ES2338111T3 - Animales porcinos que carecen de cualquier expresion de alfa 1,3 galactosiltransferasa funcional. - Google Patents
Animales porcinos que carecen de cualquier expresion de alfa 1,3 galactosiltransferasa funcional. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2338111T3 ES2338111T3 ES03786504T ES03786504T ES2338111T3 ES 2338111 T3 ES2338111 T3 ES 2338111T3 ES 03786504 T ES03786504 T ES 03786504T ES 03786504 T ES03786504 T ES 03786504T ES 2338111 T3 ES2338111 T3 ES 2338111T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- alpha
- gene
- cell
- allele
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
- A01K67/027—New breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knockout animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/108—Swine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
- A01K2267/025—Animal producing cells or organs for transplantation
Abstract
Un cerdo en el que ambos alelos del gen de la alfa-1,3-GT son inactivos, donde un alelo se vuelve inactivo a través de al menos una mutación puntual.
Description
Animales porcinos que carecen de cualquier
expresión de alfa 1,3 galactosiltransferasa funcional.
Esta solicitud reivindica prioridad a la
solicitud de patente provisional de Estados Unidos Nº 60/404.775
presentada el 21 de agosto de 2002.
La presente invención son animales, tejidos y
órganos porcinos así como células y líneas celulares obtenidas de
dichos animales, tejidos y órganos, que carecen de cualquier
expresión de alfa 1,3 galactosiltransferasa (alfa1,3GT) funcional.
Dichos animales, tejidos, órganos y células pueden usarse en
investigación y en terapia médica, incluyendo en
xenotransplante.
\vskip1.000000\baselineskip
Los pacientes con fallo orgánico en fase final
requieren el transplante de órganos para su supervivencia. El
factor limitante principal en el transplante clínico es la escasez
de donantes humanos adecuados. A lo largo de los últimos diez años
ha aumentado drásticamente la lista de espera de pacientes para
órganos, desde aproximadamente 30.000 en 1991 hasta aproximadamente
80.000 en 2001 (fuente: La Red de Donantes de Órganos de Nueva York
(New York Organ Donor Network); Estudio de Revisión del Registro de
Muertes de la Asociación de Organizaciones para la Recuperación de
Órganos (Association of Organ Procurement Organizations' Death
Record Review Study) de 1997 a 1999, proporcionado por 30
organizaciones para la recuperación de órganos). A pesar de esta
creciente necesidad a los largo de los últimos diez años, la
cantidad de donaciones de órganos se ha mantenido fija
(aproximadamente 20.000 por año).
De acuerdo con la Red Internacional de
Distribución de Órganos (United Network for Organ Sharing) (UNOS)
con fecha de 17 de julio de 2003, había 82.249 pacientes esperando
transplantes de órganos en los Estados Unidos. La necesidad de
órganos específicos es la siguiente:
En todo Estados Unidos, un promedio de 17
hombres, mujeres y niños de todas las razas y trasfondos étnicos
mueren cada día por la ausencia de órganos donados, por tanto, cada
año, mueren más de 6.200 americanos esperando un transplante de
órgano. La necesidad de una fuente más fiable e ilimitada de órganos
ha conducido a la investigación del potencial para transplante de
órganos de otros animales, llamado xenotransplante.
Los cerdos se consideran la fuente más probable
de órganos para xenoinjerto. El suministro de cerdos es abundante,
los programas de reproducción están bien establecidos, y su tamaño y
fisiología son compatibles con seres humanos. El xenotransplante,
sin embrago, presenta su propia serie de problemas. El más
significativo es el rechazo inmune. El primer obstáculo
inmunológico es el "rechazo hiperagudo" (HAR). El HAR puede
definirse por la presencia ubicua de elevados títulos de
anticuerpos naturales preformados que se unen al tejido foráneo. Se
cree que la unión de estos anticuerpos naturales a epítopos diana en
el endotelio del órgano donante es el acontecimiento inicial en el
HAR. Esta unión, en minutos desde la perfusión del órgano donante
con la sangre del receptor, está seguido de activación del
complemento, deposición de plaquetas y fibrina, y finalmente por
edema intersticial y hemorragia en el órgano donante, todo lo cual
causa fallo del órgano en el receptor (Strahan et al. (1996)
Frontiers in Bioscience 1,
e34-41).
e34-41).
Excepto para los monos del viejo mundo, los
simios y los seres humanos, la mayoría de los mamíferos portan
glucoproteínas en sus superficies celulares que contienen galactosa
alfa 1,3-galactosa (Galili et al., J. Biol.
Chem. 263: 17755-17762, 1988). Los seres humanos,
los simios y los monos del viejo mundo tienen un anticuerpo
anti-alfa gal de origen natural que se produce en
elevada cantidad (Cooper et al., Lancet 342:
682-683, 1993). Se une específicamente a
glucoproteínas y glucolípidos que albergan galactosa
alfa-1,3 galactosa.
En contraste, se encuentran glucoproteínas que
contienen galactosa alfa 1,3-galactosa en grandes
cantidades en células de otros mamíferos, tales como cerdos. Esta
distribución diferencial del "epítopo alfa-1,3
GT" y anticuerpos anti-Gal (es decir,
anticuerpos que se unen a glucoproteínas y glucolípidos que albergan
galactosa alfa-1,3 galactosa) en mamíferos es el
resultado de un proceso evolutivo que seleccionaba especies con
alfa-1,3-galactosiltransferasa
inactivada (es decir, mutada) en primates ancestrales del viejo
mundo y seres humanos. Por tanto, los seres humanos son "knockout
naturales" de alfa1,3GT. Una consecuencia directa de este
acontecimiento es el rechazo de xenoinjertos, tal como el rechazo
de órganos de cerdo transplantados en seres humanos inicialmente
mediante
HAR.
HAR.
Se ha llevado a cabo una diversidad de
estrategias para eliminar o modular la respuesta humoral
anti-Gal causada por xenotransplante porcino,
incluyendo la eliminación enzimática del epítopo con
alfa-galactosidasas (Stone et al.,
Transplantation 63: 640-645, 1997), eliminación del
anticuerpo anti-gal específico (Ye et al.,
Transplantation 58: 330-337,1994), recubriendo el
epítopo con otros restos de carbohidrato, que no lograron eliminar
la expresión de alfa-1,3-GT
(Tanemura et al., J. Biol. Chem. 27321:
16421-16425, 1998 y Koike et al.,
Xenotransplantation 4: 147-153, 1997) y la
introducción de proteínas inhibidoras del complemento (Dalmasso
et al., Clin. Exp. Immunol. 86: 31-35, 1991,
Dalmasso et al. Transplantation 52:530-533
(1991)). C. Costa et al. (FASEB J 13, 1762 (1999))
informaron de que la inhibición competitiva de
alfa-1,3-GT en cerdos transgénicos
para la H-transferasa provocaba una reducción
solamente parcial en las cantidades de epítopos. Asimismo, S.
Miyagawa et al. (J Biol. Chem 276, 39310 (2001)) informaron
de que intentos de bloquear la expresión de epítopos gal en cerdos
transgénicos para la
N-acetilglucosaminiltransferasa III también
provocaron una reducción solamente parcial de las cantidades de
epítopos gal y no lograron prolongar significativamente la
supervivencia del transplante en receptores primates.
Se ha informado de knockouts de un único alelo
del locus alfa-1,3-GT en células
porcinas y animales vivos. Denning et al. (Nature
Biotechnology 19: 559-562, 2001) informaron de la
deleción génica dirigida de un alelo del gen de la
alfa-1,3-GT en ovejas. Harrison
et al. (Transgenics Research 11: 143-150,
2002) informaron de la producción de células fibroblásticas fetales
porcinas somáticas knockout heterocigóticas para
alfa-1,3-GT. En 2002, Lai et
al. (Science 295: 1089-1092, 2002) y Dai et
al. (Nature Biotechnology 20: 251-255, 2002)
informaron de la producción de cerdos, en los que un alelo del gen
de la alfa-1,3-GT se volvió
satisfactoriamente inactivo. Ramsoondar et al. (Biol of
Reproduc 69, 437-445 (2003)) informaron de la
generación de cerdos knockout heterocigóticos para
alfa-1,3-GT que también expresan la
alfa-1,2-fucosiltransferase humana
(HT), que expresaban los epítopos tanto HT como
alfa-1,3-GT.
La publicación PCT Nº WO 94/21799 y la patente
de Estados Unidos Nº 5.821.117 del Austin Research Institute; la
publicación PCT Nº WO 95/20661 de Bresatec; y la publicación PCT Nº
WO 95/28412, la patente de Estados Unidos Nº 6.153.428, la patente
de Estados Unidos Nº 6.413.769 y la publicación de Estados Unidos Nº
2003/0014770 de BioTransplant, Inc. y The General Hospital
Corporation proporcionan un análisis de la producción de células
porcinas alfa-1,3-GT negativas en
base al conocimiento del ADNc del gen de la
alfa-1,3-GT (y sin el conocimiento
de la organización o secuencia genómica). Sin embargo, no había
evidencias de que dichas células realmente se produjeran antes de
la fecha de presentación de estas solicitudes y los ejemplos son
todos proféticos.
La primera descripción pública de la producción
satisfactoria de una célula porcina
alfa-1,3-GT negativa heterocigótica
sucedió en julio de 1999 en la Lake Tahoe Transgenic Animal
Conference (David Ayares, et al., PPL Therapeutics, Inc.).
Antes de la presente invención, nadie había publicado o descrito
públicamente la producción de una célula porcina alfa 1,3GT
negativa homocigótica. Además, como no han estado disponibles hasta
la fecha células madre embrionarias porcinas, no había y aún no hay
modo de usar una célula madre embrionaria homocigótica para
alfa-1,3-GT para intentar preparar
un cerdo knockout para alfa-1,3-GT
homocigótico vivo.
El 27 de febrero de 2003, Sharma et al.
(Transplantation 75:430-436 (2003)) publicaron un
informe que demuestra una producción satisfactoria de células
fibroblásticas de cerdo fetales homocigóticas para la eliminación
del gen de la alfa-1,3-GT.
La publicación PCT Nº WO 00/51424 de PPL
Therapeutics describe la modificación genética de células somáticas
para transferencia nuclear. Esta solicitud de patente describe la
alteración genética del gen de la
alfa-1,3-GT en células somáticas
porcinas, y el posterior uso del núcleo de estas células que carecen
de al menos una copia del gen de la
alfa-1,3-GT para transferencia
nuclear.
La patente de Estados Unidos Nº 6.331.658 de
Cooper y Koren reivindica pero no confirma ninguna producción real
de mamíferos diseñados por ingeniería genética que expresen una
proteína sialiltransferasa o fucosiltransferasa. La patente afirma
que los mamíferos diseñados por ingeniería genética mostrarían una
reducción de epítopos proteicos galactosilados sobre la superficie
celular del mamífero.
La publicación PCT Nº WO 03/055302 de The
Curators of the University of Missouri confirma la producción de
cerdos miniatura knockout para alfa 1,3GT heterocigóticos para su
uso en xenotransplante. Esta solicitud está dirigida en líneas
general a cerdos knockout que incluyen un gen de la
alfa-1,3-GT alterado, donde la
expresión de alfa-1,3-GT funcional
en los cerdos knockout está disminuida en comparación con el
tipo silvestre. Esta solicitud no proporciona ninguna directriz en
cuanto a qué grado debe disminuirse la
alfa-1,3-GT de modo que los cerdos
sean útiles para xenotransplante. Además, esta solicitud no
proporciona ninguna prueba de que los cerdos heterocigóticos que se
estaban produciendo mostraran una expresión disminuida de alfa1,3GT
funcional. Además, aunque la solicitud se refiere a cerdos knockout
para alfa 1,3GT homocigóticos, no hay evidencias en la solicitud de
que realmente se estuviera produciendo alguno o se pudiera producir,
mucho menos si la descendencia resultante sería viable o
fenotípicamente útil para xenotransplante.
La eliminación total de las glucoproteínas que
contienen galactosa alfa 1,3-galactosa es
claramente el mejor enfoque para la producción de animales porcinos
para xenotransplante. Teóricamente es posible que knockout dobles,
o la alteración de ambas copias del gen de la alfa 1,3GT, pudiera
producirse por dos métodos: 1) apareamiento de dos animales
knockout de un único alelo para producir descendientes, en cuyo
caso, se pronosticaría en base a la genética mendeliana que uno de
cada cuatro sería knockout doble o 2) modificación genética del
segundo alelo en una célula con una única eliminación
pre-existente. De hecho, esto ha sido basta difícil,
como se ilustra por el hecho de que aunque la primera solicitud de
patente de células porcinas knockout se presentó en 1993, el primer
cerdo knockout para alfa 1,3GT homocigótico no se produjo hasta
julio de 2002 (que se basó en el trabajo del presente inventor y se
describe en este documento).
Los ratones transgénicos (no cerdos) han sido
históricamente el modelo preferido para estudiar los efectos de
modificaciones genéticas sobre la fisiología de los mamíferos, por
varias razones, de las cuales que hayan estado disponibles células
madre embrionarias de ratón mientras que las células embrionarias
porcinas no han estado disponibles no es la mínima. Los ratones son
animales ideales para aplicaciones de investigación básica porque
son relativamente fáciles de manipular, se reproducen rápidamente, y
pueden manipularse genéticamente a nivel molecular. Los científicos
usan los modelos de ratón para estudiar las patologías moleculares
de una diversidad de enfermedades basadas genéticamente, desde
cáncer de colon hasta retraso mental. Se han creado miles de
ratones modificados genéticamente hasta la fecha. Se ha creado una
"base de datos de knockout y mutación en el ratón" (Mouse
Knockout and Mutation Database) por BioMedNet para proporcionar una
base de datos extensa de información fenotípica y genotípica sobre
knockouts y mutaciones clásicas en ratones
(http://research.bmn.com/mkmd; Brandon et al. Current
Biology 5[7]: 758-765(1995); Brandon
et al. Current Biology 5[8]: 873-881
(1995)), esta base de datos proporciona información sobre más de
3.000 genes únicos, que se han modificado de forma dirigida en el
genoma del ratón hasta la fecha.
En base a esta experiencia extensiva con
ratones, se ha aprendido que la tecnología transgénica tiene algunas
limitaciones significativas. A causa de los defectos en el
desarrollo, muchos ratones modificados genéticamente, especialmente
ratones nulos creados por tecnología de eliminación (knockout) de
genes mueren como embriones antes de que el investigador tenga
oportunidad de usar el modelo para experimentación. Incluso si los
ratones sobreviven, pueden desarrollar fenotipos significativamente
alterados, que pueden volverlos gravemente discapacitados,
deformados o debilitados (Pray, Leslie, The Scientist 16[13]:
34 (2002); Smith, The Scientist 14[15]: 32, (2000); Brandon
et al. Current Biology 5[6]: 625-634
(1995); Brandon et al. Current Biology 5[7]:
758-765 (1995); Brandon et al. Current
Biology 5[8]: 873-881 (1995);
http://research.bmn.com/mkmd) Además, se ha aprendido que no
es posible predecir si un gen dado desempeña o no un papel crítico
en el desarrollo del organismo y, por tanto, si la eliminación del
gen provocará un fenotipo letal o alterado, hasta que se haya creado
satisfactoriamente el knockout y se haya producido descendencia
viable.
Se han modificado genéticamente ratones para
eliminar la expresión de alfa-1,3-GT
funcional. Se han producido ratones knockout dobles para
alfa-1,3-GT. Son viables
embriológicamente y tiene órganos normales (Thall et al. J
Biol Chem 270: 21437-40 (1995); Tearle et al.
Transplantation 61: 13-19 (1996), véase también la
patente de Estados Unidos Nº 5.849.991). Sin embargo, fueron
evidentes dos anormalidades fenotípicas en estos ratones. Primero,
todos los ratones desarrollan cataratas corticales densas. Segundo,
la eliminación de ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT afectaba
significativamente al desarrollo de los ratones. El apareamiento de
ratones heterocigóticos para el gen de la
alfa-1,3-GT produjo proporciones
genotípicas que se desviaron significativamente de la proporción
mendeliana 1:2:1 predicha (Tearle et al. Transplantation 61:
13-19 (1996)).
Los cerdos tienen un nivel de glucoproteínas de
superficie celular que contienen galactosa alfa
1,3-galactosa que es 100-1000 veces
mayor que el encontrado en ratones. (Sharma et al.
Transplantation 75: 430-436 (2003); Galili et
al. Transplantation 69: 187-190 (2000)). Por
tanto, la actividad alfa 1,3-GT es más crítica y más
abundante en el cerdo que en el ratón.
A pesar de las predicciones y las afirmaciones
proféticas, antes de esta invención, nadie sabía si la alteración
de ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT sería letal o afectaría
al desarrollo porcino o provocaría un fenotipo alterado (Ayares
et al. Graft 4(1)80-85 (2001);
Sharma et al. Transplantation 75: 430-436
(2003); Porter y Dallman Transplantation 64:
1227-1235 (1997); Galili, U. Biochimie 83:
557-563 (2001)). De hecho, muchos expertos en el
campo expresaron serias dudas acerca de si cerdos knockout para
alfa-1,3-GT homocigóticos serían del
todo viables, mucho menos si se desarrollarían normalmente. Dichas
preocupaciones se expresaron hasta que se produjo el cerdo knockout
doble de la presente invención. A continuación se incluyen ejemplos
de afirmaciones por los que actualmente trabajan en el campo.
"El epítopo alfa-gal expresado
abundantemente puede tener algunos papeles biológicos en el
desarrollo del cerdo, tales como en la interacción
célula-célula. Si la suposición es correcta, puede
que los cerdos no se desarrollen en ausencia de este epítopo
(Galili, U. Biochimie 83: 557-563 (2001)".
"La incapacidad de generar cerdos knockout
para alfa-gal puede sugerir que los epítopos
alfa-gal son indispensables en esta especie (Galili
et al. Transplantation 69: 187-190
(2000))".
"Aunque los ratones knockout doble para
alfa-gal pueden desarrollarse y mantenerse bastante
normales, existe la posibilidad de que la deleción de esta enzima
tenga consecuencias más graves en otros animales (Porter y Dallman
Transplantation 64: 1227-1235 (1997))".
"Es posible que el cerdo GT(-/-) pueda no ser
viable a causa de que el gen GT es esencial para el desarrollo
embrionario. Una respuesta a esta cuestión y a la relevancia de
cerdos GT(-/-) para la búsqueda de xenotransplantes debe esperar,
si es posible, a la producción de los cerdos apropiados (Sharma
et al. Transplantation 75: 430-436
(2003))".
"Como la expresión del epítopo Gal en los
órganos del cerdo es hasta 500 veces mayor que en los órganos del
ratón, existe la posibilidad de que la actividad alfaGT sea más
crucial para el cerdo y podría afectar al desarrollo de estos
cerdos (Ayares et al. Graft
4(1)80-85 (2001))".
Por tanto, hasta que no se produzca un cerdo
knockout doble para la alfa-1,3-GT
viable, de acuerdo con los especialistas en la técnica actuales, no
será posible determinar (i) si la descendencia sería viable o (ii)
si la descendencia presentaría un fenotipo que permita el uso de los
órganos para el transplante en seres humanos.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención
es proporcionar cerdos viables que carezcan de cualquier expresión
de alfa1,3GT funcional.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar células, tejidos y órganos porcinos, que carezcan de
cualquier expresión de alfa1,3GT funcional, para su uso en
xenotransplante u otras aplicaciones biomédicas.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar un método para seleccionar y detectar células
porcinas, que carezcan de los epítopes galactosa alfa
1,3-galactosa sobre la superficie celular.
La invención proporciona un cerdo en el que
ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT son inactivos, donde un
alelo se vuelve inactivo a través de al menos una mutación
puntual.
Esta invención es la producción de los primeros
cerdos vivos que carecen de cualquier expresión funcional de alfa
1,3 galactosiltransferasa. El objeto de esta invención se anunció a
página completa en la revista Science en 2003 (Phelps et al.
(Science 299:411-414 (2003)) y se presentó
ampliamente en la prensa como un gran avance en
xenotransplante.
Se ha demostrado por primera vez que puede
producirse un animal porcino viable que carece de cualquier
expresión de alfa 1,3 galactosiltransferasa funcional. La presente
invención proporciona la inactivación completa de ambos alelos del
gen de la alfa 1,3 galactosiltransferasa en cerdos, superando de
este modo este antiguo obstáculo y haciendo del xenotransplante una
realidad. La eliminación de este gen, que provoca la ausencia de
epítopos galactosa alfa 1,3-galactosa sobre la
superficie celular, representa la etapa primera y principal en la
eliminación del rechazo hiperagudo en terapia de xenotransplante
cerdo-a-ser humano. La invención
también proporciona órganos, tejidos, y células obtenidos de dichos
animales porcinos, que son útiles para xenotransplante.
En realizaciones de la presente invención, los
alelos del gen de la alfa-1,3-GT se
vuelven inactivos, donde un alelo se vuelve inactivo a través de al
menos una mutación puntual, de modo que la enzima
alfa-1,3-GT resultante ya no puede
generar galactosa alfa 1,3-galactosa sobre la
superficie celular. En una realización, el gen de la
alfa-1,3-GT puede transcribirse en
ARN, pero no puede traducirse en proteína. En otra realización, el
gen de la alfa-1,3-GT puede
transcribirse en una forma truncada inactiva. Dicho ARN truncado
puede no traducirse o puede traducirse en una proteína no
funcional. En una realización alternativa, el gen de la
alfa-1,3-GT puede inactivarse de
tal modo que no suceda transcripción del gen. En una realización
adicional, el gen de la alfa-1,3-GT
puede transcribirse y después traducirse en una proteína no
funcional.
Los cerdos que carecen de cualquier expresión de
alfa-1,3-GT funcional son útiles
para proporcionar una evaluación más clara de los enfoques
actualmente en desarrollo enfocados a superar los mecanismos de
rechazo retardado y crónico potenciales en xenotransplante
porcino.
