CN108823210A

CN108823210A - 猪肌肉组织特异性高效表达的启动子及应用

Info

Publication number: CN108823210A
Application number: CN201810792796.7A
Authority: CN
Inventors: 任竹青; 左秀
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-07-18
Filing date: 2018-07-18
Publication date: 2018-11-16
Anticipated expiration: 2038-07-18
Also published as: CN108823210B

Abstract

本发明属于基因工程与分子生物技术应用领域，具体设计猪肌肉组织特异性高效表达的启动子及应用，以PK‑15细胞DNA为模板扩增MCK基因启动子pMCK和2个MCK增强子eMCK，并将这些调控元件串联得到改造启动子eMCK‑eMCK‑pMCK,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过双荧光检测发现eMCK‑eMCK‑pMCK启动子活性不仅比pMCK高，而且其活性与SV40启动子活性相当。本发明涉及的肌肉特异性改造启动子可提高外源基因在猪肌肉中的表达水平，对基因工程的应用具有重要意义。

Description

猪肌肉组织特异性高效表达的启动子及应用

技术领域

本发明属于基因工程与分子生物技术应用领域，涉及猪肌肉组织特异性高效表达的启动子。

背景技术

外源基因在某种组织中高效特异表达已经成为转基因研究中的重点关注问题。而要使相外源基因在肌肉组织中高效表达，则归功于调控元件。在生物体中，启动子是重要的顺式作用调控元件，可被转录调控因子识别结合从而调控基因的转录过程。目前在研究猪肌肉品质的过程中，所使用的启动子较多，而最为常用的启动子为MCK基因启动子。

肌肉型肌酸激酶(Muscle creatine kinase，MCK)是线粒体与肌原纤维之间的磷酸肌酸的关键酶，对于骨骼肌的能量代谢至关重要，其主要分布于各种肌肉细胞中，骨骼肌中的含量高达90％以上(McLeish and L Kenyon 2005)。MCK酶在骨骼肌中大量表达，其调控区域在转基因动物实验中得到了很好的表征(Welle,Bhatt et al.1999,Hauser,Robinson et al.2000)。而6.5kb的全长MCK启动子/增强子超过了一些体细胞基因载体的有限包装能力(Scott,Li et al.2002)。随后，有研究表明1.35kb的MCK截短启动子能使小肌营养不良蛋白表达在肌肉中表达(Dunant,Larochelle et al.2003)。

本发明利用MCK截短启动子与2个MCK增强子，大大提高了启动子活性，为今后对外源基因在肌肉中高效表达提供了平台。

发明内容

本发明的目的在于通过基因工程技术构建猪肌肉组织特异性高效表达的启动子eMCK-eMCK-pMCK，所述的启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的是提供了启动子eMCK-eMCK-pMCK在提高外源基因在肌肉组织中的表达量中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

猪肌肉组织特异性高效表达的启动子eMCK-eMCK-pMCK，所述的启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

启动子eMCK-eMCK-pMCK在提高外源基因在肌肉组织中的表达量中的应用，是将目的基因与eMCK-eMCK-pMCK连接后，在肌肉组织中的表达。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明中的利用2个MCK增强子eMCK大大提高了MCK启动子pMCK活性，是文献报道的pMCK启动子活性的2倍，比表现为差异显著，并且与SV40启动子活性相当。

附图说明

图1为不同载体中的启动子的双荧光相对活性示意图；

*表示差异显著，P<0.05。

图2为pGL3-eMCK-eMCK-pMCK在C2C12、PFF、ST和PK-15细胞中的活性示意图；

其中pGL3-Basic为阴性对照，pGL3-Control为阳性对照，**表示差异极显著，P<0.01。

图3为pGL3-Basic、pGL3-Control以及pRL-TK真核表达载体示意图。。

具体实施方式

本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

胶回收试剂盒Gel Extraction Kit(购自Omega Bio-tek公司)、Fast Digest KpnⅠ、Fast Digest XhoⅠ、Fast Digest AgeⅠ(购自于Fermentas公司)、T4Ligase(购自Fermentas公司)、DNA纯化试剂盒(购自BioFlux)、感受态大肠杆菌(购自全式金)、质粒提取试剂盒(购自OMEGA公司)；猪胎儿成纤维细胞PFF(徐德全老师课题组赠予)

