CN113373252B - 大豆低硫胁迫特异响应基因、检测引物及其在大豆低硫养分胁迫诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大豆低硫胁迫特异响应基因、检测引物及其在大豆低硫养分胁迫诊断中的应用。所述基因包括GmSHM1、GmSHM2、GmAPR1、GmAPR2、GmAPR3、GmSSM1、GmSDI2一个或多个，其序列依次如SEQ ID NO:1～7所示或SEQ ID NO:8～14所示。所述基因可对低硫胁迫作出快速响应，2小时就被诱导。和对照养分相比，无论是短期(2小时)还是长期(10天)低硫胁迫均诱导这7个基因在大豆根叶表达，可以作为诊断大豆是否遭受低硫胁迫的分子标记。利用所述分子标记可对大豆是否处于低硫的土壤环境进行早期诊断，从而指导农业生产施硫肥，为精准农业施肥打下基础。

Description

大豆低硫胁迫特异响应基因、检测引物及其在大豆低硫养分 胁迫诊断中的应用

技术领域

本发明涉及植物营养分子标记技术领域，更具体地，涉及大豆低硫胁迫特异响应基因GmSHM1、GmSHM2、GmAPR1、GmAPR2、GmAPR3、GmSSM1、GmSDI2、检测引物及其在大豆低硫养分胁迫诊断中的应用。

背景技术

陆生植物，与动物的最大区别在于不能随着环境的改变而移动，因而植物对于瞬息万变的外界环境的适应有为重要。植物所需营养元素对植物的生长发育尤为重要，倘若某种营养元素缺乏或过多都会造成植物的不正常生长发育，从而影响植物的繁殖。

同时，植物为例适应各种逆境胁迫，要利用各种体内响应机制来适应环境的变化。大豆(Glycine max)是世界上重要的粮油作物，在土壤缺硫的条件下，大豆的植株矮小，新叶黄化，主根也比正常更短，侧根更长多，从而增加侧根总面积以增加吸收土壤中无机硫的能力。

作为豆科作物，大豆能与根瘤菌共生形成根瘤，固定空气中氮气，为植物提供氮源，改善土壤质量。大豆生长发育与固氮过程均与硫营养有密切关系。但如何准确诊断大豆是否处于低硫营养环境还存在一定的技术难度。相对来说，通过灵敏的定量PCR技术检测大豆低硫胁迫响应的基因表达水平，可以准确的诊断大豆是否遭受低硫胁迫。

目前仅有少数大豆低硫胁迫响应的基因，例如研究表明，GmSULTR1；2b受低硫胁迫诱导，特别是在根；过表达的硫酸盐转运蛋白GmSULTR1；2b不仅可以在硫充足的条件下提高植物产量，还可以在硫缺乏的条件下减少植物生产损失，与此同时提高植物对硫缺乏胁迫的耐受性(Ding Y,Zhou X,Zuo L,Wang H,Yu D.Identification and functionalcharacterization of the sulfate transporter gene GmSULTR1；2b in soybean.BMCGenomics.2016May 20；17:373.doi:10.1186/s12864-016-2705-3.PMID:27206527；PMCID:PMC4874011.)。对大豆ATPS进行克隆和特性分析，发现一个开放的阅读框，编码一个分子量为52KD的蛋白，该基因受低硫胁迫和冷害诱导。研究表明提高大豆种子发育过程中这一关键ATPS酶的表达水平，可以提高硫的利用率(Phartiyal P,Kim WS,Cahoon RE,Jez JM,Krishnan HB.Soybean ATP sulfurylase,a homodimeric enzyme involved in sulfurassimilation,is abundantly expressed in roots and induced by coldtreatment.Arch Biochem Biophys.2006Jun 1；450(1):20-9.)。因此，迫切需要提供更多大豆低硫胁迫特异响应基因为大豆低硫养分胁迫分子诊断提供更多选择。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供大豆低硫胁迫特异响应基因。

