CN108239671A

CN108239671A - 一种猪lncRNA的分离和其特异表达启动子鉴定

Info

Publication number: CN108239671A
Application number: CN201711211547.6A
Authority: CN
Inventors: 徐德全; 侯斌; 刘敏; 苏涛; 丁海生; 游祥宾; 周昌繁
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-11-28
Filing date: 2017-11-28
Publication date: 2018-07-03
Anticipated expiration: 2037-11-28
Also published as: CN108239671B

Abstract

本发明属于猪基因工程技术领域，具体涉及一种猪lncRNA的分离和其特异表达启动子鉴定。本发明的主要步骤如下：设计定量引物对lncRNAXLOC_2017489做组织表达谱分析，鉴定其在子宫内膜中特异高表达；克隆lncRNA 5，侧翼序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)，构建其缺失重组质粒，转染细胞，检测每个缺失片段启动子活性；其中Q6启动子片段活性最高，次为Q3、Q4、Q7、Q8。本发明的高活性启动子片段的序列如SEQ ID NO:3，4，6，7和8所示。本发明为猪的遗传改良和转基因提供了重要的元件和手段，可强化猪转基因表达的组织特异性和稳定性。

Description

一种猪lncRNA的分离和其特异表达启动子鉴定

技术领域

本发明属于猪基因工程技术领域，具体涉及一种猪lncRNA的分离和其特异表达启动子鉴定。

背景技术

我国是世界养猪大国，猪肉是我国人民的主要肉食来源。养猪业在我国畜牧业和农业经济中占有重要地位。繁殖是猪生产中最重要的经济性状之一。养猪生产中存在的繁殖效率低下是困扰和制约着我国养猪业健康发展关键因素之一，进而影响猪肉的有效供给，导致近年来猪肉价格波动，多次成为领涨CPI(Consumer Price Index)的重要因素。无论从经济方面考虑还是从环境方面考虑，研究母猪的高繁殖性能，在保证需求的同时，减少能繁母猪的饲养量，具有重要的理论和实践意义。

子宫内膜是人和动物雌性生殖器官的一部分，是人和动物胎儿或幼体生长发育的场所，是维持生理特征和生育功能的重要器官，在胎儿附植、妊娠的建立和维持过程中起着不可或缺的作用。子宫内膜具有高度的增殖活性，可在雌激素、孕激素和细胞因子等的作用下发生周期性的改变，表现为子宫内膜上皮细胞和基质细胞的增生和脱落等。同时，子宫内膜对胚胎的可容受状态又直接影响着母体对胎儿的识别、胚胎植入的成功等。然而它又极易受流产、感染、内分泌等多种因素的影响，导致子宫内膜的再生能力下降，容受性降低，严重影响繁殖力。

非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)是近年来发现的一类在生物体内普遍存在并在生命活动中行使重要功能的RNA分子，它不编码蛋白质，也不直接参与蛋白质的合成。ncRNA广泛存在于从低等到高等的多种生物中，种类繁多，主要包括：miRNA(microRNA)、piRNA、siRNA、lncRNA(long noncoding RNA)等。lncRNA是一类长度大于200个碱基，通常由聚合酶转录形成，缺少完整的开放阅读框，没有或很少有蛋白编码能力的RNA。哺乳动物基因组序列中4％～9％的序列产生的转录本是lncRNA(相应的蛋白编码RNA的比例是1％)。作为分子生物学中的一个全新领域，lncRNA是以RNA的形式在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等多个层面上发挥调控基因表达的作用。作为哺乳动物转录组的重要组成部分，lncRNA的功能还有待于进一步深入研究。起初lncRNA被认为是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能。但近年来越来越多的研究表明lncRNA和蛋白质同等重要，具有多种重要的调控功能，能参与到细胞增殖分化和个体发育等几乎所有重要生命功能调控途径中，包括核内运输、细胞周期调控、X染色体沉默、染色质修饰、基因组印记、基因重组、转录、剪切、mRNA降解和翻译等。

RNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的。启动子是影响转录复合物形成和转录起始的关键DNA序列，含有RNA转录的重要信息，转录的强度以及特异性很大程度上决定于它(Remenyi et al.Combinatorial control of geneexpression.Nat Struct Mol Biol.2004,11:812-815；Kim et al.Direct isolation andidentification of promoters in the human genome.Genome Res.2005,15:830-839)。因此，分离克隆lncRNA的启动子，研究其启动子的结构、功能和核心启动区的定位，是理解其转录调控机制及调控网络最基本、最重要的内容。另外，可利用组织特异性启动子构建更有效的基因工程表达载体，强化转基因表达的组织特异性和稳定性，应用于基因工程、育种工程等领域。

发明内容

本发明的目的在于分离获得在猪子宫内膜特异表达的lncRNAXLOC_2017489，克隆、鉴定其启动子序列，应用于猪遗传改良的基因工程和育种工程等领域。

本发明克隆得到了猪lncRNAXLOC_2017489 5’端侧翼2442bp的序列(启动子)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

本发明通过以下技术方案实现：

1.选择中国地方猪种梅山猪和外来猪种“大白猪”(欧洲血缘)为实验材料，在其分别妊娠18天和32天时，提取子宫内膜组织的总RNA，通过转录组测序，获得差异表达lncRNAXLOC_2017489信息。

