real, ensaios de hibridização, imunoensaios em sanduíche, citometria de fluxo, SAGE, amplificação diferencial ou análise eletrônica. A expressão pode ser analisada direta ou indiretamente. A análise de expressão indireta pode incluir, mas não está limitada à análise dos níveis de um produto catalisado por uma enzima para avaliar a expressão da enzima. Ver, por exemplo, Ausubel et al, eds (2013) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-Interscience, New York, N.Y. and Coligan et al (2013) Current Protocols in Protein Science, Wiley-Interscience New York, NY. Os ensaios de expressão gênica para ASGR1 porcino estão comercialmente disponíveis (Applied Biosystems™, Carlsbad CA).

[0085] “Em comparação a” pretende englobar a comparação de algo a uma coisa similar, mas diferente, como comparar um ponto de dados obtido a partir de um experimento com um porco transgênico a um ponto de dados obtidos a partir de um experimento similar com um porco de tipo selvagem. A palavra “comparar” pretende abranger a análise de caracteres, qualidades, valores, quantidades ou razões, a fim de descobrir semelhanças ou diferenças entre o que está sendo comparado. A comparação pode revelar uma diferença significativa no que está sendo comparado. Por “diferença significativa” entende-se uma diferença estatisticamente significativa nos resultados obtidos para vários grupos, tais como os resultados para o material de um porco transgênico e material de um porco de tipo selvagem. Geralmente, a significância estatística é avaliada por um teste de significância estatística, tal como, mas não se limitando ao teste t de Student, Qui-quadrado, t-teste de uma cauda, teste t de duas caudas, ANOVA, teste post hoc de Dunett, Z-teste. Uma diferença significativa entre dois resultados pode ser resultados com p <0,1, p <0,05, p <0,04, p <0,03, p <0,02, p <0,01 ou superior.

[0086] A palavra “isolado” pretende abranger uma entidade que está fisicamente separada de outra entidade ou grupo. Uma célula isolada é fisicamente separada de outro grupo de células. Exemplos de um grupo de células incluem, mas não estão limitados a uma massa celular em desenvolvimento, uma cultura celular, uma linhagem celular, um tecido e um animal. A palavra “isolar” pretende abranger separar fisicamente uma entidade de outra entidade ou grupo. Os exemplos incluem separar fisicamente uma célula de outras células, separar fisicamente um componente celular do restante da célula e separar fisicamente tecido ou órgão de um animal. Uma célula isolada ou componente celular é separada por 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, até 100% de outras células ou componentes celulares de ocorrência natural. Métodos para isolar uma ou mais células de outro grupo de células são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Freshney (ED) Culture of Animal Cells: a manual of basic techniques (3rd Ed.) 1994, Wiley-Liss; Spector et al (Eds)(1998) Cells: a Laboratory Manual (vol.1) Cold Spring Harbor Laboratory Press and Darling et al (1994) Animal Cells: culture and media John Wiley & Sons. Métodos de isolamento de um tecido ou de um órgão de um animal são conhecidos na técnica e variam dependendo do tecido ou órgão a ser isolado e do método desejado de transplantar o tecido ou órgão. Métodos de isolamento de um produto de transfusão de um animal ou amostra são conhecidos na técnica e variam dependendo do produto de transfusão desejado. Tais métodos incluem, mas não se limitam a centrifugação, diálise, eluição, aférese e crioprecipitação.

[0087] Um “produto relacionado à pele” engloba produtos isolados da pele e produtos destinados a ser usados com a pele. Os produtos relacionados à pele isolados da pele ou de outros tecidos podem ser modificados antes do uso com a pele. Os produtos relacionados à pele incluem, mas não estão limitados a curativos de substituição, revestimentos de queimadura, produtos dérmicos, derme de substituição, fibroblastos dérmicos, colágeno, condroitina, tecido conjuntivo, queratinócitos, xenodermia livre de células, derme de porco sem células, substitutos de pele compósitos e epiderme e revestimentos temporários de feridas. Ver, por exemplo, Matou-Kovd et al (1994) Ann Med Burn Club 7:143, aqui incorporado a título de referência, em sua totalidade.

[0088] O período de afixação de um produto relacionado à pele é o tempo entre a aplicação do produto relacionado à pele a um indivíduo humano e a separação natural do produto relacionado à pele do indivíduo humano. Quando a ferida da pele de um indivíduo humano foi selada, um produto relacionado à pele pode ser removido por separação natural ou separação mecânica. Contudo, a separação natural de um produto relacionado à pele de um ser humano pode ocorrer prematuramente. A separação natural prematura ocorre antes da separação ser desejada por um médico. A título de exemplo e não de limitação, a separação natural prematura pode ocorrer antes de a ferida ter sido selada. A separação natural prematura também pode ser denominada “escamação”, “derramamento” ou “descascamento”. O tratamento clínico da separação natural prematura pode incluir a reaplicação de um produto relacionado à pele, aplicação de curativo, aplicação de bandagem, administração de antibiótico e administração de fluidos. Uma ferida de pele pode ser selada por quaisquer meios conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a crescimento da pele do sujeito e enxerto de pele. A separação prematura reduzida abrange uma diminuição, menor, menos frequente, diminuída, em menor quantidade de separação natural de um produto relacionado à pele antes da separação ser desejada por um médico. A separação prematura reduzida pode referir-se a um menor número de eventos de separação prematura parciais e ao envolvimento de uma porção menor do produto relacionado à pele em um evento de separação prematura parcial em comparação a um produto relacionado à pele obtido a partir de porco de tipo selvagem. Um produto relacionado à pele do presente pedido também pode exibir um período de afixação aumentado, alongado, melhorado, estendido ou expandido. O uso de um produto relacionado à pele do presente pedido pode aumentar a duração do período de afixação.

[0089] Uma ferida na pele abrange qualquer lesão do tegumento incluindo, mas não se limitando a ferida aberta, queimadura, laceração, úlceras, úlceras de perna, úlceras de pé, remoção de melanoma, remoção de câncer, cirurgia plástica e mordida.

[0090] Por “afixação cirúrgica” pretende-se juntar, combinar, unir, afixar, fixar, conectar, unir ou associar através de qualquer método cirúrgico conhecido na técnica.

[0091] Em uma modalidade, o pedido fornece material não humano adequado para transfusões de animais porcinos knockout múltiplos com expressão reduzida dos genes αGal, CMAH e β4GalNT2. Esses materiais adequados para transfusões podem incluir, mas não estão limitados a sangue, sangue total, plasma, soro, glóbulos vermelhos, plaquetas e glóbulos brancos. Tais materiais podem ser isolados, enriquecidos ou purificados. Métodos de isolamento, enriquecimento ou purificação de material adequado para transfusão são conhecidos na técnica. Os glóbulos vermelhos serologicamente porcinos (RBCs) partilham uma série de características comuns com os glóbulos vermelhos humanos (Pond W.G, Houpt K.A, The Biology of the Pig Ithaca: Comstock Pub. Associates, 1978 and Jandl, J. H. Blood: Textbook of Hematology, Boston:Little, Brown, 1996). Tal como em outros mamíferos, o sítio primário para a eritropoiese em porcos é a medula óssea. O pRBC é um disco bicôncavo de aproximadamente 4 a 8 mícrons de diâmetro. O hematócrito de sangue de porco é de 35 a 47%, com uma concentração de hemoglobina de 6 a 17 g/100 ml. A meia-vida de pRBC é de aproximadamente 40 dias, em comparação com 60 dias para os glóbulos vermelhos humanos.

[0092] Quinze sistemas de grupos sanguíneos de porcos foram identificados até agora. O mais importante e bem estudado é o A-O(H), que está intimamente relacionado com o sistema ABO humano. Os antígenos A e O em pRBC são adsorvidos passivamente a partir de glicoesfingolipídios em circulação, em um mecanismo semelhante ao dos antígenos de Lewis humanos (Marcus, D.M. & Cass, L.E. (1969) Science 164:553-555). A fenotipagem de pRBC não é inteiramente confiável. A fenotipagem de porcos pode ser conseguida por coloração imunohistoquímica de células epiteliais bucais com um anticorpo monoclonal anti-A (mAb) (tal como usado em Bancos de Sangue) e um anticorpo anti-lectina H (Ulex europaeus)(Villarroya H et al 1990 Autoimmunity 6:47-60). Os glicolipídios que suportam o grupo sanguíneo A foram isolados da mucosa estomacal porcina, células epiteliais e eritrócitos. Entre algumas das proteínas bem caracterizadas derivadas de pRBC, a hemoglobina porcina partilha identidade de sequência de 85% com a sua homóloga humana e demonstra uma estrutura tridimensional semelhante com uma resolução de 2,8 Â. Ao contrário da maioria das células teciduais, os glóbulos vermelhos porcinos não contêm um núcleo e, portanto, são menos susceptíveis de conter retrovírus, tais como, mas não se limitando a, retrovírus endógenos porcinos (PERVs). Os pRBCs também têm organelas intracelulares e uma meia-vida relativamente curta in vivo.