Al menos un alelo del gen de la
alfa-1,3-GT puede inactivarse
mediante un acontecimiento de modificación genética dirigida. En
otra realización de la presente invención, ambos alelos del gen de
la alfa-1,3-GT se inactivan
mediante un acontecimiento de modificación genética dirigida. El gen
puede modificarse de forma dirigida mediante recombinación
homóloga. En otras realizaciones, el gen puede alterarse, es decir,
puede alterarse una parte del código genético, afectando de este
modo a la transcripción y/o traducción de ese segmento del gen. Por
ejemplo, puede suceder una alteración de un gen a través de técnicas
de sustitución, deleción ("knockout") o inserción
("knockin"). Pueden insertarse genes adicionales para una
proteína deseada o una secuencia reguladora que module la
transcripción de una secuencia existente.
Los cerdos que tienen dos alelos inactivos del
gen de la alfa-1,3-GT no son de
origen natural. La frecuencia predicha de incidencia de dicho cerdo
estaría en el intervalo de 10^{-10} a 10^{-12}, y nunca se ha
identificado.
Sorprendentemente se descubrió que mientras se
intentaba eliminar el segundo alelo del gen de la
alfa-1,3-GT a través de un
acontecimiento de modificación genética dirigida, se identificó una
mutación puntual, que volvía al segundo alelo inactivo. Los cerdos
que portan mutaciones puntuales en el gen de la
alfa-1,3-GT están libres de genes
de resistencia a antibióticos y por tanto tienen el potencial de
crear un producto más seguro para uso humano. Por tanto, el cerdo
de la invención puede ser un knockout homocigótico para
alfa-1,3-GT que no tiene genes de
resistencia a antibióticos u otros genes marcadores de selección. En
una realización, esta mutación puntual puede suceder mediante un
acontecimiento de modificación genética dirigida. En otra
realización, esta mutación puntual puede suceder de forma natural.
En una realización adicional, pueden inducirse mutaciones en el gen
de la alfa-1,3-GT mediante un agente
mutagénico.
En una realización específica, la mutación
puntual puede ser una mutación T-a-G
en la segunda base del exón 9 del gen de la
alfa-1,3-GT (Figura 2). En otras
realizaciones, pueden existir al menos dos, al menos tres, al menos
cuatro, al menos cinco, al menos diez o al menos veinte mutaciones
puntuales para volver al gen de la
alfa-1,3-GT inactivo. En otras
realizaciones, se proporcionan cerdos en los que ambos alelos del
gen de la alfa-1,3-GT contienen
mutaciones puntuales que evitan cualquier expresión de alfa1,3GT
funcional. En una realización específica, se proporcionan cerdos
que contienen la mutación T-a-G en
la segunda base del exón 9 en ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT
(Figura 2).
(Figura 2).
Otra realización de la presente invención
proporciona un animal porcino, en el que ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT están inactivados, por
la cual se inactiva un alelo mediante una mutación puntual. En una
realización, se proporciona un animal porcino, en el que ambos
alelos del gen de la alfa-1,3-GT
están inactivados, por la cual se inactiva un alelo por un
acontecimiento de modificación genética dirigida y el otro alelo se
inactiva debido a la presencia de una mutación puntual
T-a-G en la segunda base del exón 9.
En una realización específica, se proporciona un animal porcino, en
el que ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT están inactivados, por
la cual se inactiva un alelo mediante una construcción de
modificación dirigida al Exón 9 (véase, por ejemplo, la Figura 6) y
el otro alelo se inactiva debido a la presencia de una mutación
puntual T-a-G en la segunda base
del exón 9 (Figura 2). La modificación dirigida, por ejemplo,
también puede dirigirse al exón 9, y/o los exones
4-8.
En una realización adicional, un alelo se
inactiva por un acontecimiento de modificación genética dirigida y
el otro alelo se inactiva debido a la presencia de una mutación
puntual T-a-G en la segunda base del
exón 9 del gen de la alfa-1,3-GT.
En una realización específica, un alelo se inactiva mediante una
construcción de modificación dirigida al Exón 9 (véase, por
ejemplo, la Figura 6) y el otro alelo se inactiva debido a la
presencia de una mutación puntual
T-a-G en la segunda base del exón 9
del gen de la alfa-1,3-GT. Un método
para clonar dichos cerdos incluye: enuclear un ovocito no humano,
fusionar el ovocito con un núcleo donante de una célula porcina que
carece de expresión de alfa1,3GT funcional, e implantar el embrión
obtenido por transferencia nuclear en una madre no humana
sustituta. En otro aspecto, la invención proporciona un método para
producir un animal no humano deficiente en
alfa-1,3-GT que comprende las etapas
enumeradas en la reivindicación 24.
Un método para producir cerdos viables que
carezcan de cualquier expresión de
alfa-1,3-GT funcional puede incluir
cruzar un cerdo macho heterocigótico para el gen de la
alfa-1,3-GT con un cerdo hembra
heterocigótico para el gen de la
alfa-1,3-GT. Los cerdos pueden ser
heterocigóticos debido a la modificación genética de un alelo del
gen de la alfa-1,3-GT para evitar la
expresión de ese alelo. Los cerdos pueden ser heterocigóticos
debido a la presencia de una mutación puntual en un alelo del gen de
la alfa-1,3-GT. La mutación puntual
puede ser una mutación puntual
T-a-G en la segunda base del exón 9
del gen de la alfa-1,3-GT. Un método
para producir un animal porcino que carezca de cualquier expresión
de alfa-1,3-GT funcional puede
incluir cruzar un cerdo macho que contiene una mutación puntual
T-a-G en la segunda base del exón 9
del gen de la alfa-1,3-GT con un
cerdo hembra que contiene una mutación puntual
T-a-G en la segunda base del exón 9
del gen de la alfa-1,3-GT, o
viceversa.
En otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un método para seleccionar células que carecen de la
expresión de galactosa alfa-1,3 galactosa, como se
relata en la reivindicación 17. El método de selección puede usarse
para determinar si células porcinas expresan galactosa
alfa-1,3 galactosa sobre la superficie celular. Se
usa la toxina bacteriana, toxina A producida por Clostridium
difficile, para seleccionar células que carecen de la expresión
de galactosa alfa-1,3-galactosa.
La exposición a la toxina de C. difficile
puede causar el redondeo de las células que muestran este epítopo
sobre su superficie, liberando las células de la matriz de la placa.
Tanto las eliminaciones génicas por modificación dirigida como las
mutaciones que inutilizan la función o la expresión de la enzima
pueden detectarse usando este método de selección. Las células que
carecen de expresión en la superficie celular de la galactosa alfa
1,3-galactosa, identificadas usando la selección
mediada por toxina A descrita, o producidas usando métodos
convencionales de inactivación génica incluyendo modificación génica
dirigida, pueden usarse después para producir cerdos que carezcan
de la expresión de alfa1,3GT funcional.
Otras realizaciones de la presente invención
serán evidentes para los especialistas en la técnica a la luz de la
siguiente descripción de la invención, las reivindicaciones y lo que
se sabe en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 es un gráfico que representa los
efectos líticos relativos del complemento sobre células de
fetos
680B1-4.
680B1-4.
La Figura 2 representa un corto segmento de la
región codificante del gen de la
alfa-1,3-GT (véase el Nº de acceso
a GenBank L36152) en el que existe la mutación puntual seleccionada
por la toxina A. La secuencia superior existe en el tipo silvestre;
la secuencia inferior muestra el cambio debido a la mutación puntual
en el segundo
alelo.
alelo.
La Figura 3 es una representación de un modelo
tridimensional del sitio de unión a UDP de la alfa1,3GT bovina. El
anillo aromático del resto de tirosina (primer plano, blanco) puede
observarse muy cerca de la base de uracilo del UDP (escala de
grises).
La Figura 4 es una fotografía de cerdos clonados
deficientes en alfa-1,3-GT
homocigóticos producidos por los métodos de la invención, nacidos
el 25 de julio de 2002.
La Figura 5 es un gráfico que representa los
niveles de IgM
anti-alfa-1,3-gal
antes y después de inyecciones de grupos celulares tipo islote
(ICC) de lechones en ratones
alfa-1,3-GT KO. Cada ratón recibió
tres inyecciones en serie de ICC vía i.p. (200-500
ICC por inyección) durante 4 días. Los tres receptores de ICC de
lechón tipo silvestre (WT) mostraron una elevación significativa
del título de IgM anti-alfa 1,3 gal y posterior
retorno a la medida inicial 4 semanas después de los implantes de
ICC. Los sueros de los tres ratones inyectados con ICC de lechón
alfa-1,3-GT DKO mantuvieron valores
basales bajos de título de IgM
anti-alfa-1,3-gal
durante el tiempo de observación de 35 días (Phelps et al.,
Science 299: 411-414, 2003, figura S4).
La Figura 6 es un diagrama del locus
alfa-1,3-GT porcino, correspondiente
a las secuencias genóminas de
alfa-1,3-GT que pueden usarse como
brazos 5' y 3' en vectores knockout de
alfa-1,3-GT, y la estructura del
locus modificado de forma dirigida después de recombinación
homóloga. Los nombres y las posiciones de los cebadores usados para
la PCR 3' y la PCR de largo alcance se indican por flechas cortas.
La barra corta indica la sonda usada para el análisis de
transferencia de Southern de
alfa-1,3-GT. También se indica el
tamaño predicho de las bandas de Southern con digestión con BstEII
tanto para el locus alfa-1,3-GT
endógeno como para el locus
alfa-1,3-GT modificado de forma
dirigida.
\vskip1.000000\baselineskip
Ahora se ha demostrado que puede producirse un
animal porcino viable que carece de cualquier expresión de alfa 1,3
galactosiltransferasa funcional. La presente invención proporciona
la inactivación completa de ambos alelos del gen de la alfa 1,3
galactosiltransferasa en cerdos, superando de este modo este antiguo
obstáculo y haciendo del xenotransplante una realidad. Eliminar la
expresión de este gen, que provoca la ausencia de galactosa alfa
1,3-galactosa sobre la superficie celular,
representa la etapa primera y principal en la eliminación del
rechazo hiperagudo en terapia de xenotransplante
cerdo-a-ser humano. La invención
también proporciona órganos, tejidos, y células obtenidos de dicho
animal porcino, que son útiles para xenotransplante.
En un aspecto, la invención proporciona órganos,
tejidos y/o células o líneas celulares purificadas o sustancialmente
puras porcinos obtenidos de cerdos que carecen de cualquier
expresión de alfa-1,3-GT funcional
donde ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT son inactivos, y donde
un alelo se vuelve inactivo a través de al menos una mutación
puntual. Los órganos, tejidos, células o líneas celulares pueden ser
útiles para xenotransplante.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se usa en este documento, se entiende que
el término "animal" (como en "animal modificado (o alterado)
genéticamente") incluye cualquier animal no humano,
particularmente cualquier mamífero no humano, incluyendo, aunque
sin limitación, cerdos, ovejas, cabras, ganado vacuno (bovino),
ciervos, mulas, caballos, monos, perros, gatos, ratas, ratones,
pájaros, pollos, reptiles, peces, e insectos. En una realización de
la invención, se proporcionan cerdos alterados genéticamente y
métodos de producción de los mismos.
Como se usa en este documento, un "órgano"
es una estructura organizada, que puede estar compuesta por uno o
más tejidos. Un "órgano" realiza una o más funciones biológicas
específicas. Los órganos incluyen, sin limitación, el corazón, el
hígado, el riñón, el páncreas, el pulmón, la tiroides, y la
piel.
Como se usa en este documento, un "tejido"
es una estructura organizada que comprende células y las sustancias
intracelulares que las rodean. El "tejido", solo o junto con
otras células o tejidos pueden realizar una o más funciones
biológicas.
Como se usa en este documento, los términos
"porcino", "animal porcino", "cerdo" y "puerco"
son términos genéricos que se refieren al mismo tipo de animal
independientemente del género, tamaño, o estirpe.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona un cerdo como se
menciona en la reivindicación 1.
En una realización de la presente invención, se
proporcionan animales porcinos en los que ambos alelos del gen de
la alfa-1,3-GT son inactivos, y en
los que un alelo se vuelve inactivo a través de al menos una
mutación puntual y en los que un alelo del gen de la
alfa-1,3-GT se inactiva mediante un
acontecimiento de modificación genética dirigida. En otra
realización de la presente invención, ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT se inactivan mediante
un acontecimiento de modificación genética dirigida. En una
realización, el gen puede modificarse de forma dirigida mediante
recombinación homóloga. En otras realizaciones, el gen puede
alterarse, es decir, puede alterarse una parte del código genético,
afectando de este modo a la transcripción y/o traducción de ese
segmento del gen. Por ejemplo, la alteración de un gen puede suceder
a través de técnicas de sustitución, deleción ("knockout") o
inserción ("knockin"). Pueden insertarse genes adicionales para
una proteína deseada o secuencia reguladora que module la
transcripción de una secuencia existente.
En realizaciones de la presente invención, los
alelos del gen de la alfa-1,3-GT se
vuelven inactivos, de modo que la enzima
alfa-1,3-GT resultante ya no pueda
generar galactosa alfa1, 3-galactosa sobre la
superficie celular. En una realización, el gen de la
alfa-1,3-GT puede transcribirse en
ARN, pero no puede traducirse en proteína. En otra realización, el
gen de la alfa-1,3-GT puede
transcribirse en una forma truncada. Dicho ARN truncado puede no
traducirse o puede traducirse en una proteína no funcional. En una
realización alternativa, el gen de la
alfa-1,3-GT puede inactivarse de tal
modo que no suceda transcripción del gen. En una realización
adicional, el gen de la alfa-1,3-GT
puede transcribirse y después traducirse en una proteína no
funcional.
Los cerdos que tienen dos alelos inactivos del
gen de la alfa-1,3-GT no son de
origen natural. Se descubrió sorprendentemente que mientras se
intentaba eliminar el segundo alelo del gen de la
alfa-1,3-GT a través de un
acontecimiento de modificación genética dirigida, se identificó una
mutación puntual, que evitaba que el segundo alelo produjera
alfa1,3GT funcional.
Un alelo del gen de la
alfa-1,3-GT se vuelve inactivo a
través de al menos una mutación puntual. En otra realización, ambos
alelos del gen de la alfa-1,3-GT
pueden volverse inactivos, a través de al menos una mutación
puntual. En una realización, esta mutación puntual puede suceder
mediante un acontecimiento de modificación genética dirigida. En
otra realización, esta mutación puntual puede ser de origen natural.
En una realización adicional, pueden inducirse mutaciones en el gen
de la alfa-1,3-GT mediante un agente
mutagénico.
En una realización específica, la mutación
puntual puede ser una mutación T-a-G
en la segunda base del exón 9 del gen de la
alfa-1,3-GT (Figura 2). Los cerdos
que portan una mutación puntual de origen natural en el gen de la
alfa-1,3-GT permiten la producción
de cerdos deficientes en alfa1,3GT libres de genes de resistencia a
antibióticos y por tanto tienen el potencial de crear un producto
más seguro para uso humano. En otras realizaciones, pueden existir
al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al
menos diez o al menos veinte mutaciones puntuales para volver al
gen de la alfa-1,3-GT inactivo. En
otras realizaciones, se proporcionan cerdos en los que ambos alelos
del gen de la alfa-1,3-GT contienen
mutaciones puntuales que evitan cualquier expresión de alfa1,3GT
funcional. En una realización específica, se proporcionan cerdos que
contienen la mutación T-a-G en la
segunda base del exón 9 en ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT (Figura 2).
Otra realización de la presente invención
proporciona un animal porcino, en el que ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT se inactivan, por lo
cual un alelo se inactiva por un acontecimiento de modificación
genética dirigida y el otro alelo se inactiva mediante una mutación
puntual. En una realización, se proporciona un animal porcino, en
el que ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT se inactivan, por lo
cual un alelo se inactiva por un acontecimiento de modificación
genética dirigida y el otro alelo se inactiva debido a la presencia
de una mutación puntual T-a-G en la
segunda base del exón 9. En una realización específica, se
proporciona un animal porcino, en el que ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT se inactivan, por lo
cual un alelo se inactiva mediante una construcción de modificación
dirigida al Exón 9 (véase, por ejemplo, la Figura 6) y el otro
alelo se inactiva debido a la presencia de una mutación puntual
T-a-G en la segunda base del exón
9.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células porcinas que pueden modificarse
genéticamente pueden obtenerse de una diversidad de diferentes
órganos y tejidos tales como, aunque sin limitación, piel,
mesénquima, pulmón, páncreas, corazón, intestino, estómago, vejiga,
vasos sanguíneos, riñón, uretra, órganos reproductores, y una
preparación disgregada de un embrión, feto o animal adulto completo
o una parte del mismo. Por ejemplo, las células porcinas pueden
seleccionarse entre el grupo compuesto por, aunque sin limitación,
células epiteliales, células fibroblásticas, células neurales,
queratinocitos, células hematopoyéticas, melanocitos, condrocitos,
linfocitos (B y T), macrófagos, monocitos, células mononucleares,
células de músculo cardiaco, otras células musculares, células de la
granulosa, células del cumulus, células epidérmicas, células
endoteliales, células de los islotes de Langerhans, células
sanguíneas, células precursoras sanguíneas, células óseas, células
precursoras óseas, células madre neuronales, células madre
primordiales, hepatocitos, queratinocitos, células endoteliales de
la vena umbilical, células endoteliales aórticas, células
endoteliales microvasculares, fibroblastos, células estrelladas
hepáticas, células del músculo liso aórtico, miocitos cardiacos,
neuronas, células de Kupffer, células de músculo liso, células de
Schwann, y células epiteliales, eritrocitos, plaquetas, neutrófilos,
linfocitos; monocitos, eosinófilos, basófilos, adipocitos,
condrocitos, células del islote pancreático, células tiroideas,
células paratiroideas, células parótidas, células tumorales,
células gliales, astrocitos, glóbulos rojos, glóbulos blancos,
macrófagos, células epiteliales, células somáticas, células de la
pituitaria, células suprarrenales, células pilosas, células de la
vejiga, células renales, células retinianas, bastones retinianos,
conos retinianos, células cardiacas, células del marcapasos,
células esplénicas, células presentadoras de antígeno, células de
memoria, células T, células B, células plasmáticas, células
musculares, células del ovario, células del útero, células de la
próstata, células epiteliales vaginales, células espermáticas,
células testiculares, células germinales, óvulos, células de
leydig, células peritubulares, células de Sertoli, células
luteínicas, células cervicales, células del endometrio, células
mamarias, células foliculares, células mucosas, células ciliadas,
células epiteliales no queratinizadas, células epiteliales
queratinizadas, células pulmonares, células calciformes, células
epiteliales columnares, células epiteliales escamosas, osteocitos,
osteoblastos, y osteoclastos.
Pueden usarse células madre embrionarias no
humanas. Puede emplearse una línea de células madre embrionarias o
pueden obtenerse células madre embrionarias no humanas recientemente
de un hospedador, tal como un animal porcino. Las células pueden
cultivarse en una capa de alimentación de fibroblastos o cultivarse
en presencia del factor inhibidor de leucemia (LIF). En una
realización preferida, las células porcinas pueden ser fibroblastos;
en una realización específica, las células porcinas pueden ser
fibroblastos fetales. Las células fibroblásticas son un tipo de
célula somática preferido porque pueden obtenerse de fetos en
desarrollo y animales adultos en grandes cantidades. Estas células
pueden propagarse fácilmente in vitro con un tiempo de
duplicación rápido y pueden propagarse clonalmente para su uso en
procedimientos de modificación génica dirigida.
\vskip1.000000\baselineskip
La recombinación homóloga permite modificaciones
específicas de sitio en genes endógenos y por tanto pueden
diseñarse nuevas alteraciones en el genoma. En la recombinación
homóloga, el ADN entrante interacciona con y se integra en un sitio
en el genoma que contiene una secuencia de ADN sustancialmente
homóloga. En integración no homóloga ("aleatoria" o
"ilícita"), el ADN entrante no se encuentra en una secuencia
homóloga en el genoma sino que se integra en cualquier parte, en
uno de la gran cantidad de lugares potenciales. En general, estudios
con células eucariotas superiores han revelado que la frecuencia de
recombinación homóloga es mucho menor que la frecuencia de
integración aleatoria. La proporción de estas frecuencias tiene
implicaciones directas para "la modificación génica dirigida"
que depende de la integración mediante recombinación homóloga (es
decir, recombinación entre el "ADN de modificación dirigida"
exógeno y el correspondiente "ADN diana" en el genoma).
Varios artículos describen el uso de
recombinación homóloga en células de mamífero. Son ilustrativos de
estos artículos Kucherlapati et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81: 3153-3157, 1984; Kucherlapati et al.,
Mol. Cell. Bio. 5: 714-720, 1985; Smithies et
al., Nature 317: 230-234, 1985; Wake et
al., Mol. Cell. Bio. 8: 2080-2089, 1985; Ayares
et al., Genetics 111: 375-388, 1985; Ayares
et al., Mol. Cell. Bio. 7: 1656-1662, 1986;
Song et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:
6820-6824, 1987; Thomas et al. Cell 44:
419-428, 1986; Thomas y Capecchi, Cell 51:
503-512, 1987; Nandi et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85: 3845-3849, 1988; y Mansour et
al., Nature 336: 348-352, 1988. Evans y
Kaufman, Nature 294: 146-154, 1981; Doetschman et
al., Nature 330: 576-578, 1987; Thomas y
Capecchi, Cell 51: 503-512, 1987; Thompson et
al., Cell 56: 316-321, 1989.
La presente invención usa la recombinación
homóloga para inactivar el gen de la
alfa-1,3-GT en las células, tales
como las células porcinas descritas anteriormente. El ADN puede
comprender al menos una parte de(de los) gene(s) en
el locus particular con la introducción de una alteración en al
menos una, opcionalmente ambas copias, del(de los)
gene(s) nativo(s), para evitar la expresión de
alfa1,3GT funcional. La alteración puede ser una inserción,
deleción, reemplazo o combinación de los mismos. Cuando la
alteración se introduce en solamente una copia del gen que se está
inactivando, las células que tienen una única copia sin mutar del
gen diana se amplifican y pueden someterse a una segunda etapa de
modificación dirigida, donde la alteración puede ser igual o
diferente de la primera alteración, habitualmente diferente, y donde
está implicada una deleción, o reemplazo, que puede estar solapando
con al menos una parte de la alteración introducida originalmente.
En esta segunda etapa de modificación dirigida, puede usarse un
vector de modificación dirigida con los mismos brazos de homología,
pero que contiene marcadores de selección en mamíferos diferentes.