2.根据猪lncRNA XLOC_2017489序列设计如下用于猪lncRNA XLOC_2017489表达谱分析的引物序列，如下所述：

正向引物XLOC_2017489-F：5'CCGTTGGTGAGGGACTAAGAG 3'；

反向引物XLOC_2017489-R：5'GTATGGTGCTGGGTTGGAATG 3'。

利用TRIzol(购自Invitrogen公司)提取猪子宫内膜、卵巢、下丘脑、脑垂体、心、肝、脾、肺、肾、背肌等组织RNA，反转录得到cDNA，利用该引物进行荧光定量PCR分析，确定其表达特异性。

3.将lncRNAXLOC_2017489在猪的基因组中进行比对，根据其5’侧翼序列设计如下用于猪lncRNA XLOC_2017489启动子扩增的引物，序列如下所述：

正向引物F：5’TGACTCCTTATCTCCACCCT 3’，

反向引物R：5’GCAACCTGTTTCTGCCTCTA3’。

具体步骤包括从猪血液中提取基因组DNA，利用该引物进行PCR扩增，克隆，提取质粒pMD18-T-XLOC_2017489，进行测序。

利用生物信息学对所获启动子可能存在的转录因子结合位点进行分析，设计出9个长度不同的启动子缺失片段的扩增引物，各引物的核苷酸序列如下所述：

Q1正向引物：5'CGACGCGTCGACTCCTTATCTCCACCCT 3'

Q2正向引物：5'CGACGCGTGTGGTCAGTCTCAGGTCTTG 3'

Q3正向引物：5'CGACGCGTAGGGGTAGAATCGGAGCTAT 3'

Q4正向引物：5'CGACGCGTGCAACCAGGAACATTCACTA 3'

Q5正向引物：5'CGACGCGTGCCATAAGCCTCCTCATACC 3'

Q6正向引物：5'CGACGCGTTGCTTCCAAGCCACTTATGT 3'

Q7正向引物：5'CGACGCGTGCGTCCAGCACTTTATTCTA 3'

Q8正向引物：5'CGACGCGTGATGGAAATTCCCAGGCTAG 3'

Q9正向引物：5'CGACGCGTGCTTTGTCATCGTGTTCCCA 3'

反向引物QR(即上述正向引物的共用引物)：5'CCCTCGAGGCAACCTGTTTCTGCCTCTA3'，

以质粒pMD18-T-XLOC_2017489为模板，利用上述正向引物分别与反向引物配对进行PCR扩增，获得9个长度不同的lncRNA XLOC_2017489启动子缺失片段。之后将9个缺失片段分别连接到PGL3-Basic载体(美国Promega公司)上，转染PK细胞(来源中国.武汉.武汉大学，中国典型培养物保藏中心)和Hela(来源中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心)细胞检测每个缺失片段的活性，确定其核心启动子区。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1为本发明克隆所的猪lncRNAXLOC_2017489的启动子序列Q1。

序列表SEQ ID NO:2为从SEQ ID NO:1克隆得到的作为另一个启动子Q2应用的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:3为从SEQ ID NO:1克隆得到的作为另一个启动子Q3应用的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:4为从SEQ ID NO:1克隆得到的作为另一个启动子Q4应用的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:5为从SEQ ID NO:1克隆得到的作为另一个启动子Q5应用的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:6为从SEQ ID NO:1克隆得到的作为另一个启动子Q6应用的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:7为从SEQ ID NO:1克隆得到的作为另一个启动子Q7应用的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:8为从SEQ ID NO:1克隆得到的作为另一个启动子Q8应用的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:9为从SEQ ID NO:1克隆得到的作为另一个启动子Q9应用的核苷酸序列。

图1：猪lncRNA XLOC_2017489在不同组织中的表达谱。

图2：猪lncRNA XLOC_2017489 5’侧翼序列的PCR扩增结果。

图3：用于分析猪lncRNAXLOC_2017489启动子不同片段活性的PGL3-basic载体结构示意图。

图4猪lncRNAXLOC_2017489启动子缺失片段重组质粒的双酶切鉴定。附图标记说明：泳道Q1-9分别为pGL3-Q1、pGL3-Q2、pGL3-Q3、pGL3-Q4、pGL3-Q5、pGL3-Q6、pGL3-Q7、pGL3-Q8、pGL3-Q9重组质粒的酶切结果。

图5：用于分析猪lncRNAXLOC_2017489启动子不同片段活性所用的pRL-TK内参载体结构示意图。

图6：猪lncRNAXLOC_2017489启动子缺失片段重组质粒转染PK和Hela细胞的活性检测结果。附图标记说明：图6中的A图为是在PK细胞中的活性；图6中的B图是在HeLa细胞中活性。

具体实施方式

实施例1利用Invitrogen公司的Trizol Reagent试剂提取猪相关组织RNA

(1)取出适量(50-100mg)猪组织(心、肝、脾、肺、肾、背肌、下丘脑、脑垂体、卵巢、子宫内膜)放入提前预冷的研钵中，并在液氮中迅速研磨至细粉末状，连同液氮一起倒入RNase-free的15ml离心管中，待液氮挥发完立即加入1ml Trizol试剂，吹打几次，涡旋振荡1min，室温放置5min；

