JP2001509362A - 分化細胞からのドナー核を使用するブタのクローニング - Google Patents

分化細胞からのドナー核を使用するブタのクローニング

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Abstract

(57)【要約】 除核ブタ卵母細胞へのドナー分化ブタ細胞核の移植を伴う核導入の改良された方法が提供される。得られた核導入単位は胎児及び子の生産による遺伝子型及びトランスジェニック遺伝子型の増殖に有益である。遺伝子操作された、又はトランスジェニックのブタ胚、胎児及び子の生産が本方法により促進される。何とならば、ドナー核の分化細胞源が遺伝子修飾され、クローン増殖し得るからである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、分化ブタ細胞に由来する細胞核がドナー核として同種の除核哺乳類
卵母細胞に移植されるクローニング操作に関する。核はクローン化胚の発達を誘
導するように再プログラミングされ、次いでこれらがレシピエント雌に導入され
て胎児及び子を産み、又は培養内部細胞塊細胞（ＣＩＣＭ）を生じるのに使用し
得る。クローン化胚は又受精胚と組み合わされてキメラの胚、胎児及び／または
子を生じ得る。
【０００２】 （背景技術） 核移植のための有蹄類内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞の使用が又報告されていた。
例えば、Ｃｏｌｌａｓら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８：２６４−２
６７（１９９４）は除核成熟卵母細胞への溶解ドナー細胞のマイクロインジェク
ションによるウシＩＣＭの核移植を開示している。Ｃｏｌｌａｓらは１５の胚盤
胞を生成するための７日間のｉｎ ｖｉｔｒｏの胚の培養を開示し、これらがウ
シレシピエントへの導入後に四つの妊娠及び二つの誕生をもたらした。又、Ｋｅ
ｅｆｅｒら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５０：９３５−９３９（１９９４）は
胚盤胞を生じるための核導入操作におけるドナー核としてのウシＩＣＭ細胞の使
用を開示し、これらがウシレシピエントへの移植後に幾つかの生きている子をも
たらした。更に、Ｓｉｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳ
Ａ，９０：６１４３−６１４７（１９９３）は除核成熟卵母細胞への短期ｉｎ
ｖｉｔｒｏ培養ウシＩＣＭ細胞からの核の導入による子ウシの生産を開示してい
た。
【０００３】 培養胚盤細胞の核導入後の生きている子ヒツジの生産が又報告されていた（Ｃ
ａｍｐｂｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：６４−６８（１９９６））。更に、
核導入におけるウシ多能胚細胞の使用及びキメラ胎児の生産が報告されていた（
Ｓｔｉｃｅら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５４：１００−１１０（１９９６）
；Ｃｏｌｌａｓら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（
１９９４））。Ｃｏｌｌａｓらは、顆粒膜細胞（成体細胞）がウシクローニング
操作に使用されて胚を生じ得ることを実証した。しかしながら、早期胚段階（胚
盤胞段階）後の発育について実証されなかった。又、顆粒膜細胞は容易に培養さ
れず、雌のみから得られる。Ｃｏｌｌａｓらは顆粒膜細胞を培養で増殖しようと
試みなかったし、又これらの細胞を遺伝的に修飾しようとしなかった。Ｗｉｌｍ
ｕｔら（Ｎａｔｕｒｅ，３６５：８１０−８１３（１９９７））は胎児繊維芽細
胞由来の核導入ヒツジの子を生産し、又成体ヒツジ由来の細胞からその子を生産
した。
【０００４】 クローニングブタ細胞はその他の種の細胞と比較して困難である。この現象は
下記の表により説明される。
【０００５】
【表１】
【０００６】 又、トランスジェニックブタの生産の分野に問題がある。現行の方法により、
異種ＤＮＡが早期の胚又は胚細胞系（これらは胎児中の種々の細胞型に分化し、
そして最終的にトランスジェニック動物に発育する）に導入される。しかしなが
ら、多くの早期の胚は一つのトランスジェニック動物を生産するのに必要とされ
、こうして、この操作は非常に非効率的である。又、胚を代理の雌に入れる時間
及び費用をかける前にトランスジェニック胚を選択する簡単かつ有効な方法はな
い。加えて、遺伝子ターゲティング技術が早期の胚トランスジェニック操作では
容易に行い得ない。
【０００７】 マウス中の胚幹細胞は研究者らがトランスジェニック細胞を選択し、遺伝子タ
ーゲティングを行うことを可能にした。これはその他のトランスジェニック技術
で可能であるよりも遺伝子操作を更に可能にする。しかしながら、胚幹細胞系及
びその他の胚細胞系がフィーダ層及び／または培地へのサイトカインの添加を必
要とする未分化状態で維持される必要がある。たとえこれらの対策が続けられる
としても、これらの細胞はしばしば自然分化を受け、現在利用できる方法により
トランスジェニック子を生産するのに使用できない。又、ある種の胚細胞系は遺
伝子ターゲティング操作に役だたない方法で増殖される必要がある。
【０００８】 早期の前移植マウス胚から胚幹（ＥＳ）細胞系をｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導する
方法は公知である（例えば、Ｅｖａｎｓら，Ｎａｔｕｒｅ，２９：１５４−１５
６（１９８１）；Ｍａｒｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ
ＳＡ，７８：７６３４−７６３８（１９８１）を参照のこと）。ＥＳ細胞は、繊
維芽細胞のフィーダ層（Ｅｖａｎｓらの上記文献）又は分化抑制源（Ｓｍｉｔｈ
ら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２１：１−９（１９８７））が存在することを条件
として、未分化状態で継代し得る。
【０００９】 ＥＳ細胞は多くの用途を有することが既に報告されていた。例えば、ＥＳ細胞
は特に早期発育の調節に関係する遺伝子の研究のために分化のｉｎ ｖｉｔｒｏ
モデルとして使用し得ることが報告されていた。マウスＥＳ細胞は前移植マウス
胚に導入された時に生殖細胞系キメラを生じることができ、こうしてそれらの多
能性を示す（Ｂｒａｄｌｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３０９：２５５−２５６（１９
８４））。 ＥＳ細胞は、それらのゲノムを次の世代に導入するそれらの能力に鑑みて、所
望の遺伝子修飾を用いて、又は用いずにＥＳ細胞を使用することにより家畜動物
の生殖細胞系操作に潜在的な実用性を有する。更に、家畜動物、例えば、有蹄類
の場合、前移植家畜胚からのような核が除核卵母細胞の発育を出産まで支持する
（Ｓｍｉｔｈら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，４０：１０２７−１０３５（１９
８９）；及びＫｅｅｆｅｒら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５０：９３５−９３
９（１９９４））。これは導入後に８細胞段階を超えると報告によれば除核卵母
細胞の発育を支持しないマウス胚からの核（Ｃｈｅｏｎｇら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ
ｒｏｄ．，４８：９５８（１９９３））とは対照的である。それ故、家畜動物か
らのＥＳ細胞が高度に望ましい。何とならば、それらが核導入操作のために、遺
伝子操作された、又はそれ以外の全能ドナー核の潜在源を与え得るからである。
【００１０】 幾つかの研究グループが合目的的に多能な胚細胞系の単離を報告していた。例
えば、Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉら，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｓｕｐｐｌ．，
４３：２５５−２６０（１９９１）はヒツジ胚盤胞から免疫手術により単離され
た内部細胞塊の一次培養液中の細胞の特性と同様のある種の形態特性及び成長特
性を示すブタ胚盤胞及びヒツジ胚盤胞からの合目的的に安定な多能細胞系の樹立
を報告している。又、Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉら，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．
Ｓｕｐｐｌ．，４１：５１−５６（１９９０）はブタ胚盤胞からの推定の多能胚
細胞系の培養中の維持及び分化を開示している。Ｇｅｒｆｅｎら，Ａｎｉｍ．Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ，６（１）：１−１４（１９９５）はブタ胚盤胞からの胚細胞系の
単離を開示している。これらの細胞はならし培地を使用しないでマウス胚繊維芽
細胞フィーダ層中で安定に維持され、報告によれば培養中に幾つかの異なる細胞
型に分化する。
【００１１】 更に、Ｓａｉｔｏら，Ｒｏｕｘ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２０１
：１３４−１４１（１９９２）は３継代を生存したが、第四継代後に死滅した培
養されたウシ胚幹細胞のような細胞系を報告している。Ｈａｎｄｙｓｉｄｅら，
Ｒｏｕｘ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９６：１８５−１９０（１９
８７）はマウスＩＣＭ由来のマウスＥＳ細胞系の単離を可能にする条件下のヒツ
ジ胚の免疫手術により単離された内部細胞塊の培養を開示している。Ｈａｎｄｙ
ｓｉｄｅらは、このような条件下では、ヒツジＩＣＭがＥＳ細胞のような細胞及
び内胚葉のような細胞の両方の領域に付着し、広がり、発達させるが、延長され
た培養後には内胚葉のような細胞のみが明らかであることを報告している。
