CN111676273A - 一种检测牛成肌细胞hmga2基因增强子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测牛成肌细胞HMGA2基因增强子的方法。根据染色质开放性高通量测序数据分析和序列保守性，并结合双荧光素酶载体报告系统，筛选具备增强子活性的牛HMGA2基因序列片段，根据Hi‑C数据分析确定筛选片段中与HMGA2基因启动子产生远距互作的序列，利用CRISPRi系统和实时荧光定量PCR技术验证序列片段功能。本发明从分子和细胞两个水平鉴定出可以促进牛成肌细胞HMGA2基因表达的增强子，可以用于肉牛的基因编辑和转基因育种，从而加快优良肉牛群体选育进程。

Description

一种检测牛成肌细胞HMGA2基因增强子的方法

技术领域

本发明涉及家畜分子育种领域，具体涉及一种检测牛HMGA2基因增强子的方法与应用。

背景技术

个体发育过程中，细胞增殖和分化是一个高度协同的过程，需要基因表达的精准调控。基因表达模式的改变与染色质结构的动态变化有关，而后者可以影响转录因子与DNA的结合。高迁移率蛋白是一类含量丰富，且包含不同亚家族的染色质非组蛋白，它们可以作为结构转录因子促进转录。HMGA家族包括HMGA1a、HMGA1b、HMGA1c和HMGA2四个成员，其中前三者均是由HMGA1基因经可变剪切产生(Fusco and Fedele,2007)，但HMGA家族成员在N末端均含有三个“AT钩”，可以与富含AT序列的DNA小沟结合，诱导染色质构象改变，进而招募转录复合物。此外，HMGA家族成员还具有酸性C端尾巴，使得HMGA家族又可作为蛋白激酶的底物，这对于蛋白互作具有重要意义。

目前HMGA2基因编辑研究主要涉及HMGA2基因外显子敲除小鼠，这些小鼠表现为侏儒症，并且具有抗肥胖特性。除了HMGA2基因编辑和自然突变鼠，目前兔子的矮小性状也被定位到HMGA2基因，一个涵盖HMGA2启动子和前三个外显子的～12.1kb的缺失导致兔子发生侏儒，比野生型个体体型缩小2/3。在育种方面，利用基因编辑和体细胞核移植技术已经成功构建了HMGA2基因敲除猪(敲除外显子2和绝大部分内含子3)，HMGA2基因杂合子公猪和母猪体重与野生型相比降低20％，纯合子公猪体重下降35％～85％，年龄越大差距越明显。HMGA2基因在正常的肌肉和脂肪原代细胞中的功能包括：HMGA2基因参与调控LIN28B-let7-HMGA2-IGF2BP2信号通路下游关键基因(cmyc、Sp1、IGF1R、UCP1)，还参与HMGA2-PLAG1-IGF2信号通路。目前多项GWAS研究表明HMGA2基因也是影响牛生长发育(体重、肌肉发育和脂肪沉积等)的重要候选基因，同时，HMGA2基因的异常高表达会导致机体过度生长，同时伴有脂肪瘤出现，与过表达HMGA2的转基因小鼠表型一致，说明HMGA2基因过表达会促进机体发育。

增强子是基因表达调控的重要元件，它可以与转录因子结合，并通过与启动子互作来提高基因转录频率，进而促进靶基因表达。利用常规ChiP-seq(H3K27Ac和H3K4me1)可实现活性增强子的鉴定，但是由于增强子对基因的调控作用不具有方向性和距离限制，因此对于增强子靶基因的鉴定比较困难。随着高通量测序技术的发展，利用高通量染色质构象捕获测序(Hi-C)技术可以为确定增强子靶基因提供参考信息，Hi-C适合测试所有的包括特异和非特异性的交互作用，但其分辨率较低，且噪声高。目前针对牛HMGA2基因的转录调控，特别是具有调控作用的增强子还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测牛成肌细胞HMGA2基因增强子的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测牛HMGA2基因增强子的方法，包括以下步骤：

1)根据序列保守性，在牛HMGA2基因选定区域内通过比对提取与其他物种中具有增强子活性的DNA序列同源的序列(即候选增强子)，得到集合I；

2)根据细胞活性实验，从集合I中筛选出具有增强子活性的序列，得到集合II；

3)根据ATAC-seq数据分析，从集合I中筛选出染色质处于开放状态的对应序列，得到集合III；

4)对集合II和集合III取交集，得到集合IV；若集合IV为空集，则返回步骤1)并更换牛HMGA2基因选定区域，若集合IV不为空集，则转至步骤5)；

5)根据Hi-C数据分析，从集合IV中筛选出可以与HMGA2基因启动子产生远距互作的序列，得到以牛HMGA2基因为靶基因的目标增强子；

6)对目标增强子进行细胞功能验证。

优选的，所述步骤1)中，与牛HMGA2基因选定区域进行比对的序列选自人基因组序列，通过选择个体发育时间长于牛的物种(此处指人类)，从而挖掘到更为丰富的具有增强子活性的参考序列。

优选的，所述步骤1)中，牛HMGA2基因选定区域选自牛HMGA2基因第三内含子区等与该基因在个体发育中的转录调控相关区域(例如，上述第三内含子区具有大量转录调控因子结合位点)。

优选的，所述步骤2)中，利用双荧光素酶载体报告系统检测集合I中的序列的增强子活性，包括以下步骤：将待筛选的序列(即候选增强子)克隆至双荧光素酶载体报告系统中的萤火虫荧光载体pGL3-Promoter中，得到pGL3-Promoter-Enh重组载体；将pGL3-Promoter-Enh重组载体、pGL3-Promoter(空载体)分别与海肾荧光pRL-TK载体(内参)共同转染牛成肌细胞。