(2)每管加入200μl氯仿，盖好样本管，常温用手剧烈摇动15s，冰浴10min；

(3)4℃，12000rpm离心15min；离心后，混合物分为三相：最下层红色的酚-氯仿相，中间相以及上层水相。RNA绝大多数留于水相，水相体积约占Trizol试剂体积的60％；

(4)将水相小心移至新的离心管中，加入500μl异丙醇，混合均匀以沉淀RNA,冰浴10min；

(5)4℃，12000rpm离心10min，移去上清；

(6)加1ml 75％乙醇溶液，上下颠倒混匀，洗涤RNA沉淀，4℃，7500rpm离心5min，弃上清；

(7)将RNA沉淀室温干燥5-10min；

(8)根据沉淀RNA量，用适量DEPC水溶解RNA，检测合格后混匀分装，封口，于-80℃保存。

实施例2猪lncRNAXLOC_2017489在不同猪组织中的表达谱

(1)使用宝生物工程大连有限公司(TaKara)的反转录试剂盒合成cDNA：在一个无RNA酶的离心管中分别加入5×gDNAEraser Buffer 2μL，gDNAEraser 1μL，Total RNA1μg，加RNase Free dH₂O至10μL。42℃反应2min；然后依次加入Buffer 4μL，RT Enzyme Mix 1μL，RT Primer Mix 1μL，加RNase Free dH₂O至20μL。37℃反应15min，85℃反应5s。合成的cDNA于-20℃保存。

(2)采用SYBR GreenⅠ荧光染料(购自Invitrogen公司)，在Roche公司的LightCycler480仪器中进行实时定量PCR。利用2^-△△Ct法进行数据分析。试验结果表明猪lncRNAXLOC_2017489主要在子宫内膜中特异高表达(见图1)。

定量PCR反应体系和定量PCR反应条件见表1和表2所述。

表1 定量PCR反应体系

表2 定量PCR反应条件

实施例3利用苯酚抽提法提取猪血液总DNA

(1)取灭菌的50mL离心管，加入1mL抗凝剂EDTA(0.5mol/L)，加入采集的猪(大白猪)血20mL左右；

(2)以3000rpm的转速，4℃离心10min，弃上层血清；

(3)加入1.5倍体积的ddH₂O，轻摇10min，使红细胞破碎；

(4)5000rpm，4℃离心10min，去除上层红细胞浆；

(5)加入20mL生理盐水洗涤，7000rpm，4℃离心10min，弃去上清，留下白细胞沉淀；

(6)加入1×SET缓冲液悬浮细胞，加入SDS(10％)至终浓度0.5％，再加入蛋白酶K(10mg/L)至浓度100μg/mL，55℃消化过夜；

(7)加入相同体积的饱和酚，按紧管盖，慢慢上下颠倒20min混匀，8000rpm，4℃离心10min；

(8)小心吸取上清液，移入新的50mL离心管，弃掉下层苯酚；

(9)重复步骤(7)、(8)一次；

(10)加入相同体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)混合液，轻轻混匀，4℃，10000r/min离心12min，收集上清；

(11)按照如上体积加入氯仿/异戊醇(体积比24：1)，重复步骤(10)；

(12)加入4倍体积的无水乙醇(预冷过)，摇动离心管，可见絮状DNA；

(13)将絮状的DNA挑入1.5mL无菌离心管中，用70％乙醇洗涤一次，4000rpm离心8min，弃去上层乙醇；

(14)在通风橱中干燥DNA，加入适量TE溶解DNA。使用Thermo NANO Drop2000Spectrophotometer对所提取的DNA进行浓度和纯度的测定。检测合格后的DNA样品置于-20℃保存。

实施例4:猪lncRNAXLOC_2017489侧翼启动子区特异DNA片段的获得

分别以猪基因组DNA为模板，用引物F和R进行PCR扩增。

PCR反应体系见表3。

表3 PCR反应体系

PCR反应条件见表4所示。

表4 PCR反应条件

PCR产物(图2)经回收、克隆后，进行序列测定。测序由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成。获得猪lncRNA XLOC_2017489 5’端侧翼2442bp的序列，其核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：1所示。

实施例5猪lncRNAXLOC_2017489 5’侧翼启动子重组质粒转染PK及BHK细胞活性分析

以克隆到的2442bp(序列见SEQ ID NO：1)5’端侧翼质粒为模板，用Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6、Q7、Q8、Q9正向引物和反向引物QR分别进行PCR扩增。

PCR反应体系见表5。

表5 PCR反应体系

PCR反应条件见表6

表6 PCR反应条件

扩增产物经回收(参见百泰克胶回收试剂盒说明书)，将回收产物与PGL3-basic(美国Promega公司)空载体用XhoI和MluI双酶切，电泳回收酶切后的缺失片段及PGL3-basic空载体，用T4连接酶过夜连接，转化进入大肠杆菌DH5α挑取阳性克隆提取质粒(参见Omega E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit说明书)，连接后用XhoI和MluI双酶切鉴定，结果见图4，酶切片段大小与预期一致，Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6、Q7、Q8、Q9分别为2442bp(SEQ ID NO:1)、2198bp(SEQ ID NO:2)、2073bp(SEQ ID NO:3)、1756bp(SEQ ID NO:4)、1394bp(SEQ IDNO:5)、1137bp(SEQ ID NO:6)、811bp(SEQ ID NO:7)、514bp(SEQ ID NO:8)、227bp(SEQ IDNO:9)。