【００１２】 最近、Ｃｈｅｒｎｙら，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，４１：１７５（１９
９４）は長期培養で維持された合目的的に多能なウシ始原生殖細胞由来の細胞系
を報告していた。これらの細胞は、培養の約７日後に、ＥＳのようなコロニーを
生じ、これらはアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）について陽性染色し、胚様体
を形成する能力を示し、少なくとも二つの異なる細胞型に自然分化した。又、こ
れらの細胞は報告によれば転写因子ＯＣＴ４、ＯＣＴ６及びＨＥＳ１についてｍ
ＲＮＡを発現し、そのホメオボックス遺伝子のパターンは専らＥＳ細胞により発
現されると考えられる。
【００１３】 又最近、Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：６４−６８（１９９６
）はマウス中のＥＳ細胞系の単離を促進する条件下で培養された９日目のヒツジ
胚からの培養胚盤（ＥＤ）細胞の核導入後の生きている子ヒツジの生産を報告し
ていた。著者らは、９日目のヒツジ胚からのＥＤ細胞が核導入により全能であり
、全能性が培養中に維持されると結論した。
【００１４】 Ｖａｎ Ｓｔｅｋｅｌｅｎｂｕｒｇ−Ｈａｍｅｒｓら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ
．Ｄｅｖ．，４０：４４４−４５４（１９９５）はウシ胚盤胞の内部細胞塊細胞
からの合目的的に永久の細胞系の単離及び特性決定を報告していた。著者らは異
なる条件下で８又は９日目のウシ胚盤胞からＩＣＭを単離し、培養してどのフィ
ーダ細胞及び培地がウシＩＣＭ細胞の付着及び外殖を支持するのに最も有効であ
るかを測定した。彼らは、培養ＩＣＭ細胞の付着及び外殖がＳＴＯ（マウス繊維
芽細胞）フィーダ細胞（ウシ子宮上皮細胞に代えて）の使用により、又培地を補
給するための木炭ストリッピングした血清（通常の血清ではない）の使用により
増進されると結論した。しかしながら、Ｖａｎ Ｓｔｅｋｅｌｅｎｂｕｒｇらは
、彼らの細胞系が多能ＩＣＭ細胞よりも上皮細胞に似ていると報告していた。
【００１５】 １９９４年１０月２７日に公表されたＳｍｉｔｈらのＷＯ９４／２４２７４、
１９９０年４月５日に公表されたＥｖａｎｓらのＷＯ９０／０３４３２、及び１
９９４年１１月２４日に公表されたＷｈｅｅｌｅｒらのＷＯ９４／２６８８９は
トランスジェニック動物を得るのに合目的的に使用し得る動物幹細胞の単離、選
択及び増殖を報告している。又、Ｅｖａｎｓらはトランスジェニック動物の生産
に有益であると主張されているブタ種及びウシ種からの合目的的に多能の胚幹細
胞の誘導を報告していた。更に、１９９４年１１月２４日に公表されたＷｈｅｅ
ｌｅｒらのＷＯ９４／２６８８４はキメラ有蹄類及びトランスジェニック有蹄類
の生産に有益であると主張されている胚幹細胞を開示していた。
【００１６】 こうして、以上に基いて、多くのグループが、例えば、クローン化胚又はトラ
ンスジェニック胚の生産及び核移植におけるそれらの潜在的な適用のためにＥＳ
細胞系を生産しようと試みていたことが明らかである。
【００１７】 それ故、文献に既に報告されていたことにかかわらず、ドナー核として培養分
化細胞を使用するブタの改良されたクローニング方法に対する要望がある。
【００１８】 （発明の目的及び要旨） 本発明の目的はドナー核として培養分化細胞を使用するクローン化ブタの新規
かつ改良された生産方法を提供することである。
【００１９】 本発明の更に特別な目的は除核ブタ卵母細胞への分化ブタ細胞の核の移植を伴
うブタの新規クローニング方法を提供することである。
【００２０】 本発明の別の目的は遺伝優秀性又はその他の望ましい形質と判明した成体ブタ
の増殖方法を提供することである。
【００２１】 本発明の別の目的は遺伝子操作されたブタ又はトランスジェニックブタ（即ち
、ＮＴ単位、胎児、子）の改良された生産方法を提供することである。又、本発
明はこのような方法によりつくられたブタを含む遺伝子操作されたブタ又はトラ
ンスジェニックブタを提供する。
【００２２】 本発明の更に特別な目的は所望のＤＮＡ配列がＮＴ単位の形成のための分化細
胞または細胞核の使用の前に分化ブタ細胞又は細胞核中で挿入、除去又は修飾さ
れる遺伝子操作されたブタ又はトランスジェニックブタの生産方法を提供するこ
とである。又、本発明はこのような方法によりつくられた遺伝子操作されたブタ
又はトランスジェニックブタを提供する。
【００２３】 本発明の別の目的は除核ブタ卵母細胞への分化ブタ細胞の核の移植、次いで得
られるＮＴ単位を使用してＣＩＣＭ細胞を生成することを伴うブタＣＩＣＭ細胞
の新規生成方法を提供することである。又、本発明はこのような方法によりつく
られたブタＣＩＣＭ細胞を提供する。
【００２４】 本発明の別の目的は治療又は診断のためにこのようなブタＣＩＣＭ細胞を使用
することである。
【００２５】 本発明の特別な目的は細胞、組織又は臓器移植が治療上又は診断上有益である
あらゆる疾患の治療又は診断のためにこのようなブタＣＩＣＭ細胞を使用するこ
とである。ＣＩＣＭ細胞は同種内又は種間で使用されてもよい。
【００２６】 本発明の別の目的は細胞、組織又は臓器移植が治療上又は診断上有益であるあ
らゆる疾患の治療又は診断のためにブタＮＴ単位、胎児又は子に由来する細胞又
は組織を使用することである。このような疾患及び損傷として、パーキンソン病
、ハンチントン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄損傷、多発性硬化症、筋ジ
ストロフィー、糖尿病、肝臓疾患、心臓疾患、軟骨置換、火傷、血管疾患、尿道
疾患が挙げられるだけでなく、その他の疾患の中でも免疫不全、骨髄移植、癌の
治療のためである。これらの組織は同種内又は種間で使用されてもよい。
【００２７】 本発明の別の特別な目的は分化細胞、組織又は臓器の生成のために本発明に従
って生成されたブタＮＴ単位、胎児もしくは子、又はブタＣＩＣＭ細胞に由来す
る細胞又は組織を使用することである。
【００２８】 本発明の別の特別な目的は、例えば、細胞分化の研究のため、又、例えば、イ
ヌの研究のための、アッセイ目的のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで本発明に従って
生成されたブタＮＴ単位、胎児もしくは子、又はブタＣＩＣＭ細胞に由来する細
胞又は組織を使用することである。
【００２９】 本発明の別の目的はブタＮＴ単位、胎児もしくは子、又はブタＣＩＣＭ細
胞に由来するこのような組織から生成された細胞、組織又は臓器を使用して移植
治療の改良された方法を提供することである。このような治療として、例えば、
パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄損傷、多発
性硬化症、筋ジストロフィー、糖尿病、肝臓疾患、心臓疾患、軟骨置換、火傷、
血管疾患、尿道疾患を含む疾患及び損傷の治療が挙げられるだけでなく、その他
の疾患の中でも免疫不全、骨髄移植、癌の治療が挙げられる。
【００３０】 本発明の別の目的はＮＴ単位の形成のための分化細胞または細胞核の使用の前
に分化ブタ細胞又は細胞核中で所望のＤＮＡ配列を挿入、除去又は修飾すること
により生成されたブタＮＴ単位、胎児もしくは子、又はブタＣＩＣＭ細胞に由来
する遺伝子操作された組織又はトランスジェニック組織を提供することである。
【００３１】 本発明の別の目的は遺伝子治療、特に上記の疾患及び損傷の治療及び／または
予防のためにブタＮＴ単位、胎児もしくは子、又はブタＣＩＣＭ細胞に由来する
トランスジェニック組織又は遺伝子操作された組織を使用することである。
【００３２】 本発明の別の目的は核移植のための核ドナーとして本発明に従って生成された
ブタＮＴ単位、胎児もしくは子、又はブタＣＩＣＭ細胞に由来する組織、又は本
発明に従って生成されたブタＮＴ単位、胎児もしくは子、又はブタＣＩＣＭ細胞
に由来するトランスジェニック組織もしくは遺伝子操作された組織を使用するこ
とである。
【００３３】 本発明の別の目的は薬理学上重要なタンパク質を生成するために本発明に従っ
て生産されたトランスジェニックブタ子又は遺伝子操作されたブタ子を使用する
ことである。
【００３４】 こうして、一局面において、本発明はブタ（例えば、胚、胎児、子）のクロー
ニング方法を提供する。その方法は （ｉ）所望の分化ブタ細胞又は細胞核を核導入（ＮＴ）単位の形成に適した条件
下で除核ブタ卵母細胞に挿入し、 （ｉｉ）得られた核導入単位を活性化し、そして （ｉｉｉ）前記培養ＮＴ単位を宿主ブタに導入し、その結果、ＮＴ単位が胎児
に発達することを特徴とする。
【００３５】 必要により、活性化された核導入単位は２細胞より大きい発育段階まで培養さ
れる。
【００３６】 胎児の細胞、組織及び／または臓器は細胞、組織及び／または臓器移植、又は
望ましい遺伝子型の生成の分野に有利に使用される。
【００３７】 又、本発明は遺伝子操作されたブタ又はトランスジェニックブタのクローニン
グ方法を含み、その方法により所望のＤＮＡ配列が除核卵母細胞への分化ブタ細
胞又は細胞核の挿入の前に分化ブタ細胞又は細胞核中で挿入、除去又は修飾され
る。このような方法により生産された遺伝子操作されたブタ又はトランスジェニ
ックブタは細胞、組織及び／または臓器移植、望ましい遺伝子型の生成、及び医
薬タンパク質の生成の分野に有利に使用される。
【００３８】 又、上記方法により得られたブタ、及びこれらのブタの子が本発明により提供
される。
【００３９】 別の局面において、本発明はブタＣＩＣＭ細胞の生成方法を提供する。その方
法は （ｉ）所望の分化ブタ細胞又は細胞核を核導入（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓ
ｆｅｒ：ＮＴ）単位の形成に適した条件下で除核ブタ卵母細胞に挿入し、 （ｉｉ）得られた核導入単位を活性化し、そして （ｉｉｉ）前記培養ＮＴ単位から得られた細胞を培養してブタＣＩＣＭ細胞を
得ることを特徴とする。
【００４０】 必要により、活性化された核導入単位は２細胞より大きい発育段階まで培養さ
れる。 ブタＣＩＣＭ細胞は細胞、組織及び臓器移植の分野に有利に使用される。
【００４１】 以上の目的及びその他の目的、並びに以下に明らかになる本発明の利点及び特
徴により、本発明の性質が以下の本発明の好ましい実施態様の詳細な説明及び請
