CN103173456B - 猪Xist基因序列、猪anti-Xist siRNA序列及通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了完整的猪Xist基因序列，并公开了提高猪克隆效率的方法。本发明利用生物信息学方法电子克隆猪Xist基因序列，并对序列进行验证分析，得到猪Xist基因序列。设计并合成anti-XistsiRNA序列，用分子生物学技术筛选出有效的anti-Xist siRNA序列，用anti-Xist siRNA抑制核移植重构胚或核移植供核细胞中Xist基因表达，来提高猪克隆胚胎发育的质量，以期达到提高猪克隆效率的目的。本技术首次获得完整的猪Xist序列及anti-Xist siRNA序列，同时，此技术可提高猪克隆胚胎体外发育的质量，而猪克隆效率的提高无论是在畜牧生产领域、科研领域还是医学领域都将具有十分重要的意义。

Description

猪Xist基因序列、猪anti-Xist siRNA序列及通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及转基因工程技术，具体涉及一种提高猪克隆效率的方法。

背景技术

1938年，德国科学家Spemanm最早提出并进行细胞核移植实验，之后大量的科学家投入到核移植克隆动物的实验中来，直到1997年英国罗斯林研究所宣布克隆羊“多莉”成功培育，表明体细胞可作为供核细胞进行细胞核移植，为克隆技术的大力发展提供了理论依据，翻开了动物克隆史新的一页。随后大量的克隆动物陆续诞生，而于2000年成功获得了世界上首例用猪胎儿成纤维细胞作为供核细胞的体细胞核移植猪。现已获得的克隆动物有小鼠、绵羊、兔、猪、牛、猴、猫、大鼠、骡子、马、狗、雪貂等。这标志着哺乳动物的核移植克隆技术已日趋成熟。

同时，动物克隆技术在农业、生物学和医药学等领域有十分广泛的用途。克隆技术可利用优良品种的体细胞作为核供体来克隆动物，可大大缩短育种年限，得到优质动物种群，加速动物育种进程；可利用克隆技术拯救濒危动物，保护珍稀物种、保护生物多样性。克隆技术与转基因技术相结合，对解决人类器官移植来源、改善动物品种、疾病治疗等有重要意义。而猪作为人类疾病治疗的模式生物，其克隆技术对解决人类异种器官移植尤为重要。

但是，动物克隆技术仍面临一个重要难题，就是克隆效率低的问题。有研究报道，哺乳动物的克隆效率一般不超过3%（出生个体数/核移植重构胚数），而猪的克隆效率更低为1-2%，这大大限制了动物克隆技术的研究与应用。提高动物克隆效率的研究较多，主要表现在核供体、核受体的选择、供受体间的相互作用和核移植的操作方法等传统方法的研究，但是效果却并不明显，克隆成功率仍不超过3%。

现有技术基本上是通过供核细胞和受体细胞的选择、供受体细胞间的相互关系及核移植的操作方法等方面来探索如何提高猪的克隆效率，这些技术一定程度上受地域、时间和个体因素差别的影响，因此可重复性差、效果不明显，不适用于大规模的制备克隆动物。

Xist基因被认为是调控X染色体失活的关键基因，它启动X染色体的失活，在X染色体失活中心开始转录，转录产物通过包围整条X染色体使其沉默，从而实现哺乳动物的剂量补偿效应。而近年来发现Xist基因在克隆动物（或胚胎）中异常表达，推测其与克隆动物（或胚胎）的异常发育或死亡有关。但是目前在猪上，尚未报道有人做过类似的实验，且猪的Xist基因序列并未公布。

发明内容

本发明目的通过生物信息学方法获得了完整的猪Xist基因序列，为今后进一步研究猪X染色体失活机制及其对克隆动物的正常发育的影响提供了基础。

本发明的另一目的是提供一种猪anti-Xist siRNA序列。

本发明的另一目的是提供一种提高猪克隆胚胎的发育质量、继而提高猪的克隆效率的方法，猪克隆效率的提高，可缩短育种年限，培育优良品种。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

一种猪Xist基因序列，所述序列为如序列表SEQ ID NO：1所述。

一种猪anti-Xist siRNA序列，所述序列为如序列表SEQ ID NO：2和3所述。

一种猪anti-Xist siRNA序列，所述序列为如序列表SEQ ID NO：4和5所述。

一种猪anti-Xist siRNA序列，所述序列为如序列表SEQ ID NO：6和7所述。

一种猪anti-Xist siRNA序列，所述序列为如序列表SEQ ID NO：8和9所述。

一种通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法，所述方法通过以下步骤实现：

1）猪Xist基因的电子克隆：对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列；

2）有效anti-Xist siRNA序列的筛选：以母猪cDNA为模版，设计引物，进行定量PCR反应，筛选有效的anti-Xist siRNA序列；

3）anti-Xist siRNA1显微注射猪早期核移植胚胎；

4）anti-Xist-siRNA1转染核移植的供核细胞，用anti-Xist siRNA1抑制克隆胚胎中Xist基因表达，提高体外培养猪克隆胚胎的囊胚内细胞数。

本发明提供了另一种通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法，所述方法为用anti-Xist siRNA显微注射激活后猪的核移植重构胚，具体步骤如下：

1）猪Xist基因的电子克隆：对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列；

2）设计合成anti-Xist siRNA序列；

3）筛选出有效的anti-Xist siRNA；

4）制备猪的核移植重构胚，将有效的anti-Xist siRNA序列显微注射到激活后的核移植重构胚中；

5）将处理后的重构胚移植到代孕母猪体内，提高克隆效率。

本发明提供了又一种通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法，所述方法为用anti-Xist siRNA直接转染核移植的供体细胞，具体步骤为：

1）猪Xist基因的电子克隆：对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列；

2）设计合成anti-Xist siRNA序列；

3）筛选出有效的anti-Xist siRNA；

4）用有效的siRNA转染核移植的供核细胞；

5）用处理后的供核细胞制备克隆胚胎以期提高克隆效率。

本发明还提供了一种通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法，所述方法为直接敲除核移植的供体细胞中Xist基因，具体步骤为：

1）猪Xist基因的电子克隆：对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列；

2）设计同源重组打靶质粒制备敲除Xist序列的细胞系；

3）用第2）步骤的细胞系作为核移植的供核细胞制备克隆猪，以提高克隆效率。

本发明还提供另一种通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法，所述方法为制备抗Xist基因的转基因猪，具体步骤为：

1）猪Xist基因的电子克隆：对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列；

2）设计合成anti-Xist siRNA序列；

3）筛选出有效的anti-Xist siRNA；

4）用有效的anti-Xist siRNA构建anti-Xist shRNA质粒；

5）用anti-Xist shRNA质粒制备转基因细胞系；

6）用第5）步骤的细胞系作为核移植的供核细胞制备克隆猪，以提高克隆效率。

本发明首次获得完整的猪Xist序列及anti-Xist siRNA序列，为今后研究猪X染色体失活机理，及研究Xist基因表达与猪克隆胚胎发育的关系提供了基础。同时，此技术可提高猪克隆胚胎体外发育的质量，为提高猪克隆效率的进一步研究提供了理论依据。而猪克隆效率的提高无论是在畜牧生产领域、科研领域还是医学领域都将具有十分重要的意义。相对于已有方法，本发明提供的方法具有更好的重复性，简便快捷，更适合规模化生产克隆猪。

