KR20110092795A

KR20110092795A - 체세포 또는 줄기세포의 핵 이식을 이용한 복제개의 생산방법

Info

Publication number: KR20110092795A
Application number: KR1020100012425A
Authority: KR
Inventors: 이병천; 장구; 구옥재; 오현주; 홍소군; 박정은; 김민정; 라정찬
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 주식회사 알앤엘바이오
Priority date: 2010-02-10
Filing date: 2010-02-10
Publication date: 2011-08-18
Also published as: KR101763343B1

Abstract

본 발명은 개과 (Canidae) 동물의 체세포 또는 줄기세포를 이용한, 새로운 핵 이식 산자 생산 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 개의 감수분열 말기의 탈핵된 난모 세포로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자에, 유사분열 G2/M단계의 체세포 또는 줄기세포의 핵 공여 세포를 이식하여 융합시키는 단계를 포함하는, 복제 개 생산용 핵이식란을 제조하는 방법 및 이를 이용한 복제 개 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 개과 동물을 고효율로 복제할 수 있게 함으로써 복제된 개과 동물을 이용한 우량 품종의 번식, 이종이식, 질환 모델동물 등 수의학, 인류학 및 의학연구 분야의 발달에 기여할 수 있다.

Description

체세포 또는 줄기세포의 핵 이식을 이용한 복제개의 생산방법{Method for Producing Cloned Canidae Using Nuclear Transfer of Somatic Cells or Stem Cells}

본 발명은 개과 (Canidae) 동물의 체세포 또는 줄기세포의 핵 이식 산자 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 핵 공여 세포로 유사분열 G2/M단계의 체세포 또는 줄기세포를 사용하고, 수용 세포로 감수분열 말기 II 단계의 난모 세포를 사용함을 특징으로 하는, 신규한 복제된 개과 동물의 생산방법에 관한 것이다.

근래에 생명공학 또는 유전자 조작기술의 발달에 따라 유용한 작물들을 원하는 형질들로 조합한 다양한 재조합 생명체들의 여러가지 생산 성공사례가 발표되어 왔고, 최근에는 예컨대 양 등과 같은 복제 동물들의 생산에 성공한 사례들이 속속 보고되었다. 복제동물의 생산은 현실적으로 생명공학 분야에서도 실로 고도로 축적된 기술적 뒷받침이 전제된 후에야 비로소 가능한 것이므로, 이러한 점에서 상기 복제동물의 생산은 당해 기술 수준의 척도가 되는 것이다.

그 중 체세포 핵 이식 기술은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.

일반적으로 체세포 핵이식 기술에서 핵 공여 세포를 이식할 수핵 난자(recipient oocyte)는 인위적으로 시험관 내(in vitro)에서 배양하여 2차 감수분열 중기까지 도달하도록 성숙시켜 사용한다. 그 다음 체세포 핵이식에 따른 염색체 이상 발생을 방지하기 위하여 체세포를 이식하기 전에 상기 성숙 난자의 핵을 제거하고 상기 탈핵 난자의 주란강 또는 세포질 내에 체세포를 주입한다. 그 후 상기 탈핵 난자와 주란강 또는 세포질에 주입된 체세포를 전기적 자극을 통하여 물리적으로 융합시키고 전기자극 또는 화학물질에 의하여 활성화시킨 후 대리모에 이식하여 산자를 탄생시킨다.

이러한 체세포 핵 이식 기술은 우량 동물의 번식, 희귀 멸종위기 동물의 보존, 특정영양물질의 생산, 치료용 생체물질 생산, 장기이식용 동물 생산, 질병질환 동물 생산, 세포 유전자 치료와 같은 의학적으로 가치를 지니는 장기이식 대체용 동물의 생산 등과 같은 분야에서 넓게 활용될 수 있다.

체세포 핵 이식을 통한 포유동물 복제기술은 영국 로슬린 연구소의 윌멋(Wilmut) 박사에 의해 6세 된 암컷 양에서 채취한 유선세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 핵 이식란을 생산한 후 생체 내 이식을 통하여 체세포 복제동물인 돌리를 탄생시킴으로써 최초로 성공하였다. 이후 소, 마우스, 염소, 돼지 및 토끼 등에서 체세포 핵이식 방법에 의한 복제된 산자 생산이 보고 되었다. 한편, 소, 돼지와 같은 산업동물의 복제와 더불어 개 또는 다른 애완동물의 복제는 많은 사람들의 관심의 대상이 되고 있다. 최근 애완동물로는 처음으로 고양이가 복제되었으며 수백만 달러의 기금으로 개 복제의 연구가 수행되기도 하였다.

그러나 개의 경우 발정이 오지 않은 암캐의 난소에서 미성숙 난자를 채취하여, 이 난자를 체외에서 성숙 배양하는 것은 매우 어렵다. 이것은 독특한 종-특이적 생식 특성으로 인해 다른 동물에 비해 체세포 핵 이식에 의한 복제가 매우 어려운 이유 중 하나이다.

그럼에도 불구하고 개는 인간과 생리학적 특성이 비슷하고 사람과 동물의 유사한 질병 발생 패턴을 가지고 있어 병리학적, 생리학적으로도 유사하며, 실제로 인간 질병연구에 응용할 수 있는 유전 질병의 수가 65개의 돼지나 136개의 고양이와 비교해 개는 224개로 월등히 많아 (http://omia.angis.org.au/) 이러한 유전 형질을 이용하여 인간의 질병모델 복제개를 만들면 인간 질병연구에 큰 도움이 되는 중요한 의미가 있다. 그렇기 때문에 오랜 기간 개복제에 대한 시도가 이루어져왔으나, 현재까지 개 복제는 여전히 성공률이 극히 낮고, 성공하기 어려운 복제로 여겨지고 있으므로, 개과 동물의 복제 효율을 향상시키기 위한 효과적인 방법이 필요한 실정이다

이에 본 발명자들은 핵이식 방법에 의한 향상된 복제개의 생산방법을 연구하던 중 핵 공여 세포로 유사분열 G2/M단계의 체세포 또는 줄기세포를, 감수분열 말기 II 단계의 탈핵된 난모 세포에 이식함으로써, 기존의 방법에서의 재구성된 배의 핵 재프로그래밍 등의 공정이 필요없이 간단한 방법에 의해서 고효율로 복제개를 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 감수분열 말기의 난모 세포를 사용한 핵이식 기술을 이용하여 개과 동물의 핵 이식란을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된, 복제된 개과 동물 생산을 위한 핵 이식란을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출생하는 단계를 포함하는, 생산 효율이 향상된 복제된 개과 동물의 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 핵이식 기술을 이용한 개의 핵 이식란 생산방법에 있어서, 핵 공여 세포를 감수분열 말기의 탈핵된 난모 세포, 바람직하게는 감수분열 말기 II단계의 탈핵된 난모 세포에 이식시키는 단계를 포함하는 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법을 제공한다.

이 때, 핵 공여 세포로서 유사분열 G2/M단계의 체세포 또는 줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 상기 유사분열 G2/M단계의 체세포는 핵공여 세포 제조시에 로스코비틴(R-Roscovitine)과 같은 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양하는 과정을 거쳐 유사분열 G2/M단계로 유도시킬 수 있고, 상기 줄기세포는 배아 또는 성체 유래일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 방법에 의해 제조된 개과 동물의 핵 이식란을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 핵 이식란을 제조 즉시 대리모에 이식하여 발생시키는단계를 포함하는, 복제된 개과 동물의 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 개과 (Canidae) 동물의 체세포 또는 줄기세포를 이용한 새로운 핵 이식 산자 생산 방법으로서, 재구성된 배의 핵 재프로그래밍 과정이 없는 간단한 방법에 의해 복제가 어려운 개과 동물의 복제를 효과적으로 가능하게 함으로써 개과 동물의 우량 품종의 번식, 보존, 이종이식, 질환 모델동물 등 수의학, 인류학 및 의학연구 분야의 발달에 기여할 수 있다.

