CN103215309B - 表达多肽的方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种表达多肽的方法。其中，多肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，表达多肽的方法包括：利用重组杆状病毒表达毒种，感染第一昆虫Sf9细胞，以便使得第一昆虫Sf9细胞表达多肽，其中重组杆状病毒表达毒种包含编码多肽的核酸分子；以及裂解第一昆虫Sf9细胞，并纯化获得多肽。利用本发明的表达多肽的方法，可以有效地表达多肽，进一步可以得到高产量、高纯度的FMRP蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种表达多肽的方法，更进一步地，涉及一种FMRP蛋白的表达方法。
背景技术
脆性X综合征(fragile X syndrome，FXS)是一种常见的遗传性智力低下综合征，其发病率仅次于唐氏综合征，呈X连锁遗传。临床表现为不同程度的智力障碍、长脸、大耳、青春期后巨大睾丸等，由于临床表现差异大，仅凭临床表型难以作出正确诊断。FXS的发病率男性为1/4000，女性为1/6000。FXS患者在智障人群中所占比例为2.6%～8.7%，给家庭和社会带来沉重的心理和经济负担，并且目前尚无有效的治疗方法，因此，国内外都非常重视FXS的筛查，以早期检出患者，针对性地对患儿进行生活技能训练。有些国家(如以色列、芬兰)已在孕妇中进行常规筛查，防止患儿出生。我国人口基数大，病人绝对数目并不少，大规模对智力低下患者进行FXS筛查，做出早期诊断可以对患者进行尽早干预，以改善生活技能和提高生活自理能力。同时，对于筛查出患者的家庭进行完善的基因型检测，可以指导优生优育，防止智力低下人口的出生，从而提高人口素质。
FXS的诊断方法有细胞遗传学检查、聚合酶链反应技术（PCR）法、Southern印迹方法等，近年还开发出了免疫细胞化学方法-快速抗体检测法检测脆性X智力低下蛋白（FMRP）水平，比其他方法能更直接反映和解释FXS患者的临床表现。该方法方法可检出由于缺失、点突变导致FMR1基因不表达的患者,其敏感性100%,特异性97.5%,适用于群体筛查。根据全突变患者细胞内FMRP缺失的特点，运用特异性抗体测定FMRP的含量，检出FXS患者，该方法比细胞遗传学方法和基因检测方法能更直接反映和解释FXS患者的临床表现。虽然该法只能区别全突变与正常者，不能检出前突变患者，但是具有快速、简便等优点，此外可用于该法检测的样本种类多，包括外周血淋巴细胞、发根毛囊细胞、羊水或绒毛标本（细胞数≧100）、脐血等，适应于大样本检测及标本邮寄传递,临床应用前景广泛。
表达、纯化得到高产量、高纯度的FMRP蛋白是FMRP的快速、高通量检测方法确立重要实验材料，同时也是制备FMRP单克隆抗体及开发FXS检测试剂盒的基础，然而，尚无方法能够表达、纯化得到高产量、高纯度的FMRP蛋白。
因此，目前对于FMRP蛋白表达方法的研究仍有待深入。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
为此，本发明的目的在于提出一种多肽的表达方法，获得FMRP蛋白。
为了实现上述目的，本发明提供了一种表达多肽的方法。根据本发明的实施例，所述多肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其特征在于，所述方法包括:利用重组杆状病毒表达毒种，感染第一昆虫Sf9细胞，以便使得所述第一昆虫Sf9细胞表达所述多肽，其中所述重组杆状病毒表达毒种包含编码所述多肽的核酸分子；以及裂解所述第一昆虫Sf9细胞，并纯化获得所述多肽。由此，利用根据本发明实施例的表达多肽的方法，可以有效地表达多肽，进一步可以得到高产量、高纯度的FMRP蛋白。
根据本发明的一些实施例，上述表达多肽的方法还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的一个实施例，所述重组杆状病毒表达毒种包含SEQ ID NO：2所示的核酸序列。由此，可以进一步提高表达所需多肽的效率。
根据本发明的一个实施例，利用重组杆状病毒表达毒种，感染第一昆虫Sf9细胞是通过向包含所述第一昆虫Sf9细胞悬液中加入所述重组杆状病毒表达毒种，并共同培养预定时间而完成的。由此，可以进一步提高表达所需多肽的效率。
根据本发明的一个实施例，共同培养96小时后，裂解所述第一昆虫Sf9细胞。由此，可以进一步提高表达所需多肽的效率。
根据本发明的一个实施例，所述第一昆虫Sf9细胞悬液的密度为2×106个细胞/ml。由此，可以进一步提高表达所需多肽的效率。
根据本发明的一个实施例，所述共同培养是在28℃下进行的。由此，可以进一步提高表达所需多肽的效率。
根据本发明的一个实施例，所述共同培养是在悬浮条件下进行的。由此，可以进一步提高表达所需多肽的效率。
根据本发明的一个实施例，所述共同培养是在170rpm的转速下进行悬浮培养的。由此，可以进一步提高表达所需多肽的效率。
根据本发明的一个实施例，每15毫升2×106个细胞/ml的第一昆虫Sf9细胞悬液中加入1.6ml所述重组杆状病毒表达毒种，其中，所述重组杆状病毒表达毒种是通过下列步骤获得的：利用编码所述多肽的杆状病毒质粒转染第二昆虫Sf9细胞，在转染72小时后，裂解所述第二昆虫Sf9细胞，以便获得病毒原种P1；在六孔板的每孔加入1×106个细胞/ml的第三昆虫Sf9细胞悬液2ml，孵育1h，镜下观察确定细胞贴壁，向每孔中各加入200μl病毒原种P1，28℃培养，感染48-72小时后，每孔收集约2ml含病毒的上清培养基，500g离心5min，弃碎片收上清，以便获得P2病毒；在25cm2培养瓶中加入1×106个细胞/ml的第四昆虫Sf9细胞悬液8ml，孵育1h，再向所述25cm2培养瓶中加入80μl P2病毒，28℃培养，感染72小时后，将所述含有病毒的培养基在500g下离心5min，弃碎片收上清，以便获得P3病毒；以及在75cm2培养瓶中加入1×106个细胞/ml的第五昆虫Sf9细胞悬液20ml，孵育1h，再向所述75cm2培养瓶中加入300μl P3病毒，28℃培养，感染72h后，将所述含有病毒的培养基在500g下离心5min，弃碎片收上清，以便获得150ml所述重组杆状病毒表达毒种。由此，可以进一步提高表达所需多肽的效率。
根据本发明的一个实施例，所述编码所述多肽的杆状病毒质粒包含SEQ ID NO：2所示的核酸序列。由此，可以进一步提高表达所需多肽的效率。
根据本发明的实施例的表达多肽的方法可以实现下列优点至少之一：