转染前一天，取一瓶生长良好的细胞经胰酶消化后，加入2ml新鲜不含任何抗生素的10％FBS(购自美国Gibco公司产品)细胞培养液，用吸管将细胞完全吹散形成均匀的细胞悬液后，用细胞计数板对细胞进行计数。计算出24孔细胞培养板共需细胞量(每孔细胞数目约为0.5-2×10⁵)。向其内加入额外的新鲜的不含任何抗生素的10％FBS细胞培养液(总体积12mL)，吹打均匀后，每孔分装500μL细胞悬液，轻轻晃动培养板摇匀细胞后置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

待细胞密度达到80％～90％时进行转染(转染步骤参见invitrogenLipofectamine^TM 2000)。本试验以PGL3-basic(购自美国Promega公司)为阴性对照，PGL3-control(购自美国Promega公司)为阳性对照，以PRL-TK(图5，购自美国Promega公司)做内参质粒(用以校正转染效率)，以Lipofectamine ^TM 2000做转染试剂，每个缺失片段进行3次重复以校正误差。

细胞转染48小时后进行收集，用1×磷酸盐缓冲液(PBS，配制方法为：将NaCl8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·H₂O 1.56g，KH₂PO₄ 0.2g倒入盛有800ml双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，调节pH至7.4，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液)清洗细胞两次。用吸管吸干PBS后，每孔加入100μl 1×PLB(Passive LysisBuffer，4体积的ddH₂O加入1体积的PLB原液)。室温下置于摇床温和摇动20min。将细胞裂解液加入灭过菌的1.5mL离心管中，用于测定双荧光素酶活性。

双荧光素酶活性测定采用Promega公司的Dual-Reporter AssaySystem进行分析(具体操作参考Dual-Reporter Assay and Dual-Reporter 1000 Assay Systems)。结果如图6所示，在PK和HeLa细胞中，猪lncRNAXLOC_2017489启动子具有明显的转录活性，其中Q6活性最高，其次是Q3、Q4、Q7、Q8，且最小片段Q9仍具有启动子活性，高于PGL3-basic，说明lncRNA XLOC_2017489启动子核心区域可能位于-212～+15bp之间(以转录起始位点碱基G为+1，上游第一个碱基为-1)。

由于猪lncRNAXLOC_2017489主要在子宫内膜中特异高表达(见图1)，故可利用猪lncRNA XLOC_2017489组织特异性启动子，特别是高活性片段构建更有效的基因工程表达载体，强化转基因表达的组织特异性和稳定性，应用于猪遗传改良和转基因表达等领域。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种猪lncRNA的分离和其特异表达启动子鉴定

<141> 2017-11-28

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2442

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(2442)

