JP2001509361A

JP2001509361A - 分化した無血清飢餓細胞からの供与核を用いるクローニング

Info

Publication number: JP2001509361A
Application number: JP2000500926A
Authority: JP
Inventors: スティーヴンエルスタイス; ジョージシーベリー; ジェームズエムローブル; ポールゴルーエク; ドレオンエフアベルポンス; ディージョセフジェリー
Original assignee: ユニヴァーシティーオヴマサチューセッツ
Priority date: 1997-07-03
Filing date: 1998-06-24
Publication date: 2001-07-24
Also published as: BR9811657A; CA2294916A1; NZ502129A; WO1999001163A1; IL133786A0; EP1017422A1; AU8154398A; EP1017422A4; CN101003800A; CN1265599A

Abstract

(57)【要約】無血清飢餓細胞からの分化した供与細胞核の移植を含む核伝達の改良された方法を提供する。得られた核伝達単位は、ヒト同質遺伝子胚細胞又は幹細胞を含む、胎児や子をつくることにより、及び同質遺伝子ＣＩＣＭ細胞をつくるために遺伝子型及びトランスジェニック遺伝子型の増殖に有効である。遺伝子操作した又はトランスジェニック哺乳乳動物の胚、胎児及び子をつくる方法は、供与核の分化した細胞源が遺伝的に修飾されクローンで増殖されるので本方法により容易になる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、分化した無血清飢餓哺乳動物細胞由来の細胞核を供与核と同じ種の
除核された哺乳動物卵母細胞へ移植するクローニング操作に関する。該核はクロ
ーン化胚の発生を特定するように再びプログラムされ、胎児と子をつくるために
受容雌に導入されるか又は内部細胞塊培養細胞（ＣＩＣＭ）をつくるために用い
られる。クローン化胚は、また、キメラ胚、胎児及び／又は子をつくるために受
精胚と混合される。

【０００２】（発明の背景）核移植のための有蹄類内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞の使用が報告された。例えば
、Ｃｏｌｌａｓら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（
１９９４）には、溶解供与細胞を除核された成熟卵母細胞へマイクロインジェク
ションすることによるウシＩＣＭの核移植が開示されている。Ｃｏｌｌａｓらに
は、胚を試験管内で７日間培養して１５の胚盤胞をつくり、ウシ受容体へ導入し
た際に４頭の妊娠と２頭の出産をもたらしたことが開示された。また、Ｋｅｅｆ
ｅｒら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５０：９３５−９３９（１９９４）には、
核伝達操作において供与核としてウシＩＣＭ細胞を用いて胚盤胞をつくり、ウシ
受容体へ移植した際に数頭の生存力のある子が得られたことが開示された。更に
、Ｓｉｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：６１
４３−６１４７（１９９３）には、試験管内短期培養したウシＩＣＭ細胞からの
核を除核された成熟卵母細胞へ導入することにより子ウシをつくることが開示さ
れた。

【０００３】胚板培養細胞を核伝達した後に生存力のある子ヒツジをつくる方法も報告され
た（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：６４−６８（１９９６））。
更に、核伝達においてウシ多能性胚細胞を用いること及びキメラ胎児をつくるこ
とが報告された（Ｓｔｉｃｅら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５４：１００−１
１０（１９９５）；Ｃｏｌｌａｓら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８：
２６４−２６７（１９９４））。Ｃｏｌｌａｓらは、胚をつくるためにウシクロ
ーニング操作において顆粒膜細胞（成体細胞）が用いられることを証明した。し
かしながら、初期胚段階（胚盤胞段階）を過ぎた発育は証明されなかった。また
、顆粒膜細胞は容易に培養されず、雌からだけ得られる。Ｃｏｌｌａｓらは、培
養内で顆粒膜細胞を増殖することを行わず、その細胞を遺伝的に修飾することも
試みなかった。Ｗｉｌｍｕｔら（Ｎａｔｕｒｅ，３５５：８１０−８１３（１９
９７））は胎児線維芽細胞由来の核伝達ヒツジ子、及び成体ヒツジ由来の細胞か
らの子をつくった。

【０００４】トランスジェニック哺乳動物をつくる領域においても問題がある。現在の方法
は、異種ＤＮＡを初期胚又は胚細胞へ導入し、胎児において種々の細胞タイプへ
分化し、最後にトランスジェニック動物へ発育するものである。しかしながら、
多くの初期胚がトランスジェニック動物をつくるために必要であり、この方法は
非常に効率が悪い。また、トランスジェニック胚を選択した後にその胚を代理雌
へ入れるという時間と費用を使うという簡便かつ効率のよい方法ではない。更に
、遺伝子ターゲッティング技術は、初期胚トランスジェニック操作ではたぶん達
成されない。

【０００５】マウスにおける胚性幹細胞は、トランスジェニック細胞を選択し遺伝子ターゲ
ッティングを行う研究を可能にした。これにより、他のトランスジェニック技術
において可能であるよりも遺伝子操作が可能になる。しかしながら、胚性幹細胞
系及び他の胚細胞系は、支持細胞層及び／又は培地へのサイトカインの添加を必
要とする未分化状態で維持されなければならない。その注意をしたとしても、細
胞はたいてい自然分化を受け、現在有効な方法でトランスジェニック子をつくる
ために用いられない。また、ある胚細胞系は、遺伝子ターゲッティング操作を援
助しない方法で増殖されなければならない。

【０００６】前挿入マウス初期胚から試験管内で胚性幹（ＥＳ）細胞系を誘導する方法は周
知である。（例えば、Ｅｖａｎｓら，Ｎａｔｕｒｅ，２９：１５４−１５６（１
９８１）；Ｍａｒｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，
７８：７６３４−７６３８（１９８１）を参照されたい。）ＥＳ細胞は、線維芽
細胞の支持細胞層（Ｅｖａｎｓら，同書）又は分化阻害源（Ｓｍｉｔｈら，Ｄｅ
ｖ．Ｂｉｏｌ．，１２１：１−９（１９８７））が存在するならば未分化状態で
継代される。

【０００７】ＥＳ細胞は多くの応用をもつことが以前から報告されている。例えば、ＥＳ細
胞は、分化、特に初期発生の調節に関係する遺伝子の研究に試験管内モデルとし
て用いられることが報告された。マウスＥＳ細胞は、前挿入マウス胚へ導入され
る場合の生殖系列キメラを生じることができ、その多能性が証明されている（Ｂｒａｄｌｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３０９：２５５−２５６（１９８４））。

【０００８】ゲノムを次の世代へ伝達する能力の観点から、ＥＳ細胞は所望の遺伝的修飾を
含む又は含まないＥＳ細胞を用いることにより家畜動物の生殖系列操作に潜在的
用途がある。更に、家畜動物、例えば、有蹄類の場合には類似の前挿入家畜胚か
らの核が除核された卵母細胞の満期までの発育を援助する（Ｓｍｉｔｈら，Ｂｉ
ｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，４０：１０２７−１０３５（１９８９）；Ｋｅｅｆｅｒ
ら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５０：９３５−９３９（１９９４））。これは
、導入後に８−細胞段階以上は除核された卵母細胞の発育を援助しないことが報
告されているマウス胚からの核と対照的である（Ｃｈｅｏｎｇら，Ｂｉｏｌ．Ｒ
ｅｐｒｏｄ．，４８：９５８（１９９３））。従って、家畜動物からのＥＳ細胞
は、核伝達操作のために遺伝的に操作された又は他の方法での潜在的全能性供与
核源を与えることから非常に望ましい。

【０００９】ある研究グループがその称するところによれば多能性胚細胞系の単離を報告し
た。例えば、Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉら，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｓｕｐｐ
ｌ．，４３：２５５−２６０（１９９１）には、ヒツジ胚盤胞から免疫外科的に
単離した内部細胞塊の初代培養内の細胞と同じ形態学的及び発育特性を示すブタ
及びヒツジ胚盤胞からのその称するところによれば安定で多能性の細胞系の樹立
が報告されている。また、Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉら，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒ
ｔ．Ｓｕｐｐｌ．，４１：５１−５６（１９９０）には、ブタ胚盤胞からの推定
多能性胚細胞系の培養内維持及び分化が開示されている。Ｇｅｒｆｅｎら，Ａｎ
ｉｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，６（１）：１−１４（１９９５）には、ブタ胚盤胞から
の胚細胞系の単離が開示されている。それらの細胞は、順化培養液を用いずにマ
ウス胚線維芽細胞支持細胞層に安定に維持され、報告では培養中に数種の異なる
細胞タイプに分化している。

【００１０】更に、Ｓａｉｔｏら，Ｒｏｕｘ’ｓＡｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２０１
：１３４−１４１（１９９２）には、３継代を生存するが４継代後に消失した培
養したウシ胚性幹細胞様細胞系が報告されている。Ｈａｎｄｙｓｉｄｅら，Ｒｏ
ｕｘ’ｓＡｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９６：１８５−１９０（１９８７
）には、マウスＩＣＭ由来のマウスＥＳ細胞系の単離を可能にする条件下でヒツ
ジ胚の免疫外科的に単離した内部細胞塊の培養が開示されている。Ｈａｎｄｙｓ
ｉｄｅらには、その条件下、ヒツジＩＣＭがＥＳ細胞様及び内胚葉様細胞双方の
領域を付着、拡散及び発育するが、長時間培養後に内胚葉様細胞のみが明らかで
あることが報告されている。

【０００１１】最近、Ｃｈｅｒｎｙら，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，４１：１７５（１９
９４）には、長期培養内に維持されたその称するところによれば多能性ウシ始原
生殖細胞由来細胞系が報告されている。培養内で約７日後の細胞は、アルカリ性
ホスファターゼ（ＡＰ）に陽性染色したＥＳ様コロニーを生じ、胚様体を形成す
る能力を示し、少なくとも２種類の異なる細胞タイプに自発的分化した。それら
の細胞は、報告ではＥＳ細胞のみで発現されると思われるホメオボックス遺伝子
パターンである転写因子ＯＣＴ４、ＯＣＴ６及びＨＥＳ１のｍＲＮＡを発現した
。

【００１２】また最近、Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：６４−６８（１９９
６）には、マウスにおいてＥＳ細胞系の単離を促進する条件下で培養した９日目
のヒツジ胚からの培養した胚板（ＥＤ）細胞を核伝達することにより生存力のあ
る子ヒツジをつくることが報告された。著者らは、９日目のヒツジ胚からのＥＤ
細胞が核伝達により全能性であり、かつ全能性が培養内で維持されると結論した
。

