CN102533965B - 检测转人乳铁蛋白基因奶牛的荧光定量pcr试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测转人乳铁蛋白基因奶牛的多重荧光定量PCR试剂盒，包括外源基因引物、内源基因引物、DNA聚合酶、外源基因荧光探针、内源基因荧光探针、荧光定量PCR反应液、阳性标准品和阴性牛的DNA，同时扩增待测奶牛内源的牛β-微球蛋白基因B2M和外源的人乳铁蛋白基因hLF，均起峰的为转基因阳性牛，B2M起峰而hLF不起峰的则为转基因阴性牛。本发明的检测极限为10个拷贝质粒/反应，可有效用于转基因奶牛外源基因的检测。

Description

检测转人乳铁蛋白基因奶牛的荧光定量PCR试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及一种检测转人乳铁蛋白基因奶牛的荧光定量PCR试剂盒及其应用。 

背景技术

“硕鼠”的问世(Palmiter et al.，1982)，加速了转基因生物的研究。克隆绵羊“多莉”的诞生(Wilmut et al.，1997)，促进了转基因技术在哺乳动物方面的广泛应用。目前研制成功多种用于生产药用或食用蛋白、提高瘦肉率、改善营养、增强抗病力的转基因猪、牛、羊(Schnieke et al.，1997；Toledo et al.，2006)，其潜在的经济效益和社会效益巨大，具有良好的商品化前景。但是由于转基因生物及其产品存在风险，转基因生物及产品的管理一直受到各国政府的高度重视。 

为了保护人类自身的健康和生存环境，包括我国在内的许多国家相继制定了转基因生物安全法规，对转基因生物及产品采用标识制度，对转基因食品进出境进行严格管理。要使这些法规、制度得以顺利实施，需要有效的检测技术做支撑。目前国际上比较认同的转基因生物及其加工食品的检测方法主要是利用PCR方法对外源基因进行检测，包括普通PCR、多重PCR(Germini et al.，2004)、巢式PCR、多重巢式PCR(张明辉等，2006)、荧光定量PCR等。转基因植物检测方法的研究已开展多年，而转基因动物检测方法的研究较少，且试验动物集中于转基因小鼠(王趁芳等，2009)。目前对具有商品化前景的转基因家畜的检测平台尚待建立，还未见转入乳铁蛋白奶牛多重荧光定量PCR检测方法的相关报道。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明只在提供一种检测转人乳铁蛋白基因 奶牛的荧光定量PCR试剂盒及其应用。 

为了实现本发明的目的，本发明提供一种检测转人乳铁蛋白基因奶牛的荧光定量PCR试剂盒，包括外源基因引物、内源基因引物、DNA聚合酶、外源基因荧光探针、内源基因荧光探针、荧光定量PCR反应液、阳性标准品和阴性奶牛的DNA，其特征在于，所述的外源基因引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述的外源基因荧光探针序列为SEQ ID No.3所示，所述的内源基因引物为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，所述的内源基因荧光探针序列为SEQ ID No.6所示，所述外源基因荧光探针的5’荧光基团为FAM，3’荧光基团为TAMRA，所述内源基因荧光探针的5’荧光基团为HEX，3’荧光基团为TAMRA。 

其中，阳性标准品包含内源基因的阳性标准品和外源基因的阳性标准品，所述的内源基因的阳性标准品为携带至少包含SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示引物特异性扩增的片段的质粒，所述的外源基因的阳性标准品为携带至少包含SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示引物特异性扩增的片段的质粒。 

根据本发明，所述的阳性标准品的拷贝数为10⁷-10¹拷贝/μL。 

本发明的另一个目的在于提供所述的试剂盒在检测转人乳铁蛋白基因奶牛中的应用，具体而言，分别以待测奶牛的DNA、阳性标准品和阴性奶牛的DNA为模板，同时对内源的牛β-微球蛋白基因和外源的人乳铁蛋白基因进行荧光定量PCR扩增，其中反应体系为： 

