JP2001500725A

JP2001500725A - 種間核移植により製造される胚性または幹細胞様細胞株

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Publication number: JP2001500725A
Application number: JP10510747A
Authority: JP
Inventors: ジェームズローブル; ジョージシーベリー; スティーヴンエルスタイス
Original assignee: ユニヴァーシティーオヴマサチューセッツ
Priority date: 1996-08-19
Filing date: 1997-07-28
Publication date: 2001-01-23
Also published as: WO1998007841A1; BR9711204A; CA2262817A1; IL128348A; AU740709B2; NZ334016A; US20050250203A1; CN1230989A; EP0934403A4; IL128348A0; EP0934403A1; AU4044397A

Abstract

(57)【要約】ドナー細胞核をドナー細胞とは異なる種の脱核卵母細胞に移植することを含む核移植の改良方法が提供される。生じた核移植ユニットは、同質遺伝子系胚幹細胞、特にヒトの同質遺伝子系胚細胞または幹細胞の製造に有用である。これらの胚性または幹細胞様細胞は、所望の分化細胞を製造するために、さらに所望の遺伝子を例えば同種組換えによって当該細胞のゲノムの特定の位置に導入し、除去し、または修飾するために有用である。これらの細胞（異種遺伝子を含むことができる）は細胞移植治療において、さらに細胞分化についてのインビトロ研究のために特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】種間核移植により製造される胚性または幹細胞様細胞株１．発明の分野本発明は、動物またはヒトの細胞に由来する細胞核を当該供与体（ドナー）と異なる動物種の脱核卵母細胞に移植することによって胚性または幹細胞様細胞を製造することに関する。より具体的には、本発明は、ヒトの細胞核を脱核した動物の卵母細胞（好ましくは有蹄類、最も好ましくはウシの脱核卵母細胞）に移植することによる、ヒト胚性または幹細胞様細胞の製造に関する。本発明はさらに、得られた胚性または幹細胞様細胞（好ましくはヒトの胚性または幹細胞様細胞）を治療、診断、分化細胞の製造（これら細胞もまた治療または診断のために用いられる）、並びにトランスジェニック（遺伝子導入）胚細胞または遺伝子導入分化細胞、細胞株、組織および器官の製造のために使用することに関する。本発明にしたがって得られる胚性または幹細胞様細胞自体もまた、核移植または核移転法における核ドナーとして用いることができる。２．発明の背景着床前のマウス初期胚からインビトロで胚性幹細胞（ＥＳ）株を誘導する方法は周知である(Evansら、Nature，29:154-156(1981);Martin，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，78:7634-7638(1981)を例えば参照されたい)。線維芽細胞のフィーダーレーヤー（養育細胞層）（Evansら、上掲書）または分化抑制源(Smithら、D ev.Biol.，121:1-9(1987))が存在する場合は、ＥＳ細胞は未分化状態で継代できる。ＥＳ細胞は、多数の用途を有することは以前に報告された。例えば、ＥＳ細胞は、分化について、特に初期発生調節に必要な遺伝子の研究に関するインビトロモデルとして用いることができる。マウスＥＳ細胞は、着床前のマウス胚に導入されると生殖細胞系統のキメラを生じ、したがってＥＳの多能性を明らかにした (Bradleyら、Nature，309:255-256(1984))。それらのゲノムを次の世代に移すことができるということから見れば、ＥＳ細胞は、所望の遺伝的修飾を伴ってまたはそのような修飾を行わずにＥＳ細胞を使用することによって家畜動物の生殖細胞系を操作することができる潜在的な用途を有する。さらにまた、家畜動物（例えば有蹄類）の場合、同様な家畜動物の着床前の胚から得られた核は脱核卵母細胞の成長を分娩まで助成する(Smithら、Bi ol．Reprod.，40:1027-1035(1989);およびKeeferら、Biol．Reprod.，50:935-93 9(1994))。これはマウス胚由来核とは対照的で、この核は移植後８細胞期以後は脱核卵母細胞の成長を助成しないと報告されている(Cheongら、Biol．Reprod.， 48:958(1993))。したがって、家畜動物のＥＳ細胞は、遺伝的操作または核移植工程のために全能性ドナー核として有望な供給源を提供する可能性があるので極めて望ましい。いくつかの研究グループは、多能性と称する胚細胞株の単離を報告した。例えば、ノタリアーニら(Notarianniら、J．Reprod．Fert．Suppl.，43:255-260(199 1))は、安定で多能性と称するブタおよびヒツジの胚盤胞由来細胞株の樹立を報告している。これら細胞株は、ヒツジの胚盤胞から免疫外科的に単離された内側細胞集団の初代培養と類似するいくつかの形態学的および増殖特性を示す（上掲書）。さらにまた、ノタリアーニら(Notarianniら、J．Reprod．Fert．Suppl.， 41:51-56(1990))は、ブタの胚盤胞由来の多能性胚細胞株と想定される培養の維持および分化を開示した。さらに、ガーフェンら（Gerfenら、Anim．Biotech，6 (1):1-14(1995)）は、ブタ胚盤胞由来の胚細胞株の単離を開示した。これらの細胞は、条件づけ培地を用いることなくマウス胚線維芽細胞の養育細胞層中で安定的に維持される。これらの細胞は、報告によれば培養時にいくつかの異なる細胞タイプに分化する（Gerfenら、上掲書）。さらに、サイトーら(Saitoら、Roux's Arch．Dev．Biol.，201:134-141(1992) )はウシの胚性幹細胞様細胞株の培養を報告した。これらの細胞株は３回の継代では生存していたが４回の継代で消失した。さらにまた、ハンディサイドら(Han dysideら、Roux's Arch．Dev．Biol.，196:185-190(1987))は、免疫外科的に単離したヒツジ胚の内側細胞集団をマウスＩＣＭに由来するマウスＥＳ細胞株の単離を許容する条件下で培養することについて開示した。そのような条件下ではヒツジのＩＣＭは付着し広がって、ＥＳ細胞様細胞および内皮様細胞の両方の領域を拡大させるが、長期培養後は内皮様細胞のみが明瞭であることをハンディサイドら（1987、上掲書）は報告した。最近では、長期培養で維持された多能性と称されるウシ原始生殖細胞に由来する細胞株が報告された（Chernyら、Theriogenology，41:175(1994)）。約７日間培養された後、これらの細胞はアルカリ性ホスファターゼが陽性に染色されるＥＳ様コロニーを生じ、胚類似体を形成する能力を示し、さらに少なくとも２種の異なる細胞タイプに自発的に分化した。報告によれば、これらの細胞はまた、転写因子ＯＣＴ４、ＯＣＴ６およびＨＥＳ１のｍＲＮＡ（これらは専らＥＳ細胞によって発現されると考えられているホメオボックス遺伝子パターンである）を発現した。また最近、キャンベルら(Campbellら、Nature，380:64-68(1996))は、マウスでＥＳ細胞株の単離を促進する条件下で培養した９日目のヒツジ胚から培養胚盤（ＥＤ）細胞の核を移植し、その後生きた仔羊を出産させることについて報告した。その結果に基づいて著者らは、９日目のヒツジ胚のＥＤ細胞は核移植によって全能性であり、全能性は培養で維持されると結論した。さらに、ウシ胚盤胞の内側細胞集団の細胞に由来する永代細胞株と称される細胞株の単離と性状が報告された(Van Stekelenburg-Hamersら、Mol．