【００１３】ＶａｎＳｔｅｋｅｌｅｎｂｕｒｇ−Ｈａｍｅｒｓら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ
．Ｄｅｖ．，４０：４４４−４５４（１９９５）には、ウシ胚盤胞の内部細胞塊
細胞からのその称するところによれば永久細胞系の単離及び確認が報告された。
著者等は、支持細胞と培養液がウシＩＣＭ細胞の付着と派生を支持するのに最も
効率のよいことを求める異なる条件下で８又は９日目のウシ胚盤胞からのＩＣＭ
を単離及び培養した。培養したＩＣＭ細胞の付着及び派生がＳＴＯ（マウス線維
芽細胞）支持細胞（ウシ子宮上皮細胞の代わりに）の使用及びその培養液を補足
する木炭ストリッピング血清（正常血清ではなく）の使用により高められると結
論した。しかしながら、ＶａｎＳｔｅｋｅｌｅｎｂｕｒｇらには、その細胞系
が多能性ＩＣＭ細胞より上皮細胞に似ていることが報告された。

【００１４】Ｓｍｉｔｈらの１９９４年１０月２７日公開の国際出願第９４／２４２７４号
、Ｅｖａｎｓらの１９９０年４月５日公開の国際出願第９０／０３４３２号、及
びＷｈｅｅｌｅｒらの１９９４年１１月２４日公開の国際出願第９４／２６８８
９号には、その称するところによればトランスジェニック動物を得るために用い
られる動物幹細胞の単離、選択及び増殖が報告されている。Ｅｖａｎｓらには、
トランスジェニック動物をつくるのに有効であることを主張しているブタ及びウ
シの種からのその称するところによれば多能性胚性幹細胞を誘導することが報告
された。更に、Ｗｈｅｅｌｅｒらの１９９４年１１月２４日公開の国際出願第９
４／２６８８９号には、キメラ及びトランスジェニック有蹄類の製造に有効であ
ることを主張している胚性幹細胞が開示された。

【００１５】従って、上記に基づいて、多くのグループが、例えば、クローン化又はトラン
スジェニック胚の生産や核移植における潜在的応用のためにＥＳ細胞系をつくる
ことを試みたことは明らかである。

【００１６】以前に文献に報告された方法にもかかわらず、哺乳動物細胞をクローン化する
改良された方法が求められている。

【００１７】（発明の目的及び要約）本発明の目的は、クローン化哺乳動物（例えば、胚、胎児及び子）をつくる新
規で改良された方法を提供することである。

【００１８】本発明の個々の目的は、分化した無血清飢餓哺乳動物細胞の核を同じ種の除核
された卵母細胞へ移植する工程を含む哺乳動物をクローン化する新規な方法を提
供することである。

【００１９】本発明の目的は、また、遺伝的優位性又は他の所望の形質がわかった成体哺乳
動物を増殖させる方法を提供することである。

【００２０】本発明の他の目的は、遺伝子操作した又はトランスジェニック哺乳動物（例え
ば、胚、胎児、子）をつくる改良された方法を提供することである。本発明は、
また、その方法でつくられた遺伝子操作した又はトランスジェニック哺乳動物を
提供する。

【００２１】本発明の個々の目的は、分化した哺乳動物細胞又は細胞核において所望のＤＮ
Ａ配列を挿入、除去又は修飾した後にその分化した細胞又は細胞核をＮＴ単位の
形成のために用いる遺伝子操作した又はトランスジェニック哺乳動物をつくる方
法を提供することである。本発明は、また、その方法でつくられた遺伝子操作し
た又はトランスジェニック哺乳動物を提供する。

【００２２】本発明の他の目的は、分化した無血清飢餓トランスジェニック細胞の核を該分
化した細胞と同じ種の除核された卵母細胞へ移植することにより遺伝子操作した
又はトランスジェニック哺乳動物をつくる方法を提供することである。本発明は
、また、その方法でつくられた遺伝子操作した又はトランスジェニック哺乳動物
を提供する。

【００２３】本発明の他の目的は、分化した無血清飢餓細胞の核を該分化した細胞と同じ種
の除核された卵母細胞へ移植する工程を含む哺乳動物ＣＩＣＭ細胞をつくる新規
な方法を提供することである。

【００２４】本発明の他の目的は、分化した無血清飢餓哺乳動物細胞の核を該分化した細胞
と同じ種の除核された卵母細胞へ移植することによりつくられたＣＩＣＭ細胞を
提供することである。

【００２５】本発明の個々の目的は、無血清飢餓ヒト細胞、例えば、ヒト成体細胞の核を除
核されたヒト卵母細胞へ移植する工程を含むヒトＣＩＣＭ細胞をつくる方法を提
供することである。

【００２６】本発明の他の目的は、そのＣＩＣＭ細胞を治療又は診断のために用いることで
ある。

【００２７】本発明の個々の目的は、ヒト及び有蹄類ＣＩＣＭ細胞を含むＣＩＣＭ細胞を細
胞、組織又は器官移植が治療的又は診断的に有益である疾患の治療又は診断に用
いることである。ＣＩＣＭ細胞は、同じ種又は交差種内で用いられる。

【００２８】本発明の他の目的は、ヒト及び有蹄類組織を含むＮＴ胚、胎児又は子由来の細
胞又は組織を細胞、組織又は器官移植が治療的又は診断的に有益である疾患又は
損傷の治療又は診断に用いることである。その疾患や損傷としては、パーキンソ
ン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄欠損又は損傷、多発性
硬化症、筋ジストロフィー、糖尿病、肝臓病、心臓病、軟骨置換、熱傷、血管性
疾患、尿路疾患、及び特に、免疫不全、骨髄移植、がんの治療が含まれる。組織
は、同じ種又は交差種内で用いられる。

【００２９】本発明の個々の他の目的は、本発明に従ってつくられたＣＩＣＭ細胞を分化し
た細胞、組織又は器官をつくるために用いることである。

【００３０】本発明の個々の目的は、本発明に従ってつくられたヒトＣＩＣＭ細胞を分化し
たヒト細胞、組織又は器官をつくるために用いることである。

【００３１】本発明の個々の他の目的は、試験管内で本発明に従ってつくられたＣＩＣＭ細
胞を細胞分化の研究及び分析目的のために用いることである。

【００３２】本発明の他の目的は、本発明に従ってつくられたＣＩＣＭ細胞から生じた同質
遺伝子又は同系細胞、組織又は器官を用いる工程を含む移植治療の改良された方
法を提供することである。その治療としては、例として、パーキンソン病、ハン
チントン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄欠損又は損傷、多発性硬化症、筋
ジストロフィー、糖尿病、肝臓病、心臓病、軟骨置換、熱傷、血管性疾患、尿路
疾患を含む疾患や損傷の治療、及び特に、免疫不全、骨髄移植、がんの治療が含
まれる。

【００３３】本発明の他の目的は、分化した哺乳動物細胞又は細胞核において所望のＤＮＡ
配列を挿入、除去又は修飾した後にその分化した細胞又は細胞核をＮＴ単位を形
成するために用いることによりつくられた遺伝子操作した又はトランスジェニッ
クＣＩＣＭ細胞を提供する。

【００３４】本発明の他の目的は、本発明に従ってつくられたトランスジェニック又は遺伝
子操作したＣＩＣＭ細胞を上記の確認された疾患や損傷を治療及び／又は予防す
るために用いることに関する。

【００３５】本発明の他の目的は、本発明に従ってつくられたＣＩＣＭ細胞又は本発明に従
ってつくられたトランスジェニック又は遺伝子操作したＣＩＣＭ細胞を核移植の
ための核供与体として用いることである。

【００３６】従って、態様においては、哺乳動物（例えば、胚、胎児、子）をクローン化す
る方法を提供する。該方法は、（ｉ）核伝達（ｕｎｃｌｅａｒｔｒａｎｓｆｅｒ：ＮＴ）単位の形成に適した
条件下、所望の分化した無血清飢餓哺乳動物細胞又は細胞核を該分化した細胞又
は細胞核と同じ種の除核された哺乳動物卵母細胞へ挿入する工程；（ｉｉ）得られた核伝達単位を活性化する工程；（ｉｉｉ）培養した前記ＮＴ単位をホスト哺乳動物へ導入して該ＮＴ単位を胎児
に発育させる工程を含む。

【００３７】好ましくは、活性化した核伝達単位を２−細胞発育段階より大きくなるまで培
養する。

【００３８】該胎児の細胞、組織及び／又は器官は細胞、組織及び／又は器官移植の領域に
有利に用いられる。

【００３９】本発明は、また、該分化した哺乳動物細胞又は細胞核において所望のＤＮＡ配
列を挿入、除去又は修飾した後に該哺乳動物細胞又は細胞核を該除核された卵母
細胞へ挿入する遺伝子操作した又はトランスジェニック哺乳動物をクローン化す
る方法が含まれる。

【００４０】本発明は、また、上記方法に従って得られた哺乳動物、及びその哺乳動物の子
が提供される。

【００４１】本発明は、また、好ましくは有蹄類をクローン化するために用いられる。

【００４２】他の態様においては、本発明はＣＩＣＭ細胞をつくる方法を提供する。該方法
は、（ｉ）核伝達（ＮＴ）単位の形成に適した条件下、所望の分化した無血清飢
餓哺乳動物細胞又は細胞核を該分化した細胞又は細胞核と同じ種の除核された哺
乳動物卵母細胞へ挿入する工程；（ｉｉ）得られた核伝達単位を活性化する工程；（ｉｉｉ）培養した前記ＮＴ単位から得られた細胞を培養してＣＩＣＭ細胞を得
る工程を含む。

【００４３】好ましくは、活性化した該核伝達単位を２−細胞発育段階より大きくなるまで
培養する。

【００４４】該ＣＩＣＭ細胞が細胞、組織及び器官移植の領域に有利に用いられる。

【００４５】以後明らかになる本発明の上記及び他の目的、利点及び特徴と共に、本発明の
本質は本発明の好適実施態様の下記の詳細な説明及び添付の請求の範囲によって
更に明らかに理解される。

【００４６】（発明の詳細な説明）本発明は、核伝達又は核移植により哺乳動物をクローン化する改良された操作
を提供する。本出願においては、核伝達又は核移植又はＮＴは同じ意味で用いら
れる。

【００４７】本発明によれば、分化した無血清飢餓哺乳動物細胞由来の細胞核が供与核と同
じ種の除核された哺乳動物卵母細胞へ移植される。該核はクローン化胚の発生を
特定するために再プログラムされ、胎児や子をつくるために受容雌へ導入される
か又はＣＩＣＭ細胞をつくるために用いられる。クローン化胚は、また、キメラ
胚、胎児及び／又は子をつくるために受精胚と混合される。