도 1은 종래 통상적인 체세포 핵이식에 의한 복제 동물 생산과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 복제 동물 생산과정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 개 난관으로부터 얻어진, 감수분열 중기 II단계 (MII)의 in vivo 성숙난모 세포 (A) 및 활성화 후에 말기 II (TII) 단계의 개 난자 난모세포 (B)를 Hoechst 33342로 염색 후 형광 현미경하에서 핵 형태를 관찰한 것이다. (C)는 로스코비틴 처리후의 G2/M 단계에서 정지된 공여 세포를 나타낸 것이다.
도 4는 로스코비틴의 처리 농도 및 시간에 따른 체세포의 세포주기를 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

본 발명에서 사용된 용어 '핵 이식'은 탈핵된 난자에 다른 세포 또는 핵을 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '핵 이식란'은 핵 공여 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '복제'는 한 개체와 동일한 유전자 세트를 가진 새로운 개체를 만드는 유전자 조작기술로서 특히 본 발명에서는 세포, 배아 세포, 태아 유래 세포 및/또는 성체 유래 세포가 다른 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 동일한 핵 DNA 서열을 갖는 것을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '핵 공여 세포'는 핵 수용체인 수핵 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '계대배양(Subculture)' 은 세포는 단층으로 자라고 멈추기 때문에 배양 접시에서 세포를 떼어내어 새로운 배양 접시에서 배양하는 방법으로 세포를 증식시키는데 이때 세포를 동물에서 떼어내어 일차, 이차, 삼차 등등 계속하여 배양하는 방법 즉, 주기적으로 새로운 배지를 교환함으로써 세포주를 보존하는 방법을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '수핵 난자'는 탈핵 과정을 통해 본래의 핵이 제거되고 핵 공여 세포로부터 핵을 전달받는 난자를 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '난자'는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '탈핵 난자'는 난자의 핵이 제거된 것을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '융합'은 핵 공여 세포와 수핵 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 플라스마 막 또는 핵막이 될 수 있다. 융합은 핵 공여 세포와 수핵 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또는 핵 공여 세포가 수핵 난자의 주란강(perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우에 전기적 자극을 가함으로써 일어날 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '핵 재프로그래밍(nuclear reprogramming)'는 핵 이식 과정 중 수핵 난자와 공여 세포를 융합한 후 공여 세포주의 핵이 재구성 되도록 일정 시간을 항온 배양하는 것으로, 핵 이식란(복제 수정란)의 정상적인 발생을 유도하는 과정을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '활성화'는 핵 전이 단계 전, 핵 전이 단계 동안 및 핵 전이 단계 후에 세포가 분열하도록 자극을 주는 것을 말한다. 바람직하게는, 본 발명에서는 핵 전이 단계 이전에 미리 자극을 주는 것을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '산자(living offspring)'는 자궁 밖에서 생존할 수 있는 동물을 말한다. 바람직하게는, 1초, 1분, 한 시간, 하루, 한 주, 한달, 6달 또는 일년 이상 생존할 수 있는 동물을 말한다. 상기 동물은 생존을 위해 자궁 내 환경을 필요로 하지 않는다.

본 발명에서 '개과 동물(canidae)'은 크게 개족(Tribe Canini)과 여우족(Tribe Vulpini)으로 나눌 수 있고, 개, 늑대, 재칼, 여우, 승냥이, 너구리, 코요테 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는 개 또는 늑대가 포함된다. 상기 개는 야생의 늑대가 가축화된 것으로 알려져 있으며 이에 따라 늑대와 개는 염색체 수가 동일하고 임신기간, 성 호르몬의 변화가 유사한 양상을 나타낸다(Seal US et al., Biology Reproduction 1979, 21:1057-1066). 본 발명에 있어서 상기 '개과 동물'이라는 용어에 대하여, '개'로 단순히 줄여서 혼용하여 쓰기도 한다.

본 발명은 일 관점에서 핵 공여 세포를 감수분열 말기 II 단계의 탈핵된 난모 세포에 이식 후 융합시키는 단계를 포함하는, 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 핵 공여 세포로서 개의 체세포 또는 줄기세포를 사용할 수 있고, 바람직하게는 줄기세포를 사용한다.

본 발명의 일 구체예에서는 핵 공여 세포로서 개의 체세포를 사용한다.

본 발명에서 사용하는 체세포는 특히 유사분열 G2/M단계의 체세포를 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 상기 유사분열 G2/M단계의 체세포는 핵공여 세포 제조시에 로스코비틴(R-Roscovitine)과 같은 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양하는 과정을 거쳐 유사분열 G2/M단계로 유도시킬 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 개과 동물의 핵 이식란 생산방법은

(a) 감수분열 중기 II 단계의 개 난모 세포를 활성화시킨 후 일정 시간 항온 배양하여 감수분열 말기 II 단계를 유도하는 단계;

(b) 상기 감수분열 말기 II 단계의 개 난모 세포의 핵을 제거하여 탈핵된 난모 세포를 수득하는 단계;

(c) 개의 조직으로부터 분리한 체세포를 유사분열 G2/M단계로 유도하여 핵 공여 체세포를 수득하는 단계; 및

(d) 상기 (b) 단계의 탈핵 난모 세포에 (c) 단계의 핵 공여 세포를 주입하고 융합시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 (b)에서, 핵 공여 세포의 수용 세포로는 감수분열 말기 II 단계(제2 감수분열 말기)의 탈핵된 난모 세포를 사용한다.

기존의 개 복제 기법은 도 1에 간단하게 모식도로 나타내고 있는데, 기존의 복제 개 생산을 위한 체세포 핵이식 과정은 감수분열 중기 II 단계의 난모세포와 휴지기의 공여세포를 사용하여 왔다. 복제 수정란의 정상적인 발달을 위해서는, 수핵 난자와 공여세포의 핵의 세포주기 동기화가 필수적이다. 일반적으로, 핵이식에 필요한 대량의 난모세포를 안정적으로 얻기 위하여, 수정 혹은 활성화 이전, 난모세포의 세포주기가 정지되어 있는 상태인, 감수분열 중기 II 단계를 그 적기로 이용해 왔다. 이러한 감수분열 중기 II 단계의 난모세포를 이용한 핵이식에 적절한 공여 세포의 세포주기로 일반적으로 간기인 G1 혹은 휴지기인 G0 기의 체세포가 선택되어져 왔다. 그 이유는, 이 시기로의 세포주기 동기화 기법이 간단하면서도 그 수율이 80~90% 이상으로 매우 높기 때문이다. 그러나, 간기 혹은 휴지기의 세포는 실제 난모세포의 세포주기인 감수분열 중기 II 시기와는 큰 차이가 나는 단계이기에, 이 난모세포-공여핵세포 간 세포주기 차이를 극복할 수 있는 새로운 전략이 필요해 왔다.

이러한 이유로 기존의 개 복제 기법에 있어서는, 감수분열 중기 II 난모세포에 G0/G1 기의 공여세포주를 융합 시킨 후, 추가적인 자극 없이 수 시간동안 항온 배양을 하는 재프로그래밍 (Reprogramming)의 단계를 가지고 있었다. 이 과정 동안, 공여세포의 세포핵은 중기 II 난모세포가 가지고 있는 고농도의 MPF(Matufation Promoting Factor)에 의해, 핵막 붕괴 과정 (NEBD; Nuclear Envelope Break Down) 및 조숙 염색체 응축 과정 (PCC; Premature Chromosomal Condensation) 등의 일련의 과정을 거치며, 난모세포와 유사한 형상의 핵상으로 변화되어 갔다.