附图说明

图1为猪Xist基因RT-PCR鉴定电泳图；

其中M为DNA Marker，1为猪Xist基因PCR扩增产物，

图2为猪Xist基因3′RACE鉴定电泳图；

其中M为DNA Marker，1为猪Xist基因3′RACE扩增产物；

图3为猪Xist基因的结构图；

其中，方框表示Xist基因的外显子，方框之间的横线表示内含子；E1-E7分别表示外显子1-7；AG，GT表示内含子边界；在猪中各外显子序列E1:1-15214，E2:16675-16763，E3:19035-19170，E4：21307-21515；E5:21872-22200；E6:22591-22719；E7:23709-30223；

图4为anti-Xist siRNA靶质粒构建路线图；

图5为anti-Xist siRNA与靶质粒共转染293T细胞48h后相对的平均绿色荧光强度柱图；

图6为anti-Xist siRNA与靶质粒共转染293T细胞48h后表达绿色荧光细胞相对比率柱图；

图7为anti-Xist siRNA与靶质粒共转染293T细胞48h后荧光显微镜下观察结果；

图8为anti-Xist siRNA转染母猪成纤维细胞48h后Xist基因相对表达量柱图；

图9为anti-Xist siRNA1注射进猪早期核移植胚胎后荧光显微镜下观察结果；

图10为anti-Xist siRNA1转染供核细胞后荧光显微镜下观察结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

1、猪Xist基因的电子克隆

利用DNAStar（www.dnastar.com/）的MegAlign程序对GenBank中已公布的Bostaurus（牛，NCBI序列号：NR 001464.2）、Homo sapiens（人，NCBI序列号：NG 016172.1）、Mus musculus（小鼠，NCBI序列号：AJ421479.1）的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，找到一段相对保守的序列。基于UCSC网站，以找到的相对保守的序列为基础，与猪Nov.2009（SGSC Sscrofa9.2/susScr2）数据库进行BLAST分析，将此段序列定位在猪的X染色体上，以此为基础前后延伸，得到一段约40kb的序列。将上述得到的40kb序列分别与牛、人和小鼠的XIST/Xist序列进行BLAST分析，进一步得到30kb的猪Xist基因序列。将得到的30kb序列，与猪EST文库和Unigene库进行BLAST分析，从猪EST数据库中挑选出全部相关的序列。然后，对匹配分数（Score）较高的EST序列进行片段整合分析（即Contig分析），用序列拼接软件延伸EST序列。将新生序列再作为种子序列重复地进行上述过程，直到新生序列不能再被进一步延伸为止，得到Xist RNA序列。采用RT-PCR、3′RACE及测序验证，得到的猪Xist基因序列外显子与内含子序列正确，即猪Xist基因序列长度为30223bp，转录本长度为22621nt，共有7个外显子，其中第1、7外显子比较长，2-6外显子比较短。第1到7外显子的长度分别为：15214bp、89bp、136bp、209bp、329bp、129bp与6515bp，结果见图1、2、3。

2、有效anti-Xist siRNA序列的筛选

2.1通过荧光显微镜观察和流式细胞仪检测筛选有效的anti-XistsiRNA序列

anti-Xist siRNA的设计与合成均由上海吉玛制药技术有限公司完成，共设计和合成了4对anti-Xist siRNA分别记为siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4及一对阴性对照siRNA记为Nc-siRNA，其序列为：

表1anti-Xist siRNA序列

将4对siRNA作用的靶序列两端加入酶切位点Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ，与pEGFP-N1质粒进行酶切、连接、转化，并进行菌液PCR鉴定、质粒酶切鉴定及测序鉴定，得到筛选anti-Xist siRNA序列的靶质粒，该质粒靶序列与EGFP绿色荧光蛋白融合表达，构建流程件图4。

将得到的靶质粒与siRNA共转染293T细胞，转染方法参照Invitrogen公司Lipofectamine^TM LTX and PLUS^TM Reagents kit说明书进行。转染48h后，在荧光显微镜下观察各组荧光表达情况，同时进行流式细胞仪检测。实验表明siRNA1对猪Xist基因的干扰效果最好，结果见图5、6、7。

2.2通过荧光定量PCR的筛选有效的anti-Xist siRNA序列

以母猪cDNA为模版，设计引物，进行定量PCR反应，反应程序为：95℃30s；（95℃5s;60℃35s；共40个循环）；95℃15s；60℃1min；95℃15s。定量PCR数据统计分析采用△△Ct法来度量各siRNA处理组内Xist基因的表达差异。具体做法是将每个样品的Ct平均值减去对应样品的β-actin平均Ct值得到各处理组的△Ct值，即△Ct=样品目的基因Ct均值-样品β-actin Ct均值，然后以Nc-siRNA作为参照，同理得到参照样品△Ct值，用其它siRNA处理组的△Ct值减去参照样品组织的△Ct值得到各组织的△△Ct，即△△Ct=其他样品△Ct值-参照样品△Ct值，最后将每个处理组相对参照组的Xist基因表达量用2^-△△Ct表示。实验表明siRNA1对Xist基因的移植效果最好，结果见图8。

3、anti-Xist siRNA1显微注射猪早期核移植胚胎

实验分为三组：注水组（对照组），注射20μM anti-XistsiRNA1组（实验组1）与注射80μM anti-Xist siRNA1组（实验组2）。核移植的供核细胞来源于杜洛克公猪成纤维细胞。在核移植细胞融合激活后，分别向实验组胚胎内显微注射10pL浓度分别为20μM与80μM anti-XistsiRNA1，向对照组胚胎注射10pL胚胎级别注射水（sigma），然后置于培养基中体外培养，观察胚胎的卵裂率、囊胚率，并计算囊胚平均细胞数。结果表明anti-Xist siRNA1显微注射猪早期胚胎对胚胎发育时的卵裂率和囊胚率无显著效果（p﹥0.05）（表2）；但注射80μM anti-XistsiRNA1组囊胚内平均细胞数显著高于20μM组与对照组（p﹤0.05），80μM组相对于对照组囊胚内平均细胞数可提高47.51%（表2和图9）。而囊胚内平均细胞数是衡量胚胎发育质量的一个重要指标，说明显微注射anti-Xist siRNA1抑制Xist基因表达可显著提高克隆囊胚发育质量。

表2anti-Xist siRNA1显微注射对猪克隆胚胎体外发育的影响

4、anti-Xist-siRNA1转染核移植的供核细胞

实验分为三组：只转染脂质体组（对照组），转染20nM anti-XistsiRNA1（实验组1）与转染40nM anti-Xist siRNA1组（实验组2），核移植的供核细胞来源于杜洛克公猪成纤维细胞。转染核移植的供核细胞。转染后48h，各组细胞分别作为核移植的核供体，进行核移植观察胚胎的卵裂率、囊胚率，并计算囊胚平均细胞数。结果表明anti-XistsiRNA1转染处理供核细胞时，转染20nM anti-Xist siRNA1组克隆胚胎卵裂率显著降低（p﹤0.05）（表3）；各组间囊胚率无显著差异（p﹥0.05）（表3），但转染20nM anti-Xist siRNA1组囊胚率偏低；转染20nManti-Xist siRNA1组的囊胚内平均细胞数显著高于其它两组（p﹤0.05），20nM组相对于对照组囊胚内平均细胞数可提高17.99%（表3和图10）。而囊胚内平均细胞数是衡量胚胎发育质量的一个重要指标，说明显微注射anti-Xist siRNA1抑制Xist基因表达可显著提高克隆囊胚发育质量。