【００４８】従来技術の方法は、クローニング操作において胚細胞タイプを用いた。これは
、Ｃａｍｐｂｅｌｌら（Ｎａｔｕｒｅ，３８０：６４−６８，１９９６）及びＳ
ｔｉｃｅら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５４：１００−１１０，１９９６）に
よる研究が含まれる。いずれの研究においても、胚細胞系は妊娠１０日未満の胚
に由来した。いずれの研究においても細胞を支持細胞層上に維持してクローニン
グ操作に用いられる供与細胞の顕性分化を防止した。本発明は胎児か又は成体細
胞を用いて有効であることがわかった。

【００４９】胎児又は成体供与核を含むクローン化胚は発育の進んだ胚及び胎児段階へ発達
することができたことは予想できなかった。科学的独断は、初期胚細胞タイプだ
けがこのタイプの発達を特定することであった。多くのクローン化胚が胎児又は
成体細胞からつくられることは予想できなかった。また、新しいトランスジェニ
ック胚細胞系がトランスジェニッククローン化胚に由来しやすいという事実は予
想できなかった。

【００５０】ヒツジからの成体細胞及び胎児線維芽細胞はその称するところによればヒツジ
子をつくるために用いられた（Ｗｉｌｍｕｔら，１９９７）。しかしながら、そ
の研究では、静止状態の血清飢餓核供与細胞の使用はＷｉｌｍｕｔクローニング
法の成功に重要であることが強調された。血清飢餓状態又は静止状態の要求は本
発明に存在しない。対照的に、クローニングは分化した無血清飢餓哺乳動物細胞
を用いて達成される。更に、本発明のクローニング効率は、胎児か又は成体供与
細胞のいずれを用いても同様に無関係であるが、Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）に
は低クローニング効率が成体供与細胞で得られることが報告された。

【００５１】従って、本発明によれば、有蹄類を含む哺乳動物の優れた遺伝子型の増殖が可
能である。これは、遺伝的優位性又は他の所望の形質がわかった成体動物を増殖
させることを可能にする。進行は、例えば、多くの重要な有蹄類種において促進
される。本発明により、収集されクローニング操作に用いられる潜在的に莫大な
胎児又は成体細胞がある。これは、短期間に多くの同じ子を潜在的に生じる。

【００５２】Ｗｉｌｍｕｔらの方法がトランスジェニック動物の作成をもたらすことも推測
された（ＭａｃＱｕｉｔｔｙ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．，１５：２９４
（１９９７）を参照されたい）。しかしながら、例えば、外来ＤＮＡでトランス
フェクトした成体細胞からの核が核伝達方法を生存することができることを推測
する理由はない。この点で、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞の性質が試験管内操作に
よって修飾され、生存できるキメラ胚を形成する能力が与えられる。従って、本
発明の以前にはトランスジェニック動物のクローニングが予測されなかった。

【００５３】本発明は、クローンで増殖される細胞源と使用することによりトランスジェニ
ック操作の簡便化を可能にする。これにより、未分化状態の細胞を維持する必要
が除かれ、従って、ランダム組込み及び遺伝子ターゲッティング双方の遺伝子修
飾が達成されやすい。また、核伝達と試験管内でこれらの細胞を修飾し選択する
能力とを混合することにより、その操作は以前のトランスジェニック胚技術より
効率がよい。本発明によれば、これらの細胞はサイトカイン、順化培養液及び／
又は支持細胞層を含めずにクローン増殖され、トランスジェニック操作を更に簡
便化及び促進する。本発明のクローニング操作においてトランスフェクトした細
胞を用いる場合、胎児及び子へ発育することができるトランスジェニック胚がつ
くられる。また、これらのクローン化トランスジェニック胚は、ＣＩＣＭ細胞系
又は他の胚細胞系をつくるために用いられる。従って、本発明は、遺伝子操作技
術を援助する未分化細胞系を試験管内で誘導及び維持する要求を除く。

【００５４】本発明は、また、例えば、細胞、組織及び器官移植に用いられるＣＩＣＭ細胞
、胎児又は子をつくるために用いられる。動物から胎児又は成体細胞を採取し、
それをクローニング操作に用いることにより、種々の細胞、組織及びたぶん器官
が器官形成によって発育するにつれてクローン化胎児から得られる。細胞、組織
、及び器官も同様にクローン化子から単離される。この方法は、細胞及び遺伝子
治療を含む多くの医薬及び動物薬治療の“材料”源を与えることができる。細胞
が動物へ戻され、細胞が誘導される場合には、免疫学的拒絶が避けられる。また
、多くの細胞タイプがクローンから単離されることから、同じ種の動物の中で及
び種間で免疫学的拒絶を避けるために造血キメラ現象のような他の方法が用いら
れる。

【００５５】従って、態様においては、本発明は、哺乳動物をクローン化する方法を提供す
る。一般に、哺乳動物は下記工程：（ｉ）供与核源として用いられる所望の分化した無血清飢餓哺乳動物細胞を得る
工程；（ｉｉ）供与核源である細胞と同じ種の哺乳動物から卵母細胞を得る工程；（ｉｉｉ）前記卵母細胞を除核する工程；（ｉｖ）該所望の分化した細胞又は細胞核を除核された該卵母細胞へ、例えば、
融合又はインジェクションにより導入してＮＴ単位を形成する工程；（ｖ）得られたＮＴ単位を活性化する工程；及び（ｖｉ）培養した前記ＮＴ単位をホスト哺乳動物へ導入し、該ＮＴ単位が胎児へ
発育する工程を含む核伝達プロセスによってつくられる。

【００５６】好ましくは、活性化した該核伝達単位は、２−細胞発育段階より大きくなるま
で培養する。

【００５７】本発明は、また、遺伝子操作した又はトランスジェニック哺乳動物をクローン
化する方法であって、分化した哺乳動物細胞又は細胞核において所望のＤＮＡ配
列を挿入、除去又は修飾した後に分化した哺乳動物細胞又は細胞核を除核された
卵母細胞へ挿入する、前記方法が含まれる。

【００５８】また、本発明は、上記方法に従って得られた哺乳動物、及び哺乳動物の子を提
供する。本発明は、好ましくは有蹄類をクローン化するために用いられる。

【００５９】本発明は、更に、細胞、組織及び器官移植の領域におけるＮＴ胎児及びＮＴ及
びキメラ子の使用を提供する。

【００６０】他の態様においては、本発明は、ＣＩＣＭ細胞をつくる方法を提供する。該方
法は、（ｉ）核伝達（ＮＴ）単位の形成に適した条件下、所望の分化した非血清飢餓哺
乳動物細胞又は細胞核を該分化した細胞又は細胞核と同じ修飾の除核された哺乳
動物卵母細胞へ挿入する工程；（ｉｉ）得られた核伝達単位を活性化する工程；及び（ｉｉｉ）培養した前記ＮＴ単位から得られた細胞を培養してＣＩＣＭ細胞を得
る工程を含む。

【００６１】好ましくは、活性化した該核伝達単位を２−細胞発育段階より大きくなるまで
培養する。

【００６２】ＣＩＣＭ細胞は、細胞、組織及び器官移植の領域、又はトランスジェニック胎
児又は子を含む胎児又は子をつくることに有利に用いられる。

【００６３】本明細書に用いられる胎児は、子宮内での形を取った後の胎生動物のまだ胎内
にいる子である。従って、ウシでは受胎後３５日から出産までである。ブタでは
、胎児段階は受胎後３０日から出産までである。哺乳動物は、出産から死までが
成体である。

【００６４】好ましくは、ＮＴ単位は、少なくとも２〜４００細胞、好ましくは４〜１２８
細胞、最も好ましくは少なくとも約５０細胞のサイズまで培養する。

【００６５】核伝達技術又は核移植技術は、文献で既知であり、発明の背景に引用された多
くの文献に記載されている。特に、Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏ
ｌｏｇｙ，４３：１８１（１９９５）；Ｃｏｌｌａｓら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ
Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）；Ｋｅｅｆｅｒら，Ｂｉｏｌ．
Ｒｅｐｒｏｄ．，５０：９３５−９３９（１９９４）；Ｓｉｍｓら，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：６１４３−６１４７（１９９３
）；国際出願第９４／２６８８４号；同第９４／２４２７４号；及び同第９０／
０３４３２号を参照されたい。これらの文献及び明細書の記載は本願明細書に含
まれるものとする。また、米国特許第４，９４４，３８４号及び同第５，０５７
，４２０号には、ウシ核移植の手順が記載されている。

【００６６】分化は、周囲の構造又は起原の細胞と異なる特性又は機能をもつ細胞を意味す
る。分化した哺乳動物細胞は、初期胚段階を過ぎた細胞である。更に詳しくは、
分化した細胞は少なくとも胚板段階（ウシ胚形成の１０日目）を過ぎた細胞であ
る。分化した細胞は外胚葉、中胚葉又は内胚葉由来である。ヒト細胞を含む哺乳動物細胞は、周知の方法によって得られる。本発明に有効
な哺乳動物細胞としては、例として、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、角化細胞
、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（Ｂ及びＴリンパ球）、赤血球
、マクロファージ、単球、単核細胞、線維芽細胞、心筋細胞、及び他の筋細胞等
が挙げられる。更に、核伝達に用いられる哺乳動物細胞は、異なる器官、例えば
、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、尿道及び他の
尿路器官等から得られる。これらは、まさに適切な供与細胞例である。適切な供
与細胞、即ち、本発明に有効な細胞は、身体の細胞又は器官から得られる。全て
の体細胞又は生殖細胞が含まれる。

【００６７】線維芽細胞は、発育している胎児及び成体動物から多量に得られるために理想
的な細胞タイプである。線維芽細胞はいくぶん分化しているので以前にはクロー
ニング操作の使用には不十分な細胞タイプとみなされた。重要なことに、これら
の細胞は急速倍加時間で試験管内で容易に増殖され、遺伝子ターゲッティング操
作での使用にクローン増殖される。また、本発明は、分化した細胞タイプが用い
られることから新規である。本発明は、細胞が容易に増殖され、遺伝的に修飾さ
れ、試験管内で選択される。

【００６８】他の報告したクローニング法（例えば、Ｗｉｌｍｕｔら，１９９７）は、血清
飢餓細胞の使用によった。しかしながら、本発明においては、供与細胞は血清飢
餓の状態にない。Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）によれば、血清飢餓細胞は静止状
態である。即ち、発育相が存在する。他の方法（化学、温度等）も静止細胞をつ
くることができる。本発明に用いられる供与細胞は静止状態ではない。

【００６９】卵母細胞に適した哺乳動物源としては、ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、ウ
サギ、モルモット、マウス、ハムスター、ラット、霊長類等が含まれる。卵母細
胞は、好ましくは有蹄類、最も好ましくはウシから得られる。

