CN103421787A - 一种在猪肌肉组织高效表达的融合启动子 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及一种在猪肌肉组织高效表达的融合启动子的分离鉴定。从梅山猪中克隆了MEF2C基因上游4个不同启动子缺失片段，将这些片段构建至pGL3-Basic载体中后确定它的活性，其中pGL3-MEF2CP3的活性相对较强，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。通过替换pGL3-Basic载体luc片段为PPAR gama CDS序列，其核苷酸序列如SEQID NO：2所示，构建融合启动子载体pGL3-MEF2CP3-PPAR gama。通过半定量PCR及蛋白质印迹验证PPAR gama的表达均有提高。

Description

一种在猪肌肉组织高效表达的融合启动子

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一个猪MEF2C基因启动子的区域的扩增和对其活性的鉴定，并对该序列构建的载体进行改造从而保持它的转录活性，利用该启动子的活性驱动下游插入的外源基因的表达。

背景技术

高等生物基因的表达受到细胞内外环境的精细调控，因而具有严格的时间及空间有序性。基因的表达调控是一个复杂且有序的过程，由多阶段调控水平共同完成，这主要包括转录前、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平。其中转录水平的调控是最关键的环节。转录水平调控受多种顺式和反式作用元件的相互协调起作用的。启动子是转录水平上一个重要的调控元件，可与众多的转录因子相互作用调控基因的表达(武力，1999)。

启动子是一段位于基因的5’端的DNA序列，该序列可被RNA酶识别并结合启动基因转录。在该段序列中存在一些特定的转录因子结合序列，这些序列可决定基因的表达频率和表达特异性。真核生物启动子由两大部分组成：上游元件(upstream element)和启动子核心(core promoter).上游元件与转录的效率有关；启动子核心包括3部分：TATA盒起始子(initinator)及下游元件(downstream element).TATA盒为转录调控因子包括各种调节蛋白的结合区与转录起始位点的精确选择及转录有关起始子是转录起始所必须，下游元件作用尚不清楚(朱玉贤等，2002；Weaver RF et al.，2002)。

启动子一般可分为三类：1、组成型启动子，该类启动子的表达不受时空的限制；2、诱导型启动子，即基因的表达受到某些诱导剂的作用才表达；3、组织特异性启动子，即该类启动子调控的基因表达具有一定的组织特异性。真核生物基因启动子具有一些典型的核心结构(Core promoter)，大约在转录起始位点-40-+50之间，在该区域一般有一些特定的元件如TATA box，该元件可与TBP(TATA-box-bindingprotein)结合调控下游基因的转录。利用诱导型启动子，可以诱导某些蛋白在特定的部位和在特定的诱导条件下调控蛋白的表达。在植物中，人们将组织和时期特异的启动子利用到生产中取得了可喜的成果。如转基因果树、番茄等(McGranahan GH et al.，1998；Penarrubia L et al.，1992)。相对于植物而言，通过分离动物组织和时空特异启动子并将其利用到转基因动物中则相对滞后一些，这主要是由于现有的转基因效率低下且动物成本昂贵等因素的影响，但其应用具有较大的诱惑力和广阔的前景。如利用乳腺特异的启动子指导药用蛋白在乳腺中超表达，可使基因工程药物产业化。一些学者也在进行积极的尝试，如黄赞等成功利用山羊的β-酪蛋白基因的启动子指导人凝血因子IX在转基因小鼠乳汁中高效表达(黄赞等，2002)。

骨骼肌细胞可以作为一种研究许多发育机制的模型，包括细胞的分化，形态以及生长发育(Naya andOlson，1999)。在这一过程中有2类转录因子家族发挥关键作用，这2类家族分别是bHLH(basichelix-loop-helix)家族转录因子(MRFs)MyoD、Myogenin、Myf5、MRF4以及肌肉增强因子2(MEF2)家族(Dodou et al.，2003)。MEF2属于转录因子MADS-Box家族，在脊椎动物中，MEF2基因是由4个基因组成的多基因家族(MEF2A，B，C和D)(Black and Olson，1998)。MEF2基因在三种肌肉类型以及神经组织中高表达，MEF2基因表达的上游调控机制尚不十分清楚，己知MEF2基因5’非翻译区包含bHLH家族MRFs的DNA结合序列E-Box，MRFs通过结合这一序列诱导启动MEF2基因的表达(程震龙等，2002)。

利用肌肉特异性启动子，通过构建相应的表达载体，能够开启基因固定于肌肉中表达。通过外源基因的蛋白骨骼肌中的表达可很好的研究肌肉的分化或功能及改善肌肉的质量。但肌肉的缺点是表达效率较低，个体间差异较大，所以，提高外源基因在肌肉组织中的表达具有重要的意义。随着生活水平的提高，人们对肉质的要求越来越高，传统的育种方式己不能满足人们的需求。随着分子生物学的发展，人们通过转基因技术利用组织或肌肉特异的启动子诱导特定基因的表达，可以将一些提高肉品质的风味物质等让其在肌肉部位高表达，从而提高肉品质以解决传统育种方式的不足。在哺乳动物中报道的组织特异性启动子主要集中在动物乳腺组织中，如β-乳球蛋白(BLG)、酪蛋白基因和乳清酸蛋白(WAP)等(樊宝良等，2005；崔奎青等，2005；Hennighausen等，1992；Whitelaw等，2000)，但肌肉组织特异的启动子报道较少，能用于转基因猪制备且拥有自主知识产权的高效表达的肌肉组织特异启动子也比较少，大大限制了转基因动物的发展，因此，获得组织特异性且表达效率较高的启动子成为急需解决的问题。因此本发明旨在构建获得适合在肌肉组织中高效表达的启动子，并对启动子进行改造，以获得适合在肌肉组织且高效表达的启动子，并且携带外源基因在肌肉组织中表达，以期提高肉品质并改善风味。