表3anti-Xist siRNA1转染供核细胞对猪克隆胚胎体外发育的影响

用anti-Xist siRNA1抑制克隆胚胎中Xist基因表达，可提高体外培养猪克隆胚胎的囊胚内细胞数，而囊胚内细胞数越多其胚胎质量发育越好。因此，本技术表明抑制早期猪克隆胚胎中Xist基因表达，可提高胚胎质量。为进一步进行猪克隆胚胎体内培养的实验奠定了基础，以期达到提高克隆效率的目的。也为提高其他物种克隆效率，提供了思路和做了初步探索与尝试。

以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  芳, 吴 珍

       聪, 李 紫

 

<120>  猪Xist基因序列、猪anti-Xist

       siRNA序列及通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法

 

<130>  1

 

<160>  9    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  30223

<212>  DNA

<213>  猪

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (2959)..(3058)

<223>  n is a, c, g, t or u

 

<400>  1

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taaaaggtaa aaggaatgtt actgtgctta aaagaagcta tagtcattta catttatcta   4380

 

ggaccctgtt cccatctaac tgactttcag tgacacaggg ggcagttggg actgttaatg   4440

 

ggctttattg cagctatagt cccttgtgtt aatctggaat cactttcctt cctgctcaat   4500

 

ttgtattaca actgaaggga actgggactg tcaatatgct taggtgcagc tacagatcct   4560

 

caccttaacc taggatcccg ttcccaccta actatctttt tgttaatgca aagcctatgt   4620

 

gggacttgtt agtgggctta atcgcactat tgtcccttct gttattttag gatccccttt   4680

 

tcctactcga tttgcattac cttaagatgt atgagactgg atttgcttaa atgcatctac   4740

 

agttcctatg ttaacctatg atcccattcc catctaacac cctttgcatg gctgcagagg   4800

 

gaacttggga tagtcaatgg gctcgattag agctacagtc ccttctgttg gttgagattc   4860

 

ccgttccctt actcgttttg cattaccaaa cgggggaaga aagggctgtt aatatgctta   4920

 

aatgcaatta cagtccctta tgctaacctg ggattcatcc ccaaataact cccttttcgg   4980

 

gattgcagag gatacttggg actgttaatg ggcttaactg catctatagt ctcttctgta   5040

 

agtctagaat ctgttccttt cctacttgat ttgcattact acagaggata caagggacag   5100

 

taaagaggct taaatatagc tgcaatccct tatgttaacc taggagcctg tccacagtta   5160

 

tttccctttt cattaatgca gagcctacat aggacttgtt aatagcctta attgctctac   5220

 

tgacccctcc cgttagtttg ggatcccatc ctcacctaat tctctctgca ttaccaggga   5280

 

ggatacaagg gactcttaat gtgcttaaat gaaggtacag tccttttttt taaacctagg   5340

 

atttcattcc catgtaactc catttgcact accacagagg gtacaagggg cgaatgagcc   5400

 

taaaagcagc tacagtccct tatgttaacc taaggatcct gtctcctagg aactcccttt   5460

 

tcctggctgc agaggatact tgggactgtt agtgagattt actgtagcta cagtctcttt   5520

 

tattagtcta gattcccatt accatcctag atgttttgca ttaccacgga ctatacaagg   5580

 

gaccattata gggcttaaat gcagctccag tcccttatta acctagaatc tcatccccac   5640

 

ctacagcctt tttcatgctg cagagggtac ttgggactgt tgattggctt tattgcagct   5700

 

gcagtccctt ctgttagtct agaatctgtt tccatcctac tccatttgca ttaccacaga   5760

 

ggggacaagg gactgttaat gtgcttaaat agaaccacag tcccttatgt taaatgagga   5820

 

tcccatcccc aactaactct cttttcatta ctgcagagct taagtaggac ttgttaatag   5880

 

actattgcat tactgttctg ttattctata ggttcccatc cctcattcta tttgcattac   5940

 

cctagagtgt aaagggactg ttaatgagct tctatggctc tacagaccct tacgttacct   6000

 

atgatctttt tgccacttaa ctcccttttc atgcctatag agagtacttg ggactgttaa   6060

 

tgggctttat tatggctaca gtcccttctg tttgtccaga atttgttact tttctactcg   6120

 

acttgcacag atggtacaag ggactgttaa tgtgcttaaa tgaagctact gtctcttatg   6180

 

tttaaataaa atcccattcc ccacctaaaa ctcttgcatg gctgtagaag gtacttggga   6240

 

cagttaatgg ctttaattag agctacagtc ccttctattg gtcaatattc ccatgcccat   6300

 

actccatttg cattaccaaa gggagtacaa gagactgttg gtatgcttca atgcaattac   6360

 

agtctcttat gttaacctac gatctgatac ccaactatct ccctttttat taatgcagaa   6420

 

gctacatggg acttgttaac ggctttaatt gcactactgt ccttccatta gtctaagatc   6480

 

ccatccccaa cctgattgcc tttacagtac caaccaagga agatacaagg gactgtcagt   6540

 

gtgcttaaat gcaattacag tcccttttaa attttaccca ggatcccatt cccccttatc   6600

 

tcccttttca acactacaga gggtacaatt gacttactgt gcttaaaaga agctatagtc   6660

 

cctcatgtta acctaaggat ctcatcccca actaactctc ctttcatgac tacagagagt   6720

 

acttgggact gttaatgggc tttattgtag ctatagtccc ttttgttagt ctagactacc   6780

 

atttactaca tgatttgcat taccacagaa tatgcaaggg actgttactg cgcttaaatg   6840

 

cagttacaga cccttatgtt aatctagaat cccatcccca actatctctc ttcattaatg   6900

 

cagagcctgc ataggactta ttaacaacct ttattgcact acagtctctt ctgttagtct   6960

 

aggagcacat cccctcctag ttccctttac attactaaag aagatacaag ggactgttga   7020

 

tgggcttaaa tacaactact gtccgttatg ttaacctagg atcccatctc cacctgaatc   7080

 

cgtttgcatg actgcagagg gaccttaggc tttattacgg gcggctacag ccccttctgg   7140

 

tagtttagct tctgttgctg tcctactgga tttgcattac tacagatggt gcaagagact   7200

 

gttaacgtgt ttattaaatg gagctacagt cttttgggtt tacttagaat cccttttctc   7260

 

taacctaaaa ccctttgcat gactgtagag ggtacttggg actgttaatg ggcttaatta   7320

 

gagctatagt cccttttatt tgtttagatt ctcgtgcctt cctactctat ctgcattact   7380

 

aaagagactg taatgcacta tttatgtgct taagtggagc tccagctctt gtgttaacct   7440

 

agcatcctat ttctacctaa ctcccttttc ataactgcag agcctatgtg ggactattag   7500

 

tgaactttac tgcagttacc ttctgttagt gtagattccc atcctctttt atatgatttg   7560

 

ataaccacag actgtacaat ggactaccaa tgtgcttaaa tgcagctaca gtcctttatg   7620

 

ttaagctaga atcccattct cacctaactc ttctcattga tgcagagcct atatgggact   7680

 

tgttaatggg cttcattgct cttctctgtc ccttctacta gtctagattc ccaagctctc   7740

 

ctactcaatt tgcattacca aggggggtac aatggactgt taatgtgcta aaatgcagct   7800

 

acaatctctt acattaatct agaatctcat gccccaacta acgccctttg catggcttca   7860

 

aaggatactt gggactctta atgggctgaa atacagctac agtctcttat gataacctag   7920

 

gatcccattc tcacctatct cccttttcat tgctgcagag cctgcatggg acttgttaat   7980

 

ggtcttaatt gcactgctgt ccctttcgtt agtctaggat tctatcccct cataaagaat   8040

 

tacattaccg tagaggtttc aagggaatgg taatgtgcta aatgcacata gtccccctct   8100

 