优选的，所述目标增强子定位于牛基因组chr5：48069675-48070539(UMD3.1.1)。

优选的，所述目标增强子的扩增引物对P1为：

上游引物F1：5′-AAATCGATAAGGATCCCGACTGTGGTTTCAATGACA-3′

下游引物R1：5′-AAGGGCATCGGTCGACAAGGCAAAATACTTTTGTTTACTGA-3′。

优选的，所述步骤6)中，利用CRISPRi技术检测目标增强子对牛成肌细胞HMGA2基因表达的调控作用(利用CRISPRi载体系统转染牛成肌细胞，靶向抑制目标增强子活性，实时荧光定量PCR检测HMGA2基因表达水平)，包括以下步骤：以引物对P2和P3为引物，分别通过双链寡核苷酸退火得到NC对照组双链核酸片段和实验组sgRNA，将NC对照组双链核酸片段和实验组sgRNA分别克隆至pX330a dCas9-KRAB载体，得到pX330a dCas9-KRAB-NC重组载体(阴性对照)和pX330a dCas9-KRAB-sgRNA重组载体(用于抑制增强子活性)，将这两个重组载体分别转染牛成肌细胞，然后以引物对P4和P5为引物，通过实时荧光定量PCR(qPCR定量)分别扩增牛GAPDH基因(内参)和HMGA2基因，并根据2^-ΔΔCt表征NC对照组和实验组中牛成肌细胞HMGA2基因的表达情况。

优选的，所述引物对P2(NC对照组)为：

上游引物F2：5′-CACCGATCGTTTCCGCTTAACGGCG-3′

下游引物R2：5′-AAACCGCCGTTAAGCGGAAACGATC-3′；

所述引物对P3(sgRNA实验组)为：

上游引物F3：5′-CACCGACACATTCTTCCAGGCTGAC-3′

下游引物R3：5′-AAACGTCAGCCTGGAAGAATGTGTC-3′；

所述引物对P4(GAPDH基因)为：

上游引物F4：5′-TGAGGACCAGGTTGTCTCCTGCG-3′

下游引物R4：5′-CACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′；

所述引物对P5(HMGA2基因)为：

上游引物F5：5′-TCCACTTCAGCCCAGGGACAAC-3′

下游引物R5：5′-TGGGTCTTCCCCTTGGTCTCTT-3′。

优选的，所述牛成肌细胞中，当转染pX330a dCas9-KRAB-sgRNA的实验组的HMGA2基因表达量显著低于转染pX330a dCas9-KRAB-NC的阴性对照组，即验证了目标增强子具有促进牛成肌细胞HMGA2基因表达的功能。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据序列保守性获得候选增强子，对候选增强子利用染色质开放性高通量测序(ATAC-seq)数据分析和双荧光素酶载体报告系统分别进行筛选，从而可以有效利用牛肌肉组织Hi-C测序数据分析，鉴定得到可以促进牛成肌细胞HMGA2基因表达的增强子。

进一步的，本发明发现了定位于牛HMGA2基因内含子内的增强子(牛基因组chr5：48069675-48070539(UMD3.1.1))，有利于提高肉牛的基因编辑和转基因育种效率(例如，无需对基因序列进行切割和修复)，并方便筛选与肉牛个体优势性状(例如，体格大、产肉量高)相关的基因组突变(即分子遗传标记)，从而加快优良肉牛群体选育进程。

进一步的，本发明采用的成肌细胞是从牛背最长肌组织分离而来的一类牛机体自身存在的具有增殖分化潜能的细胞，利用其进行功能验证，能准确反映机体状态，并且在成肌细胞中验证具有活性的增强子在背最长肌等肉牛肌肉组织中也同样具有活性。

附图说明

图1为本发明实施例中分离培养的牛成肌细胞显微照片。

图2为本发明实施例中候选增强子的分子水平筛选示意图。

图3为本发明实施例中目标增强子在牛成肌细胞中的活性鉴定结果。

图4为本发明实施例中目标增强子对牛成肌细胞HMGA2基因表达的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

本发明利用序列保守性以及双荧光素酶载体报告系统，并结合染色质开放性高通量测序(ATAC-seq)数据分析，预测及筛选具备增强子活性的牛HMGA2基因序列片段，根据Hi-C数据分析确定筛选的序列片段中与HMGA2基因启动子产生远距互作的序列片段，通过CRISPRi系统和实时荧光定量PCR技术对其进行功能验证，证实相应序列片段具备促进牛成肌细胞HMGA2基因表达的能力，从而形成了一种有效的筛选牛HMGA2基因增强子的方法。

(一)牛成肌细胞制备

1.1材料采集

妊娠90天左右的胎牛于2019年1月采集于西安伊鸣清真屠宰场。

1.2牛成肌细胞分离培养

1)将整个胎牛用清水冲洗干净后用PBS冲洗3次，再用75％酒精冲洗3次；

2)将胎牛置于含0.1％双抗的PBS中，尽可能多地收集背最长肌组织，置于细胞培养皿中，用剪刀剪碎；

3)将剪碎后的样品置于50mL离心管中，加入2倍体积的胶原酶Ⅱ(预配2mg/μL)，37℃水浴恒温摇床消化2h左右，直至没有明显组织块；

4)将消化好的样品吸取到50mL注射器中，用200目滤网过滤，收集滤液至新的50mL离心管，1200r/min离心10min，去掉上清，用含0.1％双抗的PBS重悬沉淀细胞，1200r/min离心10min，去掉上清；加入10mL含20％胎牛血清(FBS)和0.1％双抗(终浓度)的DMEM培养基，重悬后分配于5～10个70mm细胞培养皿中；

5)将各细胞培养皿置于细胞培养箱(5％CO₂、37℃)中过夜培养，至细胞融合度达70％左右时(图1)，用含0.25％胰酶的PBS消化细胞，传代培养。所得牛成肌细胞用于后续载体转染。

(二)鉴定候选增强子在牛成肌细胞中的活性

2.1候选增强子

根据人基因组上的潜在增强子序列(通过ChiP-seq分析确定)，利用序列保守性并通过比对，共预测出牛HMGA2基因第3内含子区内的20个候选增强子(表1)。

表1.候选增强子位置信息

2.2增强子PCR扩增

分离胎牛背最长肌，参考文献Sambrock et al(2002)方法进行基因组DNA的分离、提取、纯化。

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛HMGA2基因序列(GenBank AC_000162.1)为参考序列，利用Primer 5.0设计PCR克隆引物，扩增表1中的候选增强子。将所得候选增强子PCR扩增产物用于构建pGL3-Promoter-Enh重组载体。

