CN105462986B - 猪特异性友好位点Pifs302及其应用 - Google Patents

猪特异性友好位点Pifs302及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体公开了一个猪特异性友好位点Pifs302。所述友好位点Pifs302在基因组上的位置为：第15号染色体上第137957233bp(NC_010457.4，基于猪基因组序列信息版本号Sscrofa10.2，2011年9月)。本发明提供的猪特异性友好位点Pifs302可用于外源基因的稳定表达，解决转基因过程中外源基因表达的不稳定以及位置效应的不可预知性等问题。本发明提供的猪特异性友好位点Pifs302，使得对大家畜进行定点整合外源基因变得可靠，为大家畜的定点整合奠定了基础。本发明针对猪特异性友好位点Pifs302提供的打靶载体可以高效特异的实现打靶。

Description

猪特异性友好位点Pifs302及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及猪特异性友好位点Pifs302。
背景技术
在转基因动物的生产过程中，外源基因能否实现在转基因动物中高效稳定的表达，是转基因技术的关键。外源基因在受体动物基因组中随机整合，会由于位置效应表达量不稳定，受到表观修饰发生转基因的沉默。为了实现外源基因的持续稳定表达，定点转基因能够解决位置效应带来的各种问题。近年来出现ZFN和TALEN技术，以及新出现的CRISPR/Cas9技术，为基因的定点整合和基因敲除提供了新的工具，提高了转基因的效率，并在多个物种中都已经获得了成功。但是，定点转基因的关键之一在于一个好的整合位点的选择，一个好的位点能够使不同类型的外源基因表达盒稳定一致的表达,对动物细胞或者动物个体没有不利影响。目前在大动物中关于安全位点的研究比较少。因此在猪中找到这种适合外源基因整合的位点是非常重要的。
基因组中的安全位点是染色体中的一个位点，整合在这个位点的转基因能够在多个组织中稳定可靠的表达，而且能够适应不同类型的转基因表达盒的表达，对内源的基因结构和表达没有不利的影响。但是,外源DNA与寄主基因组序列之间的相互作用，会影响转基因整合的可靠性和安全性。虽然目的基因的转导已经取得了巨大的进步，但是基因插入到受体基因组中什么样的位点才能使安全性和效率最高却很少被研究。
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质的免疫系统，通过序列特异的RNA介导，切割降解外源性DNA，包括噬菌体和外源质粒。CRISPR/Cas系统可以作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点是操作简单、成本低、作用高效。2013年，科学家首次报道CRISPR/Cas系统在细胞上应用成功，随后，在斑马鱼、果蝇、小鼠、大鼠、猪中迅速得到应用。CRISPR/Cas系统在靶位点产生双链DNA断裂(double strandbreak,DSB),细胞可通过非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)进行修复，导致基因发生移码突变，丧失功能。除此之外，该系统还能与同源重组载体、寡聚核苷酸共同作用，使靶基因发生高效的精确修饰。2014年，Scott JG等利用CRISPR/Cas介导的同源重组在斑马鱼上实现了基因的替换。Hui Yang等利用相同的策略一步获得了带有报告基因的小鼠。CRISPR/Cas系统凭借其巨大优势迅速成为基因编辑工具中的佼佼者，在基因功能研究、疾病模型、基因治疗等领域得到广泛的应用。
CRISPR/Cas9介导同源重组已在斑马鱼、原虫、小鼠、大鼠上实现基因的精确编辑，但在家畜大动物上尚未见报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种猪特异性友好位点Pifs302及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一个猪特异性友好位点Pifs302，所述友好位点Pifs302在基因组上的位置为：第15号染色体上第137957233bp(NC_010457.4，基于猪基因组序列信息版本号Sscrofa10.2，2011年9月)。
所述友好位点可用于外源基因的稳定表达，解决转基因过程中外源基因表达的不稳定以及位置效应的不可预知性等问题。
第二方面，本发明提供了特异性靶向所述友好位点Pifs302的sgRNA。
以及转录所述sgRNA的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
第三方面，本发明提供了针对所述友好位点Pifs302的CRISPR/Cas9打靶载体，所述打靶载体发挥切割载体功能。
进一步地，所述打靶载体的构建方法包括如下步骤：
1)将前述DNA序列进行互补配对，形成双链DNA；
可选的，将所述DNA序列与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列进行互补配对，形成双链DNA；
2)将px330骨架载体用限制性内切酶BbsⅠ进行酶切过夜，回收后，与步骤1)得到的双链DNA连接，即得。
其中，所述px330骨架载体为本领域常规载体，可购自Addgene公司。
作为优选，本发明提供一个最佳的互补配对反应程序，具体为：94℃变性5min，35℃退火10min，0～4℃保存。可选的，可将反应物放置在冰上进行保存。
第四方面，本发明提供了针对前述友好位点的同源重组载体，所述载体含有两端带有Pifs302位点同源左臂和同源右臂的外源目的基因。
进一步地，所述同源重组载体的构建方法，包括如下步骤：