ttttgtaacc taggatccca ttccacctaa ctccctttgc attatcacca actgtacaag   8160

 

tgactggtaa tgggcttaaa agcagctatt gttaacctag gatcccatcc ccattcaact   8220

 

tcctttgcat gagtgcagag gacacttggg actgttaatg agttgtattg ctgctacagt   8280

 

ccctcctgtt attctaggat ccatgccttt tttgatttgc attgcagggg agggtactag   8340

 

ggactgttaa tgtacttaaa tagagctaca gtcctttatg gtaaccagga tctggatccc   8400

 

acctaactgc cttgtattac ttcagggctt acataggact tttttaatgg gcttaattgc   8460

 

tctgatttcc cttcttttag tctaggttcc cctccctcct actctatttt cattacccca   8520

 

gagtgtacaa gggactggta agtatgctta aatgcaatta tagtcccttc tgttagtcta   8580

 

gggtcccatt cccacctaat tccctttaca ttaccaaagg agatacaagg gactgtcgtt   8640

 

gtgcttaagt gtgggtacaa tccccatttt ttcttttttc agcctaggat ccctttccca   8700

 

cccaattgcc tttggatgac tgcagagaat actggggact gttaatgggc tttattgtag   8760

 

ccatagtcct ttttcttagt ctgagatccc atctcctcct aagtgattaa cattacccca   8820

 

gagtgtatac aggactggta ctttgctaaa tgcaattata gtcccttcta ttagtctagg   8880

 

atcccatccc cacctaaatc cctttacatt atcacagggg atagatacaa gggactgttg   8940

 

tgcttaaatg taggtacagc cccccccccc cttttaaccc taagatatct ttcccacata   9000

 

aatgcctttg catgactgca gaggatactt gggactgtta atgggcttta ttgtagccac   9060

 

agtctctttc catagtctgg gatcccatcc cctcttaaat gatttacatt atcgcagagg   9120

 

gcgcaaggaa ctgcaaaggt gcttaaatgc aggtagttgg tttttaaacc taggatccca   9180

 

ttcccagcct gacttgcttt gaattactaa agaggctaca agggactctt atgtgtttaa   9240

 

gtgcaggtac agtgcctttt gttaacctca aaatccattc ccacctaact cccttttcct   9300

 

gactgcaaag ggtaattggg actgttaacg ggctgtactg cagccacatt cctctcatag   9360

 

tctaggatcc cattccctcc tatttgattt gcattacccc agagggtaca agggactttt   9420

 

aaagtgctta agtgggagtt cctgtcatgg caccgcggaa acgaaaccaa ctaagaacca   9480

 

tgaggtttgg ggttcaatcc ctggccttgc tcagtgggtt caggatccag cgttgccctg   9540

 

ggctgtggtg taggtcgcag acgctgctcg gatctggcat tgctgtggct gtggtgtagg   9600

 

ctggcagctg tagctccaat tcgaccccta gcctgggaac ttcatatgcc acaggtgtgg   9660

 

ccctaaaaaa aaaagacaaa aaaaaccaaa aaaaacaaaa aaaccaaagt gcttaagtgg   9720

 

cactatagtc ccttatgtta tctaggaccc cattcccatc taacttttca tgactgcaga   9780

 

gtgtacttgg gactgtaaat gtacttaact gcctatacag tctcacctct tagtccagat   9840

 

tacatgccct cctacttgaa ttgtattata acagagggta caagggactt ttaatgtgct   9900

 

tttttaaaag cagctaaatt tccttaccat aacctgaaaa tccatttcca tctcaaaatc   9960

 

cactcccacc taactccctt tccatcacag cagagggtac ttgggactgt taataggctt  10020

 

aattaaagct attctccctt ctgttggtct agatttcctt tcccgcctct atttggattg  10080

 

tacctcagtg tacaatggac tgttaactgt gcttaaatgc aggtacagtc ctttttttaa  10140

 

aacctaggat cctattccca cctaactccc tttgctttac tgcagagggt acttggggct  10200

 

tgttaatagg cttagttgga ctacagtcct ttctgttagt ctaggatccc atcccctcct  10260

 

acgtgatttg catttccaca aaggctataa gggactgtta aggtgcttat taaatgcaaa  10320

 

tacagtccct tatgttaacc tgggatccca ttcccaccta tctccctttg catgactgca  10380

 

aaggtatttg agacctttaa agtagttaat ggctgctgta gcctcttcca ttataagtgt  10440

 

actttcccaa gcactccagc tccatgtaac ctgggagcac atttggggct gttaatgtgc  10500

 

tcatttttag ctgtggtccc ttttataatt ctaggatcac atccctttct gcttctttgt  10560

 

gttacttgtt ggtatttggg acagaaaagt acttaaatgc agctgtgatc taacttaggc  10620

 

tcccatgccc tctaactttt tacattaccc cagtgtatat ttgggactgt taaagtgctt  10680

 

aattgcagct gtggtcccct ctgttagtct aatttcctaa gctcaccaat tccctttgta  10740

 

ttacagcaga gggtacttgg gactgttaaa gtgtttattt gcagctctgg tcccttctct  10800

 

tagtctgggg tccatgcccc cagctttgtt tgcattacca cagagggtac ttggaactgt  10860

 

gaatgtgctt aaattcaggt gtggtccctt ttaatttagg attcctcaac tccttttacc  10920

 

agggagggca tttgggactg tcaaggtggt aagggcacct gcgttccttt ctttctgttc  10980

 

atctaggatc ccattccctc ctactccctt tgtattgcat gggaggattt ggggggctct  11040

 

taaggtgctt aactgcagct gtggtccctc ctattagttt ccaatccctt tctactccct  11100

 

ttgcattacc acagagggta cttgggactg ttgtagtaca tcccattctc tcatgcctgt  11160

 

tagcattaca gcacaaggtc ctgaacacca cggccctttc ttttgcactg ttaatgcaca  11220

 

atttcatttg tccctcatct tctgcagtat ttatagacct cactcatttc ccttgtattt  11280

 

agtggtgaat gccctttact caagacctgt gtactaggat agttaaagtg agccatggta  11340

 

attgacccca aataatgtct ttcacttaag tcccttgtat tctttgtttt acaagaagat  11400

 

gtattaatta cctcagttac ttccttctgg gagtgtttac atgcaaaatt ccagtgttca  11460

 

tggccccttt ctttaaacta atacccctcc ttttttatat tcaggggatg ttagtgaccc  11520

 

aaagtccctc tcttgggatt ctaatgtgca tgtgccctcg tgataagcta atacgttgag  11580

 

ttcagggatt actgactacc caagtctttt tttggtgggg gtgggggaca gttaatgtgc  11640

 

aaaattatac taggatccca tcctatccca ccccttttgc atttggggtg ctgaccaact  11700

 

gtggctgctt ctcctgtaca gtttaaatgc acataatttc agtaatccat gctcccttat  11760

 

gttagactag aatcccattt tcttgcccca tttacattac tttgggagct tctgaatagc  11820

 

caagattcat tttcttggac tgttaatgtg tatactgcca tttgctcctg tacatcaggt  11880

 

aaggaccctc tccattctat ttatatttca gcaggaggtg cctacttctt aagatttata  11940

 

tacttctgca gttaatctgc ataatcttag ttgtcctgta cacattctca attgtccaca  12000

 

actgcttttt aggttaggac tcctttactt atttaagcac agcatactga ctaccttaaa  12060

 

ggccttgtct tgggactgtt actatgtgta attacaattg tccatggtcc tttgagttaa  12120

 