Los transformantes resultantes se exploran para la ausencia de un
antígeno diana funcional y el ADN de la célula puede explorarse
adicionalmente para asegurar la ausencia de un gen diana tipo
silvestre. Como alternativa, puede conseguirse homocigosidad en
cuanto a un fenotipo por cruce de hospedadores heterocigóticos para
la mutación.
\vskip1.000000\baselineskip
La modificación de un locus diana de una célula
puede producirse por introducción de ADN en las células, donde el
ADN tiene homología con el locus diana e incluye un gen marcador,
que permite la selección de células que comprenden la construcción
integrada. El ADN homólogo en el vector diana se recombinará con el
ADN cromosómico en el locus diana. El gen marcador puede estar
flanqueado en ambos lados por secuencias de ADN homólogas, un brazo
de recombinación 3' y un brazo de recombinación 5'. Los métodos para
la construcción de vectores de modificación dirigida se han
descrito en la técnica, véase, por ejemplo, Dai et al.,
Nature Biotechnology 20: 251-255, 2002; el
documento WO 00/51424, Figura 6.
Pueden prepararse diversas construcciones para
recombinación homóloga en un locus diana. La construcción puede
incluir al menos 50 pb, 100 pb, 500 pb, 1 kpb, 2 kpb, 4 kpb, 5 kpb,
10 kpb, 15 kpb, 20 kpb, o 50 kpb de secuencia homóloga con el locus
diana. La secuencia puede incluir cualquier secuencia contigua del
gen porcino de la alfa-1,3-GT
(véase, por ejemplo, Nº de acceso de GenBank L36152, el documento WO
01/30992 de la University of Pittsburgh of the Commonwealth System
of Higher Education; el documento WO 01/123541 de Alexion,
Inc.).
Inc.).
Diversas consideraciones pueden estar implicadas
en la determinación del grado de homología de secuencias de ADN
diana, tales como, por ejemplo, el tamaño del locus diana, la
disponibilidad de secuencias, la eficacia relativa de
acontecimientos de entrecruzamiento doble en el locus diana y la
similitud de la secuencia diana con otras
secuencias.
secuencias.
El ADN de modificación dirigida puede incluir
una secuencia en la que el ADN sustancialmente isogénico flanquea
las modificaciones de secuencia deseadas con una secuencia diana
correspondiente en el genoma a modificar. La secuencia
sustancialmente isogénica puede ser al menos aproximadamente un 95%,
97-98%, 99,0-99,5%,
99,6-99,9%, o 100% idéntica a la secuencia diana
correspondiente (excepto para las modificaciones de secuencia
deseadas). El ADN de modificación dirigida y el ADN diana
preferiblemente pueden compartir tramos de ADN de al menos
aproximadamente 75, 150 ó 500 pares de bases que son 100% idénticos.
Por consiguiente, el ADN de modificación dirigida puede obtenerse
de células muy relacionadas con la línea celular que se está
modificando de forma dirigida; o el ADN de modificación dirigida
puede obtenerse de células de la misma línea celular o animal que
las células que se están modificando de forma dirigida.
Las construcciones de ADN pueden diseñarse para
modificar la alfa1,3GT diana endógena. La secuencia homóloga para
dirigir la construcción puede tener una o más deleciones,
inserciones, sustituciones o combinaciones de los mismos. La
alteración puede ser la inserción de un gen marcador de selección
fusionado en fase de lectura con la secuencia cadena arriba del gen
diana.
Los genes marcadores de selección adecuados
incluyen, aunque sin limitación: genes que confieren la capacidad
de crecer en ciertos sustratos del medio, tales como el gen tk
(timidina quinasa) o el gen hprt (hipoxantina
fosforribosiltransferasa) que confiere la capacidad de crecer en
medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina); el gen gpt
bacteriano (guanina/xantina fosforribosiltransferasa) que permite el
crecimiento en medio MAX (ácido micofenólico, adenina, y xantina).
Véase, por ejemplo, Song, K-Y., et al. Proc.
Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 84: 6820-6824 (1987);
Sambrook, J., et al., Molecular Cloning-A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, N.Y. (1989), Capítulo 16. Otros ejemplos de marcadores de
selección incluyen: genes que confieren resistencia a compuestos
tales como antibióticos, genes que confieren la capacidad de crecer
en sustratos seleccionados, genes que codifican proteínas que
producen señales detectables tales como luminiscencia, tales como
la proteína verde fluorescente, la proteína verde fluorescente
potenciada (eGFP). Se conoce y está disponible una amplia
diversidad de dichos marcadores, incluyendo, por ejemplo, genes de
resistencia a antibióticos tales como el gen de resistencia a
neomicina (neo) (Southern, P., y P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1:
327-341 (1982)); y el gen de resistencia a
higromicina (hyg) (Nucleic Acids Research 11:
6895-6911 (1983), y Te Riele, H., et al.,
Nature 348: 649-651 (1990)). Otros genes marcadores
de selección incluyen: acetohidroxiácido sintasa (AHAS), fosfatasa
alcalina (AP), beta galactosidasa (LacZ), beta glucuronidasa (GUS),
cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), proteína verde fluorescente
(GFP), proteína roja fluorescente (RFP), proteína amarilla
fluorescente (YFP), proteína cian fluorescente (CFP), peroxidasa de
rábano rusticano (HRP), luciferasa (Luc), nopalina sintasa (NOS),
octopina sintasa (OCS), y derivados de los mismos. Están disponibles
múltiples marcadores de selección que confieren resistencia a
ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina,
kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina,
y
tetraciclina.
tetraciclina.
Los métodos para la incorporación de genes de
resistencia a antibióticos y factores de selección negativa serán
conocidos para los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo,
el documento WO 99/15650; la patente de Estados Unidos Nº
6.080.576; la patente de Estados Unidos Nº 6.136.566; Niwa et
al., J. Biochem. 113: 343-349 (1993); y Yoshida
et al., Transgenic Research 4: 277-287
(1995)).
\newpage
También pueden usarse combinaciones de
marcadores de selección. Por ejemplo, para marcar alfa1,3GT, puede
clonarse un gen neo (con o sin su propio promotor, como se ha
analizado anteriormente) en una secuencia de ADN que es homóloga al
gen de la alfa-1,3-GT. Para usar una
combinación de marcadores, puede clonarse el gen
HSV-tk de modo que esté fuera del ADN de
modificación dirigida (podría colocarse otro marcador de selección
en el flanco opuesto, si se desea). Después de introducir la
construcción de ADN en las células a modificar de forma dirigida,
las células pueden seleccionarse en los antibióticos apropiados. En
este ejemplo particular, aquellas células que son resistentes a
G418 y ganciclovir tienen mayor probabilidad de haber surgido por
recombinación homóloga en la que el gen neo se ha combinado en el
gen de la alfa-1,3-GT pero se ha
perdido el gen tk porque estaba localizado fuera de la región de
entrecruzamiento doble.
Las deleciones pueden ser de al menos
aproximadamente 50 pb, más habitualmente de aproximadamente 100 pb,
y generalmente de no más de aproximadamente 20 kpb, donde la
deleción normalmente puede incluir al menos una parte de la región
codificante que incluye una parte de uno o más exones, una parte de
uno o más intrones, y puede incluir o no una parte de las regiones
no codificantes flanqueantes, particularmente, la región no
codificante 5' (región reguladora de la transcripción). Por tanto,
la región homóloga puede extenderse más allá de la región
codificante en la región no codificante 5' o como alternativa en la
región no codificante 3'. Las inserciones generalmente no pueden
exceder de 10 kpb, habitualmente no exceden de 5 kpb, siendo
generalmente de al menos 50 pb, más habitualmente de al menos 200
pb.
La(s) región(es) de homología
puede(n) incluir mutaciones, donde las mutaciones pueden
inactivar adicionalmente el gen diana, proporcionando un
desplazamiento de fase, o cambiando un aminoácido clave, o la
mutación puede corregir un alelo disfuncional, etc. La mutación
puede ser un cambio sutil, que no excede de aproximadamente el 5%
de las secuencias flanqueantes homólogas. Cuando se desea la
mutación de un gen, el gen marcador puede insertarse en un intrón o
un exón.
La construcción puede prepararse de acuerdo con
métodos conocidos en la técnica, diversos fragmentos pueden
juntarse, introducirse en vectores apropiados, clonarse, analizarse
y después manipularse adicionalmente hasta que se haya conseguido
la construcción deseada. Pueden hacerse diversas modificaciones a la
secuencia, para permitir el análisis de restricción, la escisión,
identificación de sondas, etc. Pueden introducirse mutaciones
silenciosas, según se desee. En diversas fases, puede emplearse
análisis de restricción, secuenciación, amplificación con la
reacción en cadena de la polimerasa, reparación con cebador,
mutagénesis in vitro, etc.
La construcción puede prepararse usando un
vector bacteriano, que incluye un sistema de replicación procariota,
por ejemplo, un origen reconocible por E. coli, en cada fase
la construcción pueden clonarse y analizarse. Puede emplearse un
marcador, igual o diferente del marcador a usar para inserción, que
puede eliminarse antes de la introducción en la célula diana. Una
vez se ha completado el vector que contiene la construcción, puede
manipularse adicionalmente, tal como por deleción de las secuencias
bacterianas, linealización, introduciendo una corta deleción en la
secuencia homóloga. Después de la manipulación final, la
construcción puede introducirse en la célula.
La presente invención incluye adicionalmente
construcciones recombinantes que contienen secuencias del gen de la
alfa-1,3-GT. Las construcciones
comprenden un vector, tal como un vector plasmídico o viral, en el
que se ha insertado una secuencia de la invención, en orientación
directa o inversa. La construcción también puede incluir secuencias
reguladoras incluyendo, por ejemplo, un promotor, unido de forma
funcional a la secuencia. Los especialistas en la técnica conocen
grandes cantidades de vectores y promotores adecuados, y están
disponibles en el mercado. Los siguientes vectores se proporcionan
a modo de ejemplo. Bacterianos: pBs, pQE-9 (Qiagen),
phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a,
pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3,
pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eucariotas:
pWLneo, pSv2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPv, pMSG,
pSVL (Pharmacia), vectores de origen viral (vectores M13, vectores
de fago 1 bacteriano, vectores adenovirales, y vectores
retrovirales), vectores de número de copia elevado, bajo y
ajustable, vectores que tienen replicones compatibles para su uso
en combinación en un único hospedador (pACYCI 84 y pBR322) y
vectores de replicación episómicos eucariotas (pCDM8). Otros
vectores incluyen vectores de expresión procariotas tales como pcDNA
II, pSL301, pSE280, pSE380, pSE420, pTrcHisA, B, y C, pRSET A, B, y
C (Invitrogen, Corp.), pGEMEX-1, y
pGEMEX-2 (Promega, Inc.), los vectores pET
(Novagen, Inc.), pTrc99A, pKK223-3, los vectores
pGEX, pEZZ18, pRIT2T, y pMC1871 (Pharmacia, Inc.),
pKK233-2 y pKK388-1 (Clontech,
Inc.), y pProEx-HT (Invitrogen, Corp.) y variantes
y derivados de los mismos. Otros vectores incluyen vectores de
expresión eucariotas tales como pFastBac, pFastBacHT, pFastBacDUAL,
pSFV, y pTet-Splice (Invitrogen),
pEUK-C1, pPUR, pMAM, pMAMneo, pBI101, pBI121, pDR2,
pCMVEBNA, y pYACneo (Clontech), pSVK3, pSVL, pMSG, pCH110, y
pKK232-8 (Pharmacia, Inc.), p3'SS, pXT1, pSG5,
pPbac, pMbac, pMC1neo, y pOG44 (Stratagene, Inc.), y pYES2, pAC360,
pBlueBacHis A, B, y C, pVL1392, pBlueBacIII, pCDM8, pcDNA1, pZeoSV,
pcDNA3, pREP4, pCEP4, y pEBVHis (Invitrogen, Corp.) y variantes o
derivados de los mismos. Vectores adicionales que pueden usarse
incluyen: pUC18, pUC19, pBlueScript, pSPORT, cósmidos, fagómidos,
YAC (cromosomas artificiales de levaduras), BAC (cromosomas
artificiales bacterianos), P1 (fago de Escherichia coli),
pQE70, pQE60, pQE9 (quagan), vectores pBS, vectores PhageScript,
vectores BlueScript, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene),
pcDNA3 (Invitrogen), pGEX, pTrsfus, pTrc99A, pET-5,
pET-9, pKK223-3,
pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pSPORT1,
pSPORT2, pCMVSPORT2.0 y pSV-SPORT1 (Invitrogen),
pTrxFus, pThioHis, pLEX, pTrcHis, pTrcHis2, pRSET, pBlueBacHis2,
pcDNA3.1/His, pcDNA3.1(-)/
Myc-His, pSecTag, pEBVHis, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO815, pPICZ, pPICZ, pGAPZ, pGAPZ, pBlueBac4.5, pBlueBacHis2, pMelBac, pSinRep5, pSinHis, pIND, pIND(SP1), pVgRXR, pcDNA2.1, pYES2, pZErO1.1, pZErO-2.1, pCR-Blunt, pSE280, pSE380, pSE420, pVL1392, pVL1393, pCDM8, pcDNA1.1, pcDNA1.1/Amp, pcDNA3.1, pcDNA3.1/Zeo, pSe, SV2, pRc/CMV2, pRc/RSV, pREP4, pREP7, pREP8, pREP9, pREP10, pCEP4, pEBVHis, pCR3.1, pCR2.1, pCR3.1-Uni, y pCRBac de Invitrogen; ExCell, gt11, pTrc99A, pKK223-3, pGEX-1 T, pGEX-2T, pGEX-2TK, pGEX-4T-1, pGEX-4T-2, pGEX-4T-3, pGEX-3X, pGEX-5X-1, pGEX-5X-2, pGEX-5X-3, pEZZ18, pRIT2T, pMC1871, pSVK3, pSVL, pMSG, pCH110, pKK232-8, pSL1180, pNEO, y pUC4K de Pharmacia; pSCREEN-1b(+), pT7Blue(R), pT7Blue-2, pCITE-4abc(+), pOCUS-2, pTAg, pET-32LIC, pET-30LIC, pBAC-2cp LIC, pBACgus-2cp LIC, pT7Blue-2 LIC, pT7Blue-2, SCREEN-1, BIueSTAR, pET-3abcd, pET-7abc, pET9abcd, pET11abcd, pET12abc, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b-pET-17xb, pET-19b, pET-20b(+), pET-21abcd(+), pET-22b(+), pET-23abcd(+), pET-24abcd(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28abc(+), pET-29abc(+), pET-30abc(+), pET-31b(+), pET-32abc(+), pET-33b(+), pBAC-1, pBACgus-1, pBAC4x-1, pBACgus4x-1, pBAC-3cp, pBACgus-2cp, pBACsurf-1, plg, Signal plg, pYX, Selecta Vecta-Neo, Selecta Vecta-Hyg, y Selecta Vecta-Gpt de Novagen; pLexA, pB42AD, pGBT9, pAS2-1, pGAD424, pACT2, pGAD GL, pGAD GH, pGAD10, pGilda, pEZM3, pEGFP, pEGFP-1, pEGFP-N, pEGFP-C, pEBFP, pGFPuv, pGFP, p6xHis-GFP, pSEAP2-Basic, pSEAP2-Control, pSEAP2-Promoter, pSEAP2-Enhancer, p gal-Basic, p gal-Control, p gal-Promoter, p gal-Enhancer, pCMV, pTet-Off, pTet-On, pTK-Hyg, pRetro-Off, pRetro-On, pIRES1neo, pIRES1hyg, pLXSN, pLNCX, pLAPSN, pMAMneo, pMAMneo-CAT, pMAMneo-LUC, pPUR, pSV2neo, pYEX4T-1/2/3, pYEX-S1, pBacPAK-His, pBacPAK8/9, pAcUW31, BacPAK6, pTriplEx, gt10, gt11, pWE15, y TriplEx de Clontech; Lambda ZAP II, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II KS +/-, pBluescript II SK +/-, pAD-GAL4, pBD-GAL4 Cam, pSurfscript, Lambda FIX II, Lambda DASH, Lambda EMBL3, Lambda EMBL4, SuperCos, pCR-Scrigt Amp, pCR-Script Cam, pCR-Script Direct, pBS +/-, pBC KS +/-, pBC SK +/-, Phagescript, pCAL-n-EK, pCAL-n, pCAL-c, pCAL-kc, pET-3abcd, pET-11abcd, pSPUTK, pESP-1, pCMVLacI, pOPRSVI/MCS, pOPI3 CAT, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMC1neo, pMC1neo Poly A, pOG44, pOG45, pFRT GAL, pNEO GAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415, y pRS416 de Stratagene y variantes o derivados de los mismos. También pueden usarse vectores de doble híbrido y de doble híbrido inversos, por ejemplo, pPC86, pDBLeu, pDBTrp, pPC97, p2.5, pGAD1-3, pGAD10, pACt, pACT2, pGADGL, pGADGH, pAS2-1, pGAD424, pGBT8, pGBT9, pGAD-GAL4, pLexA, pBD-GAL4, pHISi, pHISi-1, placZi, pB42AD, pDG202, pJK202, pJG4-5, pNLexA, pYESTrp y variantes o derivados de los mismos. Puede usarse cualquier otro plásmido y vector siempre que sea replicable y viable en el hospedador.
Myc-His, pSecTag, pEBVHis, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO815, pPICZ, pPICZ, pGAPZ, pGAPZ, pBlueBac4.5, pBlueBacHis2, pMelBac, pSinRep5, pSinHis, pIND, pIND(SP1), pVgRXR, pcDNA2.1, pYES2, pZErO1.1, pZErO-2.1, pCR-Blunt, pSE280, pSE380, pSE420, pVL1392, pVL1393, pCDM8, pcDNA1.1, pcDNA1.1/Amp, pcDNA3.1, pcDNA3.1/Zeo, pSe, SV2, pRc/CMV2, pRc/RSV, pREP4, pREP7, pREP8, pREP9, pREP10, pCEP4, pEBVHis, pCR3.1, pCR2.1, pCR3.1-Uni, y pCRBac de Invitrogen; ExCell, gt11, pTrc99A, pKK223-3, pGEX-1 T, pGEX-2T, pGEX-2TK, pGEX-4T-1, pGEX-4T-2, pGEX-4T-3, pGEX-3X, pGEX-5X-1, pGEX-5X-2, pGEX-5X-3, pEZZ18, pRIT2T, pMC1871, pSVK3, pSVL, pMSG, pCH110, pKK232-8, pSL1180, pNEO, y pUC4K de Pharmacia; pSCREEN-1b(+), pT7Blue(R), pT7Blue-2, pCITE-4abc(+), pOCUS-2, pTAg, pET-32LIC, pET-30LIC, pBAC-2cp LIC, pBACgus-2cp LIC, pT7Blue-2 LIC, pT7Blue-2, SCREEN-1, BIueSTAR, pET-3abcd, pET-7abc, pET9abcd, pET11abcd, pET12abc, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b-pET-17xb, pET-19b, pET-20b(+), pET-21abcd(+), pET-22b(+), pET-23abcd(+), pET-24abcd(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28abc(+), pET-29abc(+), pET-30abc(+), pET-31b(+), pET-32abc(+), pET-33b(+), pBAC-1, pBACgus-1, pBAC4x-1, pBACgus4x-1, pBAC-3cp, pBACgus-2cp, pBACsurf-1, plg, Signal plg, pYX, Selecta Vecta-Neo, Selecta Vecta-Hyg, y Selecta Vecta-Gpt de Novagen; pLexA, pB42AD, pGBT9, pAS2-1, pGAD424, pACT2, pGAD GL, pGAD GH, pGAD10, pGilda, pEZM3, pEGFP, pEGFP-1, pEGFP-N, pEGFP-C, pEBFP, pGFPuv, pGFP, p6xHis-GFP, pSEAP2-Basic, pSEAP2-Control, pSEAP2-Promoter, pSEAP2-Enhancer, p gal-Basic, p gal-Control, p gal-Promoter, p gal-Enhancer, pCMV, pTet-Off, pTet-On, pTK-Hyg, pRetro-Off, pRetro-On, pIRES1neo, pIRES1hyg, pLXSN, pLNCX, pLAPSN, pMAMneo, pMAMneo-CAT, pMAMneo-LUC, pPUR, pSV2neo, pYEX4T-1/2/3, pYEX-S1, pBacPAK-His, pBacPAK8/9, pAcUW31, BacPAK6, pTriplEx, gt10, gt11, pWE15, y TriplEx de Clontech; Lambda ZAP II, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II KS +/-, pBluescript II SK +/-, pAD-GAL4, pBD-GAL4 Cam, pSurfscript, Lambda FIX II, Lambda DASH, Lambda EMBL3, Lambda EMBL4, SuperCos, pCR-Scrigt Amp, pCR-Script Cam, pCR-Script Direct, pBS +/-, pBC KS +/-, pBC SK +/-, Phagescript, pCAL-n-EK, pCAL-n, pCAL-c, pCAL-kc, pET-3abcd, pET-11abcd, pSPUTK, pESP-1, pCMVLacI, pOPRSVI/MCS, pOPI3 CAT, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMC1neo, pMC1neo Poly A, pOG44, pOG45, pFRT GAL, pNEO GAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415, y pRS416 de Stratagene y variantes o derivados de los mismos. También pueden usarse vectores de doble híbrido y de doble híbrido inversos, por ejemplo, pPC86, pDBLeu, pDBTrp, pPC97, p2.5, pGAD1-3, pGAD10, pACt, pACT2, pGADGL, pGADGH, pAS2-1, pGAD424, pGBT8, pGBT9, pGAD-GAL4, pLexA, pBD-GAL4, pHISi, pHISi-1, placZi, pB42AD, pDG202, pJK202, pJG4-5, pNLexA, pYESTrp y variantes o derivados de los mismos. Puede usarse cualquier otro plásmido y vector siempre que sea replicable y viable en el hospedador.
Las técnicas que pueden usarse para permitir que
la construcción de ADN entre en la célula hospedadora incluyen
coprecipitación de fosfato cálcico/ADN, microinyección de ADN en el
núcleo, electroporación, fusión del protoplasto bacteriano con
células intactas, transfección, o cualquier otra técnica conocida
por los especialistas en la técnica. El ADN puede ser ADN
monocatenario o bicatenario, lineal o circular, relajado o
superenrollado. Para diversas técnicas para transfectar células de
mamífero véase, por ejemplo, Keown et al., Methods in
Enzymology Vol. 185, pág. 527-537 (1990).