그러나 이와 같은 고농도의 MPF에 의한 인위적 핵상 변화는 그 과정이 매우 불안정 적이고, 초래되는 결과 역시 우연성에 기초한 무작위적인 것이란 점에서 복제 동물 생산의 큰 문제로 지적되어져 왔다. 실제로, 이러한 방법의 핵이식에 기초한 복제 동물 생산 과정은 동물 종을 막론하고, 그 효율이 매우 낮았던 것이 현실이다.

이에 반하여, 본 발명에서는 제2 감수 분열 중기의 난모세포를 미리 활성화 시킨 후 유도된 제2 감수 분열의 말기(telophase-stage)의 난모세포를 사용하고, 이에 대응하는 공여 세포로 유사 분열 G2/M 단계의 체세포 혹은 줄기 세포를 사용한다는 점을 특징으로 한다. 이는 기존의 기법이 가지고 있던 수용체 난모 세포와 공여 세포간의 세포주기의 차이를 최소화한 기법으로, 복제 수정란의 정상적인 건강한 발달을 유도, 그 생산의 효율을 높일 수 있는 방법이다. 또한, 세포 주기 상 유사한 수핵 난자 및 공여 세포주의 결합에 의한 방법이므로, 별도의 핵의 재프로그래밍 과정을 거칠 필요가 없는 장점이 있다.

본 발명의 상기 개과 동물의 핵 이식란 생산방법 중 (c)단계는, 개의 조직으로부터 분리한 체세포를 세포 주기 동기화 유도 물질을 첨가하여 배양하는 공정에 의해 수행될 수 있다.

유사 분열 세포 주기에는 뚜렷한 4 단계, 즉 G, S, G2 및 M이 있고, 개시기라고 부르는 세포 주기의 초기 상태는 G1단계에서 일어나고, 다른 세포 주기를 나타내게 하는 선택이나 결정 또는 유도는 개시기에 이루어진다. 세포는 일단 개시기를 지나 진행하면, 전(前)DNA 합성 단계인 G1 단계의 후반 단계까지 진행된다. 제2 단계인 S 단계는 DNA 합성이 일어나는 시기이다. 이 시기 다음에는 DNA 합성과 유사 분열기 사이의 시기인 G2 단계가 온다. 유사 분열 자체는 M 단계에서 일어나는 시기이다. 휴지기 세포(quiescent cell)는 일반적으로 분열 또는 증식을 하지 않는 상태에 있는 세포로서, 상기 세포 주기의 4 단계 중 어느 한 단계에 있는 것이 아닌 것으로 간주된다. 따라서, 이들이 세포 주기를 통해 정상적으로 진행되지 않는다는 것을 나타내기 위해 보통 G0상태에 있는 것으로 표기한다.

종래의 방법에 따르면, 체세포 핵 이식에 사용하는 핵 공여 세포로서 기아 배양 등을 통해 수득한 휴지기 세포를 사용하는 것이 적합한 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명에서는 유사분열 G2/M 단계의 핵 공여 체세포를 사용하는 것을 특징으로 한다.

세포주기 동기화 유도물질이란, 핵분열기(M기)·DNA합성전기(G1기)·DNA합성기(S기)·DNA합성후기(G2기)로 이루어진 세포주기 중 특정한 하나의 세포주기로 세포들을 일시정지시키는 물질이며, 본 발명에서는 핵 공여 체세포의 세포주기를 DNA합성후기인 G2기에서 정지시키는 물질을 사용한다. G2/M기로의 특정 세포 주기 동기화 유도 물질을 첨가함으로써, 감수분열 말기 II 단계의 탈핵된 난모세포와 융합하여 발생을 위한 별도의 핵 재프로그래밍 공정을 생략할 수 있는 핵 공여 체세포를 수득할 수 있고, 나아가 개과 (canidae) 동물의 체세포 핵 이식 산자 생산 효율을 향상시킬 수 있다.

상기 세포 주기 동기화 유도 물질로는 Cdk(cyclin-dependent kinase) 저해제로 저농도에서는 G0/G1기를 블로킹하고 고농도에서는 G2/M기를 블로킹 하는 로스코비틴(Roscovitine)(화학식 1); G0/G1기를 블로킹하는 사이클로헥사마이드(Cycloheximide)(화학식 2); G0/G1기를 블로킹하는 디엠에스오 (Dimethyl Sulfoxide, DMSO)(화학식 3); Cdk 저해제로 G1/S기를 블로킹하는 부티로락톤 I(Butyrolactone I)(화학식 4); DNA 폴리머라아제 A,D의 저해제로 S 초기를 블로킹하는 아피디콜린(Aphidicolin)(화학식 5); 유사분열 중기에서 M기를 블로킹하는 디메콜신(Demecolcine)(화학식 6);DNA 복제 저해제로서 S기를 블로킹하는 미모신(Mimosine)(화학식 7); 미소관 저해제로서 G2/M기를 블로킹하는 콜치신(colchicine)(화학식 8); 및 DNA 토포이소머라아제로서 훽스트 33342(Hoechst 33342)(화학식 9)등이 있고, 각각의 물질에 대한 화학 구조식은 이하와 같다. 본 발명에서는, G2/M기의 세포주기를 유도하기 위하여, 바람직하게는 로스코비틴(Roscovitine), 디메콜신(Demecolcine) 또는 콜치신(colchicine)을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 로스코비틴을 사용한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

본 발명의 일 실시예에서는 개의 조직으로부터 분리한 체세포에 로스코비틴(Roscovitine)을 고농도(25-100 μM)로 처리하여 세포 주기를 유사분열 G2/M단계로 유도시킨 핵 공여 세포를 제조한다.

이처럼, 종래 방법과는 상이하게 G2/M기의 핵 공여 세포를 사용하면, 기존의 방법과 비교하여 좀 더 안정적인 복제 수정란 생산이 가능하다. G2/M기의 세포는 세포분열에 앞서 DNA의 복제를 마무리하고, 세포 분열의 시작을 위해 대기하는 단계이다. 이 시기의 세포 핵은, 정상적인 난자와 정자의 융합에 의해 이루어진 수정란이 전핵시기를 거친 후 첫 번째 분열을 시작하기 직전의 단계와 동일한 주기 및 핵상과 동일한 단계이다.

기존의 기법에 있어서는 이식된 휴지기 및 G1 기의 세포 핵이 중기 II 난모세포의 MPF에 의해 무작위적으로, 우연에 의해 G2/M 시기와 유사한 세포 핵으로 유도된 것과 달리, 본 발명은, 정상적인 세포주기를 이용해 좀 더 안정적이고 정확하게 G2/M 기를 유도하여 사용한다. 그러므로 본 발명은, 이후 복제 수정란의 발달에 있어서, 세포주기의 부정확성에 의해 야기될 수 있는 비정상적인 발달을 미연에 방지하고, 그 생산 효율을 높일 수 있다.

본 발명의 상기 (c)단계는 크게 세포막융합법 및 세포질내미세주입법으로 수행될 수 있다. 세포막융합법은 간단하며 대규모 수정란 생산에 적합하다는 장점이 있으며, 세포질내 미세주입법은 핵과 난자내 물질들과의 접촉을 극대화시킬 수 있다.

본 발명에서는 두가지 기법이 모두 사용 가능하지만, 바람직하게는 세포막융합법을 사용하는 것이 유리하다. 세포질내 미세주입법은 그 기법의 특성상, 수용 난모세포의 세포막을 침습적으로 뚫고 들어가므로, 그 과정에서 세포막의 손상을 입고, 난모세포가 사멸하는 경우가 흔히 발생한다. 개과 동물의 복제 생산에 있어서는, 체내 성숙된 소량의 난모세포를 사용해 핵 이식을 시행하므로, 난모세포의 사멸을 최소화 할 수 있는 세포막융합법이 보다 바람직하다.