求の範囲を参考にすることにより明らかに理解し得る。
【００４２】 （発明を実施するための最良の形態） 本発明は核導入又は核移植によるブタの改良されたクローニング操作を提供す
る。本件出願において、核導入もしくは核移植又はＮＴは互換可能に使用される
。
【００４３】 本発明によれば、分化ブタ細胞に由来する細胞核が除核ブタ卵母細胞に移植さ
れる。核はクローン化胚の発育を誘導するように再プログラムされ、次いでこれ
らがレシピエント雌に導入されて胎児及び子を産み、又はＣＩＣＭ細胞を生成す
るのに使用される。又、クローン化胚は受精胚と組み合わされてキメラ胚、胎児
及び／または子を生じ得る。
【００４４】 従来技術の方法はクローニング操作で胚細胞型を使用していた。これはＣａｍ
ｐｂｅｌｌら（Ｎａｔｕｒｅ，３８０：６４−６８，１９９６）及びＳｔｉｃｅ
ら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５４：１００−１１０，１９９６）による研究
を含む。これらの研究の両方において、胚細胞系は妊娠の１０日未満の胚から誘
導された。両方の研究において、細胞がフィーダ層で維持されてクローニング操
作に使用されるドナー細胞の顕在的分化を防止した。本発明は分化細胞を使用す
る。
【００４５】 ヒツジからの成体細胞及び胎児繊維芽細胞がヒツジ子を生産するのに合目的的
に使用されていた（Ｗｉｌｍｕｔら，１９９７）。しかしながら、これらの研究
はブタのクローニングがヒツジのクローニングよりも難しいことを示していた。
実際に、研究された哺乳類種のうち、ヒツジのクローニングが最も容易であるこ
とが明らかであり、ブタクローニングが最も困難であることが明らかである。本
発明の分化細胞型を使用するブタの成功裏のクローニングは全く予期されなかっ
た。
【００４６】 こうして、本発明によれば、ブタの優れた遺伝子型の増殖が可能である。これ
は判明した遺伝的優秀性又はその他の望ましい形質を有する成体ブタの増殖を可
能にするであろう。遺伝的進歩がブタで加速されるであろう。本発明により、回
収され、クローニング操作に使用し得る潜在的に数百万の胎児又は成体のブタ細
胞がある。これは潜在的に短期間で多くの同じ子をもたらすであろう。
【００４７】 又、Ｗｉｌｍｕｔらの方法がトランスジェニック動物の発生をもたらすという
考察があった（ＭａｃＱｕｉｔｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：
２９４（１９９７）を参照のこと）。しかしながら、例えば、外在性ＤＮＡでト
ランスフェクトされた成体細胞からの核が核導入のプロセスで生存し得ることを
推定する理由はない。これに関して、マウス胚幹（ＥＳ）細胞の性質はｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ操作により変更され、その結果、生存キメラ胚を形成するそれらの能力
が影響されることが知られている。それ故、本発明の前に、トランスジェニック
動物のクローニングは予測し得なかった。
【００４８】 又、本発明はクローン増殖し得る細胞源で作業することによりトランスジェニ
ック操作の簡素化を可能にする。これは細胞を未分化状態で維持する必要をなく
し、こうして、遺伝子修飾、ランダム組込み及び遺伝子ターゲティングの両方が
更に容易に行なわれる。又、核導入を修飾し、これらの細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ
で選択する能力と組み合わせることにより、この操作が従来のトランスジェニッ
ク胚技術よりも有効である。本発明によれば、これらの細胞はサイトカイン、な
らし培地及び／またはフィーダ層を用いないでクローン増殖され、トランスジェ
ニック操作を更に簡素化し、促進し得る。トランスフェクトされた細胞が本発明
のクローニング操作に使用される場合、胎児及び子に発育し得るトランスジェニ
ックブタ胚が生成される。又、これらのトランスジェニッククローン化胚はＣＩ
ＣＭ細胞系又はその他の胚細胞系を生成するのに使用し得る。それ故、本発明は
遺伝子操作技術に資する未分化細胞系をｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導し、維持する必
要を省く。
【００４９】 又、本発明は、例えば、細胞、組織及び臓器移植に使用し得るクローン化ブタ
胎児、子又はＣＩＣＭ細胞を生成するのに使用し得る。ブタから胎児細胞又は成
体細胞を採取し、それをクローニング操作に使用することにより、種々の細胞、
組織そしておそらく臓器がクローン化胎児から得られる。何とならば、それらが
器官形成中に発育するからである。細胞、組織、及び臓器は同様にクローン化子
から単離し得る。この方法は細胞及び遺伝子治療を含む多くの医療及び獣医学の
治療に“物質”の源を与え得る。細胞が細胞が誘導された動物に逆に導入される
場合、免疫拒絶が避けられる。又、多くの細胞型がこれらのクローンから単離し
得るので、造血キメリズムの如きその他の方法が同種の動物中だけでなく種間で
免疫拒絶を回避するのに使用し得る。
【００５０】 こうして、一局面において、本発明はブタのクローニング方法を提供する。一
般に、ブタは下記の工程： （ｉ）ドナー核の源として使用される所望の分化ブタ細胞を得、 （ｉｉ）ブタから卵母細胞を得、 （ｉｉｉ）前記卵母細胞を除核し、 （ｉｖ）所望の分化細胞又は細胞核を、例えば、融合又は注入により、除核卵
母細胞に導入してＮＴ単位を形成し、 （ｖ）得られたＮＴ単位を活性化し、そして （ｖｉｉ）前記培養ＮＴ単位を宿主ブタに導入し、その結果、ＮＴ単位が胎児
に発育することを特徴とする核導入方法により生産されるであろう。 必要により、活性化核導入単位は２細胞より大きい発育段階まで培養される。
【００５１】 又、本発明は、所望のＤＮＡ配列が除核卵母細胞への分化ブタ細胞又は細胞核
の挿入の前に分化ブタ細胞又は細胞核中で挿入、除去又は修飾される遺伝子操作
されたブタ又はトランスジェニックブタのクローニング方法を含む。
【００５２】 又、上記方法により得られたブタ、及びこれらのブタの子が本発明により提供
される。 上記使用に加えて、本発明の遺伝子操作されたブタ又はトランスジェニックブ
タは薬理学上重要なタンパク質の如き所望のタンパク質を生成するのに使用し得
る。次いでその所望のタンパク質がトランスジェニックブタの乳もしくはその他
の液体又は組織から単離し得る。又、外在性ＤＮＡ配列は農業上有益な形質、例
えば、疾患耐性、低下された体脂肪、増大された赤肉製品、改良された飼料転化
、又は子の変化された性別比をトランスジェニックブタに与え得る。
【００５３】 更に、本発明は細胞、組織及び臓器移植の分野におけるＮＴ胎児並びにＮＴ及
びキメラ子の使用を提供する。 別の局面において、本発明はブタＣＩＣＭ細胞の生成方法を提供する。その方
法は（ｉ）所望の分化ブタ細胞又は細胞核を核導入（ＮＴ）単位の形成に適した
条件下で除核ブタ卵母細胞に挿入し、 （ｉｉ）得られた核導入単位を活性化し、そして （ｉｉｉ）前記培養ＮＴ単位から得られた細胞を培養してブタＣＩＣＭ細胞を
得ることを特徴とする。
【００５４】 必要により、活性化核導入単位は２細胞より大きい発育段階まで培養される。
ブタＣＩＣＭ細胞は細胞、組織及び臓器移植の分野、又はトランスジェニック
胎児もしくは子を含む胎児又は子の生産に有利に使用される。
【００５５】 本明細書に使用される胎児は、それが子宮中で形態を取った後の胎生動物の未
誕生の幼児である。ブタでは、胎児段階は受胎の３０日後から誕生まで起こる。
哺乳類は誕生から死亡までの成体である。
【００５６】 ＮＴ単位は少なくとも２〜４００細胞、好ましくは４〜１２８細胞のサイズ、
最も好ましくは少なくとも約５０細胞のサイズまで培養されることが好ましい。
【００５７】 核導入技術又は核移植技術は文献に知られており、また発明の背景に引用され
た文献の多くに記載されている。特に、Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｔｈｅｒｉｏｇｅ
ｎｏｌｏｇｙ，４３：１８１（１９９５）；Ｃｏｌｌａｓら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｏ
ｒｔ Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）；Ｋｅｅｆｅｒら，Ｂｉｏ
ｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５０：９３５−９３９（１９９４）；Ｓｉｍｓら，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：６１４３−６１４７（１９
９３）；ＷＯ９４／２６８８４；ＷＯ９４／２４２７４、及びＷＯ９０／０３４
３２（これらは参考として本明細書にそのまま含まれる）を参照のこと。又、米
国特許第４，９４４，３８４号及び同第５，０５７，４２０号はウシ核移植の操
作を記載している。
【００５８】 分化は周囲の構造又は起点の細胞とは異なる形質又は機能を有する細胞を表す
。分化ブタ細胞は早期胚段階を過ぎている細胞である。更に特別には、分化細胞
は少なくとも胚盤段階（ウシ胚形成の１０日目）後からの細胞である。分化細胞
は外胚葉、中胚葉又は内胚葉から誘導されてもよい。
【００５９】 ブタ細胞は公知の方法により得られてもよい。本発明に有益なブタ細胞として
、例えば、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノ
サイト、軟骨細胞、リンパ球（Ｂリンパ球及びＴリンパ球）、赤血球、マクロフ
ァージ、単球、単核細胞、繊維芽細胞、心筋細胞、及びその他の筋肉細胞等が挙
げられる。更に、核導入に使用されるブタ細胞は異なる臓器、例えば、皮膚、肺
、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、尿道及びその他の尿器官
等から得られてもよい。これらは好適なドナー細胞の適例である。好適なドナー
細胞、即ち、本発明に有益な細胞は生体のあらゆる細胞又は臓器から得られても
よい。これは全ての体細胞又は生殖細胞を含む。
【００６０】 繊維芽細胞は理想的な細胞型である。何とならば、それらは胎児及び成体ブタ
を多量に発育させることにより得られるからである。繊維芽細胞は若干分化され