发明内容

本发明的目的一方面在于构建在猪肌肉组织中高效表达的启动子，并对获得的启动子进行功能性验证，弄清它的表达调控，克服目前在肌肉组织中特异高效表达启动子数量较少的不足。另一方面，利用MEF2C启动子在肌肉中启动特性，构建融合启动子，在肌肉组织中表达PPAR gama基因，促进肌内脂肪生成，改善肉质及风味。

本发明的技术方案如下所示：

申请人通过克隆方法，从梅山猪基因组中克隆得到一个猪肌肉组织表达的融合启动子pGL3-MEF2CP3-PPAR gama。

该启动子pGL3-MEF2CP3-PPAR gama，通过如下步骤获得：

(1)在NCBI数据库根据牛MEF2C启动子基因(登录号GU211007)同源比对获得猪同源序列，设计引物MF和MR，扩增获得1330bp的启动子片段MEF2CP，然后重新设计4条引物：MF1、MF2和MR1、MR2，将所述的引物MF1、MF2分别与引物MR1、MR2配对，得到4对引物，以启动子片段MEF2CP为模板，扩增获得4段带有Kpn I和Bgl II酶切位点的DNA片段：MEF2CP1、MEF2CP2、MEF2CP3和MEF2CP4，将上述扩增的4个DNA片段连接至pGEM-Teasy载体中；

(2)以pGL3-Basic载体为材料，切除该载体中的Kpn I和Bgl II酶切位点之间的序列，同时切割步骤1)所述的4个己连入带有Kpn I和Bgl II酶切位点的的DNA片段(MEF2CP1、MEF2CP2、MEF2CP3和MEF2CP4)的pGEM-Teasy载体，将被切割的4个片段定向插入pGL3-Basic载体的Kpn I和Bgl II酶切后的片段中，构建得到如下载体：pGL3-MEF2CP1，pGL3-MEF2CP2，pGL3-MEF2CP3和pGL3-MEF2CP4；

(3)将步骤2)的4个载体分别转染C2C12细胞及分化的C2C12细胞中，验证其活性，得到活性最高的载体pGL3-MEF2CP3；

(4)以载体pcDNA3.1-PPAR gama为模板扩增获得带Hind III和Xba I酶切位点的PPAR gama CDS片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示；

(5)用Hind III和Xba I内切酶酶切中间载体pGL3-MEF2CP3，将步骤4)所述的CDS片段连接至载体中，得到载体pGL3-MEF2CP3--PPAR gama；

其中：步骤1)所述的引物及扩增的DNA片段的核苷酸序列如下所示：

MF：CTCTATTGCTGCTTCCTGTG；

MR：CCAGACTCGTCCAGAAAAC；

MF1： GGTACCACAAGAGCAACTATTAGGGTCG；

MF2：

GGTACCCTCTTGCTGCTTCCTGTG；

MR1：

AGATCTCTAAGCACCACATCCCAT；

MR2：

AGATCTCCAGACTCGTCCAGAAAAC；

说明：上述碱基的下划线部分为酶切位点，加粗字体为保护碱基。

MEF2CP/P3片段：

CTCTATTGCTGCTTCCTGTGCAGCTGAAACTCTTCAGGATAAGTGAAGTCATCAGCTATCGGATAGGGAAGCCTAATGCATTTGGGAAGTTGGTTTGGTTTACATGTTAATGCCTTGGATAAAATCCAGTAAGGTGTGGAAGAGATACTGCGGGAGGAGGGAGGGGGAAATCTCGGAGGAAGCTGCCGCCTCAGTAAATATTTCCAACCTGATTAGAAAGTTCATGGCCCAGAGATGAAATCGAGATTTCAAATACTAGTAATTCTTTTATTATTTTGTGCATTCCTAACACTTGAGACGCGTTTCGGCTCGCTTTCTAGCCCTCCAATCTCTCAGGGCCGAATACCACGTATTCTGGGCGTGAAGGAAAAGCGCGCTGGAAAGTGCTGCAGCCCGAACTGGAATTCTTACGCGTGAGTAACTGAGGAGCGCTCGGACCGGTGGAAGAATGAAGTGGTTAACACGTCTCCATACGGGGCGGGGGGGGCGGGGGGGGGAGTCACAAGAGCAACTATTAGGGTCGCGCTCCTATTGGTCAGAGGAAAGATCCCGACTTTAGAAGGACTTTCCTGCTGGCTGGCTCGCAGCGTCCCCGGGGAGCTAGCGCGCCGCAGCCGGAGACTCGGTTCTCCAAGCGTCCTCCGCGGCGCCAGGGAGAAAGCAGGGAGCCGCCGCTCGCGGTGTTGTCTTCATTTCCAGCAGGAAAGAATTGTCATTAGGTTTGCGTATGGCATGTGCCATTACCCCACCGTAAAACTAAAATTAGCAAAATGTCAGGAATGGAAAGATTGATTCACCAAGATGCAATTATCATTTAAAAGTGCTTGATTGAGGTACTGATGTTCAGTGATTTATTCTGCATACCATATACATAATTAAAGTAGTGTAGTGGAGTAATTTATCAATCTAGTTGAGACTGGAGGGGTGAGGAGGGAACTGCTGTATGTTTGTTTTATTAAAATGCTCCGAGGTCTAGTCCCGCCCCCCTTTTGCAAGAGTGAAACTGATGATTTCTCCAGCTCGCGAGGAGAAAGAGTCAACGGTTTGGGATTGTGAGGGAAAGAGAGGAAAAGGCAGCGCCGGTCAAAGGCAAGGACAAAATAAAATAAAGGAAAAGAAGGCAAGAGGCATTTCATGGGATGTGGTGCTTAGAACCCCAAGCCGTGTGCTCCGTCTTCTCTGCCACCCCCGCCTCCCCTCCCAATATCCTTCCACTCCCCCCCGCCCCCCGCCTCTTTTACGCGATGTTTCAAAGGCTGTGAGCGGCTCTCCTTTTCCCATTCGTCTTCTGTCACTTCCTTCCTGGACGCAGTTTTCTGGACGAGTCTGG