En una realización específica, pueden producirse
células knockout heterocigóticas por transfección de fibroblastos
fetales porcinos primarios con un vector knockout que contiene la
secuencia de alfa-1,3-GT aislada de
ADN isogénico. Como se describe en Dai et al. (Nature
Biotechnology, 20: 451-455), al brazo 5' puede ser
de 4,9 kb y estar compuesto por una gran fragmento del intrón 8 y
el extremo 5' del exón 9. El brazo 3' puede ser y estar compuesto
por la secuencia del exón 9. El vector puede incorporar una
estrategia de captura de promotor, usando, por ejemplo, IRES (sitio
de entrada interno de ribosomas) para iniciar la traducción del gen
Neo (véase, por ejemplo, la Figura 6).
Las células después pueden cultivarse en medio
seleccionado apropiadamente para identificar las células que
proporcionan la integración apropiada. La ausencia del gen marcador
de selección insertado en el gen de la
alfa-1,3-GT establece la integración
de la construcción diana en el genoma hospedador. Aquellas células
que muestran el fenotipo deseado después pueden analizarse
adicionalmente por análisis de restricción, electroforesis,
análisis de Southern, reacción en cadena de la polimerasa, etc. para
analizar el ADN para establecer si ha sucedido recombinación
homóloga o no homóloga. Esto puede determinarse empleando sondas
para el inserto y después secuenciando las regiones 5' y 3' que
flanquean el inserto para la presencia del gen de la
alfa-1,3-GT que se extiende más
allá de las regiones flanqueantes de la construcción o identificando
la presencia de una deleción, cuando se introduce dicha deleción.
También pueden usarse cebadores que son complementarios a una
secuencia dentro de la construcción y complementarios a una
secuencia fuera de la construcción y en el locus diana. De este
modo, pueden obtenerse solamente dúplex de ADN que tienen ambos
cebadores presentes en las cadenas complementarias si ha sucedido
recombinación homóloga. Demostrando la presencia de las secuencias
cebadoras o la secuencia de tamaño esperado, se apoya la existencia
de recombinación homóloga.
La reacción en cadena de la polimerasa usada
para explorar acontecimientos de recombinación homóloga es conocida
en la técnica, véase, por ejemplo, Kim y Smithies, Nucleic Acids
Res. 16:8887-8903, 1988; y Joyner et al.,
Nature 338:153-156, 1989. La combinación específica
de un potenciador de polioma mutante y un promotor de la timidina
quinasa para dirigir el gen de la neomicina ha demostrado ser activa
tanto en células madre embrionarias como en células EC por Thomas y
Capecchi, supra, 1987; Nicholas y Berg (1983) en
Teratocarcinoma Stem Cell, eds. Siver, Martin y Strikland (Cold
Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N.Y. (pág.
469-497); y Linney y Donerly, Cell
35:693-699, 1983.
Las líneas celulares obtenidas de la primera
ronda de modificación dirigida probablemente son heterocigóticas
para el alelo modificado de forma dirigida. La homocigosidad, en la
que ambos alelos están modificados, puede conseguirse de varios
modos. Un enfoque es cultivar varias células en las que se ha
modificado una copia y después someter estas células a otra ronda
de modificación dirigida usando un marcador de selección diferente.
Como alternativa, los homocigotos pueden obtenerse cruzando animales
heterocigóticos para el alelo modificado, de acuerdo con la
genética mendeliana tradicional. En algunas situaciones, puede ser
deseable obtener dos alelos modificados diferentes. Esto puede
conseguirse por rondas sucesivas de modificación génica dirigida o
cruzando heterocigotos, cada uno de los cuales porta uno de los
alelos modificados deseados.
En ciertas realizaciones diferentes, los métodos
de la invención implican la introducción intencionada de una
mutación mediante un agente mutagénico. Ejemplos de agentes
mutagénicos conocidos en la técnica y adecuados para su uso en la
presente invención incluyen, aunque sin limitación, mutágenos
químicos (por ejemplo, agentes químicos que se intercalan en el ADN
o que se unen al ADN tales como
N-etil-N-nitrosourea
(ENU), etilmetanosulfonato (EMS), gas mostaza, ICR191 y similares;
véase, por ejemplo, E. C. Friedberg, G. C. Walker, W. Siede, DNA
Repair and Mutagenesis, ASM Press, Washington DC (1995), mutágenos
físicos (por ejemplo, radiación UV, radiación, rayos x), mutágenos
bioquímicos (por ejemplo, enzimas de restricción, mutágenos de
reparación del ADN, inhibidores de la reparación del ADN, y ADN
polimerasas y proteínas de replicación propensas a error), así como
la inserción de transposones. De acuerdo con los métodos de la
presente invención, las células en cultivo pueden exponerse a uno
de estos agentes, y puede seleccionarse cualquier mutación que
provoque la eliminación de galactosa
alfa1,3-galactosa sobre la superficie celular, por
ejemplo, mediante exposición a toxina A.
Las dosis preferidas de mutágenos químicos para
inducir mutaciones en células son conocidas en la técnica, o pueden
determinarlas fácilmente los especialistas en la técnica usando
ensayos de mutagénesis conocidos en la técnica. La mutagénesis
química de células in vitro puede conseguirse tratando las
células con diversas dosis del agente mutagénico y/o controlando el
tiempo de exposición al agente. Valorando la exposición al agente
mutagénico y/o la dosis, es posible realizar el grado óptimo de
mutagénesis para el propósito pretendido, mutando de este modo una
cantidad deseada de genes en cada célula diana. Por ejemplo, dosis
útiles de ENU pueden ser 0,1-0,4 mg/ml durante
aproximadamente 1-2 horas. En otro ejemplo, dosis
útiles de EMS pueden ser 0,1-1 mg/ml durante
aproximadamente 10-30 horas. Además, también pueden
usarse dosis y tiempos de exposición menores y mayores para
conseguir la frecuencia de mutación deseada.
En otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un método de selección para determinar si células
porcinas carecen de la expresión de
alfa-1,3-GT funcional.
La toxina bacteriana, toxina A producida por
Clostridium difficile, se usa para seleccionar células que
carecen del epítopo de superficie celular galactosa
alfa1,3-galactosa. La exposición a la toxina de
C. difficile puede causar el redondeo de células que
muestran este epítopo sobre su superficie, liberando las células de
la matriz de la placa. Tanto los knockouts génicos dirigidos como
las mutaciones que inutilizan la función o la expresión enzimática
pueden detectarse usando este método de selección. Las células que
carecen de la expresión en la superficie celular del epítopo
galactosa alfa1,3-galactosa, identificadas usando la
selección mediada por toxina A descrita, o producidas usando
métodos convencionales de inactivación génica incluyendo
modificación génica dirigida, después pueden usarse para producir
cerdos, en los que ambos alelos del gen de la alfa 1,3 GT son
inactivos.
En una realización, el método de selección puede
detectar la eliminación del epítopo de alfa 1,3GT directamente, ya
sea debido a eliminación dirigida del gen de la alfa 1,3GT por
recombinación homóloga, o una mutación en el gen que provoca una
enzima que no funciona o que no se expresa. La selección mediante
resistencia a antibióticos se ha usado más habitualmente para la
exploración (véase anteriormente). Este método puede detectar la
presencia del gen de resistencia en el vector de modificación
dirigida, pero no indica directamente si la integración fue un
acontecimiento de recombinación dirigida o una integración
aleatoria. Cierta tecnología, tal como la tecnología de captura de
poli A y promotor, aumenta la probabilidad de acontecimientos
dirigidos, pero de nuevo, no da evidencias directas de que se haya
conseguido el fenotipo deseado, una célula deficiente en epítopos
gal alfa 1,3 gal sobre la superficie celular. Además, pueden usarse
formas negativas de selección para seleccionar la integración
dirigida; en estos casos, se inserta el gen de un factor letal para
las células de tal modo que solamente los acontecimientos dirigidos
permitan que la célula evite la muerte. Las células seleccionadas
por estos métodos después pueden ensayarse para alteración génica,
integración de vector y, finalmente, eliminación del epítopo alfa
1,3 gal. En estos casos, como la selección se basa en la detección
de la integración del vector de modificación dirigida y no en el
fenotipo alterado, solamente pueden detectarse knockouts dirigidos,
no mutaciones puntuales, reordenamientos génicos o truncamientos u
otras de dichas modificaciones.
La toxina A, una citotoxina producida por la
bacteria Clostridium difficile, se une específicamente a la
secuencia de carbohidrato terminal de la galactosa
alfa1,3-galactosa gal alfa 1-3 gal
beta 1-4GlcNAc. La unión a este receptor media un
efecto citotóxico en la célula, causando que cambie de morfología y,
en algunos casos, se libere de la matriz de la placa. En
condiciones controladas, las células que no portan este marcador no
se ven afectadas por la toxina. Por tanto, en una realización, para
determinar si se ha eliminado satisfactoriamente o no el epítopo
alfa 1,3 gal mediante eliminación dirigida o mutación génica del
locus gal alfa-1,3-GT, pueden
seleccionarse las células que no portan el epítopo. La exposición a
toxina A puede ser tóxica para células que portan el epítopo, y
promueve la selección de aquellas células en las que el gen se ha
inactivado satisfactoriamente.
Las células útiles como donantes nucleares para
la producción de animales alterados genéticamente (por ejemplo,
cerdos) que tiene el locus gal alfa 1,3 eliminado o mutado pueden
seleccionarse por exposición de las células a la toxina A de C.
difficile.
La toxina A, una de las dos citotoxinas
producidas por Clostridium difficile, tiene elevada afinidad
de unión por la secuencia de galactosa
alfa1,3-galactosa gal alfa 1,3-gal
beta 1,4GlcNAc encontrada sobre la superficie de una diversidad de
tipos celulares (Clark et al., Arch. Biochem. Biophys. 257
(1): 217-229, 1987). Este carbohidrato parece
servir como receptor funcional para la toxina A, ya que células que
presentan este epítopo sobre su superficie son más sensibles al
efecto citotóxico de la toxina A que las células que carecen de este
receptor. Las células sensibles expuestas a toxina A en cultivo
muestran redondeo celular, probablemente debido a la
despolimerización de la actina y los cambios resultantes en la
integridad del citoesqueleto (Kushnaryov et al., J. Biol.
Chem. 263: 17755-17762 (1988) y Just et al.,
J. Clin. Invest. 95: 1026-1031, 1995). Estas
células pueden eliminarse selectivamente del cultivo, ya que se
levantan de la matriz y flotan en suspensión, dejando las células
sin afectar unidas firmemente a la superficie de la placa.
Exposición de las células a toxina A. En una
realización, las células unidas se exponen a toxina A como un
componente del medio de cultivo celular. Después de un tiempo fijo
de exposición, se retira el medio que contiene la toxina A y las
células sensibles a toxina A liberadas, se lava la placa, y se
repone el medio, sin toxina A. La exposición a toxina A se repite
durante un periodo de días para retirar las células sensibles a
toxina unidas de las placas, y permitir que las células insensibles
proliferen y se expandan. La toxina A purificada puede usarse en
los métodos de la presente invención (disponible en el mercado,
véase, por ejemplo, Techlab Inc., Nº Cat. T3001, Blacksburg, VA).
También puede usarse toxina A no purificada sin refinar (disponible
en el mercado, véase, por ejemplo, Techlab Inc. Nº Cat. T5000 o
T3000, Blacksburg, VA), que puede requerir una titulación inicial
para determinar la dosificación eficaz para la selección.
El procedimiento de selección puede realizarse
usando suero que contiene factores del complemento y anticuerpos
naturales contra el epítopo gal alfa1,3 gal (véase, por ejemplo,
Koike et al., Xenotransplantation 4:147-153,
1997). La exposición a suero de un ser humano o primate no humano
que contiene anticuerpos anti-Gal puede causar
lisis celular debido a la unión específica del anticuerpo y la
activación del complemento en células que muestran el epítopo gal
alfa 1,3 gal. Por lo tanto, las células deficientes en
alfa-1,3-GT seguirán vivas y por
tanto pueden seleccionarse.
Las células porcinas que se cree que carecen de
la expresión de alfa-1,3-GT
funcional pueden caracterizarse adicionalmente. Dicha
caracterización puede realizarse por las siguientes técnicas,
incluyendo, aunque sin limitación: análisis de PCR, análisis de
transferencia de Southern, análisis de transferencia de Northern,
ensayos de unión específica de lectina, y/o análisis de
secuenciación.
Puede usarse el análisis de PCR como se describe
en la técnica (véase, por ejemplo, Dai et al. Nature
Biotechnology 20:431-455) para determinar la
integración de vectores de modificación dirigida. Pueden originarse
amplímeros en el gen de resistencia a antibiótico y extenderse en
una región fuera de la secuencia del vector. También puede usarse
análisis de Southern (véase, por ejemplo, Dai et al. Nature
Biotechnology 20:431-455) para caracterizar
modificaciones globales en el locus, tales como la integración de un
vector de modificación dirigida en el locus alfa 1,3GT. Aunque
puede usarse análisis de Northern para caracterizar el transcrito
producido a partir de cada uno de los alelos.
La unión específica de lectina, usando lectina
GSL IB4 de Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia (Vector Labs), una
lectina que se une específicamente al resto de carbohidrato gal alfa
1,3 gal, y el análisis de unión FACS (separación de células
activadas por fluorescencia) puede determinar si el epítopo alfa 1,3
gal está presente o no en las células. Este tipo de análisis
implica la adición de lectina GSL-IB4 marcada con
fluoresceína a las células y la posterior separación celular.
Además, también puede usarse análisis de
secuenciación del ADNc producido a partir del transcrito de ARN para
determinar la ubicación precisa de cualquier mutación en el alelo
de la alfa 1,3GT.
En otro aspecto más, la presente invención
proporciona un método para producir cerdos viables en los que ambos
alelos del gen de la alfa-1,3-GT se
han vuelto inactivos, donde el método es como se indica en la
reivindicación 24. En una realización, los cerdos se producen por
clonación usando un núcleo donante de una célula porcina en la que
ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT se han inactivado. En
una realización, ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT se inactivan mediante un
acontecimiento de modificación genética dirigida. En otra
realización, ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT se inactivan debido a la
presencia de una mutación puntual. En otra realización, un alelo se
inactiva por un acontecimiento de modificación genética dirigida y
el otro alelo se inactiva mediante una mutación puntual. En una
realización adicional, un alelo se inactiva por un acontecimiento
de modificación genética dirigida y el otro alelo se inactiva debido
a la presencia de una mutación puntual
T-a-G en la segunda base del exón 9
del gen de la alfa-1,3-GT. En una
realización específica, un alelo se inactiva mediante una
construcción de modificación dirigida al Exón 9 (Figura 6) y el otro
alelo se inactiva debido a la presencia de una mutación puntual
T-a-G en la segunda base del exón 9
del gen de la alfa-1,3-GT. En otra
realización, un método para clonar dichos cerdos incluye: enuclear
un ovocito, fusionar el ovocito con un núcleo donante de una célula
porcina en la que ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT se han inactivado, e
implantar el embrión obtenido por transferencia nuclear en una madre
sustituta.
Como alternativa, se describe un método para
producir cerdos viables que carecen de cualquier expresión de
alfa-1,3-GT inactivando ambos alelos
del gen de la alfa-1,3-GT en células
madre embrionarias no humanas, que después pueden usarse para
producir descendencia.
Animales no humanos alterados genéticamente que
pueden crearse modificando cigotos directamente. Para mamíferos,
los cigotos modificados después pueden introducirse en el útero de
una hembra pseudo-preñada no humana capaz de llevar
el animal a término. Por ejemplo, si se desean animales no humanos
completos que carezcan del gen de la
alfa-1,3-GT, entonces pueden
modificarse de forma dirigida células madre embrionarias obtenidas
de este animal y después introducirse en blastocistos para que las
células modificadas crezcan en animales quiméricos. Para células
madre embrionarias, puede usarse una línea de células madre
embrionarias no humanas o células madre no humanas recién
obtenidas.
Las células totipotentes pueden ser células
madre embrionarias (ES) no humanas. El aislamiento de células ES a
partir de blastocistos, el establecimiento de líneas celulares ES y
su posterior cultivo se realizan por métodos convencionales
descritos, por ejemplo, por Doetchmann et al., J. Embryol.
Exp. Morph. 87: 27-45 (1985); Li et al.,
Cell 69: 915-926 (1992); Robertson, E. J.
"Tetracarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical
Approach", ed. E. J. Robertson, IRL Press, Oxford, Inglaterra
(1987); Wurst y Joyner, "Gene Targeting: A Practical Approach",
ed. A. L. Joyner, IRL Press, Oxford, Inglaterra (1993); Hogen et
al., "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual",
eds. Hogan, Beddington, Costantini y Lacy, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Nueva York (1994); y Wang et al., Nature
336: 741-744 (1992). Las células totipotentes
pueden ser células germinales embrionarias (EG) no humanas. Las
células germinales embrionarias son células no diferenciadas
funcionalmente equivalentes a las células ES, es decir, pueden
cultivarse y transfectarse in vitro, después contribuyen a
los linajes celulares somático y germinal de una quimera (Stewart
et al., Dev. Biol. 161: 626-628 (1994)). Las
células EG se obtienen por cultivo de células germinales
primordiales, las progenitoras de los gametos, con una combinación
de factores de crecimiento: factor inhibidor de leucemia, factor
steel y factor de crecimiento de fibroblastos básico (Matsui et
al., Cell 70: 841-847 (1992); Resnick et
al., Nature 359: 550-551 (1992)). El cultivo de
células EG puede realizarse usando métodos descritos en el artículo
de Donovan et al., "Transgenic Animals, Generation and
Use", Ed. L M. Houdebine, Harwood Academic Publishers (1997), y
en la bibliografía original mencionada en este documento.
Pueden obtenerse blastocistos tetraploides no
humanos para su uso en la invención por producción y desarrollo
natural de cigotos, o por métodos conocidos por electrofusión de
embriones de dos células y pueden cultivarse posteriormente como se
describe, por ejemplo, por James et al., Genet. Res. Camb.
60: 185-194 (1992); Nagy y Rossant, "Gene
Targeting: A Practical Approach", ed. A. L. Joyner, IRL Press,
Oxford, Inglaterra (1993); o por Kubiak y Tarkowski, Exp. Cell Res.
157: 561-566 (1985).
La introducción de las células ES no humanas o
las células EG no humanas en los blastocistos puede realizarse por
cualquier método conocido en la técnica. Un método adecuado para los
propósitos de la presente invención es el método de microinyección
descrito por Wang et al., EMBO J. 10:
2437-2450 (1991).
Como alternativa, mediante células madre
embrionarias no humanas modificadas pueden producirse animales
transgénicos. Las células madre embrionarias modificadas
genéticamente pueden inyectarse en un blastocisto y después llevarse
a término en un mamífero hospedador hembra de acuerdo con técnicas
convencionales. La progenie heterocigótica después puede explorarse
para la presencia de la alteración en el sitio del locus diana,
usando técnicas tales como PCR o transferencia de Southern. Después
del apareamiento con un hospedador de tipo silvestre de la misma
especie, la progenie quimérica resultante puede después aparearse de
forma cruzada para conseguir hospedadores homocigóticos.
Después de transformar células madre
embrionarias no humanas con el vector de modificación dirigida para
alterar el gen de la alfa-1,3-GT,
las células pueden sembrarse sobre una capa de alimentación en un
medio apropiado, por ejemplo, DMEM potenciado con suero bovino
fetal. Las células que contienen la construcción pueden detectarse
empleando un medio selectivo, y después de tiempo suficiente para
que las colonias crezcan, pueden recogerse las colonias y
analizarse para la existencia de recombinación homóloga. Puede
usarse la reacción en cadena de la polimerasa, con cebadores dentro
de y sin la secuencia de construcción pero en el locus diana.
Aquellas colonias que muestran recombinación homóloga después
pueden usarse para la manipulación de embriones y la inyección de
blastocistos. Los blastocistos pueden obtenerse de hembras
superovuladas. Las células madre embrionarias después pueden
tratarse con tripsina y añadirse las células modificadas a una gota
que contiene los blastocistos. Puede inyectarse al menos una de las
células madre embrionarias modificadas en el blastocele del
blastocisto. Después de la inyección, al menos uno de los
blastocistos puede devolverse a cada uno de los cuernos uterinos de
hembras pseudopreñadas. Se deja que las hembras continúen a término
y las camadas resultantes se exploran para células mutantes que
tengan la construcción. Los blastocistos se seleccionan por
diferente ascendencia a partir de las células ES transformadas.
Proporcionando un diferente fenotipo del blastocisto y las células
ES, la progenie quimérica puede detectarse fácilmente, y después
puede realizarse el genotipado para sondear la presencia del gen de
la alfa-1,3-GT modificado.
La presente invención proporciona un método para
clonar un cerdo que carece de un gen de la
alfa-1,3-GT funcional mediante
transferencia nuclear de células somáticas que comprende las etapas
enumeradas en la reivindicación 24. En general, el cerdo puede
producirse por un proceso de transferencia nuclear que comprende las
siguientes etapas: obtener células de cerdo diferenciadas deseadas
a usar como fuente de núcleos donantes; obtener ovocitos de un
cerdo; enuclear dichos ovocitos; transferir el núcleo deseado de la
célula diferenciada o la célula en el ovocito enucleado, por
ejemplo, por fusión o inyección, para formar unidades de TN; activar
la unidad de TN resultante; y transferir dicha unidad de TN
cultivada en un cerdo hospedador de modo que la unidad de TN se
desarrolle en un feto.
Las técnicas de transferencia nuclear o las
técnicas de transplante nuclear son conocidas en la técnica (Dai
et al. Nature Biotechnology 20: 251-255;
Polejaeva et al. Nature 407:86-90 (2000);
Campbell et al., Theriogenology, 43: 181 (1995); Collas
et al., Mol. Report Dev., 38: 264-267 (1994);
Keefer et al., Biol. Reprod., 50: 935-939
(1994); Sims et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:
6143-6147 (1993); documento WO 94/26884; documento
WO 94/24274, y documento WO 90/03432, patentes de Estados Unidos Nº
4.944.384 y 5.057.420).