[0093] Os exemplos que se seguem são oferecidos apenas para fins ilustrativos e não pretendem limitar o âmbito da presente invenção de qualquer forma. De fato, várias modificações além das apresentadas e descritas aqui se tornarão evidentes para os versados na técnica a partir da descrição anterior e dos exemplos seguintes e estão dentro do escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLOS Exemplo 1. Análise de sequenciamento de DNA de regiões CMAH, GGTA1 e β4GalNT2 alvejadas

[0094] DNA genômico de um porco clonado foi extraído usando GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). A amplificação por PCR das regiões alvo CMAH, GGTA1 e β4GalNT2 Crispr/Cas9 foi realizada. Foram usados iniciadores para sequenciar as regiões CMAH, GGTA1 e β4GalNT2 alvejadas.

[0095] Foi usado Pwo Master (Roche, Indianapolis IN), foi usado Pwo SuperYield DNA polymerase, dNTPack (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). As condições de PCR para GGTA1 foram as seguintes: 94°C, 2 min; 94°C, 15 seg, 54°C, 30 seg, e 72°C, 45 seg por 15 ciclos; 94°C, 15 seg, 54°C, 30 seg, 72°C, 45 seg com 5 seg adicionais em cada ciclo por 25 ciclos; e uma etapa de extensão final de 72°C por 5 min. Para CMAH, 94°C, 2 min; 94°C, 15 seg, 56°C, 30 seg, e 72°C, 45 seg por 15 ciclos; 94°C, 15 seg, 56°C, 30 seg, 72°C, 45 seg com 5 seg adicionais em cada ciclo por 25 ciclos; e uma etapa de extensão final de 72°C por 5 min. Para β4GALNT2, 94°C, 2 min; 94°C, 15 seg, 62°C, 30 seg, 72°C, 40 seg por 15 ciclos, 94°C 15 seg, 62°C, 30 seg, 72°C 40 seg com 5 seg adicionais em cada ciclo por 25 ciclos; e uma etapa de extensão final de 72°C por 5 min. Os produtos de PCR foram separados em 1% de gel de agarose e purificados por Kit de Extração de Gel GenElute (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Os produtos de PCR foram sequenciados pelo método de Sanger (DNA Sequencing Core Facility, Escola de Medicina da Universidade de Indiana) com o iniciador de sequenciamento específico, 5’ CCTTAGTATCCTTCCCAACCCAGAC 3’ (SEQ ID NO:5) para GGTA1; 5’ CATTTTCTTCGGAGTTGAGGGC 3’ (SEQ ID NO:6) para CMAH; 5’ AAAGCCACAGGAGGAGCCAG 3’ (SEQ ID NO:7) para β4GALNT2. Uma vez que as mutações foram detectadas, os produtos de PCR foram inseridos no vetor pCR4blunt-TOPO e transformados em E. coli. Os clones individuais foram sequenciados novamente para investigar mais a mutação em cada alelo do gene individual.

[0096] Os resultados de uma análise da sequência de DNA exemplificativa estão resumidos na Figura 1, painéis A-C. A análise da sequência de DNA confirmou alterações dos genes GGTA1 e CMAH em ambos os alelos em pelo menos um porco. A análise de sequências mostrou deleções sobrepostas de cinco e sete pares de bases na região alvo GGTA1 (painel A). No mesmo porco, a análise de sequência confirmou uma interrupção do gene CMAH consistindo em uma deleção de 12 pares de bases em um alelo e uma substituição sobreposta de 5 pares de bases para uma deleção de 3 pares de bases no outro alelo (painel B). A análise da sequência de DNA confirmou alterações da sequência de gene β4GalNT2 no mesmo porco. Os dados da sequência do gene β4GalNT2 mostram três variações; a presença de três mutações pode sugerir que o gene β4GalNT2 ocorre em pelo menos dois loci. Em uma região de sobreposição do gene β4GalNT2, um alelo mostra uma inserção de um único par de bases, um alelo mostra uma deleção de cinco pares de bases e um alelo mostra uma deleção de doze pares de bases/substituição de um par de bases. Nenhuma evidência de uma sequência de β4GalNT2 de tipo selvagem foi encontrada (painel C). A Figura 13 resume a análise da sequência de DNA de isolados de porco knockout triplos adicionais.

Exemplo 2. Produção de porcos knockout (porcos transgênicos triplos)

[0097] O recozimento de Oligo e a clonagem no plasmídeo PX330 para conduzir a expressão de gRNA foram realizados usando o plasmídeo Addgene 42230 [http://www.addgene.org/42230 e 20]. Os pares oligo para os genes alvo são GGTA1 (Acesso NCB1: XM_005660398.1), 5’CACCGAGAGAAAATAATGAATGTCAA-3’ direto) (SEQ ID NO:8), 5’AAATTGACATTCATTATTTTCTC-3’ (inverso) (SEQ ID NO:9); CMAH (Acesso NCBI: NM_001113015.1) 5’- CACCGAGTAAGGTACGTGATCTGT-3’ (direto) (SEQ ID NO:10), 5’- AAACACAGATCACGTACCTTACTC-3’ (inverso) (SEQ ID NO:11; β4GalNT2 (Acesso NCBI: NM_001244330.1) 5’- CACCGTGTATCGAGGAACACGCTT-3’ (direto) (SEQ ID NO:12), 5’- AAACAAGCGTGTTCCTCGATACAC-3’ (reverso) (SEQ ID NO:13).

[0098] As células derivadas do fígado foram cotransfectadas com todos os três plasmídeos gRNA/Cas9. Após 48 h, as células tratadas foram passadas sobre uma coluna de lectina IB4 para isolar células nulas de α-Gal. Dois milhões de células negativas de α-Gal foram adicionalmente coradas com aglutinina Dolichos biflorus (DBA)-FITC marcada com fluoresceína (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) a 2 μg/ml em 500 μl de HBSS com 0,5% de BSA e classificadas por fluxo para células DBA-negativas usando um classificador BD FACSARia (BD Bioscience, San Jose, CA, EUA). A presença de Neu5Gc, um indicador da função do gene CMAH, não foi analisada antes da transferência nuclear de células somáticas.

[0099] A transferência nuclear de células somáticas (SCNT) foi realizada utilizando oócitos maturados in vitro (DeSoto Biosciences Inc., St. Seymour TN and Minitube of America (Mount Horeb WI). Células do cumulus foram removidas dos oócitos por pipetagem em 0,1% de hialuronidase. Os oócitos com morfologia normal e um corpo polar visível foram selecionados e incubados em meios de manipulação (NCSU-23 livre de cálcio com 5% de soro bovino fetal (FBS) contendo 5 μg/ml de bizbenzimida e 7,5 μg/ml de citocalasina B durante 15 minutos. Após este período de incubação, os oócitos foram enucleados removendo o primeiro corpo polar e a placa metáfase II. Para os porcos transgênicos triplos, foram injetadas células individuais de células derivadas de fígado DBA negativas (LDC), de sítio alvejado, contrasselecionadas por IB4 em cada oócito enucleado. Alguns porcos transgênicos triplos foram desenvolvidos a partir de SCNT de fibroblastos fetais obtidos a partir de um feto triplo abortado de porco knockout criado a partir de células derivadas do fígado DBA negativas, contrasselecionadas por IB4 de sítio alvejado. A fusão elétrica foi induzida com um eletroporador BTX (Harvard Apparatus, Holliston MA). Em vários casos, os oócitos enucleados injetados com uma célula (pares) foram expostos a dois impulsos de CC de 140 V de 50 μs em 280 mM de manitol, 0,001 mM de CaCl2 e 0,05 mM de MgCh ou 180 V para 50 μs em 280 mM de manitol, 0,1 mM de CaCl2, e 0,05 mM de MgCl2. Após a ativação os oócitos foram colocados em meio NCSU-23 com albumina sérica bovina (BSA) a 0,4% e incubados a 38,5°C, 5% de CO2 em uma atmosfera umidificada por menos de uma hora. Dentro de uma hora após a ativação, os oócitos foram transferidos para um porco receptor. Os porcos receptores foram porcos ocidentais sincronizados no seu primeiro dia de estro. As gestações foram verificadas por ultrassom no dia 25 ou dia 26 após a transferência do embrião.

