KR100868245B1 - 데메콜친 처리에 의한 효율적인 복제 동물의 생산방법 - Google Patents

데메콜친 처리에 의한 효율적인 복제 동물의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 데메콜친 처리에 의한 효율적인 복제 동물의 생산방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 융합된 난자를 활성화 한 후 데메콜친(demecolcine)으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 동물의 핵 이식란 제조방법 및 상기 핵 이식란을 체외배양 및 체내이식하는 것을 특징으로 하는 복제 동물의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법은 체세포 핵 이식란의 체외 발육률을 현저하게 증가시키며 체세포 핵 이식란의 대리모 이식 후 분만까지의 임신 유지를 개선하는 효과가 있다.
데메콜친, 복제 동물, 체외 발육률, 분만율

Description

데메콜친 처리에 의한 효율적인 복제 동물의 생산방법{Effective producing method of cloned animal by demecolcine treatment}
본 발명은 데메콜친 처리에 의한 효율적인 복제 동물의 생산방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 융합된 난자를 활성화 한 후 데메콜친(demecolcine)으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 동물의 핵 이식란 제조방법 및 상기 핵 이식란을 체외배양 및 체내이식하는 것을 특징으로 하는 복제 동물의 생산방법에 관한 것이다.
최근 세포융합 또는 세포 직접주입에 의한 체세포 핵 이식 기술이 발전되면서 복제동물의 생산이 본격적으로 이루어지고 있다. 체세포 핵 이식 기술은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.
이러한 체세포 핵이식 기술은 우량 동물의 번식, 희귀· 멸종위기 동물의 보존, 특정영양물질의 생산, 치료용 생체물질 생산, 장기이식용 동물 생산, 질병질환 동물 생산, 세포· 유전자 치료와 같은 의학적으로 가치를 지니는 장기이식 대체용 동물의 생산 등과 같은 분야에서 넓게 활용될 수 있다.
체세포 핵이식을 통한 동물복제기술은 영국 로슬린 연구소의 윌멋(Wilmut) 박사에 의해 6세 된 암컷 양에서 채취한 유선세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 핵 이식란을 생산한 후 생체 내 이식을 통하여 체세포 복제동물인 돌리를 탄생시킴으로써 최초로 성공하였다. 이후 소, 마우스, 염소, 돼지 및 토끼 등에서 체세포 핵이식 방법에 의한 복제된 산자 생산이 보고 되었다(WO9937143A2, EP930009A1, WO9934669A1, WO9901164A1 및 US5,945,577).
그러나 이러한 방법들은 여전히 체세포 핵이식 란의 체외 및 체내 발육률이 저조하여 실제 복제에 성공할 확률이 매우 낮은 실정이었으며, 특히, 돼지의 경우에는 핵이식란의 배반포기까지의 체외 발육률이 매우 저조할 뿐만 아니라, 세포수가 적으며, 체내 이식 후 이들 복제수정란의 계속적인 발달이 이루어지지 못하는 등의 문제점이 있다. 따라서 복제 돼지를 효율적으로 생산하기 위해서는 핵 이식란의 착상 전단계인 배반포기까지의 발육률을 증가시킬 수 있는 새로운 방법이 요구된다.
이에 본 발명자들은 복제 동물의 효율적인 생산방법을 다년간 연구하던 중 체세포 핵이식에 의한 동물의 산자를 생산하는 과정에 있어서 융합된 핵 이식란을 활성화한 후 특정 화학물질인 데메콜친을 처리함으로써 핵 이식란의 체외 발율률이 현저하게 증가되고, 이를 대리모에 이식한 후 분만까지의 임신 유지가 대조군에 비해 현저하게 개선되었음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 체세포 핵 이식 기술을 이용한 동물의 핵 이식란의 제조방법에 있어서, 융합된 핵 이식란을 활성화한 후 데메콜친으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 동물의 핵 이식란 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 융합된 핵 이식란을 활성화한 후 데메콜친으로 처리한 다음 이를 체외배양 및 체내이식하는 것을 특징으로 하는 복제 동물의 생산방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 체세포 핵 이식 기술을 이용한 동물의 핵 이식란의 제조방법에 있어서, 융합된 핵 이식란을 활성화 한 후 데메콜친으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 동물의 핵 이식란 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 융합된 핵 이식란을 활성화한 후 데메콜친으로 처리한 다음 이를 체외배양 및 체내이식하는 것을 특징으로 하는 복제 동물의 생산방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
용어정의
본 발명에서 사용된 용어 '핵 이식'은 핵이 없는 세포에 다른 세포의 핵 DNA를 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '핵 이식란'은 공여핵세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '복제'는 한 개체와 동일한 유전자 세트를 가진 새로운 개체를 만드는 유전자 조작기술로서 특히 본 발명에서는 세포, 배아 세포, 태아 세포 및/또는 동물 세포가 다른 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 동일한 핵 DNA 서열을 갖는 것을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '공여핵세포'는 핵 수용체인 수핵 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '수핵 난자'는 탈핵 과정을 통해 본래의 핵이 제거되고 공여핵세포로부터 핵을 전달받는 난자를 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '난자'는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '탈핵 난자'는 난자의 핵이 제거된 것을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '융합'은 공여핵세포와 수핵 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 플라스마 막 또는 핵막이 될 수 있다. 융합은 공여핵세포와 수핵 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또는 공여핵세포가 수핵 난자의 위란강(perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우에 전기적 또는 화학적 자극을 가함으로써 일어날 수 있다. 또한, "위란강"은 난자의 투명대와 난세포질 사이의 공간을 가리킨다.