每25μL反应液中含有：10×含Mg²⁺的PCR缓冲液2.5μL、2.5mMdNTP 2μL、10μM两种基因的上下游引物各0.5μL、10μM两种基因的探针各0.5μL、Ex Taq热启动DNA聚合酶0.125U，DNA模板1μL，ddH₂O补足至25μL。 

反应条件为：预变性95℃，5min，变性95℃，10s，退火延伸60℃，30s，扩增40个循环。 

如果阳性标准品和待测奶牛都能同时检测到牛β-微球蛋白基因和人乳铁蛋白基因的荧光信号，而阴性DNA模板只能检测到牛β-微球蛋白基因的荧光信号，则表明该奶牛样品为阳性牛；如果待测奶牛和同阴性DNA模板一样，只能检测到牛β-微球蛋白基因的荧光信号，而阳性标准品能同时检测到牛β-微球蛋白基因和人乳铁蛋白基因的荧光信号，则表明该奶牛样品为阴性牛。 

本方法与常规PCR比较试验结果表明有以下几点优势：1)可对转人乳铁蛋白基因奶牛中的外源基因作到定量检测；2)特异性好，因为检测过程中上下游引物与探针同时保证了特异性，有“双保险”的性质，而且探针与模板结合所要求的特异性更强；3)无需对产物进行处理，在荧光定量PCR反应结束后由系统直接给出结果，实现了实时、在线检测过程，从而克服了传统PCR技术易污染的缺陷；4)该方法检测病毒量的最低限为10拷贝质粒/反应，比常规PCR敏感；5)该检测系统包括定量检测过程需1.5h和样品制备需3h，以及iQ5荧光定量PCR仪有96个反应孔，可同时检测大量样本，实现了高通量。 

附图说明

图1为实时荧光定量PCR标准曲线。 

图2为转基因阳性奶牛检测图。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 

实施例1转乳铁蛋白基因奶牛的制备 

参考Yang P.，Wang J.，Gong G.，et al.Cattle mammary bioreactor generated by a novel procedure of transgenic cloning for large-scale production of functional human lactoferrin[J].PLoS One，2008，3(10)：e3453)公开的方法制备。其中，受体奶牛品种为高产荷斯坦奶牛。 

实施例2阳性标准品的制备 

1)参照QIAGEN动物组织基因组提取试剂盒，提取转基因奶牛和非转基因牛的DNA。转基因奶牛样品为耳组织，非转基因牛样品为肌肉组织(购自市场)。 

2)以序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物扩增内源的牛β-微球蛋白基因片段；以序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的引物扩增转基因奶牛DNA中人乳铁蛋白基因片段。PCR反应体系为25μL，其中ddH₂O 17.375μL，10×PCR缓冲液(含2.5mMMgCl₂)2.5μL，dNTPs(2.5mM)2μL，上、下游引物(均为10μM)各为1μL，Ex Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.125uL，基因组DNA 1μL。PCR反应条件：预变性95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，共30循环，延伸反应72℃7min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后，用胶回收试剂盒进行回收纯化，连接到pGEM-T载体上，转化至E.coli DH5α中，阳性克隆经PCR鉴定后测序。测序结果表明为目标序列。将鉴定正确的基因片段抽提质粒DNA，测其核酸浓度，计算出拷贝数，以此作为TaqMan荧光定量质粒标准品。质粒命名为pGEM-hLF和pGEM-B2M。 

3)用紫外分光光度计测得重组质粒pGEM-hLF和pGEM-B2MDNA浓度为296.91和281.61μg/mL，稀释其拷贝数为1.0×10¹⁰和1.0×10¹⁰拷贝/μL，并用ddH₂O 10倍系列稀释成含10⁷～10¹拷贝/μL作为质粒标准品。 