实施例1：

pGL3-eMCK-eMCK-pMCK重组载体的构建：

1)猪肌肉组织特异性启动子片段pMCK的获得

根据猪MCK基因序列数据，设计引物，上游引物酶切位点为NheⅠ，下游引物的酶切位点为XhoⅠ，以PK-15细胞基因组为模板扩增长1042bp的启动子截短片段，命名为pMCK，并利用琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，对符合大小的条带进行凝胶回收。引物如表1所示，PCR体系如表2所示。

表1本发明设计的pMCK引物序列

表1说明：下划线部分为酶切位点，加粗部分为保护碱基。

表2 PCR扩增pMCK体系

成分	体积(μl)
		PK-15DNA	1.5
pMCK-F	1.5
		pMCK-R	1.5
10×PCR Buffer Neo	10
		2mM dNTP	10
25mM MgSO₄	6
		KOD-Plus-Neo	2
ddH₂O	up to 100

PCR反应才程序:95℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸30s，变性至延伸35个循环后，68℃延伸5min。

PCR产物纯化回收：将扩增的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳20min后紫外灯下将目的条带切下，放入1.5ml离心管中，然后经PCR产物纯化试剂盒，按其说明书回收纯化PCR产物，将回收产物保存至-20℃备用。

2)增强子片段eMCK的获得

根据猪MCK基因序列数据，设计两对引物，一对上游引物酶切位点为MluⅠ，下游引物的酶切位点为NheⅠ，另一对上游引物酶切位点为KpnⅠ，下游引物的酶切位点为MluⅠ；以PK-15细胞基因组为模板扩增长260bp的增强子片段eMCK，有并利用琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，对符合大小的条带进行凝胶回收。eMCK引物见表3，PCR扩增eMCK片段体系见表4。

表3本发明设计的eMCK引物

表3说明：下划线部分为酶切位点，加粗部分为保护碱基。

表4 PCR扩增eMCK体系

成分	体积(μl)
		PK-15DNA	1.5
eMCK-F	1.5
		eMCK-R	1.5
2×Tag Mix	50
		ddH₂O	up to 100

PCR反应才程序:95℃预变性3min，98℃变性10s，63℃退火10s，72℃延伸6s，变性至延伸35个循环后，72℃延伸5min。

PCR产物纯化回收：与实施例1(1)中的PCR产物纯化回收过程一致。

3)pGL3-pMCK重组载体的构建

用NheⅠ和XhoⅠ内切酶双酶切pMCK片段和pGL3-Basic质粒，酶切体系如表5和表6所示。

表5 NheⅠ和XhoⅠ内切酶双酶切pMCK片段体系

成分	剂量
		pMCK	600ng
NheⅠ	1.2μl
		XhoⅠ	1.2μl
10×Buffer	3μl
		ddH₂O	up to 60μl

表6 NheⅠ和XhoⅠ内切酶双酶切pGL3-Basic体系

37℃反应1h后，利用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化过程参考BioFlux公司核酸纯化试剂盒说明书。

连接：将双酶切后的pMCK片段和pGL3-Basic连接。连接体系为：1μl双酶切后的pMCK DNA片段，0.5μl双酶切后的pGL3-BasicL载体，0.1μl T4Ligase，1μl T4LigaseBuffer，7.4μl ddH₂O，22℃连接1h。

连接产物转化：在超净台中用灭菌枪头将连接产物加入到50μl DH5α感受态中，冰浴30min，42℃水浴90s，向感受态悬浮液中加入500μl LB液体培养基，180rpm(37℃)摇菌45min后，3000rpm离心3min，弃500μl上清，吹打使细菌完全悬浮，最后均匀涂布于LA固体培养基上，37℃恒温培养14h，选取平板中生长的单菌落，加入到LA液体培养基中，37℃摇菌4-6h，进行菌液阳性鉴定并测序。

筛选阳性克隆并测序鉴定：用灭菌枪头从平板中蘸取单克隆接入400μl含100μg/ml氨苄霉素的液体培养基中，放入220r、37℃摇床扩大培养6h。以菌液为模板，用插入载体的目的片段的引物对按扩增条件进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，有目的条带表明该克隆可能为阳性菌。

将阳性菌送至奥克生物有限公司进行测序并对比。将测序正确的阳性克隆菌利用质粒提取试剂盒提取质粒，该质粒命名为pGL3-pMCK。

4)pGL3-eMCK-pMCK重组载体的构建

用NheⅠ和MluⅠ内切酶双酶切eMCK片段(含NheⅠ和MluⅠ酶切位点)和pGL3-pMCK质粒，将双酶切后的eMCK片段和pGL3-pMCK连接，命名为pGL3-eMCK-pMCK。