Reprod．Dev .，40:444-454(1995))。著者らは、ウシＩＣＭ細胞の付着と成長を助成するためにどの養育細胞および培養液が最も有効であるかを決定するために、異なる条件下で８または９日目のウシ胚盤胞からＩＣＭを分離し培養した。それらの結果を基に彼らは、（ウシ子宮上皮細胞の代わりに）ＳＴＯ（マウス線維芽細胞）養育細胞を使用することによって、さらに培養液を補足するために（通常の血清の代わりに）木炭精製血清を使用することによって培養ＩＣＭの付着および成長が強化されると結論した。しかしながら、彼らは、それらの細胞は全能性ＩＣＭ細胞よりも上皮細胞に類似すると報告した（上掲書）。さらにまた、スミスら(Smithら、WO94/24274、1994年10月７日公開)、エバンスら(Evansら、WO90/03432、1990年４月５日公開)およびホィーラーら(Wheeler ら、WO94/26889、1994年11月24日公開)は、遺伝子導入動物を得るために使用できると主張する動物幹細胞の単離、選別および増殖を報告した。エバンスら（WO90/03432、1990年４月５日公開）はまた、遺伝子導入動物の製造に有用であると主張するブタおよびウシ由来の多能性と称する胚性幹細胞の誘導を報告した。さらにホィーラーら(Wheelerら、WO94/26884、1994年11月24日公開)は、キメラ有蹄類および遺伝子導入有蹄類の製造に有用であると主張する胚性幹細胞を開示した。したがって前述の記載によれば、多くのグループが、例えばクローン化胚または遺伝子導入胚の製造および核移植におけるそれらの潜在的な用途のためにＥＳ細胞株を製造しようと試みている。核移植のための有蹄類ＩＣＭの使用もまた報告された。例えば、コーラスら(Collasら、Mol．Reprod．Dev.，38:264-2 67(1994))は、溶解ドナー細胞を成熟した脱核卵母細胞に微量注入（マイクロインジェクション）することによるウシＩＣＭの核移植を開示した。この文献では、胚を７日間インビトロで培養し１５の胚盤胞を作出したことが開示された。これらの胚盤胞をウシ受容体に移したとき４頭が妊娠し、２頭が出産した。さらにキーファーら(Keeferら、Biol．Reprod.，50:935-939(1994))は、胚盤胞を製造するために核移植工程でドナー核としてウシＩＣＭ細胞を使用することを開示した。これらの胚盤胞をウシ受容体へ移植したとき数匹の生きた仔が得られた。さらにシムスら（Simsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90:6143-6147(1993)）は、短期間インビトロで培養したウシＩＣＭ細胞の核を成熟した脱核卵母細胞に移植することによる仔牛の製造を開示した。また、培養胚盤細胞の核移植に続いて生きた仔羊を出産させることも報告された(Campbellら、Nature，380:64-68(1996))。さらに、ウシの多能性胚細胞を核移植およびキメラ胎児産出のために使用することもまた報告された(Sticeら、Bi ol．Reprod.，54:100-110(1996);Collasら、Mol．Reprod．Dev.，38:264-267(19 94))。また、種間ＮＴユニットを製造しようという試みもこれまでにあった(Wolfeら、Theriogenology，33:350(1990))。具体的にはウシの胚細胞をバイソンの卵母細胞と融合させ、おそらく内側細胞集団を有するいくつかの種間ＮＴユニットが産出された。しかしながら、成獣細胞ではなく胚細胞が核移植工程でのドナー核として用いられた。胚細胞は成獣の細胞よりももっと容易に再プログラムできるというのがその考えであった。この考えはカエルにおけるより初期のＮＴ研究にさかのぼる（ジベラルジノの概説：DiBerardino，Differentiation，17:17-30(198 0)）。この研究はまた系統発生的に非常に類似する動物（ウシの核とバイソンの卵母細胞）を含んでいた。それとは対照的に、これまでより異なる種をＮＴ時に融合させた場合（ウシの核をハムスターの卵母細胞へ）、内側細胞集団は得られなかった。さらに、ＮＴユニットに由来する内側細胞集団の細胞を用いて増殖可能なＥＳ細胞様コロニーを形成できるという報告は以前には全く無かった。また、コーラスら（上掲書）は、顆粒層細胞（成獣の体細胞）を用いてウシの核移植胚を産出することについて開示した。しかしながら、本発明と異なりこれらの実験は種間核移植を伴わなかった。さらに本発明と異なり、ＥＳ様細胞コロニーは得られなかった。したがって、以前に文献で報告されたものにもかかわらず、胚性または幹細胞様細胞を製造する改良方法が必要とされている。特に、治療的および診断的に大きな潜在能力をもつヒトの胚性または幹細胞様細胞を製造する必要が有る。これに関しては、細胞移植によって処置できる多数のヒト疾患が特定されてきた。例えば、パーキンソン氏病は黒質のドパミン作用性ニューロンの変性によって引き起こされる。パーキンソン氏病の標準的な治療はＬ−ＤＯＰＡの投与を伴う。これは一時的にドパミンの消失を軽減するが、重篤な副作用を惹起し最終的にはこの疾患の進行を回復させない。パーキンソン氏病治療のためのまた別のアプローチ（これは多くの脳疾患および中枢神経系損傷の治療に広範囲の応用性を有すると期待される）は、胎児または新生児動物の細胞もしくは組織の当該成熟動物の脳への移植を伴う。多様な脳領域に由来する胎児ニューロンは成熟動物の脳に取り込まれることができる。そのような移植片は、実験動物で実験的に導入された行動的欠損（複雑な認識機能を含む）を軽減することが示された。ヒトの臨床試験の最初の試験結果もまた有望であった。しかしながら、流産によって得られるヒトの胎児または組織の供給は非常に限定されている。さらにまた、中絶胎児の細胞または組織を入手することは極めて異論のあるところである。現在のところ患者の“胎児様”細胞を製造する利用可能な方法は無い。さらに、異種移植片組織は入手が容易でなく、異種移植片および外来移植片組織は共に拒絶反応を受ける。さらにまた、いくつかの事例では、移植前に細胞または組織において遺伝的に修飾を施すことは有益であろう。しかしながら、そのような修飾が望まれる多くの細胞または組織は培養状態で良好に分裂せず、さらに殆どのタイプの遺伝的形質転換は迅速に分裂する細胞を要求する。したがって、当技術分野では移植並びに細胞治療および遺伝子治療で使用するためにヒトの胚性または幹細胞様未分化細胞の供給が強く希求されている。発明の目的本発明の目的は、胚性または幹細胞様細胞を製造する新規で改良された方法を提供することである。本発明のより具体的な目的は、哺乳類またはヒトの細胞の核を異なる種の脱核卵母細胞に移植することを必要とする、胚性または幹細胞様細胞を製造する新規な方法を提供することである。本発明のまた別の目的は、ヒトの細胞の核を動物の脱核卵母細胞（好ましくは有蹄類の脱核卵母細胞）に移植することを必要とする、ヒトの胚性または幹細胞様細胞を製造する新規な方法を提供することである。本発明のまた別の目的は、ヒトの細胞（例えばヒト成人細胞）の核をヒト脱核卵母細胞（好ましくは有蹄類の脱核卵母細胞）に移植することを必要とする、ヒトの胚性または幹細胞様細胞を製造する新規な方法を提供することである。本発明のまた別の目的は、動物またはヒトの細胞の核を異なる種の脱核卵母細胞に移植することによって胚性または幹細胞様細胞を提供することである。本発明のより具体的な目的は、ヒトの細胞の核を動物の脱核卵母細胞（好ましくは有蹄類の脱核卵母細胞）に移植することによってヒトの胚性または幹細胞様細胞を提供することである。本発明のまた別の目的は、そのような胚性または幹細胞様細胞を治療または診断に用いることである。本発明の具体的な目的は、細胞、組織または器官の移植が治療としてまたは診断として有益である一切の疾患の治療または診断にそのようなヒト胚性または幹細胞様細胞を使用することである。本発明の別の目的は、分化細胞、組織または器官を産出するために、本発明にしたがって製造した胚性または幹細胞様細胞を使用することである。