4)标准曲线绘制 

用质粒标准品进行荧光定量PCR反应，反应模板浓度依次为 10⁷～10¹拷贝/反应，反应的灵敏度为10¹拷贝/反应，在10⁷～10²拷贝/反应浓度范围内有极好的线性关系(图1)。其中，荧光定量PCR反应体系为25μL，其中ddH₂O 16.375μL，10×PCR buffer(含2.5mMMgCl₂)2.5μL，dNTP(2.5mM)2μL，两种基因的上、下游引物(均为10μM)各为0.5μL，Ex Taq热启动DNA聚合酶(5U/μL)0.125uL，两种基因的探针(均为10μM)各为0.5μL，DNA模板1μL。PCR反应条件：第一阶段，预变性95℃5min，第二阶段，变性95℃10s，退火延伸60℃30s，扩增40个循环，在第二阶段的退火延伸时收集荧光。 

实施例3制备用于检测人乳铁蛋白基因奶牛的荧光定量PCR试剂盒 

制备用于检测人乳铁蛋白基因奶牛的荧光定量PCR试剂盒，其中，10×PCR缓冲液(含2.5mM MgCl₂)500μL；2.5mM dNTPs 400μL；10μM的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的引物各100μL；10μM的探针Hex-AGACAGGTCTGACTGCTCCGATTTAATC-TAMRA 100μL；10μM的探针FAM-CAATGCGTCCTCCAGTCCTCCAAGA-TAMRA100μL；5U/μL Ex Taq热启动DNA聚合酶50μL；10⁷～10¹拷贝/μL的pGEM-hLF和pGEM-B2M 1∶1混合的阳性质粒各50μL，50ng/μL的阴性牛DNA 50μL；ddH₂O 4000μL。 

实施例4转基因阳性奶牛检测 

利用实施例3制备的试剂盒，对已知的3个实施例1制备的阳性样品(编号为祥娃、050211、181)和2个已知非转基因阴性牛样品进行检测。以浓度为10⁶拷贝/μL的阳性质粒为阳性对照，同时扩增hLF基因和B2M基因，其中荧光定量PCR反应体系和反应条件同实施例2。FAM荧光标记检测结果，转基因阳性牛和阳性对照起峰，转基因阴性不起峰。HEX荧光标记检测结果，转基因阳性、转基因阴性牛和阳性对照均起峰(图2)。 

Claims (4)

1.一种检测转人乳铁蛋白基因奶牛的荧光定量PCR试剂盒，包括外源基因引物、内源基因引物、DNA聚合酶、外源基因荧光探针、内源基因荧光探针、荧光定量PCR反应液、阳性标准品和阴性奶牛的DNA，其特征在于，所述的外源基因引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述的外源基因荧光探针序列为SEQ ID No.3所示，所述的内源基因引物为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，所述的内源基因荧光探针序列为SEQ ID No.6所示，所述外源基因荧光探针的5’荧光基团为FAM，3’荧光基团为TAMRA，所述内源基因荧光探针的5’荧光基团为HEX，3’荧光基团为TAMRA。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，阳性标准品包含内源基因的阳性标准品和外源基因的阳性标准品，所述的内源基因的阳性标准品为携带至少包含SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示引物特异性扩增的片段的质粒，所述的外源基因的阳性标准品为携带至少包含SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示引物特异性扩增的片段的质粒。

3.权利要求1或2所述的试剂盒在检测转人乳铁蛋白基因奶牛中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，分别以待测奶牛的DNA、阴性奶牛DNA和阳性标准品为模板，同时对内源的牛β-微球蛋白基因和外源的人乳铁蛋白基因进行荧光定量PCR扩增，其中反应体系为：

每25μL反应液中含有：10×含Mg²⁺的PCR缓冲液2.5μL、2.5mM dNTPs 2μL、10μM两种基因的上下游引物各0.5μL、10μM两种基因的探针各0.5μL、Ex Taq热启动DNA聚合酶0.125U，DNA模板1μL，ddH₂O补足至25μL；

反应条件为：预变性95℃，5min，变性95℃，10s，退火延伸60℃，30s，扩增40个循环。 

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