ており、こうして、従来クローニング操作に使用するのには不充分な細胞型と考
えられていた。重要なことに、これらの細胞は迅速な倍加時間でｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで容易に増殖でき、遺伝子ターゲティング操作に使用するためにクローン増殖
し得る。再度、本発明は新規である。何とならば、分化細胞型が使用されるから
である。本発明は有利である。何とならば、細胞が容易に増殖され、遺伝的に修
飾され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで選択し得るからである。
【００６１】 卵母細胞の単離方法は当業界で公知である。本質的に、これは卵母細胞をブタ
の卵巣又は生殖道から単離することを含むであろう。ブタ卵母細胞の容易に利用
可能な源は屠場物質である。
【００６２】 遺伝子操作、核導入及びクローニングの如き技術の成功裏の使用のために、卵
母細胞は一般にｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟される必要があり、その後にこれらの細
胞が核導入のためのレシピエント細胞として使用されてもよく、又その後にそれ
らが精子細胞により受精されて胚に発育し得る。このプロセスは一般に未熟（前
期Ｉ）卵母細胞をブタ卵巣、例えば、屠場で得られたブタ卵巣から回収し、卵母
細胞が中期ＩＩ段階（これはブタ卵母細胞の場合には吸引後約３５−４５時間で
起こる）に達するまで卵母細胞を受精又は除核の前に熟成培地中で熟成すること
を必要とする。本発明の目的のために、この時間の期間は“熟成期間”として知
られている。時間期間の計算のために本明細書に使用される“吸引”は卵胞から
の未熟卵母細胞の吸引を表す。
【００６３】 更に、中期ＩＩ段階卵母細胞（これらはｉｎ ｖｉｖｏで熟成されていた）は
核導入技術に成功裏に使用されていた。例えば、成熟中期ＩＩ卵母細胞は発情の
開始後又はヒト柔毛膜性生殖腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）もしくは同様のホルモン
の注射後３５〜４８時間に非過剰排卵又は過剰排卵ウシ又は若雌ウシから手術に
より回収された。同様の操作がブタに使用し得る。
【００６４】 除核及び核導入時の卵母細胞の成熟の段階はＮＴ方法の成功に重要であると報
告されていた（例えば、Ｐｒａｔｈｅｒら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，
４８，１−８，１９９１を参照のこと）。一般に、成功裏の哺乳類胚クローニン
グ慣例はレシピエント卵母細胞として中期ＩＩ段階卵母細胞を使用する。何とな
らば、この段階では、卵母細胞が受精精子を処理するのと同様に卵母細胞が導入
核を処理するように充分に“活性化”でき、又は“活性化”されるからである。
家畜では、卵母細胞活性化期間が一般に吸引後約１６−５２時間、好ましくは約
３５−４５時間の範囲である。
【００６５】 例えば、未熟卵母細胞は熟成培地（ＭＡＴ−実施例中の表を参照のこと）中で
洗浄されてもよい。次いで卵母細胞がＭＡＴ１〜２ｍｌに入れられ、ｄｂ−ｃＡ
ＭＰ及びホルモンの存在下で２２時間培養される。卵母細胞が再度洗浄され、続
いて更に１８時間にわたってホルモンを含まないＭＡＴ中で培養される。
【００６６】 熟成期間（これは約３０時間から５０時間、好ましくは約４０時間までの範囲
である）後に、卵母細胞が除核されるであろう。除核の前に、卵母細胞が除去さ
れて、卵丘細胞の除去の前に１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼを含むＨＥＣＭ（
Ｓｅｓｈａｇｉｒｉ及びＢａｖｉｓｔｅｒ，１９８９）に入れられることが好ま
しいであろう。これは非常に微細な口径のピペットにより反復ピペット操作する
ことにより、又は素早く（約３分間）攪拌することにより行なわれてもよい。次
いでストリッピングされた卵母細胞が極性体についてスクリーニングされ、極性
体の存在により測定して選択された中期ＩＩ卵母細胞がその後に核導入に使用さ
れる。除核が続く。
【００６７】 除核は、例えば、米国特許第４，９９４，３８４号（これは参考として本明細
書に含まれる）に記載されているような既知の方法により行なわれてもよい。例
えば、中期ＩＩ卵母細胞は即時除核のために必要により７．５μｇ／ｍｌのサイ
トカラシンＢ（ＣＢ）及び０．１５Ｍ蔗糖を含むＨＥＣＭに入れられ、又は３９
℃で５％ＣＯ２で好適な培地、例えば、胚培地、例えば、ＮＣＳＵ２３（実施例
中の表を参照のこと）に入れられ、次いでその後に、好ましくは２４時間後以内
に、更に好ましくは直ちに除核されてもよい。
【００６８】 除核はミクロピペットを使用して微小手術により行なわれて極性体及び隣接細
胞質を除去してもよい。卵母細胞がスクリーニングされて成功裏に除核された卵
母細胞を同定する。このスクリーニングは卵母細胞をＮＣＳＵ２３中で２０分間
にわたって１μｇ／ｍｌの３３３４２ヘキスト色素で染色し、次いで１０秒未満
で紫外線のもとに卵母細胞を目視することにより行なわれてもよい。次いで成功
裏に除核された卵母細胞が好適な培地、例えば、ＨＥＣＭ及び０．１５Ｍ蔗糖に
入れられる。
【００６９】 本発明において、レシピエント卵母細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ熟成の開始後約３
０時間から約５０時間まで、更に好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ熟成の開始後約３
８時間から約４２時間までの範囲の時間、最も好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ熟成
の開始後約４０時間で除核されることが好ましいであろう。
【００７０】 次いで単一ブタ細胞がＮＴ単位を生成するのに使用される除核卵母細胞の卵黄
周囲腔に導入されるであろう。ブタ細胞及び除核卵母細胞は当業界で知られてい
る方法に従ってＮＴ単位を生成するのに使用されるであろう。例えば、細胞は電
気融合により融合されてもよい。電気融合は原形質膜の一時的破壊を生じるのに
充分である電気のパルスを与えることにより行なわれる。原形質膜のこの破壊は
非常に短い。何とならば、膜が迅速に再度形成するからである。こうして、二つ
の隣接膜が分解するように誘導され、再度形成後に脂質二層が混ざり合う場合、
小さいチャンネルが二つの細胞間に開放するであろう。このような小さい開口部
の熱力学的不安定性のために、二つの細胞が一つになるまでそれが拡大する。こ
のプロセスの更なる説明についてＰｒａｔｈｅｒらの米国特許第４，９９７，３
８４号（参考として本明細書にそのまま含まれる）が参考にされる。種々の電気
融合培地、例えば、蔗糖、マンニトール、ソルビトール及びリン酸緩衝液が使用
し得る。又、融合は融合誘導因子としてセンダイウイルスを使用して行い得る（
Ｇｒａｈａｍ，Ｗｉｓｔｅｒ Ｉｎｏｔ．Ｓｙｍｐ．Ｍｏｎｏｇｒ．，９，１９
，１９６９）。好ましい融合培地は０．２８Ｍマンニトール、１０μＭ ＣａＣ
ｌ２、１００μＭ ＭｇＳＯ４及び１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ７．０である。
【００７１】 又、或る場合（例えば、小さいドナー核を用いる）には、エレクトロポレーシ
ョン融合を使用するのではなく核を卵母細胞に直接に注入することが好ましいか
もしれない。このような技術が本明細書に参考としてそのまま含まれるＣｏｌｌ
ａｓ及びＢａｒｎｅｓ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６
７（１９９４）に開示されている。
【００７２】 融合チャンバーへの導入の前に、ＮＴ単位は２：１、１：２及び０：１の比で
融合培地に対しＨＥＣＭを含む融合培地に３インキュベーションにより徐々に暴
露されることが好ましい。ブタ細胞及び卵母細胞は５００μｍのチャンバー中で
卵母細胞熟成の開始後約４４時間で約３０μ秒にわたって９０−１２０Ｖの電気
パルスの適用により電気融合されることが好ましい。融合後に、得られた融合Ｎ
Ｔ単位が融合培地中で５分間維持され、次いで１０分間にわたってＨＥＣＭに入
れられ、次いで活性化までＮＣＳＵ２３＋７．５ｍｇ／ｍｌのＣＢに入れられる
。典型的には、活性化は直後に、典型的には２４時間後以内に、好ましくは約４
−９時間後に行なわれるであろう。
【００７３】 ＮＴ単位は既知の方法により活性化されてもよい。このような方法は、例えば
、ＮＴ単位を生理温度以下で、本質的に冷ショック、又は実際に低温ショックを
ＮＴ単位に適用することにより培養することを含む。これはＮＴ単位を室温（こ
れは胚が通常暴露される生理温度条件に対し冷たい）で培養することにより最も
都合よく行なわれるかもしれない。
【００７４】 好ましい実施態様において、ブタＮＴ単位は０．２８Ｍマンニトール、１００
μＭ ＣａＣｌ２、１００μＭ ＭｇＳＯ４及び１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ７．
０を含む活性化培地中で３０μ秒にわたって３０Ｖの電気パルスの適用により５
００μｍのチャンバー中で活性化される。１時間後に、１５Ｖの第二パルスが３
０μ秒にわたって適用される。パルス間で、ＮＴ単位は３９℃及び５％ＣＯ２で
ＣＢを含むＮＣＳＵ２３中で維持される。
【００７５】 又、活性化は既知の活性剤の適用により行なわれてもよい。例えば、受精中の
精子による卵母細胞の侵入又は精子細胞中に含まれた活性化因子がＮＴ単位を活
性化することができる。又、電気ショックもしくは化学ショックの如き処理、カ
ルシウムイオノファ、及びタンパク質キナーゼインヒビターが融合後にＮＴ胚を
活性化するのに使用されてもよい。
【００７６】 活性化後に、ＮＴ単位はＮＣＳＵ２３＋ＣＢ中で３〜４時間、その後にＣＢを
含まないＮＣＳＵ２３中で培養されることが好ましい。ＮＴ単位は活性化後のい
つでもレシピエント雌に導入し得る。
【００７７】 又、活性化ＮＴ単位はその後にＣＩＣＭ細胞及び細胞コロニーの発生まで好適
なｉｎ ｖｉｔｒｏ培地中で培養されてもよい。胚の培養及び熟成に適した培地
は当業界で公知である。既知の培地の例として、ハムＦ−１０＋１０％ウシ胎児
血清（ＦＣＳ）、組織培地−１９９（ＴＣＭ−１９９）＋１０％ウシ胎児血清、
