CN108517365B - 一种提高猪天然免疫力的Sp100分子标记育种方法及其应用 - Google Patents

一种提高猪天然免疫力的Sp100分子标记育种方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108517365B
CN108517365B CN201810258604.4A CN201810258604A CN108517365B CN 108517365 B CN108517365 B CN 108517365B CN 201810258604 A CN201810258604 A CN 201810258604A CN 108517365 B CN108517365 B CN 108517365B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pig
gene
molecular marker
breeding
locus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810258604.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108517365A (zh
Inventor
杨秀芹
牛步月
狄生伟
汪亮
刘娣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northeast Agricultural University
Original Assignee
Northeast Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northeast Agricultural University filed Critical Northeast Agricultural University
Priority to CN201810258604.4A priority Critical patent/CN108517365B/zh
Publication of CN108517365A publication Critical patent/CN108517365A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108517365B publication Critical patent/CN108517365B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种提高猪天然免疫力的分子标记育种方法及其应用，它涉及分子遗传学领域，具体涉及了利用一种猪Sp100基因5’调控区突变位点的分子标记方法在猪抗病育种中的应用，发明人发现荷包猪和大白猪的Sp100 5’调控区存在多处差异，其中‑283位点处存在C到G的突变，通过荧光素酶报告基因系统发现，将‑283位点的C定点突变成G后其启动子活性显著升高，与抗病力强的荷包猪Sp100基因mRNA表达量低相一致。可见通过检测猪基因组中Sp100调控区该‑283位点的基因型可以作为与猪免疫性能相关的分子标记，不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。

Description

一种提高猪天然免疫力的Sp100分子标记育种方法及其应用
技术领域
本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种提高猪天然免疫力的育种方法，通过判断猪Sp100基因5’调控区突变位点的多态性来进行选种，并人为地应用该突变位点实现高抗病性猪的育种。
背景技术
我国是世界猪肉生产和消费第一大国，猪肉是我国人民的主体肉食，约占肉类消费总量的50～60％。提高猪的生长速度、瘦肉率、肉质以及产仔数等经济性状一直是养猪生产者和猪育种专家的工作重点。在过去的几十年，猪的日增重、胴体瘦肉率、背膘厚、饲料报酬等重要经济性状有了显著的提高。但是，由于抗病性状与生长性状之间存在着一定程度的负相关，长期以来，抗病性状没有得到足够的重视，猪的抵抗能力不断下降，各种疾病越来越多，常常对养猪生产造成严重影响。所以，抗病育种正在成为国内外育种工作者的研究重点。
疾病，尤其病毒引起的传染性疾病是影响养猪业经济效益的最重要因素之一，尽管在过去的几十年中，注射药物和疫苗等措施发挥了重要的防治作用，但仍未能完全控制和消灭传染病的流行，并且随着集约化程度的提高和饲养条件的改变，又相继出现新传染病的发生和流行。另外，随着人们生活水平的提高以及绿色、健康理念的发展，对动物性产品的质量要求越来越高，使用抗生素等药物带来的安全性和抗药性问题正逐渐成为人们关注的热点。因此，从长远看，采用遗传学的方法从遗传本质上提高猪对病原的抗性，开展抗病育种具有治本的效果。但是，由于抗病性状的遗传基础复杂、抗病性或易感性指标难以确定、后裔测定难度大，世代间隔长等因素的限制，常规育种难以取得理想效果。分子生物学及分子遗传学的发展，使得应用分子技术阐明抗病力的分子机理和遗传控制机制、寻找主效基因和遗传标记，开展标记辅助选择成为可能。
发明内容
基于上述的原因，本发明通过筛选出猪天然免疫力相关的基因标记，建立猪分子标记辅助育种方法，为猪高抗病性品种培育提供基因标记和技术方法。
本发明的一种提高猪天然免疫力的育种方法，该方法是基于SNP位点开发的，该方法是通过检测猪基因组中Sp100调控区-283位点的基因型实现的，选择出Sp100调控区-283位点的基因为C的猪，即为筛选出的目标，对该目标猪进行育种，即完成所述的提高猪天然免疫力的Sp100分子标记育种。