MP1片段：

ACAAGAGCAACTATTAGGGTCGCGCTCCTATTGGTCAGAGGAAAGATCCCGACTTTAGAAGGACTTTCCTGCTGGCTGGCTCGCAGCGTCCCCGGGGAGCTAGCGCGCCGCAGCCGGAGACTCGGTTCTCCAAGCGTCCTCCGCGGCGCCAGGGAGAAAGCAGGGAGCCGCCGCTCGCGGTGTTGTCTTCATTTCCAGCAGGAAAGAATTGTCATTAGGTTTGCGTATGGCATGTGCCATTACCCCACCGTAAAACTAAAATTAGCAAAATGTCAGGAATGGAAAGATTGATTCACCAAGATGCAATTATCATTTAAAAGTGCTTGATTGAGGTACTGATGTTCAGTGATTTATTCTGCATACCATATACATAATTAAAGTAGTGTAGTGGAGTAATTTATCAATCTAGTTGAGACTGGAGGGGTGAGGAGGGAACTGCTGTATGTTTGTTTTATTAAAATGCTCCGAGGTCTAGTCCCGCCCCCCTTTTGCAAGAGTGAAACTGATGATTTCTCCAGCTCGCGAGGAGAAAGAGTCAACGGTTTGGGATTGTGAGGGAAAGAGAGGAAAAGGCAGCGCCGGTCAAAGGCAAGGACAAAATAAAATAAAGGAAAAGAAGGCAAGAGGCATTTCATGGGATGTGGTGCTTAG

MP2片段：

CTCTATTGCTGCTTCCTGTGCAGCTGAAACTCTTCAGGATAAGTGAAGTCATCAGCTATCGGATAGGGAAGCCTAATGCATTTGGGAAGTTGGTTTGGTTTACATGTTAATGCCTTGGATAAAATCCAGTAAGGTGTGGAAGAGATACTGCGGGAGGAGGGAGGGGGAAATCTCGGAGGAAGCTGCCGCCTCAGTAAATATTTCCAACCTGATTAGAAAGTTCATGGCCCAGAGATGAAATCGAGATTTCAAATACTAGTAATTCTTTTATTATTTTGTGCATTCCTAACACTTGAGACGCGTTTCGGCTCGCTTTCTAGCCCTCCAATCTCTCAGGGCCGAATACCACGTATTCTGGGCGTGAAGGAAAAGCGCGCTGGAAAGTGCTGCAGCCCGAACTGGAATTCTTACGCGTGAGTAACTGAGGAGCGCTCGGACCGGTGGAAGAATGAAGTGGTTAACACGTCTCCATACGGGGCGGGGGGGGCGGGGGGGGGAGTCACAAGAGCAACTATTAGGGTCGCGCTCCTATTGGTCAGAGGAAAGATCCCGACTTTAGAAGGACTTTCCTGCTGGCTGGCTCGCAGCGTCCCCGGGGAGCTAGCGCGCCGCAGCCGGAGACTCGGTTCTCCAAGCGTCCTCCGCGGCGCCAGGGAGAAAGCAGGGAGCCGCCGCTCGCGGTGTTGTCTTCATTTCCAGCAGGAAAGAATTGTCATTAGGTTTGCGTATGGCATGTGCCATTACCCCACCGTAAAACTAAAATTAGCAAAATGTCAGGAATGGAAAGATTGATTCACCAAGATGCAATTATCATTTAAAAGTGCTTGATTGAGGTACTGATGTTCAGTGATTTATTCTGCATACCATATACATAATTAAAGTAGTGTAGTGGAGTAATTTATCAATCTAGTTGAGACTGGAGGGGTGAGGAGGGAACTGCTGTATGTTTGTTTTATTAAAATGCTCCGAGGTCTAGTCCCGCCCCCCTTTTGCAAGAGTGAAACTGATGATTTCTCCAGCTCGCGAGGAGAAAGAGTCAACGGTTTGGGATTGTGAGGGAAAGAGAGGAAAAGGCAGCGCCGGTCAAAGGCAAGGACAAAATAAAATAAAGGAAAAGAAGGCAAGAGGCATTTCATGGGATGTGGTGCTTAG

