CN102766629A - 猪肌肉特异性mlc2启动子克隆鉴定与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于猪基因工程技术领域，具体涉及一种猪肌肉特异表达基因MLC2启动子的克隆鉴定与应用。其步骤包括：提取“大白猪”肌肉组织总DNA，设计引物，PCR扩增获得猪MLC2基因5’端侧翼核苷酸序列(1704bp)，构建15个长度不同的MLC2启动子缺失片段的荧光素酶报告基因质粒，转染C2C12细胞，检测每个缺失片段的启动子的活性，鉴定获得猪MLC2基因的启动子。其中，猪MLC2基因启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示(1704bp)，在所述的MLC2基因的启动子中还包含具有活性的15个启动子的片段，它们的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：2-16所示。本发明为猪的遗传改良和转基因提供了重要的元件和手段，可强化猪转基因表达的肌肉组织特异性和稳定性。
Description
技术领域
本发明属于猪分子遗传学领域，具体涉及一种猪肌肉特异表达基因MLC2启动子的克隆鉴定与应用。
背景技术
肌球蛋白(myosin)，又称ATP磷酸水解酶，作为一种分子马达作用于肌动蛋白(actin)，能有效地将高能磷酸化合物ATP分解释放的化学能转化为动能，为肌肉收缩、细胞物质运输和细胞分裂等提供动力，是肌肉组织中含量最高也是最重要的蛋白质，约占肌肉总蛋白质的1/3，占肌原纤维蛋白质的50％～55％，为粗丝的主要成分(Vale and Milligan，2000)。肌球蛋白是一个大分子六聚体，由1对重链(α-MHC、β-MHC)及2对轻链(MLC)组成。2对轻链分别为可磷酸化的调节轻链(Regulatory light chain或DTNB轻链，LC2)和不可磷酸化的必需轻链(Essential light chain或碱性轻链，由LC1和LC2组成)，位于重链的头部(Trybus KM.The role of myosin light chains.J Muscle Res Cell Motil，1994，15：587-594)。
MLC2(myosin light chain 2)编码肌球蛋白轻链2，是肌球蛋白的重要组分(肌球蛋白的凝聚状态以及热诱导时的凝胶特性对肉制品的质构、脂肪和水的结合能力等有很大影响)，对肌球蛋白的结构与功能显示重要调节作用，在肌肉的发生过程中起着调控重链表达的重要作用。MLC2属于肌钙蛋白C超家族，具有能与钙离子结合的EF臂结构域，能够可逆的由肌球蛋白轻链磷酸酯酶MLCP脱磷酸化和Ca2+/CaM依赖的肌球蛋白轻链激酶MLCK磷酸化，参与调节肌动蛋白与肌球蛋白互作、Ca2+敏感性、葡萄糖转运和影响肌肉性能的其他相关参数。另外，MLC2也是一种丝氨酸/苏氨酸激酶的底物，能被有丝分裂因子活化蛋白激酶(MAPK)激活，参与多种细胞信号途径。Davoli等(2003)已将其定位于猪的3号染色体短臂。徐德全等从杂交亲代大白猪与子代长大猪的背最长肌的消减cDNA文库中筛选到其EST，利用电脑克隆和SMART等技术，获得了其cDNA全长序列和全部内含子序列(GenBank登录号分别为AY754870和AY870651，Xu et al.Identification of a differential gene HUMMLC2B between F1 hybrids Landrace×Yorkshireand their female parents Yorkshire.Gene，2005，352：118-126)。
基因表达调控可以在复制、扩增、基因激活、转录、转录后、翻译和翻译后等多级水平上进行。但基因的转录起始是基因表达调控的基本控制点，最主要和最重要的调控发生在转录起始阶段(Trinklein et al.Identification and functional analysis of human transcriptional promoters.Genome Res.2003，13：308-312)。而转录起始调控的实质是DNA-蛋白质/蛋白质-蛋白质间的相互作用对RNA聚合酶活性的影响，即通过影响相应的反式作用因子与顺式作用元件的相互作用，调控目的基因的表达。启动子是真核生物基因表达调控的顺式作用元件，含有基因表达调控网络的重要信息，基因表达的强度以及特异性很大程度上决定于它(Remenyi et al.Combinatorial control of gene expression.Nat Struct Mol Biol.2004，11：812-815；Kim et al.Direct isolation and identification of promoters in the human genome.Genome Res.2005，15：830-839)。MLC2为肌肉特异表达基因。因此，分离克隆猪MLC2的启动子，研究其启动子的结构、功能和核心启动区的定位，是理解其基因表达调控机制及调控网络最基本、最重要的内容。利用其肌肉特异性启动子构建更有效的基因工程表达载体，可强化转基因表达的肌肉组织特异性和稳定性，应用于基因工程、育种工程等领域。