본 발명에서 사용된 용어 '활성화'는 핵 전이 단계 전, 핵 전이 단계 동안 및 핵 전이 단계 후에 세포가 분열하도록 자극을 주는 것을 말한다. 바람직하게는, 본 발명에서는 핵 전이 단계 후 세포가 분열하도록 자극을 주는 것을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '산자(live offspring)'는 자궁 밖에서 생존할 수 있는 동물을 말한다. 바람직하게는, 1초, 1분, 한 시간, 하루, 한 주, 한달, 6달 또는 일년 이상 생존할 수 있는 동물을 말한다. 상기 동물은 생존을 위해 자궁 내 환경을 필요로 하지 않는다.
본 발명은 체세포 핵 이식 기술을 이용한 복제 동물의 생산 방법에 있어서, 융합된 핵 이식란을 활성화한 후 데메콜친으로 처리함으로써, 핵 이식란의 체외 발율률을 현저히 증가시키고, 대리모에 이식 후 분만까지 임신유지를 개선하였다는 데에 특징이 있다.
구체적으로 본 발명의 동물의 핵 이식란 생산방법은 수핵난자의 탈핵 단계, 공여핵세포의 주입 단계, 융합 단계 및 융합된 난자의 활성화 단계를 포함하며, 상기 융합된 난자를 활성화 한 후 데메콜친으로 처리하는 단계를 추가로 포함한다.
상기에서 동물은 바람직하게는 양, 소, 마우스, 염소, 돼지 및 토끼 등의 포유동물을 포함하며, 보다 바람직하게는 돼지를 포함한다.
제1단계: 수핵난자의 탈핵 단계
본 발명에서 수핵난자로는 복제하고자 하는 동물의 난소로부터 회수한 미성숙 난포란을 체외성숙을 유도하여 사용할 수 있다. 바람직하게는, 동물의 미성숙 난포란을 체외성숙 배양액에서 배양하여 제1극체가 돌출한 성숙 난자만을 선택한다.
미성숙 난포란의 체외성숙 배양액으로는 당업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 TCM199[5 IU eCG (equine chorionic gonadotrophin),5 IU hCG (human chorionic gonadotrophin), 10 ng/ml 표피성장인자, 1 ㎍/ml 인슐린, 0.6 mM 시스테인이 첨가됨]을 사용하였다.
성숙한 난자를 회수한 다음에는 난자의 반수체 핵을 제거한다. 난자의 탈핵은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다(미국특허 제4994384호, 미국특허 제5057420호, 미국특허 제5945577호, 유럽특허 공개공보 제0930009A1, 대한민국특허 제342437호, Kanda et al, J. Vet. Med. Sci., 57(4):641-646, 1995; Willadsen, Nature, 320:63-65, 1986, Nagashima et al., Mol. Reprod. Dev. 48:339-343 1997; Nagashima et al., J. Reprod Dev 38:37-78, 1992; Prather et al., Biol. Reprod 41:414-418, 1989, Prather et al., J. Exp. Zool. 255:355-358, 1990; Saito et al., Assis Reprod Tech Andro, 259:257-266, 1992; Terlouw et al., Theriogenology 37:309, 1992).