[00100] Todos os animais usados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Biossegurança (IBC) e pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).

Exemplo 3. Contrasseleção por IB4 de knockouts triplos

[00101] As Células Derivadas do Fígado (LDCs) foram transfectadas com três conjuntos de construções de alvejamento (αGal, β4GalNT2 e CMAH). As células foram selecionadas com IB4, uma substância que se liga a αGal. Obteve-se DNA de células na população em massa de células que sobreviveram à contrasseleção por IB4 e as sequências de genes alvo foram avaliadas. As células populacionais em massa que sobreviveram à contrasseleção por IB4 foram usadas diretamente na SCNT para fazer porcas grávidas.

Exemplo 4. Projeção de vetores de alvejamento

[00102] Os vetores de alvejamento tais como construções CrispR, construções de dedos Zn e construções TALEN são projetados para alvejar a sequência de CMAH porcino (transcrito Ensemble ENSSSCT00000001195) em um sítio adequado. As construções de vetor de alvejamento são concebidas para alvejar GGTA1 (transcrito Ensemble ENSSSCT00000006069) em um sítio adequado. As construções de vetor de alvejamento são concebidas para alvejar β4GalNT2 em um sítio adequado em NCBI GeneID:100621328 e Ensemble: ENSSSCG00000030269.

[00103] Uma construção CMAH Crispr com uma sequência iniciadora que é o complemento reverso de uma porção da sequência listada no transcrito Ensemble foi criada e utilizada na criação de um porco knockout triplo. Uma construção Gal Crispr com uma sequência iniciadora idêntica a uma porção daquele no transcrito Ensemble apropriado foi criada e utilizada na criação de um porco transgênico triplo. Uma construção β4GalNT2 Crispr com uma sequência iniciadora idêntica a uma porção da sequência NCBI indicada acima NCBI GeneID:100621328 foi criada e utilizada na criação de um porco transgênico triplo.

Exemplo 5. Correspondência cruzada de soros humanos com PBMCs transgênicos

[00104] O sangue total porcino de porcos transgênicos (GGTA- 1/β4GalNT2/CMAH triplo, por exemplo) e de tipo selvagem foi coletado em ACD por punção venosa. O sangue total foi misturado 1:1 com PBS e separado com Ficoll. Prepararam-se monócitos de sangue periférico porcino (PBMCs) a partir do sangue total usando Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Os PBMC foram removidos de camadas de Ficoll e lavados várias vezes com PBS seguido por solução de lise por necessidade de remover glóbulos vermelhos. Os PBMC foram suspensos em meio EX-CELL a 4 milhões de células/ml (EX-Cell 610 HSF-Meio livre de soro para células de hibridoma 14610C).

[00105] Os soros foram obtidos de 44 voluntários humanos saudáveis. Preparou-se soro inativado com calor a 25%. Foram adicionados 25 μl de soro inativado pelo calor, 25 μl de meio EX-CELL e 50 μl de células suspensas a cada poço em uma placa de 96 poços em V. As células foram incubadas a 4°C durante 30 minutos e depois lavadas três vezes com meio EX-CELL. As células foram coradas com anticorpo secundário como se segue: Alexa Fluor 488 IgG anti-humano de cabra 109-546-170 a uma concentração de 1:250 em meio EX-CELL, Alexa Fluor 488 IgG anti-humano de cabra 709-546-073 a uma concentração de 1:250 em meio EX-CELL, 100 μl de secundário foi adicionado. As células foram suspensas com uma pipeta. As células foram incubadas a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas uma vez com meio EX-CELL e ressuspensas com pipeta em meio EX-Cell ou meio EXCELL 1:1 e Flow Fixative Solution (1% de paraformaldeído tamponado). A análise de citometria de fluxo foi completada com o canal FL-1 para Alexa fluor 488. Os resultados de tal experimento são mostrados na Figura 3, painel B.

Exemplo 6. Coloração de citometria de fluxo de lectina de DBA

[00106] O sangue total de porcos transgênicos triplos e outros porcos de interesse foi coletado em citrato dextrose anticoagulante (ACD). O sangue total foi misturado 1:1 com PBS e separado com Ficoll (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare 17-1440-03). Foram obtidos tampões de lavagem de fluxo e de coloração contendo cálcio. O tampão de lavagem de fluxo foi HBSS com 0,5% de BSA livre de IgG a 0,1% de azida de sódio pH 7,4), 0,45 μM filtrados para remover particulados. Os PBMCs foram ressuspensos em tampão de lavagem de fluxo a 2 x 106 células/ml e suspensos homogeneamente. As células foram bloqueadas durante 15 minutos em gelo. As células foram novamente suspensas. 100 μl (2 X 105 células) foram adicionadas a tubos de fluxo de 5 ml. Foi obtida DBA-fluoresceína (2 mg/ml de matéria-prima). A matéria-prima de lectina de DBA-fluoresceína foi diluída 1:10 em Tampão de Fluxo até uma concentração final de 0,2 μg/ml. Lectina de DBA-fluoresceína foi adicionada às células a uma razão de 1 μg de DBA: 1 x 106 células (0,2 μg/ 2 x 105 células ou 1 μl). A lectina de DBA e as células foram incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas cuidadosamente com 4 ml de HBSS de Lavagem de Fluxo. As células foram centrifugadas a 400 x g durante 5 minutos e o sobrenadante da lavagem foi removido. As células foram ressuspensas em 200 μl de HBSS de Lavagem de Fluxo. Os mesmos parâmetros foram utilizados se foram realizadas lavagens adicionais. Se desejado, as células foram fixadas em aproximadamente 200 μl de Fixador de Fluxo/2 x 105 células após a última lavagem e armazenadas a 4°C até a análise. A análise de citometria de fluxo foi realizada com a porta na dispersão frontal e de luz lateral. Os eventos fluorescentes celulares foram coletados em FL-1; 10.000 eventos foram coletados em porta de dispersão. Para cada linhagem celular coletaram-se apenas células e dados de DBA-fluoresceína. A lectina IB4 interage com carboidratos ligados a αGal produzidos pelo produto do gene αGal. O anticorpo HD interage com o carboidrato de Neu5Gc produzido pelo produto do gene CMAH. A lectina DBA interage com a estrutura de carboidratos produzida pelo produto do gene β4GalNT2. Os resultados de tal experimento são apresentados na Figura 3, painel A.

Exemplo 7. Ligação de anticorpo IgG a glóbulos vermelhos

[00107] Obtiveram-se soro humano A e dois soros humanos O e glóbulos vermelhos. Foram obtidos glóbulos vermelhos de tipo selvagem porcino e j/CMAH/GAL knockout triplo. Os eritrócitos foram isolados a partir de sangue total coletado em tubos de ácido-citrato-dextrose (Becton Dickinson & Co., Franklin Lakes NJ) usando Ficoll-Paque Plus (GE Health, Uppsala Suécia). O soro fresco foi isolado coletando sangue total na ausência de anticoagulante e centrifugando-se para remover o material coagulado. Após isolamento da densidade, os glóbulos vermelhos foram lavados três vezes com PBS e diluídos 1:10 em PBS à temperatura ambiente. Para determinar a ligação do anticorpo a glóbulos vermelhos, (2 X 105 células/poço) foram incubadas com soro humano diluído, inativado por calor durante 30 min a 4°C, concentração final no soro 25%. As células foram lavadas três vezes em PBS com azida e coradas com IgA anti-humano de cabra Alexa Fluor 488 ou IgM anti-humano de burro Alexa Fluor 488 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, EUA). A análise de citometria de fluxo foi realizada usando um citômetro de fluxo Accuri C6 e um software CFlow (Accuri, Ann Arbor, MI USA). O monitoramento de glóbulos vermelhos foi baseado em dispersão frontal e lateral. A ligação exemplificativa do anticorpo IgG a traços de citometria de fluxo de glóbulos vermelhos é mostrada na Figura 5.