本発明のより具体的な目的は、ヒトの分化細胞、組織または器官を産出するために、本発明にしたがって製造したヒトの胚性または幹細胞様細胞を使用することである。本発明のまた別の具体的な目的は、遺伝子工学的に操作された胚性または幹細胞様細胞（これらの細胞は遺伝子工学的に操作され、または遺伝子を導入された分化したヒトの細胞、組織または器官（例えば遺伝子治療に使用される）を製造するために使用することができる）を製造するために、本発明にしたがって製造した胚性または幹細胞様細胞を使用することである。本発明のまた別の具体的な目的は、本発明にしたがって製造した胚性または幹細胞様細胞をインビトロで、例えば細胞の分化の研究で、さらにアッセイの目的で（例えば薬剤研究のために）使用することである。本発明の別の目的は、本発明にしたがって製造した胚性または幹細胞様細胞から製造される同質遺伝子もしくは同系遺伝子細胞、組織または器官の使用を含む、移植治療の改良法を提供することである。そのような治療法は、例えばパーキンソン氏病、ハンチントン氏病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄損傷、多発性硬化症、筋萎縮症、糖尿病、肝臓疾患、心臓疾患、軟骨補充、火傷、血管疾患、尿道疾患の治療とともに、とりわけ免疫不全の治療、骨髄移植、癌の治療のための治療法を含む。本発明の別の目的は、遺伝子治療、特に上記で特定した疾患および損傷の治療および／または予防のために、本発明にしたがって製造した遺伝子導入もしくは遺伝子操作胚性または幹細胞様細胞を使用することである。本発明のまた別の目的は、核移植のための核ドナーとして本発明にしたがって製造した胚性または幹細胞様細胞、または本発明にしたがって製造した遺伝子導入もしくは遺伝子操作胚性または幹細胞様細胞を使用することである。前述の目的並びに以下で明らかになる本発明の他の目的、利点および特徴に関する本発明の特徴は、以下の好ましい実施態様の詳細な記載および添付の請求の範囲を参考にして一層明瞭に理解されよう。図面の簡単な説明図１は、成人の細胞の脱核ウシ卵母細胞への移植によって製造された核移植（ nuclear transfer，NT）ユニットの写真である。図２から５は、例えば図１に示したようなＮＴユニットに由来する胚性幹細胞様細胞の写真である。発明の詳細な説明本発明は、胚性または幹細胞様細胞を製造する、より具体的には核移転または核移植によりヒトの胚性または幹細胞様細胞を製造する新規な方法を提供する。本出願では、核移転または核移植またはＮＴは互換的に用いられる。上記で述べたように、核移転または核移植による胚性または幹細胞様細胞の単離はこれまで全く報告されていない。むしろ、これまでに報告されたＥＳ様細胞の単離は受精胚由来であった。さらに、異なる種の細胞またはＤＮＡ（より具体的には１つの種の成獣細胞またはＤＮＡと別の種の卵母細胞）を含む核移植の成功はこれまで報告されたことがない。また、出願人らが知るところでは、組織培養でヒトの胚性または幹細胞様細胞を製造する方法はこれまで全く報告されていない。むしろ、現在利用可能な限定されたヒト胎児細胞および組織は、偶発的な流産組織および流産胎児から入手しなければならない。さらにまた本発明以前には、種間核移植によって胚性または幹細胞様細胞を得たものはいなかった。全く予期せぬことに、本発明者らは、ヒトの胚性または幹細胞様細胞および細胞コロニーは、ヒトの細胞（例えば成人の分化ヒト細胞）の核を動物の脱核卵母細胞（これは核移植（ＮＴ）ユニットの製造に用いられる）に移植することによって得ることができることを発見した。これらの細胞は培養に際して、ヒトの胚性または幹細胞用細胞および細胞コロニーを生じる。この結果は驚くべきことである。なぜならば、この結果は、効果的な種間核移植、すなわち動物またはヒトの細胞（例えば成人細胞）の細胞核を異なる動物種の脱核卵に移植して、適切な条件下で培養したとき胚性または幹細胞様細胞および細胞コロニーを生じる細胞を含む核移植ユニットを製造することを示した最初のものだからである。好ましくは、ＥＳ様細胞を製造するために用いられるＮＴユニットは、少なくとも２から４００細胞、好ましくは４から１２８細胞のサイズまで、最も好ましくは少なくとも約５０細胞のサイズまで培養されるであろう。本発明では、胚性または幹細胞様細胞は本発明にしたがって製造した細胞を指す。当該細胞が製造される態様（すなわち種間核移植）のために、本発明は幹細胞というよりはむしろ幹細胞様細胞の如き細胞を指す。これらの細胞は正常な幹細胞と類似の分化能をもつと期待されるが、一方、これらの細胞はそれらが製造される態様のために些細ないくつかの相違を有するであろう。例えば、これらの幹細胞様細胞は核移植に用いた当該卵母細胞のミトコンドリアを有する。本発見は、成人のヒト細胞（特に供与者の口腔から得られたヒト上皮細胞）の核が脱核ウシ卵母細胞に移植される核移植によって、培養時にそれらの細胞がヒトの幹細胞様または胚性細胞およびヒトの胚性または幹細胞様細胞コロニーが得られるという観察を基にしている。本発明者らは、ウシ卵母細胞およびヒト卵母細胞は、ウシ卵母細胞がヒト卵母細胞の有効な代替物または代用物として機能することを可能にするために十分に類似する成熟過程を経るにちがいないという仮説をたてた。ヒトの細胞核が効果的にウシ卵母細胞に移植できるという事実を基をすれば、ヒトの細胞は他の種（例えば他の有蹄類と同様に他の動物）の卵母細胞に移植できると考えるのは論理的である。特に、他の有蹄類（例えばブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギなど）の卵母細胞は適切なはずである。また、他の供給源由来の卵母細胞（例えば他の霊長類、両生類、ゲッ歯類、ウサギなどに由来する卵母細胞）も適切であろう。さらに、同様な方法を用いればヒトの細胞または細胞核をヒトの卵母細胞に移植することができるはずである。したがって、本発明は、胚性または幹細胞様細胞および／または細胞培養を得るために用いることができる細胞を含有するＮＴユニットを製造するために、動物もしくはヒトの細胞核または動物もしくはヒトの細胞を当該ドナー核とは異なる動物種の脱核卵母細胞に注入または融合することによって移植することを、そのもっとも広い範囲の実施態様において包含する。例えば、本発明は、有蹄類の細胞核または有蹄類の細胞を別の種（例えば別の有蹄類または非有蹄類）の脱核卵母細胞に注入または融合することによって移植することを含む。これらの細胞および／または核は合体されＮＴユニットを産出し、さらに多細胞性ＮＴユニット（好ましくは少なくとも約２から４００細胞、より好ましくは４から１２８細胞、最も好ましくは少なくとも約５０細胞を含む）を得るために適切な条件下で培養される。そのようなＮＴユニットの細胞を用いて、培養に際して胚性もしくは幹細胞様細胞または細胞コロニーを製造することができる。しかしながら、本発明の好ましい実施態様は、ドナーのヒト細胞の核またはヒト細胞を動物の脱核卵母細胞、好ましくは有蹄類の卵母細胞、最も好ましくはウシの脱核卵母細胞に移植することによってヒト胚性または幹細胞様細胞を製造することを含む。一般に、当該胚性または幹細胞様細胞は以下の工程を含む核移植方法によって製造されるであろう：（i）ドナー核の供給源として用いられる所望のヒトまたは動物細胞を入手し；（ii）適切な供給源（例えば哺乳類、最も好ましくは有蹄類、例えばウシ）から卵母細胞を入手し； (iii)当該卵母細胞を脱核し；（iv）ヒトもしくは動物細胞または核をドナー細胞またはドナー核以外の動物種の脱核卵母細胞に融合または注入することによって移植し； (v)得られたＮＴ生成物またはＮＴユニットを培養して多細胞構造物を製造し；さらに（vi）当該胚から得られた細胞を培養して胚性または幹細胞様細胞および幹細胞様細胞コロニーを得る。核移転技術または核移植技術は文献で知られており、発明の背景で引用した多くの参考文献に記載されている。