发明内容
本发明的目的在于分离克隆与鉴定猪肌肉特异表达基因MLC2的启动子，应用于猪遗传改良的基因工程和育种工程等领域。
本发明克隆得到了猪MLC2基因5’端侧翼1704bp的序列(启动子)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
本发明通过以下技术方案实现：
利用苯酚抽提法提取猪肌肉DNA，以猪MLC2基因的mRNA序列(AY754870)为种子，在猪的基因组中进行比对，根据其5’侧翼序列设计如下引物：
正向引物MLCF：5′AGAAGGTGACCAGTTAGC 3′
反向引物MLCR：5′CCTTTCCCATTAGTGATAC 3′
利用该引物进行PCR扩增，克隆pMD18-T载体，提取质粒pMD18-T-MLC2，测序。
利用生物信息学对该片段可能存在的转录因子结合位点进行分析，设计出15个长度不同的启动子缺失片段的扩增引物：
PGL3-P1正向引物 5′CGAGCTCGAAGACCCGCCAGTG 3′
PGL3-P2正向引物 5′CGAGCTCTTTCACTTCTCCAGG 3′
PGL3-P3正向引物 5′CGAGCTCTTGCTTCTTAGGGCCAC 3′
PGL3-P4正向引物 5′CGAGCTCGCAGCCACCAGCCTA 3′
PGL3-P5正向引物 5′CGAGCTCAACCCGCATCCTCAT 3′
PGL3-P6正向引物 5′CGAGCTCGCAGCACAGCAGGAA 3′
PGL3-P7正向引物 5′CGAGCTCTTTCACCTGACTCGCTTC 3′
PGL3-P8正向引物 5′CGAGCTCCGCTTCTACTGGCCTTC 3′
PGL3-P9正向引物 5′CGAGCTCCCTTCTGTCCTCCTG 3′
PGL3-P10正向引物 5′CGAGCTCCCATGGCTAGACTATAATTT 3′
PGL3-P11正向引物 5′CGAGCTCCAAGTCCAAGGTCATA 3′
PGL3-P12正向引物 5′CGAGCTCTTCCTCACAAAATCCC 3′
PGL3-P13正向引物 5′CGAGCTCCGAATCGTACCCGTTA 3′
PGL3-P14正向引物 5′CGAGCTCCCCAGGTCCGAGTGA 3′
PGL3-P15正向引物 5′CGAGCTCCGGCCCTCCAAGAAA 3′
反向引物(上述正向引物的共用引物) 5′CCCAAGCTTCAAGGCAGTGGCTCT 3′
然后以质粒pMD18-T-MLC2为模板，利用上述正向引物分别与反向引物配对进行PCR扩增，获得15个长度不同的MLC2启动子缺失片段。之后将15个缺失片段分别连接到pGL3-Basic载体(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)上，转染C2C12细胞(购自湖北省武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心)检测每个缺失片段的活性，发现其核心启动子区域位于1378～1554之间。从PGL3-P9到PGL3-P10转染活性降低了一倍，预示缺失的该部分片段可能含有正调控元件结合位点，生物信息学预测该区段存在一个AP-4的结合位点；PGL3-P8到PGL3-P9活性升高了一倍，预示缺失的该部分片段可能含有负调控元件结合位点，生物信息学预测该区段存在MyoD的转录因子结合位点。因此，AP-4和MyoD调控着MLC2基因启动子活性。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1为克隆所得到的猪MLC2的启动子序列，序列长度为1704bp。
序列表SEQ ID NO：2为从所述SEQ ID NO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P1应用的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：3为从所述SEQ ID NO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P2应用的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：4为从所述SEQ ID NO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P3应用的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：5为从所述SEQ ID NO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P4应用的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：6为从所述SEQ ID NO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P5应用的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：7为从所述SEQ ID