本发明的第二个目的在于提供大豆低硫胁迫特异响应基因的应用。

本发明的第三个目的在于提供用于大豆低硫胁迫特异响应基因表达量的检测引物。

本发明的第四个目的在于提供所述检测引物的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种用于大豆低硫养分胁迫分子诊断的试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明通过转录组测序和定量PCR分析，鉴定出7个大豆基因在低硫胁迫时受到显著的诱导上调。所述大豆低硫胁迫响应基因，包括GmSHM1、GmSHM2、GmAPR1、GmAPR2、GmAPR3、GmSSM1、GmSDI2，其基因组序列依次如SEQ ID NO:1～7所示，cDNA序列依次如SEQ ID NO:8～14所示。所述基因受诱导倍数较高，且受低硫胁迫快速(2小时)诱导。

进一步地，本发明通过营养液体培养，对大豆10天龄苗进行短期(2小时)和长期(10天)低硫胁迫处理，然后采集大豆根、叶，提取RNA，进行转录组测序，发现高达上千的基因转录水平受低硫胁迫诱导或下调表达。通过进一步分析，发现GmSHM1、GmSHM2、GmAPR1、GmAPR2、GmAPR3、GmSSM1、GmSDI2在根和或叶受诱导倍数较高；尤其是这7个基因均在大豆根快速受低硫胁迫诱导，是大豆对低硫胁迫的早期响应基因，可以作为表征大豆是否经受低硫养分胁迫，是大豆低硫胁迫响应的分子标记基因。在上述基础上，本发明开发设计针对这7个基因的定量PCR引物。为了进一步确定这些基因对低硫胁迫的响应，我们通过定量PCR分析了这些基因在大豆根、叶等的表达水平。另外，我们还通过转录组测序，分析了大豆根、叶等对低磷、低铁以及高铁(铁毒)响应，发现这7个基因表达水平均不受这些养分胁迫的影响。这说明，这7个基因是特异响应低硫养分胁迫。可通过单独检测上述7个大豆低硫胁迫特异响应基因进行大豆低硫养分胁迫分子诊断或同时检测7个基因中的至少两个，以提高诊断结果的准确性。

因此，本申请还提供上述大豆低硫胁迫特异响应基因作为分子标记在大豆低硫养分胁迫分子诊断中的应用。

本发明还提供用于检测上述大豆低硫胁迫特异响应基因表达量的检测引物。

优选地，所述检测引物为定量PCR引物，包括分别检测GmSHM1、GmSHM2、GmAPR1、GmAPR2、GmAPR3、GmSSM1、GmSDI2的上游引物和下游引物，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:8～7所示。

本发明还提供所述检测引物在大豆低硫养分胁迫分子诊断或在制备大豆低硫养分胁迫分子诊断试剂盒中的应用。

本发明还提供一种大豆低硫养分胁迫分子诊断方法，包括如下步骤：

S1.采集待测大豆根、叶，提取RNA，反转录成cDNA；

S2.以步骤S1所述cDNA为模板，利用上述检测引物进行定量PCR检测；根据基因是否上调表达判断待测大豆是否受低硫胁迫；若表达量上调，则表明大豆处于低硫的环境，进而指导施肥。

优选地，步骤S2所述定量PCR所述反应体系为：2×SYBR Green PCR master mix10μm，qF 0.4μm，qR 0.4μm，cDNA模板2μm，Mili-Q水补至20μm。

优选地，步骤S2所述定量PCR所述反应体系为：95℃1min；95℃15s，60℃15s，72℃30s，40个循环。

本发明还提供一种用于大豆低硫养分胁迫分子诊断的试剂或试剂盒，包含上述任一所述检测引物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了7个大豆低硫胁迫响应特异基因GmSHM1、GmSHM2、GmAPR1、GmAPR2、GmAPR3、GmSSM1和GmSDI2，可对低硫胁迫作出快速响应，2小时就被诱导。和对照养分相比，无论是短期(2小时)还是长期(10天)低硫胁迫均诱导这7个基因在大豆根叶表达，可以作为诊断大豆是否遭受低硫胁迫的分子标记。利用所述分子标记可对大豆是否处于低硫的土壤环境进行早期诊断，从而指导农业生产施硫肥，为精准农业施肥打下基础。

附图说明

图1为受低硫胁迫的大豆植株表型以及相关生物量数据。HS为正常硫水平营养液，LS为低硫营养液胁迫处理。第1片叶(1st leaf)为植株顶端往下数第一片叶，第二片叶(2ndleaf)为植株顶端往下数第二片叶，第三片叶(3rd leaf)为植株顶端往下数第三片叶。图中数据是4个生物学重复的平均值和标准误(Student’s T-test)。*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，***表示差异极其显著(P<0.001)。