特に以下の文献を参照されたい：Campbellら、 Theriogenology，43:181(1995);Collasら、Mol．Report Dev.，38:264-267(199) ;Keeferら、Biol．Reprod.，50:935-939(1994);Simsら、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，90:6143-6147(1993);WO94/26884;WO94/24274およびWO90/03432（これらの文献は参照により本明細書に含まれる）。また、米国特許第4944384号明細書および5057420号はウシの核移植のための工程について述べている。ヒトまたは動物の細胞は周知の方法で得ることができる。本発明に有用なヒトおよび動物の細胞には、例えば上皮細胞、神経細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球、単核球、線維芽細胞、心筋細胞および他の筋肉細胞などが含まれる。さらにまた、核移植に用いられるヒトの細胞は異なる器官（例えば皮膚、肺臓、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、尿道および他の泌尿器官など）から得ることができる。これらは適切なドナー細胞の単なる例示である。適切なドナー細胞（すなわち本発明に有用な細胞）は身体のいずれの細胞または器官からも得ることができる。これには全ての体細胞および生殖細胞が含まれる。以下の実施例では、核移植のドナーとして用いられる細胞は、ヒトのドナーの口腔に由来する上皮細胞であった。しかしながら、考察するように開示した方法は他のヒト細胞または核に応用することができる。さらにまた、当該細胞の核はヒトの体細胞および細胞の両方から得ることができる。核移植に用いられる卵母細胞は、哺乳類および両生類を含む動物から得ることができる。卵母細胞の適切な哺乳類の供給源にはヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、モルモット、マウス、ハムスター、ラット、霊長類などが含まれる。好ましい実施態様では、卵母細胞は有蹄類および最も好ましくはウシから得ることができる。卵母細胞の単離方法は当技術分野では周知である。本質的には、当該方法は、哺乳類（例えばウシ）または両生類の卵巣または生殖管から卵母細胞を単離することを含む。ウシ卵母細胞の入手が容易な供給源は屠場の材料である。遺伝子操作、核移植およびクローニングのような技術を成功させるためには、卵母細胞を核移植の受容体細胞として用いる前に、さらに精子細胞によって受精させ胚に成長させる前に、これらの卵母細胞は一般にインビトロで成熟させなければならない。一般にこの過程は、動物の卵巣（例えば屠場で得られるウシ卵巣）から未成熟（分裂前期Ｉ）卵母細胞を採集し、さらに受精または脱核前に当該卵母細胞が分裂中期の第ＩＩステージに到達するまで（ウシの卵母細胞の場合にはこれは一般に吸引後約１８−２４時間に生じる）これら卵母細胞を成熟培養液中で成熟させることを必要とする。本発明の目的のためには、この時間は“成熟期間”として知られている。時間の計算のために本明細書で用いられるように、“ 吸引”とは卵胞から未成熟卵母細胞を吸引することを指す。さらに、既にインビボで成熟していた分裂中期第ＩＩステージの卵母細胞も核移植術に用いて成功した。本来、成熟した分裂中期ＩＩの卵母細胞は、非過排卵雌牛もしくは過排卵雌牛から、または発情期の開始から３５−４８時間経過した若い雌牛から、またはヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）もしくは同様なホルモンの注射後若い雌牛から外科的に採集される。脱核および核移植時の卵母細胞の成熟ステージは、ＮＴ法の成功にとって重要であると報告された(Pratherら、Differentiation，48:1-8(1991)を例えば参照されたい)。一般に哺乳類の胚のクローニングを成功させるためには分裂中期第ＩＩステージの卵母細胞を受容体の卵母細胞として用いる。これは、このステージで卵母細胞は、それが受精精子を処理するように導入された核を処理するために“活性化”することができるかまたは十分に“活性化”されていると考えられているからである。家畜（特にウシ）では、卵母細胞活性化期間は、吸引後一般に約１６−５２時間、好ましくは約２８−４２時間の範囲である。例えば、成熟卵母細胞は文献(Seshagineら、Biol．Reprod.，40:544-606(1989 ))に記載されたようにＨＥＰＥＳ緩衝ハムスター胚培養液（ＨＥＣＭ）で洗浄し、続いて３９℃で軽量パラフィンまたはシリコン層下で１０％ウシ胎児血清含有組織培養液（ＴＣＭ）１９９（当該ＴＣＭ１９９は適切なゴナドトロピン(例えば黄体形成ホルモン（ＬＨ）および卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ))およびエストラジオールを含む）の５０マイクロリットルから成る成熟培養液の点滴下に静置した。一定の成熟時間の後（これは約１０から４０時間の範囲で、好ましくは約１６ −１８時間である）、卵母細胞を脱核する。脱核の前に、好ましくは卵母細胞を取り出し、卵丘細胞の除去前に１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼを含むＨＥＣＭ中に置く。これは、内腔が非常に細いピペットによる吸引排出を繰り返すことによって、または渦動ミキサーで短時間処理することによって実施できる。続いて裸にした卵母細胞を極体についてスクリーニングし、選別した分裂中期ＩＩの卵母細胞（極体の存在によって決定される）を続いて核移植に用いる。脱核がこの後に続く。脱核は、例えば米国特許第4994384号明細書（この文献は参照により本明細書に含まれる）に記載されたように周知の方法で実施できる。例えば、即時脱核の場合には分裂中期ＩＩの卵母細胞をＨＥＣＭ（場合によって７．５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含む）中に静置するか、または適切な培養液(例えばＣＲ１ａａ(１０％発情期ウシ血清添加))に静置した後で好ましくは２４時間以内に、より好ましくは１６−１８時間以内に脱核する。脱核は、極体および近傍の細胞質を除去するためにマイクロピペットを用いて顕微鏡下で外科的に達成できる。続いて卵母細胞をスクリーニングし、脱核が成功したものを特定する。このスクリーニングは、ＨＥＣＭ中の１μｇ／ｍｌの３３３４２ヘキスト色素で卵母細胞を染色してから１０秒未満の紫外線照射下で卵母細胞を観察することによって実施できる。脱核が成功した卵母細胞を続いて適切な培養液（例えば１０％血清添加ＣＲ１ａａ）中に静置する。本発明では、受容体の卵母細胞は、好ましくはインビトロ成熟の開始後約１０時間から約４０時間、より好ましくはインビトロ成熟の開始後約１６時間から約２４時間、最も好ましくはインビトロ成熟の開始後約１６−１８時間の範囲の時間に脱核する。続いて、脱核卵母細胞とは異種のただ１個の動物またはヒト細胞を当該ＮＴユニットの製造のために用いた脱核卵母細胞の卵黄周囲間隙に移植する。当技術分野で既知の方法にしたがってＮＴユニットを製造するために、動物またはヒト細胞および脱核卵母細胞を用いる。例えば、細胞は電気融合によって融合させることができる。電気融合は、形質膜の一過性破壊を引き起こすために十分な電流パルスを提供することによって達成される。膜は迅速に再編成されるので、形質膜のこの一過性破壊は非常に短時間である。本来、２つの隣接する膜に破壊が誘導され、再編成時に脂質二重層が混ざり合うと、小さな通路がこの２つの細胞間に開口する。そのような小さな開口部の熱力学的な不安定性のために、当該開口部は２つの細胞が１つになるまで拡大する。この方法の更なる考察のためには米国特許第4997384号明細書(Pratherら、この文献は参照により本明細書に含まれる) を参照されたい。