【００７０】卵母細胞の単離方法は、当該技術において周知である。実質的には、卵母細胞
を哺乳動物、例えば、ウシの卵巣又は生殖路から単離する工程を含む。容易に用
いうるウシ卵母細胞源は、と殺場の材料である。

【００７１】遺伝子工学、核伝達及びクローニングのような技術の満足すべき使用について
は、細胞が核伝達の受容細胞として用いられる前に、及び精細胞によって受精さ
れて胚へ発生する前に、卵母細胞は一般的には試験管内で成熟しなければならな
い。この方法には、一般的には、未熟な（前期Ｉ）卵母細胞を哺乳動物卵巣、例
えば、と殺場で得られたウシ卵巣から集める工程、及び受精又は除核前に該卵母
細胞を成熟培養液中で該卵母細胞がウシ卵母細胞の場合には吸引後一般的には約
１８〜２４時間ある中期ＩＩ段階に達するまで成熟させる工程が必要である。本
発明のためには、この時間は“成熟期間”として知られる。時間の算出について
本明細書に用いられる“吸引”は、卵巣ろ胞からの未熟卵母細胞の吸引を意味す
る。

【００７２】更に、生体内で成熟した中期ＩＩ段階卵母細胞は、核伝達技術において巧く用
いられた。実質的に、成熟中期ＩＩ卵母細胞は、発情期が起こった又はヒト絨毛
性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）又は類似ホルモンを注入した３５〜４８時間後に
非過剰排卵又は過剰排卵ウシ又は幼雌ウシから外科的に集められる。

【００７３】除核及び核伝達時の卵母細胞の成熟段階は、ＮＴ法の成功に重要であることが
報告された。（例えば、Ｐｒａｔｈｅｒら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，
４８，１−８，１９９１を参照されたい。）一般的には、満足すべき哺乳動物胚
クローニングの実施は受容卵母細胞として中期ＩＩ段階卵母細胞を用いる。この
段階で卵母細胞が“活性化”されるか又は十分に“活性化”されていて受精精子
を処理するように導入した核を処理すると考えられるからである。家畜動物、特
にウシにおいては、卵母細胞活性化期間は、吸引後一般的には約１６〜５２時間
、好ましくは約２８〜４２時間の範囲である。

【００７４】例えば、未熟卵母細胞はＳｅｓｈａｇｉｎｅら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，
４０，５４４−６０６，１９８９に記載されたＨＥＰＥＳ緩衝化ハムスター胚培
養液（ＨＥＣＭ）中で洗浄され、次に軽流動パラフィン又はシリコーン層の下の
黄体形成ホルモン（ＬＨ）やろ胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のような適切な性腺刺
激ホルモン、及びエストラジオールを含む１０％ウシ胎児血清を含む５０マイク
ロリットルの組織培養液（ＴＣＭ）１９９からなる成熟培地の数滴へ３９℃で入
れられる。

【００７５】約１０〜４０時間、好ましくは約１６〜１８時間の範囲である所定の成熟期間
後、卵母細胞が除核される。除核前に卵母細胞が除去され、１ｍｇ／ｍｌのヒア
ルロニダーゼを含むＨＥＣＭに入れた後に丘細胞が除去されることが好ましい。
これは、非常に細い口径ピペットによって繰り返しピペットでとるか又は簡単に
回転させることにより行なわれる。次に、除去した卵母細胞について極性ボディ
をスクリーニングし、極性ボディの存在によって求められる選択中期ＩＩ卵母細
胞を核伝達に用いる。除核は次の通りである。

【００７６】除核は米国特許第４，９９４，３８４号に記載されるような既知の方法によっ
て行なわれ、その明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする。例えば、中
期ＩＩ卵母細胞を、直接除核については７．５マイクログラム／ミリリットルの
サイトカラシンＢを任意により含むＨＥＣＭに入れるか又は適切な培地、例えば
、ＣＲ１ａａ、＋１０％発情期ウシ血清のような胚培養液に入れてから後で、好
ましくは２４時間以内に、更に好ましくは１６〜１８時間後に除核される。

【００７７】除核は、極性ボディ及び隣接細胞質を除去するためにマイクロピペットを用い
て顕微手術で行なわれる。次に、巧く除核されたものを同定するために卵母細胞
がスクリーニングされる。このスクリーニングは、卵母細胞をＨＥＣＭ中１マイ
クログラム／ミリリットルの３３３４２ヘキスト色素で染色し、次に卵母細胞を
紫外線照射下で１０秒未満の時間見ることにより行われる。次に、巧く除核され
た卵母細胞は、適切な培養液、例えば、ＣＲ１ａａ＋１０％血清に入れられる。

【００７８】本発明においては、受容卵母細胞は、好ましくは試験管内成熟開始の約１０〜
約４０時間後、更に好ましくは試験管内成熟の約１６〜約２４時間後、最も好ま
しくは試験管内成熟の開始の約１６〜１８時間後の範囲の時間に除核される。

【００７９】次に、除核された卵母細胞と同じ種の哺乳動物単細胞を、ＮＴ単位をつくるた
めに用いられる除核された卵母細胞の卵黄周囲の空間へ導入する。哺乳動物細胞
と除核された卵母細胞を、当該技術において既知の方法に従ってＮＴ単位をつく
るために用いる。例えば、細胞は電気融合により融合される。電気融合は、原形
質膜の一時的な破壊を引き起こすのに十分である電気パルスを与えることにより
達成される。この原形質膜の破壊は、膜が速やかに再生されることから非常に短
い。従って、２つの隣接膜を誘導して破壊し、再生時に脂質二重層が混ざる場合
には、２細胞間に小チャンネルが開く。その小開口の熱力学不安定性のために、
２細胞が１つになるまで増大する。そのプロセスの考察についてはＰｒａｔｈｅ
ｒらの米国特許第４，９９７，３８４号に言及されている（その明細書の記載は
本願明細書に含まれるものとする）。スクロース、マンニトール、ソルビトール
及びリン酸塩緩衝液等の種々の電気融合媒体が用いられる。融合誘導因子のよう
なセンダイウイルスを用いて融合が行なわれる（Ｇｒａｈａｍ，Ｗｉｓｔｅｒ
Ｉｎｏｔ．Ｓｙｍｐ．Ｍｏｎｏｇｒ．，９，１９，１９６９）。

【００８０】また、ある場合には（例えば、供与核が小さい）、エレクトロポレーション融
合を用いるよりは卵母細胞へ直接核を注入することが好ましい。その技術は、Ｃｏｌｌａｓ＆Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８：２６４
−２６７（１９９４）に開示されており、その文献の記載は本願明細書に含まれ
るものとする。

【００８１】好ましくは、哺乳動物細胞と卵母細胞を、融合培地（０．２５ＭＤ−ソルビ
トール、１００μＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢酸マグネシウム、１．０ｇ／
ｌＢＳＡ（脂肪酸を含まない）、ｐＨ７．２）を含む５００μｍチャンバ内で
卵母細胞成熟開始の約２４時間後に９０〜１２０Ｖの電気パルスを約１５μｓｅ
ｃ間加えることにより電気融合する。融合後、得られた融合ＮＴ単位を活性化さ
れるまで適切な培地、例えば、ＣＲ１ａａ培地に入れる。典型的には、活性化は
すぐ後で、典型的には２４時間以内に、好ましくは約２〜９時間後に行われる。

【００８２】ＮＴ単位は、既知の方法で活性化される。その方法は、例えば、ＮＴ単位を生
理的温度未満で培養する工程、実質的には冷たい又は実際に冷却した温度ショッ
クをＮＴ単位に加える工程が含まれる。これは、胚が通常曝露される生理的温度
条件に相対して低いＮＴ単位を室温で培養することにより最も便利に行なわれる
。

【００８３】また、既知の活性化剤を加えることにより活性化が得られる。例えば、受精中
卵母細胞の精子による侵入は、前融合卵母細胞を活性化して核伝達後に多数の生
存力のある妊娠及び複数の遺伝的に同じ子ウシを生じることがわかった。また、
電気的及び化学的ショックのような処理は、融合後にＮＴ胚を活性化するために
用いられる。適切な卵母細胞活性化法は、Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈらの米国
特許第５，４９６，７２０号の主題である。その明細書の記載は本願明細書に含
まれるものとする。

【００８４】更に、活性化は、同時に又は順次に（ｉ）卵母細胞中の２価カチオンのレベルを上げる工程、及び（ｉｉ）卵母細胞中の細胞タンパク質のリン酸化を減少させる工程により行なわれる。。これは、一般的には２価カチオン、例えば、マグネシウム、ストロンチウム、バ
リウム又はカルシウムをイオノフォアの形で卵母細胞の細胞質へ導入することに
より行われる。２価のカチオンレベルを上げる他の方法としては、電気ショック
の使用、エタノールによる処理及びケージキレート剤による処理が含まれる。

【００８５】リン酸化は、既知の方法、例えば、キナーゼ阻害剤、例えば、６−ジメチルア
ミノプリン、スタウロスポリン、２−アミノプリン、及びスフィンゴシンのよう
なセリン−トレオニンキナーゼ阻害剤の添加によって減少させられる。

【００８６】また、細胞タンパク質のリン酸化は、ホスファターゼ、例えば、ホスファター
ゼ２Ａ及びホスファターゼ２Ｂを卵母細胞へ導入することにより阻害される。

【００８７】実施態様においては、ＮＴ活性化は、融合ＮＴ単位を５μＭイオノマイシン及
び１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含むＴＬ−ＨＥＰＥＳ培地へ曝露し、続いて融合の約
２４時間以内、好ましくは融合の約２〜９時間以内に３０ｍｇ／ｍｌＢＳＡを
含むＴＬ−ＨＥＰＥＳ中で洗浄することにより行なわれる。

【００８８】次に、活性化ＮＴ単位は、ＣＩＣＭ細胞及び細胞コロニーの発生まで適切な試
験管内培養液に培養される。胚の培養及び成熟に適した培養液は当該技術におい
て周知である。ウシ胚培養及び維持に用いられる既知の培養液の例としては、Ｈ
ａｍのＦ−１０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、組織培養液−１９９（ＴＣＭ
−１９９）＋１０％ウシ胎児血清、タイロード−アルブミン−乳酸塩−ピルビン
酸塩（ＴＡＬＰ）、ダルベッコのリン酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）、イーグルの
培養液とウィッテンの培養液が含まれる。卵母細胞の収集と成熟に用いられる最
も慣用の培養液の１つは、ＴＣＭ−１９９、及び胎児ウシ血清、新生血清、発情
ウシ血清、子ヒツジ血清又は雄ウシ血清を含む１〜２０％血清補足物である。好
ましい維持培地としては、ＴＣＭ−１９９とＥａｒｌ塩、１０％ウシ胎児血清、
０．２ｍＭピルビン酸Ｎａ及び５０μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシンが含まれる。
上記のいずれもが顆粒膜細胞、輸卵管細胞、ＢＲＬ細胞及び子宮細胞のような種
々の細胞タイプとＳＴＯ細胞との共存培養を含むことができる。