바람직하게는, 수핵 난자의 탈핵은 크게 두 가지 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 한 가지 방법으로는 성숙한 수핵 난자의 난구 세포(cumulus cell)를 제거한 다음, 미세침을 이용하여 수핵 난자의 투명대 일부를 절개하여 절개창을 형성하고 이를 통하여 제1극체, 난자의 핵 및 세포질(가능한 적은 양)을 제거한다. 다른 방법으로는 수핵 난자의 난구 세포를 제거한 다음 난자를 염색하고 미세 흡인 피펫(aspiration pipet)을 이용하여 제1극체 및 난자의 핵을 제거한다. 보다 바람직하게는, 난자의 탈핵은 수핵 난자의 상태를 육안으로 평가하여 생존율이 높은 난자에 대해서 흡입 방법을 사용하고, 그렇지 않은 난자에 대해서는 절개창을 형성하는 방법을 사용한다.
제2단계 공여핵세포의 주입 단계
본 발명에서 공여핵세포로는 복제하고자 하는 대상 동물로부터 유래된 체세포가 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 사용된 체세포로는 배아세포(embryonic cell), 태아세포(fetus cell), 유세포(juvenile cell), 성체세포(adult cell), 바람직하게는 성체세포로부터 수득될 수 있는 난구, 피부, 구강 점막, 혈액, 골수, 간, 폐, 신장, 근육 및 생식기관 등과 같은 형태의 조직으로부터 유래된 것일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 체세포로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 적혈구, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 체세포로는 섬유아세포일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 신생자돈 귀 조직에서 채취한 섬유아세포를 사용하였다(실시예 2 참조). 한편, 복제하고자 하는 대상 동물이 돼지인 경우 돼지의 품종이 특별히 제한되지는 않으나, 랜드레이스(Landrace) 또는 요크셔(yorkshire) 종의 돼지를 사용하는 것이 바람직하나 목적에 따라 미니돼지 (miniature swine)를 사용할 수 있다.
나아가, 본 발명에서 사용되는 공여핵세포는 상기 야생형 체세포에 특정 유전자를 삽입하거나 조작하여 염색체를 유전자 이식방법이나 유전자 적중법을 이용하여 형질전환시킨 것일 수 있다. 상기 유전자 이식방법이나 유전자 적중법은 당업계에 공지된 방법이므로 당업자라면 용이하게 실시할 수 있다.
공여핵세포로서 제공되는 체세포는 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 제조하는 방법으로부터 수득될 수 있으며 상기 표본으로부터 공지된 방법을 사용하여 단일세포를 수득할 수 있다. 예를 들면, 대상동물로부터 조직의 일부를 무균적으로 절개하여 상기 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 수득하고 이를 미세하게 세 절하여 트립신으로 처리한 다음 조직 배양용 배지에서 배양한다. 조직 배양용 배지에서 3-4일 배양 후에 배양 접시(dish)에 자라는 것을 확인하고, 완전히 다 자라면 일부는 추후 사용을 위하여 동결하여 액체 질소에 보관하며, 나머지는 핵 이식에 이용하기 위하여 계속 배양을 실시한다. 계속하여 배양하여 핵이식에 사용할 세포는 15번 계대 배양 이하를 전제로 하여 세포가 과도하게 커지는 것을 방지한다.
상기에서 조직 배양용 배지로는 당업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며 예를 들면, TCM-199, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 등이 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 신생자돈의 귀 조직에서 채취한 섬유아세포를 10% 소태아혈청이 포함된 DMEM/F12 배양액에서 단일층 (monolayer)이 형성될 때까지 5-7일간 배양하고, 핵이식 당일 트립신 처리를 하여 세포 부유액을 제조한 후 이를 핵이식에 이용하였다.
상기 공여핵세포의 이식은 이식용 피펫을 사용하여 공여핵세포를 탈핵 난자의 난강에 미세주입함으로써 수행한다.
제3단계: 융합 단계
상기에서 공여핵세포의 미세주입이 완료된 체세포 핵 이식란은 세포 조작기를 이용하여 전기적으로 공여핵세포와 융합시킨다. 전기적 융합에서 전류는 교류 또는 직류일 수 있으며, 바람직하게는 융합은 직류전압 1.4~1.8 kV/cm로 20-40 μ sec, 2회 통전하여 난자와 공여핵세포의 융합을 유도할 수 있다.