表2.PCR克隆引物信息(表1中的第20个候选增强子)

其中，PCR扩增体系以100μL计为：50ng/μL模板DNA 4μL，10pmol/L的上、下游引物(例如，表2中的引物对P1)各1.5μL，2×Max 50μL，以及去离子水43μL。

PCR扩增的反应程序为：(1)98℃2min；(2)98℃10s，55℃15s，72℃20s，36个循环；(3)72℃5min。扩增产物经测序验证。

2.3重组载体pGL3-Promoter-Enh构建

候选增强子的PCR扩增产物通过SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行纯化，纯化产物进行双酶切(例如，表1中第20个候选增强子的扩增产物采用BamH I和SalⅠ进行酶切)，酶切产物通过SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行纯化，得到产物S1，备用。pGL3-Promoter空载体(Promega)通过酶切进行线性化，酶切产物通过SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收线性化载体，得到产物S2，备用。通过T4DNA连接酶将产物S1和产物S2进行DNA连接。连接产物转化感受态细胞DH5α(天根生化科技有限公司)后，氨苄抗性筛选后，利用Sanger测序确认阳性单克隆，利用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取得到pGL3-Promoter-Enh重组载体，用于转染牛成肌细胞，鉴定候选增强子活性。

其中，酶切体系以100μL计为：50ng/μL PCR产物或pGL3-Promoter载体20μL，酶切Buffer 10μL，每种内切酶(例如，BamH I和Sal I)4μL，及去离子水62μL。

其中，连接体系以10μL计为：50ng/μL线性化载体1μL，50ng/μL目的片段1μL，10×T4ligase buffer 1μL，T4连接酶0.5μL，及去离子水6.5μL。

其中，双酶切程序为：30℃10min，37℃20min。

其中，连接程序为：16℃过夜连接。

2.4重组载体的细胞转染

参照转染试剂TurboFect(Thermo Scientific^TM)操作说明，将pGL3-Promoter-Enh重组载体和pRL-TK内参载体(Promega)，以及pGL3-Promoter空载体和pRL-TK内参载体分别转染牛成肌细胞，用于检测候选增强子活性。

2.5增强子活性鉴定

操作流程按照

Reporter Assay System(Promega)说明书进行：依据转染增强子的相对荧光活性(转染pGL3-Promoter-Enh重组载体和pRL-TK内参载体后，萤火虫荧光除以内参pRL-TK海肾荧光的比值R1)与未转染增强子的相对荧光活性(转染pGL3-Promoter空载体和pRL-TK内参载体后，萤火虫荧光除以内参pRL-TK海肾荧光的比值R2)的大小差异进行判定：如果比值R1显著高于比值R2，则说明候选区域具备增强子活性。

参见图2及图3，结果表明：在表1所示的20个候选增强子中，发现有5个候选增强子(第1、8、9、16和第20个)在牛成肌细胞中具有活性，但ATAC-seq数据显示第4、5、7和第20个候选增强子所在的染色质处于开放状态，也就是说在牛成肌细胞中具有活性的5个候选增强子中只有一个候选增强子(第20个)所在的染色质处于开放状态。而Hi-C数据分析(预先完成了对胎牛和成年牛牛肌肉组织Hi-C测序和数据分析工作)显示其中3个候选增强子(第8、9和第20个候选增强子)可以与HMGA2基因启动子产生远距互作。因此选择表1中的第20个候选增强子为目标增强子。

(三)目标增强子对HMGA2基因的表达调控

3.1重组载体pX330a dCas9-KRAB构建

以双链寡核苷酸引物对P2和P3为引物(表3)，通过退火，得到双链寡核苷酸S3(NC对照组和sgRNA实验组)。pX330a dCas9-KRAB载体通过Bbs I进行酶切线性化，酶切产物利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收线性化载体，得到产物S4，备用。利用T4DNA连接酶将产物S3和产物S4进行连接。连接产物转化DH5α，经氨苄抗性筛选，利用Sanger测序确认阳性单克隆，利用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取得到pX330a dCas9-KRAB-NC和pX330a dCas9-KRAB-sgRNA重组载体(统称为pX330a dCas9-KRAB重组载体)。

表3.双链寡核苷酸引物信息

其中，双链寡核苷酸退火合成体系以10μL上计为：100μmol/L的引物对P2或P3所对应的上、下游引物各1μL，以及去离子水8μL；双链寡核苷酸退火合成程序为：95℃5min，室温下缓慢降温。

其中，酶切体系以100μL计为：50ng/μL pX330a dCas9-KRAB载体40μL，酶切Buffer10μL，Bbs I内切酶1μL，及去离子水49μL；酶切程序程序为：95℃3h。

其中，连接体系以10μL计为：50ng/μL线性化载体1μL，双链寡核苷酸1μL，10×T4Ligase buffer 1μL，T4连接酶0.5μL，及去离子水6.5μL；连接接程序为：16℃过夜连接。

3.2重组载体的细胞转染

参照转染试剂TurboFect(Thermo Scientific^TM)操作说明，将pX330a dCas9-KRAB-NC和pX330a dCas9-KRAB-sgRNA分别转染牛成肌细胞，用于抑制目标增强子活性的实验。

3.3RNA的分离、提取、纯化和反转录

对pX330a dCas9-KRAB重组载体处理的牛成肌细胞，通过TRIzol(Takara)法提取总RNA，利用Takara的去基因组反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNAEraser)将提取的RNA反转录成cDNA，用于牛HMGA2基因表达鉴定。

3.4牛HMGA2基因表达鉴定

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛HMGA2基因序列(GenBank AC_000162.1)为参考序列，利用Primer 5.0设计实时荧光定量PCR引物(表4)，扩增HMGA2基因序列。

其中，实时荧光定量PCR所用的扩增体系以20μL计为：10ng/μL模板cDNA 2μL，10pmol/L的引物对P4或引物对P5所对应的上、下游引物各1μL，2×SYBR Green qPCR Mix10μL，以及去离子水6μL。