【００８９】他の維持培地は、Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｓ，Ｊｒ．らの米国特許第５，０９６，
８２２号に記載されており、この明細書の記載は本願明細書に含まれるものとす
る。このＣＲ１と呼ばれる胚培地は、胚を支持するのに必要な栄養物質を含む。

【００９０】ＣＲ１は、Ｌ−乳酸半カルシウムを１．０〜１０ｍＭ、好ましくは１．０〜５
．０ｍＭの範囲の量で含む。Ｌ−乳酸半カルシウムは、Ｌ−乳酸塩とそれに取込
まれた半カルシウム塩である。Ｌ−乳酸半カルシウムは、単一成分が培養液内で
２種の主要な要求を満足させるという点で重要である：（ｉ）カルシウムはコン
パクションと細胞骨格配列に必要な要求である；及び（ｉｉ）乳酸塩は代謝と電
子伝達に必要な要求である。Ｌ−乳酸半カルシウムは、胚の生存に必要な培地と
して有効な無機エネルギー源として役立つ。

【００９１】有利には、ＣＲ１培地はウシ胎児血清のような血清を含まず、動物細胞又は他
の生物学的培地、即ち、輸卵管細胞のような動物細胞を含む培地の共存培養の使
用を必要としない。生物学的培地は、微生物又は胚に有害でありかつ検出、確認
及び除去しにくい微量因子を含むという点でしばしば不利である。

【００９２】ＣＲ１培地中の主成分の例としては、Ｌ−乳酸半カルシウム、塩化ナトリウム
、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、重炭酸ナトリウム及び少量の無脂肪酸ウシ
血清アルブミン（ＳｉｇｍａＡ−６００３）が挙げられる。更に、規定量の必
須及び非必須アミノ酸が培地に添加される。ＣＲ１とアミノ酸は略号“ＣＲ１ａ
ａ”で知られる。

【００９３】ＣＲ１培地は、好ましくは下記の成分を下記の量で含む。塩化ナトリウム１１４．７ｍＭ塩化カリウム３．１ｍＭ重炭酸ナトリウム２６．２ｍＭＬ−乳酸半カルシウム５ｍＭ無脂肪酸ＢＳＡ３ｍｇ／ｍｌ

【００９４】実施態様においては、活性化ＮＴ胚単位を１．９ｍＭＤＭＡＰを含むＣＲ１
ａａ培地に約４時間入れ、続いてＨＥＣＭで洗浄してからＢＳＡを含むＣＲ１ａ
ａ中で培養する。

【００９５】例えば、活性化ＮＴ単位は２．０ｍＭＤＭＡＰ（Ｓｉｇｍａ）を含むＣＲ１
ａａ培養液に導入され、周囲条件、例えば、約３８．５℃、５％ＣＯ_２下で適切
な時間、例えば、約４〜５時間培養される。

【００９６】その後、培養したＮＴ単位又は単位群を好ましくは洗浄してから適切な培地、
例えば、好ましくは適切な集密的支持細胞層を含むウェル平板に含まれた１０％
ＦＣＳ及び６ｍｇ／ｍｌを含むＣＲ１ａａ培地に入れる。適切な支持細胞層とし
ては、例として線維芽細胞及び上皮細胞、例えば、有蹄類、ニワトリ線維芽細胞
、マウス（例えば、マウス又はラット）線維芽細胞、ＳＴＯ及びＳＩ−ｍ２２０
支持細胞系由来の線維芽細胞及び子宮上皮細胞、及びＢＲＬ細胞が挙げられる。

【００９７】実施態様においては、支持細胞はマウス胚線維芽細胞を含んでいる。適切な線
維芽細胞支持細胞層の調製は、下記実施例に記載され、当業者に周知である。

【００９８】ＮＴ単位が受容雌に導入するのに適した又はＣＩＣＭ細胞又は細胞コロニーを
つくるために用いられる細胞を得るのに適したサイズに達するまでＮＴ単位を支
持細胞層（５×１０^５細胞／ｍｌ）上で培養する。ＮＴ単位は、好ましくは少な
くとも約２〜４００細胞、更に好ましくは約４〜１２８細胞、最も好ましくは少
なくとも約５０細胞まで培養する。培養は適切な条件、即ち、約３８．５℃及び
５％ＣＯ_２下で行なわれ、典型的には約２〜５日毎に、好ましくは約３日毎に発
育を最適化するために培養液を変える。

【００９９】本発明の胚伝達及び受容動物処理方法は、胚伝達生産に用いられる標準操作で
ある。同調的伝達は、本発明の成功に重要である。即ち、ＮＴ胚の段階は受容雌
の発情期サイクルと同調している。この利点及びどのように受容体を維持するか
は、Ｓｉｅｄｅｌ，Ｇ．Ｅ．，Ｊｒ．（“Ｃｒｉｔｉｃａｌｒｅｖｉｅｗｏ
ｆｅｍｂｒｙｏｔｒａｎｓｆｅｒｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｗｉｔｈｃａ
ｔｔｌｅ”，ＦｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄＥｍｂｒｙｏｎｉｃＤｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎＶｉｔｒｏ（１９８１）Ｌ．Ｍａｓｔｒｏｉａｎｎ
ｉ，Ｊｒ．＆Ｊ．Ｄ．Ｂｉｇｇｅｒｓ，ｅｄ．，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，
ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ，ｐ．３２３）に総説されており、この文献の記載は本
願明細書に含まれるものとする。

【０１００】本発明により、生体細胞から寄与された核を用いたクローニング効率は、胎児
細胞からの核を用いた場合と同じである。例えば、桑実胚及び芽細胞段階の発育
の効率は胎児又は成体ウシ細胞からの核を用いても同じである。

【０１０１】本発明は、また、遺伝子操作した又はトランスジェニック哺乳動物をクローン
化するために用いられる。上で説明したように、本発明はトランスジェニック操
作がクローンで増殖される分化した細胞源と使用することにより簡便化される。
特に、供与核に用いられる分化した細胞は挿入、除去又は修飾された所望のＤＮ
Ａ配列を有する。次に、遺伝的に修飾した分化した細胞を除核された卵母細胞に
よる核移植に用いる。

【０１０２】哺乳動物細胞からの所望のＤＮＡ配列を挿入、欠失又は修飾する既知の方法は
、核供与体として用いられる分化した細胞を修飾するために用いられる。これら
の操作はＤＮＡ配列の全て又は一部を除去することができ、ＤＮＡ配列は異種で
あってもよい。細胞ゲノム内の特定の部位又は部位群でのＤＮＡ配列又は配列群
の挿入、欠失又は修飾を可能にする相同的組換え技術が含まれる。

【０１０３】従って、本発明は、所望の遺伝子型を有する成体哺乳動物を与えるために用い
られる。トランスジェニック又は遺伝子操作した動物、及びキメラ動物を含む遺
伝的優位性又は他の所望の形質がわかった成体有蹄類を増殖させる方法は特に有
効である。更に、トランスジェニック及び／又はキメラ胎児を含むＮＴ胎児から
の細胞及び組織は、ＣＩＣＭ細胞の使用に関して下記の多くの疾患の治療のため
の細胞、組織及び器官移植に用いられる。

【０１０４】ＣＩＣＭ細胞及び細胞系の生産について、所望のサイズのＮＴ単位が得られた
後に細胞をゾーンから機械的に取出してから用いる。好ましくは、典型的には少
なくとも約５０細胞を含むＮＴ単位を含む細胞凝集塊を用い、その細胞を洗浄し
、細胞を支持細胞層、例えば、照射した線維芽細胞へ平板培養することにより行
なわれる。典型的には、幹細胞又は細胞コロニーを得るために用いられる細胞は
、サイズが好ましくは少なくとも５０細胞である培養したＮＴの内部のほとんど
の部分から得られる。しかしながら、小さい又は大きい細胞数のＮＴ単位及びＮ
Ｔ単位の他の部分からの細胞も、ＥＳ細胞及び細胞コロニーを得るために用いら
れる。細胞は、適切な増殖培地、例えば、１０％ＦＣＳ及び０．１ｍＭβ−メル
カプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）及びＬ−グルタミンで補足したαＭＥＭ中の支
持細胞層に維持される。増殖培地は増殖を最適化するために必要とされる毎に、
例えば、約２〜３日毎に変えられる。

【０１０５】この培養法により、ＣＩＣＭ細胞又は細胞系が形成される。当業者は、具体的
なＣＩＣＭ細胞の増殖を最適化するために所望される培養条件を変動させること
ができる。また、遺伝子操作した又はトランスジェニック哺乳動物ＣＩＣＭ細胞
は本発明に従ってつくられる。即ち、上記の方法は、所望のＤＮＡ配列又は配列
群が導入されているか又は内在ＤＮＡ配列又は配列群の全部又は一部が除去又は
修飾されたＮＴ単位をつくるために用いられる。次に、遺伝子操作した又はトラ
ンスジェニックＮＴ単位がヒト細胞を含む遺伝子操作した又はトランスジェニッ
クＣＩＣＭ細胞をつくるために用いられる。

【０１０６】得られたＣＩＣＭ細胞及び細胞系、好ましくはヒトＣＩＣＭ細胞及び細胞系は
、多くの治療及び診断適用がある。特に、そのＣＩＣＭ細胞は細胞移植治療に用
いられる。ヒトＣＩＣＭ細胞は、多くの疾患症状の治療に適用がある。ヒトＮＴ
単位自体は、疾患症状の治療にも用いられる。

【０１０７】この点で、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞はほとんどの細胞タイプ、例えば、造血
幹細胞へ分化することができることが既知である。従って、本発明に従ってつく
られたヒトＣＩＣＭ細胞は同様の分化能をもたなければならない。本発明のＣＩ
ＣＭ細胞を誘導して既知の方法の所望の細胞タイプを得るために分化する。例え
ば、本ヒトＣＩＣＭ細胞は、その細胞を分化培地中細胞分化を与える条件下で培
養することにより造血幹細胞、神経細胞、筋細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞
、上皮細胞、尿路細胞等へ分化するために誘導される。適切な培養条件であるＣ
ＩＣＭ細胞の分化を生じる培地及び方法は、当該技術において既知である。