本发明基于所述的SNP位点开发的检测方法为PCR产物直接测序法。
本发明用于将权利要求1所述的SNP位点进行基因分型的引物对，所述的引物序列如下所示：
Sp100F10：GCACATTTATGTCAACACC；
Sp100R2：ACGGCCTCCACTAGCCAT。
本发明的基于所述的SNP位点开发的检测方法的应用，它用于猪育种。
本发明通过进一步的实验发现猪Sp100 5’调控区-283位点的C到G突变在体外试验中改变了Sp100启动子的活性，两者差异显著，可见检测与突变相关联的分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。
核点蛋白Sp100是一种转录激活蛋白，作为PML核体结构(PML nuclear bodies，PML-NBs或者Nuclear Dot，ND10)中的固定成员在参与病毒感染、病毒相关蛋白相互作用、自身泛素化调节及干扰素、p53等多个信号通路中发挥作用，其表达与干扰素和病毒感染有较强的相关性。
本发明利用高通量测序技术分析了poly(I:C)作用下猪呼吸道上皮细胞内基因表达谱的差异，筛选了大量差异表达基因，其中Sp100基因的表达量受到poly(I:C)的显著调控，提示了Sp100的表达可能与猪抗病毒天然免疫能力有关；之后利用荧光定量PCR验证的结果表明poly(I:C)刺激后荷包猪和大白猪外周血白细胞中Sp100基因的表达量存在着显著差异；通过对荷包猪和大白猪Sp100基因5’调控区的对比，找到14处核苷酸序列的不同。
其中，本发明对-283位点的C>G多态性进行了群体遗传学分析，发现在抗病力存在明显差异的荷包猪和大白猪该位点等位基因的分布存在着明显的差异，荷包猪C等位基因频率显著高于大白猪(0.636vs 0.143)，大白猪G等位基因频率显著高于荷包猪(0.857vs0.364)，进一步提示该点突变与荷包猪抗病力强相关。
本发明对-283位点的C>G多态性进行了进一步研究。用TESS软件预测-283位点的C到G改变位于转录因子SP1结合位点内。SP1是一种常见而又十分重要的转录因子，与细胞生长分化、肿瘤发生发展相关，存在于多个基因的启动子中，高表达于各组织与细胞中。SP1能够与启动子区域中GC富含区结合，在无TATA-box的启动子中发挥重要作用，可以维持TATA-less启动子基因的基础转录水平。我们的研究表明突变Sp100基因-283位点的SP1结合位点(C突变为G)后，荧光素酶报告基因活性显著升高，提示SP1可能有抑制Sp100基因转录的功能，之后的转录因子SP1过表达实验证明了SP1对Sp100转录具有负调控作用；Sp100基因-283位点为CC基因型个体，Sp100基因表达量显著低于GG基因型个体；并且抗病力强的荷包猪C等位基因发生的频率显著高于非抗病性的大白猪；因此通过分子标记选择Sp100基因-283位点为C基因的猪只组建基础群进行育种，对于提高猪群体的一般抗病力具有重要的育种意义。
本发明包含以下有益效果：
本发明通过实验发现猪Sp100 5’调控区-283位点的C到G的突变在体外试验中显著增加了Sp100启动子的活性，两者差异显著，可见检测与突变相关联的分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。
附图说明
图1为PCR扩增猪Sp100基因5’调控区的电泳图；图中，泳道1为DL2000 marker，泳道2为目的条带；
图2为荧光素酶检测猪Sp100基因的启动子不同长度片段的活性示意图；
图3为突变载体P363*鉴定结果示意图；
图4为突变-283位点后荧光素酶报告系统检测载体表达变化示意图，可见突变该片段后，其启动活性显著升高；
图5为PCR扩增猪Sp100基因5’调控区多态性片段的电泳图，泳道1为目的条带，泳道2为DL 2000marker。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种提高猪天然免疫力的育种方法，该方法是基于SNP位点开发的，该方法是通过检测猪基因组中Sp100调控区-283位点的基因型实现的，选择出Sp100调控区-283位点的基因为C的猪，即为筛选出的目标，对该目标猪进行育种，即完成所述的提高猪天然免疫力的Sp100分子标记育种。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：基于所述的SNP位点开发的检测方法为PCR产物直接测序法。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：用于将所述的SNP位点进行基因分型的引物对，所述的引物序列如下所示：
Sp100F10：GCACATTTATGTCAACACC；
Sp100R2：ACGGCCTCCACTAGCCAT。
其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的提高猪天然免疫力的育种具体步骤如下：
(1)获得待检测猪的基因组DNA；
(2)以上述猪基因组DNA为模板，采用如下引物对进行扩增，获得含有-283位点的Sp100基因的5’调控区片段；
Sp100F10：GCACATTTATGTCAACACC；
Sp100R2：ACGGCCTCCACTAGCCAT；
(3)通过琼脂糖凝胶电泳对上述扩增产物进行检测；
(4)对PCR产物进行测序分析，检测上述Sp100基因的5’调控区片段内-283位点多态性；
(5)选择Sp100基因的5’调控区内-283位点的基因为C的猪，即为筛选出的目标；
(6)对筛选出的目标猪进行育种，即完成所述的提高猪天然免疫力的Sp100分子标记育种。