实时荧光定量PCR所用的反应程序为：(1)95℃30s；(2)95℃10s，60℃30s，39个循环。

表4.实时荧光定量PCR的引物信息

依据2^-ΔΔCt检测成肌细胞HMGA2基因表达量。实验结果表明：转染pX330a dCas9-KRAB-sgRNA(实验干扰载体)的实验组HMGA2基因表达量显著低于转染pX330a dCas9-KRAB-NC的阴性对照组(图4)，HMGA2表达显著下降，说明抑制了目标增强子活性。以上结果表明目标增强子可以促进HMGA2基因表达。

(四)目标增强子在肉牛的基因编辑和转基因育种中的应用

本发明鉴定出的目标增强子(即表1中第20个，具体序列参见SEQ.ID.NO.1)可以促进HMGA2基因表达，该增强子在背最长肌组织中具有活性。由于HMGA2基因是影响哺乳动物重要经济形状的关键基因，所鉴定的目标增强子(具体序列参见SEQ.ID.NO.1)为肉牛基因编辑和转基因育种提供靶位点，通过基因编辑技术(如通过CRISPRa技术)靶向该增强子进而促进HMGA2基因表达，从而促进肌肉发育，以提高产肉量；或通过筛选影响该增强子活性的重要突变进而用于肉牛标记辅助选择。

<110>西北农林科技大学

<120>一种检测牛成肌细胞HMGA2基因增强子的方法

<160>30

<210>1

<211>865

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48069675-48070539（UMD3.1.1）

<400>1

tgggttggaa aaatcccctg gagaagggaa aggctaccca ctccagtatt ctggagaatt 60

acatggacac agaagcctgg cagtctacag tctatagggt tgcaaagagt tggacatgac 120

tgagtgactg acactctatg ctatctgtgc ctataaggaa actttgatgt ttggttttga 180

ctctgaaggg ttgatggcat ttttgagaat ggcatgaaag tacatataga gattggaagg 240

cacataatgt gtttggggaa cagaaaatca cctgactggc tcaactgtga ggattaccca 300

ctggggaata ggagctcaca ttggaaagag ctgggatcag ctcttgtgga ggcttccagt 360

ggctgggcca tgagaggtgg ttgagtagag gagtgctgtg gtcagaggtc gttaggtgcc 420

caatgttctg gggaatgggt taacaggagg gtggttagag ggaaggagaa ttcttgaaag 480

gctatgggta ggccaggtag caaaagataa gcaactgagc tgatattctg gcagaggaaa 540

cagagaacag aagtatgtta gtaaaactgt gaaatcattg gctgaatcct tctctgtcac 600

agattgtact ctgggagggg aggaagaaaa acacatgaag gaagttttaa gctggatggt 660

gatctggggt tagaaaatgg gttcactgaa caccagagaa aatgggggtg gaggggaagt 720

acatttgttt gcctgggatg tggtggcaat ggaagaggaa aaaaatgtag cctgaagtga 780

tgagtgaatt agccagggag gcagcagcct agaggctggg gatgcttccc aatttctccc 840

aaagctcact gatgcagaag ccaga 865

<210>2

<211>36

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

aaatcgataa ggatcccgac tgtggtttca atgaca 36

<210>3

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<212>DNA

<213>人工合成

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aagggcatcg gtcgacaagg caaaatactt ttgtttactg a 41

<210>4

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<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

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<212>DNA

<213>人工合成

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<212>DNA

<213>人工合成

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<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

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aaacgtcagc ctggaagaat gtgtc 25

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<213>人工合成

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<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

caccaccctg ttgctgtagc ca 22

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

tccacttcag cccagggaca ac 22

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

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tgggtcttcc ccttggtctc tt 22

<210>12

<211>721

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48168035-48168755（UMD3.1.1）

<400>12

aagaaaaggg gtctaatttt tctacccaga gaaagagcaa gaaagaaatt ttttatttta 60

aaaatatctg taaatgtgta aagctgtcaa aagcttcctt tccagtttga tattttccct 120

atttagaaat ttggaagcaa atgagggggg ccttccttct gatctttttt tggggggcac 180

agagtgaggt cagtaaaatg tagaacacca agagtctcaa aacatgtacc cccatcagct 240

atttttcatt ctgaatgctt tcaaatgtca caatattata catagtttat caattttgca 300

ttaagctaaa actcattaat cccgtaagag gtctttttat gattcatgag aagccgtgct 360

gtaaaccagt gcagccatct tcttagactt acattccctc acgactgcct cagctttctc 420

catggatttt aactggggag tcagatgcta tggtggtgtt ctcaaatttg gatattccta 480

tttgagaacc agggagagac aggaaaagta gctaaattta ttgagcgctc acgatgtgcc 540

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ttggaggcca gaaacgatta catgattcaa tggctaaggt cacagacagc catgggagaa 720