cttgtgtccc aattttcaca ctctctttac tttattgcaa tggggtactg ttcacttaag  12180

 

gcccctttct caaacagtaa tatatgtaat gacaattaca ttaggatcct tccccttcac  12240

 

attccctttg aagtaccaca aggattctga tccctaaggt cccatttctt gacctgttaa  12300

 

tgtacgtgat gtatttgtct gggttcttgt gcattccttt tctcttccag caggaagtgc  12360

 

cccctccaca agactgttaa gtttggacag tcaagatgca catttgtaac tgactgcagc  12420

 

cagtcacctt ggatgttaat gtgtataact gcacatggct catcccatat gaataagatc  12480

 

ctaccctctc agaccccttc tctagtatag caagggtact gattcctaag acctctttcc  12540

 

atggctagtt attgtacata atttgctttt gtacatgttc ctgtacacta aataaggatg  12600

 

cccctcttcc cactcccttt gtcttttaca gggagcgtac actactttaa gatccttata  12660

 

tttatttgta caaagtacat gattttaatt gaccatacca taccctttgg acattaatgt  12720

 

acataattac accttaattc atcttatcct tttgctctcc atttgcagta tatcagggtt  12780

 

tgtgacccta aatcagctct ttccttggcc tattaatgtg cataattgca tttgtccagg  12840

 

ttcttgcaca ctagacaagg acaccccccc acccccgcca acttcctatg ccttccggta  12900

 

agtaggtggt tcccactgct aagaccttta tatttggaca gttaatgtgc agaattgcag  12960

 

ttttccacaa cccagttact tccaggactg ctgtatctcc tttgcaatac ctcaagggat  13020

 

actgtttttc cccaagatcg tttcttgtgg accgtcaata tatgtaattg aaatggttgt  13080

 

cttcatccat agactgagat aatatcccct cagctaacta tcatgacctc agctcttgga  13140

 

caattaatat tcaccaataa catatcaaaa gtactgatca ttagatagga cccctgttcc  13200

 

cttactgtat acatcaggga tactgactaa ggcccccttt tttgactgtt aatgcgaata  13260

 

tttgcaatta tctaattccc cttctattag agtaggacat tatttccttg caccccattc  13320

 

ggattactga aaggggctgc tgaccacaca aaacttctac tgggactgct gatgagcaca  13380

 

atgacgatga gaaatgggtt tttactccct ggccttgttg ggcaagcgct cccagcccag  13440

 

ccccaatttc ccatggtata ataaagtata aatactgcag tgtgccatga actttccatc  13500

 

aaacagcagc ccatactccc actctacttg cattggctcc agtgtatcaa attccaaata  13560

 

gctatggtct tgcccttatg ttccctctcc ataccctttg cctgcccttg gacctttctt  13620

 

atggactatt aatgctcaca attttcaggt gtccatgtat ccagataaga ttgtgctccc  13680

 

ttgcccctcc tgccccttcc acccctgccc tgcccttttg cattgttgct gggaaatgtc  13740

 

cactggcaaa gcccttttgt ttttaagaca ttaacaatcc cagatgtcat tgctttgccc  13800

 

attttgaatt gctgtaatgc ctcagttacc ctttctttgg ttccgcccat cagacatgga  13860

 

cccttccact tccttctttg cattactcct gagtagtact gactacccac agccccttct  13920

 

gtgttattaa cacagtattg attgtcccat tttttcagcc caccagccca aggtctccct  13980

 

accactttga tgttgtattt gtgcagtatt gactaccaaa agcagacctg aactatgtgg  14040

 

gtgggccttc actccttttc ctgcatttgt taatgatccc aattccaatt attgtaacat  14100

 

tctggggaca ggaaccattc ctgcccctct tttactgctt tactaggcaa aatttttaag  14160

 

gcaagtcaga cccaagggaa cttggattgc taccctgtat ttatttatta tttattatat  14220

 

ataagtatca attgaaaatt atctccccag gaaggaagtt tagcattgtc tctgcattct  14280

 

tcctttcaga gcagattgcc tggctaagaa tctctcttgg cctcttgtat attcccaaca  14340

 

tgtaatgcca attgccagga tacaaccaaa aagttgttat tttttaaatt ttttaaaacg  14400

 

tacatctggt ttgcaaggtg gaattgataa cctggtcatt gaatttttga agtcttaaaa  14460

 

acccatttat tccatgtatc tgatgaccag tgtctctcat ttactaaggg tggtgggtct  14520

 

gtggatagac ggctgtgact ttgatatttt agtattacta ccaaaggagt tctagaatgg  14580

 

aattcttagg acaagtatct ttgggctcta ccaccatttt gaaaccattc ctgttttggc  14640

 

tataccatta ttcactttta gaaaaacaac ctgaacttcc taatccttaa atttcttcat  14700

 

ctggagcatc aaccagcccc tgcttatttc aagaacattg ctataaatgg ataaaatgag  14760

 

aaaacatatc ctgaagtgct ttttggaaac tgttgatcac tttgtttgat taatctgtta  14820

 

aataaaatgc gttacattaa attcttagcc taaagcacca cactgaagtg agggcttaga  14880

 

aatgatggga ccagttttct gttttatatt aaaataaaaa taagccaaga tctagtcatt  14940

 

cttttggata taggttttca ggagtgagat agctgcctgg ttaagatgaa taatagccta  15000

 

gcttccagtg tacagggtgt ttgatggcag agaagtatta atgtggaact gctgaaggaa  15060

 

ataactagtt atcactgcag cagttccttg taatcactga aaaggatact cttctctgag  15120

 

aaggatgtca aaagatcggc tcagctcagg gtgcagtttg cactactagc tccttggaca  15180

 

gctgtaagaa gagtctctgg ctctttagac tactgtaagt actactttgt agcttttaag  15240

 

taatcttttc cttattctcg tttctttctc ttagatacta ctcctagaaa agtcagagga  15300

 

tcctataagt ttccttccct gtttctctca tttgcaattt gtatatcacc atatgattta  15360

 

actgacaaaa ttatggaatt aatattgtgt acttggccta tgctgggtta cactgaagta  15420

 

gaaacgatat agtcctatat gatctcatcc cccagatggc tgtattgtta aaggagctaa  15480

 

tataagtata cttgaaataa ttttaggaat tgatactcaa gtgctgtcat gtgaatttta  15540

 

agttttaaaa agggagtttt aaaagggagt tcaatagggt ttaaagttga tcagataagc  15600

 

ttgaaggagg tgtgttaact ttttgtattt actctgggat atgagtaata ttgcagccat  15660

 

ctgggtagta cagttggttt attttaatgt catttggttt ttacctcttt tggaggcatg  15720

 

gaaagcgatt agcaataaga cttagctatt atgtttggct atatatcaag gctggcaaat  15780

 

tgttaaattt gttctaagct tgagtgtttc aagcttcagg gattgggggt ataaatctga  15840

 

tgtgttagat ctttgtaccc ttttttaacc tctgcccaag gacagatgag agtagcagtg  15900

 

ccttcttcgt ctgagctatt tgtgaaactt gtttggcaag agggcagtag aaaagtatgc  15960

 

tttgcaagaa aaccatgacc ttgcctactt tatgatgaag ttggtatacc ctcttccctt  16020

 

ttgcctgttt caacaggtcc tttggtaaga taaaaagctt atcctccctg tttgtaaaat  16080

 

aaacacaaag gtctagctga aaaaaaaatg ttaacatcaa atttgaaaca ttttgtgtgt  16140

 

gtgtgtgtgc acatccatgt atcctagcag gagcaaaaag aatcatatta atgagtgggg  16200

 