제4단계: 융합된 난자의 활성화 단계
융합된 핵 이식란의 활성화는 성숙과정에서 일시적으로 정지되어진 세포주기를 다시 가동시키는 단계이다. 이를 위해서는 세포주기 정지요소인 MPF, MAP 키나제 등의 세포신호전달물질의 활성을 저하시켜야 한다. 일반적으로 핵 이식란을 활성화하는 방법은 전기적 방법 및 화학적 방법이 있다. 본 발명에서는 핵 이식란의 활성화를 위한 방법으로 전기적 방법을 사용하는 것이 바람직하다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 융합된 핵이식란을 활성화용 배지에 넣어 3분간 평형 시킨 후 활성화용 배지가 들어있는 일렉트로드 챔버 (electrode chamber, 1 mm 간격)에 위치시켜 직류전압 1.2 kV/cm, 60 usec, 2회 통전하여 난자의 활성화를 유도하였다. 이때, 난자 활성화용 배지로는 0.01 mM CaCl2와 0.05 mM MgCl2가 첨가된 0.28 M 만니톨 (mannitol) 액을 사용하였다 (Walker et al., Cloning Stem Cells, 4, 105-11, 2002).
제5단계: 데메콜친 처리 단계
융합된 난자를 활성화 자극 후 데메콜친으로 처리한다. 바람직하게는 데메콜친의 처리는 세포의 핵이 반응하여 세포주기 및 염색체의 형태에 변화가 생기는 적합한 조건으로 수행할 수 있다. 보다 바람직하게는 0.02~1.0㎍/ml 농도의 데메 콜친으로 2~12시간 동안 처리한다.
본 발명의 일 실험예에서는 데메콜친의 처리에 따른 돼지 핵 이식란의 체외 발육률 개선 효과를 조사한 결과(실험예 1 참조), 본 발명의 방법에 따라 데메콜친으로 처리한 다음 체외배양한 경우 비교예에 비해 배반포로의 발육률이 현저히 개선된 것을 확인할 수 있었다(표 1 참조).
또한, 본 발명의 일 실험예에서는 데메콜친의 처리 시간에 따른 돼지 핵 이식란의 체외 발육률의 변화를 조사한 결과(실험예 4 참조), 처리 시간에 따라 체세포 핵 이식란의 체외 발육률이 큰 차이를 나타내지는 않았으나 4시간 정도 정치한 경우에 가장 높은 발육률을 나타냈다(표 4 참조).
또한 다른 관점으로서, 본 발명은 수핵난자의 탈핵 단계, 공여핵세포의 주입 단계, 융합 단계, 융합된 난자의 활성화 단계, 체세포 핵 이식란의 체외배양 단계 및 체내이식 단계를 포함하는 복제 동물의 생산방법에 있어서, 융합된 난자를 활성화 한 후 데메콜친으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 복제 동물의 생산방법을 제공한다.
체세포 핵 이식란의 체외배양은 당업계에 공지된 체외배양액에서 체외발육 및 수정란이식 등 사용목적에 따라 30분~7일간 수행할 수 있으며, 체내이식은 자연발정을 보이는 복제하고자 하는 대상 동물의 암컷을 대리모로 사용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 자연 발정을 보이는 미경산돈을 수란돈으로 이 용하여 수행하였다. 구체적으로, 수란돈을 흡입 마취한 후 일반적인 방법으로 개복하여 난소 및 난관을 노출시키고 체세포 핵이식란을 난관 내에 이식하였다.
본 발명의 일 실험예에서는 데메콜친의 처리가 수란돈의 분만율 및 자돈수에 미치는 영향을 조사한 결과(실험예 3 참조), 데메콜친으로 처리한 체세포 핵 이식란을 수란돼지에 이식한 경우 분만에 도달한 수란돼지의 비율 및 출생한 1 복자돈수가 DEM을 처리하지 않은 비교예에 비해 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다(표 3 참조).
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에 만 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
수핵난자의 준비
도축장에서 채취한 돼지 난소의 표면에 존재하는 직경 3-8 mm 의 난포로부터 난포 내용물을 흡인하여 채취하였다. 난포내용물로부터 다층의 난구세포층으로 둘러 싸여 있고 세포질이 균일한 난자만을 선별하여 체외성숙에 이용하였다. 돼지 미성숙난자의 체외성숙 배양액으로는 TCM199 [5 IU eCG (equine chorionic gonadotrophin),5 IU hCG (human chorionic gonadotrophin), 10 ng/ml 표피성장인 자, 1 ㎍/ml 인슐린, 0.6 mM 시스테인이 첨가됨]을 이용하였으며, 미성숙 난자를 체외성숙 배양액에 넣어 39℃, 5% CO2의 조건 하에서 22시간 배양한 후 eCG 및 hCG가 첨가되지 않은 신선한 배양액으로 옮겨 16-20시간 추가 배양함으로써 난자의 성숙을 유도하였다.