1、根据本发明实施例的表达多肽的方法，可以有效地表达多肽，进一步可以得到高产量、高纯度的FMRP蛋白，例如重组FMRP ISO10的产量约为6.34mg/L，纯度大于90%；
2、根据本发明实施例的表达多肽的方法，以病毒毒种的体积代替病毒滴度进行病毒与细胞数量比值的优化，省去了病毒滴度测定，直接进入优化环节，有利于节省实验成本、缩短实验周期；
3、根据本发明实施例的表达多肽的方法，在对蛋白表达条件进行优化时，利用Quantityone软件对Western-blotting结果进行相对定量分析，比较蛋白表达量的差异，可以有效地排除人为主观因素干扰，实现全自动定量。在定量时，首先根据不同电泳条带的光密度值绘制光密度曲线，然后计算光密度曲线下面积作为电泳条带的定量根据，能够最大程度的排除不同泳道之间的背景差异，让各个泳道上的不同电泳条带在一条几乎相同的起跑线上进行对比；
4、根据本发明实施例的表达多肽的方法，采用BCA(bicinchoninic acid二喹啉甲酸)法对经过Ni-NTA纯化的得到的重组蛋白进行浓度测定，检测准确，操作更简便，还具有反应产物稳定、灵敏度高（0.5μg BSA微量测定）、浓度测定的线性范围广（25μg～2500μg/ml BSA微量测定）、蛋白间测定变异小、对去污剂有较高的耐受性等优点，特别适合于微量测定；
5、根据本发明实施例的表达多肽的方法，可以为FMRP的快速、高通量检测方法的确立提供重要实验材料，同时也为制备FMRP单克隆抗体、开发FXS检测试剂盒奠定以及FMRP相关靶mRNA的确认及其发挥翻译调控作用机理的研究奠定了基础。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的供体载体pFastBac1图谱及多克隆位点序列。
图2是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的蓝白斑筛选大肠杆菌DH10Bac阳性转座克隆的结果，图中，A为培养20h，B为培养48h。
图3是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的PCR鉴定重组bacmid的结果，图中，A为ISO10-bacmid，B为Gus-bacmid。
图4是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的Gus对照基因表达分析结果，图中，1为正常Sf9细胞对照组，2为重组Gus-bacmid转染Sf9细胞组。
图5是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的贴壁及悬浮状态下感染重组杆状病毒的Sf9细胞。
图6是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的Quantityone软件分析16组正交实验的Western-blotting结果。
图7是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的正交助手软件分析正交实验结果的效应曲线图。
图8是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的10%SDS-PAGE分析重组FMRPISO10-His在Sf9细胞中的表达的结果，图中，M为蛋白质Marker，C为Sf9细胞对照，1～5为15ml2×106个细胞/ml的Sf9细胞，其被分别感染0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml重组杆状病毒。
图9是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的Western-blotting检测FMRPISO10-His的纯化产物的结果，图中，I为抗His单克隆抗体检测结果，II为抗FMRP单克隆抗体检测结果，1为清洗缓冲液，2～8分别为含100、150、200、250、500、1000和2000mM咪唑的洗脱缓冲液。
图10是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的10%SDS-PAGE检测FMRPISO10-His的纯化产物的结果，图中，M为蛋白质Marker，1为清洗缓冲液，2～8分别为含100、150、200、250、500、1000和2000mM咪唑的洗脱缓冲液。
图11是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的BSA蛋白含量测定标准曲线。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“厚度”、“上”、“下”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
本发明提出了一种表达多肽的方法。根据本发明的实施例，该多肽具有如下SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列：
MEELVVEVRGSNGAFYKAFVKDVHEDSITVAFENNWQPDRQIPFHDVRFPPPVGYNKDINESDEVEVYSRANEKEPCCWWLAKVRMIKGEFYVIEYAACDATYNEIVTIERLRSVNPNKPATKDTFHKIKLDVPEDLRQMCAKEAAHKDFKKAVGAFSVTYDPENYQLVILSINEVTSKRAHMLIDMHFRSLRTKLSLIMRNEEASKQLESSRQLASRFHEQFIVREDLMGLAIGTHGANIQQARKVPGVTAIDLDEDTCTFHIYGEDQDAVKKARSFLEFAEDVIQVPRNLVGKVIGKNGKLIQEIVDKSGVVRVRIEAENEKNVPQEEEIMPPNSLPSNNSRVGPNAPEEKKHLDIKENSTHFSQPNSTKVQRGMVPFVFVGTKDSIANATVLLDYHLNYLKELILKHQMLLKQNLTTETNSVIGH(SEQ ID NO:1)
根据本发明的实施例，表达多肽方法包括：利用重组杆状病毒表达毒种感染第一昆虫Sf9细胞，以便使得第一昆虫Sf9细胞能够表达多肽，其中，重组杆状病毒表达毒种包含编码多肽的核酸分子；以及裂解第一昆虫Sf9细胞，并纯化获得多肽。由此，可以有效地表达多肽，进一步可以得到高产量、高纯度的FMRP蛋白。
