CN102643817A - 绵羊k71皮肤毛囊特异性启动子及其克隆 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种绵羊K71皮肤毛囊特异性启动子及其克隆，即角蛋白71(K71)的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。本发明提供了绵羊皮肤毛囊特异性表达K71基因5’调控区启动子克隆，并通过报告基因分析验证了该启动子的特征。本发明克隆得到的K71基因5’启动子调控区序列只在皮肤毛囊中特异性地启动其下游目的基因的转录表达，能够满足目的基因在皮肤毛囊特异性表达的要求，并能应用于转基因羊的培育。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，涉及一种绵羊皮肤毛囊特异性启动子及其克隆，具体涉及一种皮肤毛囊特异性表达基因角蛋白71(K71)5’调控区特异性启动子的克隆分析。
背景技术
基因的表达和基因的功能不仅是分子生物学研究的核心内容(这里基因的概念不仅仅是指编码蛋白的DNA序列)，也是分子生物学技术应用的关键环节。转录调控在基因表达中占有很重要的地位，其调控机制也非常复杂。其中，启动子与调控转录起始的转录因子相互作用，严格控制着基因表达(转录)的起始时间、地点和表达丰度的高低，决定了基因转录的组织特异性和表达强度，所以启动子的复杂而精细的调控是机体维持正常生理活动的基础和前提。随着基因工程的发展，常常需要构建一种能高水平、组织特异性表达外源蛋白质的表达载体。启动子对外源基因的表达水平影响很大，因此也就成为基因工程表达载体的重要元件。
在开展毛囊发育中基因表达的调控机制、培育目标基因在毛囊特异性高效表达转基因细毛羊等研究中，非常需要获得皮肤毛囊组织特异性表达的启动子指导目标基因的表达，从而准确地分析和评价不同的目标基因对皮肤毛囊发育、发生和生长的功能和作用。这些基础研究工作不仅能丰富对毛囊发育的调控机制的认识，而且也为细毛羊生产中培育细毛羊优良品种、提高羊毛产量、改善羊毛品质提供科学依据。
角蛋白71是毛囊内根鞘的重要组成蛋白，利用全基因组关联分析证明了K71是控制毛发弯曲的主要基因。然而，在羊上目前还没有相关的研究报道，该基因的报道序列只有编码区的部分序列。通过克隆获得绵羊K71启动子序列，构建K71皮肤毛囊毛皮质外源基因特异性表达载体，不仅能用于毛发弯曲、毛囊发育中基因表达调控机制的研究，而且对转基因细毛羊的培育也起到了促进作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种绵羊K71皮肤毛囊特异性启动子及其克隆，首先通过染色体步移克隆绵羊K71基因5’调控区的序列，进一步研究发现其具有组织特异性启动子的调控活性。该启动子具有皮肤毛囊表达的特异性，仅在皮肤毛囊中能够特异性地启动其下游基因的表达，满足目标基因在皮肤毛囊中特异性的表达，为皮肤毛囊特异性表达载体的构建及转基因羊的生产奠定了基础。
其技术方案如下：
本发明所提供的绵羊皮肤毛囊特异性表达K71基因5’调控区启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，并通过报告基因分析确定了该启动子的特征。
首先，通过染色体步移的方法获得绵羊皮肤毛囊特异性表达K71基因5’调控区序列，长度为3.7kb，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
然后，通过报告基因荧光素酶基因来分析启动子的活性和组织特异性。通常，在不改变受体细胞的生理活动条件下，通过检测启动子下游的报告基因的表达情况，就可以知道启动子表达与否、比较启动子表达强弱。其中，荧光素酶基因就是动物细胞、个体模型最常用的报告基因。因此，我们将绵羊皮肤毛囊特异性表达K71基因5’调控区序列(长度为3.7kb)插入到pGL3 Basic载体中，得到启动子报告基因的分析载体，同时以pGL3-CMV载体作为阳性对照，pGL3 Basic载体(无启动子载体)作为空白对照，分别转染绵羊原代成纤维细胞和小鼠C2C12成肌细胞。48小时后利用多功能酶标仪检测荧光素酶活性，以此评价启动子的活性及其组织特异性。具有上述序列的启动子或者截短的序列，具有皮肤毛囊特异性的启动活性，而在皮肤细胞之外的细胞中没有活性，可见该启动子在皮肤毛囊中特异性的启动下游基因的表达，能够满足目的基因在皮肤毛囊特异性的表达要求，能应用于毛发弯曲、毛囊发育中基因表达调控机制的研究以及转基因羊的培育。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：研究证实，含本发明的启动子具有皮肤毛囊组织特异性表达的活性。实验中，仅在人表皮角质化细胞中检测到荧光素酶的活性，而在皮肤毛囊细胞之外的细胞中没有检测到显著的荧光素酶的活性。说明克隆得到的K71基因5’启动子调控区序列只能在皮肤毛囊中特异性地启动下游基因的表达，能够满足目的基因在皮肤毛囊特异性的表达要求，能应用于转基因羊的培育。