图2为现有已知大豆植株根叶中低硫胁迫相关标记基因SULTR1；2b、GmATPS的表达水平。图中数据是4个生物学重复的平均值和标准误(Student’sT-test)，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，***表示差异极其显著(P<0.001)。

图3为GmSHM1和GmSHM2对大豆低硫胁迫的响应。GmSHM1在大豆根受2小时低硫胁迫诱导，在根受长期低硫胁迫(10天)诱导，在叶也受长期低硫胁迫诱导；差异达显著水平。同样地，GmSHM2在根部受短期和长期低硫胁迫诱导，在叶受产期低硫胁迫诱导，差异达极显著水平(P<0.001)；图中数据是4个生物学重复的平均值和标准误(Student’s T-test)，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，***表示差异极其显著(P<0.001)。

图4为GmAPR1、GmAPR2和GmAPR3对低硫胁迫的响应。GmAPR1在大豆根受2小时低硫胁迫诱导，在根受长期低硫胁迫(10天)诱导，在叶也受长期低硫胁迫诱导；差异达显著水平；和GmAPR1一样，GmAPR1和GmAPR2也是受短期和长期低硫胁迫诱导；图中数据是4个生物学重复的平均值和标准误，星号代表2个硫水平间差异(Student’s T-test)，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，***表示差异极极显著(P<0.001)。

图5为GmSSM1和GmSDI1对低硫胁迫的响应。根据序列分析，GmSSM1可能编码MYB类转录调节因子。GmSSM1在大豆根受2小时低硫胁迫诱导，在根受长期低硫胁迫(10天)诱导，在叶也受长期低硫胁迫诱导；差异达显著水平；GmSDI2也在大豆根快速受低硫诱导，在根和叶受长期低硫诱导；图中数据是4个生物学重复的平均值和标准误(Student’s T-test)，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，***表示差异极其显著(P<0.001))。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1大豆根叶转录组测序确定7个大豆低硫胁迫基因

根据制造商的规程，使用Trizol试剂盒提取大豆根叶总RNA。在Agilent 2100生物分析仪上评估RNA质量，并使用无RNase琼脂糖凝胶电泳进行检查。提取总RNA后，通过Oligo(dT)珠富集真核mRNA，而通过Ribo-ZeroTM Magnetic Kit去除rRNA富集原核mRNA。然后使用片段缓冲液将富集的mRNA片段化为短片段，并使用随机引物逆转录为cDNA。通过DNA聚合酶I，RNase H，dNTP和缓冲液合成第二链cDNA。然后用QiaQuick PCR提取试剂盒纯化cDNA片段，末端修复，添加poly(A)，并连接到Illumina测序接头。通过琼脂糖凝胶电泳选择连接产物的大小，PCR扩增，并使用Gene Denovo Biotechnology Co.(的Illumina HiSeq2500进行测序。

采用常规的RNA-SEQ技术，对大豆在低硫胁迫2小时的根，以及低硫胁迫10天的根和叶的转录组进行测序分析，鉴定受低硫胁迫诱导和上调的基因。通过分析筛选，发现七个受低硫诱导表达的基因，分别为GmSHM1、GmSHM2、GmAPR1、GmAPR2、GmAPR3、GmSSM1、GmSDI2，上述7个基因受诱导倍数较高，且受低硫胁迫快速(2小时)诱导；所述七个受低硫诱导表达的基因GmSHM1、GmSHM2、GmAPR1、GmAPR2、GmAPR3、GmSSM1、GmSDI2的基因序列分别如SEQ IDNO:1～7所示，cDNA序列分别如SEQ ID NO:8～14所示。

实施例2定量PCR检测GmSHM1、GmSHM2、GmAPR1、GmAPR2、GmAPR3、GmSSM1、GmSDI2对低硫胁迫的响应

一、实验方法

(1)定量PCR引物设计

根据实施例1所述GmSHM1、GmSHM2、GmAPR1、GmAPR2、GmAPR3、GmSSM1、GmSDI2基因组DNA序列，通过引物设计程序perlprimer设计特异的定量PCR引物，其序列如表1所示。