Un núcleo celular donante no humano, que se ha
modificado para alterar el gen de la
alfa-1,3-GT, se transfiere a un
ovocito porcino receptor. El uso de este método no está restringido
a un tipo celular donante particular. La célula donante puede ser
como se describe en este documento, véase también, por ejemplo,
Wilmut et al. Nature 385 810 (1997); Campbell et al.
Nature 380 64-66 (1996); Dai et al., Nature
Biotechnology 20: 251-255, 2002 o Cibelli et
al. Science 280 1256-1258 (1998). Pueden
emplearse todas las células de cariotipo normal, incluyendo células
somáticas embrionarias, fetales y adultas que pueden usarse
satisfactoriamente en transferencia nuclear. Los fibroblastos
fetales son una clase particularmente útil de células donantes. Se
describen métodos generalmente adecuados de transferencia nuclear
en Campbell et al. Theriogenology 43 181 (1995), Dai et
al. Nature Biotechnology 20: 251-255, Polejaeva
et al. Nature 407:86-90 (2000), Collas et
al. Mol. Reprod. Dev. 38 264-267 (1994), Keefer
et al. Biol. Reprod. 50 935-939 (1994), Sims
et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90
6143-6147 (1993), documento
WO-A-9426884; documento
WO-A-9424274, documento
WO-A-9807841, documento
WO-A-9003432, patente de Estados
Unidos Nº 4.994.384 y patente de Estados Unidos Nº 5.057.420.
También pueden usarse células donantes diferenciadas o al menos
parcialmente diferenciadas. Las células también pueden estar, aunque
no necesariamente, en cultivo y pueden ser quiescentes. Las células
donantes nucleares que son quiescentes son células que pueden
inducirse a entrar en quiescencia o que existen en un estado
quiescente in vivo. Métodos de la técnica anterior también
han usado tipos celulares embrionarios en procedimientos de
clonación (Campbell et al. (Nature, 380:
64-68, 1996) y Stice et al. (Biol. Reprod.,
20 54: 100-110, 1996).
Las células donantes nucleares somáticas pueden
obtenerse de una diversidad de diferentes órganos y tejidos tales
como, aunque sin limitación, piel, mesénquima, pulmón, páncreas,
corazón, intestino, estómago, vejiga, vasos sanguíneos, riñón,
uretra, órganos reproductores, y una preparación disgregada de un
embrión, feto o animal adulto completo o parte del mismo. Las
células donantes nucleares, por ejemplo, se seleccionan entre el
grupo compuesto por células epiteliales, células fibroblásticas,
células neurales, queratinocitos, células hematopoyéticas,
melanocitos, condrocitos, linfocitos (B y T), macrófagos, monocitos,
células mononucleares, células de músculo cardiaco, otras células
musculares, células de la granulosa, células del cumulus, células
epidérmicas o células endoteliales.
La célula donante nuclear puede ser una célula
madre embrionaria no humana. Preferiblemente, pueden usarse células
fibroblásticas como células donantes.
Las células donantes nucleares de la invención
pueden ser células germinales de un animal no humano. Puede usarse
cualquier célula germinal de una especie animal en la fase
embrionaria, fetal, o adulta como célula donante nuclear. En una
realización adecuada, la célula donante nuclear es una célula
germinal embrionaria.
Las células donantes nucleares pueden detenerse
en cualquier fase del ciclo celular (G0, G1, G2, S, M) para
asegurar la coordinación con la célula aceptora. Puede usarse
cualquier método conocido en la técnica para manipular la fase del
ciclo celular. Los métodos para controlar la fase del ciclo celular
incluyen, aunque sin limitación, quiescencia G0 inducida por
inhibición por contacto de células cultivadas, quiescencia G0
inducida por la eliminación de suero u otro nutriente esencial,
quiescencia G0 inducida por senescencia, quiescencia G0 inducida
por la adición de un factor de crecimiento específico; quiescencia
G0 o G1 inducida por medios físicos o químicos tales como choque
por calor, presión hiperbárica u otro tratamiento con un agente
químico, hormona, factor de crecimiento u otra sustancia; control
de la fase S mediante tratamiento con un agente químico que
interfiere con cualquier punto del procedimiento de replicación;
control de la fase M mediante selección usando separación de
células activadas por fluorescencia, agitación mitótica, tratamiento
con agentes de alteración de microtúbulos o cualquier agente
químico que altere el progreso en la mitosis (véase también
Freshney, R. I., "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic
Technique", Alan R. Liss, Inc, Nueva York (1983).
Los métodos para el aislamiento de ovocitos son
bien conocidos en la técnica. Esencialmente, esto puede comprender
aislar ovocitos de los ovarios o el tracto reproductor de un cerdo.
Una fuente fácilmente disponible de ovocitos de cerdo es materiales
del matadero. Para la combinación de técnicas tales como ingeniería
genética, transferencia nuclear y clonación, los ovocitos
generalmente deben madurarse in vitro antes de que estas
células puedan usarse como células receptoras para transferencia
nuclear, y antes de que puedan fertilizarse por la célula
espermática para desarrollarse en un embrión. Este proceso
generalmente requiere recoger ovocitos inmaduros (profase I) de
ovarios de mamífero, por ejemplo, ovarios bovinos obtenidos en un
matadero, y madurar los ovocitos en un medio de maduración antes de
la fertilización o enucleación hasta que el ovocito alcance la fase
de metafase II, que en el caso de ovocitos bovinos generalmente
ocurre aproximadamente 18-24 horas después de la
aspiración. Este periodo de tiempo se conoce como el "periodo de
maduración". En ciertas realizaciones, el ovocito se obtiene de
una lechona. Una "lechona" es un cerdo hembra que nunca ha
tenido descendencia. En otras realizaciones, el ovocito se obtiene
de una cerda. Una "cerda" es un cerdo hembra que previamente ha
producido descendencia.
Un ovocito no humano en fase de metafase II
puede ser el ovocito receptor, en esta fase se cree que el ovocito
puede estar o está suficientemente "activado" para tratar al
núcleo introducido como a un esperma fertilizante. Los ovocitos en
fase de metafase II, que se han madurado in vivo se han usado
satisfactoriamente en técnicas de transferencia nuclear.
Esencialmente, pueden recogerse quirúrgicamente ovocitos en metafase
II maduros de cerdos no superovulados o superovulados de 35 a 48, o
39-41, horas después del inicio del celo o después
de la inyección de gonadotropina coriónica humana (hCG) o una
hormona similar.
Después de un periodo de tiempo de maduración
fijo, que varía de aproximadamente 10 a 40 horas, y preferiblemente
aproximadamente 16-18 horas, los ovocitos pueden
enuclearse. Antes de la enucleación, los ovocitos pueden retirarse
y colocarse en medio apropiado, tal como HECM que contiene 1
miligramo por mililitro de hialuronidasa antes de retirar las
células del cumulus. Los ovocitos separados después pueden
explorarse para los cuerpos polares, y los ovocitos en metafase II
seleccionados, determinados por la presencia de cuerpos polares, se
usan después para transferencia nuclear. La enucleación viene
seguida.
La enucleación puede realizarse por métodos
conocidos, tales como los descritos en la patente de Estados Unidos
Nº 4.994.384. Por ejemplo, ovocitos en metafase II pueden colocarse
en HECM, que contiene opcionalmente 7,5 microgramos por mililitro
de citocalasina B, para la enucleación inmediata, o pueden colocarse
en un medio adecuado, por ejemplo un medio de cultivo de embriones
tal como CR1aa, más suero de vaca en celo al 10%, y después
enuclearse posteriormente, preferiblemente no más de 24 horas
después, y más preferiblemente 16-18 horas
después.
La enucleación puede realizarse por microcirugía
usando una micropipeta para retirar el cuerpo polar y el citoplasma
adyacente. Los ovocitos después pueden explorarse para identificar
aquellos que se han enucleado satisfactoriamente. Un modo de
explorar los ovocitos es teñir los ovocitos con 1 microgramo por
mililitro de colorante Hoechst 33342 en HECM, y después visualizar
los ovocitos bajo irradiación ultravioleta durante menos de 10
segundos. Los ovocitos que se han enucleado satisfactoriamente
después pueden sembrarse en un medio de cultivo adecuado, por
ejemplo, CR1aa más suero al 10%.
Después puede transferirse una única célula de
mamífero no humano de la misma especie que el ovocito enucleado en
el espacio perivitelino del ovocito enucleado usado para producir la
unidad de TN. La célula de mamífero y el ovocito enucleado pueden
usarse para producir unidades de TN de acuerdo con métodos conocidos
en la técnica. Por ejemplo, las células pueden fusionarse por
electrofusión. La electrofusión se consigue proporcionando un pulso
de electricidad que es suficiente para causar una descomposición
transitoria de la membrana plasmática. Esta descomposición de la
membrana plasmática es muy corta porque la membrana se vuelve a
formar rápidamente. Por tanto, si se induce que dos membranas
adyacentes se descompongan y después de la reformación las bicapas
lipídicas se entremezclan, pueden abrirse pequeños canales entre las
dos células. Debido a la inestabilidad termodinámica de dicha
pequeña abertura, ésta se agranda hasta que las dos células se
convierten en una. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos
Nº 4.997.384 de Prather et al. Puede usarse una diversidad de
medios de electrofusión incluyendo, por ejemplo, sacarosa, manitol,
sorbitol y solución tamponada con fosfato. La fusión también puede
conseguirse usando el virus Sendai como agente fusogénico (Graham,
Wister Inot. Symp. Monogr., 9, 19, 1969). También, el núcleo puede
inyectarse directamente en el ovocito en lugar de usar fusión por
electroporación. Véase, por ejemplo, Collas y Barnes, Mol. Reprod.
Dev., 38: 264-267 (1994). Después de la fusión, las
unidades de TN fusionadas resultantes se colocan posteriormente en
un medio adecuado hasta su activación, por ejemplo, medio CR1aa.
Típicamente la activación puede realizarse poco después, por
ejemplo, menos de 24 horas después, o aproximadamente
4-9 horas después, u óptimamente 1-2
horas después de la fusión. En una realización preferida, la
activación sucede al menos una hora después de la fusión y a las
40-41 horas después de la maduración.
La unidad de TN puede activarse por métodos
conocidos. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, cultivar la unidad
de TN a temperatura sub-fisiológica, en esencia,
aplicar un choque térmico frío, o realmente helado a la unidad de
TN. Esto puede hacerse más convenientemente cultivando la unidad de
TN a temperatura ambiente, que es relativamente fría respecto a las
condiciones de temperatura fisiológicas a las que los embriones se
exponen habitualmente. Como alternativa, la activación puede
conseguirse por la aplicación de agentes de activación conocidos.
Por ejemplo, la penetración de ovocitos por esperma durante la
fertilización ha demostrado activar los ovocitos
pre-fusión produciendo cantidades mayores de
preñeces viables y múltiples terneros genéticamente idénticos
después de la transferencia nuclear. Además, pueden usarse
tratamientos tales como choque eléctrico y químico para activar los
embriones de TN después de la fusión. Véase, por ejemplo, la patente
de Estados Unidos Nº 5.496.720, de Susko-Parrish
et al. Además, la activación puede realizarse aumentando
simultánea o secuencialmente los niveles de cationes divalentes en
el ovocito, y reduciendo la fosforilación de proteínas celulares en
el ovocito. Esto puede realizarse generalmente introduciendo
cationes divalentes en el citoplasma del ovocito, por ejemplo,
magnesio, estroncio, bario o calcio, por ejemplo, en forma de un
ionóforo. Otros métodos para aumentar los niveles de cationes
divalentes incluyen el uso de choque eléctrico, tratamiento con
etanol y tratamiento con queladores enjaulados. La fosforilación
puede reducirse por métodos conocidos, por ejemplo, por la adición
de inhibidores de quinasa, por ejemplo, inhibidores de
serina-treonina quinasa, tales como
6-dimetil-aminopurina,
estaurosporina, 2-aminopurina, y esfingosina. Como
alternativa, la fosforilación de las proteínas celulares puede
inhibirse por la introducción de una fosfatasa en el ovocito, por
ejemplo, fosfatasa 2A y fosfatasa 2B.
Las unidades de TN activadas, o "embriones
fusionados", después pueden cultivarse en un medio de cultivo
in vitro adecuado hasta la generación de colonias celulares.
Los medios de cultivo adecuados para el cultivo y maduración de
embriones son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de medios
conocidos, que pueden usarse para el cultivo y mantenimiento de
embriones, incluyen medio de Ham F-10+suero de
ternera fetal al 10% (FCS), Medio de Cultivo
Tisular-199 (TCM-199)+suero de
ternera fetal al 10%, medio
Tyrode-Albúmina-Lactato-Piruvato
(TALP), solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco,
medios de Eagle y Whitten y, en un ejemplo específico, las unidades
de TN activadas pueden cultivarse en medio NCSU-23
durante aproximadamente 1-4 h a aproximadamente
38,6ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5%.
Después, la unidad o unidades de TN cultivadas
pueden lavarse y después colocarse en un medio adecuado contenido
en placas de pocillos que contienen preferiblemente una capa de
alimentación confluyente adecuada. Las capas de alimentación
adecuadas incluyen, a modo de ejemplo, fibroblastos y células
epiteliales. Las unidades de TN se cultivan en la capa de
alimentación hasta que las unidades de TN alcanzan un tamaño
adecuado para transferirlas a una hembra receptora, o para obtener
células que puedan usarse para producir colonias celulares.
Preferiblemente, estas unidades de TN pueden cultivarse hasta al
menos aproximadamente 2 a 400 células, aproximadamente 4 a 128
células, o al menos aproximadamente 50 células.
Las unidades de TN activadas después pueden
transferirse (transferencias de embrión) al oviducto de cerdos
hembra. En una realización, los cerdos hembra pueden ser lechonas
receptoras de celo sincronizado. Pueden usarse lechonas de estirpe
cruzada (large white/Duroc/Landrace) (127,01-181,44
kg (280-400 lbs)). Las lechonas pueden
sincronizarse como animales receptores por administración oral de
18-20 mg de Regu-Mate (Altrenogest,
Hoechst, Warren, NJ) mezclado en el pienso.
Regu-Mate puede suministrarse durante 14 días
consecutivos. Después pueden administrarse i.m. mil unidades de
gonadotropina coriónica humana (hCG, Intervet America, Millsboro,
DE) aproximadamente 105 h después del último tratamiento con
Regu-Mate. Las transferencias de embrión pueden
entonces realizarse aproximadamente 22-26 h después
de la inyección de hCG. En una realización, la preñez puede
llevarse a término y producir el nacimiento de descendencia viva. En
otra realización, la preñez puede detenerse temprano y pueden
recogerse las células embrionarias.
Un método para producir cerdos viables que
carezcan de cualquier expresión de
alfa-1,3-GT funcional puede
comprender cruzar un cerdo macho heterocigótico para el gen de la
alfa-1,3-GT con un cerdo hembra
heterocigótico para el gen de la
alfa-1,3-GT. Los cerdos pueden ser
heterocigóticos debido a la modificación genética de un alelo del
gen de la alfa-1,3-GT para evitar la
expresión de ese alelo. Como alternativa, los cerdos pueden ser
heterocigóticos debido a la presencia de una mutación puntual en un
alelo del gen de la alfa-1,3-GT. La
mutación puntual puede ser una mutación puntual
T-a-G en la segunda base del exón 9
del gen de la alfa-1,3-GT. Se
describe un método para producir un animal porcino que carezca de
cualquier expresión de alfa-1,3-GT
funcional en el que un cerdo macho que contiene una mutación
puntual T-a-G en la segunda base del
exón 9 del gen de la alfa-1,3-GT se
cruza con un cerdo hembra que contiene una mutación puntual
T-a-G en la segunda base del exón 9
del gen de la alfa-1,3-GT.
En un método, pueden cruzarse animales
sexualmente maduros producidos a partir de transferencia nuclear de
células donantes que portan una doble eliminación en el gen de la
alfa-1,3-GT, y ensayarse su
descendencia para el knockout homocigótico. Estos animales knockout
homocigóticos después pueden cruzarse para producir más
animales.
En otro método, los ovocitos de un animal no
humano knockout doble sexualmente maduro pueden fertilizarse in
vitro usando esperma de tipo silvestre de dos líneas de cerdos
genéticamente diferentes e implantarse los embriones en sustitutos
adecuados. La descendencia de estos apareamientos puede ensayarse
para la presencia de la eliminación, por ejemplo, pueden ensayarse
por secuenciación de ADNc, PCR, sensibilidad a toxina A y/o unión
de lectina. Después, en la madurez sexual, pueden aparearse los
animales de cada una de estas camadas.
En ciertos métodos pueden detenerse las preñeces
temprano de modo que puedan aislarse fibroblastos fetales y
caracterizarse adicionalmente fenotípica y/o genotípicamente. Los
fibroblastos que carecen de la expresión del gen de la
alfa-1,3-GT pueden usarse después
para transferencia nuclear de acuerdo con los métodos descritos en
este documento (véase también Dai et al.) para producir
múltiples preñeces y descendencia que porte la doble eliminación
deseada.
Otra realización de la presente invención
proporciona un animal porcino, en el que ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT están inactivados, por
la cual un alelo se inactiva por un acontecimiento de modificación
genética dirigida y el otro alelo se inactiva mediante una mutación
puntual de origen natural.
La presente invención proporciona, por primera
vez, cerdos viables en los que ambos alelos del gen de la alfa 1,3
galactosiltransferasa se han inactivado. La invención también
proporciona órganos, tejidos, y células obtenidos de dicho cerdo,
que son útiles para xenotransplante.
En una realización, la invención proporciona
órganos, tejidos y/o células o líneas celulares purificadas o
sustancialmente puras porcinos obtenidos de cerdos que carecen de
cualquier expresión de alfa1,3GT funcional.
En una realización, la invención proporciona
órganos que son útiles para xenotransplante. Puede usarse cualquier
órgano porcino, incluyendo, aunque sin limitación: cerebro, corazón,
pulmones, glándulas, cerebro, ojo, estómago, bazo, páncreas,
riñones, hígado, intestinos, útero, vejiga, piel, pelo, uñas,
orejas, nariz, boca, labios, encías, dientes, lengua, glándulas
salivares, amígdalas, faringe, esófago, intestino grueso, intestino
delgado, recto, ano, píloro, glándula tiroides, glándula tímica,
cápsula suprarrenal, huesos, cartílago, tendones, ligamentos,
músculos esqueléticos, músculos lisos, vasos sanguíneos, sangre,
médula espinal, tráquea, uréteres, uretra, hipotálamo, pituitaria,
glándulas suprarrenales, ovarios, oviductos, útero, vagina,
glándulas mamarias, testículos, vesículas seminales, pene, linfa,
ganglios linfáticos y vasos linfáticos.
En otra realización, la invención proporciona
tejidos que son útiles para xenotransplante. Puede usarse cualquier
tejido porcino, incluyendo, aunque sin limitación: epitelio, tejido
conectivo, sangre, hueso, cartílago, músculo, nervio, adenoide,
adiposo, areolar, hueso, adiposo pardo, esponjoso, músculo,
cartilaginoso, cavernoso, condroide, cromafínico, dartoico,
elástico, epitelial, graso, fibrohialino, fibroso, de Gamgee,
gelatinoso, de granulación, linfoide asociado al intestino,
vascular de Haller, hemopoyético duro, indiferente, intersticial, de
revestimiento, de los islotes, linfático, linfoide, mesenquimático,
mesonefrítico, conectivo mucoso, adiposo multilocular, mieloide,
nasión blando, nefrogénico, nodal, óseo, osteogénico, osteoide,
periapical, reticular, retiforme, elástico, músculo esquelético,
músculo liso, y tejido subcutáneo.
En una realización adicional, la invención
proporciona células y líneas celulares de animales porcinos que
carecen de la expresión de alfa1,3GT funcional. En una realización,
estas células o líneas celulares pueden usarse para
xenotransplante. Pueden usarse células de cualquier tejido u órgano
porcino, incluyendo, aunque sin limitación: células epiteliales,
células fibroblásticas, células neurales, queratinocitos, células
hematopoyéticas, melanocitos, condrocitos, linfocitos (B y T),
macrófagos, monocitos, células mononucleares, células de músculo
cardiaco, otras células musculares, células de la granulosa, células
del cumulus, células epidérmicas, células endoteliales, células de
los islotes de Langerhans, células secretoras de insulina
pancreáticas, células pancreáticas alfa-2, células
pancreáticas beta, células pancreáticas alfa-1,
células sanguíneas, células precursoras sanguíneas, células óseas,
células precursoras óseas, células madre neuronales, células madre
primordiales, hepatocitos, queratinocitos, células endoteliales de
la vena umbilical, células endoteliales aórticas, células
endoteliales microvasculares, fibroblastos, células estrelladas
hepáticas, células del músculo liso aórtico, miocitos cardiacos,
neuronas, células de Kupffer, células de músculo liso, células de
Schwann, y células epiteliales, eritrocitos, plaquetas,
neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos, basófilos,
adipocitos, condrocitos, células del islote pancreático, células
tiroideas, células paratiroideas, células parótidas, células
tumorales, células gliales, astrocitos, glóbulos rojos, glóbulos
blancos, macrófagos, células epiteliales, células somáticas,
células de la pituitaria, células suprarrenales, células pilosas,
células de la vejiga, células renales, células retinianas, bastones
retinianos, conos retinianos, células cardiacas, células del
marcapasos, células esplénicas, células presentadoras de antígeno,
células de memoria, células T, células B, células plasmáticas,
células musculares, células del ovario, células del útero, células
de la próstata, células epiteliales vaginales, células
espermáticas, células testiculares, células germinales, óvulos,
células de leydig, células peritubulares, células de Sertoli,
células luteínicas, células cervicales, células del endometrio,
células mamarias, células foliculares, células mucosas, células
ciliadas, células epiteliales no queratinizadas, células epiteliales
queratinizadas, células pulmonares, células calciformes, células
epiteliales columnares, células dopaminérgicas, células epiteliales
escamosas, osteocitos, osteoblastos, osteoclastos, dopaminérgicas,
células madre embrionarias (no humanas), fibroblastos y
fibroblastos fetales. En una realización específica, se proporcionan
células pancreáticas, incluyendo, aunque sin limitación, células de
los islotes de Langerhans, células secretoras de insulina, células
alfa-2, células beta, células alfa-1
de cerdos que carecen de la expresión de
alfa-1,3-GT
funcional.
funcional.