cttctctaac tgcccattta aattcacatc catattttct cacagctttt ctcccctaat  16260

 

gcctaaagac attatttgtc tgactgactg ggggtaataa atgaatggtc ctgagccttt  16320

 

ttggaaacgt ggtctctgcc actgtttctc aaacagaaaa atttgtcaag atgcaacacc  16380

 

tcaatttttt tttgagatcc taaagagtat gtgttttgag aaacactgac ttaaagttat  16440

 

ttgaaatgaa aacatgtttt tcaatttcaa gttatctttg ttgaagacat aatttatata  16500

 

atttatgtag aacttaggga tccatgataa tatatccaca aacccccagg gttcttatca  16560

 

ccccaatttg agaaacactg gtctatgctt atgagatctt ttattgctac taacctaagc  16620

 

gaattattca ttattaacac acaacaataa ctacttgttg gaattttttt aaagggatga  16680

 

attctgagcc ggtaccccca cctcaagagg aaggatggat caattttagg tgaattgaag  16740

 

cctatactaa acagcctcca aaggtgaatc ttggagttgt atttcagttc attgcttgaa  16800

 

ataaagtctc tagcagtggc aaaaagggat ggtctgggaa cgtgggcatc ttcaaatttg  16860

 

agaaaatcct tttgttaatt caacagatat ttattggacc aggcactaga ataaacagta  16920

 

aaacctaaga catggtttct gtcaagggat ttgctatttc atggaggatg cagaaatgaa  16980

 

caaatcactt tgggcaattt gatgaatacc ataaaaattt tgagaaattt tgtggggcat  17040

 

agaggaagaa gaatggaaaa aaagacattt tttctatgca aagtgatggc aaaggaaaaa  17100

 

cgcaaggtgt gcctagagag caccttaatc agtcagctgg ggggggaggg gggctttcta  17160

 

agctgaaagc ttacaggcac tactctactg ctttttcctt tttacaagtg cattttaaca  17220

 

aagcactagt tttttttttt tttaagatgg agtgaattat tatttttttt catgggtttg  17280

 

gaggcagaaa gagtgagatg ctgacaaaat tatgaaaaat caccatccat atcaacttca  17340

 

gtgtctaggg actgctgatg agttatgata gggacttgaa tacctcaatc cctaaaaaat  17400

 

tttgtcattt tcaaagagtc aagaaagaaa gcacttaatt tttttttggc atttctctaa  17460

 

atggttattg agatttctct tctgattttc cttcttatag aaccttaata tataaggttg  17520

 

gagggagttt tccaaccctg gttttgtgct tcttttccca tactcccctt gagcttttct  17580

 

gttgtctttc tgcaacttac ctagacattt ctctaaccat ctccctaaat tatagaaaat  17640

 

cttaaaaccc agggatgcta tgactaagca ttaataattt cttttcaggg tatctaggcc  17700

 

ctggtcatca aatgtacacc tggataggaa tttgtgactt gaagaattaa aagttgatct  17760

 

gtggtggctg ttaaatattc ttaacatcct gggaaaataa taccagctta aagagaagga  17820

 

aactgatatc tgaactatta cccctaaacc ttataagctt ggagggcaaa gagtactgat  17880

 

gtgcatggtt aaacagagct aatgccctcc tctgcctcaa gtcttaaaga cttgagtaga  17940

 

agaaatcttg attttcccgc taccatattt ttggctacag ataagtagca cttaacactg  18000

 

gtgtccttca aaatccacct caagttggat ctcaattatt tgcatgaaac ttagctgacc  18060

 

tgctgaatgt aacaaaacta gagggctttg atgctgaagt agccgtactc agtcaatata  18120

 

gttcagagtg tctgagaaga tctggggaga ctggaatagt tgtttccttt tgggtatctt  18180

 

aactaagcag tatatagatg aatttgagct tggatttgtg aatttaaaaa ttctttgggt  18240

 

aaatctgatt gtatatggag tgtccagtta ctgtcattaa ttgggtttca ggaaggagca  18300

 

gagtaaatat gttatggatt gtcatgttta actggaaggc tgtatttagg gatgaaataa  18360

 

ctaatcctag gttaaataag gatggggaag gatgttgcca aaagacttca aagcctgttc  18420

 

tcatattgag aacatcataa aataacagtt aggctttact ggacatctta tctagagaat  18480

 

agagttgaat aaatgatctt ttacatacta taatttgttt gatattgaca taaaggtcct  18540

 

tgtaatgtaa tataataata taatcaggaa tctggaagcc atacctggtg ctttccacac  18600

 

cataacatac catacaaatt actttcacag ctacaaactt ggcttagacc tgcttcagtg  18660

 

agctcctatc ctatagtaag ggcatttagc tacttattat aaatgatcaa ggcaatcgta  18720

 

ataccttgca tcttgaaata ttttcttcaa gaagtaggcc acagatttag tcatctctaa  18780

 

aggtggctat tggtttgacc ccatgttttc atttagttct ttttctatat ttgcctagtc  18840

 

cttctgtgat actgccaagg cttgacctta caggaccttt gggagataac aggctagaga  18900

 

ggagagacaa gaggcaccaa tatctaatgc ttcaagttat tgctgcttca ttttttgttt  18960

 

tgttttgttt ttattgtagt tgatgttttc tcaacacttt tggtatctta ctgaaccctg  19020

 

tctttattct caaggatatt ccaagcaagt gagccctgag actgcaagca gctctaagaa  19080

 

gttccgcatt gatcaggtct tcccttttga gaatctggat aagctccaac caatctaaaa  19140

 

ggatggtttg cagactgtct ggagaaaaag gtaatttatt tggggagccc agtgttgtat  19200

 

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tgagccaatt ttcattaatt cctacacagt tttttttttc tttttgggca tatatatata  19320

 

tacacatttt aactttccac aatgagtttg acctattatt tttatctgtc cctcagagtt  19380

 

aggcttgagt gagatctgta agggtaagca cacctgatcc tcattcataa atgaaggatg  19440

 

agagatgcaa aacaataaat tacttcattt tacatctcat agctacttaa cagaaacctt  19500

 

agagagcaaa cttaatgcct tgaaattatt tccactttcc ttggacagac tggtaagtgc  19560

 

tgaggatttg ttatgatctg tttcatagcc ttgttttggc aggcctaatt ccattgtcac  19620

 

tgtcatttcc ttgttttaag aagtggagga tttgttcatt tgaaaaacca tggaatggct  19680

 

aaagggtaga taacggagcc ctgagggact ggttaagcta tttactggat ccctatcctt  19740

 

ccatacctta tttttccttt tgcatagatt tgcttagctg gggttttata tgcctgttgc  19800

 

cattcctgat ttttctgaat atcctggcac tctggtagtg ccttgtttat atataagctg  19860

 

ttctggaaat atactatgta gattgagtag aaaagttatg tttactttgg caattctcca  19920

 

gcatcttact acttaatata cacattaaaa tagaggaatg ctgcaaaact agatgagaga  19980

 

gaggcacatt ggttgagata gattgctcag ttcttaagat agtgctttgt aaaagaagcc  20040

 

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cttttctttt tctttttctt tttttaattg aagtattgtt gatttacaaa gttgtgtaaa  20160

 

tttatgctgt acatcagagt gactcagtca tatacatata tacattcttt ttaatattat  20220

 

tttccattat ggtttatcca aggatattga atatagttcc ctgtgctgta cagtatgacc  20280

 

ttattgttta tccattctat atgtaatagt ttgcatctac taaccccaac ctcccactcc  20340

 