[00108] A análise da superfície celular de glicanos de superfície celular de glóbulos vermelhos porcinos foi realizada usando anticorpos/isolectina de lectina Griffonia simplicifolia GS-IB4 Alexa Fluor 647 (Invitrogen, Grand Island NY, EUA) para αGal, um kit de anticorpo anti-Neu5Gc de frango (BioLegend, San Diego CA) para Neu5Gc, e Aglutinina Dolichos Biflorus de Fluoresceína (DBA) (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA EUA) para carboidratos derivados de β4GalNT2. Traços de tal série de experimentos são apresentados na Figura 6. [Matt- favor confirmar detalhes experimentais. ][ACDI] Exemplo 8. Extração de glóbulos vermelhos e citometria de fluxo associada

[00109] Após isolamento da densidade, os glóbulos vermelhos foram lavados três vezes em PBS e suspensos em solução de Alsever a 50%. Os glóbulos vermelhos foram granulados a 21.300 x g durante 2 minutos. Adicionou-se soro às células granuladas a um volume de grânulos de 1:1 do volume de soro. A mistura de glóbulos vermelhos do soro foi misturada e incubada durante 20 minutos a 4°C. As células foram sedimentadas a 21.300 x g durante 2 minutos e lavadas uma vez com solução de Alsever. As células foram misturadas com tampão de extração ácida (pH 2,75 Ácido Cítrico/Fosfato a 300 mOs/kg) para remover os anticorpos ligados e neutralizados com 1 M de Tris-base, pH 9,0 (Calbiochem, LaJolla CA). O material que eluiu durante o tratamento com pH baixo foi analisado por SDS- PAGE e espectrometria de massa (ver abaixo). A análise de citometria de fluxo correspondente para a amostra de eluição de anticorpo foi completada usando 2 x 106 glóbulos vermelhos. As células foram suspensas em meio livre de soro EX-CELL 610-HSF (Sigma, St. Louis, MO EUA) com azida de sódio a 0,1% incubado durante 30 min a 4°C com uma mistura de 25% de soro inativado por calor. Os glóbulos vermelhos foram lavados três vezes e corados com anticorpos IgG anti-humano de cabra Alexa Fluor 488 ou IgM anti-humano de burro Alexa Fluor 488 (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove PA, EUA). Os anticorpos secundários foram incubados com glóbulos vermelhos durante 30 minutos a 4°C e lavados. A análise por citometria de fluxo foi completada com citômetro de fluxo BD Accuri C6 (Accuri, Ann Arbor, MI, EUA) e os histogramas foram gerados usando FlowJo 7.6.5 (FlowJo LLC, Ashland OR, EUA). Os traços representativos são mostrados na Figura 8. O monitoramento de glóbulos vermelhos foi baseado em dispersão frontal e lateral. Um monitoramento representativo é mostrado na Figura 10.

Exemplo 9. Análise em gel SDS-PAGE de proteínas eluídas de glóbulos vermelhos

[00110] Um único soro humano foi incubado com vários glóbulos vermelhos (porcos de tipo selvagem (W), CMAH/GAL DKO (D), CMAH/GAL/β4GalNT2 (T) e humanos autólogos (A)). Após a extração acima descrita, os eluatos neutralizados foram precipitados diluindo 100 μl de eluição em 900 μl de acetona e depois incubados em menos 20°C durante 30 minutos. Os precipitados foram centrifugados a 20.000 X g a 4°C durante 15 min. O sobrenadante foi rejeitado e os grânulos foram lavados com etanol a 70% v/v em água. Os precipitados foram novamente centrifugados a 20.000 x g a 4°C durante 15 minutos. O sobrenadante foi de novo descartado e os grânulos foram secos em um Vacufuge Plus (Eppendorf, Hauppauge, NY, EUA) a 37°C durante 30 min. As amostras foram então dissolvidas em 100 microlitros de 2 x Laemmeli Buffer (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) contendo 2-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram então aquecidas a 95°C durante 5 min e depois deixadas resfriar até a temperatura ambiente. Em seguida, 15 microlitros de cada amostra foram carregados em um gel TGX de 4 a 20% de Stain-Free (Bio-Rad) de 26 poços, e submetidos a eletroforese em condições de desnaturação e redução a 200 V durante 42 min usando o sistema de critérios Bio-Rad. Após a eletroforese, o gel foi removido e corado durante 30 min com 100 mililitros de G-250 Bio-Safe Coomassie Stain (Bio-Rad). O gel foi então descorado em água e teve imagem formada usando um laser de 700 nm em um Li-Cor Classic Imager (LiCor Biosciences, Lincoln, NE EUA). As amostras respectivas foram então enviadas em gelo seco para preparação e análise de espectrometria de massa. Um esquema de processo é mostrado na Figura 7, painel A; um gel representativo de material eluído a partir de glóbulos vermelhos é mostrado na Figura 7, painel B.

Exemplo 10. Quantificação de espectrometria de massa de imunoglobulina eluída de glóbulos vermelhos

[00111] A análise por espectrometria de massa foi realizada por MSBioworks, LLC. Alíquotas de 50 μl de cada amostra foram tratadas com PNGase F (New England Biolabs) de acordo com as instruções do fabricante. Cada amostra foi precipitada com acetona durante 30 minutos seguido de uma lavagem com etanol a 70% a 4°C por protocolo do cliente. Os precipitados resultantes foram secos e ressuspensos em 40 μl de tampão de carga LDS 1,4 X com DTT. Fez-se passar 20 μl em um gel SDS PAGE de 4-12% bis tris no sistema de tampão MOPS.

[00112] A região contendo a cadeia pesada (50 kDa) foi excisada e a digestão com tripsina foi realizada usando um robô (ProGest, DigiLab) com o seguinte protocolo: 1) Lavada com 25 mM de bicarbonato de amônio seguido por acetonitrila. 2) Reduzida com 10 mM de ditiotreitol a 60°C seguido por alquilação com 50 mM de iodoacetamida à TA. 3) Digerida com tripsina (Promega) a 37°C durante 4 h. 4) Resfriada bruscamente com ácido fórmico e o sobrenadante foi analisado diretamente sem processamento adicional.

[00113] As digestões em gel foram analisadas por nano LC/MS/MS com um sistema de HPLC Waters NanoAcquity ligado a um ThermoFisher Q Exactive. Os peptídeos foram carregados em uma coluna de captura e eluídos sobre uma coluna analítica de 75 um a 350 nL/min; ambas as colunas foram embaladas com resina Jupiter Proteo (Phenomenex). O espectrômetro de massa foi operado em modo dependente de dados, com MS e MS/MS executados no Orbitrap com resolução de 70.000 FWHM e resolução de 17.500 FWHM, respectivamente. Os quinze íons mais abundantes foram selecionados para MS/MS. A área sob a curva (AUC) foi identificada e calculada para cada peptídeo específico de isótipo. A comparação da AUC permite uma avaliação quantitativa dos níveis de cada anticorpo em uma amostra. Os traços representativos são mostrados na Figura 9. As sequências dos peptídeos usados para identificar e quantificar cada anticorpo por espectroscopia de massa são mostradas na Tabela 2.

• n minúsculo no peptídeo IgM representa um resíduo de asparagina desamidado que presumivelmente ocorreu como consequência de tratamento com PNGase F.

Exemplo 11. Processamento de dados

[00114] Os dados foram pesquisados usando uma cópia local da Mascot com os seguintes parâmetros: Enzima: Tripsina, Banco de dados: Swissprot humano (direto e reverso anexado com contaminantes comuns), modificação fixa: Carbidometila (C), Modificações variáveis: Oxidação (M), Acetila (Proteína N-terminal), Desamidação (NQ), Pyro-Glu (N-terminal Q). Valores de massa: Peptídeo monoisotópico Tolerância à massa: 10 ppm Tolerância à massa do fragmento: 0,02 Da Máx. clivagens perdidas: 2 Os arquivos DAT da Mascot foram analisados no software Scaffold para validação, filtragem e para criar uma lista não redundante por amostra. Os dados foram filtrados a 1% de proteína e taxa de falsa descoberta de nível de peptídeos (FDR) e requerendo pelo menos dois peptídeos únicos por proteína. Os dados crus de LC/MS foram inspecionados quanto aos valores m/z exatos dos peptídeos alvo, os cromatogramas de íons selecionados foram extraídos em QualBrowser (Thermo); a área do pico em cada caso foi calculada.