Los derivados no viables incluyen tejidos
separados de células viables por tratamiento enzimático o químico,
estos derivados tisulares pueden procesarse adicionalmente mediante
reticulación u otros tratamientos químicos antes de su uso en
transplante. En una realización preferida, los derivados incluyen
matriz extraceluar obtenida de una diversidad de tejidos,
incluyendo piel, de las vías urinarias, vejiga o tejidos submucosos
de los órganos. Además, se proporcionan tendones, articulaciones y
huesos separados de tejido viable para incluir las válvulas
cardiacas y otros tejidos no viables como dispositivos médicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células pueden administrarse en un
hospedador a petición en una amplia diversidad de modos. Los modos
preferidos de administración son parenteral, intraperitoneal,
intravenoso, intradérmico, epidural, intraespinal, intrasternal,
intra-articular, intra-sinovial,
intratecal, intra-arterial, intracardiaco,
intramuscular, intranasal, subcutáneo, intraorbital, intracapsular,
tópico, por parche transdérmico, por administración rectal, vaginal
o uretral incluyendo mediante supositorio, percutáneo, por
pulverización nasal, por implante quirúrgico, parche quirúrgico
interno, bomba de infusión, o mediante catéter. En un ejemplo, el
agente y el vehículo se administran en una formulación de
liberación lenta tal como una inyección directa al tejido o en
embolada, implante, micropartícula, microesfera, nanopartícula
o
nanoesfera.
nanoesfera.
Los trastornos que pueden tratarse por infusión
de las células descritas incluyen, aunque sin limitación,
enfermedades resultantes de un fallo o una disfunción de la
producción y maduración normal de células sanguíneas (es decir,
anemia aplásica y trastornos hiperproliferativos de células madre);
enfermedades neoplásicas, malignas en los órganos hematopoyéticos
(por ejemplo, leucemia y linfomas); tumores sólidos malignos de
amplio espectro de origen no hematopoyético; afecciones
autoinmunes; y trastornos genéticos. Dichos trastornos incluyen,
aunque sin limitación, enfermedades resultantes de un fallo o
disfunción de la producción y maduración normal de células
sanguíneas, trastornos hiperproliferativos de células madre,
incluyendo anemia aplásica, pancitopenia, agranulocitosis,
trombocitopenia, aplasia de glóbulos rojos, síndrome de
Blackfan-Diamond, debido a fármacos, radiación, o
infección idiopática; malignidades hematopoyéticas incluyendo
leucemina linfoblástica (linfocítica) aguda, leucemina linfocítica
crónica, leucemia mielogénica aguda, leucemia mielogénica crónica,
mieloesclerosis maligna aguda, mieloma múltiples, policitemia vera,
mielometaplasia agnogénica, macroglobulinemia de Waldenstrom,
linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin; inmunosupresión en pacientes
con tumores sólidos malignos incluyendo melanoma maligno, carcinoma
del estómago, carcinoma de ovario, carcinoma de mama, carcinoma
pulmonar microcítico, retinoblastoma, carcinoma testicular,
glioblastoma, rabdomiosarcoma, neuroblastoma, sarcoma de Ewing,
linfoma; enfermedades autoinmunes incluyendo artritis reumatoide,
diabetes tipo I, hepatitis crónica, esclerosis múltiples, lupus
sistémico eritematoso; trastornos genéticos (congénitos) incluyendo
anemias, aplásica familiar, síndrome de Fanconi, deficiencias de la
dihidrofolato reductasa, deficiencia de la formamino transferasa,
síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome diseritropoyético
congénito I-IV, síndrome de
Chwachmann-Diamond, deficiencias de la
dihidrofolato reductasa, deficiencia de la formamino transferasa,
síndrome de Lesch-Nyhan, esferocitosis congénita,
eliptocitosis congénita, estomatocitosis congénita, enfermedad de Rh
nulo congénita, hemoglobinuria paroxística nocturna, variantes 1,
2, 3 de la G6PD (glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa), deficiencia de la piruvato quinasa, sensibilidad
congénita a eritropoyetina, deficiencia, enfermedad y rasgos
falciformes, talasemia alfa, beta, gamma, metahemoglobinemia,
trastornos congénitos de inmunidad, enfermedad de inmunodeficiencia
combinada severa (SCID), síndrome del linfocito desnudo,
inmunodeficiencia combinada sensible a ionóforos, inmunodeficiencia
combinada con una anormalidad de recubrimiento, deficiencia de la
nucleósido fosforilasa, deficiencia en la actina de granulocitos,
agranulocitosis infantil, enfermedad de Gaucher, deficiencia en la
adenosina desaminasa, síndrome de Kostmann, disgenesia reticular,
síndromes congénitos de disfunción leucocitaria; y otros tales como
osteoporosis, mieloesclerosis, anemias hemolíticas adquiridas,
inmunodeficiencias adquiridas, trastornos infecciosos que causan
inmunodeficiencias primarias o secundarias, infecciones bacterianas
(por ejemplo, Brucelosis, Listeriosis, tuberculosis, lepra),
infecciones parasitarias (por ejemplo, malaria, Leishmaniasis),
infecciones fúngicas, trastornos que implican desproporción en
series de células linfoides y funciones inmunes alteradas debido a
la edad, trastornos fagocitarios, agranulocitosis de Kostmann,
enfermedad granulomatosa crónica, síndrome de
Chediak-Higachi, deficiencia de la actina de
neutrófilos, deficiencia de GP-180 de la membrana
de neutrófilos, enfermedades de almacenamiento metabólico,
mucopolisacaridosis, mucolipidosis, trastornos diversos que
implican mecanismos inmunes, síndrome de
Wiskott-Aldrich, deficiencia de alfa
1-antitripsina,
etc.
etc.
Las enfermedades o patologías incluyen
enfermedades neurodegenerativas, enfermedades hepatodegenerativas,
enfermedades nefrodegenerativas, lesión de médula espinal,
traumatismo o cirugía craneal, infecciones víricas que provocan
degeneración de tejidos, órganos, o glándulas, y similares. Dichas
enfermedades neurodegenerativas incluyen aunque sin limitación,
complejo de demencia del SIDA; enfermedades desmielinizantes, tales
como esclerosis múltiples y mielitis transversa aguda; trastornos
extrapiramidales y cerebelares, tales como lesiones del sistema
corticoespinal; trastornos de los ganglios basales o trastornos
cerebelares; trastornos de movimiento hipercinético, tales como
corea de Huntington y corea senil; trastornos del movimiento
inducidos por fármacos, tales como los inducidos por fármacos que
bloquean los receptores de dopamina del SNC; trastornos de
movimiento hipocinético, tales como enfermedad de Parkinson;
parálisis supra-nuclear progresiva; lesiones
estructurales del cerebelo; degeneraciones espinocerebelares, tales
como ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones corticales
cerebelares, degeneraciones de sistemas múltiples (Mencel, Dejerine
Thomas, Shi-Drager, y
Machado-Joseph), trastornos sistémicos, tales como
enfermedad de Rufsum', abetalipoproteinemia, ataxia,
telangiectasia; y trastorno mitocondrial multisistema; trastornos
centrales desmielinizantes, tales como esclerosis múltiples,
mielitis transversa aguda; y trastornos de la unidad motora, tales
como atrofias musculares neurogénicas (degeneración celular del
cuerno anterior, tales como esclerosis lateral amiotrófica, atrofia
muscular espinal infantil y atrofia muscular espinal juvenil);
enfermedad de Alzheimer; síndrome de Down a edad intermedia;
enfermedad con cuerpos de Lewy difusos; demencia senil de tipo
cuerpos de Lewy; enfermedad de Parkinson, síndrome de
Wernicke-Korsakoff; alcoholismo crónico; enfermedad
de Creutzfeldt-Jakob; panencefalitis esclerosante
subaguda, enfermedad de Hallervorden-Spatz; y
demencia pugilística. Véase, por ejemplo, Berkow et al.,
(eds.) (1987), The Merck Manual, (15a) ed.), Merck and Co.,
Rahway,
NJ.
NJ.
La presente invención se describe con detalle
adicional en los siguientes ejemplos. Se pretende que los ejemplos
proporcionados a continuación sean solamente ilustrativos, y no se
pretende que limiten el alcance de la invención.
\newpage
Ejemplo
1
Aislamiento y transfección de fibroblastos
fetales porcinos primarios. Se aislaron células fibroblásticas
fetales (PCFF4-1 a PCFF4-10) de 10
fetos de la misma preñez en el día 33 de gestación. Después de
eliminar la cabeza y las vísceras, los fetos se lavaron con
solución salina equilibrada de Hank (HBSS;
Gibco-BRL, Rockville, MD), se colocaron en 20 ml de
HBSS, y se trocearon con pequeñas tijeras quirúrgicas. El tejido se
sedimentó y se resuspendió en tubos de 50 ml con 40 ml de DMEM y
100 U/ml colagenasa (Gibco-BRL) por feto. Los tubos
se incubaron durante 40 min. en un baño de agua en agitación a
37ºC. El tejido digerido se dejó reposar durante
3-4 min. y el sobrenadante rico en células se
transfirió a un nuevo tubo de 50 ml y se sedimentó. Las células
después se resuspendieron en 40 ml de DMEM que contenía suero de
ternera fetal al 10% (FCS), 1X aminoácidos no esenciales, piruvato
sódico 1 mM y 2 ng/ml de bFGF, y se sembraron en placas de 10 cm.
Todas las células se crioconservaron después de alcanzar la
confluencia. Se aislaron células SLA-1 a
SLA-10 de 10 fetos en el día 28 de preñez. Los
fetos se machacaron a través de un tamiz metálico de malla 60 usando
fórceps quirúrgicos curvados lentamente para no generar calor
excesivo. La suspensión celular después se sedimentó y se
resuspendió en 30 ml de DMEM que contenía FCS al 10%, 1X
aminoácidos no esenciales, 2 ng/ml de bFGF, y 10 \mug/ml de
gentamicina. Las células se sembraron en placas de 10 cm, se
cultivaron de uno a tres días, y se crioconservaron. Para las
transfecciones, se introdujeron 10 \mug de ADN del vector
linealizado en 2 millones de células por electroporación. Cuarenta
y ocho horas después de la transfección, las células transfectadas
se sembraron en placas de 48 pocillos a una densidad de 2.000
células por pocillo y se seleccionaron con 250 \mug/ml de
G418.
Construcción del vector knockout. Se
construyeron dos vectores knockout para
alfa-1,3-GT, pPL654 y pPL657, a
partir de ADN isogénico de dos fibroblastos fetales porcinos
primarios, células SLA1-10 y
PCFF4-2. Se generó un fragmento genómico de 6,8 kb
de alfa-1,3-GT, que incluye la mayor
parte del intrón 8 y el exón 9, por PCR a partir de ADN purificado
de células SLA1-10 y células
PCFF4-2, respectivamente. El sitio EcoRV único en
el extremo 5' del exón 9 se convirtió en un sitio SalI y se insertó
un fragmento de 1,8 kb IRES-neo-poli
A en el sitio SalI. IRES (sitio de entrada interno de ribosomas)
funciona como sitio de inicio de la traducción para la proteína
neo. Por tanto, ambos vectores tienen un brazo de recombinación 5'
de 4,9 kb y un brazo de recombinación 3' de 1,9 kb
(Figura 6).
(Figura 6).
PCR 3' y PCR de largo alcance. Se
resuspendieron aproximadamente 1.000 células en 5 \mul de tampón
de lisis de embriones (ELB) (Tris 40 mM, pH 8,9, Triton
X-100 al 0,9%, NP40 al 0,9%, 0,4 mg/ml de proteinasa
K), se incubaron a 65ºC durante 15 min. para lisar las células y se
calentaron hasta 95ºC durante 10 min. para inactivar la proteinasa
K. Para el análisis de PCR 3', los fragmentos se amplificaron usando
el sistema de PCR de elevada fidelidad de expansión (Roche
Molecular Biochemicals) en 25 \mul de volumen de reacción con los
siguientes parámetros: 35 ciclos de 1 min. a 94ºC, 1 min. a 60ºC, y
2 min. a 72ºC. Para la LR-PCR, los fragmentos se
amplificaron usando el sistema TAKARA LA (Panvera/Takara) en 50
\mul de volumen de reacción con los siguientes parámetros: 30
ciclos de 10 s a 94ºC, 30 s a 65ºC, 10 min. + 20 s aumento/ciclo a
68ºC, seguido de un ciclo final de 7 min. a 68ºC. Las condiciones
de PCR 3' y LR-PCR para el ADN purificado fueron las
mismas que para las células excepto en que se mezcló 1 \mul de
ADN purificado (30 \mug/ml) con 4 \mul de ELB.
Análisis de transferencia de Southern de
muestras celulares. Se lisaron aproximadamente 10^{6} células
durante una noche a 60ºC en tampón de lisis (Tris 10 mM, pH 7,5,
EDTA 10 mM, NaCl 10 mM, Sarcosil al 0,5% (p/v), 1 mg/ml de
proteinasa K) y el ADN se precipitó con etanol. El ADN después se
digirió con BstEII y se separó en un gel de agarosa al 1%. Después
de la electroforesis, el ADN se transfirió a una membrana de nylon y
se sondeó con la sonda marcada con digoxigenina en el extremo 3'.
Las bandas se detectaron usando un sistema de sustrato
quimioluminiscente (Roche Molecular Biochemicals).
Resultados. Las colonias resistentes a
antibiótico (G418) se exploraron por PCR 3' con neo442S y
\alphaGTE9A2 como cebadores directo e inverso. Neo442S está en el
extremo 3' del gen neo y \alphaGTE9A2 está en el extremo 3' del
exón 9 en secuencias localizadas fuera del brazo de recombinación 3'
(Figura 6). Por lo tanto, solamente a través de modificación
dirigida satisfactoria en el locus \alpha1,3GT se obtendría el
producto de PCR de 2,4 kb esperado. De un total de siete
transfecciones en cuatro líneas celulares diferentes, se recogieron
1105 colonias resistentes a G418, de las cuales 100 (9%) eran
positivas para la alteración del gen \alpha1,3 GT en la
exploración por PCR 3' inicial (intervalo 2,5-12%).
Las colonias 657A-A8, 657A-I6, y
657A-I11 mostraron la banda de 2,4 kb esperada,
mientras que las células PCFF4-6 de control, y otra
colonia resiste a G418, 657A-P6, fueron negativas.
Se congeló una parte de cada colonia positiva a PCR 3'
inmediatamente, en varias alícuotas pequeñas, para su uso futuro en
experimentos de TN, mientras que el resto de las células se
expandieron para PCR de largo alcance (LR-PCR) y
transferencia de Southern.
Como el análisis de PCR para detectar uniones de
recombinación, o el análisis de ARNm (RT-PCR) pueden
generar resultados falsos positivos, se realizó una PCR de largo
alcance, que abarcaría la región modificada de forma dirigida
completa. La LR-PCR cubre la secuencia genómica de
7,4 kb de \alpha1,3GT desde el exón 8 hasta el extremo del exón
9, con los dos cebadores (\alphaGTE8S y \alphaGTE9A2)
localizados fuera de la región de recombinación (Figura 2). Las
células PCFF4-6 de control, y la colonia negativa a
la PCR 3', 657A-P6, mostraron solamente la banda de
7,4 kb endógena del locus \alpha1,3GT de tipo silvestre. En
contraste, tres de las colonias positivas a PCR 3',
657A-A8, 657A-I6 y
657A-I11, mostraron tanto la banda endógena de 7,4
kb como una nueva banda de 9,2 kb, del tamaño esperado para la
inserción dirigida del casete IRES-neo de 1,8 kb en
el locus \alpha1,3GT.
Aproximadamente la mitad (17/30) de las colonias
positivas a LR-PCR se expandieron satisfactoriamente
para producir suficientes números de células (1 x 10^{6} células)
para análisis de Southern. Se preveía que las colonias serían
heterocigóticos para el knockout en el locus \alpha1,3 GT, y por
tanto deben tener una copia del gen normal sin modificar, y una
copia alterada del gen \alpha1,3 GT. Con digestión con BstEII, las
células knockout para \alpha1,3 GT deben mostrado dos bandas: una
banda de 7 kb del tamaño esperado para el alelo \alpha1,3 GT
endógeno, y una banda de 9 kb característica de la inserción de
secuencias IRES-neo en el locus \alpha1,3 GT
(Figura 2). Las 17 colonias positivas a LR-PCR se
confirmaron por análisis de Southern para el knockout. Las mismas
membranas se volvieron a sondear con secuencias específicas para neo
y la banda de 9 kb se detectó con la sonda neo, conformando de este
modo la inserción dirigida del casete IRES-neo en el
locus \alpha1,3GT alterado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se aislaron fibroblastos fetales knockout para
alfa-1,3-GT heterocigóticos, células
(657A-I11 1-6), de una preñez en el
día 32 como se ha descrito anteriormente (Véase también Dai et
al. Nature Biotechnology 20:451 (2002)). Se construyó un vector
knockout para alfa-1,3-GT dirigido
al ATG (codón de inicio) (pPL680), que también contenía un gen neo,
para eliminar el segundo alelo del gen de la
alfa-1,3-GT. Estas células se
transfectaron por electroporación con pPL680 y se seleccionaron
para el fenotipo alfa1,3Gal-negativo con toxina A
de C. difficile purificada (descrito a continuación).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Las células porcinas (PCFF4-6)
se expusieron durante 1 hora o durante una noche a diluciones en
serie de factor diez de toxina A (0,00001 \mug/ml a 10
\mug/ml). Las células se cultivaron en placas de 24 pocillos y se
incubaron con la toxina durante 1 hora o durante una noche a 37ºC.
Los resultados de esta exposición se detallan en la Tabla 2.
Claramente, una exposición de 1 hora a toxina A a >1 \mug/ml
provocaba un efecto citotóxico en >90% de las células. Por lo
tanto se eligió una concentración de toxina A a o ligeramente por
encima de 1 \mug/ml para la selección de células alteradas
genéticamente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las células disgregadas de un embrión porcino
(I-11:1-6) que contenía un knockout
dirigido previamente identificado en un alelo del gen de la gal
alfa-1,3-GT (Dai et al.) se
transfectaron con 10 \mug de ADN del vector linealizado (captura
de promotor) por electroporación. Después de 48 horas, las células
se sembraron en placas de 48 pocillos a una densidad de 2000
células por pocillo y se seleccionaron con 250 \mug/ml de G418.
Cinco días después de la transfección, se extrajo el medio de los
pocillos, y se reemplazó con 2 \mug/ml de toxina A en medio de
cultivo (DMEM de alto contenido en glucosa con 2,8 \mug/ml de bFGF
y FCS al 20%). Las células se expusieron al efecto selectivo de la
toxina A durante 2 horas a 37ºC. Se extrajo el medio que contenía
toxina A, junto con cualquier célula afectada que se hubiera
liberada de la superficie de la placa, las células restantes se
lavaron con medio fresco, y se reemplazo el medio sin toxina A. Diez
días después, las células se expusieron de nuevo a toxina A a 1,3
\mug/ml en medio durante 2 horas a 37ºC. El medio, la toxina A, y
cualquier célula en solución se retiraron, las células restantes se
lavaron, y se reemplazó el medio.
Dieciséis días después de la transfección, se
recogió una única colonia que mostrada insensibilidad a toxina A,
denominada 680B1, y una parte se envió para análisis de ADN y
tinción con lectina. El análisis de ADN indicó que la
insensibilidad a toxina A no se debía a la integración del segundo
vector diana; sin embargo, las células no se teñían con lectina GSL
IB-4, lo que indica que había sucedido un knockout
funcional del locus. Las células knockout doble 680B1 se usaron
para transferencia nuclear en 5 receptores y se produjeron tres
preñeces. Dos de estas preñeces sufrieron un aborto espontáneamente
en el primer mes; los cuatro fetos de la preñez restante se
recogieron en el día 39 de la preñez y las células se disgregaron y
sembraron en cultivo tisular. Estas células fetales
(680B1-1, 680B1-2,
680B1-3, 680B1-4) se expusieron a
toxina A a 1 \mug/ml durante 1 hora a 37ºC, seguido de
eliminación del medio, lavado celular, y reemplazo del medio sin
toxina A. Los fetos 1, 2, y 4 no se vieron afectados por la toxina
A, mientras que la mayor parte de las células del feto 3 se
redondearon, lo que indica que este embrión era sensible a los
efectos citotóxicos de la toxina A.
Los fetos 1, 2, y 4 no se unían a lectina GS
IB4, como se indica por el análisis FACS (véase la Tabla 3),
mientras que el 3 se unía a lectina. Esto sugiere que los fetos 1,
2, y 4 no portan el epítopo alfa 1,3 gal para el que esta lectina
particular es específica.
Células positivas a lectina GS IB4 (%)
Se realizó un ensayo de fijación del complemento
sobre células de los cuatro fetos. El ensayo de lisis del
complemento se desarrolló como un bioensayo para la ausencia de
expresión de alfa gal. El suero humano contiene elevados niveles de
anticuerpos preformados contra alfa gal así como el repertorio
completo de proteínas reguladoras del complemento (la vía C3). La
presencia de alfa gal sobre la superficie de una célula, después de
la unión del anticuerpo anti-alfa gal, activa la
cascada del complemento, y provoca lisis celular mediada por el
complemento. Las células alfa-gal negativas serían
resistentes a la lisis mediada por el complemento. En tres ensayos
diferentes, se expusieron células de cerdo B1 y de control a suero
humano más el complemento, y se realizaron ensayos para evaluar la
sensibilidad o resistencia a la lisis celular mediada por el
complemento indiciada por alfa-gal. El ensayo se
realizó con células B1-1, B1-2, y
B1-4, así como células GT KO heterocigóticas
(B1-3, gal positivas), y con células de cerdo
PCFF4-6 alfa-gal (+) de tipo
silvestre como control. Las células se expusieron a uno de tres
tratamientos; dos controles negativos, albúmina sérica bovina (BSA),
y suero humano inactivado por calor (HIA-HS) no
contienen ninguna proteína del complemento funcional y por tanto no
se esperaría que causan ninguna lisis celular significativa; el
tercer tratamiento, suero humano no inactivado por calor (NHS)
contiene el complemento humano funcional así como anticuerpos
específicos anti-gal, y por tanto se esperaría que
lisara células que tiene galactosa alfa 1,3 galactosa sobre su
superficie celular.