<실시예 2>
공여핵세포의 준비
신생자돈의 귀 조직에서 채취한 섬유아세포를 10% 소태아혈청이 포함된 DMEM/F12 배양액에서 단일층 (monolayer)이 형성될 때까지 5-7일간 배양하였다. 핵이식 당일 트립신 처리를 하여 세포 부유액을 제조한 후 이를 핵이식에 이용하였다.
<실시예 3>
체세포 핵 이식란의 제조
<3-1> 수핵난자의 탈핵
실시예 1에 따른 난자의 체외성숙 38-42시간 후 0.1% (w/v)히아루로니다아제 (hyaluronidase)가 첨가된 체외성숙 배양액 내에서 난자를 부드럽게 피펫팅함으로 써 난자에 부착되어 난구세포를 제거하였다. 난구세포 제거 후 형태학적으로 정상이라고 판단되는 난자를 선별하여 TLH-BSA로 2회 세정한 후 핵이식에 이용하였다. 체외성숙 난자를 5 ㎍/ml 사이토칼라신 B (cytochalasin B) 및 5 ㎍/ml 비스 벤지미드 (bis benzimide)가 들어있는 미세조작 배양액에서 10-15분간 정치시킨 후 미세조작용 배양액의 미소적으로 옮겨 탈핵용 피펫 (내경 16-17 mm)을 이용하여 제1극체 및 중기 염색체 (metaphase chromosome)를 흡인, 제거하였다. 이 과정에서 난자를 자외선에 순간적으로 노출시켜 탈핵여부를 확인하였다. 탈핵이 끝난 난자는 새로운 미세조작용 배양액으로 옮겨 공여핵세포 주입 전까지 39℃에서 정치하였다. 이때, 난자 미세조작용 배양액으로는 헤페스 완충 티로이드 배지 (Hepes buffered Tyrode's medium, Bavister et al., Biol Reprod 28, 235-24, 1983)에 0.4%(w/v) 소혈청알부민 및 0.6 mM 시스테인을 첨가하여 사용하였고, 핵이식란의 체외배양액으로는 글루코스를 제거한 NCSU-23 배양액 (North Carolina State University-23)에 0.5 mM 피루브산 (pyruvate), 5.0 mM 젖산 (lactate)을 첨가하여 사용하였다 (Park et al., Zygote 2005, 13, 269-27, 2005).
<3-2> 공여핵세포의 주입
미세조작용 디쉬 (dish)에 각각 난자용 및 공여핵 체세포용 미소적을 만들어 난자 및 체세포를 위치시켰다. 세포주입용 피펫 (내경 16-17 mm) 내부로 15-20개의 체세포를 흡인한 후 탈핵 난자가 들어있는 미소적으로 이동하여 각 난자의 난강 (perivitelline space)에 1개씩의 세포를 주입하였다.
<3-3> 전기적 세포융합
상기 실시예 <3-2>에서 공여핵세포의 주입에 의해 제조된 체세포 핵이식란을 융합용 배지에 3분간 정치시킨 후 융합배지가 들어 있는 1 mm 간격의 두개의 전극 사이에 위치시켰다. 직류전압 1.4~1.8 kV/cm로 20-40 μsec, 2회 통전하여 난자와 공여핵세포의 융합을 유도하였다. 전기자극 후 핵이식란을 미세조작용 배양액으로 3회 세정 후 체외배양액으로 옮겨 활성화 처리 전까지 1시간 정치하였다. 세포융합 배양액으로는 0.001 mM CaCl2 와 0.05 mM MgCl2가 첨가된 0.28 M 만니톨 액을 사용하였으며, 미세조작을 포함한 모든 난자의 조작은 39℃에서 수행하였다.
<3-4> 난자의 활성화
융합된 핵이식란을 활성화용 배지에 넣어 3분간 평형 시킨 후 활성화용 배지가 들어있는 일렉트로드 챔버 (electrode chamber, 1 mm 간격)에 위치시켜 직류전압 1.2 kV/cm, 60 usec, 2회 통전하여 난자의 활성화를 유도하였다. 난자 활성화용 배지로는 0.01 mM CaCl2와 0.05 mM MgCl2가 첨가된 0.28 M 만니톨 (mannitol) 액을 사용하였다 (Walker et al., Cloning Stem Cells, 4, 105-11, 2002).