【０１０８】例えば、Ｐａｌａｃｉｏｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ
ＳＡ，９２：７５３０−７５３７（１９９５）には、最初にレチン酸を含む懸濁
培養液中で細胞の凝集塊を培養することを含む誘導操作に幹細胞を供し、次にレ
チン酸を含む同じ培養液中で培養し、続いて細胞接着を与える基質へ細胞凝集塊
を導入することが教示される。

【０１０９】更に、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．，６：
５４３−５５２（１９９４）は、特に、造血細胞、筋細胞、心筋細胞、神経細胞
を含む種々の分化した細胞タイプをつくる胚幹細胞の試験管内分化方法を開示し
ている多くの論文を言及している総説論文である。

【０１１０】更に、Ｂａｉｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６８：３４２−３５７（１９９５
）には、ニューロン特性をもつ神経細胞をつくる胚性幹細胞の試験管内分化が教
示されている。これらの文献は、胚細胞又は幹細胞から分化した細胞を得るため
に報告された方法の例である。これらの文献及び特に胚性幹細胞を分化する方法
に関する開示の記載は本願明細書に含まれるものとする。

【０１１１】従って、既知の方法及び培養液を用いて当業者は遺伝子操作した又はトランス
ジェニックＣＩＣＭ細胞を含む本ＣＩＣＭ細胞を培養して分化した所望の細胞タ
イプ、例えば、神経細胞、筋細胞、造血細胞等を得ることができる。

【０１１２】本ＣＩＣＭ細胞は、所望の分化細胞タイプを得るために用いられる。その分化
したヒト細胞の治療使用は並ぶものがない。例えば、ヒト造血幹細胞は、骨髄移
植を必要とする医薬治療に用いられる。その操作は、多くの疾患、例えば、卵巣
がんや白血病のような後期がん、及びエイズのような免疫系と妥協する疾患を治
療するために用いられる。造血幹細胞は、がん又はエイズ患者の成体体細胞、例
えば、上皮細胞又はリンパ球を除核された卵母細胞で融合し、その細胞を分化を
援助する条件下で造血幹細胞が得られるまで培養することにより得られる。その
造血細胞は、がんやエイズを含む疾患の治療に用いられる。

【０１１３】また、神経疾患をもつ患者からの成体体細胞は、除核された卵母細胞、それか
ら得られたヒトＣＩＣＭ細胞と融合され、その細胞が分化条件下で培養されて神
経細胞系をつくる。そのヒト神経細胞の移植によって治療できる特定の疾患とし
ては、例として特に、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ及び脳性麻痺
が含まれる。パーキンソン病の個々の例では、移植した胎児脳神経細胞が周囲の
細胞と適切な結合をし、ドーパミンを生じる。これにより、パーキンソン病症状
の長期逆転が得られる。

【０１１４】本発明の大きな利点は、移植に適切な同質遺伝子又は同系ヒト細胞の実質的に
無限の供給を与えることである。従って、現在の移植法と関連のある重要な問題
、即ち、宿主対移植片拒絶又は移植片対宿主拒絶のために生じる移植組織の拒絶
を未然に防ぐ。便利には、シクロスポリンのような抗拒絶剤を投与することによ
り拒絶を予防又は減少する。しかしながら、その薬剤は有害な副作用、例えば、
免疫抑制、発がん性があり、非常に高価である。本発明は、抗拒絶剤を必要とす
ることを排除しなければならないか又は少なくとも非常に減少させなければなら
ない。

【０１１５】同質遺伝子細胞治療によって治療できる他の疾患及び症状としては、例として
、脊髄損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー、糖尿病、肝臓病、即ち、高コレ
ステロール血症、心臓病、軟骨置換、熱傷、足潰瘍、胃腸病、血管性疾患、腎臓
病、尿路疾患、老化関連疾患及び症状が挙げられる。

【０１１６】この方法は、欠陥遺伝子、例えば、欠陥免疫系遺伝子、嚢胞性線維症を置き換
えるために、又は治療的に有益なタンパク質、例えば、成長因子、リンホカイン
、サイトカイン、酵素等の発現をもたらす遺伝子を導入するために用いられる。
例えば、脳由来成長因子をコードしているＤＮＡ配列はヒトＣＩＣＭ細胞へ導入
され、それらの細胞は神経細胞へ分化され、それらの細胞はその疾患中神経細胞
の消失を遅らせるパーキンソン病患者へ移植される。

【０１１７】以前には、ＢＤＮＦでトランスフェクトした細胞タイプは、初代細胞から不死
化細胞系、神経又は非神経（筋芽細胞及び線維芽細胞）まで変動させる。例えば
、星状膠細胞はレトロウイルスベクターを用いてＢＤＮＦ遺伝子でトランスフェ
クトされており、それらの細胞はパーキンソン病のラットモデルへ移植されてい
る（Ｙｏｘｈｉｍｏｔｏら，６９１：２５−３６（１９９５））。

【０１１８】この生体外治療により、導入の３２日後に４５％までラットのパーキンソン病
様症状が減少した。また、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子を星状膠細胞へ入れ
て同様の結果を得た（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，
１３９：３９−５３（１９９６）及びその中に引用された文献）。

【０１１９】しかしながら、その生体外系は問題がある。特に、現在用いられているレトロ
ウイルスベクターは生体内でダウンレギュレートし、トランスジェニックは一時
的に発現するだけである（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６
−９３２（１９９３）による総説）。また、その実験には有限の寿命をもち徐々
に複製する初代細胞、星状膠細胞が用いられた。その特性はトランスフェクショ
ン率に悪影響し、安定にトランスフェクトした細胞の選択を妨害する。更に、相
同的組換え技術において用いられる遺伝子標的初代細胞の大きな集団を増殖させ
ることはほとんど不可能である。対照的に、レトロウイルス系と関連のある困難
は、分化した細胞及びＣＩＣＭ細胞を用いた哺乳動物クローニングの使用によっ
て排除されるにちがいない。

【０１２０】本ＣＩＣＭ又は分化した細胞へ導入されるＤＮＡ配列としては、例として、上
皮成長因子、基本線維芽細胞成長因子、グリア由来神経栄養成長因子、インスリ
ン様成長因子（Ｉ及びＩＩ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−
４／５、繊毛神経栄養因子、ＡＦＴ−１、シトキニン（インターロイキン、イン
ターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子（α及びβ）等）、治療酵素等
をコードしているものが含まれる。

【０１２１】細胞、組織及び器官移植におけるヒトＮＴ単位及びＣＩＣＭ細胞の使用のほか
に、本発明は、ヒト疾患の治療における非ヒト細胞の使用が含まれる。従って、
あらゆる種のＣＩＣＭ細胞、ＮＴ胎児及びＮＴ及びキメラ子（トランスジェニッ
ク又は非トランスジェニック）が細胞、組織又は器官移植が正しいとするヒト疾
患症状の治療に用いられる。一般的には、本発明のＣＩＣＭ細胞、胎児及び子は
同じ種（自家移植、同質遺伝子移植又は同種移植）又は交差種（異種移植）内で
用いられる。例えば、ウシＮＴ胎児からの脳細胞はパーキンソン病を治療するた
めに用いられる。

【０１２２】また、本ＣＩＣＭ細胞、好ましくはヒト細胞は、分化の試験管内モデルとして
、特に初期発生の調節調節に関係する遺伝子の研究に用いられる。また、本ＣＩ
ＣＭ細胞を用いた分化した細胞組織及び器官は薬剤研究に用いられる。

【０１２３】更に、本ＣＩＣＭ細胞は、他のＣＩＣＭ細胞及び細胞コロニーの生産に核供与
体として用いられる。

【０１２４】本発明を更に明らかに記載するために、下記の実施例を示す。

【０１２５】（実施例）実施例１ウシ及びブタ胚及び成体ウシ線維芽細胞の初代培養の単離

【０１２６】ウシ及びブタ線維芽細胞の初代培養を胎児から得た（ウシの妊娠４５日及びブ
タ胎児３５日）。頭、肝臓、心臓及び消化管を無菌的に除去し、胎児を細かくし
、前加温したトリプシンＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤ
ＴＡ；ＧＩＢＣＯ，グランドアイランド，ニューヨーク州）中３７℃で３０分間
インキュベートした。線維芽細胞を組織培養皿に平板培養し、α−ＭＥＭ、１０
％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇｅｎ，ユタ州）、ペニシリ
ン（１００ＩＵ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｌ／ｍｌ）で補足した
培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，ウォーカーズビル，メリーランド州）中で培
養した。線維芽細胞を増殖させ、空気中５％ＣＯ_２で加湿した雰囲気中３７℃で
維持した。集密的に達した際に定期的に細胞を継代した。

【０１２７】成体線維芽細胞をウシ（年齢約５歳）の肺と皮膚から単離した。細かくした肺
組織をトリプシンＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ；
ＧＩＢＣＯ，グランドアイランド，ニューヨーク州）中１０℃で一晩インキュベ
ートした。翌日の組織及び分離した細胞を前加温トリプシンＥＤＴＡ溶液（０．
０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ；ＧＩＢＣＯ，グランドアイランド，ニ
ューヨーク州）中３７℃で１時間インキュベートし、３連続洗浄とトリプシンイ
ンキュベーション（１時間）によって処理した。線維芽細胞を組織培養皿で平板
培養し、胚板段階を過ぎたころから動物の成体寿命まで（ウシ受精後１２〜１５
日目から１０〜１５歳の年齢まで）の範囲の発育中の時点で補足したα−ＭＥＭ
培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，ウォーカーズビル，メリーランド州）中で培
養した。この操作は、マウスを含む他の哺乳動物からの線維芽細胞を単離するた
めに用いられる。

【０１２８】マーカー遺伝子（外来異種ＤＮＡ）の胚細胞及び成体線維芽細胞への導入。

【０１２９】下記のエレクトロポレーション操作を胚（ウシとブタ）及び成体（ウシ）線維
芽細胞双方に行った。異種ＤＮＡを線維芽細胞へ導入するために標準マイクロイ
ンジェクション操作も用いられるが、本実施例においては、簡単な操作であるこ
とからエレクトロポレーションを用いた。

【０１３０】増殖している線維芽細胞を含む培養平板をトリプシンＥＤＴＡ溶液（０．０５
％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ；ＧＩＢＣＯ，グランドアイランド，ニュー
ヨーク州）中でインキュベートした。細胞を５００×ｇで回転させ、リン酸塩緩
衝食塩水（ＰＢＳ）と５００万細胞／ｍｌで再懸濁した。

【０１３１】リポーター遺伝子構築物はサイトメガロウイルスプロモーター及びβ−ガラク
トシダーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合遺伝子（β−ＧＥＯ）
を含有した。リポーター遺伝子及び５０μｇ／ｍｌの最終濃度の細胞をエレクト
ロポレーションチャンバへ添加した。エレクトロポレーションパルス後、線維芽
細胞を増殖培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇｅｎ
，ユタ州）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μ
ｌ／ｍｌ）で補足したα−ＭＥＭ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，ウォーカー
ズビル，メリーランド州）へ戻した。