<400> 1

tgactcctta tctccaccct agatctgtct cctgagctcc aggcacgaac agcctagaca 60

cctgcctatt ggacagctct acggatattt tatagacacc tcgaaggcaa catgtcccaa 120

actgaacagc ttttcttcct cccaaacctg ctcctccact ggtacttcca accatgtcag 180

taggcaaaat tgcctcgcca gagtcccagg actcatcctc aacagctgtc ccaactgtca 240

gatgtggtca gtctcaggtc ttggggagcc tagtccccaa aacatctcct ttgaaaaaga 300

atcccttctt tttttttttt acttgctttt tttagggcca aaggtgcagc atgtggaagt 360

tcccaggcca ggggtagaat cggagctata gctgcctgcc tacaccacag ccacagcagc 420

accagatcca agctgcatct gcaacctaca cagcagctca cggcaatgcc agatctttaa 480

cccactgagc gaggccaagg attgaacctg catcctcatg gatactagtt ggattcgttt 540

ctgctgcacc acaacaaact tccaagaatc acttgtgatt aggtaataca tcacatggca 600

caaaattcaa agagaaaaaa aagtacccct atctctctct cttccagccc cataggttcc 660

cccccccgcc ccgccccagc ccccctgcaa ccaggaacat tcactaataa ctgctcttta 720

tcctttcaaa aatactctat gcatatttga gcatagatat gtatatattc cttgaaaaac 780

acagtaatca gaaagtacat taggaaaaca gttcttgctt ttttcattta atatattttt 840

gaaggccatc tcatctgtct ctacctcccc agacacgact gccattcttc caaaccgggc 900

ctctgccctc catcctggga gtgggttccg acccgctctc tttgcgcttg ttcacaggct 960

tggtttgctc agatctccag tgcacactag agccagactc atctttgtaa gatgcaactc 1020

gtgcctcaag ctgtgatcta gatgccttgc cataagcctc ctcatacctg cttcctctca 1080

gcctcggttt cactgagatg aattattagt tcctgttttc ttttccttct gttcagcctt 1140

cacaatttct agacctttct acatctccgc ccagcctccc ttccagctct gtaacttcag 1200

ttcatcctgt tggtctcagc ttaacacttg tacagagagt gtgtgtgtga gtgtgtgtgt 1260

gtaaggggtc cctttcccac aggcgaggtc agagtctgcc tgtcctgctt ccaagccact 1320

tatgtttttt cttccttcct tccttccttc cttccttcct tccttccttc cttctttttt 1380

gctttttagg gctacaccca cggcatatgg aggttaccag actaggggtt gaagtggagc 1440

tacagctgcc agtctatacc acagccacaa taacgcccga tctgagccta caccacagct 1500

cacggcaacg ccggatcctt aacccactga gcaaggccag ggatcgaacc cgcaacttca 1560

tggttcctag tcagattcgt ttctgctgcg caacgacaat gggaactctc tattttcttt 1620

ttaaataaca tgtccagcac tttattctac ttacctattt ttttttttct tggctgcacc 1680

tgcggcaaat ggaagttccc aggccaggaa aagaccctgg gaactatacc acagctgcag 1740

tcacagtgaa tccttaaccc actgcaccgg gctggggatc aaacctgtgc caccacagaa 1800

acaatgtcag atccttaacc tgctgcatta cagagggaac tcctttactt acctttgtgt 1860

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtttta gggccacacc 1920

tgtagtatat ggaaattccc aggctagggg tcgaatcaga gctgcagctg ccagcctaca 1980

ccactgacac agcaactcag gacccaagcc gcatctgtga cctacaccac agctcacagc 2040

agtgccggat ccttaaccca ctgagcgagg ccacgatcaa acctgtgtcc tcatggatcc 2100

tagtctggtt cattaccact gagccaggat gggaactccc catgcttact tttttaaatg 2160

tctgtttccc ttaacagact gtaagttcca taaagggact gtgatgacca tcttatttgt 2220

catcgtgttc ccagggcttg gcataactcc tggtacatgt agcgtgtgat aaatattcat 2280

taacaaaatc tatgaatgat tgacctgttt gtattgtaat tctcccaatg gacatatttc 2340

aaattttttt ccctgtcaaa ggtggtaaaa aaaaaatacc tgcttttgtg tggggttgca 2400

atgatgaaag atgaggacgt aatagaggca gaaacaggtt gc 2442

<210> 2

<211> 2198

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(2198)