MP4片段：

ACAAGAGCAACTATTAGGGTCGCGCTCCTATTGGTCAGAGGAAAGATCCCGACTTTAGAAGGACTTTCCTGCTGGCTGGCTCGCAGCGTCCCCGGGGAGCTAGCGCGCCGCAGCCGGAGACTCGGTTCTCCAAGCGTCCTCCGCGGCGCCAGGGAGAAAGCAGGGAGCCGCCGCTCGCGGTGTTGTCTTCATTTCCAGCAGGAAAGAATTGTCATTAGGTTTGCGTATGGCATGTGCCATTACCCCACCGTAAAACTAAAATTAGCAAAATGTCAGGAATGGAAAGATTGATTCACCAAGATGCAATTATCATTTAAAAGTGCTTGATTGAGGTACTGATGTTCAGTGATTTATTCTGCATACCATATACATAATTAAAGTAGTGTAGTGGAGTAATTTATCAATCTAGTTGAGACTGGAGGGGTGAGGAGGGAACTGCTGTATGTTTGTTTTATTAAAATGCTCCGAGGTCTAGTCCCGCCCCCCTTTTGCAAGAGTGAAACTGATGATTTCTCCAGCTCGCGAGGAGAAAGAGTCAACGGTTTGGGATTGTGAGGGAAAGAGAGGAAAAGGCAGCGCCGGTCAAAGGCAAGGACAAAATAAAATAAAGGAAAAGAAGGCAAGAGGCATTTCATGGGATGTGGTGCTTAGAACCCCAAGCCGTGTGCTCCGTCTTCTCTGCCACCCCCGCCTCCCCTCCCAATATCCTTCCACTCCCCCCCGCCCCCCGCCTCTTTTACGCGATGTTTCAAAGGCTGTGAGCGGCTCTCCTTTTCCCATTCGTCTTCTGTCACTTCCTTCCTGGACGCAGTTTTCTGGACGAGTCTGG

本发明的具体步骤如下：

本发明的技术路线见图1所示。

首先根据文献查阅确定MEF2C为肌肉组织中表达的基因。在NCBI数据库根据牛MEF2C启动子基因(登录号GU211007)同源比对获得猪同源序列并设计引物扩增得到1330bp启动子片段(SEQ ID NO：1所示)。在网站http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl分析发现具有转录起始位点，在http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html上分析发现该序列具有大量转录因子识别位点。该序列通过克隆测序，并通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的BLAST(Basic Local Alignment Search Toll)工具比对，发现该序列与网站提交的序列具有86％相似性。接着申请人将上述扩增获得的序列克隆至克隆载体pGEM-Teasy载体(购自美国Promega公司)中，以它为模板重新设计了4对扩增不同长度缺失片段的启动子片段的引物并在引物两侧加入Kpn I和Bgl II酶切位点，扩增获得4段启动子片段并将这4个片段连接至pGEM-Teasy载体中测序并保证序列的正确性，并将其编号为MEF2CP1，MEF2CP2，MEF2CP3和MEF2CP4。然后提取上述片段的质粒，利用Kpn I和Bgl II酶将上述片段酶切下来后连接至pGL3-Basic质粒中，转染细胞，通过检测上述片段驱动的Luc+报告基因的活性来确定活性最高的片段。然后选取活性最高的pGL3-MEF2CP3做为连接PPAR gama CDS的中间载体。将PPAR gama CDS片段连接至中间载体pGL3-MEF2CP3质粒中，构建一个融合启动子载体，将其命名为pGL3-MEF2CP3-PPAR gama。申请人将改造的融合载体pGL3-MEF2CP3-PPAR gama转染肌细胞C2C12和分化的C2C12细胞，通过半定量以及蛋白质印迹，确定构建的融合启动子是否在肌肉组织中高效表达。

本发明的优点在于：

(1)本发明首次分析了MEF2C启动子不同长度的片段的活性，找到活性较高的片段MEF2CP3，并且置换该载体(pGL3-Basic)报告基因luc序列为PPAR gama CDS序列，构建融合启动子载体pGL3-MEF2CP3-PPAR gama。

(2)本发明利用MEF2C启动子在肌肉中启动特性，构建融合启动子pGL3-MEF2CP3-PPAR gama，旨在在肌肉组织中表达PPAR gama基因，促进肌内脂肪生成，改善肉质及风味。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1为本发明克隆的猪MEF2C基因启动子MEF2CP3的核苷酸序列，序列长度为1330bp。

序列表SEQ ID NO：2为本发明克隆的猪PPAR gama基因的CDS序列，序列长度为1515bp。

图1为本发明技术路线图。

图2为本发明扩增的MSEF2C启动子克隆载体Kpn I和Bgl II双酶切电泳图，长度为1330bp，即1000-2000bp之间较亮的条带。

图3为本发明构建的不同长度缺失片段Kpn I和Bgl II双酶切鉴定的电泳图谱，从左到右分别为DL10000marker、pGL3-MEF2CP1，pGL3-MEF2CP2，pGL3-MEF2CP3和pGL3-MEF2CP4。