利用重组病毒感染昆虫细胞表达异源蛋白时，一般采用恒定的MOI值(multiplicity ofinfection，感染复数)感染处于对数生长期的细胞，MOI的含义是指感染时病毒与细胞数量的比值，常用的测定病毒滴度的方法有蚀斑检测法、终点稀释法、实时定量PCR、免疫染色法、流式细胞术等。蚀斑检测法重复性不好、耗时长，得到最终结果通常需要三周，终点稀释法测定病毒滴度比较准确，但也要耗时两周，而且对细胞状态的要求也较高，实时定量PCR和免疫染色法检测病毒滴度耗时短、结果稳定性好，但价格昂贵且使用的次数有限，而流式细胞术检测并计数病毒则需要配备专门的流式细胞仪。总之，对于病毒滴度的测定还是比较复杂的，本发明的发明人在研究中惊奇地发现，以病毒毒种的体积代替病毒滴度进行病毒与细胞数量比值的优化，能够省去病毒滴度测定，直接进入优化环节，具有节省实验成本和缩短实验周期的优点，此技术方案的特征和优点将在以下部分做进一步地描述。
根据本发明的实施例，重组杆状病毒表达毒种包含如下SEQ ID NO:2所示的核酸序列：acttccggtg gagggccgcc tctgagcggg cggcgggccg acggcgagcg cgggcggcggcggtgacgga ggcgccgctg ccagggggcg tgcggcagcg cggcggcggc ggcggcggcggcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg ctgggcctcg agcgcccgcagcccacctct cgggggcggg ctcccggcgc tagcagggct gaagagaaga tggaggagctggtggtggaa gtgcggggct ccaatggcgc tttctacaag gcatttgtaa aggatgttcatgaagattca ataacagttg catttgaaaa caactggcag cctgataggc agattccatttcatgatgtc agattcccac ctcctgtagg ttataataaa gatataaatg aaagtgatgaagttgaggtg tattccagag caaatgaaaa agagccttgc tgttggtggt tagctaaagtgaggatgata aagggtgagt tttatgtgat agaatatgca gcatgtgatg caacttacaatgaaattgtc acaattgaac gtctaagatc tgttaatccc aacaaacctg ccacaaaagatactttccat aagatcaagc tggatgtgcc agaagactta cggcaaatgt gtgccaaagaggcggcacat aaggatttta aaaaggcagt tggtgccttt tctgtaactt atgatccagaaaattatcag cttgtcattt tgtccatcaa tgaagtcacc tcaaagcgag cacatatgctgattgacatg cactttcgga gtctgcgcac taagttgtct ctgataatga gaaatgaagaagctagtaag cagctggaga gttcaaggca gcttgcctcg agatttcatg aacagtttatcgtaagagaa gatctgatgg gtctagctat tggtactcat ggtgctaata ttcagcaagctagaaaagta cctggggtca ctgctattga tctagatgaa gatacctgca catttcatatttatggagag gatcaggatg cagtgaaaaa agctagaagc tttctcgaat ttgctgaagatgtaatacaa gttccaagga acttagtagg caaagtaata ggaaaaaatg gaaagctgattcaggagatt gtggacaagt caggagttgt gagggtgagg attgaggctg aaaatgagaaaaatgttcca caagaagagg aaattatgcc accaaattcc cttccttcca ataattcaagggttggacct aatgccccag aagaaaaaaa acatttagat ataaaggaaa acagcacccatttttctcaa cctaacagta caaaagtcca gaggggtatg gtaccatttg tttttgtgggaacaaaggac agcatcgcta atgccactgt tcttttggat tatcacctga actatttaaaggaactaatt ctgaagcatc aaatgcttct gaaacagaat ctgaccacag agacgaactcagtgattggt cattagctcc aacagaggaa gagagggaga gcttcctgcg cagaggagacggacggcggc gtggaggggg aggaagagga caaggaggaa gaggacgtgg aggaggcttcaaaggaaacg acgatcactc ccgaacagat aatcgtccac gtaatccaag agaggctaaaggaagaacaa cagatggatc ccttcagatc agagttgact gcaataatga aaggagtgtccacactaaaa cattacagaa tacctccagt gaaggtagtc ggctgcgcac gggtaaagatcgtaaccaga agaaagagaa gccagacagc gtggatggtc agcaaccact cgtgaatggagtaccctaaa ctgcataatt ctgaagttat atttcctata ccatttccgt aattcttattccatattaga aaactttgtt aggccaaaga caaatagtag gcaagatggc acagggcatgaaatgaacac aaattatgct aagaattttt tattttttgg tattggccat aagcaacaattttcagattt gcacaaaaag ataccttaaa atttgaaaca ttgcttttaa aactacttagcacttcaggg cagattttag ttttattttc taaagtactg agcagtgata ttctttgttaatttggacca ttttcctgca ttgggtgatc attcaccagt acattctcag tttttcttaatatatagcat