表7 NheⅠ和XhoⅠ内切酶双酶切eMCK片段体系

成分	剂量
		eMCK片段	600ng
NheⅠ	1.2μl
		MluⅠ	1.2μl
10×Buffer	3μl
		ddH₂O	up to 60μl

表8 NheⅠ和XhoⅠ内切酶双酶切pGL3-pMCK体系

成分	体积
		pGL3-pMCK	3μg
NheⅠ	1.2μl
		MluⅠ	1.2μl
10×Buffer	3μl
		ddH₂O	up to 60μl

连接：将双酶切后的eMCK片段和pGL3-pMCK连接，命名为pGL3-eMCK-pMCK。连接体系为：1μl双酶切后的pMCK DNA片段，0.5μl双酶切后的pGL3-BasicL载体，0.1μl T4Ligase，1μl T4Ligase Buffer，7.4μl ddH₂O，22℃连接1h。

连接产物转化感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆并测序鉴定。

5)pGL3-eMCK-eMCK-pMCK重组载体的构建

用KpnⅠ和MluⅠ内切酶双酶切eMCK片段(含KpnⅠ和MluⅠ酶切位点)和pGL3-eMCK-pMCK质粒,将双酶切后的eMCK片段(含KpnⅠ和MluⅠ酶切位点)和pGL3-eMCK-pMCK连接，命名为pGL3-eMCK-eMCK-pMCK。

表9 NheⅠ和XhoⅠ内切酶双酶切eMCK片段体系

成分	剂量
		片段(质粒)	600ng(1ug)
KpnⅠ	1.2μl
		MluⅠ	1.2μl
10×Buffer	3μl
		ddH₂O	up to 60μl

表10 NheⅠ和XhoⅠ内切酶双酶切pGL3-eMCK-pMCK体系

连接：将双酶切后的eMCK片段和pGL3-eMCK-pMCK连接，命名为pGL3-eMCK-eMCK-pMCK。连接体系为：1μl双酶切后的pMCK DNA片段，0.5μl双酶切后的pGL3-BasicL载体，0.1μl T4Ligase，1μl T4Ligase Buffer，7.4μl ddH₂O，22℃连接1h。

连接产物转化感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆并测序鉴定。

实施例2：

pGL3-eMCK-pMYOD1和pGL3-eMCK-pMYF5重组载体的构建：

1)猪肌肉组织特异性启动子片段pMYOD1和pMYF5的获得

根据猪MYOD1和MYF5基因序列数据，设计引物，以PK-15细胞基因组为模板扩增启动子截短片段，分别命名为pMYOD1和pMYF5，并利用琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，对符合大小的条带进行凝胶回收。引物如表11所示，PCR体系如表12所示。

表11本发明设计的pMYOD1和pMYF5引物序列

表11说明：下划线部分为酶切位点，加粗部分为保护碱基。

表12 PCR扩增pMCK体系

PCR反应才程序:95℃预变性3min，98℃变性10s，65℃退火30s，68℃延伸30s，变性至延伸35个循环后，68℃延伸5min。

2)pGL3-pMYOD1和pGL3-pMYF5重组载体的构建

用MluⅠ和NheⅠ内切酶双酶切pMYOD1片段和pGL3-Basic载体，酶切体系：600ngpMYOD1片段(或3μg pGL3-Basic载体)，1.2μl MluⅠ，1.2μl NheⅠ，3μl 10×Buffer，加水使体系达60μl。

NheⅠ和XhoⅠ内切酶双酶切pMYF5片段和pGL3-Basic载体，，酶切体系：600ng pMYF5片段(或3μg pGL3-Basic载体)，1.2μl NheⅠ，1.2μl XhoⅠ，3μl 10×Buffer，加水使体系达60μl。

连接产物转化感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆并测序鉴定。将测序正确的阳性克隆菌利用质粒提取试剂盒提取质粒，质粒即为pGL3-pMYOD1和pGL3-pMYF5。

3)pGL3-eMCK-pMYOD1和pGL3-eMCK-pMYF5重组载体的构建

用KpnⅠ和MluⅠ内切酶双酶切pGL3-pMYOD1和pGL3-pMYF5,将双酶切后的pGL3-pMYOD1和pGL3-pMYF5分别与KpnⅠ和MluⅠ双酶切后的eMCK连接，酶切体系为：1μg质粒，1.2μlKpnⅠ，1.2μl MluⅠ，3μl 10×Buffer，加ddH₂O至60μl。将配好的酶切体系于37℃反应1h后，利用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化过程参考BioFlux公司核酸纯化试剂盒说明书。