表1定量PCR引物

(2)大豆材料的种植和缺硫、缺磷、缺铁、高铁处理

a、种子消毒

将成熟、饱满的大豆种子单层排列在培养皿中，放入干燥器中，并将培养皿打开，盖子紧挨着培养皿。将100mL的次氯酸钠加至干燥器中的250mL烧杯中，然后沿着杯壁缓缓加入4.2mL浓盐酸(HCl)，立即密闭干燥器，静置10小时。从干燥器中拿出后除去过多的氯气。

b、催芽

将消毒后的种子点入湿润的石英砂中催芽萌发。

c、移苗

一周后两叶一心时选择正常、长势一致的幼苗移栽至水培系统，于温室中用1/2大豆营养液培养(配方见表2)。低硫处理的营养液把(NH4)₂SO₄用NH₄Cl代替，K₂SO₄用KCl代替，MgSO₄用MgCl₂代替；低磷处理的营养液把KH₂PO₄去除，并添加K₂SO₄用来补钾，低铁处理的营养液将EDTA-Fe去掉，高铁将EDTA-Fe浓度增加到500μM。

表2大豆水培营养液配方

d、处理

一周左右待第一片三出复叶完全展开后进行处理：正常(HS：1103.5μM)、低硫(LS：14.5μM)、低磷(LP：5μM)、高铁(HFe：500μM EDTA-Fe)、低铁(LFe：0μM EDTA-Fe)，对照(完全)营养液磷的浓度为500μM，铁的浓度为40μM，硫的浓度为1103.5μM。

每个处理4个生物学重复。

每周换一次营养液，每3天调一次pH，保持pH为5.9～6.0。

e、采样

对处理后2小时和10天的根、叶采样，液氮冷冻，-80℃保存。

(3)总RNA的提取

参照TRIzo1一步法分离总RNA。取0.2g样品放入预冷的研钵中磨成粉末状，转至1.5mL离心管，加入1mL TRIzo1提取液，剧烈震荡混匀，室温静止5分钟；加入0.2mL氯仿，大力摇动，室温静止2～5分钟，4℃下12000rpm离心15分钟；取上清转入新管，加入0.5mL异丙醇，室温放置10分钟，4℃下12000rpm离心5分钟，倒掉乙醇，风干沉淀，加入DEPC水溶液；最后测其OD值，来确定RNA的纯度和浓度。

(4)实时荧光定量PCR样品的制备及分析

用DNaseI处理总RNA以移除基因组DNA的污染，按逆转录酶说明书将RNA反转成第一条链。将所得第一链稀释10倍作为定量PCR反应模板。将适量cDNA原液做梯度稀释为标准曲线的模板。反应体系及反应条件分别见表3和表4。

表3定量PCR反应体系(总体积20μL)

表4定量PCR反应条件

用Rotor-Gene的Real-Time Analysis Software 6.0计算每个样品的表达量。

二、实验结果

受低硫胁迫10天后的表型及生理相关数据如图1所示，表明长期受低硫胁迫的大豆新叶黄化，植株较正常的更矮小，主根更短，主侧根长度差不多，根叶中总硫含量显著低于正常植株。

以大豆看家基因GmEF1a(Glyma.17g186600)为参照基因(其引物序列为GmEF1a-qF:tgcaaaggaggctgctaact，GmEF1a-qR:cagcatcaccgttcttcaaa)，相对表达量为目的基因的表达量与看家基因表达量的比值。分析大豆SULTR1；2b、ATPS在不同硫水平的表达模式(图2)，发现大豆SULTR1；2b在根受短期(2小时)和长期(10天)低硫胁迫显著上调达，叶中也有被上调表达，ATPS在叶受长期低硫胁迫上调表达，这些结果与已有文献结果一致，证明大豆确实处于低硫养分环境。

图3结果表明：GmSHM1和GmSHM2基因在大豆叶和根均受低硫诱导上调表达。图4结果表明，GmAPR1、GmAPR2和GmAPR3在大豆根受2小时低硫胁迫诱导，在根受长期低硫胁迫(10天)诱导，在叶也受长期低硫胁迫诱导。图5结果表明，GmSSM1和GmSDI1在大豆根受2小时低硫胁迫诱导，在根受长期低硫胁迫(10天)诱导，在叶也受长期低硫胁迫诱导表达。