ttatggtaat catattagac ttctgttttc aatctcgtat agaagtcttcatgaaatgct atgtcatttc atgtcctgtg tcagtttatg ttttggtcca cttttccagtattttagtgg accctgaaat gtgtgtgatg tgacatttgt cattttcatt agcaaaaaaagttgtatgat ctgtgccttt tttatatctt ggcaggtagg aatattatat ttggatgcagagttcaggga agataagttg gaaacactaa atgttaaaga tgtagcaaac cctgtcaaacattagtactt tatagaagaa tgcatgcttt ccatattttt ttccttacat aaacatcaggttaggcagta taaagaatag gacttgtttt tgtttttgtt ttgttgcact gaagtttgataaatagtgtt attgagagag atgtgtaatt tttctgtata gacaggagaa gaaagaactatcttcatctg agagaggcta aaatgttttc agctaggaac aaatcttcct ggtcgaaagttagtaggata tgcctgctct ttggcctgat gaccaatttt aacttagagc tttttttttttaattttgtc tgccccaagt tttgtgaaat ttttcatatt ttaatttcaa gcttattttggagagatagg aaggtcattt ccatgtatgc ataataatcc tgcaaagtac aggtactttgtctaagaaac attggaagca ggttaaatgt tttgtaaact ttgaaatata tggtctaatgtttaagcaga attggaaaag actaagatcg gttaacaaat aacaactttt ttttctttttttcttttgtt ttttgaagtg ttggggtttg gttttgtttt ttgagtcttt tttttttaagtgaaatttat tgaggaaaaa tatgtgaagg accttcactc taagatgtta tatttttcttaaaaagtaac tcctagtagg ggtaccactg aatctgtaca gagccgtaaa aactgaagttctgcctctga tgtattttgt gagtttgttt ctttgaattt tcattttaca gttacttttccttgcataca aacaagcata taaaatggca acaaactgca catgatttca caaatattaaaaagtctttt aaaaagtatt gccaaacatt aatgttgatt tctagttatt tattctgggaatgtatagta tttgaaaaca gaaattggta ccttgcacac atcatctgta agctgtttggttttaaaata ctgtagataa ttaaccaagg tagaatgacc ttgtaatgta actgctcttgggcaatattc tctgtacata ttagcgacaa cagattggat tttatgttga catttgtttggttatagtgc aatatatttt gtatgcaagc agtttcaata aagtttgatc ttcctctgctaaattgatgt tgatgcaatc cttacaaatg attgctttta aaattttaag ctaggaaaagaaatctatag aaagtgttct gttacaaaat gtaactgtta ccattggaaa tttcacgtcataggaagtta gcctttatct accaactttc aagaacttgt ttaataaagc gaaaaactcaaccaaatggt acaaaaccac agtgtaccat taaaatatgc actaagtctc ttttttacaaaggctgtatt cagcaaggcg ctaacttgct taaatgtgaa ttactaactt ctaaaactgtactttgattc acatgttttc aaatggagtt ggagttcatt catattacaa tatttgtgtgctaaacgtgt atgtttttca gttcaaagtc atgatgtttt taaaatctta ttaaagtttcaaaaatctga agattgttta tctagatgta aatttttatt aaaaagttgc acttatgaaaaagcaaaaaa tt(SEQ ID NO:2)
根据本发明的实施例，利用重组杆状病毒表达毒种，感染第一昆虫Sf9细胞是通过向包含第一昆虫Sf9细胞悬液中加入重组杆状病毒表达毒种，并共同培养预定时间而完成的。由此，可以有效地利用重组杆状病毒表达毒种感染昆虫细胞，从而实现在昆虫细胞中表达所需要的多肽。
根据本发明的实施例，共同培养96小时后，裂解第一昆虫Sf9细胞。这是因为，发明人通过比较不同表达时间（48h、72h、96h和120h）条件下目的蛋白的表达量，发现了在其他条件相同的情况下，当表达时间为96h时，蛋白表达量最高。
根据本发明的实施例，第一昆虫Sf9细胞悬液的密度为2×106个细胞/ml。这是因为，发明人通过比较接种不同密度的第一昆虫Sf9细胞悬液后目的蛋白的表达量，发现在其他条件相同的情况下，当第一昆虫Sf9细胞悬液接种密度为2X106个细胞/ml时，蛋白表达量最高。
根据本发明的实施例，共同培养是在28℃下进行的。这是因为，该培养温度是培养昆虫Sf9细胞生长的最适温度。
根据本发明的实施例，共同培养是在悬浮条件下进行的。这是因为，细胞悬浮培养可获得同步分裂的、增殖迅速的大量细胞，可满足大规模的工业化生产。
根据本发明的实施例，共同培养是在170rpm的转速下进行悬浮培养的。这是因为，发明人发现，在170rpm转速下，可对昆虫Sf9细胞细胞团施加一种缓和的压力，使细胞团破碎成小细胞团和单细胞，并且在培养基中保持均匀的分布，并且该转速可促进培养基和容器内空气之间的气体交换。
