JPH11289916A - 牛の筋肉組織の培養細胞を用いて受胎可能な体細胞核移植クローン胚の 作出及びクローン胚を凍結保存する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 牛の体細胞核移植クローン胚の作出におい
て、どのような牛からでも採取できる体細胞、体細胞の
簡易な培養方法、作出した牛体細胞クローン胚の受胎可
能な凍結方法を解決する。 【課題解決手段】 牛の筋肉組織由来の細胞を培養し、
１０％の割合で牛胎児血清を添加した市販のダルベッコ
の修正イーグル培養液（Ｄ−ＭＥＭ）で培養した細胞を
核移植のドナー核として用いることにより、効率的に借
り腹牛へ移植できる胚盤胞期のクローン胚が作出でき、
１０％グリセロール液と０．６Ｍ蔗糖液によるストロー
内１段階希釈方法により凍結すれば受胎させることがで
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生きている牛のコ
ピー牛を作成するため、筋肉組織を培養後、発生した細
胞を継代培養し、細胞周期を休止期に誘導する処理をし
ないで、供与核（ドナー核）とした核移植により、クロ
ーン胚の作出とクローン胚を凍結保存する技術である。

【０００２】

【従来の技術】哺乳動物の体細胞核移植クローンは、羊
の培養乳腺細胞を５日間０．５％の血清を加えた低栄養
の培養液で培養すること（飢餓培養）により、細胞を細
胞周期の休止期（Ｇ０期）に誘導でき、その処理細胞を
ドナー核とすることによって、体細胞クローン羊が１９
９７年に英国で誕生した。（Ｎａｔｕｒｅ，３８５：８
１０−８１３（１９９７） Ｂｉｏ，Ｒｅｐｒｏｄ，．
５０：１３８７−１３９３（１９９４） Ｎａｔｕｒ
ｅ，３８０：６４−６６（１９９６））

【０００３】体細胞クローン羊のドナー核として用いら
れた体細胞は乳腺細胞である。

【０００４】体細胞クローン羊では、０．５％血清で５
日間培養し、細胞周期を休止期に誘導した細胞をドナー
核として使っている。

【０００５】体細胞クローン胚の受胎可能な凍結保存方
法がこれまで確立していない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ドナー核として用いら
れる乳腺細胞は、子牛を分娩することによって乳腺細胞
が発達することから、雄牛や子牛からこの部位の細胞を
採取することは難しく、乳腺以外の部位の細胞をドナー
核の細胞とする必要がある。

【０００７】細胞周期の調整のため、０．５％血清中で
５日間培養することで、核移植を実施する日が特定され
ることから、受核卵となる未受精卵子をこれに合わせて
準備しなければならない。

【０００８】本発明は、牛の体細胞クローン胚を作出す
るため、ドナー体細胞を乳腺細胞に替わる細胞で体細胞
核移植クローン胚を作出することを目的としており、体
細胞の培養方法を改良して体細胞核移植クローン胚を簡
易に作出する方法並びにその凍結保存方法を提供する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
め、本発明は牛の体細胞核移植クローン胚を作出するた
め、体細胞の採取部位、体細胞の培養方法の改善とそれ
により作出した体細胞クローン胚の受胎可能な凍結方法
を実現している。

【００１０】牛の体細胞核移植クローン胚の作出に用い
る培養体細胞を、どのような牛からでも採取できる筋肉
組織をもちいて作成する。

【００１１】その採取方法は

【図１】に示したように、採取する牛に浅い麻酔を施
し、採取部位からバイオプシー針を使って採取する。

【００１２】最も採取しやすい部位は、季肋骨（最後の
肋骨）部位近くの胸最長筋で、採取部位を４ｃｍ角に剃
毛後、洗浄して７％消毒用アルコールと希ヨード液で消
毒した後、バイオプイシー針を刺す皮膚部分をバイオプ
シー針が通る程度に先鋭のメスで切る。

【００１３】１４ゲージのバイオプシーニードル（Ｂａ
ｘｔｅｒ社、米国）を切皮部から刺して筋肉組織を採取
する。このパイオプシーを３回繰り返し、採取した筋肉
組織を組織培養液のハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ液）に入
れる。

【００１４】ハンクス液で洗浄後、コラゲナーゼｔｙｐ
ｅＩを１ｍｇ／ｍｌ含んだハンクス液１０ｍｌを入れた
ディスポーザブル５０ｍｌ遠心管に筋肉組織を入れて、
３８℃の恒温水槽中で１２０サイクル／分で２０分間左
右にシェークして組織を消化分散処理を行う。

【００１５】終了後、これに１０％に牛胎児血清（ＦＢ
Ｓ）を加えたダルベッコのＭＥＭ培養液（Ｄｕｌｂｅｃ
ｃｏ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕ
ｍ、以下Ｄ−ＭＥＭ）を２０ｍｌ加え消化分散作用を停
止させ、これを４８５×Ｇの回転で５分間遠心分離す
る。１０％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭで更に２回遠心分離後、
上清を捨て沈殿している分散細胞を集める。