图4：用不同缺失片段转染C2C12及分化的C2C12后，测试双荧光素酶的活性。

图5：Hind III和Xba I内切酶酶切的pGL3-MEF2CP3的电泳图谱。

图6：扩增获得的PPAR gama CDS片段。

图7：pGL3-MEF2CP3-PPAR gama转染C2C12和分化的C2C12后的RNA提取效果图，其中编号1-2是空白的C2C12细胞的RNA；编号3-5是pGL3-MEF2CP3-PPAR gama转染C2C12的RNA；编号6-8是分化的C2C12的RNA；9-11是pGL3-MEF2CP3-PPAR gama转染分化的C2C12的RNA。

图8：图7提取的编号1-11的RNA反转录成cDNA后bata-actin检测图，marker DL2000。

图9：为半定量检测pGL3-MEF2CP3-PPAR gama转染C2C12和分化的C2C12后PPAR gama表达情况，从左到右分别为DL2000marker；编号1是C2C12空白细胞；编号2是pGL3-MEF2CP3-PPAR gama转染C2C12；编号3是分化的C2C12空白细胞；编号4是pGL3-MEF2CP3-PPAR gama转染分化的C2C12。

图10：蛋白质印迹检测pGL3-MEF2CP3--PPAR gama转染C2C12和分化的C2C12后PPAR gama表达情况。从左到右分别编号1是C2C12空白细胞；编号2是pGL3-MEF2CP3-PPAR gama转染C2C12；编号3是分化的C2C12空白细胞；编号4是pGL3-MEF2CP3-PPAR gama转染分化的C2C12。

图11：本发明所用的pGL3-Basic载体图谱。

图12：本发明所用的pGL3-Control载体图谱。

图13：本发明所用的pGL3-TK载体图谱。

图14：本发明所用的pGEM-Teasy载体图谱。

图15：本发明所用的Kpn I和Xba I双酶切的pcDNA3.1-PPAR gama电泳图

图16：本发明pGL3-MEF2CP3载体图谱。

图17：本发明pGL3-MEF2CP3-PPAR gama载体图谱。

图18：本发明所用的pcDNA3.1(+)载体图谱。

具体实施方式

实施例1：猪肌肉组织表达启动子MEF2CP片段及不同缺失片段的获得

主要试剂及来源：

苯酚(购自国药集团化学试剂有限公司)、氯仿(购自国药集团化学试剂有限公司)、异戊醇(购自国药集团化学试剂有限公司)、质粒提取试剂盒(购自OMEGA公司)、pGEM-Teasy载体(购自美国Promega公司)、2×GC Buffer(购自宝生物工程大连有限公司)、Ex Taq聚合酶(宝生物工程大连有限公司)、dNTP(购自Fermentas公司)、DL-2000Marker、DL-10000Marker(购自宝生物工程大连有限公司)、琼脂糖DNA回收试剂盒(购自OMEGA公司)

(1)猪血液基因组DNA提取

本发明所用的梅山猪(血样采集自华中农业大学精品猪场，为常规品种)DNA样品采用血液DNA提取试剂盒(购自全式金生物技术公司产品)提取基因组DNA，具体操作步骤参照产品说明书。

(2)猪基因MEF2C启动子片段的获得

在NCBI数据库根据牛MEF2C启动子基因(登录号GU211007)同源比对获得猪同源序列，设计引物MF和MR(其序列见表1)，扩增获得1330bp的启动子片段MEF2CP，扩增片段链接入克隆载体pGEM-Teasy，Kpn I和Bgl II内切酶酶切检测结果如图2。在网站http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl分析发现具有转录起始位点，在http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html上分析发现该序列具有大量转录因子识别位点。

(3)PCR反应体系：12.5μl2×GC Buffer，2μl2mM dNTP，0.5μl 10μM引物MF和MR，1U Ex Taq酶，0.5μl DNA，加去离子水补至25μl。PCR反应条件为：94℃预变性4min，26个循环94℃变性40s，68℃退火40s，72℃延伸2min，每个循环退火降低0.5℃，然后9个循环94℃变性4min，55℃退火40s，72℃延伸2min，总共35个循环后，72℃延伸10min。引物如表1所示。

表1本发明设计的引物序列

表1说明：下划线部分为酶切位点，MF1-2为Kpn I酶切位点，MR1-2为Bgl II酶切位点；加粗部分为保护性碱基。

PCR产物回收纯化：将扩增的PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳20min后紫外灯下将目的条带(1330bp)切下，放入1.5ml离心管中，然后经PCR产物纯化试剂盒(购自OMEGA公司，产品货号：D2500-02)，按上述试剂盒说明书介绍的方法回收纯化PCR产物，将回收产物保存至-20℃备用。

回收产物连接：将回收产物按如下体系与载体pGEM-Teasy连接。连接体系为：2.5μl2×Ligbuffer，0.3μl pGEM-Teasy vector，0.5μl T4ligase，1.7μl回收产物，将混合体系放至4℃过夜连接。

连接产物转化：用灭菌的枪头将连接产物加入50μl感受态细胞DH5α(购自全式金生物技术公司产品)冰浴30min，然后42℃热激45s，然后迅速放至冰上1-2min，加入400μl加氨苄的LB培养基，放入37℃恒温摇床中复苏45min。接着以3000rpm/min离心5min，去除300μl上清，将剩余的上清吹散细菌沉淀，并将它们涂抹于含有100μg/ml氨苄的LB固体培养基平板中，37℃正置培养30min后，倒置培养14-16小时，观察有无白色菌落长出。