한편, 본 발명의 다른 구체예로, 본 발명의 개과 동물의 핵 이식란 생산방법은

(a) 감수분열 말기 II 단계의 개 난모 세포를 활성화 시킨 후 핵을 제거하여 탈핵된 난모 세포를 수득하는 단계;

(b) 핵 공여 세포로서, 개의 배아 유래 줄기세포 또는 개의 조직으로부터 분리한 성체 줄기세포를 수득하는 단계; 및

(c) 상기 (a) 단계의 탈핵 난모 세포에 (b) 단계의 핵 공여 줄기세포를 주입하고 융합시키는 단계를 포함한다.

단계 (a)의 감수분열 말기 II 단계의 탈핵된 난모 세포에 대한 설명 및 단계 (c)의 주입에 대한 설명은 상기와 같다.

한편, 줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능성 줄기세포(totipotent stem cell), 전능성 줄기세포(pluripotent stem cell), 다능성 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다.

만능성 줄기세포(totipotent stem cell)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전능성 줄기세포(pluripotent stem cell)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4∼5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라고 한다. 다능성 줄기세포(multipotent stem cell)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있으며 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라 한다.

본 발명에서는 개과 동물로부터 배아 유래 줄기세포 또는 성체 유래 줄기세포 모두 사용가능하다. 바람직하게는 성체 줄기세포를 사용한다.

본 발명의 개 유래 성체 줄기세포는 이미 공지되어 있는 유방, 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등으로 구성된 조직으로부터 분리, 사용할 수 있다. 성체 줄기세포는 배아줄기세포와 달리 원하는 방향으로 분화되지 않은 세포가 암을 유발할 가능성이 매우 희박하여 임상적으로 매우 중요한 장점을 갖고 있기 때문이다.

본 발명에 있어서, 공여세포로서 줄기세포의 사용은 그 효율성을 극대화하는데 유용한 사항이 될 수 있다.

핵 이식 과정의 재프로그래밍은 앞서 기술한 수용체 난자와 공여 세포 핵간의 세포주기 동기화를 위한 과정 이외에도, 세포 분화 과정에서 그 발현이 억제되었던, 초기 배아 단계의 미분화 표지 유전자들을 재발현 시키는 과정 역시 포함한다. 그러므로, 재프로그램 과정의 생략은 전자의 핵 주기의 동기화에는 유익한 영향을 줄 수 있으나, 반대로, 억제된 배아 유전자의 재 발현에는 역효과를 낼 수 있는 가능성이 존재한다. 물론, 유전자의 재 발현 기전은, 핵이식 이후에도 초기 복제 배아 발달 과정에 걸쳐 지속적으로 일어나는 과정이기에 핵 이식 이후에 보완이 가능하며, 세포주기 동기화가 정상적인 발달을 위해서 더 주요 인자이므로, 본 발명의 방법이 유용하게 이용되어질 수 있지만, 유전자 재발현 문제까지 보완될 수 있다면, 본 발명의 방법을 통해 더 큰 효율의 향상을 기대할 수 있을 것이다. 이와 같은 문제의 보완을 위해 일반적으로 사용 되어지던 섬유 아세포에 비해 미분화 단계인, 즉, 좀 더 배아 세포의 단계와 유사한 줄기세포의 사용이 고려될 수 있다.

미분화 단계의 줄기세포의 핵이식으로의 사용은, 본 발명에 있어서, 재프로그램 시간의 부재에 의해 발생할 수 있는 부작용을 최소화 할 수 있다. 또한 역으로, 그간 줄기세포를 공여세포로 사용한 연구에서 제기되어졌던, 과도한 재프로그래밍에 의한 역효과 역시 본 발명을 통해 상호 보완적으로 개선이 가능하다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵 이식란을 이용하는 것을 특징으로 하는, 복제된 개과 동물의 생산방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명의 복제된 개과 동물의 생산방법은

(a) 감수분열 중기 II 단계의 개 난모 세포를 활성화 시킨 후 항온 배양하여 말기 II 단계로 유도한 후, 핵을 제거하여 탈핵된 난모 세포를 수득하는 단계;

(b) 핵 공여 세포로서, 개의 배아 유래 줄기세포 또는 개의 조직으로부터 분리한 성체 줄기세포를 수득하거나 개의 조직으로부터 분리한 체세포를 유사분열 G2/M단계로 유도하여 핵 공여 체세포를 수득하는 단계;

(c) 상기 (a) 단계의 탈핵 난모 세포에 (b) 단계의 핵 공여 세포를 주입하고 융합시키는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 융합된 핵 이식란을 대리모의 난관에 즉시 이식하는 단계를 포함한다

그 밖의 상기 단계들에 대한 구체적인 설명은 상기와 같다.

특히, (d) 단계에서 본 발명에 따른 핵 이식란은 in vitro에서의 별도의 핵 재프로그래밍 공정이 필요없기 때문에, 제조된 핵 이식란을 (c)단계의 융합 후 즉시 대리모의 난관에 이식하는 것을 특징으로 한다.

즉, 별도의 in vitro에서의 핵 재프로그래밍 공정이 필요없기 때문에 상기 공정상에서 발생할 수 있었던 i) 수용체 난자와 공여 세포의 주기 차이에 의해 발생되는 비정상적 복제 배아의 발달을 방지할 수 있고, ii) 핵이식 과정을 좀 더 효율적으로 빠르고 간편하게 진행할 수 있으며, iii) 난모세포의 회수 ~ 복제수정란 이식 과정의 시간을 최소화 함으로서, 체내 성숙 난모세포의 체외 노출시간을 단축, 그 효율을 향상시킬 수 있을것으로 기대되는 등 종래의 방법보다 훨씬 간단한 방법으로, 복제가 어려운 것으로 알려져 있는 개과 동물의 복제를 효율적으로 성공할 수 있다.

본 발명에 따른 개과 동물의 핵 이식란 생산방법 및 복제된 개과 동물의 생산방법에 있어서, 구체적으로 각 단계들을 설명하면 다음과 같다.

제1단계: 수핵 난자의 탈핵

일반적으로 포유동물(예컨대 소, 돼지, 양 등)의 난자는 성숙난자, 즉 제2차 감수분열 중기(metaphase Ⅱ)에 배란되는 것에 반해, 개과 동물의 난자는 다른 동물과는 달리 제1차 감수분열의 전기에 배란되어 난관 내에서 48∼72시간 동안 머물면서 성숙되는 특징이 있다.

수핵 난자는 개과 동물의 미성숙난자, 성숙난자, 초기 노화, 중간노화, 심한 노화 단계의 난자일 수 있다. 바람직하게는, 개에서 회수된 미성숙 난자를 체외에서 성숙시켜 이용하거나 개과 동물의 체내에서 성숙된 난자를 회수하여 이용할 수 있다. 개과 동물의 미성숙 난자는 체외에서의 핵 성숙률이 매우 낮으며, 배란시기 및 번식 생리가 다른 포유동물과는 달라서, 개과 동물의 수핵 난자는 개과 동물의 생체 내에서 성숙된 난자를 회수하는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로 개과 동물로부터 성숙 난자의 회수는 개과 동물의 배란이 이루어진 후 약 48∼72시간째, 보다 바람직하게는 72시간째에 수행하는 것이 바람직하다.

상기에서 개과 동물의 배란일은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 배란일을 결정하는 방법으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 질세포 도말검사(vaginal smear), 혈장 성 호르몬 수준 측정 및 초음파 진단 시스템을 사용할 수 있다. 개과 동물의 발정의 시작은 외음부 팽창 및 장액성 혈액의 배출 여부를 통해 확인할 수 있다.

본 발명의 일 실험예에서는 개과 동물의 배란일을 질세포 도말검사와 혈장 프로게스테론 농도 검사를 수행함으로써 결정한 결과 무각화 상피 세포가 80%이상이고 혈장 프로게스테론 농도가 약 4.0ng/mL 이상으로 처음 도달할 때 배란이 이루어짐을 알 수 있었다.