種々の電気融合培養液（例えば蔗糖、マンニトール、ソルビトールおよび燐酸緩衝溶液を含む）を用いることができる。融合はまた、融合誘導剤としてセンダイウイルスを用いて達成できる（Graham，Wister Inot．Symp．M onogr.，9:19(1969)）。いくつかの事例ではまた（例えば小さなドナー核の場合）、電気穿孔よりはむしろ核を卵母細胞に直接注入することが好ましい。そのような技術は文献に開示されている（Collas & Barnes，Mol．Reprod．Dev.，38:264-267(1994)、これは参照により本明細書に含まれる）。好ましくは、卵母細胞の成熟開始後約２４時間して５００μｍのチャンバー内で、９０−１２０Ｖの電気パルスを約１５μｓｅｃ用いることによってヒトまたは動物細胞および卵母細胞を電気融合させる。融合後、続いて生じた融合ＮＴユニットを活性化まで適切な培養液（例えばＣＲＩａａ培養液）に静置する。典型的には、活性化はその後まもなく、典型的には２４時間以内に、好ましくは４− ９時間以内に実施する。ＮＴユニットは既知の方法によって活性化することができる。そのような方法は、例えば生理的な温度以下で（本質的にはＮＴユニットにコールドショックまた実際には低温ショックを適用することによって）ＮＴユニットを培養することを含む。これは、ＮＴユニットを室温で培養することによって最も簡便に実施できる。室温は胚が通常曝されている生理的温度条件と比較して低い。また別には、既知の活性化剤を利用して活性化を達成できる。例えば、受精時の卵母細胞の精子の貫入は融合前の卵母細胞を活性化し、核移植後により多数の生存妊娠および遺伝的に同一の多数の仔牛を生じることが示された。また、例えば電気的および化学的ショックのような処置を用いて、融合後のＮＴ胚を活性化できる。適切な卵母細胞活性化法は米国特許第5496720号明細書(Susko-Parrish ら)の主題である。さらに活性化は以下の工程を同時にまたは連続的に行って実施できる：（i）卵母細胞中の二価陽イオンレベルを増加させ、さらに（ii）卵母細胞の細胞蛋白質の燐酸化を低下させる。一般に、これは、二価陽イオン（例えばイオン運搬体（イオノフォア）の形をした例えばマグネシウム、ストロンチウム、バリウムまたはカルシウム）を卵母細胞の細胞質に導入することによって実施される。二価陽イオンレベルを増加させる他の方法には電気ショック、エタノールによる処置およびケージド(caged)キレーターによる処置が含まれる。燐酸化は既知の方法、例えばキナーゼ抑制物質（例えば６−ジメチルアミノプリン、スタウロスポリン、２−アミノプリンおよびスフィンゴシンのようなセリン・スレオニンキナーゼ抑制物質）の添加によって低下させることができる。また別に、細胞蛋白の燐酸化は、卵母細胞にホスファターゼ（例えばホスファターゼ２Ａおよびホスファターゼ２Ｂ）を導入することによって抑制できる。好ましい実施態様では、ＮＴの活性化は、当該融合ＮＴユニットをＴＬ−ＨＥＰＥＳ培養液（５μＭのイオノマイシンおよび１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む）に短時間曝し、続いて３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＴＬ−ＨＥＰＥＳで融合後約２４時間以内、好ましくは融合後約４から９時間以内に洗浄することによって実施される。続いて活性化ＮＴユニットは、胚性または幹細胞様細胞および細胞コロニーが生じるまで、適切なインビトロ培養液で培養することができる。胚の培養および成熟に適した培養液は当技術分野で周知である。ウシの胚の培養および維持に使用することができる既知培養液の例には、ハムのＦ−１０（Ham's F-10）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、組織培養液−１９９（Tissue Culture Medium-199 ，TCM-199）＋１０％ウシ胎児血清、タイロード・アルブミン・ラクテート・ピルベート（Tyrodes-Albumin-Lactate-Pyruvate，TALP）、ダルベッコの(Dulbecc o's)燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、イーグル(Eagle's)培養液およびホィッテン(Wh itten's)培養液が含まれる。卵母細胞の採集および成熟に用いられる最も一般的な培養液の１つは、１から２０％の血清補充（ウシ胎児血清、新生児血清、発情期ウシ血清、仔羊血清または若牛血清を含む）ＴＣＭ−１９９である。好ましい維持培養液には、アール（Earl）の塩、１０％ウシ胎児血清、０．２ＭＭＭａピルベートおよび５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンスルフェートを含有するＴＣＭ−１９９が含まれる。上記のいずれもまた種々の細胞タイプ（例えば顆粒層細胞、卵管細胞、ＢＲＬ細胞、子宮細胞およびＳＴＯ細胞）との同時培養を含むことができる。また別の維持培養液が米国特許第5096822号明細書(Rosenkrans，Jr.ら、この文献は参照により本明細書に含まれる)に記載されている。この胚培養液（ＣＲ１と称される）は胚を維持するために必要な栄養物質を含む。ＣＲ１は、１．０ｍＭから１０ｍＭ、好ましくは１．０ｍＭから５．０ｍＭの範囲の量のヘミカルシウムＬ−乳酸塩を含む。ヘミカルシウムＬ−乳酸塩は、その中にヘミカルシウム塩を取り込んだＬ−乳酸塩である。ヘミカルシウムＬ−乳酸塩は、単一の成分が当該培養液で２つの主要な要求を満たすという点で重要である。すなわち、(i)緻密性と細胞骨格編成に必要なカルシウム要求、および（i i）代謝と電子伝達に必要な乳酸塩要求である。ヘミカルシウムＬ−乳酸塩はまた重要な鉱物としてさらに胚の生命活性に必要な培養液のエネルギー供給源として機能する。好都合なことに、ＣＲ１培養液は血清（例えばウシ胎児血清）を含まず、さらに動物細胞の同時培養または他の生物学的培養液（すなわち卵管細胞のような動物細胞を含む培養液）の使用を必要としない。生物学的培養液は時には不都合である。なぜならば、それら生物学的培養液は微生物または微量因子を含み、胚に有害であり検出、性状特定および排除が困難である。ＣＲ１培養液中の主要成分の例には、ヘミカルシウムＬ−乳酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、重炭酸ナトリウムおよび微量の脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン（Sigma A-6003）が含まれる。さらに、特定量の必須アミノ酸および非必須アミノ酸が当該培養液に添加される。アミノ酸を含むＣＲ１は“ＣＲｌａａ” の略語で知られている。ＣＲ１培養液は好ましくは以下の量で以下の成分を含む：塩化ナトリウム −１１４．７ｍＭ塩化カリウム −３．１ｍＭ重炭酸ナトリウム −２６．２ｍＭヘミカルシウムＬ−乳酸塩 −５ｍＭ脂肪酸非含有ＢＳＡ −３ｍｇ／ｍｌ好ましい実施態様では、活性化ＮＴ胚ユニットを１．９ｍＭのＤＭＡＰを含むＣＲｌａａ培養液に約４時間置き、続いてＨＥＣＭで洗浄した後ＢＳＡ含有ＣＲｌａａで培養する。例えば、活性化ＮＴユニットを２．０ｍＭのＤＭＡＰ(Sigma)を含むＣＲＩａａ培養液に移し、周囲環境（例えば約３８．５℃、５％ＣＯ₂）下で適切な時間（例えば約４から５時間）培養する。その後、好ましくは培養ＮＴユニットを洗浄し、続いてウェル培養プレートに含まれる適切な培養液（例えば１０％ＦＣＳおよび６ｍｇ／ｍｌ含有ＣＲＩａａ）に静置する。当該ウェル培養プレートは好ましくは適切な間隙のない養育細胞層を含む。適切な養育細胞層には、例示すれば線維芽細胞および上皮細胞（例えば有蹄類に由来する線維芽細胞および子宮上皮細胞、ニワトリ線維芽細胞、ネズミ（例えばマウス、ラット）線維芽細胞）、ＳＴＯ細胞およびＳＩ−Ｍ２２０養育細胞株並びにＢＲＬ細胞が含まれる。好ましい実施態様では、養育細胞はマウスの胚線維芽細胞を含む。