筛选阳性克隆并测序验证：用灭过菌的牙签从平板中蘸取单克隆接入500μl100μg/ml的LB液体培养基中，并放入37℃摇床上扩大培养4-6h。以菌液为模板，MF，MR为引物按扩增MEF2CP片段的条件进行PCR扩增，PCR扩增结束后经电泳检测，有目的条带表明该克隆子可能为阳性克隆子，将阳性克隆子送至奥科鼎盛基因公司测序。测序后将序列拼接并经BLAST与牛MEF2C启动子序列比对，将测序正确的阳性克隆至经TIANprep Mini Plasmid Kit试剂盒(购自TIANGEN天根生化科技有限公司)提取质粒，将所得质粒命名为pGEM-MEF2CP质粒。

(4)猪MEF2C基因启动子不同缺失片段的获得

以pGEM-MEF2CP质粒为模板，设计了2对扩增不同长度大小的启动子缺失片段，引物分别命名为MF1-2与MR1-2。上游引物加入Kpn I酶切位点，下游引物加入Bgl II酶切位点，并在引物两侧加入保护性碱基，引物序列及结合的位置如表1，扩增的片段长度分别为651bp、1152bp、1330bp、829bp。将扩增获得的不同长度启动子片段进行电泳，并纯化回收目的条带，连接至pGEM-Teasy载体，然后转化、挑取阳性克隆并进行测序验证，具体操作步骤如实例1(2)(猪MEF2C基因启动子片段的获得)。然后将含有上述4个片段的阳性克隆扩大培养，并提取质粒，质粒命名为：MEF2CP1，MEF2CP2，MEF2CP3和MEF2CP4。

实施例2：猪MEF2C启动子相应缺失片段载体的构建

主要试剂及来源

Kpn I和Bgl II内切酶(购自Fermentas公司)、T4连接酶及连接试剂(购自NEB公司)、质粒提取试剂盒(购自OMEGA公司)、pGL3-Basic载体(购自美国Promega公司)。

(1)含不同缺失片段的载体及pGL3-Basic载体双酶切

用Kpn I和Bgl II内切酶酶切克隆载体质粒MEF2CP1，MEF2CP2，MEF2CP3和MEF2CP4及pGL3-Basic载体。酶切体系为：2μl10×Fast Buffer，1μl Kpn I，1μl Bgl II、4μl质粒(分别为MEF2CP1，MEF2CP2，MEF2CP3和MEF2CP4)及12μl灭菌水，37℃酶切30min-1h。酶切后用纯化试剂盒回收4个不同大小的启动子片段，及pGL3-Basic载体酶切后的条带。回收产物保存于-20℃备用。

(2)重组载体的构建

将回收的4个不同长度大小，酶切处理的启动子片段分别与酶切后的pGL3-Basic载体条带连接构建成重组载体，分别命名为pGL3-MEF2CP1，pGL3-MEF2CP2，pGL3-MEF2CP3和pGL3-MEF2CP4。连接体系为：2μl酶切后的pGL3-Basic载体片段，6μl酶切后的不同长度大小的启动子片段，1ul T4连接酶，1ul 10×T4DNA ligation Buffer，16℃连接12-16h。然后转化至DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆并进行测序验证，具体操作步骤如实例1(4)(猪MEF2C基因启动子片段的获得)。对于阳性克隆扩大培养，利用OMEGA公司的去内毒素质粒小提试剂盒提取质粒，并测定质粒的浓度。所用质粒浓度测定仪器为：NanoDrop2000Spectrophotometer。提取的质粒按步骤实例2(1)进行酶切鉴定，确定提取质粒是否正确。酶切鉴定图谱如图3。

实施例3：本发明的启动子缺失片段活性测定

主要试剂及来源：

胎牛血清(即FBS，购自GBICO公司)，DMEM高糖溶液(购自GBICO公司)，0.25％胰酶(购自GBICO公司)，Lipofectamin^TM2000脂质体(购自Invitrogen公司)，Dual-LuciferaseReporter Assay System(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)、磷酸盐缓冲液即PBS(购自Hyclone公司)、pGL3-Control和pRL-TK载体(购自美国Promega公司)。

主要耗材：

24孔细胞培养板(Costar)、细胞培养瓶、一次性无菌吸管、一次性注射器、酶标板(Costar)等。

(1)细胞培养用溶液的配制

细胞生长培养基：用一次性注射器吸取9份高糖培养基(DMEM)兑一份胎牛血清(FBS)，混匀后备用，整个过程注意无菌操作。

细胞分化培养基：用一次性注射器吸取49份DMEM兑一份马血清(HS)，混匀后备用，整个过程注意无菌操作。

(2)转染用细胞的准备

在转染前一天接种C2C12细胞(购自中国科学院细胞库)至24孔板中，18-24h后待细胞长至80％-90％汇合，进行转染实验。

(3)细胞转染

1)在转染前将24孔板中细胞换成新鲜培养基，以便让细胞长至最好的生长状态。

2)pGL3-MEF2CP1，pGL3-MEF2CP2，pGL3-MEF2CP3和pGL3-MEF2CP4质粒分别按每孔0.8μg DNA量均匀溶于50μl Opti-MEM无血清培养基中，每个质粒三个重复。同时以每孔0.04μg DNA量将pRL-TK作为内参均匀溶于之前分别溶有pGL3-MEF2CP1，pGL3-MEF2CP2，pGL3-MEF2CP3和pGL3-MEF2CP4质粒的50μl Opti-MEM中。以pGL3-Basic质粒和pGL3-Control为阴性与阳性对照。