NO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P6应用的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：8为从所述SEQ ID NO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P7应用的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：9为从所述SEQ ID NO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P8应用的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：10为从所述SEQ ID NO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P9应用的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：11为从所述SEQ ID NO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P10应用的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：12为从所述SEQ ID NO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P11应用的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：13为从所述SEQ ID NO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P12应用的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：14为从所述SEQ ID NO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P13应用的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：15为从所述SEQ ID NO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P14应用的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：16为从所述SEQ ID NO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P15应用的核苷酸序列。
图1为1704bp猪MLC25’侧翼序列的PCR扩增结果：泳道1-6为以大白猪基因组DNA为模板扩增结果；图中：M为DL2000Marker。
图2为猪MLC2启动子各个缺失片段的PCR扩增结果，图中：泳道1-15大小分别是1386bp、1299bp、1212bp、1151bp、1034bp、993bp、968bp、955bp、901bp、865bp、699bp、618bp、459bp、248bp、177bp；M为DL2000Marker。
图3为用于分析猪MLC2启动子不同片段活性的PGL3-basic载体结构示意图。
图4为构建的猪MLC2启动子缺失片段重组质粒的双酶切鉴定，图中：泳道1-15分别为pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5、pGL3-P6、pGL3-P7、pGL3-P8、pGL3-P9、pGL3-P10、pGL3-P11、pGL3-P12、pGL3-P13、pGL3-P14和pGL3-P15重组质粒的酶切结果；M为DL2000Marker。
图5为用于分析猪MLC2启动子不同片段活性所用的pRL-TK内参载体结构示意图。
图6为猪MLC2启动子缺失片段重组质粒转染C2C12细胞的活性检测结果。
具体实施方式
实施例1利用苯酚抽提法提取大白猪肌肉组织总DNA
(1)将大白猪的肌肉组织在液氮中磨碎，加入等体积1×SET溶液(1ml)，蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度200μg/mL，十二烷基硫酸钠(即SDS，10％)至终浓度0.5％，摇匀。55℃水浴摇床中温育过夜消化。
(2)将消化后的组织样加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管15min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清液转移至另一离心管中，注意标上相应的记号。
(3)加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。
(4)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)缓慢颠倒离心管10min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min。