<3-5> 데메콜친의 처리
활성화 자극 후 0.4 ㎍/ml의 데메콜친 (demecolcine, DEM) (Sigma-Aldrich Corp., USA)이 첨가된 NCSU-23배양액 내에서 4시간 정치하였다.
<비교예 1>
실시예 <3-4>와 동일한 방법으로 융합된 핵이식란을 전기적으로 활성화하되, 데메콜친 처리는 하지 않았다.
<실시예 4>
체세포 핵이식란의 체외배양 및 체내이식
활성화 자극 후 체세포 핵이식란을 체외배양액으로 옮겨 5% CO2, 5% O2, 90% N2의 기상조건 하에서 6일간 체외배양하였다.
핵이식란의 체내 이식에는 자연발정을 보이는 미경산돈을 수란돈으로 이용하였다. 핵이식란 제조 당일 승가허용발정 (standing estrus)을 보인 돼지를 흡입 마취한 후 일반적인 방법으로 개복하여 난소 및 난관을 노출시켰다. 난소의 상태를 관찰하여 난포, 배란 및 황체 존재여부를 확인한 후 난관채를 통하여 활성화 조작 및 데메콜친 처리가 완료된 90-160개의 체세포 핵이식란을 난관 내에 이식하였다. 핵 이식란이 이식된 수란돈은 발정발현 여부를 관찰하였고 수정란 이식 4주후부터 2주 간격으로 임신여부를 검사하였다. 체세포 핵이식란 유래 돼지 산자가 태어났을 때 임신기간, 산자수, 각 산자의 체중 및 형태학적 이상여부를 관찰, 기록 하였다.
<실험예 1>
DEM 처리에 의한 돼지 체세포 핵이식란의 체외 발육률 개선효과
실시예 3 및 비교예 1의 체세포 핵이식란을 체외배양액으로 옮겨 5% CO2, 5% O2, 90% N2의 조건 하에서 6일간 체외배양하였다. 체외배양 2일 및 6일째에 각각 분할율 및 배반포로의 발생을 관찰하였다. 또한 배반포를 비스 벤지미드 (bis benzimide)로 염색한 후 형광현미경 하에서 세포수를 산정하였다.
실험 결과, 본 발명의 방법에 따라 DEM으로 처리한 다음 체외배양한 경우 DEM으로 처리하지 않은 비교예에 비해 배반포로의 발육률이 현저히 개선된 것으로 나타났다(표 1).
체세포 핵이식란의 배반포로의 발육률
그룹 N ≥ 2-Cell(%) 배반포(%) 세포수/배반포
비교예 1(DEM 무처리) 188 146(77.7) 30(16.0) 38.8
실시예 3(DEM 처리) 187 144(76.8) 51(27.3) 39.5
<실험예 2>
DEM 처리가 돼지 체세포 핵이식란의 유사전핵 (pseudo-pronucleus) 형성에 미치는 영향
실시예 3의 데메콜친 처리 난자 또는 비교예 1의 난자를 체외배양액에서 7시간 배양한 후 난자활성화 후 11시간에 고정, 염색하여 유사전핵의 개수 및 형성률을 검사하였다. 난자의 고정은 홀마운트법 (whole-mount)을 이용하였다. 난자 10-20개를 슬라이드그라스에 위치시킨 후 커버글라스로 덮은 후 33℃에서 고정액 (25% acetic acid in ethanol)으로 10-20분간 고정하였다. 고정한 난자를 1% orcein (1% orcein in 45% acetic acid solution)으로 염색한 후 위상차현미경 하에서 유사전핵을 관찰하였다.
실험 결과, DEM 처리한 체세포 핵 이식란에서 1개의 유사전핵 형성을 유도하는 효과를 보였다(표 2). 이는 DEM이 난자에 도입된 공여핵세포의 형태 변화에 영향을 미쳐 염색체 (DNA ploidy)를 배수체 (2n) 상태로 효율적으로 유지시킬 수 있다는 것을 의미한다.