实施例3转录组测序分析GmSHM1、GmSHM2、GmAPR1、GmAPR2、GmAPR3、GmSSM1、GmSDI2对低磷、低铁以及铁毒的响应

为了进一步明确上述7个基因是否专一的受低硫胁迫诱导，我们对大豆在低磷、低铁以及高铁(铁毒害)条件下转录组进行了测序分析，如表5所示，发现GmSHM1、GmSHM2、GmAPR1、GmAPR3、GmSDI2、GmSSM1转录水平均不受磷水平及铁营养水平的影响；而GmAPR2仅在大豆叶受高铁下调。

表5 7个基因对低磷、低铁以及铁毒的响应

注：表中LS-2h-R表示低硫处理两小时后的根样，LS-10d-R表示低硫处理十天后的根样，LS-10d-L表示低硫处理十天后的叶样，LP-10d-R表示低磷处理十天后的根样，LP-14d-L表示低磷处理十天后的叶样，low F-R表示低铁处理下根，high Fe-R表示高铁处理下根。UP,上调；Down:下调。

这些结果表明，上述7个基因较特异的受低硫胁迫诱导表达，可以作为分子标记基因，在农业生产和基础研究方面，作为低硫响应基因来诊断(或判断)大豆是否处理低硫胁迫环境，这样可以在大田农业生产中开发分子诊断试剂盒，特别是这些基因在低硫胁迫2小时就上调表达，可以作为分子标记来对大豆是否处于低硫的土壤环境进行早期诊断，从而指导农业生产施硫肥，为精准农业施肥打下基础。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 大豆低硫胁迫特异响应基因、检测引物及其在大豆低硫养分胁迫诊断中的应用

<141> 2021-03-18

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5706

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 1

atggttgacc acgatttgca acaagaaact caaagtgaac ctagacctga ttccatccag 60

gtggtcgtat gacatattcc cataattagt agacaattaa tttaaggtta atgtgtgttt 120

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agaattggtg agtacctctc atatagtacg actgaagtat ggtattacta ttagactatt 4620

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gctccaactt ccacatattt aacaaatggt cctcaaaagt cctattttct agagaattga 4860

ttggtggaaa gaaataaatg tgtatttatc atgcttacag actaccattt ccttgtgcag 4920

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atcttatgtt gacttagcag acaagttagc agggtcaaca gggatgaagg ttggaaaatt 1560