タイロード−アルブミン−ラクテート−ピルベート（ＴＡＬＰ）、ダルベッコ食
塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、イーグル培地及びウィッテン培地が挙げられる。
卵母細胞の回収及び熟成に使用される最も普通の培地の一つはＴＣＭ−１９９、
及びウシ胎児血清、新生児血清、発情ウシ血清、子ヒツジ血清、ブタ血清、又は
去勢ウシ血清を含む１〜２０％血清補給物である。好ましい維持培地はアール塩
、１０％ウシ胎児血清、０．２ｍＭ Ｎａピルベート及び５０μｇ／ｍｌゲンタ
マイシンスルフェートを含むＴＣＭ−１９９を含む。更に好ましくは、使用され
る培地はＮＣＳＵ２３であり、活性化の２〜５日後に、ＮＴ単位が新しいＮＣＳ
Ｕ２３及び５〜１０％ウシ胎児血清中で培養される。上記のいずれもが又顆粒膜
細胞、卵管細胞、ＢＲＬ細胞及び子宮細胞並びにＳＴＯ細胞の如き種々の細胞型
との同時培養を伴ってもよい。
【００７８】 別の維持培地はＲｏｓｅｎｋｒａｎｓ，Ｊｒ．らの米国特許第５，０９６，８
２２号（これは参考として本明細書に含まれる）に記載されている。ＣＲ１と称
されるこの胚培地は胚を支持するのに必要な栄養物質を含む。
【００７９】 典型的には、ＮＴ単位はレシピエント雌に導入するのに、又はＣＩＣＭ細胞も
しくは細胞コロニーを生成するのに使用し得る細胞を得るのに適したサイズに達
するまで、ＮＴ単位はＮＣＳＵ２３＋５〜１０％ＦＣＳ中で培養される。これら
のＮＴ単位は少なくとも約２〜４００細胞、更に好ましくは約４〜１２８細胞、
最も好ましくは少なくとも約５０細胞まで培養されることが好ましいであろう。
培養は好適な条件、即ち、３８．５℃及び５％ＣＯ２で行なわれ、増殖を最適に
するために培地が典型的には約２−５日毎、好ましくは約３日毎に交換される。
【００８０】 本発明における胚導入方法及びレシピエント動物処理方法は胚導入工業に使用
される通常の操作である。同調導入が本発明の成功に重要であり、即ち、ＮＴ胚
の段階がレシピエント雌の発情サイクルと同調している。この利点及びレシピエ
ントを維持する方法がＷａｌｌら（“前核及び核の視覚化を可能にするために遠
心分離されたブタ卵子の開発”，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，３２：６４５−６
５１（１９８５））に説明されており、その内容が参考として本明細書に含まれ
る。
【００８１】 又、本発明は遺伝子操作されたブタ又はトランスジェニックブタをクローン化
するのに使用し得る。先に説明したように、本発明はトランスジェニック操作が
クローン増殖し得る分化細胞源で作業することにより簡素化し得る点で有利であ
る。特に、ドナー核に使用される分化細胞は挿入、除去又は修飾された所望のＤ
ＮＡ配列を有する。これらの遺伝的に変更された分化細胞がその後に除核卵母細
胞による核移植に使用される。
【００８２】 所望のＤＮＡ配列を哺乳類細胞から挿入、欠失又は修飾するためのあらゆる既
知の方法が核ドナーとして使用される分化細胞を変更するのに使用されてもよい
。これらの操作はＤＮＡ配列の全部又は一部を除去してもよく、又ＤＮＡ配列は
異種であってもよい。相同組換えの技術が含まれ、これは細胞ゲノム中の特定の
一つ以上の部位で一つ以上のＤＮＡ配列の挿入、欠失又は修飾を可能にする。
【００８３】 こうして、本発明は所望の遺伝子型を有する成体ブタを提供するのに使用し得
る。トランスジェニック動物又は遺伝子操作された動物、及びキメラ動物を含む
、判明した遺伝的優秀性又はその他の望ましい形質を有する成体ブタの操作が特
に有益である。こうして、本発明は単一性別の子の生産、並びに改良された食肉
生産、生殖形質及び疾患耐性を有するブタの生産を可能にするであろう。更に、
トランスジェニック胎児及び／またはキメラ胎児を含む、ＮＴ胎児からの細胞及
び組織がＣＩＣＭ細胞の使用に関して以下に記載されるような多種の疾患の治療
のために細胞、組織及び臓器移植に使用し得る。それ故、トランスジェニックブ
タは疾患のモデル、細胞及び臓器の異種移植、並びに医薬タンパク質の生成を含
む用途を有する。
【００８４】 ＣＩＣＭ細胞及び細胞系の生成について、所望のサイズのＮＴ単位が得られた
後に、細胞がそのゾーンから機械的に除去され、次いで使用される。これはＮＴ
単位を含み、典型的には少なくとも約５０細胞を含む細胞の塊を採取し、このよ
うな細胞を洗浄し、細胞をフィーダ層、例えば、照射された繊維芽細胞に塗布す
ることにより行なわれることが好ましい。典型的には、幹細胞又は細胞コロニー
を得るのに使用される細胞が少なくとも５０細胞のサイズであることが好ましい
培養ＮＴ単位の最も内部の部分から得られるであろう。しかしながら、それより
小さいか、又は大きい細胞数のＮＴ単位だけでなく、ＮＴ単位のその他の部分か
らの細胞がＥＳ細胞及び細胞コロニーを得るのに使用されてもよい。細胞はフィ
ーダ層中で好適な増殖培地、例えば、１０％ＦＣＳ並びに０．１ｍＭβ−メルカ
プトエタノール（シグマ）及びＬ−グルタミンを補給したαＭＥＭ中で維持され
る。増殖培地は増殖を最適にするのに必要な程度にしばしば、例えば、約２−３
日毎に交換される。
【００８５】 この培養方法はＣＩＣＭ細胞又は細胞系の形成をもたらす。当業者は特別なＣ
ＩＣＭ細胞の増殖を最適にするのに所望されるように培養条件を変化し得る。又
、遺伝子操作されたブタＣＩＣＭ細胞又はトランスジェニックブタＣＩＣＭ細胞
が本発明に従って生成し得る。即ち、上記方法が所望の一つ以上のＤＮＡ配列が
導入され、又は一つ以上の内因性ＤＮＡ配列の全部又は一部が除去又は修飾され
たＮＴ単位を生成するのに使用し得る。次いでこれらの遺伝子操作されたＮＴ単
位又はトランスジェニックＮＴ単位が遺伝子操作されたＣＩＣＭ細胞又はトラン
スジェニックＣＩＣＭ細胞を生成するのに使用し得る。
【００８６】 得られたＣＩＣＭ細胞及び細胞系は多くの治療用途及び診断用途を有する。最
も特別には、このようなＣＩＣＭ細胞は細胞移植療法に使用されてもよい。
【００８７】 これに関して、マウス胚幹（ＥＳ）細胞が殆どあらゆる細胞型、例えば、造血
幹細胞に分化することができることが知られている。それ故、本発明に従って生
成されたブタＣＩＣＭ細胞は同様の分化能を有するべきである。本発明のＣＩＣ
Ｍ細胞は既知の方法に従って所望の細胞型を得るように分化するように誘導され
るであろう。例えば、主題ブタＣＩＣＭ細胞はこのような細胞を分化培地中で細
胞分化を与える条件下で培養することにより造血幹細胞、神経細胞、筋肉細胞、
心筋細胞、肝臓細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿道細胞、神経細胞等に分化するよ
うに誘導されてもよい。ＣＩＣＭ細胞の分化をもたらす培地及び方法が好適な培
養条件と同様に当業界で知られている。
【００８８】 例えば、Ｐａｌａｃｉｏｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ
ＳＡ，９２：７５３０−７５３７（１９９５）は幹細胞をこのような細胞の凝集
物をレチノイン酸を欠いている懸濁培地中で最初に培養し、続いてレチノイン酸
を含む同培地中で培養し、続いて細胞付着を与える基質に細胞凝集物を移すこと
を含む誘導操作にかけることによる胚細胞系からの造血幹細胞の生成を教示して
いる。
【００８９】 更に、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．，６：
５４３−５５２（１９９４）は中でも造血細胞、筋肉細胞、心筋細胞、神経細胞
を含む種々の分化細胞型を生成するための胚幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化の方
法を開示している多数の文献を載せている総説文献である。
【００９０】 更に、Ｂａｉｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６８：３４２−３５７（１９９５
）は神経特性を有する神経細胞を生成するための胚幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分
化を教示している。これらの文献は胚細胞又は幹細胞から分化細胞を得るための
報告された方法の例示である。これらの文献及び特に胚幹細胞の分化方法に関す
るそれらの中の開示が参考として本明細書にそのまま含まれる。
【００９１】 こうして、既知の方法及び培地を使用して、当業者は遺伝子操作されたＣＩＣ
Ｍ細胞又はトランスジェニックＣＩＣＭ細胞を含む主題ＣＩＣＭ細胞を培養して
所望の分化細胞型、例えば、神経細胞、筋肉細胞、造血細胞等を得てもよい。
【００９２】 主題ＣＩＣＭ細胞はあらゆる所望の分化細胞型を得るのに使用し得る。このよ
うな分化細胞の治療使用は前例がない。例えば、造血幹細胞は骨髄移植を必要と
する医療措置に使用し得る。このような操作は多くの疾患、例えば、末期癌、例
えば、卵巣癌及び白血病だけでなく、免疫系を悪化する疾患、例えば、ＡＩＤＳ
を治療するのに使用される。造血幹細胞は、例えば、癌又はＡＩＤＳ患者の成体
体細胞、例えば、上皮細胞又はリンパ球を除核卵母細胞と融合し、上記のように
ＣＩＣＭ細胞を得、造血幹細胞が得られるまでこのような細胞を分化を有利にす
る条件下で培養することにより得られる。このような造血細胞は癌及びＡＩＤＳ
を含む疾患の治療に使用し得る。
【００９３】 本発明は欠陥遺伝子、例えば、欠陥免疫系遺伝子を置換し、又は治療上有益な
タンパク質、例えば、成長因子、リンホカイン、サイトカイン、酵素等の発現を
もたらす遺伝子を導入するのに使用し得る。
【００９４】 主題ＣＩＣＭ細胞に導入し得るＤＮＡ配列として、例えば、上皮成長因子、塩
基性繊維芽細胞成長因子、膠細胞由来神経栄養成長因子、インスリン様成長因子
（Ｉ及びＩＩ）、ノイロトロピン−３、ノイロトロピン−４／５、毛様体神経栄
養因子、ＡＦＴ−１、サイトカイン（インターロイキン、インターフェロン、コ
ロニー刺激因子、腫瘍壊死因子（α及びβ）、等）、治療酵素等をコードする配
列が挙げられる。
【００９５】 本発明はヒト疾患の治療におけるブタ細胞の使用を含む。こうして、ブタＣＩ
ＣＭ細胞、ＮＴ胎児並びにＮＴ及びキメラ子（トランスジェニック又は非トラン
スジェニック）は、細胞、組織又は臓器移植が認められるヒト症状の治療に使用
されてもよい。一般に、本発明のＣＩＣＭ細胞、胎児及び子は同種内（オートロ