根据本发明的实施例，每15毫升2×106个细胞/ml的第一昆虫Sf9细胞悬液中加入1.6ml所述重组杆状病毒表达毒种，其中，重组杆状病毒表达毒种是通过下列步骤获得的：利用编码多肽的杆状病毒质粒转染第二昆虫Sf9细胞，在转染72小时后，裂解第二昆虫Sf9细胞，以便获得病毒原种P1；在六孔板的每孔加入1×106个细胞/ml的第三昆虫Sf9细胞悬液2ml，孵育1h，镜下观察确定细胞贴壁，向每孔中各加入200μl病毒原种P1，28℃培养，感染48-72小时后，每孔收集约2ml含病毒的上清培养基，500g离心5min，弃碎片收上清，以便获得P2病毒；在25cm2培养瓶中加入1×106个细胞/ml的第四昆虫Sf9细胞悬液8ml，孵育1h，再向所述25cm2培养瓶中加入80μlP2病毒，28℃培养，感染72小时后，将所述含有病毒的培养基在500g下离心5min，弃碎片收上清，以便获得P3病毒；以及在75cm2培养瓶中加入1×106个细胞/ml的第五昆虫Sf9细胞悬液20ml，孵育1h，再向所述75cm2培养瓶中加入300μlP3病毒，28℃培养，感染72h后，将含有病毒的培养基在500g下离心5min，弃碎片收上清，以便获得150ml重组杆状病毒表达毒种。
根据本发明的实施例，编码多肽的杆状病毒质粒包含前面所述的SEQ ID NO：2所示的核酸序列。
根据本发明的实施例的表达多肽的方法可以实现下列优点至少之一：
1、根据本发明实施例的表达多肽的方法，可以有效地表达多肽，进一步可以得到高产量、高纯度的FMRP蛋白，例如重组FMRP ISO10的产量约为6.34mg/L，纯度大于90%；
2、根据本发明实施例的表达多肽的方法，以病毒毒种的体积代替病毒滴度进行病毒与细胞数量比值的优化，省去了病毒滴度测定，直接进入优化环节，有利于节省实验成本、缩短实验周期；
3、根据本发明实施例的表达多肽的方法，在对蛋白表达条件进行优化时，利用Quantityone软件对Western-blotting结果进行相对定量分析，比较蛋白表达量的差异，可以有效地排除人为主观因素干扰，实现全自动定量。在定量时，首先根据不同电泳条带的光密度值绘制光密度曲线，然后计算光密度曲线下面积作为电泳条带的定量根据，能够最大程度的排除不同泳道之间的背景差异，让各个泳道上的不同电泳条带在一条几乎相同的起跑线上进行对比；
4、根据本发明实施例的表达多肽的方法，采用BCA(bicinchoninic acid二喹啉甲酸)法对经过Ni-NTA纯化的得到的重组蛋白进行浓度测定，检测准确，操作更简便，还具有反应产物稳定、灵敏度高（0.5μg BSA微量测定）、浓度测定的线性范围广（25μg～2500μg/ml BSA微量测定）、蛋白间测定变异小、对去污剂有较高的耐受性等优点，特别适合于微量测定；
5、根据本发明实施例的表达多肽的方法，可以为FMRP的快速、高通量检测方法的确立提供重要实验材料，同时也为制备FMRP单克隆抗体、开发FXS检测试剂盒奠定以及FMRP相关靶mRNA的确认及其发挥翻译调控作用机理的研究奠定了基础。
下面通过具体的实施例，对本发明进行说明，需要说明的是这些实施例仅仅是为了说明目的，而不能以任何方式解释成对本发明的限制。另外，在下列实施例中如果没有特别说明，则所采用的设备和材料均为市售可得的。
实施例1
1.材料
细胞株：Sf9昆虫细胞，购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。
真核供体质粒：pFastBac1购自Invitrogen。
菌株：大肠杆菌TOP10感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，大肠杆菌DH10Bac感受态细胞购自Invitrogen公司。
引物：Invitrogen公司合成，序列(5'至3')如下所示：
Middle-Forward：TTGACATGCACTTTCGGA(SEQ ID NO:3)，
pUC/M13-Forward：CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG(SEQ ID NO:4)，
pUC/M13-Reverse：AGCGGATAACAATTTCACACAGG(SEQ ID NO:5)，
Forward：CCGGAATTCATGGAGGAGCTGGTGGTG(SEQ ID NO:6)，
ISO10-Reverse：CGCGTCGACTTAGTGATGGTGATGGTGATGATGACCAATCACTGA
(SEQ ID NO:7)，
其中，引物Forward的5’末端引入限制性内切酶EcoR I识别位点，标记为单划线的部分，黑体加粗标记部分为起始密码子；引物ISO10-Reverse的5’末端引入限制性内切酶Sal I识别位点，标记为单划线的部分，黑体加粗标记部分为终止密码子，双下划线标记部分为6个His标签。
2.方法
2.1Sf9昆虫细胞培养
2.1.1贴壁培养
1）吸取单细胞层上的培养液和悬浮的细胞，弃掉。
2）加入4ml的室温全培养基（含10%FBS的Grace’s培养基或者SF900Ⅱ培养基），用吸管或移液器重悬细胞，不宜采用酶消化法。在倒置显微镜下观察细胞，确定细胞全部离壁。
3）进行细胞活力计数（用trypan染色法），每个培养瓶中接种约1～2×106个细胞。在27.5℃～28.5℃条件下培养，盖子稍松以保证氧气的交换，或者用盖子上有透气滤膜的培养瓶。
4）在2-4天后，细胞汇合度达到80%～100%时进行传代，每瓶细胞传3-4瓶。对于有些长的慢的细胞，去上清，在单层细胞的另一边轻轻加入新鲜的培养液。
2.1.2悬浮培养
1）当贴壁生长良好时，取2-3瓶长满细胞的75cm2培养瓶，以SF900II培养基将细胞吹成细胞悬液，若之前以含10%FBS的Grace’s培养基进行贴壁培养，则需提前1-2代更换为SF900Ⅱ培养基，使细胞适应新的培养基。
2）转入100ml培养瓶中进行试悬浮培养，28℃、170rpm悬浮培养。悬浮培养接种密度不应小于0.5×106个细胞/ml，细胞密度为6.0×106个细胞/ml时可进行传代。
3）传代时将适量细胞悬液吸出，补充新培养基即可。
2.2供体载体FMR1ISO10-pFast的构建
2.2.1引物退火温度优化
以克隆载体ISO10-pEASY为模板，Forward、ISO10-Reverse为引物进行PCR反应；两组引物扩增后可分在FMR1ISO10的5’末端引入限制性内切酶EcoR I识别位点和起始密码子，在3’末端引入限制性内切酶Sal I识别位点、终止密码子及6个His的标签。
2.2.2目的基因FMR1ISO10及供体载体pFastBac1的双酶切
通过琼脂糖凝胶电泳回收目的基因FMR1ISO10，以限制性内切酶EcoR I和Sal I进行双酶切，形成两个不同的粘性末端，以便克隆进入供体载体pFastBac1。按如下表1分别配制插入片段及供体载体的双酶切反应混合物，37℃酶切4h后琼脂糖凝胶电泳纯化回收酶切产物。