【００１６】この分散した細胞を２５ｃｍ^２スタイルの
ディスポーザブル培養フラスコの１０％ＦＢＳ加Ｄ−Ｍ
ＥＭ１０ｍｌに播種し、３９℃、５％ＣＯ２、９５％空
気の湿潤気相下で７〜１０日間培養する。細胞がコンフ
ルエントな状況にフラスコ底面全体に単層に増殖したも
のを継代培養する。

【００１６】継代培養は、培養フラスコ内の培養液を捨
てた後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ⁻）７ｍｌで２回洗浄
し、同液で作成したＥＤＴＡを０．１Ｍ／ｍｌを補足し
た０．２５％トリプシン２ｍｌを入れて３９℃のインキ
ュベーター内に２分間置いて、細胞を消化分散する。

【００１７】消化分散後、１０％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭを
７ｍｌ加えて反応停止し軽くピペッテングした後、１０
ｍｌのデスポザブル遠心管に入れ４８５×Ｇの回転で遠
心する。上清を除去し更にもう１回１０％ＦＢＳ加Ｄ−
ＭＥＭ９ｍｌを入れて遠心分離して細胞を洗浄する。

【００１８】この沈殿物（細胞）を新たに上記培養液の
入った２５ｃｍ２スタイルのディスポーザブル培養フラ
スコに播種する（継代２代目細胞）。

【００１９】この継代処理の３代目に、１５０ｃｍ^２ス
タイルの培養フラスコに接種して、細胞数を増加させ、
４代目の継代処理時に細胞の凍結保存を行い、一部をド
ナー核用の培養細胞とする。

【００２０】培養細胞の凍結保存方法は、１０％ＦＢＳ
加Ｄ−ＭＥＭに１０％の濃度になるようエチレングリコ
ールを加えた凍結用液中に細胞を入れ０．２５ｍｌのス
トローに充填後、プログラムフリーザーのアルコールバ
ス中の−７℃に１０分間置く。入れた後２分後に液体窒
素で冷やしたピンセットでストロー内で凍結液の充填さ
れている部分の端をつまみ強制的に氷を作る（植氷）。
１０分経過後、−３０℃まで１分間に０．３℃の割合で
冷却する。終了後液体窒素に投入して保存する。細胞の
凍結は、体細胞核移植用に使っている細胞が絶えてしま
ったときに融解して培養すれば、継代４代目として新た
に使うことができる。

【００２１】継代４代目の培養を行っている細胞から、
体細胞核移植クローン胚のためのドナー核として

【００１６】と同じ処理を行い、細胞を１個１個に分散
して用いる。

【００２２】羊の乳腺細胞による体細胞クローン胚作出
法では、０．５％血清を加えた培養液で５日間培養し
（血清飢餓培養法）、その細胞群の細胞周期をＧ０期に
することにより、核移植後の核の初期化が可能となり、
分化した体細胞を使って子羊の生産に成功したというこ
とが報告されている。（Ｎａｔｕｒｅ，３８５：８１０
−８１３，１９９７）

【００２３】しかし、ここで提供する方法は上記の血清
飢餓法をすることなく、１０％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭで培
養したものを用いることによって、牛の体細胞核移植ク
ローン胚が効率的に作出でき、その胚は借り腹牛の子宮
内で受胎できる。

【００２４】体細胞核移植の方法

【図２】は、前日屠場卵巣から採取した未成熟卵母細胞
を５％子牛血清加ＴＣＭ−１９９培養液で２０〜２１時
間５％ＣＯ２、９５％空気の湿潤気相下のインキュベー
ターで成熟培養し、成熟卵母細胞（成熟卵子）にする。

【００２５】成熟培養後、成熟した卵子を選別し、５μ
ｇ／ｍｌサイトカラシンＢ液中で、第一極体近くの透明
帯をガラス微細針で切開し、ガラス微細針で透明帯の上
から押して第一極体を含む細胞質の約１／３押し出し、
成熟卵子内の核を取り出す（除核卵子）。

【００２６】サイトカラシンＢ液中で除核卵子の囲卵腔
内に体細胞を挿入するが、除核卵子の細胞質膜と体細胞
が接着するように挿入する（集合卵子）。

【００２７】チンマーマン細胞融合液（Ｚｉｍｍｅｒｍ
ａｎｎ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎｍｅｄｉｕｍ）を入れ
た１ｍｍ間隔のワイヤーチャンバー内に集合卵子を細胞
膜接着部分がワイヤー電極と平行になるよう入れ、７０
０〜１，０００ｖ／ｃｍの直流電流を５０μ秒間２回印
加する（融合処理）。