適切な線維芽細胞養育層の調製手段は以下の実施態様で述べるが、当技術分野では周知の技術である。ＮＴユニットは、胚性幹細胞様細胞または細胞コロニーを製造するために用いることができる細胞を得るために適したサイズに達するまで養育細胞層上で培養される。好ましくは、これらのＮＴユニットは、少なくとも約２から４００細胞、より好ましくは約４から１２８細胞、最も好ましくは少なくとも約５０細胞まで培養される。この培養は、適切な条件（すなわち約３８．５℃および５％ＣＯ₂ ）下で、最適な増殖のために培養液を交換しながら（典型的には２−５日毎、好ましくは約３日毎）実施される。ヒト細胞／脱核ウシ卵母細胞に由来するＮＴユニットの場合には、ＥＳ細胞コロニーを産生するために十分な細胞（典型的には約５０細胞の規模で）が卵母細胞が活性化してから約１２日で得られる。しかしながら、これは核ドナーとして用いられる個々の細胞、個々の卵母細胞の種、および培養条件にしたがって変動するであろう。当業者は、当該培養ＮＴユニットの形態を基にして所望する十分な数の細胞が得られたときは目で容易にこれを確認できる。所望のサイズのＮＴユニットを得た後、細胞を機械的に透明帯から取り出し、続いて胚性または幹細胞様細胞および細胞株を製造するために用いる。これは、好ましくはＮＴユニットを含む細胞集塊（典型的には少なくとも約５０細胞を含む）を取り、当該細胞を洗浄し、養育細胞層（例えば照射線維芽細胞）上に静置することによって実施される。典型的には、幹細胞様細胞または細胞コロニーを得るために用いられる細胞は、好ましくはサイズが少なくとも５０細胞の培養ＮＴユニットの最内側部分から得られる。しかしながらこれより少ないまたは多い細胞数のＮＴユニットもまた、当該ＮＴユニットの他の部分から得られる細胞と同様にＥＳ様細胞および細胞コロニーを得るために用いることができる。これらの細胞は適切な増殖培養液（例えば１０％ＦＣＳおよび０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール(Sigma)およびＬ−グルタミン補充アルファＭＥＭ）で養育細胞層中で維持する。増殖培養液は最適な増殖のために必要なだけ（例えば約２−３日毎）交換する。この培養過程によって胚性または幹細胞様細胞または細胞株が形成される。ヒト細胞／ウシ卵母細胞に由来するＮＴ胚の場合は、コロニーは培養約２日目までにアルファＭＥＭ培養液で観察される。しかしながら、この時期は、個々の核ドナー細胞、個々の卵母細胞および培養条件にしたがって変動するであろう。当業者は、個々の胚性または幹細胞様細胞の増殖を最適にするために望ましいように培養条件を変えることができる。得られる胚性または幹細胞様細胞および細胞コロニーは、典型的にはドナー卵母細胞の種ではなくしばしば核の細胞ドナーとして用いた種の胚性または幹細胞様細胞と類似の外観を示す。例えば、ヒトの核ドナー細胞を脱核ウシ卵母細胞に移植して得た胚性または幹細胞様細胞の場合は、細胞はウシのＥＳ様細胞よりマウス胚性幹細胞により類似する形態を呈するより具体的には、ヒトＥＳ系統の細胞コロニーの個々の細胞の境界は明瞭ではなく、さらにコロニーの周囲は光が屈折し外観的に滑らかである。さらに、当該細胞コロニーはより長い細胞分裂時間（マウスのＥＳ細胞のそれの２倍）を有する。さらにまた、ウシおよびブタに由来するＥＳ細胞と異なり、コロニーは上皮様外観をもたない。得られた胚性または幹細胞様細胞および細胞株（好ましくはヒト胚性または幹細胞様細胞および細胞株）は、多くの治療的および診断的用途を有する。特に、そのような胚性または幹細胞様細胞は細胞移植療法に用いることができる。ヒトの胚性または幹細胞様細胞は多くの症状の治療に用いることができる。これに関して、マウスの胚性幹細胞（ＥＳ）は殆ど全ての細胞タイプ（例えば造血幹細胞）に分化することができることが知られている。したがって、本発明にしたがって製造されるヒトの胚性または幹細胞様細胞は同様な分化能力を有しているはずである。本発明にしたがって製造したヒトの胚性または幹細胞様細胞は、既知の方法にしたがって分化させ所望の細胞タイプを得るために誘導することができるであろう。例えば、本発明のヒトの胚性または幹細胞様細胞を分化培養液中で、さらに細胞分化を提供する条件下で培養することによって、そのような細胞を造血幹細胞、筋肉細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿道細胞などに分化させるために誘導することができるであろう。胚性幹細胞の分化をもたらす培養液および方法は、適切な培養条件と同様に当技術分野で知られている。例えばパラシオら（Palaciosら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，92:7530-7537 (1995)）は、幹細胞の凝集塊を先ずレチン酸を欠く浮遊培養液で培養し、続いてレチン酸を含む同じ培養液で培養し、その後細胞付着を供給する基質に細胞凝集塊を移す工程を含む誘発工程に幹細胞を付すことによって胚細胞系から造血幹細胞を産生することについて教示する。さらにまた、ペデルセン（Pedersen，J．Reprod．Fertil．Dev.，6:543-552(1 994)）の文献は、種々の分化細胞タイプ（とりわけ造血細胞、筋肉細胞、心筋細胞、神経細胞を含む）を製造する胚性幹細胞のインビトロ分化を開示する多数の論文を引用した概説である。さらに、ベインら(Bainら、Dev．Biol.，168:342-357(1995))は、ニューロンの特性を有する神経細胞を製造する胚性幹細胞のインビトロ分化を教示する。これらの文献は胚性または幹細胞様細胞から分化細胞を得る方法の報告例である。これらの方法および特に胚性幹細胞を分化させる方法に関してその中に開示された事柄は参照により本明細書に含まれる。したがって、既知の方法および培養液を用いて当業者は本発明の胚性または幹細胞様細胞を培養し、所望の分化細胞（例えば神経細胞、筋肉細胞、造血細胞など）を得ることができる。本発明の胚性または幹細胞様細胞を用いて、所望するいずれの分化細胞タイプを得ることも可能である。そのようなヒトの分化細胞の治療的な使用はこれまでにはなかった。例えば、ヒトの造血幹細胞は骨髄移植に必要な医療処置に用いることができるであろう。そのような工程は、免疫系を傷つける疾患（例えばエイズ）とともに多くの疾患（例えば卵巣癌および白血病のような癌の後期）の治療に用いられる。造血幹細胞は、例えば癌またはエイズ患者の成人体細胞（例えば上皮細胞またはリンパ球）を脱核卵母細胞（例えばウシ卵母細胞）と融合させ、胚性または幹細胞様細胞を上記のようにして入手し、さらにそのような細胞を分化を促進させる条件下で造血幹細胞が得られるまで培養することによって得ることができる。そのような造血細胞は、癌およびエイズを含む疾患の治療に用いることができる。また別には、神経学的疾患を有する患者の成人体細胞を脱核動物卵母細胞（例えばウシ卵母細胞）と脱核動物卵母細胞（例えばウシ卵母細胞）を融合させ、ヒト胚性または幹細胞様細胞を得て、そのような細胞を神経細胞株を産出する分化条件下で培養する。そのようなヒト神経細胞の移植によって治療できる具体的な疾患には、例示すればとりわけパーキンソン氏病、アルツハイマー病、ＡＬＳおよび脳性麻痺が含まれる。パーキンソン氏病の具体的な例では、移植された胎児脳の神経細胞は周辺の細胞と適切な連結を生じ、さらにドパミンを産生することが示された。これによってパーキンソン氏病の長期的な兆候の回復がもたらされた。本発明の大きな利点は、移植に適するヒトの同質遺伝子または同系遺伝子細胞を本質的に無制限に提供するということである。したがって、本発明は現在の移植方法に付随する重大な問題、すなわちホスト対移植片または移植片対ホスト拒絶反応のために生じる可能性がある移植組織の拒絶を予防するであろう。慣用的には拒絶は抗拒絶薬（例えばシクロスポリン）の投与によって予防または低下させられる。しかしながら、そのような薬剤は、きわめて高価であるとともに重大な副作用、例えば免疫抑制、発癌特性を有する。