a 721

<210>13

<211>491

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48159921-48160411（UMD3.1.1）

<400>13

tgtccctgaa ctaaacttat aaacttagca agattttcta cattttgtta tctttgcagg 60

tatttttctg acatctgctt ctaagtctac tctctatttt gtaatctcac tgaatgtagt 120

ggtggagcta atgtcactta tatttatgtc tctaagtatt ggatccaaga gattaatagc 180

agcggtaatt cctctgagta ctataattaa tggcataaac tgtggaaata cttgggaaaa 240

aaaagcttcc aattacacag ttttaagaaa tcatctttgg ggaatgacct aagttgccca 300

gccataggca ttttaaattt tattcaacaa atatgtatta agcaactact gtatacccct 360

gtcctgggtt ttaaagaaaa tgcaaaacac gtggtagctc ttctcaaaga gtataaaact 420

gctaaacaga gatgggaact attcaaaaag tctcagtaca aaggaaaatg gatcatgctt 480

taagcaaggc a 491

<210>14

<211>1207

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48153701-48154907（UMD3.1.1）

<400>14

ttttctccat attcaaggta aagggggctt tgggcccaat tgatgcaaca ttgcctccgt 60

cctccctttc ctgtttcaca ttctgacaca gccaagcctg gaacgtaatc tgacacctcc 120

ctgatgctag tggactgctt ccaggatgat aatttagttt tcattcttca tgtgctctgt 180

aaaaccacct actgctagaa aggctctttg acgtgttctt cactctaaga acaaatgaaa 240

atggcatttt gaaaaaaaaa aaaaacgaag ccagaacaaa gaagtcagaa acatgatact 300

gagaggtcag gcacttatct gcactgcaag tgcctcaaag aacttagcaa tttaaccact 360

agtttcctcc tgagacttga ctgtcacaag agatccttac atttccaatg gcattcaaca 420

gaattctctc ccctttcagt gaggccagcg gcagaaggtt actggatatt tgttctttct 480

cagactcaga gattcctttg tgagcaatgt tggacggaga aagagctcga aagcgagtgg 540

acataggaag acaaaaggga caggactaca ggtacctgtg acacttgttt ccattttgag 600

ctgtggccgg tggcagagta gaaggccagt ctttcatgga tgtagcaaca tggcgcccaa 660

gtccctcatt ccagctcttg gtaaacactg ctatagagta acaagggacc tcagggaaca 720

tataagaaag agatactgca ttctcaacct ccaggtggtt ccagtcttct tcaggtgaca 780

agttttacgt atgttaactc cagtcttgtc ctcacttcct ccaaaactcc gcccaaaatt 840

ctcctgcagg cagccttact gaccaattac tcatgcctca actctgtgtt ccctacaaga 900

ctcatatcct ccccttttac acaactggaa cttggcagaa gtgttctttg gttaattcct 960

gtgtgctcag gccaactgat ttgtcagtat cacgaggata gggttttggt cttctctttc 1020

ctttgtgtct gctcacagta attagctctg tagcttaagc ataataaaca ctcactggcc 1080

agccaattcc aactcctcct gctcagatac cattccaagt gttctgagtc ctggctctcc 1140

ccagaagaat aagttcctag aggttcctct tcctgagaag atctcaaggt tttcatgcta 1200

cctttgt 1207

<210>15

<211>468

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48138492-48138959（UMD3.1.1）

<400>15

tgtgtcaaaa tggaaggatg ggagttaact tgagagtggt gcacatttct ctgtaccacc 60

acatggatta gctttatatg ggacaacttt ggaggtaaca aattggaggt tgggcagcga 120

tctattttca tcttacccat cttcttctct gagaaacccg ttcctagtct gcacaccacg 180

gcttttcaac tgtgatctat gacaaggacg ggtaagtctt gtgttaaggt gaatttcaga 240

ggtggggagt ttatcagctg agccatctta cctgcattcc ttgcaaacga tttgagccct 300

ggaagccagg cctagctttg ggcttctcca gcagagagca gtgaaacact gtcaataaac 360

ttaattctgg aagccagagt agcttctgag ctaagagaaa aggcagaagc agaactggca 420

ggctcatcag cattgtaagg aatgggagga tctgggcttg tagatttt 468

<210>16

<211>611

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48137319-48137929（UMD3.1.1）

<400>16

caagtaattt atcttctctg attatacatt ttattatctt taatacaaag ggactgtgtt 60

aaggattttt aatttcttat ctagcttaaa aatcatgtat ttgtttaatg aaagactatt 120

aacactgtca acggcagttt ttattttaac ctttaaatac aaaggctgca cagcacaaaa 180

atagatcatg ttgccataac ctcctagaga aatatttttg caaaaatttc cttgctcttc 240

ttggaagaaa aacatatcat gccagcaggc tctgtgataa gatgccagtg atacaggata 300

gaagatagtt gttttatttg tttactctga atgagcaagg ctctgaaagc gctagtatct 360

tccccatgga aaatgtgttt gcctctaata ttatctctcg tgatcgtgat cgggagtcag 420

tgtcaaaggt ttgtgaatgg atttcagaat gtgcaagtgg cacctcccat cgttagctgt 480

ctacattttt ttataaccac ttgcatactt ttggtcaacc actgtaaaat aaacagtcct 540

tcccaaatgt ttttgttttc tttgacagca cagcaataat tcacttggaa tgctgtagaa 600

tagaagagca c 611

<210>17

<211>550

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48132154-48132703（UMD3.1.1）

<400>17

cctctgctgg caggaggatt ctctaccact gagccacctg ggaagcccag agtgtactgt 60

aaggtgcatg aatgcttctg ctgcctcaaa gaaaactttg ttccaacatg ttatttattc 120

ccagggactg tgcacattcc agatgacatc accagggctg ctagtgcaca agaaaataag 180

caaatgagac acacattggc tcatgtggca aatcaccggg tttgccaaat ggaaaagaac 240

aaaaacgggg agggaaaaca ttttgttttc aatctacaag gatattaata aaactcaaac 300

ccagcattct gtggctacat ttcccaggaa gaggagtctt ttctggccaa aagaacataa 360

caacaaactt ttgtatctga gaaatatgta tctcaagatg tcatttaaaa acccactatt 420