其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：筛选出的含有-283位点的Sp100基因的5’调控区片段，其序列如Seq ID No：1所示。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式基于权利要求1所述的SNP位点开发的检测方法的应用，其特征在于它用于猪育种。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：它用于猪的早期选种。其它与具体实施方式六相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明有益效果：
实施例1
PCR方法分析猪Sp100基因的5’调控区
1.基因组提取：取猪耳组织，用常规酚-氯仿法进行基因组DNA提取。
2.引物设计：利用克隆得到的Sp100 cDNA序列(GenBank登录号：KC538899)做探针，对UCSC数据库(http://genome.ucsc.edu/)进行blat分析，截取起始密码子上游2500bp核苷酸序列进行引物设计Sp100F1和Sp100R1，并在其5’末端分别引入KpnI和XhoI酶切位点，引物序列如下：
Figure GDA0002851647530000051
注：Sp100F1下划线表示KpnI酶切位点；Sp100R1下划线表示XhoI酶切位点。
3.PCR扩增：本实施例使用的是常规PCR扩增荷包猪Sp100基因5’调控区-1891～+18片段，引物序列如下：
扩增体系为：基因组DNA 25ng，10×Buffer2.5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，上下游引物各10pmol，LA Taq酶1U，ddH2O补齐至25μL。
按如下程序进行PCR扩增：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。
利用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，检测结果见图1。
4.PCR产物克隆：
(1)扩增产物与loading buffer混合上样至1％的琼脂糖凝胶，5V/cm电泳30分钟置于紫外线切胶回收，按天根公司的琼脂糖凝胶纯化试剂盒说明书操作得到纯化产物。
(2)连接反应：将纯化PCR产物与pMDl8-T Vector连接，严格按照大连宝生物工程有限公司的载体试剂盒说明书进行操作。
(3)感受态细胞的制备：从37℃培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2mL LB中，于37℃振荡培养3h，转接1mL菌液于含有30mL LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600达到0.3-0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃4,000g离心10min一次，用4mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，置4℃保存备用。
(4)转化：在灭菌的1.5mL离心管中加入100μL感受态细胞，于冰上加入连接产物5μL，用移液枪吸打均匀，冰浴30min；将离心管置于42℃的循环水浴中(勿震动)，热激90s后迅速冰浴2min；再往离心管中加入400μL LB培养液，在37℃摇床(200rpm/min)温浴复苏45-60min；离心，去除部分上清液，取100μL复苏后的菌液布于含Amp的平板上，铺平；待液体充分吸收后，倒置平皿，于37℃培养14-16小时，观察有无菌落长出；
(5)阳性克隆子的鉴定及测序：从平板上挑取转化好的菌斑接入含1mL LB的1.5mL离心管中并于37℃振摇培养约8h左右。收集菌液，提取质粒，进行双酶切鉴定，选取含有阳性质粒的菌液送去测序，序列测定由华大基因科技服务有限公司完成。测序结果见Seq IDNo：2。
5.多态位点鉴定：荷包猪和大白猪各随机选取2个个体，利用Sp100F1/R1引物扩增猪基因组DNA后，获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，直接送华大基因科技服务有限公司测序，测序引物为Sp100R1，利用DNAMAN软件比对分析不同个体的测序结果，并通过肉眼分析测序峰图，查找多态位点。在该区域共检测到14个SNPs位点，分别为
Figure GDA0002851647530000061
实施例2
构建Sp100启动子载体及5’末端截短载体，荧光素酶报告系统检测其活性
1.启动子克隆载体构建：利用引物Sp100F1/R1扩增荷包猪基因组DNA 5’调控区-1891～+18片段，并以pMD-18T为骨架，构建Sp100基因启动子克隆载体，具体方法见实施例1。
2.引物设计：设计引物Sp100F2-F9，分别与Sp100R1配对使用，以-1891～+18片段的克隆载体为模板，分别扩增Sp100基因启动子区-1661～+18、-1432～+18、-1147～+18、-984～+18、-761～+18、-553～+18、-363～+18、-186～+18片段。各引物的5’末端均引入KpnI酶切位点，引物序列如下：
Figure GDA0002851647530000062
Figure GDA0002851647530000071
注：下划线分别表示KpnI酶切位点。
PCR扩增体系为：含有-1891～+18片段的克隆载体DNA25 ng，10×Buffer2.5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)2μL，上下游引物各10pmol，Ex Taq酶1U，ddH2O补齐至25μL。
PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。
3.截短型启动子克隆载体构建：将各片段分别插入到pMD-18T载体中，构建Sp100基因截短型启动子片段克隆载体。
4.荧光素酶报告基因构建：利用引物上引入的限制性内切酶识别位点(KpnI和XhoI)，将各种长度的Sp100基因启动子片段从pMD-18T载体中切下来。
酶切体系：Kpn I，0.5μL；Xho I，0.5μL；10×M Buffer，1.0μL；Plasmid，4.0μL；ddH2O，4.0μL。
反应条件：37℃水浴，2小时。
酶切后经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用天根公司的琼脂糖凝胶纯化试剂盒按照说明书对目的片段进行纯化，连接入pGL3-basic载体中，利用大连宝生物工程公司的T4DNA连接酶进行连接，连接体系和反应条件严格按照说明书进行。
5.感受态细胞制备、连接产物转化、阳性克隆子的鉴定及测序验证：具体步骤见实施例1。获得的阳性重组子按其长度分别命名为1.9K-pGL3(-1891～+18片段)、1.7K-pGL3(-1661～+18片段)、1.45K-pGL3(-1432～+18片段)、1.2K-pGL3(-1147～+18片段)、1K-pGL3(-984～+18片段)、0.8K-pGL3(-761～+18片段)、0.6K-pGL3(-553～+18片段)、0.4K-pGL3(-363～+18片段)和0.2K-pGL3(-186～+18片段)。
6.去内毒素质粒提取：将测序正确的、含有荧光素酶报告基因的菌液按照1:500的比例接种至含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，200rpm剧烈摇换16h。4℃6000rpm收集菌体，利用天根公司的去内毒素质粒提取试剂盒提取去内毒素质粒，具体操作严格按照说明书进行，利用紫外分光光度计测量质粒浓度。
7.细胞培养：PK-15细胞培养：PK-15细胞用含有10％胎牛血清和1％双抗(青霉素+链霉素)的完全培养基进行培养，在5％CO2培养箱、37℃生长至80～90％融合。
8.转染：利用Invitrogen公司的lipofectamine 2000转染试剂盒，将构建的9种载体分别与海肾荧光素酶报告基因载体(pRL-TK)共转染PK-15细胞，转染操作严格按照试剂盒说明书进行，转染后24h，收获细胞。每组转染3次，每次3个重复。
9.荧光素酶活性检测：利用Promega公司的双荧光素酶检测试剂盒测量萤火虫和海肾荧光素酶活性，萤火虫荧光素酶活性用海肾荧光素酶活性校正后即为相对荧光素酶活性。测定结果如图3，从图3可以看出，相对于pGL3-basic对照，Sp100基因5’端-1891～+18片段具有明显的启动子活性，说明该区段为猪Sp100基因的启动子；当Sp100基因的5’调控区片段由-1891bp逐渐删除至-1147bp时，荧光素酶活性有升高的趋势，但差异不显著，继续删除至-984bp时，荧光素酶活性显著降低(P<0.05)，表明在-1147bp到-984bp有促进基因转录的顺式作用调控元件。继续截短Sp100启动子的5’末端至-363bp，荧光素酶活性变化不大，当从-363bp截短至-186bp，启动子活性又有显著升高，说明在该区域内存在着抑制启动子活性的顺式调控元件。
实施例3
猪Sp100基因5’调控区-283位点定点突变及荧光素酶活性检测
1.根据实施例2中截短实验的结果，利用TESS预测软件分析Sp100基因的5’调控区-363～-186区段，并结合多态性分析发现-283位点C到G改变发生在转录因子SP1的结合位点上。用PCR方法以0.4K-pGL3载体为模板，对-283位点进行定点突变，构建该位点基因为G的突变型载体0.4K-pGL3*。引物序列为
Figure GDA0002851647530000081
方框表示突变碱基。
2.定点突变的方法为重叠延伸PCR法，包括两轮反应，第一轮反应利用Sp100F8/SP100MR和SP100MF/Sp100R1引物对分别以0.4K-pGL3载体为模板，扩增得到两个末端含有点突变且相互重叠的片段，第二轮反应以上述两个反应的PCR产物适当稀释物为模板，Sp100F8/Sp100R1为引物进行PCR扩增，将点突变引入到PCR产物的内部。
第一轮PCR扩增体系为：0.4K-pGL3载体DNA25ng，10×Buffer2.5μL，dNTP mix2μL，上下游引物各10pmol，高保真pfu DNA聚合酶1U，ddH2O补齐至25μL。
第二轮PCR扩增体系为：第一轮反应的两种PCR产物稀释物各1μL，10×Buffer2.5μL，dNTP mix2μL，上下游引物各10pmol，Ex Taq DNA聚合酶1U，ddH2O补齐至25μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。
将第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，连接入pMD-18T载体，再转接pGL3-basic载体，构建的载体质粒经KpnI和XhoI限制性内切酶进行双酶切鉴定后，送华大基因科技服务有限公司测序，鉴定了Sp100基因-283位点的C突变为G，鉴定结果如图4所示。荧光素酶报告系统检测突变对启动子活性的影响，结果如图5所示，突变该位点后，其启动活性显著升高(P<0.05)。说明SP1结合位点是一个重要的顺式调控元件。
实施例4
群体检测-283位点的多态性及标记辅助育种