连接：将双酶切后的eMCK片段分别和pGL3-pMYOD1和pGL3-pMYF5连接，命名为pGL3-eMCK-pMYOD1和pGL3-eMCK-pMYF5。连接体系为：1μl双酶切后的eMCK DNA片段，0.5μl双酶切后的pGL3-eMCK-pMYOD1载体(或pGL3-eMCK-pMYF5载体)，0.1μl T4Ligase，1μlT4Ligase Buffer，7.4μl ddH₂O，22℃连接1h。

连接产物转化感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆并测序鉴定。将测序正确的阳性克隆菌利用质粒提取试剂盒提取质粒，命名为pGL3-eMCK-pMYOD1和pGL3-eMCK-pMYF5。

实施例3:

重组载体活性鉴定：

实验组的载体分别为：pGL3-pMYOD1、pGL3-eMCK-pMYOD1、pGL3-pMYF5、pGL3-eMCK-pMYF5、pGL3-pMCK、pGL3-eMCK-pMCK和pGL3-eMCK-eMCK-pMCK；以pGL3-Basic为阴性对照，以pGL3-Control为阳性对照。

在转染前一天以1.5×10⁵的密度接种C2C12细胞至24孔板中，待细胞长至80％汇合度

后进行转染实验。

1、细胞转染

(1)在转染前将24孔板中培养基换成新鲜培养基，以便让细胞长至最好的生长状态。

(2)质粒稀释：

分别将1μg pGL3-pMCK、pGL3-eMCK-pMCK和pGL3-eMCK-eMCK-pMCK、pGL3-Basic、pGL3-Control与50ng pRL-TK载体用25μl Opti-MEM稀释，混匀，室温静置5min；

将2μl Lipo6000用25μl Opti-MEM稀释，混匀，室温静置5min；

(3)将(2)中两种混合液混合并吹打混匀，室温静置20min。

(4)将(3)中混合液加入到相应孔中，摇匀，于放入37℃，5％CO2培养箱中培养。

2、荧光素酶活性鉴定

(1)1×PLB：以1份5×Passive Lysis Buffer与4份体积的灭菌超纯水，轻轻摇匀，用于细胞收集。

LARⅡ荧光素酶分析底物配制：将试剂盒中10ml荧光素酶分析缓冲液Ⅱ全部加入到棕色瓶中的荧光素酶分析底物中，待溶解后避光-70℃保存。

1×Stop&Glo Reagent试剂配制：吸取1份50×Stop&Glo Substrate溶于Stop&GloBuffer中稀释成1×Stop&Glo Reagent试剂，现配现用。

(2)细胞的收集

转染36h后收集细胞，首先将培养基吸出，然后用PBS清洗一遍，然后向每孔中加配制好的100μl细胞裂解液1×PLB，室温摇晃20min充分裂解细胞，然后将裂解液收集至1.5ml离心管中。

(3)活性鉴定

吸取裂解液加入酶标板底部，用PerkinElmer公司的VICTORTMX2MultilabelPlate Reader仪器来进行双荧光活性测定。

(4)不同片段启动子的活性分析

申请人利用Excel对数据进行。进行初步处理(A/B)后，再对不同启动子活性进行统计分析，利用GraphPad Prism 5绘制柱形图，统计结果显示：eMCK无法提高pMYOD1的活性，表现为差异不显著，eMCK其会降低PMYF5的活性，表现为差异显著(P<0.05)，eMCK-pMCK活性比pMCK活性高，表现为差异显著(P<0.05)；eMCK-eMCK-pMCK活性比eMCK-pMCK活性高且差异显著(P<0.05),结果见图1。

实施例4：

eMCK-eMCK-pMCK启动子细胞特异性

将pGL3-eMCK-eMCK-pMCK、pGL3-Basic(阴性对照)、pGL3-Control(阳性对照)转染小鼠成纤维细胞(C2C12)、猪胎儿细胞(PFF)、猪睾丸细胞(ST)和猪肾细胞(PK-15)。细胞转染及启动子活性鉴定过程同实施例2。

统计结果显示：eMCK-eMCK-pMCK启动子在C2C12和PFF细胞中的活性与pGL3-Control中SV40启动子活性相当，表现为差异不显著(P>0.05)；在ST和PK-15细胞的活性远低于SV40启动子活性，表现为差异极显著(P<0.01),因此eMCK-eMCK-pMCK为肌肉特异性启动子。

参考文献

Dunant,P.,N.Larochelle,C.Thirion,R.Stucka,D.Ursu,B.J.Petrof,E.Wolfand H.Lochmüller(2003)."Expression of dystrophin driven by the 1.35-kb MCKpromoter ameliorates muscular dystrophy in fast,but not in slow muscles oftransgenic mdx mice."Molecular Therapy 8(1):80-89.