체세포 핵 이식란의 유사전핵 형성
그룹 N 1PPN**(%) Muti-PPN***(%) 기타(%)
비교예 1(DEM 무처리) 42 26(61.9) 13(31.0) 3(7.1)
실시예 3(DEM 처리) 43 36(83.7) 4(9.3) 3(7.0)
**1PPN: 1개의 유사전핵
***Muti-PPN: 2 이상의 유사전핵
<실험예 3>
DEM 처리가 수란돈의 분만율 및 자돈수에 미치는 영향
체세포 핵 이식란의 DEM 처리가 수란돈의 분만율 및 자돈수에 미치는 영향을 조사하였다. 실시예 4의 방법에 따라 DEM 처리한 체세포 핵 이식란(107-160/수란돈)개 또는 DEM을 처리하지 않은 비교예의 체세포 핵 이식란 (102-165/수란돈)개를 각각 수란돼지 8마리 또는 10마리에 이식하고 발정발현 여부를 관찰하였다. 수정란 이식 4주후부터 2주 간격으로 임신여부를 검사하였다. 체세포 핵 이식란 유래 돼지 산자가 태어났을 때 임신기간, 산자수, 각 산자의 체중 및 형태학적 이상여부를 관찰, 기록하였으며, 분만에 도달한 수란돼지의 수, 출생한 복자돈수 등을 조사하였다.
실험 결과, DEM 처리한 체세포 핵 이식란을 수란돼지에 이식한 경우 분만에 도달한 수란돼지의 비율 및 출생한 1 복자돈수가 DEM을 처리하지 않은 비교예에 비해 현저히 증가한 것으로 나타났다(표 3).
수란돈의 분만율 및 자돈수
그룹 수란돈의 수 분만한 수란돈 수(%) 출생한 자돈수 자돈수/리터
비교예 1(DEM 무처리) 10 3(30.0) 7 2.3
실시예 3(DEM 처리) 8 4(50.0) 12 3.0
<실험예 4>
DEM 처리 시간에 따른 돼지 체세포 핵이식란의 체외 발육률
체세포 핵 이식란의 DEM 처리 시간에 따른 체외 발육률 변화를 조사하였다. 실시예 <3-4>에서 활성화한 체세포 핵 이식란을 0.4 ㎍/ml의 데메콜친 (demecolcine, DEM)이 첨가된 NCSU-23배양액 내에서 각각 2시간, 4시간 및 6시간 동안 정치시키고, 실험예 1과 동일한 방법으로 체외 배양한 다음 배반포로의 발생을 관찰하였다.
실험 결과, DEM 처리 시간에 따라 체세포 핵 이식란의 체외 발육률이 큰 차이를 나타내지는 않았으나 4시간 정도 정치한 경우에 가장 높은 발육률을 나타냈다(표 4).
DEM 처리 시간에 따른 체세포 핵 이식란의 발육률
그룹 N ≥2 세포(%) 배반포(%) 세포수/배반포
DEM 2시간 처리군 141 119(84.4) 35(24.8) 35.3±2.1
DEM 4시간 처리군 142 114(80.3) 42(29.6) 35.2±1.8
DEM 6시간 처리군 142 111(78.2) 36(25.4) 30.8±2.7
본 발명에 따른 방법은 체세포 핵 이식란의 체외 발율률을 현저하게 증가시키는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 방법은 체세포 핵 이식란의 대리모 이식 후 분만까지의 임신 유지를 개선하는 효과가 있다.

Claims (8)

  1. 수핵난자의 탈핵 단계, 공여핵세포의 주입 단계, 융합 단계 및 융합된 난자의 활성화 단계를 포함하는 동물의 핵 이식란의 제조방법에 있어서, 융합된 난자를 활성화 한 후 데메콜친(demecolcine)으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는, 인간을 제외한 동물의 핵 이식란 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 데메콜친의 처리는 0.02~1.0㎍/ml 농도로 2~12시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 동물이 포유동물인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 포유동물이 돼지인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 수핵난자의 탈핵 단계, 공여핵세포의 주입 단계, 융합 단계, 융합된 난자의 활성화 단계, 체세포 핵 이식란의 체외배양 단계 및 체내이식 단계를 포함하는 복제 동물의 생산방법에 있어서, 융합된 난자를 활성화 한 후 데메콜친 (demecolcine)으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는, 인간을 제외한 복제 동물의 생산방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 데메콜친의 처리는 0.02~1.0㎍/ml 농도로 2~12시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 동물이 포유동물인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 포유동물이 돼지인 것을 특징으로 하는 방법.
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