1.根据克隆得到的猪Sp100基因5’调控区序列设计引物Sp100F10和Sp100R2，通过PCR手段检测Sp100基因-283位点在抗病力存在明显差异的荷包猪和大白猪中的分布情况，引物序列如下：
Figure GDA0002851647530000091
2.PCR扩增体系为：基因组DNA 25ng，10×Buffer2.5μL，dNTP Mixture(2.5mM)2μL，上下游引物各10pmol，高保真pfu DNA聚合酶1U，ddH2O补齐至25μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。
PCR产物直接测序，利用DNAMAN软件比对分析不同个体的测序结果，并通过肉眼分析测序峰图，确定-283位点的等位基因和基因型。发现不同等位基因在两品种猪中的分布存在着极显著的差异，荷包猪以C为优势等位基因，大白猪的优势等位基因为G。
Figure GDA0002851647530000092
Figure GDA0002851647530000101
将-283位点C等位基因的有无作为天然免疫力相关基因标记，其中携带有C等位基因的序列如Seq ID No：1所示，其中第702碱基为多态位点，基因型为C，第985位碱基为翻译起始位点计为+1；将携带该分子标记的猪进行配种繁殖，产下仔猪后，鉴定该标记，从中筛选出一般抗病力强的猪，即可培养抗病优良群体。
序列表
<110>东北农业大学
<120>一种提高猪天然免疫力的分子标记育种方法及其应用
<160> 2
<210> 1
<211> 1012
<212> DNA
<213>猪（Sus scrofa）。
<220>
<223>群体检测-283位点的多态性序列
<400>1
gcacatttat gtcaacaccc agtatggtgg tggcctgatc cacctgctgt acagggacgg 60
agagaagaga gagagtggac actagaaaag gcaggtgtgc tctgtgccag gcttgtctgg 120
atcctgtgcc ccatggagtc aggagcagag ggcagccgtg cccaccagaa cctcagcttg 180
ctaatccttc taccccctga ggggagggag ggagagaggg ctccacagag accttgtgca 240
ctgggtagga tggcctcatc cgtcttctgg aatctgtacc aaccaggctg atgctcgctc 300
tttgggggga aagaacagga gtggagagag gatagaaagc ctgccccaca ttttcaagtg 360
taactggctc agacccctcc tcaaagctgg aggaagtcaa attcagggga gcatcacgtg 420
gaaaccatcg ctgcttcatc agacatctgg acactgggac ctacctcagt tgggtccaag 480
ctctcccatg ggctggagag aagatccgaa gtgtccattt tccccccgcc ccggccatct 540
tggcaaggga aggggcaaag agggactttg cccttgaccc ccatgctctg aaaccccctg 600
agaaggcagg agcctgagga cggctgggat cacacagacg ttggttgttg ctgtctttgc 660
acaaacaggt ggactcccgg ggcccgggtc tgcccctccc ccagtcctcc tccggggtcc 720
tccggggccc tccagtccct gagtgtcact ccttgtcttc catccctggg ggtcacatgt 780
cataacggct agaaggactg tgtagctgca ggaggaggga gggaggacgt ccacagctca 840
ctgagctact ttcacttccc ttttccccac ttgggcggag ccctagagag acttcctgtt 900
cagggttcag gcctcgggcc gcctccctgg acactggagt ggttgcaggc caagctcagg 960
cccaggctgg gctgaggtgg aaagatggct agtggaggcc gt 1012
<210> 2
<211>1919
<212> DNA
<213>猪Sp100启动子序列。
<400>2
ttgtcagagc ttcttgccgc cccagaaaat accccaggca ccccctgatt tccttcagtc 60
actccagcag gggttttcga agttcatcct gcttctttgg ttggtcctgt tcttttccaa 120
atctgagtgg gactgacaat gtttcctgga ccaaagaaac tgcttttttt ttggtctttt 180
tagggccgca cctgcggcat atggaggttc ccaggctagg ggttgaatca gatttgtagc 240
tccaggtcta caccacagcc acagcaatgt ttgatccgag ccgcgtctgt gacctacacc 300
acagctcaag gcaacacggg atccttaacc cactgagcaa ggccaaggat caaacctgca 360
tccttgtgga tcctaatcag attcgcttct gctgagccac gacgggaaca tccagagaaa 420