Hauser,M.A.,A.Robinson,D.Hartigan-O'Connor,D.A.Williams-Gregory,J.N.Buskin,S.Apone,C.J.Kirk,S.Hardy,S.D.Hauschka and J.S.Chamberlain(2000)."Analysis of muscle creatine kinase regulatory elements in recombinantadenoviral vectors."Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 2(1):16-25.

McLeish,M.and G.L Kenyon(2005).Relating Structure to Mechanism in Creatine Kinase.

Scott,J.M.,S.Li,S.Q.Harper,R.Welikson,D.Bourque,C.DelloRusso,S.D.Hauschka and J.S.Chamberlain(2002)."Viral vectors for gene transfer ofmicro-,mini-,or full-length dystrophin."Neuromuscular disorders:NMD 12 Suppl1:S23-29.

Welle,S.,K.Bhatt and C.A.Thornton(1999)."Inventory of high-abundancemRNAs in skeletal muscle of normal men."Genome research 9(5):506-513.

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 猪肌肉组织特异性高效表达的启动子及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1574

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgctctgacc cgagttgccg cccagcctcc tccccctgcg ggtgggtgtg gacgcctccc 60

cagggccggg gctgtggctg cccttgtaag gaggtgaggc ctggggacac cagagaggcc 120

tggttataat taaccgggac acgtggccag cccgccccca acacctgccc ccgcccctgc 180

ccccatcccc agcgcctcgg gtctcccgga ggagacagcg agtagcgagc tctaaaaata 240

aactcccttt tctgcaagcc ggtacctgct ctgacccgag ttgccgccca gcctcctccc 300

cctgcgggtg ggtgtggacg cctccccagg gccggggctg tggctgccct tgtaaggagg 360

tgaggcctgg ggacaccaga gaggcctggt tataattaac cgggacacgt ggccagcccg 420

cccccaacac ctgcccccgc ccctgccccc atccccagcg cctcgggtct cccggaggag 480

acagcgagta gcgagctcta aaaataaact cccttttctg caagccacgc gtccacagag 540

tctcctcaac cccgagagcc ctgtgctctg acccgagttg ccgcccagcc tcctccccct 600

gcgggtgggt gtggacgcct ccccagggcc ggggctgtgg ctgcccttgt aaggaggtga 660

ggcctgggga caccagagag gcctggttat aattaaccgg gacacgtggc cagcccgccc 720

ccaacacctg cccccgcccc tgcccccatc cccagcgcct cgggtctccc ggaggagaca 780

gcgagtagcg agctctaaaa ataaactccc ttttctgcaa gcctgcaggc cctgtcccct 840

ccagcgtgga atcacccagt gtcactgggc cctgcgccgc ttctggcctg gctttgagtc 900

tgaatggccc ccctgggccc ggcctcgtgt cccccccact gccatcaagg agggaaaacc 960

cgctaagcac aggcatcagg gatcaggctg cccagctccc acctctgccc gggtcacagg 1020

ctccctgtag ccgggtgaca gtaggcaaat cacgcagcct ctctgggcca ctatttcctc 1080

ctctggagaa ccagacactt ggtccttctg ggatgatggc agggtttccc cagaagcagg 1140

gctcaggact ttgctggggt caaggccacc ctgggggcca aggagagact ggcggcctag 1200

cggagggcca ggggagggtg gtttctacgt gcctgggaca gcctctgaca cagtcccgtg 1260

gccccggcgg ggggccagct gtccccgcca gcccgactca gcacttggtc tggggaccag 1320

cttggtttgg gggtgggggg tgggcccagc ccctggggcg gcccatacaa ggccatgggg 1380

ctgggcgcaa ggcacgcctg ggttcagggt gggcacggtg cccaggcagc gaagcgagag 1440

cgcagctgcc ctccaccccc ctcctggcca gcggcccctc ctgaccaata gcacaacctg 1500

ggccccccct ataaaaggcc agggctgcag tcctgtcctt tgggtcagtg tcgcctccag 1560

gatacagacg cccc 1574

Claims

1.猪肌肉组织特异性高效表达的启动子，所述的启动子的核苷酸为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的启动子在提高外源基因在肌肉组织中的表达量中的应用。