tagagcagat ggagaacaga aagaatttgc aaagagtgaa ctgcaattc 1609

<210> 11

<211> 1964

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 11

ttcacgccac gtaagcaaaa cgaagatagc aagaattgcg tccagattcc ttctccaaca 60

atggctctcg ccgtttccac tacttcttcc tcttcagcag ctgctgcagc ttctagctcc 120

ttcttctctc gtctcggatc ttcctccgac gcaaaagctc ctcaaatcgg ttcgtttcgg 180

tttccggaga ggtcgcttgt ttcgtctgtt gttgtcaatg taactcaacg acgctccttg 240

gtgaggccac tcaacgccga accgcaacgg aacgattcta ttgttcctct tgcagcaact 300

atcgttgctc ctgaggttga gaaggaagag gaagattttg agcaaatagc gaaagacctt 360

gaaaatgcat ctcctcttga aattatggat agggccctcg agaaatttgg gaacgacatc 420

gctattgcat ttagtggtgc tgaagatgtt gctttgattg agtatgcaca tttgacgggt 480

cgaccctaca gagtgtttag tcttgacact gggagactga atccagaaac ctacaaattt 540

tttgatgcgg ttgagaagca ttatggaatt cacattgagt acatgttccc tgatgcggtt 600

gaggttcagg cattagtaag aactaaaggg ctcttctcat tttacgagga tgggcatcaa 660

gagtgctgcc gagtaaggaa ggtgaggccc ttgaggagag cccttaaggg tctcaaagca 720

tggatcactg gacagagaaa agatcagtct cctggtacta ggtctgaaat ccctgttgtc 780

caggttgatc ctgtttttga gggactggat ggtggaattg gcagcctggt gaagtggaac 840

ccggttgcaa atgttaatgg tctagacata tggagcttcc ttaggaccat ggatgttcct 900

gtaaattcat tgcattccca aggatatgtt tcgattggct gtgagccgtg cacaaggcca 960

gttttaccgg gtcaacatga aagagaagga aggtggtggt gggaggatgc caaagccaag 1020

gagtgtggtc ttcacaaagg taatataaaa catgaagatg ctgcccagct taatggaaat 1080

ggggcctccc aagcaaatgg atctgccact gtcgctgaca ttttcaactc ccaggatgtg 1140

gtcagcttga gcaggtctgg gattgagaat ttggcaaaat tggagaaccg aaaagaaccc 1200

tggcttgttg tgctctatgc accatggtgc cgcttctgtc aggctatgga ggaatcatat 1260

gttgatttgg cagaaaagtt agctgggtca ggagtgaagg ttgcaaaatt cagagcggat 1320

ggagaccaga aggaatatgc aaagactgaa ctgcagttgg gaagcttccc cacaatacta 1380

ctcttcccca aacactcttc tcaaccaatt aagtaccctt cggaaaagag agatgttgat 1440

tcattgacgg cattcgtgaa tgctttacgg tgatggttaa ttgagtatct tgctcaatgt 1500

tccgtcgtac aataccggca ataaatttct tcacagtttt ggcaattcac tgaaaatggg 1560

aatggcagtt ttgacagcaa aacgaagatt ctcagctaga agtatccctg tataggttta 1620

gataatcttc ctcacaaata taattgtagt agtcattctg agaatgtgat ttcctgtttt 1680

gttagatgag tagagttatg gttgtattat gttgtttctt cactatcata atctacgttt 1740

ttagttttgc cagatttcca agaacgaagg ctaaatagtt cagcttatgt tccgtgtgaa 1800

ataatagtgt ccctgtctcg tatgttttca tggaatggtt ctgttaaaat gttctagcca 1860

caacggaaca aaaaccaatt tggatttgat cattggtttc ctatgtttct ttcctgcaat 1920

gagtatgcaa taacatgtat ccgtgcaata ttactttttt caag 1964

<210> 12

<211> 2014

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 12

gtccaggttc aaatgcactc ctctttataa tgaaaacttc attctccttc atgtctctga 60

gaaataacca acagaatcta ctctctattt tcctagctta gattccttct ccaatggctc 120

ttgccgtttc cactacttct tcctcttcag ctgcagcagc agcagcagcg tcgagctctt 180

tcttctcgcg ccttggatct tcatcggacg ctaaagctcc gcaaattggt tcctttcggt 240

ttccggagag gcctcaagtt tcgtctggtg ttgttaattt aactcaaaga cgctcctcgg 300

tgaggccact caatgccgaa ccgcaacgga atgattctgt tgttcctctt gcagcaacta 360

tcgttgctcc tgaggttgag aaggagaaag aagattttga gcaattagcg aaagaccttg 420

aaaattcatc tcctcttgag attatggata aggccctcga gaaatttggg aacgacatcg 480

ctattgcctt tagtggtgct gaagatgttg ctttgattga gtatgcacat ttgacgggtc 540

gaccctacag agtgtttagt cttgacactg ggagactgaa cccagaaacc tacaaatttt 600

ttgacgctgt tgagaagcat tatggaattc atattgagta catgttccct gatgcggttg 660

aggttcaggc attagtaaga actaaggggc tcttctcatt ttacgaggat gggcatcaag 720

agtgctgtag agtaagaaag gtgaggccct tgaggagagc ccttaagggt ctcaaagcat 780