表1酶切反应体系
2.2.3目的基因FMR1ISO10及克隆载体pFastBac1的连接
按表2配制酶切后插入片段FMR1ISO10及酶切后载体pFastBac1的连接反应混合物，室温连接30min，构建供体载体ISO10-pFast。
表2连接反应体系
2.2.4供体载体ISO10-pFast的鉴定
取5μl连接产物加入到50μl Top10大肠杆菌感受态，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入无抗性LB培养基800μl，180rpm、37℃培养1h，4000rpm离心5min，弃上清培养基，余下约100μl轻轻吹匀，涂布于100μg/ml青霉素的LB培养基，倒置37℃培养约12h，过夜培养后挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。
阳性菌落接种于液体LB培养基，过夜培养后小量提取质粒进行PCR及以EcoRI和SalI进行双酶切鉴定。
2.2.5测序
以PH-Profor、pFastBac-rev为引物对阳性质粒进行双向测序。
2.3重组FMR1ISO10-bacmid及Gus-bacmid的转座制备
2.3.1供体载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态
取供体载体ISO10-pFast及Invitrogen公司的转座对照载体pFastBac-Gus各1μl分别加入到30μl DH10Bac大肠杆菌感受态，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入无抗性S.O.C培养基800μl，225rpm、37℃培养4h。以S.O.C培养基梯度稀释10-1、10-2、10-3各取100μl，涂布LB固体三抗性蓝白斑筛选平板。
2.3.2阳性转座克隆筛选及鉴定
1）蓝白斑初筛：稀释涂布好的转化平板37℃倒置培养超过48h，较大白斑即可能为转座成功克隆。
2）二次划线复筛：挑若干纯白色克隆于LB固体三抗性筛选平板上划线，37℃培养过夜。仍旧为白色的克隆可初步鉴定为转座成功的阳性克隆。
3）PCR鉴定：复筛板上挑白色克隆接种于接种于三抗性LB液体培养基5ml，37℃、250rpm过夜培养，培养后取2ml常规方法提取bacmid（即杆状病毒质粒）做PCR鉴定。见表3所示，PCR鉴定所用引物及相对应退火温度，步骤3，ISO10-bacmid的鉴定用A、B两组引物，Gus-bacmid的鉴定用B组引物。确认为阳性重组bacmid后剩余菌液加入10%甘油，-20℃保藏。
表3ISO10-bacmid PCR反应
2.4重组ISO10-bacmid及Gus-bacmid的提取
2.4.1重组bacmid DNA的提取
大肠杆菌DH10Bac中所含的bacmid（bMON14272）大小为135kb，较普通载体大很多，采用Invitrogen公司的PureLinkTMHiPure Plasmid DNA Miniprep Kit提取重组bacmid。
将鉴定含有阳性转座ISO10-bacmid及Gus-bacmid的菌体分别接种于含卡那50μg/ml、庆大7μg/ml、四环10μg/ml LB液体培养基5ml，37℃、250rpm过夜培养。操作过程中动作轻柔，避免机械力剪切，保证重组bacmid的完整性。
2.4.2重组bacmid DNA浓度的测定
以去离子水将提取的重组bacmid溶液稀释30倍，用去离子水设置空白，再以紫外分光光度计进行样品浓度测定。浓度测定好按每份约1μg重组bacmid进行分装，以便转染之用。4℃避光保存最多两周，-20℃长期保存，避免冻融次数过多而降低转染效率。
2.5整合FMR1ISO10及Gus的重组杆状病毒的制备
2.5.1重组bacmid转染昆虫细胞
以对数期、活细胞数大于95%的Sf9昆虫细胞为对象，在六孔板中每孔接种8×105个细胞，通过脂质体转染试剂CellfectinⅡ分别将将1μg重组ISO10-bacmid及Gus-bacmid转染至昆虫细胞，包装杆状病毒。为不影响转染效果，过程中应采用Grace’s unsupplymentedmedium，同时加抗生素及FBS。
2.5.2病毒原种(P1)的分离与贮存
1）感染迹象：转染后细胞放置在37℃湿度培养箱中孵育，转染小于24h，细胞直径增大25～50%，细胞核增大充满细胞；24～72h，细胞停止生长，出现病毒包被的迹象，细胞中出现颗粒状、空泡，细胞漂浮；大于72h，细胞裂解。
2）病毒收集：转染约72h或当细胞出现感染迹象后，将上层培养基（约2ml）转移到无菌带盖的EP管中，500g离心5min以去除细胞及大的碎片。将含病毒的上清液转移到另一个无菌带盖的EP管中。
3）毒种保存：将得到的病毒液体避光置于4℃冰箱（短期）。若长期保存，进行分装，避光储存于-80℃。如果培养基是无血清的，需要加入2%FBS。
2.5.3Gus基因表达分析
1）配制20mg/ml X-GLUC：取1.25mlDMF（或DMSO）溶解25mg X-GLUC。-20℃、避光保存。
2）转染重组Gus-bacmid的Sf9细胞，在收取P1病毒时取50μl无细胞的上清培养基，加入5μl上述X-GLUC溶液。
3）两小时内观察溶液颜色变化，表达β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,Gus)则可催化X-GLUC底物分解为蓝色物质。
2.5.4重组病毒的扩增
利用Sf9细胞分别扩增整合了FMR1ISO10的P1代重组杆状病毒，选用的细胞应生长状态良好。病毒扩增采用贴壁培养方式进行，以0.05～0.1的低MOI（multiplicity of infection，感染复数）感染细胞扩增重组杆状病毒。扩增时加入的病毒量按如下公式计算：病毒体积（ml）=[MOI(pfu/cell)×细胞数]/病毒滴度(pfu/ml)；病毒滴度经验值P1一般为1×106-1×107pfu/ml，P2一般为1×107-1×108pfu/ml。经过计算按以下步骤进行重组杆状病毒的扩增，为重组蛋白FMRP ISO10的表达制备毒种：
1）在六孔板中扩增P2：每孔加入1×106个细胞/ml的细胞悬液2ml，孵育1h，镜下观察确定细胞贴壁。每孔中各加入200μl整合了FMR1ISO10的P1重组病毒，28℃培养。感染48h或出现感染迹象后（如72h）收集病毒，但时间过长细胞裂解，活性降低。每孔收集约2ml含病毒的上清培养基，500g离心5min，弃碎片收上清，此即为第二代P2病毒。