1)以猪细胞基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示引物序列扩增Pifs302位点的同源右臂，利用SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示引物序列扩增Pifs302位点的同源左臂；
2)将外源目的基因通过NheI和NotI限制性内切酶连入同源重组载体。
更进一步地，所述外源目的基因的两端带有loxP序列，一端为突变型loxP，序列如SEQ ID No.7所示，另一端为野生型loxP。
在本发明的一个具体实施方式中，为了验证所述前述位点的友好性，所述外源基因为来自pEGFP-N1载体的表达单元EGFP(报告基因)。
第五方面，本发明提供了一种转基因方法，将前述打靶载体与前述同源重组载体按物质的量1:1的比例混合，用电击转染或脂质体转染的方法共转入猪成纤维细胞。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了猪特异性友好位点Pifs302，所述友好位点可用于外源基因的稳定表达，不会因为受到表观遗传的修饰发生外源基因的沉默，解决转基因过程中外源基因表达的不稳定以及位置效应的不可预知性等问题。本发明提供的猪特异性友好位点Pifs302，使得对大家畜进行定点整合外源基因变得可靠，为大家畜的定点整合奠定了基础。本发明针对猪特异性友好位点Pifs302提供的打靶载体可以高效特异的实现打靶。
附图说明
图1是本发明实施例5中所述同源重组载体的结构示意图。
图2是本发明实施例6中PCR法鉴定细胞单克隆，发生定点整合的会扩增出7kb的条带，没有定点整合的只有3kb的条带。
图3是本发明实施例6中在友好位点处的外源基因表达。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
其中：px330载体购于Addgene公司；T4DNA连接酶、限制性内切酶购于大连TaKaRa公司；引物合成及序列测定由上海生工和深圳华大完成；LongAmp Taq DNA聚合酶、Q5DNA聚合酶；Trizol Reagent购于康为世纪公司；反转录酶购于Promega公司；SYBR Green购于Roche公司；质粒去内毒素大提试剂盒、基因组提取试剂盒购于QIAGEN公司；酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。
实施例1
实施例1用于说明本发明所述猪特异性友好位点。
所述友好位点Pifs302在基因组上的位置为：第15号染色体上第137957233bp(NC_010457.4，基于猪基因组序列信息版本号Sscrofa10.2，2011年9月)。
实施例2
实施例2用于说明特异性靶向本发明所述友好位点Pifs302的sgRNA，该sgRNA由SEQ ID No.1所示的DNA序列转录得到。
实施例3
实施例3用于说明针对本发明所述友好位点Pifs302的CRISPR-Cas9打靶载体。
CRISPR-Cas9打靶载体的构建方法如下：
1、构建打靶载体
将SEQ ID No.1所示序列与SEQ ID No.2所示序列进行互补配对，构建双链DNA；构建过程如下：94℃，5min，再35℃，10min，然后立即放冰上，对寡聚核苷酸进行保存。
将px330骨架载体用限制性内切酶BbsⅠ进行酶切过夜，回收后，与退火的寡聚核苷酸16℃连接3h。通过常规转化法进行转化、涂板。待单菌落长成后，挑取数个扩大培养并测序。测序验证正确，将成功构建的CRISPR-Cas9打靶载体命名为px330-301。
实施例4
实施例4用于说明实施例2所述打靶载体的应用，具体包括如下步骤：
1、阳性单菌落扩大培养
具体步骤为：
a.初始培养，用枪头挑取阳性单菌落，加入盛有5ml LB培养基(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g溶于1L蒸馏水中)的灭菌管中，37℃，220rpm，培养8h至12h；
b.扩大培养，将过夜培养液按体积1:500的比例转移到盛有100ml LB培养基的灭菌三角瓶中，37℃，220rpm，培养12h至16h。
2、px330质粒去内毒素大提
按照质粒去内毒素大提试剂盒(EndoFree Plasmid Maxi Kit)上提供的方法，提取px330质粒，所提的质粒用于细胞的转染。
3、细胞转染
细胞转染采用Lonza Nucleofector进行电转。具体流程如下：a.将消化并收集的6孔细胞培养板中一个孔的猪成纤维细胞(约1×106个)、4μg px330质粒和100μlNucleofector试剂混匀，装入电击杯用T-016程序进行电击转染；b.电击结束后，沿电击杯内壁缓慢加入37℃预热的成纤维细胞培养基(10％FBS+DMEM)500μL，将细胞接种于6孔细胞培养板的一个孔内；c.用无筛选药物的成纤维细胞培养基(10％FBS+DMEM)于37.5℃，5％CO2培养箱培养。
实施例5
实施例5用于说明针对本发明所述友好位点Pifs302的同源重组载体。
同源重组载体的构建方法如下：
1)以猪细胞基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示引物序列扩增Pifs302位点的同源右臂，利用SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示引物序列扩增Pifs302位点的同源左臂；
2)利用来自pEGFP-N1载体的表达单元EGFP作为报告基因(所述表达单元EGFP的两端带有loxP序列，一端为突变型loxP，序列如SEQ ID No.7所示，另一端为野生型loxP)，通过NheI和NotI限制性内切酶连入同源重组载体，即得。所述同源重组载体的结构示意图如图1所示。
实施例6
实施例6用于说明利用实施例3所述的打靶载体与实施例5所述的同源重组载体在转基因方面的应用。
1、阳性单克隆细胞的筛选