ガス、同系間又は同種移植）又は種間（異種移植）で使用し得る。例えば、ブタ
ＮＴ胎児からの脳細胞がパーキンソン病を治療するのに使用されてもよい。
【００９６】 又、主題ＣＩＣＭ細胞は、特に早期発育の調節に関係する遺伝子の研究のため
に、分化のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして使用されてもよい。又、主題ＣＩＣＭ
細胞を使用する分化細胞組織及び臓器は薬物研究に使用されてもよい。 更に、主題ＣＩＣＭ細胞はその他のＣＩＣＭ細胞及び細胞コロニーの生成のた
めの核ドナーとして使用されてもよい。 本発明を更に明記するために、以下の実施例が示される。
【００９７】 （実施例） ブタクローニングのための物質及び方法
【００９８】
【表２】
【００９９】 １８ミリオーム、ＲＯ、ＤＩ水を使用する。 ｐＨは７．４であるべきであり、重量オスモル濃度をチェックし、記録する。 真空濾過（０．２２μｍ）により滅菌し、びんに日付けし、イニシャルを付ける
。 ４℃で貯蔵し、１０日以内に使用する。
【０１００】
【表３】
【０１０１】＊＊ ６０％シロップ＊ ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏを最後に徐々に添加して沈殿を防止する。 １８ミリオーム、ＲＯ、ＤＩ水を使用する。 ｐＨを７．４に調節し、重量オスモル濃度をチェックし、記録する。 真空濾過（０．２２μｍ）により滅菌し、びんに日付けし、イニシャルを付ける
。 ４℃で貯蔵し、１０日以内に使用する。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】 １８ミリオーム、ＲＯ、ＤＩ水を使用する。 ｐＨは７．４であるべきであり、重量オスモル濃度をチェックし、記録する。 赤色のナルゲンフィルターを使用して真空濾過（０．２２μｍ）により滅菌し、
びんに日付けし、イニシャルを付ける。 ４℃で貯蔵し、１０日以内に使用する。 注：ＢＳＡ型が重要である。シグマＢＳＡカタログ＃Ａ−７９０６を使用するこ
とが好ましい。又、ペニシリンＧ／ストレプトマイシンは任意である。
【０１０４】 培地調製 熟成培地（ＭＡＴ）： ｍＮＣＳＵ３７ １８．０ｍｌ ブタ卵胞液（ｐＦＦ）２．０ｍｌ 希釈β−メルカプトエタノール（１０μｌのβ−メルカプトエタノールを９９０
μｌのｍＮＣＳＵ３７に希釈する；最終濃度５０μＭ）７．０μｌ システイン０．００２ｇ（最終濃度０．６ｍＭ） ＥＧＦ原液２０μｌ（１０ｎｇ／μｌのＥＧＦ原液からの上皮成長因子） ０．２２μｍで１０ｍｌの培養管に濾過する。日付け及びイニシャルで標識し、
ＣＯ２インキュベーター中で平衡にする。
【０１０５】 ブタ卵胞液調製 卵胞液を青春期前の若雌ブタの３−６ｍｍの卵胞から回収し、卵母細胞及び卵
胞を５−１０分間にわたって沈降させる。ｐＦＦを吸引し、１５ｍｌの円錐管に
移す。４℃で３０００ｒｐｍで３０分間にわたってソーバルで遠心分離する。管
を除去し、ペレットの上のｐＦＦを回収し、溜め、０．８μｍ、次いで０．４５
μｍのフィルター（ステリベックス）で濾過する。１．５ｍｌの滅菌微小遠心分
離管にアリコートとし、使用まで−２０℃で凍結する。
【０１０６】 上皮成長因子原液（ＥＧＦ） ＥＧＦ１００μｇ ０．１％のＢＳＡを含むｍＮＣＳＵ３７ １０ｍｌ 良く混合する。２５μｌのアリコートとし、−２０℃で凍結する。
【０１０７】 ＭＡＴのためのウマ柔毛膜性生殖腺刺激ホルモン及びヒト柔毛膜性生殖腺刺激ホ
ルモン原液（ＰＭＳＧ／ｈＣＧ） ＥＣＧ（ＰＭＳＧ６０００；インターベット社、ミルズボロ；ＤＥ１９９６６）
ｄＨ２Ｏ ３ｍｌを添加することにより６０００ＩＵを２０００ＩＵ／ｍｌに
希釈する。 ｈＣＧ（チョルロン；インターベット社） ｄＨ２Ｏ ５ｍｌを添加することにより１０，０００ＩＵを２０００ＩＵ／ｍ
ｌに希釈する。 ＰＭＳＧ１ｍｌ及びｈＣＧ１ｍｌを混合して夫々のホルモン１０００ＩＵ／ｍｌ
を得る。アリコート５０μｌをつくり、−２０℃で凍結する。同様に残りのＰＭ
ＳＧ及びｈＣＧ原液を凍結する。
【０１０８】 ｄｂ−ｃＡＭＰ１００ｍＭ原液 ｄｂ−ｃＡＭＰ２５ｍｇ（デシケーター中で−２０℃で貯蔵した） ｄＨ２Ｏ ０．５０９ｍｌ 良く混合する。アリコート５０μｌをつくり、−２０℃で凍結する。
【０１０９】 融合培地 ０．２８Ｍマンニトール １０μＭ ＣａＣｌ２ １００μＭ ＭｇＳＯ４ １０ｍＭヒスチジン ｐＨ７．０に調節する。
【０１１０】 活性化培地 ０．２８Ｍマンニトール １０μＭ ＣａＣｌ２ １００μＭ ＭｇＳＯ４ １０ｍＭヒスチジン ｐＨ７．０に調節する。
【０１１１】 抗生物質／抗真菌剤（Ａｂ／Ａｍ） １００Ｕ／ｌペニシリン、１００μｇ／ｌストレプトマイシン及び０．２５μｇ
／ｌアンホテリシンＢ、（ギブコ＃１５２４０−０６２） アリコート１０ｍｌを食塩水１リットルに添加する。 １０μｌを精液１ｍｌに添加する。
【０１１２】 卵母細胞−卵丘複合体（ＯＣＣ）回収 卵巣を２５℃で実験室に輸送し、直ちに抗生物質／抗真菌剤（１０ｍｌ／Ｌ；
ギブコ＃６００−５２４０ｇ）を含む０．９％食塩水で洗浄する。１８ｇのニー
ドル及び真空系（ＧＥＭＬウシ系）に連結されたファルコン管５０ｍｌを使用し
て卵胞３−６ｍｍを吸引する。管が満たされた後、ＯＣＣを５−１０分間にわた
って沈降させる。卵胞液（ｐＦＦ）を吸引し、必要により培養系中の使用のため
に貯蓄する（下記のｐＦＦ調製プロトコルを参照のこと）。
【０１１３】 ＯＣＣ洗浄 ＯＣＣをＨｅｐｅｓ−ＰＶＡ２０ｍｌ中で再度懸濁させ、沈降させる。２回繰
り返す。最後の洗浄後に、ＯＣＣをグリッド皿に移し、培養のために選択する。
選択したＯＣＣをＨｅｐｅｓ−ＰＶＡの６０ｍｍの皿中で２回洗浄する。全ての
吸引及び卵母細胞回収を室温（約２５℃）で行う。
【０１１４】 ｉｎ ｖｉｔｒｏ熟成（ＩＶＭ） ＭＡＴ中で３回洗浄した後、５０ＯＣＣを４ウェルＮｕｎｃプレート中のＭＡ
Ｔ０．５ｍｌに移す（内部区画は１−２ｍｌのＭＡＴ又はｍＮＣＳＩ３７を含む
）。１００ｍＭ ｄｂ−ｃＡＭＰ（水中）５μｌをＯＣＣの夫々のウェルに添加
する。ホルモンとともに２２時間培養する。ホルモンを含まない新しいＭＡＴで
３回洗浄し、新しいＭＡＴの０．５ｍｌのウェルに移す（約５０卵母細胞／ウェ
ル）。３９℃で５．０％ＣＯ２雰囲気中で合計約４０時間にわたってＭＡＴ中で
２２時間インキュベートする。
【０１１５】 ブタ胚細胞及び成体繊維芽細胞の一次培養物の単離 ブタ繊維芽細胞の一次培養物を受精後３０〜１１４日、好ましくは３５日のブ
タ胎児から得る。頭部、肝臓、心臓及び消化道を無菌除去し、胎児を細断し、３
７℃で前もって温めたトリプシンＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン／０．０
２％ＥＤＴＡ；ギブコ、グランド・アイランド、ＮＹ）中で３０分間にわたって
インキュベートする。繊維芽細胞を組織培養皿に塗布し、１０％ウシ胎児血清（
ＦＣＳ）（ハイクロン、ローゲン、ＵＴ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）及
びストレプトマイシン（５０μｌ／ｍｌ）を補給したα−ＭＥＭ培地（バイオウ
ィテッカー、ウォーカーズビル、ＭＤ）を含む繊維芽細胞増殖培地（ＦＧＭ）中
で培養する。繊維芽細胞を増殖し、保湿雰囲気中で５％ＣＯ２で空気中で３７℃
で維持する。
【０１１６】 成体繊維芽細胞をブタの肺及び皮膚から単離する。細断した肺組織を１０℃で
トリプシンＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ；ギブコ
、グランド・アイランド、ＮＹ）中で一夜インキュベートする。翌日組織及び解
離した細胞を３７℃で前もって温めたトリプシンＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリ
プシン／０．０２％ＥＤＴＡ；ギブコ、グランド・アイランド、ＮＹ）中で１時
間にわたってインキュベートし、３回連続の洗浄及びトリプシンインキュベーシ
ョン（１時間）により処理する。繊維芽細胞を組織培養皿に塗布し、１０％ウシ
胎児血清（ＦＣＳ）（ハイクロン、ローゲン、ＵＴ）、ペニシリン（１００ＩＵ
／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｌ／ｍｌ）を補給したα−ＭＥＭ培地
（バイオウィテッカー、ウォーカーズビル、ＭＤ）中で培養する。繊維芽細胞を
発育中の実際にいずれかの時点（ほぼ胚盤段階後から動物の成体寿命中の範囲）
（受精後９〜１０日目〜年齢５才以上までのブタ）で単離することができる。
【０１１７】 核導入のための繊維芽細胞の調製 ドナー核として使用し得る胎児繊維芽細胞の例は以下のとおりである。 １．いずれか一つの細胞段階と同調しておらず、又は血清飢餓され、もしくは
静止状態である増殖している繊維芽細胞が核ドナーとして利用することができる
。上記培養からの細胞を１０分間にわたってトリプシンＥＤＴＡで処理し、１０
０％ウシ胎児血清中で３回洗浄する。次いで単細胞繊維芽細胞をＨｂＴ培地（Ｂ
ａｖｉｓｔｅｒら，１９８３）の微量操作液滴に入れる。これを除核ブタ卵母細
胞への繊維芽細胞の導入の１０〜３０分前に行う。ＣＭＶプロモーター及び緑色
蛍光タンパク質遺伝子（第９継代）を有する増殖しているトランスジェニック繊
維芽細胞を使用してＮＴ単位を生成することが好ましい。
【０１１８】 ２．第二の方法により、繊維芽細胞を細胞サイクルのＧ１又はＧ０に同調させ
る。繊維芽細胞を集密まで増殖させる。次いでＦＧＭ中のウシ胎児血清の濃度を
４日連続にわたって半分にする（０日目＝１０％、１日目＝５％、２日目＝２．
５％、３日目＝１．２５％、４日目＝０．６２５％）。５日目に、細胞をトリプ
シンＥＤＴＡで１０分間処理し、１００％ウシ胎児血清中で３回洗浄する。次い
で単細胞繊維芽細胞をＨｂＴ培地の微量操作液滴に入れる。これを除核ブタ卵母
細胞への繊維芽細胞の導入の前の１５分以内に行う。
【０１１９】 卵丘細胞の除去 熟成期間（これは約３０時間から５０時間、好ましくは約４０時間までの範囲
である）後に、卵母細胞を除核する。除核の前に、卵母細胞を除去し、卵丘細胞
の除去の前に１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼを含むＨＥＣＭ（Ｓｅｓｈａｇｉ
ｒｉ及びＢａｖｉｓｔｅｒ，１９８９）に入れることが好ましい。これは非常に