Exemplo 12. Comparação de técnicas de espectrometria de massa e citometria de fluxo para quantificação de ligação de anticorpos a glóbulos vermelhos

[00115] O uso de anticorpos secundários fluorescentes, um potencial para mascaramento artificial e a incapacidade de reportar facilmente diferentes isótipos de IgG podem afetar os resultados da citometria de fluxo. A espectrometria de massa quantitativa pode permitir a análise peptídica direta sem reagentes secundários e pode fornecer informação sobre os níveis individuais de isótipo. A espectrometria de massa e a citometria de fluxo fornecem medidas de ligação a anticorpos que podem refletir diferentes vieses inerentes nos métodos. Os níveis individuais de isótipo podem contribuir de forma diferente para várias funções efetoras imunológicas. Soro e glóbulos vermelhos foram coletados de três pessoas. Cada soro foi incubado com seu glóbulo vermelho autólogo (A) e com glóbulo vermelho de porco (tipo selvagem (W) ou knockout triplo (T)). A ligação à imunoglobulina foi avaliada usando citometria de fluxo e espectrometria de massa. Figura 8, painéis A e B fornecem traços de citometria de fluxo a partir de tal experimento. A quantificação da espectrometria de massa indicou que as células suínas knockout triplas (T) ligavam menos IgG do que os glóbulos vermelhos humanos autólogos (A) para dois dos três soros e menos IgM para os três soros. Tanto a citometria de fluxo como a espectrometria de massa quantitativa indicaram baixos níveis de imunoglobulina humana ligando-se a glóbulos vermelhos a partir dos porcos knockout triplos. As comparações foram feitas aos glóbulos vermelhos do grupo sanguíneo humano O porque a antigenicidade dos glóbulos vermelhos do grupo sanguíneo humano O é suficientemente baixa para evitar dano humoral mesmo na ausência de supressão imunológica.

Exemplo 13. Análise de isótipo de ligação de anticorpo a glóbulos vermelhos

[00116] A AUC da espectrometria de massa foi usada para quantificar a ligação de cada isótipo aos diferentes glóbulos vermelhos. As avaliações foram realizadas usando glóbulos vermelhos knockout GGTA1/CMAH (D), glóbulos vermelhos knockout GGTA1/CMAH/β4GalNT2 (T) e glóbulos vermelhos humanos autólogos (A). Os valores nulos no soro 1 indicam que não há ligação dos isótipos particulares a uma célula alvo. A ligação de IgG4 a células humanas autólogas nos soros 2, 3 e 4 aumentou em uma faixa de 10 vezes a 16 vezes. IgG2 foi o único outro isótipo a mostrar aumento da ligação a células humanas (A) em comparação com o glóbulo vermelho de porco (T) em soros múltiplos, mas os aumentos foram menores do que os observados para IgG4 (intervalos de 3 a 6 vezes, ver soros 2, 3, e 4). Os resultados de tal série de experimentos são mostrados na Figura 10.

Exemplo 14. Coloração com lectina de porcos diferentes

[00117] Rins porcinos de porcos DKO GGTA1/CMAH foram lavados com 0,025% de colagenase tipo IV de Clostridium histolyticum (Sigma, St. Louis, MO, EUA). As RMEC primárias foram isoladas e cultivadas com meio RPMI suplementado com 10% de soro de porco DKO, 100 μg/ml de fator de crescimento específico das células endoteliais, penicilina, estreptomicina e anfotericina B. Após uma cultura de 3 dias, as RMEC porcinas foram infectadas por 24 h com sobrenadante lentiviral, contendo vetor lentiviral no qual um c-DNA expressa o antígeno T grande e pequeno de SV40 (Applied Biological Materials Inc, Richmond, BC, Canadá). Os clones de célula única foram isolados e amplificados até 10 passagens. iRMEC foram cultivadas com meio RPMI suplementado com 10% de soro de porco DKO, 100 μg/ml de fator de crescimento específico das células endoteliais, penicilina, estreptomicina e foram usadas para caracterização dentro das passagens 1540. Foram obtidas as iREC’s interrompidas com antígeno αGal/CMAH/β4GalNT2/SLA.

[00118] As células endoteliais aórticas primárias de ramos torácicos e abdominais aórticos de porco KO GGTA1/CMAH/B4GALNT2 foram isoladas com 0,025% de colagenase tipo IV de Clostridium histolyticum (Sigma, St.Louis, MO, EUA) 2. As AEC foram cultivadas com meio RPMI 1640 suplementado com soro de porco KO GGTA1/CMAH/B4GALNT2, fator de crescimento específico de célula endotelial de 100 ug/ml, penicilina, estreptomicina e anfotericina B, bem como FBS a 10% para AEC de KO WT/GGTA1 ou 5% de soro de porco DKO GGTA1/CMAH para DKO GGTA1/CMAH e AEC de GGTA1/CMAH/B4GALNT2. Essas células foram usadas dentro de 5 passagens. As células porcinas deficientes em CMAH foram cultivadas em soro de porco DKO GGTA1/CMAH para evitar a captação de Neu5Gc a partir de soro bovino.

[00119] As células AEC primárias (2 x 105 células) foram coradas usando lectina de aglutinina Dolichos biflorus marcada com Fluoresceína (diluída a 1:1000 em HBSS) (DBA, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA), lectina Artocarpus integrifolia marcada com fluoresceína (diluída a 1:1000 em HBSS) (AIL, Vector Laboratories), lectina Vicia villosa marcada com fluoresceína (diluída a 1:1000 em HBSS) (VVL, Vector Laboratories), lectina Arachis hypogaea marcada com fluoresceína (diluída a 1:1000 em HBSS) (PNA, Vector Laboratories), e Isolectina IB4 marcada com Alexa Fluor 488 (diluída a 1:1000 em HBSS) de Griffonia simplicifolia (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA). Para Neu5GC, as células foram coradas em uma razão de diluição final de 1:5000 a partir de uma matéria-prima de 0,5 mg/mL com Anti-Neu5GC marcado com Alexa Fluor ou IgY de galinha normal (BioLegend). As células foram coradas durante 30 minutos a 4°C. As células foram então lavadas e analisadas usando um citômetro de fluxo C6 (BD Biosciences). A intensidade de fluorescência foi então calculada em comparação com células não coradas no caso de lectinas ou controle de isótipo no caso de Neu5GC. Os traços representativos são mostrados na Figura 12.

Exemplo 15. Análise de fenótipo de PBMC

[00120] As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas por Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) e contadas. As células foram então ressuspensas a uma densidade de 2 x 106 células/mililitro em tampão de bloqueio Neu5GC (Biolegend, San Diego, CA, EUA) diluído em solução de sal equilibrada de Hank (HBSS) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram incubadas em gelo durante 15 minutos antes da coloração. Cem microlitros (2 x 105 células) foram adicionados a tubos de coloração de fluxo de poliestireno de 12 x 75 mm (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA). As células foram coradas a uma razão de um micrograma por 1 x 106 células de: lectina de aglutinina Dolichos biflorus marcada com Fluoresceína (DBA, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA), lectina Artocarpus integrifolia marcada com fluoresceína (AIL, Vector Laboratories), lectina Vicia villosa marcada com fluoresceína (VVL, Vector Laboratories), lectina Arachis hypogaea marcada com fluoresceína (PNA, Vector Laboratories), e Isolectina IB4 marcada com Alexa Fluor 488 de Griffonia simplicifolia (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA). Para Neu5GC, as células foram coradas em uma razão de diluição final de 1:5000 a partir de uma matéria-prima de 0,5 mg/mL com Anti-Neu5GC marcado com Alexa Fluor ou IgY de galinha normal (BioLegend). As células foram coradas durante 30 minutos enquanto se incubava em gelo. As células foram então lavadas com quatro mililitros de tampão de bloqueio Neu5GC e granuladas a 400 x g durante cinco minutos. O sobrenadante foi rejeitado e as células foram ressuspensas em 200 microlitros do tampão de bloqueio e analisadas imediatamente. As células foram analisadas utilizando um citômetro de fluxo C6 (BD Biosciences) coletando 10.000 eventos usando um método de monitoramento de dispersão frontal e lateral. A intensidade de fluorescência foi então calculada em comparação com células não coradas no caso de lectinas ou controle de isótipo no caso de Neu5GC.