本発明は、抗拒絶薬の必要性を排除するか、または少なくとも大きく減少させるはずである。同質遺伝子細胞療法によって治療できる他の疾患または症状には、例を挙げれば脊髄損傷、多発性硬化症、筋萎縮症、糖尿病、肝臓疾患（すなわち高コレステロール血症）、心臓疾患、軟骨補充、火傷、足の潰瘍、胃腸疾患、血管疾患、腎臓疾患、尿道疾患並びに加齢に関係する疾患および症状が含まれる。本発明にしたがって製造されたヒト胚性または幹細胞様細胞はまた、遺伝子操作または遺伝子導入ヒト分化細胞の製造のために用いることができる。本質的には、これは所望の遺伝子（異種でもよい）を導入するか、または本発明にしたがって製造されたヒト胚性または幹細胞様細胞の内在遺伝子の全てまたは一部分を除去し、さらにそのような細胞を所望の細胞タイプに分化させることによって実施される。そのような修飾を達成する好ましい方法は同種組換えによるが、これは、そのような技術は当該幹細胞様細胞のゲノムの特定部位に遺伝子を挿入させるか、当該特定部位の遺伝子を欠失または修飾させるために用いることができるからである。この方法論を用いて、不完全な遺伝子（例えば不完全な免疫系遺伝子、嚢胞性線維症遺伝子）を置換するか、または治療的に有益な蛋白質（例えば増殖因子、リンホカイン、サイトカイン、酵素など）の発現をもたらす遺伝子を導入することができる。例えば、脳由来増殖因子をコードする遺伝子をヒト胚性または幹細胞様細胞に導入し、この細胞を神経細胞に分化させ、さらにパーキンソン氏病患者に移植して当該疾患時の神経細胞消失を遅らせることができる。これまではＢＤＮＦをトランスフェクト（核酸感染）される細胞は初代培養細胞から不朽化細胞株（神経由来または非神経（筋原細胞および線維芽細胞）由来細胞のいずれか）までいろいろであった。例えば、レトロウイルスベクターを用いて星状細胞にＢＤＮＦ遺伝子を核酸感染し、この細胞をパーキンソン氏病のラットモデルに移植した(Yoshimotoら、Brain Research，691:25-36(1995))。このエクスビボ治療法は、移植後３２日で４５％までラットのパーキンソン様症状を減少させた。タイロシンヒドロキシラーゼ遺伝子もまた星状細胞に導入され、同様な結果が得られた（Lundbergら、Develop．Neurol.，139:39-53(1996) およびその中に引用された文献）。しかしながら、そのようなエクスビボ系には問題がある。特に、現在用いられているレトロウイルスベクターはインビボでダウンレギュレートされ、導入遺伝子は一過性でしか発現されない（Mulligan，Science，260:926-932(1993)）。そのような実験はまた初代培養細胞（星状細胞）を用いるが、これは寿命が有限で増殖が遅い。そのような特性は核酸感染率に悪影響を及ぼし、安定的に核酸感染された細胞の選別を妨げる。さらにまた、同種組換え技術で用いられる遺伝子標的初代培養細胞の大量の集団を調製することはほとんど不可能である。それとは反対に、ヒト胚性または幹細胞様細胞を使用することによってレトロウイルス系に付随する問題は排除されるはずである。本発明の譲受け人は、ウシおよびブタの胚性細胞株に異種ＤＮＡを核酸感染し当該ＤＮＡの安定な組み込みについて選別できることを以前に明らかにした。そのような方法は、共同譲渡された米国特許出願第08/626054号明細書（1996年４月１日出願、この文献は参照により本明細書に含まれる）に記載されている。したがって、そのような方法または他の既知の方法を用いて所望の遺伝子を本発明のヒト胚性または幹細胞様細胞に導入し、この細胞を所望の細胞タイプ（例えば造血細胞、神経細胞、膵臓細胞、軟骨細胞など）に分化させることができる。本発明の胚性または幹細胞様細胞に導入できる遺伝子は、例示すれば上皮性増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、神経膠細胞由来神経栄養性増殖因子、インスリン様増殖因子（ＩおよびＩＩ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４／５、毛様体性神経栄養因子、ＡＦＴ−１、サイトカイン遺伝子（インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子（アルファおよびベータ）など）、治療用酵素をコードする遺伝子などが含まれる。本発明の胚性または幹細胞様細胞（好ましくはヒト細胞）はまた分化のインビトロモデルとしても、特に初期発生の調節に必要な遺伝子の研究のために用いることができる。さらにまた、本発明の胚性または幹細胞様細胞を用いた分化細胞組織および器官は薬剤の研究にも用いることができる。さらに、本発明の胚性または幹細胞様細胞は、他の胚性または幹細胞様細胞および細胞コロニーの製造のために核ドナーとして用いることができる。さらに本発明を明瞭に説明するために以下の実施例を提供する。実施例１材料と方法核移植のためのドナー細胞承諾を得た成人の口内から標準的なガラススライドで上皮細胞を軽くこすり取る。ＣａまたはＭｇを含まないリン酸緩衝食塩水を含むペトリ皿に細胞を洗い出す。細い内腔のピペットを通して細胞を吸引排出して、細胞塊を単一細胞懸濁液にする。続いて脱核ウシ卵母細胞に核移植するためにオイル下で１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＴＬ−ＨＥＰＥＳ培養液の微量点滴中にこの細胞を移す。核移植方法基本的な核の移植方法は以前に記載された。簡単に記せば、屠場の卵母細胞をインビトロで成熟させた後、卵母細胞を卵丘細胞から剥がし、成熟後約１８時間で斜めに切ったマイクロピペットで脱核した。脱核はＴＬ−ＨＥＰＥＳ培養液＋ビスベンジミド(Hoechst33342、３μｇ／ｍｌ、Sigma)中で確認した。続いて個々のドナー細胞を受容体の卵母細胞の卵黄周囲間隙に置く。ウシ卵母細胞の細胞質とドナー核（ＮＴユニット）を電気融合術を用いてともに融合させる。９０Ｖ、１５μｓｅｃから成る１回の融合パルスをＮＴユニットに用いた。これは卵母細胞の成熟開始後２４時間で行われる。ＮＴユニットを成熟開始後２８時間までＣＲｌａａ培養液に静置した。人工的に卵母細胞を活性化させるために用いる方法は別のところで述べた。ＮＴユニット活性化は成熟開始後２８時間であった。活性化方法を簡単に記せば以下の通りである：ＮＴユニットを１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ補充ＴＬ−ＨＥＰＥＳ中のイオノマイシン(５μＭ、CalBiochem(ラホイヤ、カリフォルニア))に４分間曝し、続いて３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ補充ＴＬ−ＨＥＰＥＳで５分間洗浄した。続いて当該ＮＴユニットを０．２ｍＭのＤＭＡＰ(Sigma)含有ＣＲｌａａ培養液の微量滴下中に移し、４から５時間３８．５℃、５％ＣＯ₂で培養した。ＮＴユニットを洗浄し、続いて間隙なく増殖させたマウス胚線維芽細胞養育細胞層（下記に記載）を含む４つのウェル培養プレートのＣＲｌａａ培養液（１０％ＦＣＳおよび６ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ添加）に静置した。このＮＴユニットをさらに３日間３８．５℃、５％ＣＯ₂で培養した。活性化後１２日目まで３日毎に培養液を交換した。この時期に所望の細胞数（約５０細胞数）に達したＮＴユニットを機械的に透明帯から取り出し、胚細胞株を製造するために用いた。上記に述べたように得たＮＴユニットの写真は図１に含まれる。線維芽細胞養育層胚線維芽細胞の初代培養を１４−１６日齢のネズミ胎児から得た。頭部、肝臓、心臓および消化管を無菌的に除去した後、胎児を細切し、さらに前もって温めたトリプシンＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン／Ｏ．