【００２８】融合処理後、５％子牛血清加ＴＣＭ１９９
で作成した１０μＭのカルシュームイオノホアＡ２３１
８７液に遮光条件で５分間、ついで１０μｇ／ｍｌのシ
クロヘキシミド液に４〜５時間入れ、細胞質の活性化処
理とＭ期促進因子（ＭＰＦ）活性を低下させる。

【００２９】上記処理終了後、ミネラルオイルを覆った
３５×１０ｍｍスタイルのミニシャーレ内の１００μｌ
のＣＲ１ａａ培養液中で２０個前後の融合卵子を

【００２３】の気相と温度の条件下で８日間培養する。

【００３０】培養６〜８日目に

【図４】に示したように、体細胞核移植胚は３５％前後
の割合で、借り腹に移植可能な胚盤胞〜拡張胚盤胞期に
発育する。

【００３１】この体細胞核移植クロンー胚は

【図５】に示したように、凍結または凍結することなく
借り腹牛に移植し、受胎させることができる。

【００３２】この体細胞の核移植クローン胚の凍結は、
２０％子牛血清加ダルベッコのリン酸緩衝液で１０％グ
リセロール液、０．６Ｍ蔗糖（シュークロース）液を作
成し、０．３％グリセロール液、６．６％グリセロール
液、１０％グリセロール液にそれぞれ１０分間浸漬して
最終濃度１０％グリセロール液への平衡を行い、

【図３】のように０．２５ｍｌプラスチックストローに
充填する。

【００３３】プログラムフリーザーのアルコールバス中
で、室温（約２２℃）から−５．５℃まで１分間に１℃
の割合で冷却し、途中−３．５℃で液体窒素に浸け冷や
したピンセットにより、プラスチックストローの胚のあ
る場所から５ｃｍ離れた部分掴み強制的に氷を発生さ
せ、過冷却になるのを防止する。−５．５℃に１０分間
置いた後、−３５℃まで１分間に０．３℃の割合で冷却
後液体窒素中に投入する。

【００３４】ストローは液体窒素中で保存し、使用時に
液体窒素から取り出して、室温に６秒晒した後３５℃の
温水で１５秒間浸漬して融解する。この融解ストローの
熱シール部分を持って体温計を振るように１〜２回振り
下ろし、気泡を除去して耐凍剤グリセロールの除去をス
トロー内で行う。熱シール部分を上にして立て、１０分
間保持する。この後、ストローを消毒用アルコールで清
拭後、ストローカッターで熱シール部分の近くを切除し
て移植器に装着して借り腹牛の子宮内に移植する。

【発明の効果】本発明は、以上説明したように構成され
ているので、以下に記載されるような効果を奏する。

【００３５】牛の筋肉組織を培養して発生した細胞を体
細胞核移植クローン胚の作出のためのドナー核とするこ
とから、乳腺細胞と異なりどのような牛からも採取でき
る。

【００３６】とくに能力の判明している優秀種雄牛のコ
ピー牛が生産できるので、改良がスピードアップし、そ
の経済効果が著しい。

【００３７】また、優秀雌牛の増産によって、雌牛側か
らの改良も飛躍的に進展する。

【００３８】１０％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭで培養した細胞
を使うことから、０．５％ＦＢＳ添加による飢餓培養を
５日間することなく、何時でも体細胞核移植が可能であ
る。

【００３９】現在まで、国内外で凍結保存後の牛体細胞
核移植クローン胚の受胎例はなく、ここに提供した凍結
方法によって借り腹に受胎させることが可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】体細胞核移植の実施過程である。

【図２】筋肉組織の採取と体細胞の分離、培養方法の流
れずである。

【図３】体細胞核移植クローン胚の凍結のためのプラス
チックストローへの充填方法である。

【図４】牛の体細胞核移植によるクローン胚の発生割合
である。

【図５】凍結又は凍結していない牛の体細胞クローン胚
の借り腹牛への移植後の受胎成績である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 体細胞核移植クローン胚作出に用いる体
   細胞を、筋肉組織から採取し、消化分散処理後、培養液
   によって発育した細胞をドナー核として使うことによ
   り、体細胞クローン胚の作出並びにそのクローン胚を借
   り腹牛で受胎させることができる。
2. 【請求項２】 ドナー核として用いる体細胞は、従来
   の処理方法で不可欠とされていた０．５％の血清添加培
   養液で５日間飢餓培養して細胞周期の休止期に誘導する
   ことなく、１０％の割合で牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加
   した市販のダルベッコの修正エーグル培養液（Ｄ−ＭＥ
   Ｍ）で培養した細胞を使うことにより、体細胞核移植ク
   ローン胚の作出ができる。
3. 【請求項３】 凍結液として２０％の割に子牛血清を添
   加したダルベッコのリン酸緩衝液（ｍ−ＰＢＳ）に１０
   ％の割合で添加したグリセロール液と耐凍剤除去液の
   ０．６Ｍ蔗糖液によるストロー内１段階希釈法により、
   牛の体細胞クローン胚を凍結保存し、融解後借り腹牛に
   移植すれば受胎させることができる。