Exemplo 16. Testagem clínica de correspondência cruzada

[00121] As PBMC de porcos transgênicos triplos foram submetidas a ensaios de correspondência cruzada clínicos humanos usados em alotransplante. Os soros foram obtidos a partir de 31 indivíduos humanos com um painel de anticorpos reativos (PRA) de 0 (gráfico superior) e 19 indivíduos humanos com um escore PRA de painel superior a 80 (gráfico inferior). Os médicos rotineiramente transplantam órgãos humanos com um escore de citotoxicidade de 1. As PBMC tratadas com Ficoll de porcos transgênicos triplos foram ajustadas a uma concentração de células de 2 X 106 células/ml. Algumas alíquotas de soro foram tratadas com DTT. Prepararam- se dois conjuntos de bandejas de correspondência cruzada. Os soros e os controles foram carregados nas bandejas de correspondência cruzada. A preparação de células foi cuidadosamente misturada e lentamente extraída em um dispensador de repetição Hamilton. Um microlitro de células foi adicionado a cada poço contendo soro sobre uma caixa de visualização iluminada. As células de teste foram adicionadas em último lugar aos poços de controle positivo. Números iguais de bandejas foram colocados em baldes opostos de uma centrífuga Sorvall. A centrífuga foi ligada e deixada atingir 1000 rpm, em seguida a centrífuga foi desligada. As bandejas foram examinadas sobre uma caixa de vista iluminada para assegurar que as gotículas das células foram misturadas com soro. As bandejas foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. Todas as bandejas foram lavadas quatro vezes com 15 μl de PBS a cada poço utilizando Jet Pipette. As células foram deixadas sedimentar durante 2-3 minutos usando uma técnica de lavagem suave. PBS, óleo e soro foram removidos.

[00122] Foi preparada uma diluição de trabalho de mistura AHG/C’ Classe 1. Um conjunto de bandejas foi tratado com 5 μl de AHG/C’; o outro conjunto de bandejas foi tratado com 5 μl de complemento de coelho não diluído (sem bandejas AHG). As bandejas foram opcionalmente colocadas em um rotador durante 4 minutos a 60 rpm. As bandejas foram incubadas durante 60 minutos à temperatura ambiente. As células foram coradas com 5 μl de Fluoroquench e deixadas em repouso durante 5’. As bandejas foram colocadas em um microscópio de fluorescência de fase invertida; cada poço foi avaliado usando uma ampliação total de 160X.

[00123] A porcentagem de células mortas em cada poço é estimada. AO atravessa membranas celulares intactas de células vivas, intercala DNA e fluoresce verde (535 nm) quando excitado a 490 nm. As células mortas coradas com brometo de etídio fluorescem vermelho (605 nm) quando excitadas a 490 nm. Cada poço é classificado usando o sistema descrito abaixo:

[00124] Os resultados de tal série de experimentos são mostrados na Figura 14. Observar soros múltiplos com valores de citotoxicidade de 1.

Exemplo 17. Perfusão ex vivo de plaquetas humanas através de fígado transgênico

[00125] Um porco triplo transgênico GGTA1/CMAH/β4GalNT2 é anestesiado e intubado. É feita uma incisão abdominal na linha média. O fígado é removido e colocado em um dispositivo de perfusão em condições normotérmicas. A umidade, a temperatura e o fluxo de ar são mantidos no dispositivo de perfusão. O dispositivo de perfusão mantém a pressão constante variando a vazão. Fluxo centrífugo através da veia porta e fluxo pulsátil através da artéria hepática são usados. Ambas as vazões são ajustadas à pressão fisiológica porcina. A solução de perfusão de base é uma solução de Ringers oxigenada com nutrição fisiológica e insulina.

[00126] As plaquetas humanas são obtidas de voluntários saudáveis ou são adquiridas comercialmente menos de seis dias após o isolamento e são armazenadas a 20 a 24°C. Aproximadamente 1 x 1011 as plaquetas humanas são lavadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril contendo o citrato de dextrose anticoagulante. As plaquetas podem ser marcadas com CFSE de acordo com o protocolo do fabricante.

[00127] Os fígados de porco são perfundidos duas horas antes da adição de plaquetas. As amostras de plaquetas são obtidas antes da adição ao sistema de perfusão e após a adição das plaquetas em pontos de tempo predeterminados. Os níveis de plaquetas nas amostras de pré-perfusão e pós- perfusão são avaliados. A avaliação pré e pós-perfusão do fígado de porco é realizada. São obtidos fígados de porco de tipo selvagem e os fígados são perfundidos em condições similares.

Exemplo 18. Avaliação de resposta a um xenoenxerto transgênico

[00128] Os fígados porcinos são obtidos a partir de um porco knockout triplo (αGal, CMAH, β4GalNT2). Os fígados são cirurgicamente transplantados para um cadáver humano recentemente falecido usando o método “piggyback”. Após a cirurgia, as amostras biológicas são obtidas a partir do cadáver humano. Os indícios clínicos de uma resposta relacionada à rejeição são monitorados.

Exemplo 19. Avaliação de resposta a um xenoenxerto transgênico

[00129] Os rins porcinos são obtidos a partir de um porco transgênico triplo (αGal, CMAH, β4GalNT2). São administrados compostos a um indivíduo humano altamente sensibilizado para gerenciar anticorpos preexistentes e específicos de doadores de novo. Os rins porcinos são transplantados cirurgicamente para o indivíduo. Após a cirurgia, as amostras biológicas são obtidas a partir do cadáver humano. Os indícios clínicos de uma rejeição ao enxerto são monitorados.

Exemplo 20. Análise de microscopia confocal

[00130] Leitões (triplos GGTA1, CMAH, knockouts βGalNT2, tipo selvagem ou outros leitões de interesse) são eutanasiados. Tecido de fígado, coração e rim são obtidos a partir do porco. Preparam-se seções congeladas de cada tecido. Os tecidos montados são bloqueados em tampão de bloqueio Odyssey (Li-Cor Biosciences, Lincoln NE) em HBSS durante uma hora. As lâminas são fixadas em paraformaldeído a 4% durante 10 minutos. Os tecidos são corados com a lectina IB4 Alexa Fluor 647 (Invitrogen, Grand Island NY) para visualizar a presença do epítopo Gal. Para visualizar o epítopo de Neu5Gc, os tecidos são corados com um anticorpo anti-Neu5Gc de galinha ou com um anticorpo de controle (Sialix, Vista CA) durante uma hora. Os tecidos são corados com DBA para visualizar a presença de epítopos tipo Sda. Os tecidos são lavados três vezes com HBSS. O anticorpo secundário anti- galinha de burro Dylight 649 (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove PA) é incubado com o tecido durante aproximadamente uma hora. Os tecidos são lavados três vezes com 0,1% de HBSS Tween. Para corar o núcleo, adiciona-se o corante de DAPI (Invitrogen, Grand Island NY) a todas as lâminas durante 1 minuto seguido por duas lavagens com 0,1% de HBSS Tween. Os tecidos são montados em ProLong Gold (Invitrogen, Grand Island NY). Microscopia confocal é realizada usando um Olympus FV1000.

Exemplo 21. Citotoxicidade dependente de complemento mediada por anticorpo

[00131] Ensaios de citotoxicidade dependente de complemento mediada por anticorpo são conhecidos na técnica. Um método de Diaz et al (Diaz et al., 2004 Transplant Immunology 13(4):313-317) é realizado. O soro humano é obtido a partir de voluntários saudáveis. É preparado 25% de soro inativado por calor. Os soros humanos inativados por calor são diluídos em série e 100 μL de cada concentração são colocados em uma placa de ensaio de 96 poços de fundo em V. O soro é misturado com uma alíquota de 100 μl de PBMC obtida de um porco de interesse (GGTA1/CMAH/β4GalNT2 triplo transgênico ou outro). As concentrações finais de PBMC são 5 x 106/ml ou 1 x 106/ml. As concentrações séricas variam entre 50%, 17%, 2%, 0,6%, 0,2% e 0,07%. As misturas são incubadas durante 30 minutos a 4°C. Após 30 minutos, as placas são centrifugadas durante 4 minutos a 400 x g. As placas são decantadas e lavadas com HBSS. O complemento de coelho (150 μl de uma diluição 1:15) é adicionado a cada poço e incubado durante 30 minutos a 37°C. As PBMC são marcadas com uma solução stock de diacetato de fluoresceína (FDA), preparada diariamente de fresco em HBSS (1 μg/ml) a partir de uma solução de carga de 1 mg/ml em acetona e com iodeto de propídio (PI), preparada a 50 μg/ml em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Após incubação em complemento, as amostras são transferidas por pipeta para tubos contendo 250 μl de HBSS e 10 μl de FDA/PI para análise usando um citômetro de fluxo Accuri C6.