<400> 2

tggtcagtct caggtcttgg ggagcctagt ccccaaaaca tctcctttga aaaagaatcc 60

cttctttttt ttttttactt gcttttttta gggccaaagg tgcagcatgt ggaagttccc 120

aggccagggg tagaatcgga gctatagctg cctgcctaca ccacagccac agcagcacca 180

gatccaagct gcatctgcaa cctacacagc agctcacggc aatgccagat ctttaaccca 240

ctgagcgagg ccaaggattg aacctgcatc ctcatggata ctagttggat tcgtttctgc 300

tgcaccacaa caaacttcca agaatcactt gtgattaggt aatacatcac atggcacaaa 360

attcaaagag aaaaaaaagt acccctatct ctctctcttc cagccccata ggttcccccc 420

cccgccccgc cccagccccc ctgcaaccag gaacattcac taataactgc tctttatcct 480

ttcaaaaata ctctatgcat atttgagcat agatatgtat atattccttg aaaaacacag 540

taatcagaaa gtacattagg aaaacagttc ttgctttttt catttaatat atttttgaag 600

gccatctcat ctgtctctac ctccccagac acgactgcca ttcttccaaa ccgggcctct 660

gccctccatc ctgggagtgg gttccgaccc gctctctttg cgcttgttca caggcttggt 720

ttgctcagat ctccagtgca cactagagcc agactcatct ttgtaagatg caactcgtgc 780

ctcaagctgt gatctagatg ccttgccata agcctcctca tacctgcttc ctctcagcct 840

cggtttcact gagatgaatt attagttcct gttttctttt ccttctgttc agccttcaca 900

atttctagac ctttctacat ctccgcccag cctcccttcc agctctgtaa cttcagttca 960

tcctgttggt ctcagcttaa cacttgtaca gagagtgtgt gtgtgagtgt gtgtgtgtaa 1020

ggggtccctt tcccacaggc gaggtcagag tctgcctgtc ctgcttccaa gccacttatg 1080

ttttttcttc cttccttcct tccttccttc cttccttcct tccttccttc ttttttgctt 1140

tttagggcta cacccacggc atatggaggt taccagacta ggggttgaag tggagctaca 1200

gctgccagtc tataccacag ccacaataac gcccgatctg agcctacacc acagctcacg 1260

gcaacgccgg atccttaacc cactgagcaa ggccagggat cgaacccgca acttcatggt 1320

tcctagtcag attcgtttct gctgcgcaac gacaatggga actctctatt ttctttttaa 1380

ataacatgtc cagcacttta ttctacttac ctattttttt ttttcttggc tgcacctgcg 1440

gcaaatggaa gttcccaggc caggaaaaga ccctgggaac tataccacag ctgcagtcac 1500

agtgaatcct taacccactg caccgggctg gggatcaaac ctgtgccacc acagaaacaa 1560

tgtcagatcc ttaacctgct gcattacaga gggaactcct ttacttacct ttgtgtgtgt 1620

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gttttagggc cacacctgta 1680

gtatatggaa attcccaggc taggggtcga atcagagctg cagctgccag cctacaccac 1740

tgacacagca actcaggacc caagccgcat ctgtgaccta caccacagct cacagcagtg 1800

ccggatcctt aacccactga gcgaggccac gatcaaacct gtgtcctcat ggatcctagt 1860

ctggttcatt accactgagc caggatggga actccccatg cttacttttt taaatgtctg 1920

tttcccttaa cagactgtaa gttccataaa gggactgtga tgaccatctt atttgtcatc 1980

gtgttcccag ggcttggcat aactcctggt acatgtagcg tgtgataaat attcattaac 2040

aaaatctatg aatgattgac ctgtttgtat tgtaattctc ccaatggaca tatttcaaat 2100

ttttttccct gtcaaaggtg gtaaaaaaaa aatacctgct tttgtgtggg gttgcaatga 2160

tgaaagatga ggacgtaata gaggcagaaa caggttgc 2198

<210> 3

<211> 2073

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(2073)

<400> 3

aggggtagaa tcggagctat agctgcctgc ctacaccaca gccacagcag caccagatcc 60

aagctgcatc tgcaacctac acagcagctc acggcaatgc cagatcttta acccactgag 120

cgaggccaag gattgaacct gcatcctcat ggatactagt tggattcgtt tctgctgcac 180

cacaacaaac ttccaagaat cacttgtgat taggtaatac atcacatggc acaaaattca 240

aagagaaaaa aaagtacccc tatctctctc tcttccagcc ccataggttc ccccccccgc 300

cccgccccag cccccctgca accaggaaca ttcactaata actgctcttt atcctttcaa 360

aaatactcta tgcatatttg agcatagata tgtatatatt ccttgaaaaa cacagtaatc 420

agaaagtaca ttaggaaaac agttcttgct tttttcattt aatatatttt tgaaggccat 480

ctcatctgtc tctacctccc cagacacgac tgccattctt ccaaaccggg cctctgccct 540

ccatcctggg agtgggttcc gacccgctct ctttgcgctt gttcacaggc ttggtttgct 600

cagatctcca gtgcacacta gagccagact catctttgta agatgcaact cgtgcctcaa 660

gctgtgatct agatgccttg ccataagcct cctcatacct gcttcctctc agcctcggtt 720

tcactgagat gaattattag ttcctgtttt cttttccttc tgttcagcct tcacaatttc 780

tagacctttc tacatctccg cccagcctcc cttccagctc tgtaacttca gttcatcctg 840

ttggtctcag cttaacactt gtacagagag tgtgtgtgtg agtgtgtgtg tgtaaggggt 900

ccctttccca caggcgaggt cagagtctgc ctgtcctgct tccaagccac ttatgttttt 960

tcttccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt ccttcttttt tgctttttag 1020

ggctacaccc acggcatatg gaggttacca gactaggggt tgaagtggag ctacagctgc 1080

cagtctatac cacagccaca ataacgcccg atctgagcct acaccacagc tcacggcaac 1140

gccggatcct taacccactg agcaaggcca gggatcgaac ccgcaacttc atggttccta 1200

gtcagattcg tttctgctgc gcaacgacaa tgggaactct ctattttctt tttaaataac 1260

atgtccagca ctttattcta cttacctatt tttttttttc ttggctgcac ctgcggcaaa 1320

tggaagttcc caggccagga aaagaccctg ggaactatac cacagctgca gtcacagtga 1380

atccttaacc cactgcaccg ggctggggat caaacctgtg ccaccacaga aacaatgtca 1440

gatccttaac ctgctgcatt acagagggaa ctcctttact tacctttgtg tgtgtgtgtg 1500

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtttt agggccacac ctgtagtata 1560

tggaaattcc caggctaggg gtcgaatcag agctgcagct gccagcctac accactgaca 1620

cagcaactca ggacccaagc cgcatctgtg acctacacca cagctcacag cagtgccgga 1680

tccttaaccc actgagcgag gccacgatca aacctgtgtc ctcatggatc ctagtctggt 1740

tcattaccac tgagccagga tgggaactcc ccatgcttac ttttttaaat gtctgtttcc 1800

cttaacagac tgtaagttcc ataaagggac tgtgatgacc atcttatttg tcatcgtgtt 1860

cccagggctt ggcataactc ctggtacatg tagcgtgtga taaatattca ttaacaaaat 1920

ctatgaatga ttgacctgtt tgtattgtaa ttctcccaat ggacatattt caaatttttt 1980

tccctgtcaa aggtggtaaa aaaaaaatac ctgcttttgt gtggggttgc aatgatgaaa 2040

gatgaggacg taatagaggc agaaacaggt tgc 2073

<210> 4

<211> 1756

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(1756)