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ctaccaacag tgtaggaggg ttcccttttc cacattggaa ctttcctaaa gtgacttgat  20880

 

ggctcttggt tgagaaagtt ctaatttctc cttttactag tctcaacccc ttcatttctt  20940

 

gacctccact atattttatg aagacaccag gacattagaa gtctatactc tagaggattg  21000

 

ttcatcagtg gagattggag aataaagcac agtgtgggta ttttgctaat tatttagctc  21060

 

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ttatttgttg ctaggctggt agccagaata tagaactcta cacagttcta aatttccact  21180

 

tgttaatcca tctgaagaaa aggatagaca tagtttaatt ttactactgg ccactcactg  21240

 

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ttgcacttag ctttcccttt agattgtttt cattgttgtc aaccatgtct gttttggtaa  21720

 

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tgaaaagaat agcaggctgc atgagttcgg gtgtttaggg tgggactgta ggatgtgata  21840

 

gaggcttaca gccaagtttt ctttctttta ggaaaacagg gacaacaact gccatatctt  21900

 

acattcatca tgacattcat catgagcaga tcataattct ggaccctttg atccccaaag  21960

 

cctcccttga ggccctgttg gagaacttca ccaatcattt atatacttca agatgccttg  22020

 

ggataactgg acaaaacaaa aaaacaacct gtttgagaag ataaaacagt tgtatctttt  22080

 

tatgctgtgc ctgctaattg aaagaagcct cataactatg aatgtgaacc tgactaggaa  22140

 

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gtgtagtaag gctttgtata cattagtacc aacacattag tattgtatac attagtatcc  22320

 

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ttatttggtt tccttctcat ttttcggtag ctcctgattg ttcccttcat atttgccaaa  22620

 

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cctgtatgaa tcactttaga gctaatagct ttttgttgga ggtttgtgtg ggatggggta  22800

 

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ccttagaagc cttaacaaat agaaaattaa accaaaacaa tggttttgtt tttttgctga  23040

 

aagggtgtcc ctttctaacc tccttttgtg agagaatctg tggttaagat ttagtattaa  23100

 

agaaaatcca gtccctgaag ctgacactgt aattgtaaag ggtgtgaaaa tcaaggcagt  23160

 

tttctaaagg ggtgaagata taaagtgagg ggattgatta ggtgctctct aagggccctt  23220

 

tattaaaata ttcactcatc tgtggcacct aggaaacaag tcagttagtt gaatgtttaa  23280

 

atcctctgcc actcattagg tgaagagcct gtggcagttt agagtctaat tagacttgtc  23340

 

tgtttgtgaa ggttaaataa aataatatat ggaaagagct tcacatggta ggttaaaaaa  23400

 

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gtagaaaagt atctgttggt agtgcttaat gttattataa tcattatcat tagtaataat  23580

 

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gtgatgctta ttgtggctat tgcgctcctc actgtatttt gtctcttcca tttcttaccc  23700

 

tcttccagtg attgtctgcc tttgcttatc ttaaactctt aagtgtgtat ttgtttgctt  23760

 

gtctctttct ttcttccttg cgcatctttg gtctttttct ctaaattgtg tcttacccat  23820

 

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ttgattctcc ttggtctcct agatctggct ctttcactgt tgttcacttt gtgtctcttg  24000

 

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tttgtgaatt ctgattgtct gttatccatt ccccttcttg ttcgtttgac atttcaccta  24120

 

gtctaatact ggctaccctt ttgctgtttc tactcctgat ctcacatttc tcttttcaca  24180

 

tattcttttt gcctctcttg ggccattttc tctttttcgt gctttgtatg cttctgtgtc  24240

 

tctttgtgct ttgtgatttt ccatttcaac atccatctct ctgttctctt atttcttctc  24300

 

tacttttgac ttcctattca cctttgagta ttttggcctc ttcttgtgtc tatgtctccc  24360

 

ctttgattac atgcaattct ctcgccttgc acattttcta tgtatgtgtg tgggctcttg  24420

 

tgtgtttgta acaaaggggc ttcctaaccc cttctcagta ggtgcaagag tgtcagctac  24480

 

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tgtgctgtga aatgatccaa gaccaataga aggcccaaga tctggactgg agttggatgg  24600

 

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catggcccag aatctgggaa tgatagaagc accaagacca agggaaatta caagatgata  24780

 

accctaaatc ccagctcttt tctattgttc tcctccctac tcttggatat tttcacttct  24840

 

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cttaaaccag tttttttaaa cttccatttc tcttcacctc cactccactt gagagacaca  25020

 

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gaaagtatca tgctgttgag ggggaaaaaa tgtgccaggc tatctagaga aaatatgaag  25140

 

agatgctcca ggccaatgag aagaattaga caggaaatac acagatgcgc cagcctgctg  25200

 

agaagcatca gccagcaaca ccttactcct ttgagcttag gtgagcagga ttcctgaggt  25260

 

ttgggtacta gtgatggtta tgaaaaagga aattgggtct gggacagagt gagggaggtc  25320

 

ccaaggagat agcctgaact ccctgctcat agtagtggcc taataatttg gcaaactgca  25380

 

ctaaccttgc gcctggtttt aatacccacc tctaggctta aagttgaaag aacttacgcg  25440

 

tatttagcag gtttaatact ttccttcatt tctttcctct taccatgagg gaagataatt  25500

 

taaatgaaaa tatatgtgaa acctttgtaa aacacaaaaa aacaaagcat tctcattaat  25560

 

aacatattgg catttgtgca cagcaaagat ttggaaatgt actgtcagtt gtgaagtact  25620

 

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catatggttt cctgctttaa aaaaacaagt gaatttggtc tgtgggccat agtttattac  25740

 

ccctgatgta attgccaggg actgtgttct gaaattaatt ccttctctgt gcctgtccct  25800

 

gtattaggca ctaaggatgt aatgattact tatgatcata tctaggtgat ccaaagaaaa  25860

 

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ctgagggatt taagataatt gtgaacactt ataatgtgcc agataacatt ctaggcatta  26040

 

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catattaaag tgctttgtag gagttcccgt cgtggctcag tggttaatga acacgactgg  26160

 

catccatgag gacacaggtt caatccctgg cctcgctcag tgggttaagg atctggtgtt  26220

 

gccgtgagct gtggtgtagg tcgtagatgc ggctcagatc cctcgttgtt gtgcctgtgg  26280

 

cgtaggccag cagttacagc tccaattcaa cccctagcct gggaacctcc atatgctgct  26340

 

ggtgcagccc taaaagacaa aaagaaaaaa aaaaacaaca aaaaaaaata aagtgctttg  26400

 

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tcccaagtaa taagagggag gtttatgtct tacactacag aggtataaga attagatatt  26580