消化并收集6孔细胞培养板中一个孔的IBRS-2细胞或猪成纤维细胞(约1×106个)，将构建的打靶载体和同源重组的载体，按物质的量1:1的比例混合，取总质量4μg，按实施例4中的方法进行转染后，放至CO2培养箱中，37.5℃培养。48h后细胞汇合度达到80-90％，此时将1个孔的细胞平均分到8个10cm培养皿中。24h后细胞贴壁，将培养基更换为含G418(600μg/mL)的成纤维细胞培养基(10％FBS+DMEM)，每3～4d换一次液，培养基仍然为含G418(600μg/mL)的成纤维细胞培养基。细胞培养6～9d后，可以观察到细胞克隆点形成。在显微镜下找到抗性细胞克隆点，用Marker笔做标记，倒掉培养基，PBS溶液清洗一次，用细胞克隆环将抗性细胞克隆点罩住，加入10～30μL在37℃预热的0.25％胰蛋白酶消化液，37.5℃消化细胞2min左右，加入细胞培养基终止消化反应，将消化下来的细胞接种到48孔细胞培养板中培养。待细胞汇合度达到90％时，消化细胞，接种到12孔细胞培养板中继续培养，原来48孔细胞培养板中的未被消化下来的细胞也继续培养以供提取细胞基因组DNA，细胞继续扩大培养至6孔细胞培养板，按照猪胚胎成纤维细胞冻存方法进行抗性细胞冻存。
2、阳性细胞单克隆的鉴定
对所挑取的细胞单克隆进行鉴定：
以提取的细胞单克隆基因组DNA为模板，用LongAmp Taq DNA聚合酶进行PCR，扩增出7kb的片段，引物(5’-CAAAG TAGGA GACCC TCGTTA-3’)和(5’-TGAAG TGAGT GTTGG AGCA-3’)，以野生型细胞基因组DNA为模板的PCR反应为阴性对照。扩增条件：94℃，30sec；94℃，30sec；58℃，30sec；65℃，7min；65℃，10min；35个循环。扩增完成后，0.8％琼脂糖电泳观察结果。结果见图2。该步鉴定所用的上游引物位于同源左臂上游，下游引物位于同源右臂下游，因此若发生同源重组则能扩增出7kb的片段，若没发生重组则不能扩增出7kb的片段。
本实施例中，经过跨越同源臂的PCR鉴定结果，说明外源基因在目的位点处发生了整合。
对发生成功定点整合的细胞克隆，我们采用定量PCR的方法进行了外源基因表达的分析，说明友好位点能够支持外源基因的高效表达。如图3所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.特异性靶向猪特异性友好位点Pifs302的sgRNA，其特征在于，转录所述sgRNA的DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述友好位点Pifs302在基因组上的位置为：基于2011年9月的猪基因组序列信息版本号Sscrofa10.2，第15号染色体上第137957233bp。
2.针对猪特异性友好位点Pifs302的CRISPR/Cas9打靶载体，所述猪特异性友好位点Pifs302在基因组上的位置为：基于2011年9月的猪基因组序列信息版本号Sscrofa10.2，第15号染色体上第137957233bp，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：
1）将SEQ ID No.1所示的DNA序列进行互补配对，形成双链DNA；
2）将px330骨架载体用限制性内切酶BbsⅠ进行酶切过夜，回收后，与步骤1）得到的双链DNA连接，即得。
3.权利要求2所述打靶载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将SEQ ID No.1所示的DNA序列进行互补配对，形成双链DNA；
2）将px330骨架载体用限制性内切酶BbsⅠ进行酶切过夜，回收后，与步骤1）得到的双链DNA连接，即得。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述互补配对的反应程序为：94℃变性5min，35℃退火10min，0~4℃保存。
5.针对友好位点的同源重组载体，其特征在于，所述载体含有两端带有Pifs302位点同源左臂和同源右臂的外源目的基因，其构建方法包括如下步骤：
1）以猪细胞基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示引物序列扩增Pifs501位点的同源右臂，利用SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示引物序列扩增Pifs501位点的同源左臂；
2）将外源目的基因通过NheI和NotI限制性内切酶连入同源重组载体；
所述Pifs302位点在基因组上的位置为：基于2011年9月的猪基因组序列信息版本号Sscrofa10.2，第15号染色体上第137957233bp。
6.权利要求5所述同源重组载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）以猪细胞基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示引物序列扩增Pifs302位点的同源右臂，利用SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示引物序列扩增Pifs302位点的同源左臂；
2）将外源目的基因通过NheI和NotI限制性内切酶连入同源重组载体。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述外源目的基因的两端带有loxP序列，一端为突变型loxP，序列如SEQ ID No.7所示，另一端为野生型loxP。
8.一种转基因方法，其特征在于，将权利要求3中所述的打靶载体与权利要求5所述的同源重组载体按物质的量1:1的比例混合，用电击转染或脂质体转染的方法共转入猪成纤维细胞。
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