<400> 4

gcaaccagga acattcacta ataactgctc tttatccttt caaaaatact ctatgcatat 60

ttgagcatag atatgtatat attccttgaa aaacacagta atcagaaagt acattaggaa 120

aacagttctt gcttttttca tttaatatat ttttgaaggc catctcatct gtctctacct 180

ccccagacac gactgccatt cttccaaacc gggcctctgc cctccatcct gggagtgggt 240

tccgacccgc tctctttgcg cttgttcaca ggcttggttt gctcagatct ccagtgcaca 300

ctagagccag actcatcttt gtaagatgca actcgtgcct caagctgtga tctagatgcc 360

ttgccataag cctcctcata cctgcttcct ctcagcctcg gtttcactga gatgaattat 420

tagttcctgt tttcttttcc ttctgttcag ccttcacaat ttctagacct ttctacatct 480

ccgcccagcc tcccttccag ctctgtaact tcagttcatc ctgttggtct cagcttaaca 540

cttgtacaga gagtgtgtgt gtgagtgtgt gtgtgtaagg ggtccctttc ccacaggcga 600

ggtcagagtc tgcctgtcct gcttccaagc cacttatgtt ttttcttcct tccttccttc 660

cttccttcct tccttccttc cttccttctt ttttgctttt tagggctaca cccacggcat 720

atggaggtta ccagactagg ggttgaagtg gagctacagc tgccagtcta taccacagcc 780

acaataacgc ccgatctgag cctacaccac agctcacggc aacgccggat ccttaaccca 840

ctgagcaagg ccagggatcg aacccgcaac ttcatggttc ctagtcagat tcgtttctgc 900

tgcgcaacga caatgggaac tctctatttt ctttttaaat aacatgtcca gcactttatt 960

ctacttacct attttttttt ttcttggctg cacctgcggc aaatggaagt tcccaggcca 1020

ggaaaagacc ctgggaacta taccacagct gcagtcacag tgaatcctta acccactgca 1080

ccgggctggg gatcaaacct gtgccaccac agaaacaatg tcagatcctt aacctgctgc 1140

attacagagg gaactccttt acttaccttt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 1200

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt tttagggcca cacctgtagt atatggaaat tcccaggcta 1260

ggggtcgaat cagagctgca gctgccagcc tacaccactg acacagcaac tcaggaccca 1320

agccgcatct gtgacctaca ccacagctca cagcagtgcc ggatccttaa cccactgagc 1380

gaggccacga tcaaacctgt gtcctcatgg atcctagtct ggttcattac cactgagcca 1440

ggatgggaac tccccatgct tactttttta aatgtctgtt tcccttaaca gactgtaagt 1500

tccataaagg gactgtgatg accatcttat ttgtcatcgt gttcccaggg cttggcataa 1560

ctcctggtac atgtagcgtg tgataaatat tcattaacaa aatctatgaa tgattgacct 1620

gtttgtattg taattctccc aatggacata tttcaaattt ttttccctgt caaaggtggt 1680

aaaaaaaaaa tacctgcttt tgtgtggggt tgcaatgatg aaagatgagg acgtaataga 1740

ggcagaaaca ggttgc 1756

<210> 5

<211> 1394

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(1394)

<400> 5

gccataagcc tcctcatacc tgcttcctct cagcctcggt ttcactgaga tgaattatta 60

gttcctgttt tcttttcctt ctgttcagcc ttcacaattt ctagaccttt ctacatctcc 120

gcccagcctc ccttccagct ctgtaacttc agttcatcct gttggtctca gcttaacact 180

tgtacagaga gtgtgtgtgt gagtgtgtgt gtgtaagggg tccctttccc acaggcgagg 240

tcagagtctg cctgtcctgc ttccaagcca cttatgtttt ttcttccttc cttccttcct 300

tccttccttc cttccttcct tccttctttt ttgcttttta gggctacacc cacggcatat 360

ggaggttacc agactagggg ttgaagtgga gctacagctg ccagtctata ccacagccac 420

aataacgccc gatctgagcc tacaccacag ctcacggcaa cgccggatcc ttaacccact 480

gagcaaggcc agggatcgaa cccgcaactt catggttcct agtcagattc gtttctgctg 540

cgcaacgaca atgggaactc tctattttct ttttaaataa catgtccagc actttattct 600

acttacctat tttttttttt cttggctgca cctgcggcaa atggaagttc ccaggccagg 660

aaaagaccct gggaactata ccacagctgc agtcacagtg aatccttaac ccactgcacc 720

gggctgggga tcaaacctgt gccaccacag aaacaatgtc agatccttaa cctgctgcat 780

tacagaggga actcctttac ttacctttgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 840

gtgtgtgtgt gtgtgtgttt tagggccaca cctgtagtat atggaaattc ccaggctagg 900

ggtcgaatca gagctgcagc tgccagccta caccactgac acagcaactc aggacccaag 960

ccgcatctgt gacctacacc acagctcaca gcagtgccgg atccttaacc cactgagcga 1020

ggccacgatc aaacctgtgt cctcatggat cctagtctgg ttcattacca ctgagccagg 1080

atgggaactc cccatgctta cttttttaaa tgtctgtttc ccttaacaga ctgtaagttc 1140

cataaaggga ctgtgatgac catcttattt gtcatcgtgt tcccagggct tggcataact 1200

cctggtacat gtagcgtgtg ataaatattc attaacaaaa tctatgaatg attgacctgt 1260

ttgtattgta attctcccaa tggacatatt tcaaattttt ttccctgtca aaggtggtaa 1320

aaaaaaaata cctgcttttg tgtggggttg caatgatgaa agatgaggac gtaatagagg 1380

cagaaacagg ttgc 1394

<210> 6

<211> 1137

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(1137)