2）在25cm2培养瓶中扩增P3：每瓶加入1×106个细胞/ml的细胞悬液8ml，孵育1h，每瓶中各加入80μl整合了FMR1ISO10的P2重组病毒，感染72h收集P3病毒。
3）在75cm2培养瓶中扩增P4：每瓶加入1×106个细胞/ml的细胞悬液20ml，孵育1h，每瓶中各加入300μl整合了FMR1ISO10的P3重组病毒，28℃培养，感染72h收集P4病毒。
4）为防止杆状病毒在扩增代数过多而产生突变，所以毒种的代数尽量低，实验过程中扩增了整合FMR1ISO10的杆状病毒P4约150ml作为蛋白表达毒种，扩增整合FMR1ISO10的杆状病毒P3约100ml作为毒种。
2.6FMRP ISO10蛋白表达条件优化
在细胞密度2×106个细胞/ml收获时间为96h的条件下对FMRP ISO10表达时加入病毒的量进行优化。病毒毒种为P3，在15ml体系中分别含0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml病毒，同时设一组空白对照，共六组。加入病毒96h后收取1ml培养物，1000rpm离心5min，沉淀加入1.5ml1×SDS上样缓冲液，沸水变性5min，取样品进行SDS-PAGE（即聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析。
2.7FMRP ISO10的小规模表达及纯化
1）培养：按照上述实验优化的FMRP ISO10表达条件确定最佳表达工艺，并扩大培养规模至150ml，整合FMR1ISO10的毒种分别加入16ml和15ml，细胞密度2×106个细胞/ml，收获时间为96h，28℃、170rpm悬浮培养。
2）收集：96h收集细胞，1000g离心5min，以PBS洗细胞一次，1000g离心5min。
3）裂解：每1～2×107个细胞加入4ml裂解液（1%NP40，20mM咪唑，NaH2PO450mM，NaCl300mM，pH8.0），加入PMSF至终浓度1mM，冰浴30～60min。裂解后于13,000g4℃条件下离心10min，收集裂解物上清。
4）结合：50%Ni-NTA悬液需经15倍体积PBS洗，除去乙醇后以裂解液平衡，每1-2×107个细胞裂解液加入200μl50%Ni-NTA混悬液，4℃、200rpm，结合1-2h使Ni-NTA胶与蛋白充分结合。将结合物装入层析柱，在重力条件下收集穿过液。
5）洗脱条件优化：以洗涤缓冲液（咪唑20mM，NaH2PO450mM，NaCl300mM，pH8.0）洗两次，去除未结合的杂蛋白，收集待分析。依次以含100、150、200、250、500mM咪唑洗脱液（咪唑，NaH2PO450mM，NaCl300mM，pH8.0）200μl对FMRP ISO7进行洗脱；以含100、150、200、250、500、1000、2000mM咪唑洗脱液500μl对FMRP ISO10进行洗脱；收集洗脱液进行SDS-PAGE及Western-blotting分析。
6）分析洗脱结果，确定最佳的咪唑洗脱浓度，按上述操作再次小规模表达，按最佳咪唑洗脱浓度，以500μl为单位进行洗脱，收集12管，共6ml洗脱液。SDS-PAGE对12管洗脱液进行检测，将收集到目的蛋白的样品组进行蛋白含量检测。
2.8BCA蛋白定量FMRP ISO10纯化产物
在96孔板中，以BCA蛋白浓度测定试剂盒对FMRP ISO10的纯化产物进行微量测定定量。以BSA为标准品测定标准曲线，BSA浓度稀释为50、100、150、200、250、300、350、400μg/ml，同时设空白调零孔。在562nm处测定光吸收值，利用标准品及空白孔的浓度与OD值做标准曲线。待测样品原液进行测定，根据标准曲线计算样品蛋白含量，具体操作步骤见其说明书。
3实验结果
3.1供体载体FMR1ISO10-pFast的构建
大量PCR扩增ISO10后经限制性内切酶EcoR I和Sal I进行双酶切，与同样双酶切的供体载体pFastBac1进行连接，载体图谱及多克隆位点序列见图1所示。含阳性重组质粒的Top10大肠杆菌经菌落PCR鉴定，再提取质粒进行PCR及以EcoRI和SalI进行双酶切鉴定，最终双向测序进行序列确定插入供体载体pFastBac1的序列无突变，并且3’末端融合编码His-tag的碱基序列。
3.2大肠杆菌DH10Bac选转座阳性克隆的筛选及鉴定
参考图2，大肠杆菌DH10Bac中进行转座，三抗性及蓝白斑筛选平板37℃倒置培养，培养超过48h有较大白斑，即为转座成功的阳性克隆，培养时间不足则不易区分不出蓝白斑及菌落大小。
较大白色菌落经二次划线复筛仍为白色，则挑取接种于三抗性LB液体培养基，以提取普通质粒的方法提取bacmid进行PCR鉴定。以Forward和ISO10-Reverse、pUC/M13-Forward+pUC/M13-Reverse两组引物对ISO10-bacmid进行PCR鉴定，两组引物相应的PCR产物分别为1323bp、3623bp；以pUC/M13-Forward+pUC/M13-Reverse为引物对Gus-bacmid进行PCR鉴定，PCR产物约为4,200bp。结果如图3所示，在预期位置都有目的带出现，证明三组均为阳性重组bacmid，分别整合了FMR1ISO10和Gus。
3.3紫外分光光度计测定提取的bacmid DNA浓度
以重力提取试剂盒提取重组bacmid以去离子水稀释30倍，用紫外分光光度计测定浓度结果见表4。
表4浓度测定结果
3.4Gus基因表达鉴定
重组Gus-bacmid转染Sf9细胞后收获P1代病毒时，取50μl无细胞的上清培养基于200μl的EP管中，加入5μl20mg/ml X-GLUC溶液。二者混匀后Gus组显现蓝色，见图4，并且随时间延长颜色逐渐加深，而为进行转染的正常细胞组无此现象。
3.5感染重组杆状病毒Sf9细胞的病变
昆虫Sf9细胞感染病毒24h细胞直径会增大25-50%，细胞核增大充满细胞；染毒24-72h，细胞停止生长，出现病毒包被的迹象，细胞中出现颗粒状、空泡，细胞漂浮；大于72h，细胞裂解。如图5所示，200倍倒置显微镜下观察，在贴壁状态下细胞分别感染P2代重组ISO10杆状病毒48h后细胞体积变大，并且细胞生长出现抑制，数量上较对照组少；悬浮状态下细胞感染P4代重组杆状病毒72h后的细胞出现明显裂解现象，死细胞边缘不规则，不反光，无立体感。
3.6FMRP ISO10表达条件优化