ggattactgg acagagaaaa gaccagtctc ctggtactag gtctgaaatc cctattgtcc 840

aggttgatcc tgtttttgag ggactggatg gtggaattgg cagcctggtg aagtggaacc 900

cggttgcaaa tgttaatggt ctagacatat ggaacttcct taggaccatg aatgttcctg 960

taaattcatt gcattcccaa ggatatgttt cgattggctg tgagccatgc acaaggccgg 1020

ttttacccgg acaacatgaa agagaaggaa ggtggtggtg ggaggatgcc aaagccaagg 1080

agtgtggtct tcacaaaggt aatttgaaac aggaagatgc tgcccagctt aatggaaatg 1140

ggacctccca aggaaatggc tctgccactg ttgctgacat tttcatctcc cagaatgtgg 1200

tcagcttgag caggtccggg attgagaatt tggcaaaatt agagaaccga aaagaacact 1260

ggcttgttgt gctctatgca ccatggtgcc gcttctgtca ggctatggag gagtcgtatg 1320

ttgatctggc agagaagtta gcaaggtcag gagtgaaggt tgcaaaattc agagccgatg 1380

gagagcagaa ggaatatgca aagagtgaac tgcagttggg aagcttcccc acaatacttc 1440

tcttccccaa gcactcttct caaccaatta agtacccttc agaaaagaga gatgttgatt 1500

cattgacggc attcgtgaat gccttacggt gatggtcaat tgagtatctt gctcaatgtt 1560

ccgtcgtacc ataccggcaa taaatttctt cacagatttg ggcaattcac tgaaaatggg 1620

aatggcagtt tttgatagca aaacgaagat tctcagctag cagtatccct gtatagattt 1680

agataacctt cctcacaaat ataattgtag tagtcatgag gaggatgtga tttcctgttt 1740

tgttagatga gtagagttat ggttgtatta tgttgtttct tcactatcat aatctacttt 1800

tttagatttt gccaaattta caagaacgaa cgtctaacct actgtgaagt cttatgttcc 1860

gtgtgcaata atgtccctgt cacgtatgtt ttcatggact ggtgcagtca aaatgttcta 1920

gccacaacgg aacaaaaatc catttggatt tgatcattgg tttcctatgt tttttttcct 1980

gaaatgagta cacgtgatag catgtatacg tctc 2014

<210> 13

<211> 1585

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 13

aaaaagtagg gactgttaat taatggcttt tttgttttcg taactgagtt tggcatataa 60

atgagcatat cacagaagtg gagtaactaa atctgcataa gagtttgaga ctttaggtta 120

tataggttga gagaagcatg tatcagtata gttcccaact atacggaact gaatgggagt 180

cctacatggg gattagcaac ctagacaagg ttgttggatc agaacaactg agttttgagc 240

ccacaaaatc acccttcaac attgtgacaa ctcctcttca aattactcca ccaggttttt 300

gtgcaagtgc aatcaaaagc cttgtgagtt ttcaagctca gcaacaacaa caacatgctc 360

atcaccagca tcagattgaa gttccagctg cttggtgctt tgagtttcca aagacgacaa 420

caacaacaga tacgcacatg gtgatgaaca atatttgcca agcctctgga gataacttca 480

ccacaaaaca agatcgacca tcgtctcaat tcacaagctc cttcttgtct agcagtggtg 540

cagattgccg ttcttcttct gaaaaatatt gtaaaattgc ttcttattcc gaagaaaaac 600

atagtagcat tcagcctgat agtattcaat attacgacct ctattcacaa gaagatgata 660

aattactgag ggatgatgct gccacggatg aagggcccct tgaaatttcc tttcagagaa 720

atcagttgga ctcgtgtaca aagcgagaaa agcaagctcc tcatcgaact tgtggtgttg 780

cctgtgtagc ttctaggaga ggcaaaagaa gaataaaatg gaccaaagat ctgcatgagc 840

catttatgat gattgtcaat agccttggtg gtcccgaaaa ggcaaagcct aaagctatac 900

tagatatgat gaaatcagat ttgctgtcca tttctcacgt taaaagccat ttgcagaaat 960

gtaggtctac tatacacatg cacaaagctt tgcaggaaag atctgagaaa ggacagagaa 1020

ctaatggggt gtctgagctt caagtcaaaa tccatatgca aattgaggaa tcacggcaac 1080

tacaactaga gatccggaga aatatatgcc aacaactaaa gatgcaacga aatttgcaca 1140

ctctaattca agagcagagt cagcagctca aagtaatgtt agattaccaa aaggaaagaa 1200

ccaaactgga gaagacccct tacacagaac tggaagctac tgtccccaaa tgatgggtca 1260

attgttttga taaagttact ctattttcct agctctgtca tgtggcatgg ctatgactta 1320

tgcaaacacc atgttgctgc ctttgttttg caataggcaa atcaagcatg taagtgtaag 1380

aaaccatttt ttgggcagtt acttcaaaat gtaagcatgt cttgtatgct cttattgagc 1440

actcccacac aaatttcaca cagcattcac acacaaggag agttgtcaca aaattaagag 1500

aaaaaatgaa aacactattc actgtgaggg tcttatacaa acaatatgat actcttgtat 1560

ttattaatta tacggtttat tgtta 1585

<210> 14

<211> 1355

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 14