ctgctttctc cacagaggcc tgggggctac ttcagaaacc accactgctc ccacagagtg 480
tggtgcgtgc cctgctttct ctgactcact ggaaactttc ctccctatgg ccaggagcag 540
ccctgtgtgg gaatatctgc cctgtgggtt tcccacccag ccgctgctag ctggcctctg 600
attccttgga gccccaagca gacaacagaa aagctggcac actggagttc ccactgtggc 660
tcagcagcaa tgaacccaac tagtatccat gaggatgtgc gttcgatccc tggcctcgct 720
ccgtgggtta aggatctggc attgccatga gctgcagtga gtgtgcagac tcggctcgga 780
tcctgcgttg ctgtggctgt ggtgtaggtc agcagctgga gctccaattc gactcctagc 840
ctgggaacct ccatatgcca cgggtgtggc cctaaaaagc agaaaaaaag aaggaaaaga 900
aaagcaggca catttatgtc aacacccagt atggtggtgg cctgatccac ctgctgtaca 960
gggacggaga gaagagagag agtggacact agaaaaggca ggtgtgctct gtgccaggct 1020
tgtctggatc ctgtgcccca tggagtcagg agcagagggc agccgtgccc accagaacct 1080
cagcttgcta atccttctac cccctgaggg gagggaggga gagagggctc cacagagacc 1140
ttgtgcactg ggtaggatgg cctcatccgt cttctggaat ctgtaccaac caggctgatg 1200
ctcgctcttt ggggggaaag aacaggagtg gagagaggat agaaagcctg ccccacattt 1260
tcaagtgtaa ctggctcaga cccctcctca aagctggagg aagtcaaatt caggggagca 1320
tcacgtggaa accatcgctg cttcatcaga catctggaca ctgggaccta cctcagttgg 1380
gtccaagctc tcccatgggc tggagagaag atccgaagtg tccattttcc ccccgccccg 1440
gccatcttgg caagggaagg ggcaaagagg gactttgccc ttgaccccca tgctctgaaa 1500
ccccctgaga aggcaggagc ctgaggacgg ctgggatcac acagacgttg gttgttgctg 1560
tctttgcaca aacaggtgga ctcccggggc ccgggtctgc ccctccccca gtcctcctcc 1620
ggggtcctcc ggggccctcc agtccctgag tgtcactcct tgtcttccat ccctgggggt 1680
cacatgtcat aacggctaga aggactgtgt agctgcagga ggagggaggg aggacgtcca 1740
cagctcactg agctactttc acttcccttt tccccacttg ggcggagccc tagagagact 1800
tcctgttcag ggttcaggcc tcgggccgcc tccctggaca ctggagtggt tgcaggccaa 1860
gctcaggccc aggctgggct gaggtggaaa gatggctagt ggaggccgt 1919

Claims (6)

1. 一种提高猪天然免疫力的Sp100分子标记育种方法，其特征在于：该方法是基于SNP位点开发的，该方法是通过检测猪基因组中Sp100基因调控区-283位点的基因型实现的，所述的-283位点位于Seq ID No：1第702位碱基处，选择出Sp100基因调控区-283位点为C等位基因的猪，即为筛选出的目标，对该目标猪进行育种，即完成所述的提高猪天然免疫力的Sp100分子标记育种；
采用如下所示的引物对进行PCR扩增以用于Sp100基因调控区-283位点的基因分型：
Sp100F10：GCACATTTATGTCAACACC；
Sp100R2：ACGGCCTCCACTAGCCAT。
2.根据权利要求1所述的分子标记育种方法，其特征在于，用于检测猪基因组中Sp100基因调控区-283位点的基因型的方法为PCR产物直接测序法。
3.根据权利要求1所述的分子标记育种方法，其特征在于，所述的提高猪天然免疫力的分子标记育种方法具体步骤如下：
（1）获得待检测猪的基因组DNA；
（2）以上述猪基因组DNA为模板，采用如下引物对进行扩增，获得含有-283位点的Sp100基因的5’调控区片段：
Sp100F10：GCACATTTATGTCAACACC；
Sp100R2：ACGGCCTCCACTAGCCAT；
（3）通过琼脂糖凝胶电泳对上述扩增产物进行检测；
（4）对PCR产物进行测序分析，检测上述Sp100基因的5’调控区片段内-283位点多态性；
（5）选择Sp100基因的5’调控区内-283位点为C等位基因的猪，即为筛选出的目标；
（6）对筛选出的目标猪进行育种，即完成所述的提高猪天然免疫力的Sp100分子标记育种。