由于FMRP ISO10重组表达量低，SDS-PAGE电泳看不到目的蛋白表达，但一抗为小鼠抗人FMRP单克隆抗体和小鼠抗His-tag单克隆抗体的Western-blotting结果都显示，在约75kDa处有FMRP有表达，并且融合了His-tag，上清培养基中没有检测出目的蛋白（结果此处未给出）。DNAMAN软件根据氨基酸组成计算出融合His-tag的FMRP ISO10的蛋白质分子量为49.6kDa，但由于昆虫细胞中蛋白质合成出来以后要经糖基化、磷酸化、去磷酸化等修饰，这些都会影响蛋白质分子量，而这些软件就很难预测准确了，所以会有几kDa的误差。
利用Quantityone软件对Western-blotting实验结果进行条带轨迹定量法分析，选取的条带见图6所示，以峰面积(Trace，Int x mm)为准，以第4组为标准进行相对定量。由于电泳泳道数限制，16组样品分别以小鼠抗人FMRP及His-tag两种单克隆抗体分四次进行，每次以峰面积最高的为100%，相对定量其余泳道目的带，将4组实验最终的相对定量结果输入正交助手软件进行分析，输出效应曲线图（见图7）。
在细胞密度2×106细胞/ml收获时间为96h的条件下，在15ml体系中分别含0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml病毒，加无病毒的正常细胞对照共六组。FMRP ISO10的预测分子量为49.6kDa，SDS-PAGE检测在约为55kDa处有蛋白表达，见图8，然后经Western-blotting鉴定为融合his-tag的FMRP。由SDS-PAGE可看出5组不同的病毒与细胞比例对蛋白表达的影响不明显，所以取其中间值，即15ml细胞密度为2×106细胞/ml体系中应加入ISO10病毒毒种1.5ml，悬浮培养96h后收获细胞。
3.7FMRP ISO10的纯化
按照表达条件确定最佳表达工艺，扩大培养规模至150ml，收获细胞进行重组FMRPISO10的纯化，由于在构建供体载体时通过引物设计将6个组氨酸的His-tag融合至蛋白的C末端，所以以Ni-NTA进行亲和纯化，以含100、150、200、250、500、1000、2000mM咪唑洗脱液进行梯度洗脱。收集洗脱液进行SDS-PAGE及Western-blotting分析。
利用小鼠抗人FMRP单克隆抗体和小鼠抗His-tag单克隆抗体对FMRP ISO10的纯化产物进行Western-blotting实验，结果见图9。由图9可看出，对FMRP ISO10的纯化洗脱液中含有目的蛋白。
由SDS-PAGE检测FMRP ISO10纯化效果的结果见图10。如图10可看出，250mM以上的咪唑可将FMRP ISO10从Ni-NTA上洗脱下来，并且目的条蛋白含量较高，杂带很微弱；且SDS-PAGE电泳结果经Quantityone软件分析500mM及以上咪唑洗脱产物的纯度均在90%以上。由SDS-PAGE结果可看出，许多杂蛋白结合在Ni-NTA上，浓度逐渐增加的咪唑洗脱液也不能把杂蛋白与目的蛋白区分开。
3.8FMRP ISO10纯化后的含量测定
按优化好的表达条件在150ml培养体系中对FMRP ISO10进行表达、纯化，以500mM咪唑进行洗脱，每次500μl，共洗12次。经SDS-PAGE检测，12组洗脱液中第2到第11组中都含有目的蛋白，将2-11组进行含量测定。以标准品BSA制作标准曲线，结果见图11，洗脱收集的2-11组样品，蛋白含量测定结果见表5。经过计算2-11组中蛋白含量一共为951.5μg，即150ml培养物可纯化得到重组FMRP ISO10约951.5μg，产量约为6.34mg/L。
表5FMRP ISO10蛋白含量测定结果
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，这些均落在本发明的权利保护范围。
Claims (3)
1.一种表达多肽的方法，所述多肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其特征在于，所述方法包括：
利用重组杆状病毒表达毒种感染第一昆虫Sf9细胞，以便使得所述第一昆虫Sf9细胞表达所述多肽，其中，所述重组杆状病毒表达毒种包含编码所述多肽的核酸分子；以及
裂解所述第一昆虫Sf9细胞，并纯化获得所述多肽，
其中，
所述重组杆状病毒表达毒种的供体质粒为pFastBac1，
利用重组杆状病毒表达毒种感染第一昆虫Sf9细胞是通过向包含所述第一昆虫Sf9细胞悬液中加入所述重组杆状病毒表达毒种，并于28℃下以170rpm的转速悬浮培养96小时后裂解所述第一昆虫Sf9细胞而完成的，
所述第一昆虫Sf9细胞悬液的密度为2×106个细胞/ml，
每15毫升2×106个细胞/ml的第一昆虫Sf9细胞悬液中加入1.6ml所述重组杆状病毒表达毒种，
其中，所述重组杆状病毒表达毒种是通过下列步骤获得的：
利用编码所述多肽的杆状病毒质粒转染第二昆虫Sf9细胞，在转染72小时后，裂解所述第二昆虫Sf9细胞，以便获得病毒原种P1；
在六孔板的每孔加入1×106个细胞/ml的第三昆虫Sf9细胞悬液2ml，孵育1h，镜下观察确定细胞贴壁，向每孔中各加入200μl所述病毒原种P1，28℃培养，感染48-72小时后，每孔收集2ml含病毒的上清培养基，500g离心5min，弃碎片收上清，以便获得P2病毒；
在25cm2培养瓶中加入1×106个细胞/ml的第四昆虫Sf9细胞悬液8ml，孵育1h，再向所述25cm2培养瓶中加入80μl所述P2病毒，28℃培养，感染72小时后，将含有病毒的培养基在500g下离心5min，弃碎片收上清，以便获得P3病毒；以及
在75cm2培养瓶中加入1×106个细胞/ml的第五昆虫Sf9细胞悬液20ml，孵育1h，再向所述75cm2培养瓶中加入300μl所述P3病毒，28℃培养，感染72h后，将含有病毒的培养基在500g下离心5min，弃碎片收上清，以便获得150ml所述重组杆状病毒表达毒种，
其中，在制备所述重组杆状病毒表达毒种的各步骤中加入的病毒量是按如下公式计算的：病毒体积＝[MOI×细胞数]/病毒滴度；其中，所述病毒滴度为病毒滴度经验值，所述病毒滴度经验值P1为1×106-1×107pfu/ml，P2为1×107-1×108pfu/ml。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组杆状病毒表达毒种包含SEQ IDNO：2所示的核酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码所述多肽的杆状病毒质粒包含SEQ ID NO：2所示的核酸序列。
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