3)按每孔2μl(质粒∶Lipofectamin^TM2000脂质体＝1∶2.5)Lipofectamin^TM2000脂质体(Invitrogen)的量溶于50μl Opti-MEM无血清培养基中，室温静止5min。

4)5min后将溶解好的Lipofectamin^TM2000与溶解好的质粒混合，室温静止20min。

5)20min后取100μl溶好的质粒DNA与脂质体复合物滴加至待转染的细胞中，边滴加边晃动培养板，以便使复合物均匀分布在细胞培养基中。

6)将细胞培养板放入CO₂培养箱中，培养4-6h后将培养基换成新鲜培养基继续培养，48h后收集细胞。

(4)荧光素酶活性测定

1)溶液配制

细胞裂解液PLB的配制：以1份5×Passive Lysis Buffer(PLB)与4份体积的灭菌超纯水，轻轻混匀，用于细胞收集。

LAR II荧光素酶分析底物配制：将试剂盒中10ml荧光素酶分析缓冲溶液II全部加入棕色瓶中的荧光素酶分析底物中，待溶解后避光-70℃保存。

1×Stop & Glo Reagent试剂配制：吸取1份50×Stop& Glo Substrate溶于Stop& Glo Buffer中稀释成1×Stop & Glo Reagent试剂，现配现用。

2)细胞的收集

转染48h后收集细胞，首先将培养基吸出，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗三遍，然后向每个孔中加入配制好的120μl细胞裂解液1×PLB，室温摇晃15min充分裂解细胞，然后将裂解液收集至1.5ml离心管中。

3)活性测定

吸取裂解液加入酶标板底部，用PerkinElmer公司的VICTOR^TMX²Multilabel Plate Reader仪器来进行双荧光素酶活性测定。

测定的具体过程如下：

a、打开测定用仪器后再打开控制仪器的电脑。

b、启动测定软件，并选择工具栏中的Tool下的Dispenser maintenance，弹出对话框。

c、选择进样管道1和2，用灭菌超纯水对进样管道清洗2次。

d、选择进样管道1，用灭菌超纯水继续清洗，单独检查管道进样是否正常，清洗完后排空管道1中的超纯水。

e、选择进样管道1，选择Fill，用LAR II填满管道1，并将回收杯中的LAR II回收重新利用。

f、选择进样管道2，用灭菌超纯水单独对管道2清洗后排空。

g、选择进样管道2，选择Fill，用Stop buffer填满管道1，并将回收杯中的Stop buffer回收重新利用。

h、将加入细胞裂解液的酶标板放入Multilaber Reader中。

i、进入软件界面，选择自动加样Auto-dual-luciferase，检查程序。

j、选择要测定的样品，并选择保存设置结果的保存，选择测量按钮对样品进行测量。

k、测定完后选择Tool下的Dispenser maintenance，弹出对话框，选择Empty对多余的溶液排出。

l、按步骤c对进样管道进行清洗，清洗完后关闭仪器与电脑。

(5)不同片段启动子活性分析

申请人首先对数据进行初步处理(M1/M2)后，利用SPSS17.0对不同片段长度启动子活性进行统计分析。找出活性最高的片段，统计结果显示pGL3-MEF2CP3相对于其它片段较高。结果如图4。

实施例4：融合启动子pGL3-MEF2CP3--PPAR gama的构建

主要试剂及来源：

HindIII内切酶、Xba I内切酶(购自Fermentas公司)、T4连接酶(NEB公司)、质粒提取试剂盒和琼脂糖DNA回收试剂盒(购自OMEGA公司)、载体pGEM-Teasy(购自美国Promega公司)，2×GC Buffer、Ex Taq聚合酶和DL-2000Marker(购自宝生物工程大连有限公司，dNTP(购自Fermentas公司)。

(1)PPAR gama CDS序列的获得

申请人首先以pcDNA3.1-PPAR gama质粒(见图15)为模板，设计带Hind III内切酶与Xba I内切酶酶切位点的一步克隆引物，扩增获得了PPAR gama CDS序列。引物命名为：PF和PR，将扩增的片段命名为PPAR，引物序列为：PF：GCGATCTAAGTAAGCTTGCCACCATGGGTGAAAC，PR：CGGCCGGCCGCCCCGACTCTAGATCAATGATGGTGATGGTGGTGGTACAAGTCCTTGTAT，扩增片段电泳检测结果如图6。

PCR反应体系为：12.5μl 2×GC Buffer，2μl 2mM dNTP，0.5μl 10μM引物PF和PR，1U Ex Taq酶，0.5μl DNA，加超纯水补至25μl。PCR反应条件为：94℃预变性4min；35个循环94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸2min；72℃延伸10min。