4. 根据权利要求3所述的分子标记育种方法，其特征在于：筛选出的-283位点为C等位基因的Sp100基因的5’调控区片段的序列如Seq ID No：1所示。
5.权利要求1所述的分子标记育种方法的应用，其特征在于它用于猪抗病育种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于它用于猪的早期选种。
CN201810258604.4A 2018-03-27 2018-03-27 一种提高猪天然免疫力的Sp100分子标记育种方法及其应用 Active CN108517365B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810258604.4A CN108517365B (zh) 2018-03-27 2018-03-27 一种提高猪天然免疫力的Sp100分子标记育种方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810258604.4A CN108517365B (zh) 2018-03-27 2018-03-27 一种提高猪天然免疫力的Sp100分子标记育种方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108517365A CN108517365A (zh) 2018-09-11
CN108517365B true CN108517365B (zh) 2021-03-19

Family

ID=63432972

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810258604.4A Active CN108517365B (zh) 2018-03-27 2018-03-27 一种提高猪天然免疫力的Sp100分子标记育种方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108517365B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112522424B (zh) * 2020-12-18 2024-02-20 扬州大学 一种利用猪tlr6基因erv插入多态提高仔猪天然免疫力的分子标记及其育种方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000023625A2 (en) * 1998-10-22 2000-04-27 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules which encode scp proteins, and uses thereof
WO2004101816A1 (en) * 2003-05-15 2004-11-25 Human Genetic Signatures Pty Ltd Decoys for nucleic acid-binding proteins
CN101001613A (zh) * 2004-06-28 2007-07-18 生命周期药物公司 作为液体制剂载体的多孔片剂
CN102621313A (zh) * 2011-01-28 2012-08-01 上海科新生物技术股份有限公司 胶体金层析法抗Sp100抗体检测试纸及其制备方法
CN105586389A (zh) * 2014-10-21 2016-05-18 天津华大基因科技有限公司 试剂盒及其在检测遗传性骨病基因中的用途

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000023625A2 (en) * 1998-10-22 2000-04-27 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules which encode scp proteins, and uses thereof
WO2004101816A1 (en) * 2003-05-15 2004-11-25 Human Genetic Signatures Pty Ltd Decoys for nucleic acid-binding proteins
CN101001613A (zh) * 2004-06-28 2007-07-18 生命周期药物公司 作为液体制剂载体的多孔片剂
CN102621313A (zh) * 2011-01-28 2012-08-01 上海科新生物技术股份有限公司 胶体金层析法抗Sp100抗体检测试纸及其制备方法
CN105586389A (zh) * 2014-10-21 2016-05-18 天津华大基因科技有限公司 试剂盒及其在检测遗传性骨病基因中的用途

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A genome-wide association study of fetal response to type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus challenge;Tianfu Yang等;《Scientific RepoRts》;20160205;第6卷;第20305期 *
Mitogen-activated Protein Kinase-mediated Licensing of Interferon Regulatory Factor 3/7 Reinforces the Cell Response to Virus;Sonja Schmid等;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20140103;第289卷(第1期);299–311 *