(5)将上清液吸入标记好的的离心管中，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，即可以看到白色絮状DNA。
(6)用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水(一般300ul左右)溶解DNA。
(7)在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在1％琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测提取的DNA质量。
实施例2猪MLC2基因5’端上游启动子调控序列的克隆
以猪MLC2基因的mRNA序列(登录号AY754870)为种子，在猪的基因组中进行比对，根据其5’侧翼序列设计如下引物：
正向引物MLCF：5′AGAAGGTGACCAGTTAGC 3′，
反向引物MLCR：5′CCTTTCCCATTAGTGATAC 3′。
用上述方法所提取的大白猪肌肉组织DNA为模板，进行PCR扩增。
PCR反应体系见表1所示：
表1PCR反应体系
PCR反应条件见表2所示：
表2PCR反应条件
得到如图1所示的结果。然后对PCR扩增产物经纯化，克隆。送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。获得猪MLC2基因5’端侧翼1704bp的序列，其序列见序列表SEQ ID NO：1所示。
实施例3猪MLC2启动子不同缺失载体的构建
利用TFSEARCH(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)在线预测该区域内潜在的转录因子结合位点。根据在线预测的结果应用Primer 5.0引物设计软件设计了15条上游引物和共用的1条下游引物(序列见表3所示)。根据猪MLC2基因5’端侧翼1704bp的序列特点和PGL3-basic载体(Promega)的特点，在所有的15条正向引物的5’端均添加Sac I限制性酶切位点，在所述的1条共用的反向引物的5’端添加Hind III限制性酶切位点，扩增的片段长度分别为PGL3-P1：1386bp(位置：169～1554，序列见序列表SEQ ID NO：2)，PGL3-P2：1299bp(位置256～1554，序列见序列表SEQ ID NO：3)，PGL3-P3：1212bp(位置343～1554，序列见序列表SEQ ID NO：4)，PGL3-P4：1151bp(位置404～1554，序列见序列表SEQ IDNO：5)，PGL3-P5：1034bp(位置521～1554，序列见序列表SEQ ID NO：6)，PGL3-P6：993bp(位置562～1554，序列见序列表SEQ ID NO：7)，PGL3-P7：968bp(位置587～1554，序列见序列表SEQ ID NO：8)，PGL3-P8：955bp(位置600～1554，序列见序列表SEQ ID NO：9)，PGL3-P9：901bp(位置654～1554，序列见序列表SEQ ID NO：10)，PGL3-P10：865bp(位置690～1554，序列见序列表SEQ ID NO：11)，PGL3-P11：699bp(位置856～1554，序列见序列表SEQ ID NO：12)，PGL3-P12：618bp(位置937～1554，序列见序列表SEQ ID NO：13)，PGL3-P13：459bp(位置1096～1554，序列见序列表SEQ ID NO：14)，PGL3-P14：248bp(位置1307～1554，序列见序列表SEQ ID NO：15)，PGL3-P15：177bp(位置1378～1554，序列见序列表SEQ ID NO：16)。缺失片段扩增引物序列见表3，表3中斜体加粗下划线部位为酶切位点。
表3缺失片段引物序列
以克隆到的1704bp MLC2(SEQ ID NO：1)5’端侧翼质粒为模板进行PCR扩增(见图2)。
PCR反应体系见表4
表4PCR反应体系
PCR反应条件见表5：
表5PCR反应体系
扩增产物经回收(使用北京百泰克生物技术有限公司胶回收试剂盒，按照说明书操作)，连接到pMD18-T载体(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)上，转化进入大肠杆菌DH5α挑取阳性克隆提取质粒(使用天根生化科技北京有限公司质粒小提试剂盒，按照试剂的说明书操作)。通过Sac I和Hind III双酶切(见图4)，回收所有缺失片段及pGL3-basic空载体(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司，利用T4连接酶将缺失片段与pGL3-basic空载体连接，挑取阳性克隆提取质粒(参见Omega E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit说明书)。pGL3-basic结构示意图见图3。
实施例4：细胞的培养、转染及猪MLC2启动子活性鉴定
日常细胞的培养根据细胞的生长状况换培养液，所用培养液配制为10ml FBS(胎牛血清，购自美国Gibco公司)+90ml DMEM(Dulbecco′s Modification of Eagle′s Medium，购自美国Gibco公司)，一般每天更换一次同类的新鲜培养基。