[00132] A porcentagem de células mortas (PI+/FDA-), células danificadas (PI+/FDA+) e células vivas é determinada. Eventos negativos duplos (PI-/FDA-) são excluídos dos cálculos. A porcentagem de citotoxicidade em células não expostas ao soro é considerada morte espontânea. Os valores de citotoxicidade são corrigidos para morte espontânea.

Exemplo 22. Aquisição de fígado porcino

[00133] Os porcos são pré-medicados, intubados e anestesiados com propofol e colocados em posição supina. É feita uma incisão na linha média do abdômen. Ligamentos anexos ao fígado são retirados. A veia porta e a artéria hepática são canuladas e lavadas com 2 litros de solução fria de histidina-triptofano-cetoglutarato (Essential Pharmaceuticals, LLC). Os fígados são removidos dos porcos e armazenados em solução de histidina- triptofano-cetoglutarato em gelo a 4°C até serem colocados em um circuito de perfusão do fígado. O tempo de isquemia fria varia entre 45 minutos e 3 horas. Em certos experimentos, os fígados de porco podem ser obtidos a partir de abatedouros. Os fígados de porco de abatedouros são lavados com solução de histidina-triptofano-cetoglutarato contendo heparina (2000 U/L) em dois minutos de exsanguinação.

Exemplo 23. Análise de captação de plaquetas I

[00134] As plaquetas são marcadas com éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoreceína (CFSE), um marcador citoplasmático verde fluorescente. É usado um sistema de perfusão de fígado de porco normotérmico. Fígados de porco de porcos knockout de interesse ou porcos de tipo selvagem são perfundidos durante duas horas antes da adição de plaquetas. Aproximadamente 300 bilhões de plaquetas (70% não marcadas, 30% marcadas) são adicionadas ao sistema de perfusão. As biópsias são retiradas dos fígados de porco em vários pontos de tempo predeterminados. As biópsias são examinadas por microscopia confocal. As biópsias são tratadas com um corante específico para os corpos de Wieble-Palade. Os corpos de Wieble-Palade ocorrem nas plaquetas e nas células endoteliais. Realizam-se ensaios fluorescentes ELISA. As plaquetas são humanas ou de babuínos. Em alternativa, as biópsias são marcadas com marcadores endoteliais e um marcador lisossômico, antes da microscopia confocal.

Exemplo 24. Análise de captação de plaquetas II

[00135] As plaquetas são marcadas com éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoreceína (CFSE), um marcador citoplasmático verde fluorescente. É usado um sistema de perfusão de fígado de porco normotérmico. Fígados de porco de porcos knockout de interesse ou porcos de tipo selvagem são perfundidos durante duas horas antes da adição de plaquetas. As biópsias são analisadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM).

Exemplo 25. Captação de plaquetas in vitro

[00136] As células endoteliais sinusoidais hepáticas primárias (LSECs) são isoladas a partir da sinusoide de um fígado de porco ou de fígados de interesse. As LSECs porcinas de tipo selvagem primárias possuem capacidade fagocítica solta após 5 dias em cultura; esses experimentos são realizados com LSECs primárias de dias 3 e 4. As plaquetas humanas ou de babuíno são marcadas com CFSE como descrito em outro local deste documento. As LSEC isoladas e as plaquetas marcadas são incubadas em conjunto. As amostras são analisadas por microscopia confocal.

Exemplo 26. Xenoenxerto renal em NHPs

[00137] Primatas não humanos (NHP) receptores são tratados com uma dose de anti-CD4/anti-CD8 (50 mg/kg), anti-CD154/anti-CD28 dAbs, MMF e esteroides. Em certos estudos é usado tacrolimus (níveis alvo 8 a 12). Macacos Rhesus (Macaca mulatta) são usados como o NHP. Em alguns experimentos, os macacos podem ter 3 a 5 anos e menos de 6 kg. Os rins porcinos knockout (ou rim de controle de tipo selvagem) são transplantados para os receptores NHP. Amostras (amostras de biópsia de sangue, urina e rim) são coletadas em pontos de tempo definidos para análise. Função renal, creatinina sérica, presença e quantidade de xenoanticorpos (citometria de fluxo e citometria de fluxo multiparâmetro), secreção de citocinas, perfis de transcritos de sangue periférico, biópsias de urina e enxerto, histologia de xenoenxerto e desenvolvimento de anticorpos anti-porco (ensaio de Xenocorrespondência cruzada com base em fluxo) são acompanhadas. A deleção de CMAH não é útil para o estudo em NHP. Para os estudos de NHP, são usados porcos com um gene CMAH de tipo selvagem (Gal-/β4GalNT2). As biópsias por agulha guiadas por ultrassom são realizadas em 2, 5 e 10 semanas após o transplante.

Exemplo 27. Cuidados veterinários de NHPs

[00138] Os NHP são alojados em gaiolas individuais e equipados com quartos de habitação limpos e adequadamente dimensionados; alimentados duas vezes por dia; e são verificados pelo menos duas vezes por dia por técnicos de cuidados com animais e uma vez por dia por equipe clínica veterinária. Exames físicos são realizados cada vez que um animal é anestesiado para coleta de sangue ou outros procedimentos.

Exemplo 28. Flebotomia de NHP e amostragem de tecidos

[00139] A flebotomia e a amostragem de tecidos (por exemplo: coleta de sangue, biópsia de linfonodos e aspirados de medula óssea) de NHPs são realizadas sob anestesia de cetamina (10 mg/kg) ou Telazol (4 mg / kg) em animais em jejum. A buprenefrina (0,01 mg/kg a cada 6 horas) é administrada como analgesia pós-operatória para animais submetidos a transplante renal e conforme necessário, conforme determinado pelo veterinário assistente. Os animais são monitorados quanto a “doença crítica irreversível” tal como, mas não se limitando a perda de 25% do peso corporal a partir da linha de base; anorexia completa por 4 dias; icterícia, uremia, diarreia intratável, automutilação ou vômitos persistentes e complicações cirúrgicas que não respondem à intervenção imediata: sangramento, insuficiência vascular do enxerto/circulação, infecção e deiscência da ferida.

Exemplo 29. Cirurgia de transferência de embrião porcino, flebotomia e procedimentos de colheita

[00140] Cirurgia de transferência de embrião: Antes da cirurgia, a porca é anestesiada com TKX (Telazol (500 mg) + Cetamina (250 mg) e Xilazina (250 mg), 1 cc por 50 libras, intramuscular) para intubação mais isoflurano por inalação através do tubo ET usando um vaporizador de precisão e eliminação de gases residuais. Durante o período de recuperação, os animais são monitorados pelo menos uma vez a cada 15 minutos e os sinais vitais (temperatura, frequência cardíaca, frequência respiratória e tempo de recarga capilar) são avaliados e registrados. Técnicos de cuidados com animais treinados ou veterinários monitoram os animais até que possam manter-se em decúbito esternal voluntário. Os animais são devolvidos às áreas habitacionais regulares após a aprovação pelo veterinário assistente. Os analgésicos pós-operatórios incluem buprenorfina 0,01 a 0,05 mg/kg intramuscular a cada 8 a 12 horas ou carprofeno 2 a 4 mg/kg subcutâneo diariamente. Aproximadamente 26 dias após a transferência do embrião, o ultrassom é realizado para confirmar o estabelecimento da gravidez enquanto a porca é distraída pelos alimentos. Cerca de 10 dias depois é realizado um segundo ultrassom. O nascimento ocorre por meio de parto natural, a menos que surja dificuldade clínica. A cesariana é realizada recomendada pela equipe veterinária. Os protocolos padrão da cesárea são usados com o protocolo de anestesia geral utilizado na cirurgia de transferência embrionária. Os leitões experimentais são limpos e o cordão umbilical é desinfectado. Cada leitão recebe colostro durante as primeiras horas após o nascimento. Leitões são observados 24 horas por dia até que tenham pelo menos 7 dias de idade. As caixas de parto são usadas para proteger os leitões de sua mãe, mantendo a capacidade dos leitões de amamentar.