taccatgagt aggaccaaaa acatgtttct ttgaaacttg gacaccaaga aaaaaaatga 480

gggcaaattc tacctataat aatctgcagt tcagagtaaa tcaattcaat gagtgtaatt 540

tgatgcatta 550

<210>18

<211>881

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48125922-48126802（UMD3.1.1）

<400>18

tgaggttctg aagtgccctg tcctggcaga tctcatggtg agagtaaatg cctgggctct 60

caggcttaac cacacagggc gggaagagat ggtggatggg gctatgaaga gaatgcagcc 120

cttaaaggtc ctcctgtact aacagcaatt agaaagtgaa gctgtaattt cagccctcct 180

tccttcacat tggaccttgt ctctccgtct ccaggaaatg ggggccaagt tagtggggca 240

tgactataat agggatctgt gactacagcg gggtagccat cagtataaat ctgtcataga 300

cacactcgca gaggaagagg gacttccata cactgcagcc ttcacacttt ttgatgcaga 360

tacagattta tggcacacgg gaagcagaaa gcctttgagc caaaggggcc ctgtgaatca 420

aggccatttt gtaggtttcc gccgcctgaa aaagctacac atttataatt gtgcttggag 480

tcagccccct tccagcccca ggaggcagca gcatttggtt gaaataaaac ggaggacttt 540

tcccaacagc tggccagctc cagttttaag ttttaacaac aggatgaatg aattgaggac 600

agctgaaggg atcaaaaagc attatgccag accttttttt tttccttaaa gacccttccc 660

caccacaacc cccctgccct gactacgctg ttcccatgta tcagattcat tcagagatga 720

tgaactctac tttgaagagt tccctcccat tgttcagctg acacagatga ctctttcacc 780

aacatactca gaaatgatcc agcggagacc ttcaggaaat gtcttaaaaa aaaaaaaaag 840

tttccggcaa gaaaaagagg gggaaaaaaa aaaaagagag a 881

<210>19

<211>997

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48122199-48123195（UMD3.1.1）

<400>19

ctcattcatc acaaatccca ggacttaaat gccagcacgt aagaaagatc tctaaaccgt 60

attcttcatg cagtgttcct ccaatgtttt atcaattagg aaaacacaga cctccccgca 120

ggctacgggg ctactgcaga tcagtttata gaaccatctt acatccaaca aagacctgta 180

gctggccact gactggtgag caacggcgaa ggtcagaaga tctgcttctg gaaatggccc 240

tgctgcacac agacagaaat gtacattcat aaaaagaaag gaaaggaaaa gaccgagagg 300

aaggaggaaa aaaagagaaa gagaacgagg gagaaagcag tacacctccg acaagagcgg 360

ctttgtgacc cctctggtaa tgttacccag ttttgtttat catgaaaaga tcccattaat 420

gcctcagccc catcaaacag cagatcaagt ccatgaatgg cacctatcag agcccagggt 480

aaatccaatg attagaggga attcgccaaa gggcctttgt agctgagaaa aatgcctact 540

ccagggagga atgcagaaaa ttcctgggag tacaggcctt cctttgttgg cagtctggcg 600

gtattctgga gcaaataaaa ggacaaaaat gggaccttag atgcaatgaa catttgaaga 660

aaatgttttt caaagacttc cttgaaacat tcctttaaaa aaaaaaacac cctcaaacta 720

tcactctgat aaagatgaac tacagaactt cttcccaaac caccaattta taggattgca 780

taaccttgga gattctcaac aggaatagtg ttttcgttag atctcctttg tcctgctgag 840

tttcctggtt aaacagtaag tcccagttaa aacttgacag ataagaaaac acacacattc 900

cctcactccc cctcaaattg actgacagaa tccactgaga tttagcataa cataaaagca 960

ctgggcaagg aaagaggaga acacagaata ctgaatc 997

<210>20

<211>268

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48116264-48116531（UMD3.1.1）

<400>20

ctgttccatg ctctcattcc tgggaggctg ttttctcatg ctgtgctatc taaggcagaa 60

aatggatctg gtcatccaga agtcacttgg ttttatcctc tcacttgtcg aaaagcattt 120

ccccaggctc tgtgggtgtt caggaatggt gtaagaaaga atatactttg tatttgtttt 180

gtgttatttc tgagggcctc agggtaaaaa ccttttcaga aaagatagag aatttttgta 240

tcaggaagac ccgaactcaa atcccatc 268

<210>21

<211>671

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48114953-48115623（UMD3.1.1）

<400>21

tgcaaattac ccgacacatt caagatatta taattactac tcatgataat cacaatggga 60

tatgtttggt tttgttattt actcttcctg gcaaatctaa caccacctcc ctcaagtgaa 120

acatgttccc ttttcttcta ccaggaaatc aagcagttat tgtgaatgtc agtttgtcag 180

cgtgcgtttt gtctcactcc agccatagaa atgaatgtta tctgttttct gctaattatg 240

cacagaagtc cgcatcgcac caatctagca gccagaggat gtggctgaac tttgggttca 300

gaaaattctg tgatttaatc cctagtcatt ttcaaggtga agaagcactg tgctcggaac 360

acaaacagcc tctcttggcc caccgatgca gtgtttgaca gggctgtcag aaacattttg 420

ctaacatttg acctatataa atattcactg tgacacttcg aacctgttct attagctcct 480

ttttacaggg actgctccga ccccccccca cccccacccc atgtctcaat ctgctcctgt 540

gaccgtaggc tttccaactt tcaccagaaa gaatcctttc ccacccacac agattacttt 600

tctgtgttct tcagtatttc tccaaagttt ccgaatagac tgtaatttat atcgcctcca 660

actgatgact t 671

<210>22

<211>673

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48112573-48113245（UMD3.1.1）

<400>22

gggacgacag aggatgagat ggctggatgg catcactgac ttgatggacg tgagtccgag 60

tgaactctgg gagttggtga tggacaggga ggcctggcgt gctgcgattc acggggtcgc 120

aaagagttgg acacgactga gcgactaatc tgatctaatc tgaggggaag caaaaaccac 180