(2)PPAR片段连接至中间载体pGL3-MEF2CP3

将中间载体pGL3-MEF2CP3同时以Hind III内切酶与Xba I内切酶进行酶切切除载体luc序列。酶切体系为：2μl 10×Fast Buffer，1μl HindIII，1μl Xba I、4μl质粒、加灭菌水补齐至20μl，37℃酶切30min-1h。酶切后用纯化试剂盒回收6000bp左右的包含MEF2CP3启动子片段的载体骨架片段。将回收产物保存于-20℃备用。

(3)融合启动子的构建

将回收的MEF2CP3片段与PPAR PCR产物用NovoRec重组酶(购自Novoprotein公司)连接，连接体系为：2μl NovoRec10x重组缓冲液(购自Novoprotein公司)，1μl NovoRec重组酶，10μl线性化载体(pGL3-MEF2CP3)骨架(＞15ng/ul)，3μl PPAR PCR回收产物，加灭菌水补齐至20μl，37℃连接30min。然后转化至DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆并进行测序验证，提取质粒并测定质粒浓度，保存于-20℃备用，将所得质粒命名为pGL3-MEF2CP3-PPAR gama，具体操作步骤如猪MEF2C基因启动子不同缺失片段的获得(见实施例2)。将提取的质粒pGL3-MEF2CP3-PPAR gama送奥科鼎盛生物测序公司进行测序检测正确性。

实施例5：融合启动子载体pGL3-MEF2CP3-PPAR gama表达情况验证

主要试剂耗材、细胞培养及脂质体转染细胞步骤均同实施例3。

(1)pGL3-MEF2CP3-PPAR gama mRNA水平表达情况验证

将本发明构建的启动子载体pGL3-MEF2CP3-PPAR gama分别转染C2C12和分化的C2C12细胞，转染方式同实施例3，转染48h后使用试剂TRIzol(购自Invitrition公司)提取细胞RNA(见图7)。具体方法如下：

1)6孔板每孔加入0.5ml Trizol，混匀，室温静置5min。

2)加入0.1ml氯仿，振荡15s，静置2min。

3)4℃离心，12000g×15min，取上清。

4)加入0.5倍体积异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

5)4℃离心，12000g×10min，弃上清。

6)加入1ml75％浓度的乙醇(用DEPC水配制)，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。

7)晾干，加入适量的DEPC水溶解(65℃促溶10-15min)。

将提取好的RNA进行cDNA第一链的合成，利用Fermentas公司RevertAid^rM First Strand cDNASynthesis Kit试剂盒进行，按该试剂盒的说明书操作。

具体步骤如下：

1)合成cDNA第一链前，先处理提取的总RNA中的DNA污染；

37℃孵育30min，加入1μL50mMEDTA，65℃孵育10min

2)合成cDNA第一链：处理过的cDNA加入1μL olig(dT)₁₈，5×Reaction Buffer4μL，RiboLock RNaseInhibitor(20u/μL)1μL，10mM dNTP Mix2μL，RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase(200u/μL)1μL，总体系20μL。42℃孵育60min，70℃灭活酶活性5min

3)反应结束后于-20℃保存，长期保存于-80℃

cDNA第一链合成后，利用内参基因β-actin进行反转录效果检测，同时在设计内参基因β-actin定量引物时，为了避免基因组DNA的污染，引物跨了一个内含子。这样在检测反转录效果的同时也可以检测是否存在基因组DNA的污染(见图8)。

反转录的cDNA进行半定量检测(semi-RT PCR)，设计PPAR gama定量引物，命名为PPF：GCTGACCAAAGCAAAGGC，PPR：ACGGAGCGAAACTGACACC。semi-RT PCR反应体系为：10μlMix Buffer，0.5μl 10μM引物PPF和PPF，0.5μl cDNA，加超纯水补至20μl。PCR反应条件为：94℃预变性4min；30个循环94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸20s；72℃延伸10min。semi-RT PCR结果(见图9)显示：不论C2C12还是分化的C2C12细胞转入pGL3-MEF2CP3-PPAR gama，mRNA水平表达比空白细胞均有提高，说明构建的融合启动子pGL3-MEF2CP3-PPAR gama能够表达PPAR gama基因。

(2)pGL3-MEF2CP3-PPAR gama蛋白水平表达情况验证

将本发明分离的启动子载体pGL3-MEF2CP3-PPAR gama分别转染C2C12和分化的C2C12细胞，转染方式同实施例3，转染48h后使用RIPA(使用前加入1mM PMSF)裂解细胞提取总蛋白，进行蛋白质印迹，具体实验方法详见(美)F.奥斯伯(FrederickM.Ausubel)《精编分子生物学实验指南》(第五版)，科学出版社，2008年出版。蛋白质印迹结果(见图10)显示本发明构建的融合启动子pGL3-MEF2CP3-PPAR gama能够表达PPAR gama蛋白。

参考文献：

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Whitelaw，CB.Nucleosome organisation of the beta-lactoglobulin gene.Transcription complex formation.AdvExp Med Biol.2000，480：147-53.

Claims (4)

1.一个猪肌肉组织特异性表达的启动子MEF2CP3，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.一个猪肌肉组织特异性表达的融合启动子pGL3-MEF2CP3-PPAR gama，其核苷酸序列如序列表SEQID NO：2所示。

3.权利要求1所述的启动子在猪肌肉组织表达中的应用。

4.权利要求2所述的启动子在猪肌肉组织表达中的应用。

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