【０１３２】線維芽細胞を接着したエレクトロポレーション後の日にちについてリポーター
遺伝子の安定な組込みを選択した。Ｇ４１８（４００μｇ／ｍｌ）を増殖培地に
１５日間添加した（範囲：３日目から培養した細胞寿命の終わりまで）。ｎｅｏ
耐性遺伝子を発現しないので、この薬剤はβ−ＧＥＯ遺伝子を含まない細胞を破
壊する。この時間の終わりに、安定なトランスジェニック細胞のコロニーが存在
した。各コロニーは相互に独立して増殖した。トランスジェニック線維芽細胞を
Ｘ−ｇａｌで染色してβ−ガラクトシダーゼの発現を見出し、β−ＧＥＯ遺伝子
のＰＣＲ増幅を用いアガロースゲル上に流出した組込みが陽性であることを確認
した。

【０１３３】ＣＩＣＭ細胞系及びトランスジェニック胎児をつくる核伝達操作におけるトラン
スジェニック線維芽細胞の使用

【０１３４】ウシ胚線維芽細胞のコロニー由来の細胞系（ＣＬ−１）を核伝達（ＮＴ）操作
の供与核として用いた。一般ＮＴ操作は上に記載されている。

【０１３５】と殺場卵母細胞を試験管内で成熟した。卵母細胞を卵丘細胞から除去し、成熟
後約１８〜２０時間（ｈｐｍ）で斜端マイクロピペットで除核した。除核をＴＬ
−ＨＥＰＥＳ培地＋ヘキスト３３３４２（３μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）中で確認
した。次に、個々の供与細胞（線維芽細胞）を受容卵母細胞の卵黄周囲の空間に
入れた。ウシ卵母細胞の細胞質と供与核（ＮＴ単位）を電気融合技術を用いて共
に融合した。融合培地を充填した５００μｍギャップチャンバ内で１２０Ｖ１
５μｓｅｃからなる融合パルスをＮＴ単位に加えた。これは、２４ｈｐｍで起こ
った。ＮＴ単位を２６〜２７ｈｐｍまでＣＲ１ａａ培地に入れた。

【０１３６】卵母細胞を人工的に活性化するために用いられる一般手順は上に記載されてい
る。ＮＴ単位活性化を２６〜２７ｈｐｍで開始した。概要としては、ＮＴ単位を
１ｍｇ／ｍｌＢＳＡで補足したＴＬ−ＨＥＰＥＳ中イオノマイシン（５μＭ；
ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，ラ・ホーヤ，カリフォルニア州）に４分間曝露してから
３０ｍｇ／ｍｌＢＳＡで補足したＴＬ−ＨＥＰＥＳ中で５分間洗浄した。イオ
ノマイシン処理の間中、ＮＴ単位を２ｍＭＤＭＡＰ（Ｓｉｇｍａ）に曝露した
。洗浄後、ＮＴ単位を２ｍＭＤＭＡＰ（Ｓｉｇｍａ）を含むＣＲ１ａａ培養液
の小滴へ導入し、３８．５℃ ５％ＣＯ_２で４〜５時間培養した。胚を洗浄して
からマウス胚線維芽細胞の集密的支持細胞層を含む４ウェルプレート中ＣＲ１ａ
ａ培地＋１０％ＦＣＳ及び６ｍｇ／ｍｌＢＳＡに入れた。ＮＴ単位を３８．５
℃及び５％ＣＯ_２で３日以上培養した。活性化後の５〜８日まで培養液を３日毎
に変えた。このときにトランスジェニックＣＩＣＭ（培養した内部細胞塊）細胞
系又は胎児をつくるために胚盤胞段階のＮＴ胚が用いられる。ＮＴ単位の内部細
胞塊が単離され、支持細胞層上に平板培養される。また、ＮＴ単位を受容雌へ導
入した。妊娠３５〜４８日で流産した。これにより、検査した組織全てにβ−Ｇ
ＥＯ遺伝子をもつ７のクローン化トランスジェニック胎児が得られた。７の胚中
６が超音波所見により正常な心拍が検出された。また、胎児の組織学的切片から
顕性異常は示さなかった。従って、これはトランスジェニックＣＩＣＭ細胞系と
胎児をつくる迅速で容易な方法である。この操作は、一般的に遺伝子標的ＣＩＣ
Ｍ細胞系及び胎児を援助する。

【０１３７】下記の表は、これらの実験の結果を纏めたものである。

【０１３８】

【０１３９】実施例２トランスジェニックＣＩＣＭ細胞由来のキメラ胎児及び子。トランスジェニック
ＣＩＣＭ細胞系ははじめはトランスジェニックＮＴ単位に由来するものであった
（分化した細胞）。

【０１４０】トランスジェニックＮＴ胚由来のＣＩＣＭ（除核された卵母細胞へ導入したＣ
Ｌ−１細胞）を用いてキメラ胚及び胎児をつくった。トランスジェニックＣＩＣ
Ｍ細胞のコロニーを機械的脱凝集法により混合した１〜５ｍｇ／ｍｌプロナーゼ
か又は０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて脱凝集し、５細胞以下の凝集塊
をつくった。細胞を３０〜１００％のウシ胎児血清の多回洗浄に通過させること
によってトリプシン又はプロナーゼ活性を不活性化した。脱凝集した細胞をＴＬ
−ＨＥＰＥＳ培地を含む顕微操作プレートに入れた。受精した胚もそれらのプレ
ートに入れ、顕微操作手段を用いてキメラ胚をつくった。８〜１０のトランスジ
ェニックＣＩＣＭ細胞を８〜１６細胞段階の受精胚へ注入した。これらの胚を胚
盤胞段階まで試験管内で培養してから受容動物へ導入した。

【０１４１】合計６の胚盤胞段階のキメラ胚を２の受容雌へ非外科的に導入した。妊娠５週
間後、３胎児を回収した。生殖腺の生殖細胞を含む３胎児の数組織（生殖系列キ
メラを示す）をＰＣＲ増幅及びβ−ガラクトシダーゼ断片に対する増幅産物のサ
ザンブロットハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。３胎児のうち
２胎児がトランスジェニックＣＩＣＭ細胞からの寄与に陽性であった。これらの
胎児は共に生殖腺に対するトランスジェニックＣＩＣＭ寄与があった。

【０１４２】１０のキメラ胚が満期まで達し、１０のうち７つが子に発達した。耳の切れ目
を用い、ＤＮＡを各ウシから単離した。ＰＣＲ増幅時に、７のうち１つがトラン
スジェニックキメラ子であることを確認した。

【０１４３】トランスジェニックＣＩＣＭ細胞系由来のトランスジェニックＮＴ胚。トランス
ジェニックＣＩＣＭ細胞系ははじめはトランスジェニックＮＴ単位に由来したも
のである（分化した細胞）。

【０１４４】同じトランスジェニックＣＩＣＭ細胞系を用いてＮＴ胚をつくった。線維芽細
胞の代わりにＣＩＣＭ細胞を除核された卵母細胞と融合した供与細胞として用い
る以外は実施例１に記載されたＮＴ操作を用いた。トランスジェニックＣＩＣＭ
細胞のコロニーを機械的脱凝集法により混合した１〜５ｍｇ／ｍｌプロナーゼか
又は０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて脱凝集したので、５細胞以下の凝
集塊が生じた。細胞を３０〜１００％のウシ胎児血清の多回洗浄に通過させた後
に細胞を除核された卵母細胞へ導入することによってトリプシン又はプロナーゼ
活性を不活性化した。結果を表１に示す（第３グループ）。５の胚盤胞段階胚が
生じた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 35/12 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者スタイススティーヴンエルアメリカ合衆国マサチューセッツ州 01007 ベルチャータウンアムハーストロード 468 (72)発明者シーベリージョージアメリカ合衆国マサチューセッツ州 01002 アムハーストヴィレッジパーク 166 (72)発明者ローブルジェームズエムアメリカ合衆国マサチューセッツ州 01007 ベルチャータウンオールドエンフィールド 196 (72)発明者ゴルーエクポールアメリカ合衆国マサチューセッツ州 01007 ベルチャータウンダイアンドライヴ８−＃３ (72)発明者ポンスドレオンエフアベルアメリカ合衆国ミネソタ州 55127 ノースオークサウスロングレイクトレイル 27 (72)発明者ジェリーディージョセフアメリカ合衆国マサチューセッツ州 01072 シューツバリーウェストペーラムロード（番地なし) Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA10 GA03 GA08 GA18 4B065 AA90X AA90Y AB01 AB04 BA01 BA30 BB32 BD32 BD41 CA44 CA60 4C084 AA13 ZA022 ZA162 ZA362 ZA752 ZA812 ZA892 ZA942 ZA962 ZB262 ZC352 ZC552 4C087 AA01 AA02 BB44 BB45 ZA16 ZA36 ZA75 ZA81 ZA89 ZA94 ZA96 ZB26 ZC35 ZC55