当细胞生长铺满培养瓶底部时进行传代。吸管吸出旧的培养基，用1×PBS(磷酸盐缓冲液，配制方法为：将NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO4 0.2g倒入盛有800ml双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，调节PH至7.4，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液)冲洗两次，加入0.25％胰酶(预先将0.25％胰酶置于37℃培养箱温浴几分钟以减少对细胞的伤害)。快速的前后旋转细胞瓶以便胰蛋白酶可以覆盖所有细胞，然后置于培养箱中约1min，加速胰蛋白酶的消化。在显微镜下观察细胞形态，待细胞附着松动，快速的向培养瓶中加入新鲜的10％的FBS细胞生长液，终止胰蛋白酶的作用。用吸管反复吹打细胞瓶底部，使细胞完全从瓶壁上脱离并且分散均匀。吸出细胞悬浮液加入新的细胞瓶中，进行传代。
转染前一天，取一瓶生长良好的细胞经胰酶消化后，加入2ml新鲜不含任何抗生素的10％的FBS细胞生长培养液，用吸管将细胞完全吹散形成均匀的细胞悬液后，用细胞计数板对细胞进行计数。计算出24孔细胞培养板共需细胞量(每孔细胞数目约为0.5-2×105)，然后吸出共需的悬液，向其内加入额外的新鲜的不含任何抗生素的10％的FBS细胞生长培养液(总体积12mL)，吹打均匀后，每孔分装500μL细胞悬液，轻轻晃动培养板摇匀细胞后置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h。
待细胞密度达到80％～90％时进行转染。对于每孔待转染的细胞：每孔加待转染质粒1μg，将1μg质粒加入到50μL OPTI-MEM培养液(购自美国Gibco公司)中，轻轻吹打混合均匀后室温静置5min；以质粒量∶LipofectamineTM 2000的体积量为1∶2.5的情况下，取2.5μL的LipofectamineTM 2000加入到50μLOPTI-MEM培养液中，混合均匀后室温静置5min。将两份混合液混合均匀，室温静置20min。吸管吸出原培养液，用1×PBS清洗细胞两次，并将清洗液吸净。每孔细胞加入混合液100μL后补足OPTI-MEM培养液至总体积为500μL，以前后左右十字交叉的姿势晃动培养板以混合均匀。37℃，5％CO2细胞培养箱培养6h后更换成不含任何抗生素的10％的FBS细胞生长培养液。
本试验以PGL3-basic(Promega)为阴性对照，以海肾荧光素酶报告基因pRL-TK(见图5)做内参质粒(用以校正转染效率)，以LipofectamineTM 2000做转染试剂，每个缺失片段进行3次重复以校正误差。
待细胞转染48小时后进行细胞收集，用1×PBS清洗细胞两次。用吸管吸干PBS后，每孔加入100μl1×被动裂解缓冲液(Passive Lysis Buffer，4体积的ddH2O加入1体积的PLB原液)。室温下置于摇床温和摇动20min。将细胞裂解液转入灭过菌的1.5mL离心管中，用于测定双荧光素酶的活性。
双荧光素酶活性测定采用Promega公司的Dual-Luciferase
Reporter Assay System进行分析。将所收集的细胞裂解液吸取10μl加入酶标板，放入多功能酶标仪后，首先向每孔内快速加入50μl LAR II，读取样品萤火虫荧光素酶的值M1。然后加入50μl Stop & Glo Reagent(终止缓冲剂)，读取内参质粒的海肾荧光素酶的活性值M2。比值M1/M2的大小代表启动子的活性。
结果见图6：在C2C12细胞(购自湖北省武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心)中，猪MLC2基因启动子具有明显的转录活性，当启动子从PGL3-P15缩至PGL3-P14时双荧光素酶活性有所降低，但活性依然高于pGL3-basic，所以初步确定该启动子的核心启动区位于1378～1554之间。转染C2C12细胞发现从PGL3-P9到PGL3-P10转染活性降低了一倍，预示缺失的该部分片段含有正调控元件结合位点，而生物信息学预测该区段存在一个AP-4的结合位点；PGL3-P8到PGL3-P9活性升高了一倍，预示缺失的该部分片段可能含有负调控元件结合位点，生物信息学预测该区段存在MyoD的转录因子结合位点。因此，AP-4和MyoD调控着MLC2基因启动子的活性。
Claims (4)
1.一种分离克隆的猪肌肉特异表达基因MLC2的启动子，其特征在于：该启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的猪肌肉特异表达基因MLC2的启动子，其包含如下所示的启动子的片段，其特征在于：所述片段的核苷酸序列分别如序列表SEQ IDNO：2-16所示。
3.权利要求1所述启动子在猪遗传改良和转基因表达中的应用。
4.权利要求2所述启动子的片段在猪遗传改良和转基因表达中的应用。
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