Molecular characterization of Sp110 gene in pigs;Li-zu Li等;《Mol Genet Genomics》;20160319;第291卷;1431-1442 *
Sus scrofa nuclear antigen Sp-100 isoform 5 (SP100) mRNA, complete cds, alternatively spliced;Zhang,J.等;《GenBank Database》;20130827;GenBank Accession：KF017544.1 *
UCSC Genome Browser on Pig Feb. 2017 (Sscrofa11.1/susScr11) Assembly;UCSC;《UCSC Genome Browser》;20170228;第1-6页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108517365A (zh) 2018-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105518135B (zh) CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA
CN107475412B (zh) 一种与鸡产蛋性状相关的分子标记及其在鸡育种中的应用
CN107267627B (zh) 与猪生产性状相关的Six1基因分子标记的制备与应用
CN108018301B (zh) 确定miR-27a基因的核心启动子及其内转录因子Myod结合位点的方法
CN110643716B (zh) 一种与绵羊尾脂重相关的分子标记及其应用
CN109811063B (zh) 一种与猪生长速度相关的snp分子标记及其应用
WO2019113472A1 (en) Compositions and methods for treating disorders of genomic imprinting
Garcia et al. Significant association of the calpastatin gene with fertility and longevity in dairy cattle.
CN110004144B (zh) 猪小肠上皮细胞表达的pgc启动子及其应用
CN108517365B (zh) 一种提高猪天然免疫力的Sp100分子标记育种方法及其应用
NZ541698A (en) Selecting animals for desired genotypic or potential phenotypic properties based on a single nucleotide polymorphism (snp) in intron 3 of the IGF2 gene
CN110894510A (zh) 一种基因敲除选育Lgr6基因缺失型斑马鱼的方法
CN112980970B (zh) 一种改良猪肌内脂肪含量的pabpn1分子标记育种方法及其应用
CN110747230B (zh) 一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法
Yu et al. Polymorphisms in the 5′ regulatory region of myostatin gene are associated with early growth traits in Yorkshire pigs
Kim et al. Development of polymorphic microsatellite markers suitable for genetic linkage mapping of olive flounder Paralichthys olivaceus
CN113832189B (zh) 一种用于敲除猪免疫球蛋白重链IGHG区的gRNA及其应用
KR102368835B1 (ko) 한우의 육량 관련 hspb1 유전자의 유전형 결정용 프라이머 세트 및 이의 용도
CN104109669B (zh) 猪ampd1基因启动子区域snp作为猪胴体性状的遗传标记及应用
Shah et al. Molecular analysis of callipyge gene mutation (C. 267A> G) in Kajli, Lohi and Thalli sheep breeds of Pakistan
CN108753989B (zh) 一种筛选抗猪圆环病毒病猪的cxcl13分子标记育种方法及其应用
Sihite et al. Polymorphism and association of 5’UTR CAPN1 gene with growth traits in bali cattle by PCR-RFLP
CN109576276B (zh) 猪肉质性状相关基因Prox1的分子克隆及应用
Niu et al. A 12-bp indel in the 3’UTR of porcine CISH gene associated with Landrace piglet diarrhea score
CN110551763A (zh) CRISPR/SlutCas9基因编辑系统及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant