JP2005507637A - 改変され安定化されたgdfプロペプチドおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
(発明の分野)
本発明は、増殖分化因子8(GDF−8)タンパク質のインヒビターおよびその使用方法に関する。より詳細には、本発明は、GDF−8の活性を阻害する、GDF−8タンパク質の改変され安定化されたプロペプチドを提供する。本発明は、骨格筋組織の増加が治療上有益であるヒト障害または動物障害を予防または処置するために特に有用である。このような障害としては、筋障害または神経筋障害(例えば、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮症、うっ血性閉塞性肺疾患、筋るいそう症候群、筋肉減少症(sarcopenia)、悪液質)、代謝疾患または代謝障害(例えば、2型糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、高血糖症、または肥満)、脂肪組織障害(例えば、肥満)、または骨変性疾患(例えば、骨粗鬆症)が挙げられる。
【背景技術】
【0002】
(発明の背景)
増殖および分化因子8(GDF−8)(ミオスタチンとしても公知)は、構造的に関連する増殖因子のトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)スーパーファミリーのメンバーであり、このスーパーファミリーはすべて、重要な増殖調節特性および形態発生特性を有する(Kingsleyら(1994)Genes Dev.8:133−46;Hoodlessら(1998)Curr.Topics Microbiol.Immunol.228:235−72)。GDF−8は、骨格筋量の負のレギュレーターであり、その生物学的活性を調節する因子を同定することにかなり興味が存在する。例えば、GDF−8は、発生中および成体の骨格筋において高度に発現される。トランスジェニックマウスにおけるGDF−8ヌル変異は、骨格筋の顕著な肥大および過形成により特徴づけられる(McPherronら(1997)Nature 387:83−90)。骨格筋量における同様の増加が、ウシにおける天然に存在するGDF−8の変異において明らかである(Ashmoreら(1974)Growth 38:501−507;SwatlandおよびKieffer(1994)J.Anim.Sci.38:752−757;McPherronおよびLee(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:12457−12461;Kambadurら(1997)Genome Res.7:910−915)。最近の研究はまた、ヒトHIV感染に関連する筋るいそうが、GDF−8タンパク質発現の増加を伴うことを示した(Gonzalez−Cadavidら(1998)PNAS 95:14938−43)。さらに、GDF−8は、筋特異的酵素(例えば、クレアチンキナーゼ)の生成を調節し得、そして筋芽細胞増殖を調節し得る(WO00/43781)。
【0003】
骨格筋におけるその増殖調節特性および形態発生特性に加えて、GDF−8はまた、多数の他の生理学的プロセス(例えば、グルコースホメオスタシス)および異常な状態(例えば、2型糖尿病および脂肪組織障害(例えば、肥満)の発症)に関与し得る。例えば、GDF−8は、脂肪細胞へのプレ脂肪細胞の分化を調節する(Kimら(2001)B.B.R.C.281:902−906)。
【0004】
TGF−β−1、TGF−β−2、およびTGF−β−3と同様に、GDF−8タンパク質は、前駆タンパク質として合成され、この前駆タンパク質は、アミノ末端プロペプチドおよびカルボキシ末端成熟ドメイン(McPherronおよびLee、1997(上記))、ならびにこのタンパク質を細胞外ドメインに指向しこのタンパク質から切除されるシグナル配列からなる。このプロペプチドの切断の前に、この前駆体GDF−8タンパク質は、ホモダイマーを形成すると考えられる。その後、このアミノ末端プロペプチドは、成熟ドメインから切断され、切断されたプロペプチドは、成熟ドメインダイマーに非共有結合したままであり得、それにより、その生物学的活性が阻害される(Miyazonoら(1988)J.Biol.Chem.263:6407−6415;Wakefieldら(1988)J.Biol.Chem.263:7646−7654;およびBrownら(1990)Growth Factors 3:35−43)。2つのGDF−8プロペプチドが、このGDF−8成熟ダイマーに結合すると考えられる(Thiesら(2001)Growth Factors 18:251−259)。