Los resultados mostrados en la Figura 1
demuestran claramente que las células B1-1,
B-2 y B1-4 son resistentes a la
lisis mediada por el complemento humano mientras que las células
B1-3, que son \alpha1,3 Gal positivas, son aún
tan sensibles a plasma humano como las células
PCFF4-6 de tipo silvestre.
Los resultados de secuenciación del ADNc de
todos los fetos indicaron que los fetos 1, 2 y 4 contienen una
mutación puntual en el segundo alelo alfa 1,3 GT, un cambio que
podría producir una enzima disfuncional (véase la figura 2). Este
mutación sucedía en el pb 424 de la región codificante,
significativamente, el segundo par de bases del exón 9, del gen de
la alfa-1,3-GT (GGTA1) (Nº de acceso
a GenBank L36152) como una conversión de un resto de timina a
guanina, que provoca una sustitución aminoacídica de tirosina en el
aa 142 en un ácido aspártico.
Esto es una conversión significativa, ya que la
tirosina, un aminoácido hidrófilo, es un componente crítico del
sitio de unión a UDP de alfa 1,3GT (véase la Fig. 3). El análisis de
la estructura cristalina de la proteína
alfa-1,3-GT bovina mostró que esta
tirosina es el centro del dominio catalítico de la enzima, y está
implicada en la unión UDP-Gal (Gastinel et
al., EMBO Journal 20(4): 638-649, 2001).
Por lo tanto, se esperaría que un cambio de tirosina (un aminoácido
hidrófobo) en ácido aspártico (un aminoácido hidrófilo) causara la
alteración de la función \alphaGT (como se observa).
Para confirmar que el ADNc mutado no creará
proteína \alphaGT funcional, se clonaron los ADNc del segundo
alelos de las 4 células en un vector de expresión y este vector de
expresión de GT se introdujo por transfección en células
fibroblásticas humanas (células HeLa) así como en células primarias
de mono Rhesus. Como los seres humanos y los monos del viejo mundo
carecen del gen de la alfa 1,3 GT funcional, las células HeLa no
tendrían una alfa 1,3 galactosa sobre su superficie celular (como
se ensayó por experimentos de unión a lectina). Los resultados
mostraron que las células HeLa y de mono, cuando se transfectaban
con ADNc obtenido de células B1-1,
B1-2 y B1-4, aún eran \alpha1,3
Gal negativas por tinción con IB4-lectina, mientras
células Hela y de mono Rhesus transfectadas con ADNc de la célula
B1-3, creaban un transcrito funcional de alfa 1,3 GT
y posteriormente eran \alpha1,3Gal positivas. Claramente, las
células con la mutación aspartato (en lugar de tirosina) no pueden
crear alfa 1,3 galactosiltransferasa
funcional.
funcional.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Preparación de células para transferencia
nuclear. Las células donantes se manipularon genéticamente para
producir células homocigóticas para la deficiencia de alfa 1,3 GT
como se ha descrito en líneas generales anteriormente. La
transferencia nuclear se realizó por métodos que son bien conocidos
en la técnica (véase, por ejemplo, Dai et al., Nature
Biotechnology 20: 251-255, 2002; y Polejaeva et
al., Nature 407:86-90, 2000), usando
fibroblastos porcinos seleccionados con toxina A como donantes
nucleares que se produjeron como se ha descrito en detalle
anteriormente en este documento.
Transferencia de embriones y nacimientos vivos
resultantes. En el intento inicial de producir cerdos vivos
alfa-1,3-GT dKO por transferencia
nuclear, se realizó un total de 16 transferencias de embriones con
células donantes manipuladas genéticamente. Se establecieron nueve
preñeces iniciales pero solamente dos llegaron más allá del día 75
de gestación. Cinco lechones nacieron el 25 de julio de 2002. Un
lechón murió inmediatamente después del nacimiento y otros cuatro
nacieron vivos y parecían normales (Figura 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se obtuvieron células fibroblásticas del rabo y
secciones de tejido umbilical de los 5 lechones knockout doble y se
tiñeron usando la lectina GS-IB4 como se ha descrito
previamente. No se observó tinción, lo que indicia una ausencia
completa del epítopo galactosa alfa 1,3 galactosa sobre la
superficie de los tejidos de estos animales (datos no mostrados).
Células endoteliales de la aorta y fibroblastos musculares y del
rabo del lechón muerto (761-1) eran negativos con
tinción con lectina GS-IB4. El análisis de FACS de
fibroblastos musculares del lechón 761-1 también
mostró un resultado negativo para la unión a GS-IB4.
Secciones tisulares de hígado, riñón, bazo, piel, intestino,
músculo, cerebro, corazón, páncreas, pulmón, aorta, lengua, ombligo,
y rabo obtenidas del lechón 761-1 eran todas
negativas con tinción con GS-IB4, lo que indica una
ausencia completa de epítopos alfa 1,3Gal de superficie celular
detectables (Phelps et al., Science 299:
411-414, 2003 incluyendo la figura S3).
Se realizó un ensato de inmunogenicidad in
vivo con ratones knockout para alfa 1,3GT. Se inyectaron grupos
celulares tipo islote (ICC) aislados del páncreas del lechón
761-1 por vía intraperitoneal en ratones knockout
para alfa 1,3GT. Se usaron ICC de un lechón tipo silvestre neonato
como control. Como se muestra en la fig. 5, no se observó aumento
en el título de inmunoglobulina M (IgM) contra alfa 1,3 gal en
ratones knockout para alfa 1,3GT después de la inyección con ICC
del lechón alfa 1,3GT DKO, en contraste con los aumentos
significativos del título de IgM observados en aquellos ratones
inyectados con ICC de lechón de tipo silvestre (Phelps et
al., Science 299: 411-414, 2003 incluyendo la
figura S4). Este resultado demuestra claramente que las células de
lechón DKO no crean ningún epítopo alfa 1,3Gal.
La secuenciación del ADN obtenido de los cinco
lechones confirmó la presencia de la mutación en el pb 424 del gen
GGTA1, como se observa en las células 680B1-2 usadas
para clonar estos animales (Figura 2).
Desde esta primera producción satisfactoria de
una camada de cerdos alfa-GT dKO, se han producido
dos camadas posteriores de lechones dKO por transferencia nuclear,
en un caso (camada 662) usando los fibroblastos fetales dKO como
células donantes nucleares. La camada 660 se produjo por
transferencia nuclear usando células fibroblásticas del rabo de un
miembro de la camada 761 como donante nuclear. Estos nacimientos se
resumen en la Tabla 4.
Ejemplo
6
Se ha generado un total de 29 cerdos hembra
GT-SKO clonados confirmados por transferencia de
Southern y 25 cerdos macho GT-SKO clonados
confirmados por transferencia de Southern hasta la fecha. Estos
machos y hembras heterocigóticos (cerdos knockout simple para el
gen de la alfa1,3GT) se han cruzado por cruce natural y por
inseminación artificial (IA), para generar una piara de cerdos DKO
para su uso en estudios preclínicos y ensayos clínicos humanos. Se
han producido 16 lechones alfa1,3-GT DKO de 13
camadas.
Esta invención se ha descrito con referencia a
realizaciones ilustrativas. Otras realizaciones de la invención
general descrita en este documento y modificaciones serán evidentes
para los especialistas en la técnica y todas se consideran dentro
del alcance de la invención.
Claims (49)
1. Un cerdo en el que ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT son inactivos, donde un
alelo se vuelve inactivo a través de al menos una mutación
puntual.
2. Un cerdo de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que al menos un alelo se vuelve inactivo por un acontecimiento
de modificación genética dirigida.
3. Un cerdo de acuerdo con la reivindicación 2,
donde el acontecimiento de modificación genética dirigida es
recombinación homóloga.
4. Un cerdo de acuerdo con la reivindicación 2 o
reivindicación 3, donde el acontecimiento de modificación genética
dirigida usa una construcción de modificación dirigida al exón 9 del
gen de la alfa-1,3-GT.
5. Un cerdo de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que ambos alelos se vuelven inactivos
a través de al menos una mutación puntual.
6. Un cerdo de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde la al menos una mutación puntual es
una mutación de sustitución, deleción o inserción o una combinación
de las mismas.
7. Un cerdo de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde al menos una mutación puntual es una
mutación puntual T-a-G en la segunda
base del exón 9.
8. Un cerdo de acuerdo con la reivindicación 7,
que comprende la mutación puntual
T-a-G en la segunda base del exón 9
en ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT.
9. Un cerdo de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, donde un alelo se vuelve inactivo a través
de al menos dos mutaciones puntuales.
10. Un órgano de un cerdo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. El órgano de la reivindicación 10, donde el
órgano es un riñón, un hígado, un corazón, un pulmón o un
páncreas.
12. Un tejido de un cerdo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
13. El tejido de la reivindicación 12, donde el
tejido es cartílago, hueso, adiposo o músculo.
14. Una célula o una línea celular de un cerdo
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
15. La célula de la reivindicación 14, donde la
célula se obtiene del páncreas.
16. La célula de la reivindicación 15, donde la
célula es una célula del islote de Langerhans o una célula
secretora de insulina.
17. Un método para seleccionar células que
carecen de la expresión de galactosa alfa-1,3
galactosa, que comprende:
- a)
- exponer una población de células a toxina A de Clostridium difficile;
- b)
- eliminar las células que se levantan de la matriz de superficie porque están afectadas de forma adversa por la toxina A debido a la citotoxicidad mediada por receptor de la toxina; y
- c)
- expandir y mantener aquellas células que no muestran los efectos de citotoxicidad medida por receptor.
18. El método de la reivindicación 17, en el que
la toxina A de Clostridium difficile usada para la selección
está en forma de una toxina purificada.
19. El método de la reivindicación 17, en el que
la toxina A de Clostridium difficile usada para la selección
está en forma de un fluido sobrenadante de cultivo.
20. El método de la reivindicación 17, en el que
la toxina purificada se aplica a células dispersadas, y en el que
dichas células dispersadas después se cultivan in vitro en
recipientes adecuados para la adherencia celular.
21. El método de la reivindicación 17, en el que
la toxina purificada se aplica a células adheridas.
22. El método de la reivindicación 17, en el que
el fluido sobrenadante de cultivo se aplica a células dispersadas y
no adheridas seguido de cultivo en recipientes adecuados para la
adherencia celular.
23. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 22, en el que las células son células
porcinas.
24. Un método para producir un animal no humano
deficiente en alfa 1,3 GT que comprende:
- a)
- seleccionar células no humanas que carecen de la expresión de alfa-1,3-GT funcional realizando un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23;
- b)
- usar las células resistentes a toxina A seleccionadas en la etapa (a) como donantes nucleares para el transplante nuclear en una célula ni humana receptora adecuada;
- c)
- implantar las células fusionadas y activadas en una hembra no humana sustituta; y
- d)
- producir un animal clonado que muestra una deficiencia o ausencia completa de epítopos gal alfa 1,3-gal sobre sus superficies celulares.
25. El método de la reivindicación 24, en el que
ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT en las células a
seleccionar son inactivos, y un alelo se vuelve inactivo a través
de al menos una mutación puntual.
26. El método de la reivindicación 25, en el que
al menos un alelo del gen de la
alfa-1,3-GT en las células a
seleccionar se ha vuelto inactivo por un acontecimiento de
modificación genética dirigida.
27. El método de la reivindicación 25 o
reivindicación 26, en el que ambos alelos de la
alfa-1,3-GT en las células a
seleccionar se vuelven inactivos a través de al menos una mutación
puntual.
28. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 27, en el que la mutación puntual es una
mutación de sustitución, deleción o inserción o una combinación de
las mismas.
29. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 28, en el que al menos una mutación puntual es
una mutación puntual T-a-G en la
segunda base del exón 9.
30. El método de la reivindicación 29, en el que
las células a seleccionar comprenden la mutación puntual
T-a-G en la segunda base del exón 9
en ambos alelos del gen de la
alfa-1,3-GT.
31. El método de la reivindicación 24, en el que
las células a seleccionar se han vuelto homocigóticas con respecto
a la expresión del alelo alfa 1,3-GT, mediante
knockout dirigido de ambos alelos por recombinación homóloga.
32. El método de la reivindicación 24, en el que
las células a seleccionar son homocigóticas con respecto a la
expresión del alelo alfa 1,3-GT conseguidas mediante
mutaciones naturales de ambos alelos de la alfa
1,3-GT, que inutiliza el gen de la alfa
1,3-GT.
33. El método de la reivindicación 24, en el que
las células a seleccionar son homocigóticas con respecto a la
expresión del alelo alfa 1,3-GT, conseguidas
mediante knockout dirigido de un alelo por recombinación homóloga y
mutación natural del segundo alelo que inutiliza el gen de la alfa
1,3-GT.
34. El método de la reivindicación 24, en el que
las células a seleccionar se han vuelto homocigóticas con respecto
a la expresión del alelo alfa 1,3-GT mediante
mutaciones inducidas de ambos alelos de la alfa
1,3-GT, que inutiliza el gen de la alfa
1,3-GT.
35. El método de la reivindicación 24, en el que
dicho animal es un cerdo.
36. El método de la reivindicación 24, en el que
se induce una mutación por un agente mutagénico seleccionado entre
el grupo compuesto por un mutágeno químico, radiación, y un
transposón.
37. El método de la reivindicación 24, en el que
dicho mutágeno químico se selecciona entre el grupo compuesto por
EMS, ENU, gas mostaza e ICR191.
38. El método de la reivindicación 24, en el que
dicha radiación se selecciona entre el grupo compuesto por
radiación ultravioleta, radiación alfa, radiación beta y radiación
gamma.
39. Una célula en la que ambos alelos de su gen
de la alfa-1,3-GT son inactivos en
la que al menos un alelo contiene una mutación natural o espontánea
en el gen de la alfa-1,3-GT, donde
dicha célula se puede producir por un método que comprende:
- a)
- exponer una población de células a toxina A de C. difficile;
- b)
- eliminar las células que se ha visto afectadas de forma adversa por la toxina A debido a la citotoxicidad mediada por receptor de la toxina; y
- c)
- expandir y mantener una célula que no muestra los efectos de citotoxicidad mediada por receptor.
40. La célula de la reivindicación 39, en la que
al menos un alelo contiene la sustitución de bases timina a guanina
en la posición de la base 424 del gen de la alfa
1,3-GT, que provoca una sustitución de aminoácido
de tirosina a ácido aspártico en la posición 142 en la proteína
alfa-1,3-GT.
41. La célula de la reivindicación 39, en la que
al menos un alelo contiene una mutación inducida en el gen de la
alfa-1,3-GT.
42. Un animal no humano que se puede producir de
acuerdo con el método de la reivindicación 24, en el que ambos
alelos del gen de la alfa-1,3-GT son
inactivos.
43. Un animal no humano que se puede producir
por clonación de transferencia nuclear usando la célula de una
cualquiera de las reivindicaciones 39 a 41 como donante nuclear.
44. Una célula, tejido, u órgano que se puede
obtener del animal de la reivindicación 42 o reivindicación 43, o
de un cerdo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 9, para su uso como suplemento o reemplazo in vivo o ex
vivo para células, tejidos u órganos receptores.
45. Una construcción recombinante para modificar
la secuencia endógena del gen de la
alfa-1,3-GT del cerdo, en la que la
secuencia comprende una mutación puntual
T-a-G en la segunda base del exón
9.
46. Una construcción recombinante de acuerdo con
la reivindicación 45, en la que la secuencia del gen de la
alfa-1,3-GT comprende al menos 50
nucleótidos contiguos.
47. Un método para producir células que son
heterocigóticas para alfa-1,3-GT,
que comprende la transfección de fibroblastos fetales porcinos
primarios con una construcción de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 45 a 47.
48. Una célula de cerdo en la que ambos alelos
del gen de la alfa-1,3-GT son
inactivos, donde un alelo se vuelve inactivo a través de al menos
una mutación puntual.