gtaccactga ggcttctgct tagcttttcc ctcttaaagc catggagccc acagagaaac 240

acaaagatgt acttaaacac ttattaatga atattgctgg gctactgaat ccatttctgt 300

agatatcacc cttcaagggc tctcgtgtaa aatggcaaca catctgtatg cctacaagat 360

gctggcgcac aggcactgac cccccgcagt gacccctccc agtccccctc acctctctca 420

caagacttcc agagaacctc cccctccggc cattgttcca tgtgacctca tggcaacttc 480

ccgacaagag tttagctgta ggctgatgtc taaaagttca ggcactataa aaactggttt 540

attggatgca aaagagaatt aggacttcaa agactcttac tctgtcaaat taaattaaca 600

tatggaacag caactaagct atgattggta ttcatagcat cagctcttta gtaaggctct 660

ggctggctct taa 673

<210>23

<211>659

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48107090-48107748（UMD3.1.1）

<400>23

actattaact ttaacccatc tcttcttttt ttgttctagt gaaagtgttt cttctacaca 60

ttcaacatcc aagacaatat gcatacagca atctcacatc ctgagcttcc caggtcgtgc 120

tagtggtaaa gaacccacct gccaacgcag gggcataaga gacatgggtt cgatctctgg 180

gttgggaaga tcccctgaag gaggaaaatg gcagtccact ccagtattct tgcctgaaaa 240

atcccataga cagagaaatc tggtaagcta cagtccatgc agttgcagag attaggacag 300

gactgaagtg acttagcaca catgcacaca gtctcacata ttaggaccaa atggtcccac 360

agggctgacc acaggacacc agagaggcca gtcagggagt cagtgaagat gtgaatgtaa 420

caggaagggc agagtgctct actggcatat ctgggtgggt acatgttcct gccacgtggt 480

gtagtctaac atcttggtcc tgtaagcaga atataaaatt atatgcaatg gatttatgaa 540

tatggggttt atgtttccat aaccctgccc atggatgttc tactcctaaa ttcatgtcta 600

tgtaggcaaa atagagacat gacatcaggc ttgaagcatg gtgatttggt taagttagg 659

<210>24

<211>351

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48105184-48105534（UMD3.1.1）

<400>24

atgaaaattc aaatgaccca gcgctcatta ggaggttcag cattaggcat aagatgtgct 60

ggtggaactg accatgctac agagaaagag acaacttaga gcctctcacc cagccctgct 120

tcctgtgtcc taatctcact gtcatcacac agctttcctt ggagctctgc caagcagtgt 180

gccaacagag aagctgctct gcggagcaga cgatgtggac agtaactact cagtcacctg 240

cttccgggaa aggctgaaag catattaagg tttttagaag cctgatcctc ccaacagcca 300

gccccattat taagctctcc tttcatctaa aactgacttt agagtcaagt g 351

<210>25

<211>728

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48096467-48097194（UMD3.1.1）

<400>25

aagttacata cagatgccat tcccaagact atttctagac tctccagcct tctgatattt 60

gtcaacactt tcatcttgat ctccaccaaa aggcaaattt tatttctttt tttttttaag 120

tttgagaaaa atatatgcag atatttttga atgacaagaa aaccacattt ttgatgcttt 180

caaacccact ttctcattca gatccttgct gcacacaaat tggtagaaaa ttaaaaagct 240

gatgttttcc aggtgttggg attctttaaa ggagatcttg tggactaact acagaggcat 300

ttcccaggtt caaaattaat taaccacctc caccgaattt tctcaccagc ccctgcttat 360

gtttcccacg tgtacactcc acctcaacat gcctgagctc tctttgtaag tcttcctatc 420

acagacttac atggacactt catttccctc cagaacaaca cagtctttaa aattcatctg 480

caaatgctta gagttattct tatggaaaca gaacaaaaat tggaatgagg gaggagagaa 540

gcatatttca aatcctttag gcaggtgtgt ccccattttt ctaagattca gaaggaagct 600

tgtatggtgg gctcggaagg tcatttcaca agcaatgtac attcttttag aggaagaagt 660

tggagtaaat ggtttagaaa atccaagtta aaaagtcaac tgtgaatgga gaaggggtgt 720

tttagttt 728

<210>26

<211>375

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48091305-48091679（UMD3.1.1）

<400>26

gcttttaggg gtggagttca cacgttttca aaaatcagtg gcatccctaa taaatacagt 60

gatgtggtgg aaattctgat tgtcttgggt ctgtgtccct gagagcagac gctttcattt 120

attttgctct aagcaggtgt gtaatgagaa gagaggcagt gttgataaga gaaccctggg 180

agctggtaat atattatcct ctgtaatttc ttcccaaaat agacttaatg gaaagaggat 240

gcataatata accgtttctc aaggaagcgt tccccaatac aacagaagca gtcattctaa 300

aaacagcttt atggctcttc agtcaatagc tctattttct cccctttcac aacttccttc 360

cttctgctat gtaag 375

<210>27

<211>1051

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48087842-48088892（UMD3.1.1）

<400>27

taacccataa aagtgaaaca cgttatgcct tttcctggtg aattattcca gtctcatgtt 60

ttcaaattaa ctaagatgct gttttattta aaatggagga cttcgatgct attttaattt 120

tccaaagtca gcacataata ccaatttccc tgaaggtcaa aaacaatata ttaaggaaat 180

accacctgct acttagagct tccataggaa atttgcattt ccactttgta atgtattatt 240

taggggagga aatgacaacc tacttcatgg tctcccaggc ggttcatggt ctcccaaagc 300

acagtctccc atccctgcaa agcggcagac aaaaaggaac aagtccagtg tcccttttcc 360

cactgactct ctatggaaat taaaaattca gtaggcgaaa gcaaaaagca tgtgttgaaa 420

gatgtcaggc ccacccaaac tctctcttct gtttctatta aagccaggct tgctttgcca 480

gcccacttga atgaggctag ttctgcagag ggggagggga tgggccctgg gcacattttt 540

cagtcttctg taaacaattc ttgaaggaat aaggtggtgg tcatggctgt gccctttaaa 600