微細な口径のピペットにより反復ピペット操作により又は素早く（約３分間）攪
拌することにより行ってもよい。次いでストリッピングされた卵母細胞を極性体
について選択し、極性体の存在により測定して選択された中期ＩＩ卵母細胞をそ
の後に核導入に使用する。除核が続く。
【０１２０】 除核、繊維芽細胞の導入及び融合 卵丘を含まないブタ卵母細胞を熟成の約４０時間後（ｈｐｍ）に斜端ミクロピ
ペットで除核する。この操作がＰｒａｔｈｅｒら，１９８９により既に記載され
ており、その内容が参考として本明細書に含まれる。卵母細胞をＨＥＣＭ ＨＥ
ＰＥＳ及び７．５ｍｇ／ｍｌＣＢ＋０．１５Ｍ蔗糖中で除核する。卵母細胞をＮ
ＣＳＵ２３培地＋ヘキスト３３４２（３μｇ／ｍｌ；シグマ）中で２０分以上イ
ンキュベートした後に、除核を確認する。次いで斜端ミクロピペットを使用して
個々のドナー細胞（繊維芽細胞）をＨＥＣＭ ＨＥＰＥＳ＋０．１５Ｍ蔗糖及び
ＣＢ（７．５ｍｇ／ｍｌ）中のレシピエント卵母細胞の卵黄周囲腔に入れる。電
気融合技術を使用してブタ卵母細胞細胞質及びドナー核（ＮＴ単位）を一緒に融
合する。ＮＴ単位を次第に増加する量の融合培地（２：１、１：２及び０：１の
ＨＥＣＭ ＨＥＰＥＳ対融合培地の比）中で３回洗浄する。融合チャンバーは５
００μｍのギャップで平行に走っている直径２００μｍの２本のワイヤからなる
。夫々のＮＴ単位を、融合される膜が２本のワイヤに平行となるように手動で配
列する。３０μ秒にわたって１００Ｖからなる一つの融合パルスを電気融合チャ
ンバー中でＮＴ単位に適用する。これは４４〜４５ｈｐｍで起こる。ＮＴ単位を
５分間にわたって融合培地中でインキュベートし、次いでＨＥＣＭ ＨＥＰＥＳ
中で１０分間インキュベートする。ＮＴ単位を４７〜４９ｈｐｍまでＮＣＳＵ２
３＋ＣＢ培地にもどす。
【０１２１】 活性化 活性化後４７〜４９時間で使用し得る活性化の方法の例は以下のとおりである。
１．単一活性化パルス。ＮＴ単位をＮＣＳＵ２３＋ＣＢから除去し、活性化培
地中で３回洗浄する。平衡後に、ＮＴ単位を融合操作に記載された活性化培地を
入れた融合チャンバー（５００μｍのギャップ）に入れる。３０μ秒にわたって
３０Ｖのパルスを適用する。次いでＮＴ単位を直ちにＨＥＣＭ ＨＥＰＥＳ中で
３回洗浄し、胚導入又はｉｎ ｖｉｔｒｏ培養（３９℃、ＮＣＳＵ２３中５％Ｃ
Ｏ２）まで２時間以上にわたってＮＣＳＵ２３中で培養する（３９℃、５％ＣＯ
２）。培養した場合、ＮＴ単位を培養の２日目に新しいＮＣＳＵ２３＋５％ウシ
胎児血清に入れる。表１中の結果は、卵母細胞がこの操作を使用して活性化でき
、それらが発育能を有することを示す。
【０１２２】 ２．二つの活性化パルス。ＮＴ単位をＮＣＳＵ２３＋ＣＢから除去し、活性化
培地中で３回洗浄する。平衡後に、ＮＴ単位を融合操作に記載された活性化培地
を入れた融合チャンバー（５００μｍのギャップ）に入れる。３０μ秒にわたっ
て３０Ｖのパルスを適用する。次いでＮＴ単位を直ちにＨＥＣＭ ＨＥＰＥＳ中
で３回洗浄し、ＮＣＳＵ２３＋ＣＢ培地にもどし、１時間後の次の電気パルスま
でこの中で３９℃、５％ＣＯ２で培養する。１時間後に、今回活性化培地平衡工
程を繰り返し、３０μ秒にわたって１５Ｖのパルスを適用する。次いでＮＴ単位
を直ちにＨＥＣＭ ＨＥＰＥＳ中で３回洗浄し、ＮＣＳＵ２３＋ＣＢ培地にもど
し、この培地中で３９℃、５％ＣＯ２で２〜６時間以上培養する。次いで１に上
記したのと同じ操作を使用してＮＴ単位を培養する。表１中の結果は、卵母細胞
がこの操作を使用して活性化でき、それらが発育能を有することを示す。同じこ
とが核導入胚について言える。４胚盤胞段階ＮＴ単位が２パルス活性化操作で生
成された。
【０１２３】 ３．精子因子。Ｓｔｉｃｅ及びＲｏｂｌ（Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，
２５：２７２−２８０（１９９０））（その内容が参考として本明細書に含まれ
る）により哺乳類精子で最初に記載された、この因子は卵母細胞中で活性化を生
じる。ブタ精子細胞からの精子因子単離の方法及びマイクロインジェクションは
Ｆｉｓｓｏｒｅら（Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，４６：１７６−１８９（
１９９７））に記載されており、その内容が参考として本明細書に含まれる。Ｎ
Ｔ単位をＮＣＳＵ２３＋ＣＢから除去し、除核及び繊維芽細胞導入について上記
された微量操作プレートに入れる。精子因子を入れたマイクロインジェクション
・ニードル（１μｍの開口部）を使用して、卵母細胞がＮＴ単位の細胞質への因
子の送出後に活性化を受ける。マイクロインジェクション後に、ＮＴ胚をＨＥＣ
Ｍ ＨＥＰＥＳ中で洗浄し、ＮＣＳＵ２３＋ＣＢ中に２〜６時間保ち、その後に
胚導入までＮＣＳＵ２３中に保つ。
【０１２４】
【表５】
【０１２５】 胚導入 ブタ中の胚１細胞胚導入の方法は公知である（例えば、Ｐｉｎｋｅｒｔら，１
９９３を参照のこと、その内容が参考として本明細書に含まれる）。簡単に言え
ば、２０〜３０ＮＴ単位を飼育若雌ブタ又は非飼育若雌ブタの卵管に同調導入す
る。妊娠２９日後に、核導入胎児（トランスジェニック又は非トランスジェニッ
ク）をレシピエント若雌ブタから回収することができる。又、胎児を出産させ（
妊娠１１４日）、クローン化ブタ子を生産する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 9/00 9/00 13/02 13/02 17/00 17/00 19/00 19/00 25/00 25/00 25/16 25/16 25/28 25/28 31/18 31/18 35/00 35/00 Ａ６１Ｋ 35/12 Ｃ１２Ｎ 5/10 37/02 15/09 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 35/12 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 スタイス スティーヴン エル アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01007ベルチャータウン アムハースト ロード 468 (72)発明者 ローブル ジェームズ エム アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01007ベルチャータウン オールド エン フィールド 196 (72)発明者 シーベリー ジョージ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01002アムハースト ヴィレッジ パーク 166 (72)発明者 ゴルーエク ポール アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01007ベルチャータウン ダイアン ドラ イヴ ８−＃３ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA10 AA20 DA02 GA03 GA08 GA09 GA11 GA12 GA14 GA18 GA30 4B065 AA90X AA90Y AA99Y AB01 AB04 AB10 AC20 BA01 BA08 BA30 BB01 BC01 BC50 CA24 CA43 CA44 CA60 4C084 AA06 AA13 CA21 CA53 ZA022 ZA162 ZA362 ZA662 ZA752 ZA812 ZA892 ZA942 ZA962 ZB262 ZC352 ZC552 4C087 AA01 AA02 AA03 BB61 BB63 BB65 ZA02 ZA16 ZA36 ZA66 ZA75 ZA81 ZA89 ZA94 ZA96 ZB26 ZC35 ZC55

Claims (78)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ｉ）所望の分化ブタ細胞又は細胞核を核導入（ＮＴ）単位の形成に適した条
    件下で除核ブタ卵母細胞に挿入し、 （ｉｉ）得られた核導入単位を活性化し、そして （ｉｉｉ）前記培養ＮＴ単位を宿主哺乳類に導入して、ＮＴ単位を胎児に発達
    させることを特徴とするブタのクローニング方法。
  2. 【請求項２】 胎児を子に発育させることを更に含む請求の範囲第１項記
    載の方法。
  3. 【請求項３】 所望のＤＮＡを前記分化ブタ細胞又は細胞核中で挿入、除
    去又は修飾して、遺伝的に変化したＮＴ単位の生成をもたらす請求の範囲第１項
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 胎児を子に発育させることを更に含む請求の範囲第３項記
    載の方法。
  5. 【請求項５】 ２細胞より大きい発育段階まで前記活性化核導入単位を培
    養することを更に含む請求の範囲第１項記載の方法。
  6. 【請求項６】 分化ブタ細胞又は細胞核が中胚葉に由来する請求の範囲第
    １項記載の方法。
  7. 【請求項７】 分化ブタ細胞又は細胞核が外胚葉に由来する請求の範囲第
    １項記載の方法。
  8. 【請求項８】 分化ブタ細胞又は細胞核が内胚葉に由来する請求の範囲第
    １項記載の方法。
  9. 【請求項９】 分化ブタ細胞又は細胞核が繊維芽細胞又は細胞核である請
    求の範囲第１項記載の方法。
  10. 【請求項１０】 分化ブタ細胞又は細胞核が成体細胞又は細胞核である請
    求の範囲第１項記載の方法。
  11. 【請求項１１】 分化ブタ細胞又は細胞核が胚又は胎児の細胞又は細胞核
    である請求の範囲第１項記載の方法。
  12. 【請求項１２】 除核卵母細胞を除核の前に成熟させる請求の範囲第１項
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】 融合核導入単位を二つの電気パルスへの暴露により活性
    化する請求の範囲第１項記載の方法。
  14. 【請求項１４】 融合核導入単位を単一電気パルスへの暴露により活性化
    する請求の範囲第１項記載の方法。
  15. 【請求項１５】 融合核導入単位を精子細胞由来の少なくとも一種の活性
    化因子への暴露により活性化する請求の範囲第１項記載の方法。
  16. 【請求項１６】 マイクロインジェクションを使用して異種ＤＮＡを挿入