<400> 6

tgcttccaag ccacttatgt tttttcttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt 60

ccttccttct tttttgcttt ttagggctac acccacggca tatggaggtt accagactag 120

gggttgaagt ggagctacag ctgccagtct ataccacagc cacaataacg cccgatctga 180

gcctacacca cagctcacgg caacgccgga tccttaaccc actgagcaag gccagggatc 240

gaacccgcaa cttcatggtt cctagtcaga ttcgtttctg ctgcgcaacg acaatgggaa 300

ctctctattt tctttttaaa taacatgtcc agcactttat tctacttacc tatttttttt 360

tttcttggct gcacctgcgg caaatggaag ttcccaggcc aggaaaagac cctgggaact 420

ataccacagc tgcagtcaca gtgaatcctt aacccactgc accgggctgg ggatcaaacc 480

tgtgccacca cagaaacaat gtcagatcct taacctgctg cattacagag ggaactcctt 540

tacttacctt tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 600

ttttagggcc acacctgtag tatatggaaa ttcccaggct aggggtcgaa tcagagctgc 660

agctgccagc ctacaccact gacacagcaa ctcaggaccc aagccgcatc tgtgacctac 720

accacagctc acagcagtgc cggatcctta acccactgag cgaggccacg atcaaacctg 780

tgtcctcatg gatcctagtc tggttcatta ccactgagcc aggatgggaa ctccccatgc 840

ttactttttt aaatgtctgt ttcccttaac agactgtaag ttccataaag ggactgtgat 900

gaccatctta tttgtcatcg tgttcccagg gcttggcata actcctggta catgtagcgt 960

gtgataaata ttcattaaca aaatctatga atgattgacc tgtttgtatt gtaattctcc 1020

caatggacat atttcaaatt tttttccctg tcaaaggtgg taaaaaaaaa atacctgctt 1080

ttgtgtgggg ttgcaatgat gaaagatgag gacgtaatag aggcagaaac aggttgc 1137

<210> 7

<211> 811

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(811)

<400> 7

gtccagcact ttattctact tacctatttt tttttttctt ggctgcacct gcggcaaatg 60

gaagttccca ggccaggaaa agaccctggg aactatacca cagctgcagt cacagtgaat 120

ccttaaccca ctgcaccggg ctggggatca aacctgtgcc accacagaaa caatgtcaga 180

tccttaacct gctgcattac agagggaact cctttactta cctttgtgtg tgtgtgtgtg 240

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgttttag ggccacacct gtagtatatg 300

gaaattccca ggctaggggt cgaatcagag ctgcagctgc cagcctacac cactgacaca 360

gcaactcagg acccaagccg catctgtgac ctacaccaca gctcacagca gtgccggatc 420

cttaacccac tgagcgaggc cacgatcaaa cctgtgtcct catggatcct agtctggttc 480

attaccactg agccaggatg ggaactcccc atgcttactt ttttaaatgt ctgtttccct 540

taacagactg taagttccat aaagggactg tgatgaccat cttatttgtc atcgtgttcc 600

cagggcttgg cataactcct ggtacatgta gcgtgtgata aatattcatt aacaaaatct 660

atgaatgatt gacctgtttg tattgtaatt ctcccaatgg acatatttca aatttttttc 720

cctgtcaaag gtggtaaaaa aaaaatacct gcttttgtgt ggggttgcaa tgatgaaaga 780

tgaggacgta atagaggcag aaacaggttg c 811

<210> 8

<211> 514

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(514)

<400> 8

atggaaattc ccaggctagg ggtcgaatca gagctgcagc tgccagccta caccactgac 60

acagcaactc aggacccaag ccgcatctgt gacctacacc acagctcaca gcagtgccgg 120

atccttaacc cactgagcga ggccacgatc aaacctgtgt cctcatggat cctagtctgg 180

ttcattacca ctgagccagg atgggaactc cccatgctta cttttttaaa tgtctgtttc 240

ccttaacaga ctgtaagttc cataaaggga ctgtgatgac catcttattt gtcatcgtgt 300

tcccagggct tggcataact cctggtacat gtagcgtgtg ataaatattc attaacaaaa 360

tctatgaatg attgacctgt ttgtattgta attctcccaa tggacatatt tcaaattttt 420

ttccctgtca aaggtggtaa aaaaaaaata cctgcttttg tgtggggttg caatgatgaa 480

agatgaggac gtaatagagg cagaaacagg ttgc 514

<210> 9

<211> 227

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(227)

<400> 9

tttgtcatcg tgttcccagg gcttggcata actcctggta catgtagcgt gtgataaata 60

ttcattaaca aaatctatga atgattgacc tgtttgtatt gtaattctcc caatggacat 120

atttcaaatt tttttccctg tcaaaggtgg taaaaaaaaa atacctgctt ttgtgtgggg 180

ttgcaatgat gaaagatgag gacgtaatag aggcagaaac aggttgc 227

Claims

1.一种分离克隆的猪子宫内膜特异表达的lncRNA XLOC_2017489的启动子，其特征在于：该启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

2.猪子宫内膜特异表达lncRNA XLOC_2017489启动子的高活性片段，其特征在于：所述片段的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:3,4,6,7和8所示。

3.权利要求1所述启动子在猪遗传改良和转基因表达中的应用。

4.权利要求2所述的启动子高活性片段在猪遗传改良和转基因表达中的应用。