tggcctctga gagtgagagg gagcacatgg agaaggtctt ttcaaagtgc aacagacctt 660

ttctaccgtg ttatttacaa gccaaacaag gttgaagata gattacttcc tactgtccag 720

ctcagagaga aaaagcattt tgcttaggta catgatatgc attacagaac aaagacactg 780

cagaaagtat ctccccttaa tttattggtc acactgtgag gcatatagga acctagttcc 840

ccgaccaggg atcgaacctt cgtcccctgc actggaagca ccgagtccta accactggac 900

cgccagggaa gtctcaaaag catctccact taaaagcatt caaatatatt gaggtgtcca 960

atatatttta ctctgaaagt acttcataac ttttcagctt ttcttgaggt tatcatttct 1020

ttcctcttcc ttctcattct tttgtatctt t 1051

<210>28

<211>1039

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48081083-48082121（UMD3.1.1）

<400>28

ctgtgacttg gtagcaattt aaacctcaat ttcctaactt gtctaatgtg gatacctcca 60

ctgggttgct gcggtgatta aaactgatta acgtctctaa aatgcatggc acaattgctg 120

gctgtaaaaa cttcataaac attatttaat agcactaggc gggtaagggt gcagtagtag 180

taatagtaac agcaaaggca gcagcagtag cagccctcct ggctgtgttt tgaattgttc 240

aacatcaaag aactgggttt cactctggtg aatgattacc ggattctctg cgatataaat 300

ttaaaacccc tcatctctga tttgccaatg tgtcacttct gtggccttca agattccggt 360

ttcagcggca caggagtatg catggcaacc agaataggat tttttatgtg ctttgttcac 420

cgaacttgca caggacaatg gcaatttcct ttgtattgtg tgatgcaaag ttcattggca 480

tacattttac aaagatgtta tctagcccga tttccttcgt tcagctctct cctggctatt 540

taaagcactt gatttgtgga tagagatgtc ctcccccgac attcttataa agccaaaaaa 600

aaaaaagaat ggaacaaaag atttacagag agcagcaaag aacacatgta gtcacaatat 660

taactagtaa ccattactta atggtaaaac agcttaataa tagtggcttg caagttgcat 720

ctgatcccca gatcccgttt gttgaatgga tccagctata tggacattaa agctacatgt 780

gttaggcatg tatgagaatt ccctgtagct tttttttcat aatattactg taatatgacg 840

ctgcatcaag aatgcagtgc ctaaagcact taactgcacc cctgcaagat gtcacagctt 900

aaagtacttc ccttgtttgc ctgtcttcaa aacaccctgg gctgctggga aagagagcta 960

ggctttaaaa tgtactattg tcagagattt cttttgagag gaacctacat tttattaaat 1020

ttgattaatg actaccaat 1039

<210>29

<211>535

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48080192-48080726（UMD3.1.1）

<400>29

gtggtttttg ctttcccagc ctgtttggaa tctgtgtttg gcgaatccag atctgagttc 60

atttcatcgt ggatcgaagg gtgtaagctg ttcctgacgg ccaattaatg agtatgccgc 120

gctgcctaaa aaccagctgc aactcattgg tcatgtccaa aagggattcc agagatgggg 180

aggaaataac tcacaggagc ttctgcccat attctggaag ctgactaaat gtggactttt 240

aacgagagtc aaccggagta ctgcccggct gaactgaagg gagcaggacg tgggctggtg 300

ctctggtggg tgtgctgggg gccttcggct gcctgcttgt aactactctt tgttgtatgc 360

tgctcttcca gctccctgtc acttcagcag gggagcgtac ctattcgggg aatgagttgt 420

ctctataaat gcttctctct ctgtcggaca gtgggattca ggtcttggct ctagacaata 480

catgttttga tacgtctggg cttattgcca gatccgtgtg tgtatctctg atctt 535

<210>30

<211>420

<212>DNA

<213>牛HMGA2基因chr5：48076585-48077004（UMD3.1.1）

<400>30

aaatggtttt acaaaatgat ttgaggagcc agcatttccc agcagctata ctacttacac 60

atggaaaccg aatttaaaaa gctgaatcat gattttaggc atttcctttc tttaaggaaa 120

gagtcagtaa atttatttgt aatctcttat gctctcaagg actacaaagg gatagtttat 180

gggttgagag ctctacgata cttaactgag tcatatctct cctagaaccc taatttagca 240

gtattttctt ggcattagcc tggggctgac tttagcagtt gagttgtttt ccttggagga 300

agtttcatat tcagtccgag aaatgttaac tattcccgaa cattagctta aatcctttaa 360

cgttttaaac agttgtagaa gtgagctctc tttctttcac attctcacac ttccagagtg 420

Claims (8)

1.一种检测牛HMGA2基因增强子的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)根据序列保守性，在牛HMGA2基因选定区域内通过比对提取与其他物种中具有增强子活性的DNA序列同源的序列，得到集合I；

2)根据细胞活性实验，从集合I中筛选出具有增强子活性的序列，得到集合II；

3)根据ATAC-seq数据分析，从集合I中筛选出染色质处于开放状态的对应序列，得到集合III；

4)对集合II和集合III取交集，得到集合IV；若集合IV为空集，则返回步骤1)并更换牛HMGA2基因选定区域，若集合IV不为空集，则转至步骤5)；

5)根据Hi-C数据分析，从集合IV中筛选出可以与HMGA2基因启动子产生远距互作的序列，得到以牛HMGA2基因为靶基因的目标增强子；

6)对目标增强子进行细胞功能验证。

2.根据权利要求1所述一种检测牛HMGA2基因增强子的方法，其特征在于：所述步骤1)中，与牛HMGA2基因选定区域进行比对的序列选自人基因组序列。

3.根据权利要求1所述一种检测牛HMGA2基因增强子的方法，其特征在于：所述步骤1)中，牛HMGA2基因选定区域选自与牛HMGA2基因在个体发育中的转录调控相关的区域。

4.根据权利要求1或3所述一种检测牛HMGA2基因增强子的方法，其特征在于：所述步骤1)中，牛HMGA2基因选定区域选自该基因的第三内含子区。

5.根据权利要求1所述一种检测牛HMGA2基因增强子的方法，其特征在于：所述步骤2)中，利用双荧光素酶载体报告系统检测集合I中的序列的增强子活性。

6.根据权利要求1所述一种检测牛HMGA2基因增强子的方法，其特征在于：所述目标增强子定位于牛基因组chr5：48069675-48070539(UMD3.1.1)。

7.根据权利要求1所述一种检测牛HMGA2基因增强子的方法，其特征在于：所述目标增强子的扩增引物对为：

上游引物F1：5′-AAATCGATAAGGATCCCGACTGTGGTTTCAATGACA-3′

下游引物R1：5′-AAGGGCATCGGTCGACAAGGCAAAATACTTTTGTTTACTGA-3′。

8.根据权利要求1所述一种检测牛HMGA2基因增强子的方法，其特征在于：所述步骤6)中，利用CRISPRi载体系统转染牛成肌细胞，靶向抑制目标增强子活性，然后采用实时荧光定量PCR检测牛HMGA2基因表达水平。

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