생체 내 성숙 난자를 회수하는 방법으로는 대상 동물을 마취한 후 개복시키는 것을 포함하는 외과적 방법을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 생체 내 성숙 난자의 회수는 당업계에 공지된 방법인 난관 절제법을 사용할 수 있다. 상기 난관 절제법은 난관을 수술적으로 잘라낸 후 배아 수집 배지를 난관 내부에 관류시켜 관류액을 수득하고 상기 관류액으로부터 난자를 회수하는 방법이다.

또한, 생체 내 성숙 난자는 카테터를 난관채에 장착한 후 난관-자궁 접합부위에 주사침을 이용하여 관류액을 주입함으로써 회수할 수 있다. 이 방법은 난관을 손상시키지 않기 때문에 난자를 공여하는 동물을 다음 발정에도 이용할 수 있는 장점이 있다.

본 발명에서는 제2 감수분열 말기의 난모세포를 탈핵하여 사용한다. 특히 난관의 관류에 의해 회수된 제2 감수분열 중기의 난모세포를 활성화 시킨 후 약 2 내지 4시간 동안 항온 배양한 후 핵을 제거한다.

탈핵공정은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 수핵 난모세포의 탈핵은 크게 두 가지 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 한 가지 방법으로는 성숙한 수핵 난모세포의 난구 세포(cumulus cell)를 제거한 다음, 미세침을 이용하여 수핵 난모세포의 투명대 일부를 절개하여 절개창을 형성하고 이를 통하여 제1극체, 제2극체 및 난모세포의 핵 및 세포질(가능한 적은 양)을 제거한다. 다른 방법으로는 수핵 난모세포의 난구 세포를 제거한 다음 난모세포를 염색하고 미세 흡입 피펫(aspiration pipette)을 이용하여 제1극체, 제2극체 및 제2 난모세포의 핵을 제거한다. 보다 바람직하게는, 난모세포의 탈핵은 수핵 난모세포의 상태를 육안으로 평가하여 생존율이 높은 난모세포에 대해서 흡입 방법을 사용하고, 그렇지 않은 난모세포에 대해서는 절개창을 형성하는 방법을 사용한다.

제2단계: 핵 공여 세포의 준비

체세포 핵이식 기술에 의한 목적 유전자를 발현하는 형질전환동물의 생산에는 핵 공여 세포가 필요하다. 본 발명에서의 핵 공여 세포로는 개로부터 유래된 체세포 또는 줄기세포를 사용한다.

구체적으로, 본 발명에서 사용된 체세포로는 개의 배아세포(embryonic cell), 태아 유래 세포(fetal derived cells), 유세포(juvenile cell), 성체 유래 세포(adult derived cell), 바람직하게는 성체 유래 세포로부터 수득될 수 있는 난구, 피부, 구강 점막, 혈액, 골수, 간, 폐, 신장, 근육 및 생식기관 등과 같은 형태의 조직으로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 체세포로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 체세포로는 태아 유래 세포 및 성체 섬유아세포, 난구세포일 수 있다. 가장 바람직하게는, 개의 태아 및 성체에서 분리한 섬유아세포를 이용한다. 이 세포의 특징은 초기 분리시 다수의 세포를 얻을 수 있고, 세포 배양도 비교적 쉬우며 체외에서 배양 및 조작이 용이하다는 장점을 지니고 있다.

핵 공여 세포로서 제공되는 상기 체세포는 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 제조하는 방법으로부터 수득될 수 있으며 상기 표본으로부터 이하와 같은 방법을 사용하여 최적화된 조건으로 배양된 단일세포를 수득할 수 있다.

대상동물로부터 조직의 일부를 채취하여 세포를 분리한 다음 기본 조직 배양용 배지에서 배양한 후 세포주기 동기화 유도 물질을 첨가하여 재배양한 다음 완전히 자라면 트립신을 처리하여 회수한 후 핵 공여 세포로 사용할 수 있다.

본 발명에서는 유사분열 G2/M단계의 체세포의 제조 및 복제 개의 생산 효율을 향상시키기 위하여, 세포 주기 동기화 유도 물질을 첨가하는 것을 특징으로 한다. 사용할 수 있는 세포 주기 동기화 유도 물질로는 Cdk(cyclin-dependent kinase) 저해제로 저농도에서 G0/G1기를 블로킹하고 고농도에서 G2/M기를 블로킹하는 로스코비틴(Roscovitine); G0/G1기를 블로킹하는 사이클로헥사마이드(Cycloheximide); G0/G1기를 블로킹하는 디엠에스오 (Dimethyl Sulfoxide, DMSO); Cdk(cyclin-dependent kinase) 저해제로 G1/S기를 블로킹하는 부티로락톤 I(Butyrolactone I); DNA 폴리머라아제 A,D의 저해제로 S 초기를 블로킹하는 아피디콜린(Aphidicolin); 유사분열 중기에서 M기를 블로킹하는 디메콜신(Demecolcine);DNA 복제 저해제로서 S기를 블로킹하는 미모신(Mimosine); 미소관 저해제로서 G2/M기를 블로킹하는 콜치신(colchicine); 및 DNA 토포이소머라아제로서 훽스트 33342(Hoechst 33342) 등이 있고, 각각의 물질에 대한 화학 구조식은 앞서 설명한 바와 같다. 바람직하게는 로스코비틴, 디메콜신, 및 콜치신을 사용하고, 더욱 바람직하게는 25~100 μM의 고농도의 로스코비틴을 사용한다.

일 구체예를 들어 설명하면, 우선, 대상동물로부터 조직의 일부를 무균적으로 절개하여 상기 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 수득하고 이를 미세하게 세절하여 트립신으로 처리한 다음 조직 배양용 배지에서 배양한다. 상기 조직 배양용 배지로는 당업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며 예를 들면, TCM-199, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 등이 있다. 조직 배양용 배지에서 3-4일 배양 후에 배양 접시(dish)에 자라는 것을 확인하고, 배양한 후 완전히 다 자라면 트립신 처리하여 일부는 추후 사용을 위하여 동결하여 액체 질소에 보관하며, 나머지는 핵 이식에 이용하기 위하여 계속 배양을 실시한다. 계속하여 배양하여 핵이식에 사용할 세포는 새로운 배양접시에서 배양한 후, 트립신 처리하여 세포를 단일세포로 제조한다.

마지막으로, 상기 세포에 로스코비틴을 첨가하여 추가 배양 한 후, 트립신 처리하여 세포를 회수하여 체세포 핵이식을 실시한다. 이 때 첨가하는 로스코비틴의 농도는 바람직하게는 10~100μM, 보다 바람직하게는 15~100μM이며, 가장 바람직하게는 30~60μM이다. 그리고, 배양시간은 바람직하게는 14~84시간, 보다 바람직하게는 24~48시간 동안 배양한다.

한편, 상기 체세포 이외에도 본 발명에서 사용될 수 있는 줄기세포로는 개의 배아 유래 또는 성체 유래의 것을 사용할 수 있다.

성체 유래 줄기세포의 예를 들면, 유방, 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등으로 구성된 군에서 유래된 조직으로부터 분리, 사용할 수 있다. 성체 줄기세포는 배아줄기세포와 달리 원하는 방향으로 분화되지 않은 세포가 암을 유발할 가능성이 매우 희박하여 임상적으로 매우 중요한 장점을 갖고 있다.

개로부터 배아 줄기세포를 수득하거나 개의 다양한 조직으로부터 성체 줄기세포를 분리하는 방법은 당업계에 공지되어 있는 통상적인 방법을 사용할 수 있다.

일 구체예로 이하와 같은 방법을 사용하여 줄기세포를 수득할 수 있다.

개 지방조직을 PBS로 세척한 다음, 조직을 잘게 자른 후 콜라게나아제 I(collagenase type 1)을 첨가한 DMEM 배지를 이용해 37℃에서 2시간동안 침지(digestion)하고, PBS로 세척 후 원심분리한다. 상층액은 석션하고 바닥에 남은 펠렛은 PBS로 세척한 후 다시 원심분리한다. 100㎛ 메쉬에 필터링하여 찌꺼기(debris)를 제거하고, PBS로 세척한 후 DMEM(10% FBS, 2mM NAC, 0.2mM ascorbic acid) 배지에 인큐베이션한다. 붙지않은 세포들은 PBS로 세척하고, K-NAC 배지(Keratinocyte-SFM media + 2mM NAC + 0.2mM ascorbic acid + 0.09mM calcium + 5ng/ml rEGF + 50㎍/ml BPE + 5㎍/ml insulin + 74ng/ml hydrocortisone)를 2일마다 교체하면서 배양하여, 개 지방조직 유래 줄기세포를 수득할 수 있다.

줄기세포를 핵 공여 세포로 사용하는 경우, 상기 줄기세포는 '미분화' 상태이기 때문에, 미분화 상태의 세포 핵이 핵이식 과정에서의 재프로그래밍이 과도하게 일어날 수 있는 문제점이 존재한다. 실제로, 줄기세포를 공여세포로 사용해 왔던 기존의 연구에 있어서, 많은 경우에 있어서, 미분화 관련 유전자의 과도한 발현에 의해, 시험과적 체외 성숙에는 일부 향상된 결과를 얻기도 하였으나, 복제 수정란의 임신 및 산자 생산 효율이 일반적인 체세포에 비해 낮았던 것이 사실이다. 본 발명에서는, 수핵 난모세포로서 핵 재프로그래밍 공정을 요하지 않는 감수분열 말기 II 단계의 난모 세포를 사용함으로써 상기와 같은 문제점을 극복할 수 있다.

또한, 줄기세포를 사용할 경우, 줄기세포의 특성 상 일반적으로 초기 배아 발달에 필수적이라 여겨지고 있는, 미분화 유전자들이 발현되고 있다는 점이 그 장점으로 부각될 수 있다. 일반적으로, 섬유아세포 등의 분화된 체세포를 공여세포롤 사용할 경우, 핵 이식 후 비특이적 재프로그램에 의해 무작위로 발현되는 유전자 중 우연에 의해 미분화 관련 유전자들이 재 발현 되어야 그 성공이 가능했지만, 줄기세포는 이와같은 과정이 조절 가능하므로 좀 더 안정적이고 고 효율로 복제 동물 생산이 가능하다.

제3단계: 핵 공여 세포의 미세주입 및 융합 - 핵 이식란의 제조

제1단계에서 준비한 탈핵 난자에 제2단계에서 제조한 핵 공여 세포를 미세주입한다. 이 때, 상기 미세주입은 이식용 피펫을 사용하여 핵 공여 세포를 탈핵 난자의 세포질과 투명대 사이에 주입함으로써 수행한다.

핵 공여 세포의 미세주입이 완료된 탈핵 난자는 세포 조작기를 이용하여 전기적으로 핵 공여 세포와 융합시킨다. 전기적 융합에서 전류는 교류 또는 직류일 수 있다. 특히, 바람직하게는 전압이 2.0∼6.0 kV/cm 조건으로 수행할 수 있으며, 보다 바람직하게는 직류전압이 3.0∼5.0 kV/cm 조건으로 10∼30 ㎲ 동안 1∼5 회 수행할 수 있다. 가장 바람직하게는, 전압 3.5∼5.0 kV/cm 조건으로 15㎲ 동안 2회 수행할 수 있다.

상기 전기적 융합시의 전압 범위는 지금까지 알려진 다른 종에서의 일반적인 전기적 융합시의 전압 범위보다 매우 높은 특징이 있다. 이같은 범위는 전기융합의 최적화된 조건으로서, 보다 높은 복제효율로 복제개를 생산할 수 있게 한다.

상기 핵 공여 세포와 난자의 전기적 자극에 의한 융합은 다양한 융합용 배지, 예를 들면 짐머맨 (Zimmerman) 또는 만니톨 등의 내에서 수행할 수 있다. 바람직하게는 만니톨, MgSO₄, 헤페스, BSA가 혼합된 배지를 사용할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상술한 방법에 의해 제조된 개의 핵 이식란에 관한 것이다.

제4단계: 핵 이식란의 대리모 이식 및 산자생산

통상적으로, 융합된 핵 이식란은 '재프로그래밍'과정을 통해 일시적으로 정지되어진 세포주기를 다시 가동시키게 된다. 즉, 융합된 핵 이식란을 핵 재프로그래밍하여 정상적인 발생을 유도한다. 이 때, 세포주기 정지요소인 MPF, MAP 키타제 등의 세포신호전달물질의 활성을 저하시키는 물리적 또는 화학적방법을 사용할 수 있다.

그러나, 본 발명에 따른 복제개의 생산방법에 있어서는 상기 융합된 핵 이식란을 별도로 in vitro에서 재프로그래밍시키지 않고, 융합시킨 즉시 대리모에 이식하는 것을 특징으로 한다. 즉, 융합된 핵 이식란에 대하여 별도의 핵 재프로그래밍 공정 또는 체외 배양공정없이 융합 후 바로 이식하는데, 상기 이식은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있으며 바람직하게는 카테터를 사용하여 복제 배아를 이식할 수 있다.

핵 이식란을 이식하여 정상적으로 태아로 발생시킬 수 있는 대리모를 선발한다. 성숙에 도달한 후 자연적 발정을 보인 개 또는 성숙 전 또는 후의 개에서 인위적 호르몬 처치 등으로 발정이 유발된 개의 발정기 및 배란을 파악하여 이식적기를 선정한다. 일반적으로, 적당한 이식 시기는 핵이식에 사용된 난자를 제공한 난자제공 개와 배란시기가 1-2일 범위 내에서 일치하는 것을 선택할 수 있으며, 바람직하게는 난자제공견이 1일 먼저 배란 된 것, 가장 바람직한 것으로는 동일한 날짜에 배란이 된 것이다. 대리모의 바람직한 발정주기 평가는 프로게스테론 농도를 기준으로 할 수 있다.

핵이식란의 이식 후 3주 이후에 초음파 검사를 실시하여 임신여부를 확인한다. 이 후에도 2주일 간격으로 초음파검사를 통하여 임신지속여부 및 태아의 발육상태 등을 확인한다. 태아의 출산은 분만간격이 30분 이상이 지났는데도 산자가 태어나지 않으면 분만을 도와야 하며, 분만 예정일이 지난 경우는 호르몬 제제 주사 또는 제왕절개와 같은 수술방법을 통하여 산자를 생산하게 된다.

본 발명에 따른 복제개의 생산은 종래 극히 낮았던 임신 성공률을 높이는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 방법은 복제 효율이 너무 낮아 실용화가 어려웠던 이전에 공지된 방법의 단점을 개선하여 실질적으로 복제 개를 생산의 효율을 높이는데 적용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

개로부터 수핵 난자의 회수

난자 공여자로 실험에 사용한 개는 1~5년령의 발정주기가 일정하고, 생식기에 질병이 없는 암캐를 사용하였다. 상기 난자 공여자로 사용한 개들은 서울대학교의 사육관리 기준에 따라 사육하였다. 자연적으로 발정기가 시작된 개를 대상으로 질세포 도말검사(vaginal smear)와 혈청 프로게스테론의 농도를 매일 측정하여 배란일을 결정하고, 배란일로부터 72시간 후에 수술을 실시하여 난자를 회수하였다.

혈청 프로게스테론의 농도는 혈액 3-5ml을 매일 채취하고 원심분리하여 혈청을 수득한 다음 DSL-3900 ACTIVE 프로게스테론 코팅된 튜브 방사선면역 분석 키트(Diagnostic Systems Laboratories, Inc., USA)를 사용하여 분석하였다. 프로게스테론 농도가 4.0 ng/ml 이상에 처음 도달되면 배란일로 간주하였다(Hase et al., J. Vet . Med . Sci., 62:243-248, 2000).

질세포 도말검사는 발정기의 초기 증후가 나타난 날로부터 매일 표본을 수득함으로써 수행하였다. 질세포 표본은 면봉을 외음부로 삽입함으로써 수집하였고 이를 슬라이드 글라스 위에 도말하였다. 그 다음 디프-퀴(Diff-Quik) 염색(International chemical co., Japan)으로 염색한 후 현미경으로 검경하여 표피세포가 상피세포 인덱스(cornified index, Evans J.M. et al., Vet . Rec, 7:598-599, 1970)의 80%이상인 경우를 배란시기로 간주하였다.

본 발명자들은 상술한 방법에 따라 배란시기를 확인한 후 개복술을 통하여 난자 공여자 개로부터 다음과 같은 방법으로 회수하였다.

먼저, 난자 공여자인 암캐에 케타민 HCl(ketamine HCl) 6mg/kg과 자일라진(xylazine) 1mg/kg을 투여하여 마취시키고, 이소플루란(isoflurane)을 흡입 투여함으로써 마취상태를 유지하였다.

상기 마취된 개의 생식열구(bursal slit)를 통하여 난관의 술 모양의 말단에 접근하고 앞부분이 둥글게 처리된 니들을 삽관하였다. 삽입된 니들을 수술용 봉합사로 고정하였다. 이때 3cm 플라스틱 튜브(직경 2mm) 및 지혈겸자(hemostatic forceps)를 이용한 퀵-릴리즈 장치(quick-release device)를 사용하였다. 그 다음 난관의 도관을 잘 보이게 하기 위하여, 디지털 압력을 난관과 주위의 자궁-난관 접합부의 아랫부분에 가하고, 정맥 내 카테터(24 게이지)를 삽입한 다음 상기 카테터를 통해 10% (v/v) FBS, 2 mM NaHCO₃, 5 mg/ml BSA (Invitrogen, Carlsbad, CA)가 첨가된 헤페스-버퍼 조직 배양 배지 표 1의 난자 회수용 배지를 관류시켜 난자가 흘러나오도록 하였다.

성분	함량
TCM powder 1L 용 (Gibco 31100-027)	9.9g
P/S 항생제	1%(페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg)
HEPES 완충액	2.38g
FBS	10%(v/v)
NaHCO₃	0.1680g
BSA	5mg/L

수핵 난자의 제2 감수분열 말기 유도 및 탈핵

상기 수득한 난자를 표 1의 난자 회수용 배지에 넣고, 히알루로니다제(Sigma, USA)를 반복적으로 피펫팅함으로써 난구세포를 제거하였다. 그 다음 난구세포가 제거된 난자를 5㎍/mL 훽스트(Hoechst 33342)로 5분간 염색하고 형광 도립 현미경을 이용하여 x 200의 배율로 관찰하여 제1극체가 확인된 난자만을 선별하였다.

선별된 난자를 10μM 아이오노포어(Sigma)가 함유된 mSOF에 넣고 39℃에서 4분간 배양하여 난모세포의 활성화를 유도하였다. 그 다음 상기 난모세포를 세척하고 1.9mM 6-디메틸아미노퓨린이 첨가된 mSOF(표 2)에서 2~4시간 동안 추가로 배양하여 제2 감수분열 말기를 유도하였다. 상기 배양은 미네랄 오일이 덮여진 mSOF 25 미세유적(microdrop)에서 이루어졌다. 도 3은 개 난관으로부터 얻어진, 감수분열 중기 II단계 (MII)의 in vivo 성숙난모 세포 (A) 및 활성화 후에 말기 II (TII) 단계의 개 난자 난모세포 (B)를 Hoechst 33342로 염색후 형광 현미경하에서 핵 형태를 관찰한 것이다. (C)는 로스코비틴 처리후의 G2/M 단계에서 정지된 공여 세포를 나타낸 것이다.

배양중인 난모 세포에 미세조작장치(micromanipulator, Narishige, Tokyo, Japan)를 이용하여 탈핵을 수행하였다. 즉, 홀딩 마이크로 피펫(약 150㎛ 직경)으로 수핵 난자를 고정한 후 제1극체 및 추가 배양 과정에서 배출된 제2극체를 난자 핵 그리고 일부 세포질(5% 이하)과 함께 흡입 피펫(약 20 μm 직경)을 이용하여 제거하였다.

핵 공여세포의 준비

핵 공여 세포로는 개로부터 수득한 성체 섬유아세포를 사용하였다. 이를 위해 먼저 개의 귀 피부 조직을 분리하였다. 상기 귀 피부 조직 단편을 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 3회 세척하고 수술용 칼로 잘게 조각내었다. 상기 조각낸 피부조직을 1mM EDTA가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지(DMEM Life Technologies, Rockville, MD)에 넣고 300 x g로 2분간 원심분리한 후 60mm 플라스틱 배양용 접시(Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ)에서 배양하였다.

그 다음 상기 세포를 10%(v/v) FBS, 1mM 글루타민, 25mM NaHCO₃ 및 1%(v/v) 최소 필수 배지(MEM) 비필수 아미노산 용액(Invitrogen, CA)이 첨가된 DMEM 배지에서 39℃, 5% CO₂ 및 95% 공기로 가습된 조건으로 3~4일간 배양하였다.

세포가 컨플루언시(confluency)가 될 때까지 배양한 후, 체세포가 부착되지 않은 세포는 제거하고 부착된 나머지 세포는 0.1% 트립신 및 0.02% EDTA가 포함된 배지 내에서 1분간 트립신 처리하고 추가 계대를 위해 3개의 새로운 배양접시로 옮기어 4 내지 6일 간격으로 계대배양하였다. 그 다음 80%(v/v) DMEM, 10%(v/v) DMSO 및 10%(v/v) FBS로 이루어진 동결 배지에 넣고 -196℃의 액체 질소에 보관하였다.

체세포 핵 이식을 하기에 앞서, 세포들을 해동하고, 30 μM의 로스코비틴이 첨가된 배양 배지(즉, DMEM + 10% FBS + 50 μ M 로스코비틴) 에서 24시간 동안 배양하여 G2/M기로 유도하고, 세포를 회수하였다.

체세포 핵이식

상기 실시예 2에서 제조한 탈핵 난자에 상기 실시예 3에서 제조한 핵 공여 세포를 미세주입하였다. 핵 공여 세포는 탈핵 난자의 주란강(perivitellin) 공간으로 다음과 같은 방법으로 미세주입하였다. 미세주입시 정치된 탈핵 난자를 100/mL 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)이 함유된 표 1의 배지에 처리하고, 탈핵 난자의 절개창을 고정용 피펫으로 고정한 다음 이식용 피펫을 절개창으로 삽입하여 실시예 3에서 단일세포로 분리된 섬유아세포를 탈핵 난자의 세포질과 투명대 사이에 주입하였다. 미세조작장치(Nikon-Narishige, Japan)에 부착되어 있는 평행한 2개의 전극사이에 놓고 전기-세포 융합 장치(Electro-Cell Fusion apparatus) (NEPA GENE Co., Chiba, Japan)로 전기적 자극을 가하였다.

전기자극 후에 핵 공여 세포와 난자 세포질체의 융합을 입체현미경 하(stereomicroscope)에서 관찰하였다. 이를 수정란 이식에 바로 이용하였다.

대리모 이식 및 복제개의 생산

상기 실시예 4에서 융합시켜 제조한 핵 이식란을 발정 동기화된 대리모의 난관에 외과적 수술방법을 사용하여 즉시 이식하였다. 이식은 상기에서 핵 이식란을 활성화한 후 4시간 이내에 수행하였다. 대리모로는 질병에 이환되지 않으며 정상적인 발정주기가 반복되며 자궁상태가 정상인 암캐를 사용하였다.

이를 위해 먼저 대리모에 0.1mg/kg 아세프로마진(acepromazine)과 6mg/kg 프로포폴(propofol)을 혈관주사하여 마취시켰고, 2% 이소플루란(isoflurane)을 이용하여 흡입마취상태를 유지하였다. 마취된 개의 수술부위를 무균처리하고 난관을 노출시키기 위해 일반적인 개복수술법에 따라 등배쪽 부위를 절개하였다. 손으로 복강 내를 촉진하여 난소와 난관 및 자궁을 절개창으로 견인하였다. 견인된 난소의 난소간막을 조심스레 다루어 난관의 개구부를 인지하고 1.0ml 튜버큘린(tuberculin) 주사기(Latex free, Becton Dickinson & CO. Franklin lakes, NJ 07417)가 장착된 3.5F 톰 캣 카테터(Tom cat catheter, Sherwood, St. Louis, MO)를 난관 내로 넣어 카테터 전방에 충분한 공간을 확보하고 핵 이식란을 주입하였다. 핵 이식란의 주입여부는 현미경을 검경하였다. 복부의 봉합은 흡수성 봉합사를 이용하였고 이후 피부봉합을 실시하였다. 수술 후 감염을 방지하기 위하여 광범위 항생제를 3일간 투여하였다.

임신여부는 대리모에 핵 이식란을 이식한 후 23일째에 7.0 MHZ 리니어-어레이 프로브(linear-array probe)가 장착된 SONOACE 9900 초음파 스캐너(Medison Co. LTD, Korea)를 이용하여 검사하였다. 임신상태는 초기에 임신을 확인한 후 2주마다 초음파로 모니터링하였다. 그 결과, 개에게서 임신 사실을 확인하였고 자연분만을 유도하거나 제왕절개 수술로 복제개를 생산하였다.

실험예 1: 핵 공여세포의 G2 /M기 유도

개 태아로부터 얻은 섬유아세포 (fetal fibroblast)에 로스코비틴을 각각 30 또는 60μM에서 24, 48, 또는 72시간동안 처리하였고, 대조군(0μM)은 GO기에서 정지하도록 하기 위해, 세포를 컨플루언시(confluency)가 될 때까지 배양하였다.

그 다음, 플로우 사이토미트리로 분석한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 30 및 60 μM 의 로스코비틴 처리군의 경우, G2/M기에서 정지한 세포 빈도가 대조군에 비하여 훨씬 높게 나타났다 (각각 32.0% 및 26.0% vs. 19.8%). 하지만, 30 및 60 μM 의 로스코비틴 처리군 사이에서는 차이가 나타나지 않았다 (P>0.05). 60μM의 로스코비틴 48시간 처리군 및 30μM 72시간 처리군에서 G2/M기 세포들의 비율이 가장 높게 나타났다.

실험예 2 : 본 발명에 따른 핵 이식란의 in vitro 발달능의 비교

상기 실시예 4에 기재된 방법에 따라 얻어진 핵 이식란 (TII-G2/M)의 수는 하기 표에 나타난 바와 같이 43개였으며, 이로부터 융합된 배의 수는 34개로 89.4%의 융합율을 나타내는 반면, 종래 알려진 방법에 따라 얻어진, 감수분열 중기 II단계의 난모세포에 G0의 핵 공여세포를 주입한 경우 (MII-G0), 38개의 핵 이식란 및 34개의 융합된 배가 얻어졌다.

더욱이, 발달을 거듭할 수록, 본 발명에 따른 실험군의 경우, 8세포기 이상까지 종래에 알려진 방법에 따라 얻어진 MII-GO군에 비하여 우수하게 나타났으며, 핵이식란의 발달율이 종래의 방법에 비하여 뒤쳐지지 않을 뿐만 아니라, 오히려 매우 우수한 결과를 나타내었다. 여기서, parthenogenesis는 상기 실험군들의 대조군으로써, 개 수정란의 체외배양의 발달정도를 나타내는 기준 척도로써 사용된 것이다. 현재로서는, 개의 핵 이식란의 체외배양 시스템이 개발되지 않은 상태이므로, 체외에서 개의 수정란을 배양했을 때, 다른 동물에 비해 그 결과가 현저히 낮기 때문에, MII-TII의 낮은 발달율이 실험적 오류가 아님을 입증해주는 근거가 된다.

실험군	핵 이식란	융합된 배	2세포기 분할된 배(%)	4세포기	8세포기 이상
MII-G0	38	34 (89.4%)	8 (23.5±8.1)	6 (17.6±7.7)	1 (2.9±5.4)
TII-G2/M	43	38 (89.4%)	14 (39.4±7.7)	13 (34.2±7.3)	3 (7.8±4.7)
parthenogenesis	25	-	11 (44.0±9.5)	9 (36.0±9.0)	4 (16±4.4)

부호없음

Claims

핵 공여 세포를 감수분열 말기 II 단계의 탈핵된 난모 세포에 이식한 다음 융합시키는 단계를 포함하는 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 핵 공여 세포는 유사분열 G2/M단계의 체세포 또는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 또는 성체 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 성체 유래 줄기세포는 골수, 제대혈, 혈액, 지방, 피부, 위장관, 태반 및 자궁으로 구성된 군으로부터 선택된 조직 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 체세포는 개과 동물의 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 성체 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 체세포는 섬유아세포 또는 난구세포인 것을 특징으로 하는 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 유사분열 G2/M단계의 체세포는 로스코비틴(Roscovitine), 사이클로헥사마이드(Cyclohesimide), 디엠에스오 (DMSO), 부티로락톤 I(Butyrolactone I), 아피디콜린(Aphidicolin), 디메콜신(Demecolcine), 미모신(Mimosine), 콜치신(colchicine) 및 훽스트 33342(Hoechst 33342)으로 구성된 군에서 선택되는 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양하는 공정에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 세포 주기 동기화 유도물질은 로스코비틴(Roscovitine), 디메콜신(Demecolcine) 또는 콜치신(colchicine) 인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 세포 주기 동기화 유도물질은 10 ~ 100μM의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 감수분열 말기 II 단계의 탈핵된 난모세포는,
감수분열 중기 II 단계의 세포를 활성화 후 배양하여 감수분열 말기 II 단계로 유도한 다음 탈핵된 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 융합공정은 전압이 2.0∼6.0 kV/cm인 조건에서 수행되는 전기융합인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 융합공정은 전압이 3.5∼5.0 kV/cm인 조건에서 수행되는 전기융합인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항의 방법으로 제조되고, 감수분열 말기 II 단계의 탈핵된 난모세포에 유사분열 G2/M단계의 체세포의 핵이 이식되어 있는, 복제된 개과 동물의 생산용 핵 이식란.
제2항의 방법으로 제조되고, 감수분열 말기 II 단계의 탈핵된 난모세포에 줄기 세포의 핵이 이식되어 있는, 복제된 개과 동물의 생산용 핵 이식란.
핵 공여 세포를 감수분열 말기 II 단계의 탈핵된 난모 세포에 이식 한 다음 융합시켜 핵 이식란을 제조하는 단계 및 상기 제조된 핵 이식란을 즉시 대리모에게 이식시켜 발생시키는 단계를 포함하는, 복제된 개과 동물의 생산방법.
제15항에 있어서, 상기 핵 공여 세포는 유사분열 G2/M단계의 체세포 또는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 유사분열 G2/M단계의 체세포는 로스코비틴(Roscovitine), 사이클로헥사마이드(Cyclohesimide), 디엠에스오 (DMSO), 부티로락톤 I(Butyrolactone I), 아피디콜린(Aphidicolin), 디메콜신(Demecolcine), 미모신(Mimosine), 콜치신(colchicine) 및 훽스트 33342(Hoechst 33342)으로 구성된 군에서 선택되는 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양하는 공정에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 융합공정은 전압이 3.5∼5.0 kV/cm인 조건에서 수행되는 전기융합인 것을 특징으로 하는 방법.