49. Una célula de cerdo en la que al menos un
alelo de la alfa 1,3-GT contiene una sustitución de
base timina a guanina en posición de la base 424, que provoca la
sustitución de aminoácido de tirosina a ácido aspártico en la
posición 142 en la proteína
alfa-1,3-GT.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US40477502P | 2002-08-21 | 2002-08-21 | |
| US404775P | 2002-08-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2338111T3 true ES2338111T3 (es) | 2010-05-04 |
Family
ID=32043169
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03786504T Expired - Lifetime ES2338111T3 (es) | 2002-08-21 | 2003-08-21 | Animales porcinos que carecen de cualquier expresion de alfa 1,3 galactosiltransferasa funcional. |
| ES09015192.9T Expired - Lifetime ES2609292T3 (es) | 2002-08-21 | 2003-08-21 | Animales porcinos que carecen de cualquier expresión de alfa 1,3 galactosiltransferasa funcional |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES09015192.9T Expired - Lifetime ES2609292T3 (es) | 2002-08-21 | 2003-08-21 | Animales porcinos que carecen de cualquier expresión de alfa 1,3 galactosiltransferasa funcional |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7795493B2 (es) |
| EP (3) | EP2163614B1 (es) |
| JP (2) | JP2005536228A (es) |
| AT (1) | ATE451448T1 (es) |
| AU (2) | AU2003295322B2 (es) |
| CA (2) | CA2899360A1 (es) |
| DE (1) | DE60330468D1 (es) |
| DK (2) | DK2163614T3 (es) |
| ES (2) | ES2338111T3 (es) |
| NZ (2) | NZ538464A (es) |
| PT (2) | PT1534819E (es) |
| WO (1) | WO2004028243A2 (es) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2899360A1 (en) * | 2002-08-21 | 2004-04-08 | Revivicor, Inc. | Porcine animals lacking any expression of functional alpha 1,3 galactosyltransferase |
| WO2004108904A2 (en) | 2003-06-06 | 2004-12-16 | University Of Pittsburgh | Porcine cmp-n-acetylneuraminic acid hydroxylase gene |
| CA2533259C (en) | 2003-07-21 | 2014-01-28 | Lifecell Corporation | Acellular tissue matrices made from galactose .alpha.-1,3-galactose-deficient tissue |
| WO2005081714A2 (en) | 2003-11-21 | 2005-09-09 | Revivicor, Inc. | Use of interfering rna in the production of transgenic animals |
| CA2857051A1 (en) | 2004-03-17 | 2005-09-29 | David Ayares | Tissue products derived from animals lacking any expression of functional alpha 1,3 galactosyltransferase |
| JP2007530242A (ja) * | 2004-03-29 | 2007-11-01 | メイヨ フオンデーシヨン フオー メデイカル エジユケーシヨン アンド リサーチ | 遺伝子操作した心臓弁の異種移植片 |
| AU2005299413A1 (en) | 2004-10-22 | 2006-05-04 | Revivicor, Inc. | Ungulates with genetically modified immune systems |
| US20080026457A1 (en) | 2004-10-22 | 2008-01-31 | Kevin Wells | Ungulates with genetically modified immune systems |
| AU2006292827B2 (en) | 2005-08-09 | 2013-02-14 | Revivicor, Inc. | Transgenic ungulates expressing CTLA4-IG and uses thereof |
| WO2010051288A1 (en) | 2008-10-27 | 2010-05-06 | Revivicor, Inc. | Immunocompromised ungulates |
| US8986377B2 (en) * | 2009-07-21 | 2015-03-24 | Lifecell Corporation | Graft materials for surgical breast procedures |
| JP2013501528A (ja) | 2009-08-14 | 2013-01-17 | レビビコア， インコーポレイテッド | 糖尿病の処置のためのマルチ・トランスジェニック・ブタ |
| FR2951549B1 (fr) * | 2009-10-15 | 2013-08-23 | Olivier Schussler | Procede d'obtention de bioprotheses medicales implantables |
| US9420770B2 (en) | 2009-12-01 | 2016-08-23 | Indiana University Research & Technology Corporation | Methods of modulating thrombocytopenia and modified transgenic pigs |
| WO2011068778A1 (en) * | 2009-12-03 | 2011-06-09 | Lifecell Corporation | Nerve treatment devices and methods |
| BR112012020257A8 (pt) * | 2010-02-11 | 2018-02-14 | Recombinetics Inc | métodos e aparelhos para produzir artiodátilos transgênicos |
| AU2012217792A1 (en) | 2011-02-14 | 2013-08-29 | Revivicor, Inc. | Genetically modified pigs for xenotransplantation of vascularized xenografts and derivatives thereof |
| US10920242B2 (en) | 2011-02-25 | 2021-02-16 | Recombinetics, Inc. | Non-meiotic allele introgression |
| EP2726604B1 (en) * | 2011-06-30 | 2018-04-04 | Sigma Aldrich Co. LLC | Cells deficient in cmp-n-acetylneuraminic acid hydroxylase and/or glycoprotein alpha-1,3-galactosyltransferase |
| EP3400900B1 (en) | 2012-01-13 | 2020-05-20 | LifeCell Corporation | Methods of manufacturing breast prostheses |
| US9883939B2 (en) | 2012-05-08 | 2018-02-06 | The General Hospital Corporation | Reducing immunogenicity of xenogeneic transplant tissues |
| DK3281607T3 (da) | 2012-06-21 | 2019-06-11 | Lifecell Corp | Implanterbar protese med acellulære vævsvedhæftninger. |
| US20140115728A1 (en) | 2012-10-24 | 2014-04-24 | A. Joseph Tector | Double knockout (gt/cmah-ko) pigs, organs and tissues |
| US10307510B2 (en) | 2013-11-04 | 2019-06-04 | Lifecell Corporation | Methods of removing alpha-galactose |
| US20170311579A1 (en) | 2014-10-22 | 2017-11-02 | Indiana University Research & Technology Corporation | Triple transgenic pigs suitable for xenograft |
| AU2015360502A1 (en) | 2014-12-10 | 2017-06-29 | Regents Of The University Of Minnesota | Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease |
| JP6800888B2 (ja) | 2015-05-15 | 2020-12-16 | ライフセル コーポレーションＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | 形成外科用組織マトリックス |
| EP3337427A1 (en) | 2015-08-21 | 2018-06-27 | Lifecell Corporation | Breast treatment device |
| EP3506854B1 (en) | 2016-08-31 | 2020-08-19 | LifeCell Corporation | Breast treatment device |
| CA3037676A1 (en) | 2016-09-21 | 2018-03-29 | Mtd Products Inc | Control assembly for a walk-behind mower |
| US11026980B1 (en) | 2018-02-26 | 2021-06-08 | Triad Life Sciences, Inc. | Flowable birth tissue composition and related methods |
| US11602548B1 (en) | 2018-02-26 | 2023-03-14 | Convatec, Inc | Fibrous birth tissue composition and method of use |
| US10883084B2 (en) | 2018-10-05 | 2021-01-05 | Xenotherapeutics, Inc. | Personalized cells, tissues, and organs for transplantation from a humanized, bespoke, designated-pathogen free, (non-human) donor and methods and products relating to same |
| KR20210089659A (ko) | 2018-10-05 | 2021-07-16 | 제노세라퓨틱스, 인코포레이티드 | 이종이식 생성물 및 방법 |
| BR112021018788A2 (pt) | 2019-03-25 | 2021-11-23 | Xenotherapeutics Corp | Células, tecidos e órgãos personalizados para transplante de um doador (não humano) humanizado, indivi-dualizado, designado livre de patógenos e métodos e produtos relacionados aos mesmos |
| WO2020227095A1 (en) | 2019-05-03 | 2020-11-12 | Lifecell Corporation | Breast treatment device |
| US20220409669A1 (en) * | 2019-12-02 | 2022-12-29 | The General Hospital Corporation | Nerve Xenografts and Related Methods |
| WO2022046824A1 (en) | 2020-08-24 | 2022-03-03 | Xenotherapeutics, Inc. | Immunologically compatible cells, tissues, organs, and methods for transplantation for silencing, humanization, and personalization with minimized collateral genomic disruptions |
| WO2022087089A1 (en) | 2020-10-21 | 2022-04-28 | Tissue Testing Technologies Llc | Minimizing immunogenicity of decellularized tissues |
| EP4247151A1 (en) | 2020-11-20 | 2023-09-27 | Revivicor Inc. | Multi-transgenic pigs with growth hormone receptor knockout for xenotransplantation |
| WO2022256401A1 (en) * | 2021-06-01 | 2022-12-08 | Xenotherapeutics, Inc. | Xenogeneic nerve transplants and methods |
| AU2022347161A1 (en) | 2021-09-20 | 2024-04-04 | Revivicor, Inc. | Multitransgenic pigs comprising ten genetic modifications for xenotransplantation |
Family Cites Families (105)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4797368A (en) * | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
| US4863852A (en) * | 1985-07-03 | 1989-09-05 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Method of detecting, isolating and purifying clostridium difficile toxin A and its receptors |
| US4994384A (en) | 1986-12-31 | 1991-02-19 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Multiplying bovine embryos |
| US5057420A (en) | 1987-06-05 | 1991-10-15 | Granada Biosciences, Inc. | Bovine nuclear transplantation |
| US5354768A (en) * | 1988-07-26 | 1994-10-11 | Sankyo Company, Limited | Use of imidazopyrazole derivatives as analgesics and anti-inflammatory agents |
| US6436701B1 (en) | 1988-09-21 | 2002-08-20 | Babraham Institute | Derivation of pluripotential embryonic cell lines from ungulate species |
| US4944384A (en) | 1989-01-30 | 1990-07-31 | Hay & Forage Industries | Trash discharge apparatus for crop transferring conveyor mechanism |
| US5175383A (en) * | 1989-02-17 | 1992-12-29 | President And Fellows Of Harvard College | Animal model for benign prostatic disease |
| US4997384A (en) | 1989-04-17 | 1991-03-05 | Otis Engineering Corporation | Wet connector |
| US5324663A (en) | 1990-02-14 | 1994-06-28 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures |
| WO1991018088A1 (en) * | 1990-05-23 | 1991-11-28 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors |
| US5173414A (en) * | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
| US5589582A (en) | 1992-10-27 | 1996-12-31 | Biotransplant, Inc. | Polynucleotides en coding porcine cytokines |
| JPH08510636A (ja) | 1993-01-20 | 1996-11-12 | バイオトランスプラント，インコーポレイテッド | 多重翻訳開始部位から多量体タンパク質を発現出来るレトロウイルスベクター |
| US5496720A (en) | 1993-02-10 | 1996-03-05 | Susko-Parrish; Joan L. | Parthenogenic oocyte activation |
| JPH06253856A (ja) | 1993-02-26 | 1994-09-13 | Amano Pharmaceut Co Ltd | ムタロターゼ遺伝子 |
| EP0689597A4 (en) | 1993-03-16 | 1998-10-21 | Austin Research Inst | USE OF PIG GAL-g (a) (1,3) GALACTOSYL TRANSFERASE FOR XENOGENE THERAPIES |
| US6331658B1 (en) * | 1993-04-20 | 2001-12-18 | Integris Baptist Medical Center, Inc. | Genetically engineered mammals for use as organ donors |
| GB9308271D0 (en) | 1993-04-21 | 1993-06-02 | Univ Edinburgh | Method of isolating and/or enriching and/or selectively propagating pluripotential animal cells and animals for use in said method |
| US5523226A (en) * | 1993-05-14 | 1996-06-04 | Biotechnology Research And Development Corp. | Transgenic swine compositions and methods |
| US5849991A (en) | 1994-01-27 | 1998-12-15 | Bresatch Limited | Mice homozygous for an inactivated α 1,3-galactosyl transferase gene |
| WO1995020661A1 (en) | 1994-01-27 | 1995-08-03 | Bresatec Ltd. | Materials and methods for management of hyperacute rejection in human xenotransplantation |
| DE69535752D1 (de) | 1994-04-13 | 2008-06-26 | Biotransplant Inc | Alpha(1,3)galactosyltransferase-negatives schwein |
| AUPM516994A0 (en) | 1994-04-20 | 1994-05-12 | Gene Shears Pty. Limited | An in vivo gene expression system |
| US5714353A (en) * | 1994-05-24 | 1998-02-03 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vectors for gene therapy |
| US5989808A (en) | 1994-06-14 | 1999-11-23 | American Cyanamid Company | Identification of compounds affecting specific interaction of peptide binding pairs |
| CA2192660A1 (en) | 1994-06-15 | 1995-12-21 | Mauro S. Sandrin | Methods for reducing hyperacute rejection of xenografts |
| US5850004A (en) * | 1994-08-02 | 1998-12-15 | Cornell Research Foundation, Inc. | Transgenic mouse deficient in inducible nitric oxide synthase |
| AU711183B2 (en) | 1994-08-19 | 1999-10-07 | Biotransplant Incorporated | Genetically engineered swine cells |
| US6001557A (en) | 1994-10-28 | 1999-12-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adenovirus and methods of use thereof |
| US5625048A (en) | 1994-11-10 | 1997-04-29 | The Regents Of The University Of California | Modified green fluorescent proteins |
| US5922601A (en) * | 1995-01-19 | 1999-07-13 | Biotransplant, Inc. | High efficiency gene trap selection of regulated genetic loci |
| US5958713A (en) | 1995-01-31 | 1999-09-28 | Novo Nordisk A/S | Method of detecting biologically active substances by using green fluorescent protein |
| WO1996028967A1 (fr) | 1995-03-17 | 1996-09-26 | Chihiro Koike | Mammiferes transgeniques autres que des primates, ou des serotypes de primates superieurs ont ete exprimes par un transfert de genes etrangers et procede pour creer ceux-ci |
| EP0832193A1 (en) | 1995-05-26 | 1998-04-01 | Diacrin, Inc. | Porcine hepatocytes for use in treatment of disorders characterized by insufficient liver function |
| US5962644A (en) | 1995-06-07 | 1999-10-05 | Biotransplant, Inc. | Porcine CD34 |
| AU4482996A (en) | 1995-09-22 | 1997-04-09 | Novo Nordisk A/S | Novel variants of green fluorescent protein, gfp |
| US5952236A (en) | 1995-10-26 | 1999-09-14 | Thompson; Richard B. | Enzyme-based fluorescence biosensor for chemical analysis |
| US5856106A (en) | 1995-11-01 | 1999-01-05 | Biotransplant, Inc. | Determination of antibody production against administered therapeutic glycoproteins, especially monoclonal antibodies |
| JP2000514641A (ja) | 1995-11-03 | 2000-11-07 | ザ マウント シナイ メディカル センター | 異種移植拒絶を低減するための方法および組成物 |
| US5968738A (en) | 1995-12-06 | 1999-10-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Two-reporter FACS analysis of mammalian cells using green fluorescent proteins |
| US6020192A (en) | 1996-01-18 | 2000-02-01 | University Of Florida | Humanized green fluorescent protein genes and methods |
| US6255558B1 (en) | 1996-02-14 | 2001-07-03 | Btg International Limited | Gene expression |
| US6027881A (en) | 1996-05-08 | 2000-02-22 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Mutant Aequorea victoria fluorescent proteins having increased cellular fluorescence |
| US5948889A (en) | 1996-05-21 | 1999-09-07 | Case Western Reserve University | Compositions and methods for screening antimicrobials |
| EP0874900B1 (en) | 1996-08-02 | 2007-10-03 | The Austin Research Institute | Improved nucleic acids encoding a chimeric glycosyltransferase |
| US5948681A (en) | 1996-08-14 | 1999-09-07 | Children's Hospital Of Philadelphia | Non-viral vehicles for use in gene transfer |
| US6124128A (en) | 1996-08-16 | 2000-09-26 | The Regents Of The University Of California | Long wavelength engineered fluorescent proteins |
| PT959899E (pt) | 1996-08-16 | 2009-08-28 | Univ Catholique Louvain | Anticorpo lo-cd2a e suas utilizações para inibir a activação e proliferação de células t |
| JP2001500725A (ja) | 1996-08-19 | 2001-01-23 | ユニヴァーシティー オヴ マサチューセッツ | 種間核移植により製造される胚性または幹細胞様細胞株 |
| AUPO182396A0 (en) * | 1996-08-23 | 1996-09-12 | Austin Research Institute, The | Improved nucleic acids for reducing carbohydrate epitopes |
| US5914233A (en) | 1996-08-23 | 1999-06-22 | Osteo Screen | Screening assay for the identification of agents which alter expression of PTH-rP |
| AU4153497A (en) | 1996-08-26 | 1998-03-19 | Eli Lilly And Company | Combinatorial process for preparing substituted thiophene libraries |
| EP0950111A1 (en) | 1996-09-06 | 1999-10-20 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods using cre-lox for production of recombinant adeno-associated viruses |
| US6025192A (en) | 1996-09-20 | 2000-02-15 | Cold Spring Harbor Laboratory | Modified retroviral vectors |
| US6255071B1 (en) | 1996-09-20 | 2001-07-03 | Cold Spring Harbor Laboratory | Mammalian viral vectors and their uses |
| US6136566A (en) | 1996-10-04 | 2000-10-24 | Lexicon Graphics Incorporated | Indexed library of cells containing genomic modifications and methods of making and utilizing the same |
| TW371617B (en) | 1996-10-09 | 1999-10-11 | Of Animal And Plant Health Inspection And Quarantine Council Of Agriculture Executive Yuan Bureau | Method to transplant GFP into autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus for inflicting pest in an attempt to detect and flow up it existence and to improve life span against UV |
| US6455037B1 (en) * | 1996-11-01 | 2002-09-24 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Cells expressing an αgala nucleic acid and methods of xenotransplantation |
| JP2001505766A (ja) | 1996-11-18 | 2001-05-08 | マクギル ユニバーシティー | アポトーシスと生長を調節するアデノウイルスベクターを有する、有糸分裂後のニューロン |
| US6235969B1 (en) * | 1997-01-10 | 2001-05-22 | University Of Massachusetts | Cloning pigs using donor nuclei from non-quiescent differentiated cells |
| US5994077A (en) | 1997-01-31 | 1999-11-30 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Flourescence-based isolation of differentially induced genes |
| CA2279544A1 (en) | 1997-02-05 | 1998-08-06 | Biotransplant Incorporated | Induction of b cell tolerance |
| WO2000006194A2 (en) | 1997-02-05 | 2000-02-10 | Biotransplant, Inc. | Depletion of cells responsible for antibody-mediated graft rejection |
| US6197928B1 (en) | 1997-03-14 | 2001-03-06 | The Regents Of The University Of California | Fluorescent protein sensors for detection of analytes |
| US5994071A (en) | 1997-04-04 | 1999-11-30 | Albany Medical College | Assessment of prostate cancer |
| US6251384B1 (en) | 1997-04-28 | 2001-06-26 | Anticancer, Inc. | Metastasis models using green fluorescent protein (GFP) as a marker |
| US5993778A (en) | 1997-05-07 | 1999-11-30 | Firestein; Stuart J. | Functional expression of, and assay for, functional cellular receptors in vivo |
| US6251582B1 (en) | 1997-07-17 | 2001-06-26 | New York University | Alternative G-coupled receptors associated with retroviral entry into cells, methods of identifying the same, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| WO1999009163A1 (en) | 1997-08-13 | 1999-02-25 | Biotransplant, Inc. | Porcine stem cell factor varients and recombinant cells expressing such polypeptides |
| WO1999009141A1 (en) | 1997-08-14 | 1999-02-25 | Biotransplant, Inc. | Porcine totipotent cells and method for long-term culture |
| US6251677B1 (en) | 1997-08-25 | 2001-06-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof |
| US6153409A (en) | 1997-09-11 | 2000-11-28 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Process for continuous optimized protein production in insect larvae |
| EP1017803B1 (en) | 1997-09-26 | 2010-06-16 | ABT Holding Company | Expression of endogenous genes by non-homologous recombination of a vector construct with cellular dna |
| US6482937B1 (en) | 1997-10-09 | 2002-11-19 | Biotransplant, Inc. | Porcine Oct-4 promoter |
| AU1581899A (en) | 1997-10-28 | 1999-05-17 | Biotransplant Incorporated | Nuclear transfer for production of transgenic animal embryo |
| US5968773A (en) | 1997-11-14 | 1999-10-19 | Heddle; John A. | System and method for regulation of gene expression |
| US6013447A (en) | 1997-11-21 | 2000-01-11 | Innovir Laboratories, Inc. | Random intracellular method for obtaining optimally active nucleic acid molecules |
| US5922576A (en) | 1998-02-27 | 1999-07-13 | The John Hopkins University | Simplified system for generating recombinant adenoviruses |
| US6210910B1 (en) | 1998-03-02 | 2001-04-03 | Trustees Of Tufts College | Optical fiber biosensor array comprising cell populations confined to microcavities |
| AU2993599A (en) | 1998-03-09 | 1999-09-27 | Regents Of The University Of California, The | Regulation of the cell cycle by sterols |
| KR101085210B1 (ko) | 1998-03-20 | 2011-11-21 | 커먼웰쓰 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션 | 유전자 발현 조절방법 |
| US6080576A (en) | 1998-03-27 | 2000-06-27 | Lexicon Genetics Incorporated | Vectors for gene trapping and gene activation |
| US6037133A (en) | 1998-04-17 | 2000-03-14 | Clontech Laboratories, Inc. | IκBEGFP constructs, cell lines and methods of use |
| US6316181B1 (en) | 1998-04-24 | 2001-11-13 | Virginia Commonwealth University | Establishment of cell lines with persistent expression of a green fluorescent protein (GFP) using a pIRES/EGFP DNA vector construct |
| US6150176A (en) | 1998-06-09 | 2000-11-21 | The Regents Of The University Of California | Fluorescent protein sensors for measuring the pH of a biological sample |
| US6469229B1 (en) | 1998-08-20 | 2002-10-22 | The General Hospital Corporation | Inbred miniature swine and uses thereof |
| US6180343B1 (en) | 1998-10-08 | 2001-01-30 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Green fluorescent protein fusions with random peptides |
| US5985577A (en) | 1998-10-14 | 1999-11-16 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Protein conjugates containing multimers of green fluorescent protein |
| US6203986B1 (en) | 1998-10-22 | 2001-03-20 | Robert H. Singer | Visualization of RNA in living cells |
| US6268201B1 (en) | 1998-10-23 | 2001-07-31 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | IniB, iniA and iniC genes of mycobacteria and methods of use |
| US6270958B1 (en) | 1998-10-29 | 2001-08-07 | Washington University | Detection of negative-strand RNA viruses |
| US6700037B2 (en) | 1998-11-24 | 2004-03-02 | Infigen, Inc. | Method of cloning porcine animals |
| US6258998B1 (en) * | 1998-11-24 | 2001-07-10 | Infigen, Inc. | Method of cloning porcine animals |
| US6210922B1 (en) | 1998-11-30 | 2001-04-03 | National Research Council Of Canada | Serum free production of recombinant proteins and adenoviral vectors |
| ES2338631T3 (es) | 1999-03-04 | 2010-05-11 | Revivicor, Inc. | Modificacion genetica de celulas somaticas y usos de las mismas. |
| CA2385162A1 (en) | 1999-09-30 | 2001-04-05 | William L. Fodor | Compositions and methods for altering gene expression |
| WO2001030992A2 (en) | 1999-10-22 | 2001-05-03 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | α1-3 GALACTOSYLTRANSFERASE GENE AND PROMOTER |
| US7126039B2 (en) * | 2001-03-21 | 2006-10-24 | Geron Corporation | Animal tissue with carbohydrate antigens compatible for human transplantation |
| WO2002074948A2 (en) * | 2001-03-21 | 2002-09-26 | Geron Corporation | Animal tissue with carbohydrate antigens compatible for human transplantation |
| EP1370132A2 (en) | 2001-03-21 | 2003-12-17 | Geron Corporation | Use of telomerase reverse transcriptase to create homozygous knockout animals |
| RU2243630C2 (ru) | 2001-08-06 | 2004-12-27 | Жаров Владимир Павлович | Оптическое устройство для пространственной манипуляции объектами |
| AU2002364596A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-15 | Immerge Biotherapeutics, Inc. | Knockout swine and methods for making the same |
| CA2507486A1 (en) * | 2002-08-14 | 2004-02-26 | Immerge Biotherapeutics, Inc. | .alpha.(1,3)-galactosyltransferase null cells, methods of selecting and .alpha.(1,3)-galactosyltransferase null swine produced therefrom |
| CA2899360A1 (en) * | 2002-08-21 | 2004-04-08 | Revivicor, Inc. | Porcine animals lacking any expression of functional alpha 1,3 galactosyltransferase |
-
2003
- 2003-08-21 CA CA2899360A patent/CA2899360A1/en not_active Abandoned
- 2003-08-21 EP EP09015192.9A patent/EP2163614B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-21 PT PT03786504T patent/PT1534819E/pt unknown
- 2003-08-21 PT PT90151929T patent/PT2163614T/pt unknown
- 2003-08-21 EP EP16193354.4A patent/EP3170890A1/en not_active Withdrawn
- 2003-08-21 ES ES03786504T patent/ES2338111T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-21 DE DE60330468T patent/DE60330468D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-21 WO PCT/US2003/026622 patent/WO2004028243A2/en active Application Filing
- 2003-08-21 AT AT03786504T patent/ATE451448T1/de active
- 2003-08-21 ES ES09015192.9T patent/ES2609292T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-21 EP EP03786504A patent/EP1534819B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-21 NZ NZ538464A patent/NZ538464A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-08-21 US US10/646,970 patent/US7795493B2/en active Active
- 2003-08-21 AU AU2003295322A patent/AU2003295322B2/en not_active Ceased
- 2003-08-21 DK DK09015192.9T patent/DK2163614T3/en active
- 2003-08-21 CA CA2496761A patent/CA2496761C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-21 JP JP2004539849A patent/JP2005536228A/ja not_active Withdrawn
- 2003-08-21 DK DK03786504.5T patent/DK1534819T3/da active
- 2003-08-21 NZ NZ562736A patent/NZ562736A/en not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-05-28 AU AU2009202105A patent/AU2009202105B2/en not_active Ceased
-
2010
- 2010-07-13 US US12/835,026 patent/US20120255047A1/en not_active Abandoned
- 2010-09-13 JP JP2010204963A patent/JP5329502B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2014
- 2014-05-19 US US14/281,464 patent/US20150106959A1/en not_active Abandoned
-
2018
- 2018-02-26 US US15/905,249 patent/US11172658B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2009202105A1 (en) | 2009-06-18 |
| CA2899360A1 (en) | 2004-04-08 |
| US20180332832A1 (en) | 2018-11-22 |
| EP2163614B1 (en) | 2016-10-12 |
| EP2163614A1 (en) | 2010-03-17 |
| AU2009202105B2 (en) | 2011-07-14 |
| JP2011015697A (ja) | 2011-01-27 |
| JP2005536228A (ja) | 2005-12-02 |
| NZ562736A (en) | 2009-07-31 |
| US20120255047A1 (en) | 2012-10-04 |
| US20040268424A1 (en) | 2004-12-30 |
| CA2496761A1 (en) | 2004-04-08 |
| ATE451448T1 (de) | 2009-12-15 |
| NZ538464A (en) | 2008-01-31 |
| PT2163614T (pt) | 2017-01-17 |
| US7795493B2 (en) | 2010-09-14 |
| AU2003295322A1 (en) | 2004-04-19 |
| JP5329502B2 (ja) | 2013-10-30 |
| DE60330468D1 (de) | 2010-01-21 |
| DK1534819T3 (da) | 2010-04-19 |
| CA2496761C (en) | 2015-06-02 |
| US11172658B2 (en) | 2021-11-16 |
| EP1534819A2 (en) | 2005-06-01 |
| WO2004028243A3 (en) | 2004-08-05 |
| EP1534819A4 (en) | 2005-09-21 |
| US20150106959A1 (en) | 2015-04-16 |
| EP1534819B1 (en) | 2009-12-09 |
| DK2163614T3 (en) | 2017-01-09 |
| WO2004028243A2 (en) | 2004-04-08 |
| PT1534819E (pt) | 2010-03-11 |
| AU2003295322B2 (en) | 2009-06-18 |
| EP3170890A1 (en) | 2017-05-24 |
| ES2609292T3 (es) | 2017-04-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2338111T3 (es) | Animales porcinos que carecen de cualquier expresion de alfa 1,3 galactosiltransferasa funcional. | |
| JP7308243B2 (ja) | 遺伝子改変された免疫系を有する有蹄動物 | |
| US7732180B2 (en) | Porcine Forssman synthetase protein, cDNA, genomic organization, and regulatory region | |
| US20090049562A1 (en) | Porcine cmp-n-acetylneuraminic acid hydroxylase gene | |
| US7560538B2 (en) | Porcine isogloboside 3 synthase protein, cDNA, genomic organization, and regulatory region |