０２％ＥＤＴＡ(GIBCO 、グランドアイランド、ニューヨーク))で３７℃で３０分保温した。線維芽細胞を組織培養フラスコに静置し、１０％ウシ胎児血清(FCS，Hyclone，Logen、ユタ )、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０μｌ／ｍｌ）を補充したアルファ−ＭＥＭ培養液（BioWhittaker、ウォーカースビル、メリーランド）で培養した。継代後３から４日後、胚線維芽細胞（３５×１０Ｎｕｎｃ培養皿(Baxter Scientific，McGaw Park、イリノイ)を照射した。照射線維芽細胞を成長させ、５％ＣＯ２を含む湿潤な大気中で３７℃で維持した。この後均一な単層細胞を含む培養プレートを用いて胚細胞株を培養した。胚細胞株の製造上記のように得たＮＴユニット細胞を洗浄し、照射した養育線維芽細胞上に直接静置した。これらの細胞はＮＴユニットの内側部分の細胞を含んでいた。細胞は、１０％ＦＣＳおよび０．１ｍＭベーターメルカプトエタノール(Sigma)を補充したアルファＭＥＭから成る増殖培養液中で維持した。増殖培養液は２−３日毎に交換した。培養２日目までに最初のコロニーが観察された。このコロニーは増殖して、以前に開示されたマウス胚性幹細胞（ＥＳ）と同様な形態を呈した。コロニー内の個々の細胞は輪郭が明瞭でなく、コロニーの周囲は光が屈折し外観は滑らかであった。細胞コロニーはマウスＥＳ細胞より遅い細胞分裂時間をもつようである。またウシおよびブタ由来ＥＳ細胞と異なり、コロニーはこれまでのところ上皮性外観をもたない。図２から５は、上記に記載したように得たＥＳ様細胞コロニーの写真である。分化ヒト細胞の製造得られたヒト胚細胞を分化培養液に移し、分化ヒト細胞が得られるまで培養した。結果表１．ＮＴユニット製造および成長におけるドナー核としてのヒト細胞１６細胞より大きい構造に成長した１つのＮＴユニットを線維芽細胞の養育細胞層上で平板培養した。この構造物は当該養育細胞層に付着し、増殖を開始してＥＳ細胞様形態をもつコロニーを形成した（例えば図２参照）。さらにまた、４から１６細胞期の構造物はＥＳ細胞コロニーを産出させるために用いなかったが、このステージはＥＳまたはＥＳ様細胞株を産出することができることが以前に示された（マウス、Eistetterら、Devel．Growth and Differ.，31:275-282(198 9);ウシ、Sticeら、(1996)）。したがって、４−１６細胞期のＮＴユニットもまた胚性または幹細胞様細胞および細胞コロニーを生じるはずである。本発明は、種々の特定の材料、工程および実施例を参考に本明細書で説明し例示してきたが、本発明は、当該目的のために選択した特定の材料、材料の組み合わせおよび工程に限定されるものではないことは理解されよう。そのような細部に関する多数の変形例は当然包含され、これらは当業者には理解されるところである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 13/00 13/00 25/16 25/16 25/28 25/28 31/18 31/18 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ローブルジェームズアメリカ合衆国マサチューセッツ州 01002 ベルチャータウンオールドエンフィールド 196 (72)発明者シーベリージョージアメリカ合衆国マサチューセッツ州 01002 アムハーストヴィレッジパーク 166 (72)発明者スタイススティーヴンエルアメリカ合衆国マサチューセッツ州 01007 ベルチャータウンアムハーストロード 468

Claims

【特許請求の範囲】 1．胚性または幹細胞様細胞を製造する方法であって、以下の工程：（i)所望のヒトもしくは哺乳類細胞または細胞核を、当該ヒトまたは哺乳類細胞以外の異なる動物種に由来する脱核動物細胞に、核移植（ＮＴ）ユニットの形成に適した条件下で挿入する工程、（ii）当該生じた核移植ユニットを活性化する工程、（iii)当該活性化核移植ユニットを２細胞発育ステージより大きいステージまで培養する工程、および（iv）当該培養ＮＴユニットから得た細胞を培養して胚性または幹細胞様細胞を得る工程、を含むことを特徴とする方法。 2．脱核動物卵母細胞に挿入される細胞がヒト細胞である請求項１記載の方法。 3．当該ヒト細胞が成人の細胞である請求項２記載の方法。 4．当該ヒト細胞が上皮性細胞またはリンパ球である請求項２記載の方法。 5．当該卵母細胞が哺乳類から得られる請求項２記載の方法。 6．当該動物の卵母細胞が有蹄類から得られる請求項５記載の方法。 7．当該有蹄類がウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギおよびバッファローから成る群から選ばれる請求項６記載の方法。 8．当該脱核卵母細胞が脱核前に成熟している請求項１記載の方法。 9．当該融合核移植ユニットがイオノマイシンおよびＤＭＡＰに暴露されることによって活性化される請求項１記載の方法。 10．当該活性化核移植ユニットが養育細胞層培養物上で培養される請求項１記載の方法。 11．当該養育細胞層が線維芽細胞を含む請求項１０記載の方法。 12．工程（iv）で１６細胞以上の細胞をもつＮＴユニットに由来する細胞が養育細胞層上で培養される請求項１記載の方法。 13．当該養育細胞層が線維芽細胞である請求項１２記載の方法。 14．当該線維芽細胞がマウス胚線維芽細胞を含む請求項１３記載の方法。 15．生じた胚性または幹細胞様細胞を誘導し分化させる請求項１記載の方法。 16．生じた胚性または幹細胞様細胞を誘導し分化させる請求項２記載の方法。 17．融合が電気融合によって実施される請求項１記載の方法。 18．請求項１記載の方法にしたがって得られる胚性または幹細胞様細胞。 19．請求項２記載の方法にしたがって得られるヒト胚性または幹細胞様細胞。 20．請求項３記載の方法にしたがって得られるヒト胚性または幹細胞様細胞。 21．請求項４記載の方法にしたがって得られるヒト胚性または幹細胞様細胞。 22．請求項６記載の方法にしたがって得られるヒト胚性または幹細胞様細胞。 23．請求項７記載の方法にしたがって得られるヒト胚性または幹細胞様細胞。 24．請求項１６記載の方法によって得られるヒトの分化細胞。 25．神経細胞、造血細胞、膵臓細胞、筋肉細胞、軟骨細胞、泌尿器細胞、肝臓細胞、脾臓細胞、生殖細胞、皮膚細胞、腸管細胞および胃の細胞から成る群から選ばれる請求項２４記載のヒト分化細胞。 26．細胞移植治療を必要としている患者に請求項２４記載の同質遺伝子系分化ヒト細胞を投与することを特徴とする治療方法。 27．当該細胞移植治療が、パーキンソン氏病、ハンチントン氏病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄欠損または損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、肝臓疾患、糖尿病、心臓疾患、軟骨欠損または損傷、火傷、足の潰瘍、血管疾患、尿道疾患、エイズおよび癌から成る群から選ばれる疾患または症状の治療のために実施される請求項２６記載の方法。 28．当該ヒトの分化細胞が造血細胞または神経細胞である請求項２６記載の方法。 29．当該治療がパーキンソン氏病のためであり、当該分化細胞が神経細胞である請求項２６記載の方法。 30．当該治療が癌治療のためであり、当該分化細胞が造血細胞である請求項２６記載の方法。 31．挿入された遺伝子を含み、これを発現させる請求項２４記載のヒト分化細胞。 32．当該胚性または幹細胞様細胞内で所望の遺伝子が挿入され、除去され、または修飾される請求項１記載の方法。 33．当該所望の遺伝子が治療用酵素、増殖因子、またはサイトカインをコードする請求項３２記載の方法。 34．当該胚性または幹細胞様細胞がヒト胚性または幹細胞様細胞である請求項３２記載の方法。 35．当該所望の遺伝子が同種組換えによって除去され、修飾され欠失させられる請求項３２記載の方法。