 

gcttatttta gtcaatcaag actttaccag tgaggtcaga ttaaattatt accaggatgt  26640

 

tttcccaggt aacaggaaaa tgtaatgaat gagattgagt tttctaaact ataaaatgct  26700

 

tcataaacat aagacattag atgttttcta tgtgaataaa acttatgtga ggcaggcatt  26760

 

atctctacaa aattctcatt gtgtgcgtaa cccactacga gaaaaattgt ataaatattt  26820

 

atacaaactg tttaaatact taagtgaatt aattattcat atcaattgcc tactatgtga  26880

 

actcactgtt agaggcatga aagatatgca cacatttatc attttattgt gcctgtaaat  26940

 

gagaataaag taatacatat gttagcattt tgtgaactct aaagcaccat gtaaatataa  27000

 

ctattgatct tcttatttgg tgtgcctgta ctagtttaca aaattgcatc atagttatac  27060

 

tatgaaaaag agaaaaaaaa ttgaggaagg atttttttac tcttgaacac tttgaatatg  27120

 

atatttaaag gattaaatgc ctgatgaatg aaagactaaa taataatttt ctattatgtg  27180

 

ccagtctcct gaatcagggc tgtgaagata atccattgtt ttattgtgtt ctaggtagca  27240

 

gaatgtaatg tgtaaaatca atttgtaagt cttaaactgg catacatttc tgctgaatga  27300

 

acattgatta gttactcttt cttatcccca gagatagcaa gtggggatgc taaattcatt  27360

 

gtcattgtca ctgaacctgc aacagagatc tgtgtgtaaa tttacaaagc ctattgatct  27420

 

atacaaatat taggaattaa ctgttggctc aatgagtgat taccagttac tttctatgag  27480

 

gctcagaact gcacatgctc taggatatga aaatgatatc cttatctgat gttccctgga  27540

 

ggaaatgagg taataggtgt gggaatctag actgaaagtt acttaatcac tgccaagctt  27600

 

atttgatggc aaaaacatag gaaaaatgga attgtgcaag gcagtatgct tctgaatgct  27660

 

gagctaggtg gaaagaaaat ccagaccaga aggctacttg ctcctttgcc tgattgacga  27720

 

gatgggattt ttttctttaa gcaagatgtt gtgcttgttt ttaaattcta aagatggagg  27780

 

tgaatgagat ccaccctgac atggcattaa aggagtaaaa attaatggct caagttgctt  27840

 

ttagattaat ttgataaaca gtatctttta tgtggaatac attgttctag gtcctgagca  27900

 

taacagaaat gaaaggggcc tagtctaaag ggcattaggt agataacaaa tcatggctga  27960

 

aaattcagaa atgtctttga tttctggaaa tatttgagtg cctctggaag aatttgttga  28020

 

ttagatctga tccaaaaaaa cctattgact tgccttggaa attgaaaaaa tagggaaaaa  28080

 

aagatatgat tctgtcaatg taaaatgaca tttttcctag atctggaaag tcccagtgtc  28140

 

acttggtcat tgacatagat tgaagccaga agattgataa aagagctcat ggtttgacct  28200

 

ttaattcttt aacattctgc ttttattatg gttaaatggt ttatgatgaa aatcaagctg  28260

 

aaacaactag ttctaaaagt gttttgtttt gttttttttt tttttttact cattggtctg  28320

 

ccagagagtc agaaagccac ttaactaaaa actaaaaaaa aaaaaataat aaaaacttcc  28380

 

tagatttttc atattttgta aaaaaactag tcacttgagt gaagtactgt tcttaagtac  28440

 

caagaatgaa gattttcaag atctagatca aaatataatt ttggtagctt atagaggaaa  28500

 

cataagaaca aatttaataa gagactgaag ttctttcatt agttgaaaaa cttcattgag  28560

 

cagccatgat attaagaaac tgaaatggaa tggttaagta gacaccttct gcttggcatg  28620

 

tgtggtagcg taggaataag agacctttgt gtttactcat tcatgtaaac actgaagaag  28680

 

atgatgctaa attaaataga tgtggcacaa aagcacttag tcttggagat gtagttaaaa  28740

 

acaacagtaa gaagaaatgg agtgaaactc ttcatgaaac agaaatgtct atttcaaggc  28800

 

attgtgtgat actcctagac agaaaacaaa agatcttgac tgaaagatac ttgcttggct  28860

 

tggaaactga aatataagag gagaggttac tgtttattca tattttcatt tatttgttca  28920

 

ttctgccagt atatttgagt gcctactgtg tgtaagcttt cttggctagt ttcttagttg  28980

 

gccccagaga catgaaaaaa tgaatgtctt ccaagagaac ttagaacttt aaaaacttgc  29040

 

cttttggcca gttttctggt taggggcaag gcttagttcc tcactaacat tgtgtagctt  29100

 

aattcttgct ccatatttcc tctgctactc tggccactac aataagcagg gatttctatt  29160

 

gcgcttgctc cttccttaac aatagtactt catttttcct agtccatcct taatgaaaaa  29220

 

tggccgtgaa ctttggtggg caggagagat gagaaacaat tgattcccta actctagtct  29280

 

cattggtacc agcttttggg aacattcata ttcaagccac aactggtttt gaaacacatt  29340

 

taccagtttt gatgattctc agttcacctt ttatattatg gcaaatgtat ttttaagaga  29400

 

caatccccca aaagtacata acaagtttgg agatgttttg gttttgcagt agcttctcac  29460

 

cttacactta gaaatctttt ccttctcacc atcaaaacct gcttaagaaa ggacttatta  29520

 

tttgtaacag aatagtgcag agaatgaaaa taacaatttt attcttaagt tttaggaata  29580

 

ataaaaattg gaagtaattg gaaaaaattg gatagaagaa atacccccac caaaaaaagt  29640

 

ctaaattttg acccaaatgg gctttggcct tttctatttt taaatcactc agagagggtg  29700

 

ggataggagg aagagtgaaa gaaaaggtca gacctagttc gatgggcaac ctgcctttgt  29760

 

tctggattgg tcttaaaagt attactacct ccagatctaa cttgggggat tgcatcttta  29820

 

gtttaaatgc aactccagta actggtcact attaagatga ggacaaattc ctttgttccc  29880

 

cctcatttct atatgttttt gagaaacatt ttttgttaat ggctgtcaat taagccttgt  29940

 

gctagatgtt atgaagttga ttaattaaat caatgtagtc ttaagctaaa gccgaaattc  30000

 

attgcaaaag aagagggctt ttttgtttac tgtaagtcat acatatttca tacatatttc  30060

 

aaagcatcca aactttagtt tacatggcaa gccaacagta acatctgtga tggagaagga  30120

 

aatagatgaa tggcgaagga tagttgctga agggagcaaa gttgaagagg attttctgac  30180

 

atgttaataa tgtttaataa aaaaaataat gtttaatata tga                    30223

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  2

gccugguuaa gaugaauaat t                                               21

 

 

<210>  3

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

uuauucaucu uaaccaggct t                                               21

 

 

<210>  4

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  4

gugccugcua auugaaagat t                                               21

 

 

<210>  5

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  5

ucuuucaauu agcaggcact t                                               21

 

 

<210>  6

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  6

cccuucauau uugccaaaut t                                               21

 

 

<210>  7

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  7

auuuggcaaa uaugaagggt t                                               21

 

 

<210>  8

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  8

gugacucauu cccuuugaut t                                               21

 

 

<210>  9

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  9

aucaaaggga augagucact t                                               21

 

 

Claims (2)

1.一种猪anti-Xist siRNA序列，其特征在于，所述序列为如序列表SEQ ID NO：2和3所述。

2.一种通过抑制如SEQ ID NO：1所示的猪Xist基因表达来提高体外培养猪克隆胚胎的囊胚内细胞数的方法，其特征在于，所述方法通过以下步骤实现：

1)猪Xist基因的电子克隆：对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90％以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列得到Xist RNA序列；

2)有效anti-Xist siRNA序列的筛选：以母猪cDNA为模版，设计引物，进行定量PCR反应，筛选获得有效的anti-Xist siRNA1序列，所述anti-Xist siRNA1的序列如SEQ ID NO：2和3所示；

3)anti-Xist siRNA1显微注射猪早期核移植胚胎；用anti-XistsiRNA1抑制克隆胚胎中Xist基因表达，提高体外培养猪克隆胚胎的囊胚内细胞数。