附图说明
图1是扩增绵羊K71基因5’调控区结果图，(其中：M为150bp marker，1为第一轮扩增产物，2为第2轮扩增产物，3为第三轮扩增产物)；
图2是扩增绵羊K71基因5’调控区结果图，(其中：M为1kb marker，1，2为K71的扩增产物)；
图3是K71皮肤毛囊组织特异性启动子在不同类型细胞中活性评价结果图
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细地说明。
本发明涉及遗传资源新疆细毛羊自行采集于中国新疆乌鲁木齐市新疆畜牧科学院绵羊繁育基地。
1.绵羊K71基因5’调控区的克隆
(1)采集绵羊血液，使用肝素纳抗凝，用酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA。
(2)使用Genome Walking Kit试剂盒(大连宝生物)AP3结合设计的三条下游引物，扩增绵羊K71基因5’调控区，引物序列如表1所示，可参见序列表SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。按照试剂盒中提供反应体系和反应程序进行，结果见图1、图2。
表1
| 引物名称 | 引物序列 |
| K71SP1 | CCAGGAGGCTCTCATTGACAGTG |
| K71SP2 | CCATAACCTCCACTCTTCCCACTG |
| K71SP3 | AGCTCCCGACTTGCAGGTGAATTG |
(3)将第三次扩增产物与6×loading buffer混合上样至1％的琼脂糖凝胶，5V/cm电泳25分钟后切胶回收目的片段，按照北京天根的DNA纯化试剂盒说明书操作得到纯化产物，利用T4 DNA连接酶将其与连接PMD-18T载体，连接产物转化E.coli DH5α。利用氨苄青霉素平板筛选，并以PCR法和限制性酶切法鉴定，阳性克隆测序由上海生物工程公司完成。
2.启动子报告基因载体的构建
以无启动子的pGL3 Basic载体为骨架，利用XhoⅠ和MluⅠ酶切，回收片段。以测序验证后的重组载体为模板，PCR扩增K71基因的5’调控区，上游引物引入XhoⅠ酶切位点，下游引物引入MluⅠ酶切位点，下划线表示，均引入保护碱基，加粗表示。引物序列如表2所示，具体参见序列表SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。
表2
按照如表3所示体系配置PCR反应液
表3
| 10×LA PCR Buffer II(Mg2+Plus) | 5.0μL |
| dNTP mixture(2.5mM each) | 4.0μL |
| TaKaRa LA Taq(5U/μl) | 0.5μL |
| pMD18-T-K71 | 100ng |
| 引物1(20μM) | 1.0μL |
| 引物2(20μM) | 1.0μL |
| 灭菌蒸馏水 | 加至50μL |
PCR程序设定如下：
将扩增产物与6×loading buffer混合上样至1％的琼脂糖凝胶，5V/cm电泳25分钟后切胶回收目的片段，按照北京天根的DNA纯化试剂盒说明书操作得到纯化产物，用XhoⅠ和MluⅠ酶切纯化产物，酶切之后琼脂糖切胶回收得到K71基因的5’调控区的粘性末端，利用T4 DNA连接酶将其与酶切后pGL3 Basic载体连接，连接产物转化E.coli DH5α。利用氨苄青霉素平板筛选，并以PCR法和XhoⅠ和MluⅠ性酶切法鉴定，阳性克隆载体命名为pGL3-K71。
3.启动子活性的评价
将pGL3 Basic，pGL3 CMV，pGL3-K71和pRL-SV40分别转化至E.coli DH5α，涂板，分别挑单克隆至3ml含100ug/ml的氨苄青霉素LB培养基，200rpm剧烈摇晃8h的后，将菌液按照1∶500比例接钟至含100ug/ml的氨苄青霉素LB培养基中，200rpm剧烈摇晃14h，4℃6000g离心15min收集菌体至50ML离心管中，用于无内毒素的质粒的提取，具体操作按照QIAGEN中提质粒的试剂盒说明书进行，纯化得到的质粒A260/280在1.8-1.9之间。