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】哺乳動物をクローン化する方法であって、（ｉ）核伝達（ＮＴ）単位の形成に適した条件下、所望の分化した無血清飢餓哺
乳動物細胞又は細胞核を該分化した細胞又は細胞核と同じ種の除核された哺乳動
物卵母細胞へ挿入する工程；（ｉｉ）得られた核伝達単位を活性化する工程；（ｉｉｉ）培養した前記ＮＴ単位をホスト哺乳動物へ導入して該ＮＴ単位を胎児
に発育させる工程を含む、前記方法。
【請求項２】該胎児を子に発育させる工程を更に含む、請求項１記載の方
法。
【請求項３】前記分化した哺乳動物細胞又は細胞核において所望のＤＮＡ
を挿入、除去又は修飾し、よって遺伝的に修飾したＮＴ単位がつくられる、請求
項１記載の方法。
【請求項４】該胎児を子に発育させる工程を更に含む、請求項３記載の方
法。
【請求項５】該分化した哺乳動物細胞又は細胞核が中胚葉系列由来である
、請求項１記載の方法。
【請求項６】該分化した哺乳動物細胞又は細胞核が外胚葉系列由来である
、請求項１記載の方法。
【請求項７】該分化した哺乳動物細胞又は細胞核が内胚葉系列由来である
、請求項１記載の方法。
【請求項８】該分化した哺乳動物細胞又は細胞核が線維芽細胞又は細胞核
である、請求項１記載の方法。
【請求項９】該分化した哺乳動物細胞又は細胞核が有蹄類由来である、請
求項１記載の方法。
【請求項１０】該有蹄類がウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ及びバッファ
ローからなる群より選ばれる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】該分化した哺乳動物細胞又は細胞核が成体細胞又は細胞核
である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】該分化した哺乳動物細胞又は細胞核が胚細胞又は胎児細胞
又は細胞核である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】該除核された卵母細胞が除核前に成熟する、請求項１記載
の方法。
【請求項１４】融合した該核伝達単位がイノマイシン及び６−ジメチルア
ミノプリンに曝露することにより活性化される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】マイクロインジェクションを用いて異種ＤＮＡを挿入する
、請求項３記載の方法。
【請求項１６】エレクトロポレーションを用いて異種ＤＮＡを挿入する、
請求項３記載の方法。
【請求項１７】請求項１記載の方法に従って得られる胎児。
【請求項１８】請求項２記載の方法に従って得られる子。
【請求項１９】請求項１８記載の子の子孫。
【請求項２０】請求項３記載の方法に従って得られたトランスジェニック
胎児。
【請求項２１】請求項４記載の方法に従って得られるトランスジェニック
子。
【請求項２２】請求項２１記載の子の子孫。
【請求項２３】該クローン化ＮＴ単位と受精胚とを混合してキメラ胚をつ
くる工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２４】該胎児を子に発育させる工程を更に含む、請求項２３記載
の方法。
【請求項２５】請求項２３記載の方法に従って得られる胎児。
【請求項２６】請求項２４記載の方法に従って得られる子。
【請求項２７】請求項２６記載の哺乳動物の子孫。
【請求項２８】活性化した前記核伝達単位を２−細胞発育段階より大きく
なるまで培養する、請求項１記載の方法。
【請求項２９】ＣＩＣＭ細胞系の生産方法であって、（ｉ）核伝達（ＮＴ）単位の形成に適した条件下、所望の分化した無血清飢餓哺
乳動物細胞又は細胞核を該分化した細胞又は細胞核と同じ種の除核された哺乳動
物卵母細胞へ挿入する工程；（ｉｉ）得られた核伝達単位を活性化する工程；（ｉｉｉ）培養した前記ＮＴ単位から得られた細胞を培養してＣＩＣＭ細胞系を
得る工程を含む、前記方法。
【請求項３０】活性化した前記核伝達単位を２−細胞発育段階より大きく
なるまで培養する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】請求項２９記載の方法に従って得られたＣＩＣＭ細胞系。
【請求項３２】前記分化した哺乳動物細胞又は細胞核において所望のＤＮ
Ａを挿入、除去又は修飾し、よって遺伝的に修飾したＮＴ単位がつくられる、請
求項２９記載の方法。
【請求項３３】請求項３２記載の方法に従って得られたトランスジェニッ
クＣＩＣＭ細胞系。
【請求項３４】得られたＣＩＣＭ細胞系を誘導して分化させる、請求項２
９記載の方法。
【請求項３５】請求項３４記載の方法によって得られる分化細胞。
【請求項３６】請求項３４記載の方法によって得られるヒト分化細胞。
【請求項３７】治療方法であって、請求項３６記載の同質遺伝子分化細胞
を細胞移植治療を必要としている患者に投与することを特徴とする、前記方法。
【請求項３８】前記細胞移植治療がパーキンソン病、ハンチントン病、ア
ルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄欠損又は損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー
、嚢胞性線維症、肝臓病、糖尿病、心臓病、軟骨欠損又は損傷、熱傷、足潰瘍、
血管性疾患、尿路疾患、エイズ及びがんからなる群より選ばれた疾患又は症状を
治療するために行なわれる、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】治療方法であって、請求項３５記載の異種分化細胞を細胞
移植治療を必要としているヒト患者に投与することを特徴とする、前記方法。
【請求項４０】該異種分化細胞がウシ細胞である、請求項３９記載の方法
。
【請求項４１】前記細胞移植治療がパーキンソン病、ハンチントン病、ア
ルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄欠損又は損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー
、嚢胞性線維症、肝臓病、糖尿病、心臓病、軟骨欠損又は損傷、熱傷、足潰瘍、
血管性疾患、尿路疾患、エイズ及びがんからなる群より選ばれた疾患又は症状を
治療するために行なわれる、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】該ヒト分化細胞が造血細胞又は神経細胞である、請求項３
７記載の方法。
【請求項４３】該治療がパーキンソン病の治療のためであり、該分化細胞
が神経細胞である、請求項３７記載の方法。
【請求項４４】該治療ががんの治療のためであり、該分化細胞が造血細胞
である、請求項３７記載の方法。
【請求項４５】治療方法であって、請求項１７記載の胎児から得られた異
種細胞を細胞移植治療を必要としているヒト患者に投与することを特徴とする、
前記方法。
【請求項４６】該異種細胞がウシ細胞である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】前記細胞移植治療がパーキンソン病、ハンチントン病、ア
ルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄欠損又は損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー
、嚢胞性線維症、肝臓病、糖尿病、心臓病、軟骨欠損又は損傷、熱傷、足潰瘍、
血管性疾患、尿路疾患、エイズ及びがんからなる群より選ばれた疾患又は症状を
治療するために行なわれる、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】前記細胞移植治療がパーキンソン病を治療するために行な
われる、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】治療方法であって、請求項１８記載の子から得られた異種
細胞を細胞移植治療を必要としているヒト患者に投与することを特徴とする、前
記方法。
【請求項５０】該異種細胞がウシ細胞である、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】前記細胞移植治療がパーキンソン病、ハンチントン病、ア
ルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄欠損又は損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー
、嚢胞性線維症、肝臓病、糖尿病、心臓病、軟骨欠損又は損傷、熱傷、足潰瘍、
血管性疾患、尿路疾患、エイズ及びがんからなる群より選ばれた疾患又は症状を
治療するために行なわれる、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】治療方法であって、請求項２０記載のトランスジェニック
胎児から得られた異種トランスジェニック細胞を細胞移植治療を必要としている
ヒト患者に投与することを特徴とする、前記方法。
【請求項５３】該異種トランスジェニック細胞がウシ細胞である、請求項
５２記載の方法。
【請求項５４】前記細胞移植治療がパーキンソン病、ハンチントン病、ア
ルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄欠損又は損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー
、嚢胞性線維症、肝臓病、糖尿病、心臓病、軟骨欠損又は損傷、熱傷、足潰瘍、
血管性疾患、尿路疾患、エイズ及びがんからなる群より選ばれた疾患又は症状を
治療するために行なわれる、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】前記細胞移植治療がパーキンソン病を治療するために行な
われる、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】請求項２１記載のトランスジェニック子から得られた異種
トランスジェニック細胞を細胞移植治療を必要としているヒト患者に投与するこ
とを特徴とする、前記方法。
【請求項５７】該異種トランスジェニック細胞がウシ細胞である、請求項
５６記載の方法。
【請求項５８】前記細胞移植治療がパーキンソン病、ハンチントン病、ア
ルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄欠損又は損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー
、嚢胞性線維症、肝臓病、糖尿病、心臓病、軟骨欠損又は損傷、熱傷、足潰瘍、
血管性疾患、尿路疾患、エイズ及びがんからなる群より選ばれた疾患又は症状を
治療するために行なわれる、請求項５６記載の方法。
【請求項５９】クローン化した該ＮＴ単位を受精胚と混合してキメラをつ
くる工程を更に含む、請求項２９記載の方法。
【請求項６０】該キメラＣＩＣＭ細胞系をキメラ胚に発育させる工程を更
に含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】請求項６０記載の方法に従って得られるキメラ胚。
【請求項６２】該キメラ胚をキメラ胎児に発育させる工程を更に含む、請
求項６０記載の方法。
【請求項６３】請求項６２記載の方法に従って得られるキメラ胎児。
【請求項６４】該キメラ胎児をキメラ子に発育させる工程を更に含む、請
求項６２記載の方法。
【請求項６５】請求項６４記載の方法に従って得られるキメラ子。
【請求項６６】前記分化した哺乳動物細胞又は細胞核において所望のＤＮ
Ａを挿入、除去又は修飾し、よって遺伝的に修飾したＮＴ単位がつくられる、請
求項５９記載の方法。
【請求項６７】該キメラＣＩＣＭ細胞系をキメラ胚に発育させる工程を更
に含む、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】請求項６７記載の方法に従って得られるキメラ胚。
【請求項６９】該キメラ胚をキメラ胎児に発育させる工程を更に含む、請
求項６７記載の方法。
【請求項７０】請求項６９記載の方法に従って得られるキメラ胎児。
【請求項７１】該キメラ胎児をキメラ子に発育させる工程を更に含む、請
求項６９記載の方法。
【請求項７２】請求項７１記載の方法に従って得られるキメラ子。
【請求項７３】哺乳動物をクローン化する方法であって、（ｉ）核伝達（ＮＴ）単位の形成に適した条件下、所望の分化した無血清飢餓Ｃ
ＩＣＭ細胞又は細胞核を該分化したＣＩＣＭ細胞又は細胞核と同じ種の除核され
た哺乳動物卵母細胞へ挿入する工程；（ｉｉ）得られた核伝達単位を活性化する工程；（ｉｉｉ）培養した前記ＮＴ単位をホスト哺乳動物へ導入して該ＮＴ単位を胎児
に発育させる工程を含む、前記方法。
【請求項７４】活性化した前記核伝達単位を２−細胞発育段階より大きく
なるまで培養する、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】該胎児を子に発育させる工程を更に含む、請求項７３記載
の方法。
【請求項７６】請求項７３記載の方法に従って得られる胎児。
【請求項７７】請求項７５記載の方法に従って得られる子。
【請求項７８】請求項１８記載の子から得られる、器官異種移植片として
用いるための器官。
【請求項７９】請求項２１記載の子から得られる、器官異種移植片として
用いるための器官。
【請求項８０】請求項２６記載の子から得られる、器官異種移植片として
用いるための器官。
【請求項８１】請求項７２記載の子から得られる、器官異種移植片として
用いるための器官。
【請求項８２】請求項７７記載の子から得られる、器官異種移植片として
用いるための器官。
【請求項８３】該除核された卵母細胞が試験管内で成熟する、請求項１３
記載の方法。
【請求項８４】活性化が該ＮＴ単位の形成後に生じる、請求項１記載の方
法。
【請求項８５】活性化が該ＮＴ単位の形成の４時間以降に生じる、請求項
８４記載の方法。
【請求項８６】該ＮＴ単位を非規定培地中でヘルパー細胞と試験管内共存
培養する、請求項１記載の方法。
【請求項８７】医薬的に活性なタンパク質の生産方法であって、請求項２
１記載のトランスジェニック子によって発現する医薬的に活性なタンパク質を単
離する工程を含む、前記方法。