[00141] Todas as flebotomias são realizadas sob anestesia com cetamina (10 mg/k) ou Telazol (4 mg/kg) em animais em jejum. A colheita de órgãos, procedimento cirúrgico terminal, usa o protocolo de anestesia (Telazol (500 mg) + cetamina (250 mg) + xilazina (250 mg), 1 cc por 50 libras; intramuscular) +/- pentotal (10-20 mg/kg) intravenoso se necessário para intubação e isoflurano por inalação através de tubo ET usando um vaporizador de precisão, para efeito com eliminação de gases residuais. Os suínos são perfundidos com solução salina seguido de remoção do coração e outros tecidos/órgãos. Alternativamente, os suínos são anestesiados com anestésico inalatório e tratados com um derivado de ácido barbitúrico (100150 mg/kg) e é realizado um pneumotórax bilateral.

Exemplo 30. Avaliação de CFSE MLR de agentes imunossupressores em resposta proliferativa de células T

[00142] PBMCs de macacos rhesus são incubadas com PBMCs de porco de GGTA-/β4GalNT2- knockout duplo ou porcos de controle. A diluição de CFSE é usada para avaliar a proliferação de células T em subconjuntos de células T.

Exemplo 31. Avaliação de agentes imunossupressores em xenoenxerto renal

[00143] Os macacos receptores são imunologicamente maduros (CMV+, LCV+, SV40+, >4 kg), MHC- e de pedigree definido. Os candidatos imunossupressores (anti-CD154 dAb, clone 5C8 anti-CD154) são administrados aos macacos rhesus. Os macacos receptores são tratados com depleção de células T (anti-CD4/anti-CD8, dose única), MMF, esteroides e o candidato imunossupressor antes do transplante. A função renal é avaliada usando creatinina sérica. O aumento da creatinina e/ou nitrogênio ureico no sangue (BUN) > 5,0 mg/dl ou 100 mg/dl, respectivamente, são considerados resultados negativos. As biópsias por agulha guiada por ultrassom são realizadas em 2, 5 e 10 semanas após o transplante. As amostras pré- transplantadas e semanais de sangue periférico pós-transplante são coletadas para imunofenotipagem usando citometria de fluxo multiparâmetro (T, B e outros subconjuntos celulares). Os ensaios funcionais incluindo a avaliação ex vivo da secreção de citocinas, bem como os perfis de transcrição são sangue periférico, urina e biópsias de enxerto em pontos de tempo definidos. A expressão de receptores coestimuladores e coinibitórios (tais como, mas não se limitando a ICOS, CTLA-4, BTLA, PD-1, LAG-3, TIM-3) em amostras de sangue periférico pode ser avaliada.

[00144] A invenção não está limitada às modalidades aqui apresentadas para ilustração, mas inclui tudo o que está dentro do escopo das reivindicações. Tendo descrito a invenção com referência às modalidades exemplificativas, deve ser entendido que não se pretende que quaisquer limitações ou elementos que descrevem as modalidades exemplificativas aqui descritas sejam incorporados nos significados das reivindicações de patente a menos que tais limitações ou elementos sejam listados explicitamente nas reivindicações. Do mesmo modo, deve ser entendido que não é necessário satisfazer qualquer ou todas as vantagens ou objetos identificados da invenção aqui descrita para se enquadrar no escopo de quaisquer reivindicações, uma vez que a invenção é definida pelas reivindicações e, visto que vantagens inerentes e/ou imprevistas da presente invenção podem existir mesmo que possam não ser explicitamente discutidas aqui.

[00145] Além disso, todas as referências aqui citadas são aqui incorporadas por referência na sua totalidade e para todas as finalidades como se estivessem totalmente aqui apresentadas.

Claims

1. Uso de um tecido de um porco geneticamente modificado que compreende genes α(1,3) galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 interrompidos no genoma nuclear de uma pluralidade de células do dito porco, em que a expressão de α(1,3) galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 é reduzida em comparação a um porco selvagem, caracterizado pelo fato de que é para a manufatura de um produto para transplante, em que o dito produto melhora um sintoma relacionado à rejeição de transplante.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido sintoma relacionado à rejeição de transplante é selecionado a partir do grupo que compreende: um sintoma relacionado à resposta de rejeição celular, um sintoma relacionado à resposta de rejeição humoral, um sintoma relacionado à rejeição hiperaguda, um sintoma relacionado à rejeição de reação de xenoenxerto humoral aguda, e um sintoma relacionado com a resposta de rejeição vascular aguda.

3. Uso de um produto relacionado com a pele de um porco geneticamente modificado que compreende genes α(1,3) galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 interrompidos no genoma nuclear da pluralidade de células do dito porco, em que a expressão de α(1,3) galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 é reduzida em comparação a um porco do tipo selvagem, caracterizado pelo fato de que é para manufatura de um produto para tratamento de feridas, em que o referido produto exibe separação prematura reduzida de uma ferida em comparação com um produto relacionado à pele de um porco do tipo selvagem.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dito produto relacionado com a pele é selecionado do grupo compreendendo: curativos de substituição, coberturas para queimaduras, produtos dérmicos, derme de substituição, fibroblastos dérmicos, colágeno, condroitina, tecido conjuntivo, queratinócitos, xenoderme livre de células, derme de porco livre de células, substitutos de pele compostos e epiderme e coberturas de feridas temporárias.

5. Método para preparação de material de transplante para xenoenxerto em um humano, caracterizado pelo fato de que compreende prover porco geneticamente modificado compreendendo genes α(1,3)- galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 interrompidos no genoma nuclear de uma pluralidade de células do dito porco, em que a expressão de α(1,3)- galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 é reduzida em comparação ao porco do tipo selvagem como uma fonte do dito material de transplante e em que o dito material de transplante é selecionado do grupo que consiste em órgãos, tecidos, produtos de transfusão e células, e em que o dito material de transplante tem um nível reduzido de antígenos aGal, um nível reduzido de antígenos Neu5GC e um nível reduzido de antígenos semelhantes a Sd8.

6. Uso do tecido de um porco geneticamente modificado compreendendo genes α(1,3) galactosyltransferase, CMAH e β4GalNT2 interrompidos no genoma nuclear de uma pluralidade de células do dito porco, em que a expressão de α(1,3)-galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 no dito porco é reduzida em comparação ao porco do tipo selvagem, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um produto para aumentar a duração de um período entre o momento em que um indivíduo humano é identificado como um indivíduo com necessidade de um transplante de órgão humano e quando o transplante de órgão humano ocorre.

7. Método para produção de um composto de interesse com um perfil de epítopo alterado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de prover um reagente de cultura de células que exibe um perfil de epítopo alterado em que o dito reagente de cultura de células é isolado de um porco geneticamente modificado compreendendo um gene α(1,3)- galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 e em que a expressão de uma α(1,3)-galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 no dito porco geneticamente modificado está diminuída em comparação com um porco do tipo selvagem e incubar uma célula isolada capaz de expressar o dito composto de interesse com o dito reagente de cultura celular; e em que o nível de epítopos de Neu5Gc, Sd8 ou alfaGal no dito composto de interesse é inferior ao nível dos ditos epítopos no dito composto de interesse quando o dito composto de interesse é produzido a partir de uma célula isolada incubada com um reagente de cultura celular isolado a partir de um porco selvagem.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito composto de interesse é selecionado do grupo que compreende glicolípídeos e glicoproteínas.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o composto de interesse ser uma glicoproteína selecionada a partir do grupo de glicoproteínas compreendendo anticorpos, fatores de crescimento, citoquinas, hormonas e fatores de coagulação.

10. Método para produzir um reagente de cultura de células que exibe um perfil de epítopo alterado, caracterizado pelo fato de que compreende isolar o dito reagente de cultura de células de um porco geneticamente modificado compreendendo um gene α(1,3) galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 interrompido no genoma nuclear de uma pluralidade de células do dito porco, e em que a expressão de α(1,3)- galactosiltransferase, CMAH e β4GalNT2 no dito porco geneticamente modificado é reduzida em comparação a um porco do tipo selvagem.