    する請求の範囲第３項記載の方法。
  17. 【請求項１７】 エレクトロポレーションを使用して異種ＤＮＡを挿入す
    る請求の範囲第３項記載の方法。
  18. 【請求項１８】 請求の範囲第１項記載の方法により得られる胎児。
  19. 【請求項１９】 請求の範囲第２項記載の方法により得られる子。
  20. 【請求項２０】 請求の範囲第１９項記載の子の子孫。
  21. 【請求項２１】 請求の範囲第３項記載の方法により得られるトランスジ
    ェニック胎児。
  22. 【請求項２２】 請求の範囲第４項記載の方法により得られるトランスジ
    ェニック子。
  23. 【請求項２３】 請求の範囲第２２項記載の子の子孫。
  24. 【請求項２４】 クローン化ＮＴ単位を受精胚と組み合わせてキメラ胚を
    生成することを更に含む請求の範囲第１項記載の方法。
  25. 【請求項２５】 胎児を子に生育することを更に含む請求の範囲第２４項
    記載の方法。
  26. 【請求項２６】 請求の範囲第２４項記載の方法により得られる胎児。
  27. 【請求項２７】 請求の範囲第２５項記載の方法により得られる子。
  28. 【請求項２８】 請求の範囲第２７項記載の哺乳類の子孫。
  29. 【請求項２９】 （ｉ）所望の分化ブタ細胞又は細胞核を核導入（ＮＴ）単位の形成に適した条
    件下で除核ブタ卵母細胞に挿入し、 （ｉｉ）得られた核導入単位を活性化し、そして （ｉｉｉ）前記培養ＮＴ単位から得られた細胞を培養してブタＣＩＣＭ細胞系
    を得ることを特徴とするＣＩＣＭ細胞系の生成方法。
  30. 【請求項３０】 ２細胞より大きい発育段階まで前記活性化核導入単位を
    培養することを含む請求の範囲第２９項記載の方法。
  31. 【請求項３１】 請求の範囲第２９項記載の方法により得られるＣＩＣＭ
    細胞系。
  32. 【請求項３２】 所望のＤＮＡを前記分化ブタ細胞又は細胞核中で挿入、
    除去又は修飾し、それにより遺伝的に変化したＮＴ単位の生成をもたらす請求の
    範囲第２９項記載の方法。
  33. 【請求項３３】 請求の範囲第３２項に従って得られるトランスジェニッ
    クＣＩＣＭ細胞系。
  34. 【請求項３４】 得られたＣＩＣＭ細胞系を分化するように誘導する請求
    の範囲第２９項記載の方法。
  35. 【請求項３５】 請求の範囲第３４項記載の方法により得られる分化細胞
    。
  36. 【請求項３６】 細胞移植治療を要するヒト患者に請求の範囲第３５項記
    載の異種間分化細胞を投与することを特徴とする治療方法。
  37. 【請求項３７】 前記細胞移植治療を行ってパーキンソン病、ハンチント
    ン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄欠陥又は損傷、多発性硬化症、筋ジスト
    ロフィー、膵のう胞性繊維炎、肝臓疾患、糖尿病、心臓疾患、軟骨欠陥又は損傷
    、火傷、足潰瘍、血管疾患、尿道疾患、ＡＩＤＳ及び癌からなる群から選ばれた
    疾患又は症状を治療する請求の範囲第３６項記載の方法。
  38. 【請求項３８】 細胞移植治療を要するヒト患者に請求の範囲第１８項記
    載の胎児から得られた異種間細胞を投与することを特徴とする治療方法。
  39. 【請求項３９】 前記細胞移植治療を行ってパーキンソン病、ハンチント
    ン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄欠陥又は損傷、多発性硬化症、筋ジスト
    ロフィー、膵のう胞性繊維炎、肝臓疾患、糖尿病、心臓疾患、軟骨欠陥又は損傷
    、火傷、足潰瘍、血管疾患、尿道疾患、ＡＩＤＳ及び癌からなる群から選ばれた
    疾患又は症状を治療する請求の範囲第３８項記載の方法。
  40. 【請求項４０】 細胞移植治療を要するヒト患者に請求の範囲第１９項記
    載の子から得られた異種間細胞を投与することを特徴とする治療方法。
  41. 【請求項４１】 前記細胞移植治療を行ってパーキンソン病、ハンチント
    ン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄欠陥又は損傷、多発性硬化症、筋ジスト
    ロフィー、膵のう胞性繊維炎、肝臓疾患、糖尿病、心臓疾患、軟骨欠陥又は損傷
    、火傷、足潰瘍、血管疾患、尿道疾患、ＡＩＤＳ及び癌からなる群から選ばれた
    疾患又は症状を治療する請求の範囲第４０項記載の方法。
  42. 【請求項４２】 細胞移植治療を要するヒト患者に請求の範囲第２１項記
    載のトランスジェニック胎児から得られた異種間トランスジェニック細胞を投与
    することを特徴とする治療方法。
  43. 【請求項４３】 前記細胞移植治療を行ってパーキンソン病、ハンチント
    ン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄欠陥又は損傷、多発性硬化症、筋ジスト
    ロフィー、膵のう胞性繊維炎、肝臓疾患、糖尿病、心臓疾患、軟骨欠陥又は損傷
    、火傷、足潰瘍、血管疾患、尿道疾患、ＡＩＤＳ及び癌からなる群から選ばれた
    疾患又は症状を治療する請求の範囲第４２項記載の方法。
  44. 【請求項４４】 細胞移植治療を要するヒト患者に請求の範囲第２２項記
    載のトランスジェニック子から得られた異種間トランスジェニック細胞を投与す
    ることを特徴とする治療方法。
  45. 【請求項４５】 前記細胞移植治療を行ってパーキンソン病、ハンチント
    ン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄欠陥又は損傷、多発性硬化症、筋ジスト
    ロフィー、膵のう胞性繊維炎、肝臓疾患、糖尿病、心臓疾患、軟骨欠陥又は損傷
    、火傷、足潰瘍、血管疾患、尿道疾患、ＡＩＤＳ及び癌からなる群から選ばれた
    疾患又は症状を治療する請求の範囲第４４項記載の方法。
  46. 【請求項４６】 請求の範囲第２２項記載のトランスジェニック子により
    発現される医薬上活性なタンパク質を単離することを特徴とする医薬上活性なタ
    ンパク質の生成方法。
  47. 【請求項４７】 クローン化ＮＴ単位を受精胚と組み合わせてキメラを生
    成することを更に含む請求の範囲第２９項記載の方法。
  48. 【請求項４８】 キメラＣＩＣＭ細胞系をキメラ胚に発育させることを更
    に含む請求の範囲第４７項記載の方法。
  49. 【請求項４９】 請求の範囲第４８項に従って得られるキメラ胚。
  50. 【請求項５０】 キメラ胚をキメラ胎児に発育させることを更に含む請求
    の範囲第４８項記載の方法。
  51. 【請求項５１】 請求の範囲第５０項に従って得られるキメラ胎児。
  52. 【請求項５２】 キメラ胎児をキメラ子に発育させることを更に含む請求
    の範囲第５０項記載の方法。
  53. 【請求項５３】 請求の範囲第５２項に従って得られるキメラ子。
  54. 【請求項５４】 所望のＤＮＡを前記分化ブタ細胞又は細胞核中で挿入、
    除去又は修飾し、それにより遺伝的に変更したＮＴ単位の生成をもたらす請求の
    範囲第４７項記載の方法。
  55. 【請求項５５】 キメラＣＩＣＭ細胞系をキメラ胚に生育することを更に
    含む請求の範囲第５４項記載の方法。
  56. 【請求項５６】 請求の範囲第５５項に従って得られるキメラ胚。
  57. 【請求項５７】 キメラ胚をキメラ胎児に発育させることを更に含む請求
    の範囲第５５項記載の方法。
  58. 【請求項５８】 請求の範囲第５７項に従って得られるキメラ胎児。
  59. 【請求項５９】 キメラ胎児をキメラ子に発育させることを更に含む請求
    の範囲第５７項記載の方法。
  60. 【請求項６０】 請求の範囲第５９項に従って得られるキメラ子。
  61. 【請求項６１】 （ｉ）所望の分化ブタＣＩＣＭ細胞又は細胞核を核導入（ＮＴ）単位の形成に
    適した条件下で除核ブタ卵母細胞に挿入し、 （ｉｉ）得られた核導入単位を活性化し、そして （ｉｉｉ）前記培養ＮＴ単位を宿主哺乳類に導入して、ＮＴ単位を胎児に発達
    させることを特徴とするブタのクローニング方法。
  62. 【請求項６２】 ２細胞より大きい発育段階まで前記活性化核導入単位を
    培養することを含む請求の範囲第６１項記載の方法。
  63. 【請求項６３】 胎児を子に発育させることを更に含む請求の範囲第６１
    項記載の方法。
  64. 【請求項６４】 請求の範囲第６１項記載の方法により得られる胎児。
  65. 【請求項６５】 請求の範囲第６２項記載の方法により得られる子。
  66. 【請求項６６】 請求の範囲第１９項記載の子から得られる臓器異種移植
    片としての使用のための臓器。
  67. 【請求項６７】 請求の範囲第２２項記載の子から得られる臓器異種移植
    片としての使用のための臓器。
  68. 【請求項６８】 請求の範囲第２７項記載の子から得られる臓器異種移植
    片としての使用のための臓器。
  69. 【請求項６９】 請求の範囲第６０項記載の子から得られる臓器異種移植
    片としての使用のための臓器。
  70. 【請求項７０】 請求の範囲第６５項記載の子から得られる臓器異種移植
    片としての使用のための臓器。
  71. 【請求項７１】 農業上有益な形質を含む請求の範囲第１９項記載の子。
  72. 【請求項７２】 農業上有益な形質を含む請求の範囲第２２項記載の子。
  73. 【請求項７３】 農業上有益な形質を含む請求の範囲第２７項記載の子。
  74. 【請求項７４】 農業上有益な形質を含む請求の範囲第６０項記載の子。
  75. 【請求項７５】 農業上有益な形質を含む請求の範囲第６５項記載の子。
  76. 【請求項７６】 トランスジェニックブタ。
  77. 【請求項７７】 請求の範囲第７６項記載の子から得られる臓器異種移植
    片としての使用のための臓器。
  78. 【請求項７８】 医薬上活性なタンパク質をトランスジェニック子の乳か
    ら単離する請求の範囲第４５項記載の方法。
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