原代绵羊皮肤成纤维细胞和小鼠C2C12成肌细胞在含10％的胎牛血清的DMEM的培养基中，于37℃，5％的CO2培养，待汇合度达到90％时，利用0.05％的胰酶消化传代，取5×105个细胞铺入6孔培养板中，37℃、5％CO2培养箱培养，待细胞汇合度达到70％～80％时进行转染；
在聚丙烯管里准备Lipofectamine 2000脂质体和DNA复合物；
加入0.25ml预热的Opti-MEM培养基后，将pGL3 Basic，pGL3 CMV，pGL3-K71各2ug分别与pRL-SV4040ng加入到培养基中。轻轻混匀。室温放置；
在使用Lipofectamine 2000之前先轻轻混匀脂质体；而后，在另一个管中加入0.25mlml室温的Opti-MEM培养基，再加入6ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀后室温放置，室温放置5min后；将上述稀释好的DNA与脂质体混合，混合物置于室温孵育20分钟；在此期间，用Opti-MEM培养基清洗待转染细胞一次，将脂质体和DNA复合物加入到原代绵羊皮肤成纤维细胞；将细胞培养板放回37℃培养箱中孵育，2-4小时后，移去脂质体和DNA复合物，在每个培养皿中加入2ml新鲜的培养液，重新将细胞培养板放回37℃培养箱中培养；48小时后测定其萤光素酶的活性，具体操作按照Dual-GloTM Luciferase Assay System(promega)说明书进行。K71基因5‘启动子调控区序列在绵羊成纤维细胞和小鼠C2C12小鼠成肌细胞系的活性和组织特异性分析结果参见图3。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此。应用本发明启动子时，可以是该启动子截短的序列，截短的序列是指绵羊启动子K71如序列表SEQ IDNO：1所示的1个或多个区域。采用重组核酸序列，该序列含有上述启动子序列或者截短的序列，这样可以使位于启动子下游的目的基因在皮肤毛囊中特异性地表达，为研究皮肤毛囊的特性提供必要的研究模型。另外，还可以利用转基因技术，将重组序列用于生产转基因动物。重组核酸序列的中的目的基因主要包括改善羊毛品质和促进羊毛生长的相关功能基因。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (2)
1.一种绵羊K71皮肤毛囊特异性启动子，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1所示。
2.权利要求1所述启动子K71在转基因羊培育中的应用。
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| CN103421782A (zh) * | 2012-11-27 | 2013-12-04 | 华中农业大学 | 绵羊毛囊特异性表达启动子片段的分离及表达模式鉴定 |
| CN103642806A (zh) * | 2013-12-02 | 2014-03-19 | 华中农业大学 | 基于绵羊毛囊特异表达基因的启动子分离及鉴定 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1262032A (zh) * | 1999-01-22 | 2000-08-09 | 上海世华植物基因工程有限公司 | 动物角蛋白转基因棉纤维及其基因工程方法 |
| EP1659175A1 (en) * | 2004-11-18 | 2006-05-24 | Institut Curie | Alterations in seborrheic keratoses and their applications |
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2012
- 2012-03-30 CN CN201210088972.1A patent/CN102643817B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
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| CN103642806B (zh) * | 2013-12-02 | 2015-10-21 | 华中农业大学 | 基于绵羊毛囊特异表达基因的启动子分离及鉴定 |
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