gcacacccgt ccaggttcac aatgttgttg ttgttcatct tcttctcatc ctttgttcct 60

cctttcacaa ctccaaagtt gaaactcgaa agcgcgtaat attaataatc gtaacaaaca 120

agagagagaa cagaactact actgtttctt tttttgcctt tgtttctctg cccctttgtg 180

cagcgtctca cacaccaatg gaagaaccaa gtggttgcaa caagagcgct ccaaaaggaa 240

aaaaggatga cctttaccat gtacttcaca aggtccctta tggagatagc ccttatgtca 300

gagctaagca tgcccagctg gtagaaaagg acccggaagc tgcaattgta ttattttgga 360

aagcaataaa ttctggggat aaagtggaca gtgctctaaa ggatatggca gtagtgatga 420

agcaattgga cagatctgat gaagccattg aagccattcg ttcatttaga agcctttgct 480

ccaaacaatc ccaagagtcc cttgataatg tactaataga tctttataag aaatgtggaa 540

aaatagatga gcaaatagaa atgctgaagc gaaagttgaa gttgatctac caaggtgagg 600

ccttcaatgg gaaactcacc aagacagcaa ggtctcatgg caagaagttc caagtttcta 660

tcaaacaaga aacttcaaga ttactgggaa acctgggctg ggcctatatg caaaagatga 720

actacatgat ggctgaggtg gtgtatcgga aagcccaaat aattgatccg gattgtaaca 780

aggcctgtaa cttgggcctg tgcctcatca gacaagccag atatgaagag gcacaattgg 840

ttcttgaaga tgtattaaaa ggaaatcttc ccggctcaga tgatagcaag gcaaggaaac 900

gggcccaaga tctccgaaca gagttgagat ccatgctacc gccaccacat ttctcagatc 960

ttttgggcct agatgatgag ttcatcaaag gactggaaca attgatgaat gaatggggcc 1020

caattagatc aaagagactt ccaatttttg aggagatttc ttcatttaga gatcaattag 1080

catgttaagt tcatactttg tgtatatagc tttcatacat tgggttgggt aataggtgtt 1140

tatgaagaac tagcttcttt ttgttttctt tttcctattt ttgatgaagt ggtgggtgtt 1200

gctttttttg taagagtgag gaattaaata gagtgaagaa cttgatgtaa attaattatg 1260

aaaacaaagt aataagccta gtattttata aactccaata agaagttatt gcaagtcttc 1320

ttttagttta ggtttattta gaagcaaaga tgaaa 1355

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 15

tttgccttat aaggttaatc cgcag 25

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 16

ctagctactt ccttagccgc t 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 17

gtgagaattg gtactcctgc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 18

aactgaatgt ctcaacccga 20

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 19

atttatctca aagacggagc ttgg 24

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 20

tcttcagcac cactgaagg 19

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 21

atctgccact gtcgctg 17

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 22

gtctttgcat attccttctg gtc 23

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 23

tctgtcaggc tatggaggag 20

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 24

ctttgcatat tccttctgct ctc 23

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 25

acaagatcga ccatcgtctc 20

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 26

cacgagtcca actgatttct ctg 23

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 27

gattactggg aaacctgggc 20

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 28

ccttgccttg ctatcatctg ag 22

Claims (3)

1.一种用于检测大豆低硫养分胁迫相关分子标记表达量的引物在大豆低硫养分胁迫分子诊断或在制备大豆低硫养分胁迫分子诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述分子标记为GmSHM1、GmSHM2、GmAPR1、GmAPR2、GmAPR3、GmSSM1和GmSDI2，其基因组序列依次如SEQID NO:1～7所示，cDNA序列依次如SEQ ID NO:8～14所示；所述引物为定量PCR引物，包括分别检测GmSHM1、GmSHM2、GmAPR1、GmAPR2、GmAPR3、GmSSM1、GmSDI2的上游引物和下游引物，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:15～28所示。

2.一种大豆低硫养分胁迫分子诊断方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.采集待测大豆根、叶，提取RNA，反转录成cDNA；

S2.以步骤S1所述cDNA为模板，使用权利要求1中所述引物进行定量PCR检测；根据所述分子标记是否上调表达辅助判断待测大豆是否受低硫胁迫。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤S2所述定量PCR的反应程序为：95℃ 1min；95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，40个循环。

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