この不活化特性に起因して、このプロペプチドは、「潜伏関連ペプチド」(LAP)として公知であり、成熟ドメインとプロペプチドとの複合体は、一般的に「小潜伏複合体」と呼ばれる(GentryおよびNash(1990)Biochemistry 29:6851−6857;Derynckら(1995)Nature 316:701−705;およびMassague(1990)Ann.Rev.Cell Biol.12:597−641)。この成熟ドメインは、このプロペプチドが除去されたときに、ホモダイマーとして活性であると考えられる。他のタンパク質もまた、GDF−8または構造的に関連するタンパク質に結合してそれらの生物学的活性を阻害することが、公知である。このような阻害タンパク質としては、フォリスタチン(Gamerら(1999)Dev.Biol.208:222−232)およびフォリスタチン関連タンパク質が挙げられる。
【0005】
さらに、多数のヒト障害および動物障害が、筋組織の損失または筋組織の機能的損傷に関連しており、そのような障害としては、筋ジストロフィー、筋萎縮症、うっ血性閉塞性肺疾患、筋るいそう症候群、筋肉減少症(sarcopenia)、および悪液質が挙げられる。現在までに、これらの障害について、非常にわずかしか信頼できる治療または有効な治療が存在しない。これらの障害に関連する厳しい症状は、これらの障害に罹患している患者における筋組織の量を増加する治療を使用することによって、実質的に減少され得る。このような治療は、これらの患者の生活の質を有意に改善し、そしてこれらの疾患の多くの効果を軽減し得る。したがって、これらの障害に罹患している患者における筋組織の全体の増加に寄与する新規な治療を同定する必要性が、当該分野において存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、その生物学的活性を保持しかつGDFタンパク質の活性を阻害する、改変され安定化されたGDFプロペプチドまたはBMP−11プロペプチドを提供することにより、この必要性を満たす。本発明の改変プロペプチドは、筋組織の増加が治療上有益であるヒト障害または動物障害を処置するために使用され得る。
【0007】
(発明の要旨)
GDF−8は、多くの重要な生物学的プロセスの調節に関与する。これらのプロセスにおけるそのGDF−8の重要な機能に起因して、GDF−8は、治療介入のための望ましい標的であり得る。天然に存在するGDF−8プロペプチドは、効力および毒性の予測から、魅力的なGDF調節手段であり得るが、本発明は、天然のプロペプチドの循環半減期が、実際の治療用途または予防用途をこの分子が有するには、短すぎるかもしれないことを発見した。
【0008】
従って、本発明は、増殖分化因子8(GDF−8)のプロペプチドは、GDF−8タンパク質の活性を阻害し、GDF−8と構造が関連する他のトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)タンパク質(例えば、骨形成タンパク質11(BMP−11;GDF−11としても公知)もまた、GDF−8プロペプチドにより阻害されるという知見に、少なくとも一部基づく。従って、本発明は、GDFタンパク質を阻害するための組成物および手段を提供し、ならびにそのようなインヒビターを同定、生成および使用するための方法を提供する。
【0009】
上記のように、本発明はまた、天然のGDF−8プロペプチドが、比較的短いインビボ半減期を有し、これにより、実際の治療用途または予防用途を妨げ得るという知見に、一部基づく。従って、本発明は、改善した薬理動態特性(例えば、循環半減期の増加またはタンパク質分解からの防御の増加)を有する、改変GDF−8プロペプチドおよび改変BMP−11プロペプチドを提供する。
【0010】
本発明により開示されるGDF−8プロペプチドまたはBMP−11プロペプチドは、当該分野で公知の任意の手段により安定化され得る。例えば、1つの実施形態において、この改変プロペプチドは、GDF−8プロペプチドと、IgG分子のFc領域とを含む、融合タンパク質である。GDF−8プロペプチド融合タンパク質は、活性サブユニットとして、IgG分子のFc領域と融合した、GDF−8タンパク質のプロペプチド、またはGDF−8プロペプチドの活性部分を含み得る。他の実施形態において、またはさらに、このGDF−8プロペプチドは、グリコシル化されており得るか、またはアルブミンもしくは非タンパク質様ポリマーに連結されており得る。
【0011】
他の実施形態において、この改変プロペプチドは、BMP−11プロペプチドと、IgG分子のFc領域とを含む、融合タンパク質である。BMP−11プロペプチド融合タンパク質は、活性サブユニットとして、IgG分子のFc領域と融合した、BMP−11タンパク質のプロペプチド、またはBMP−11プロペプチドの活性部分を含み得る。他の実施形態において、またはさらに、このBMP−11プロペプチドは、グリコシル化されており得るか、またはアルブミンもしくは非タンパク質様ポリマーに連結されており得る。
【0012】
本発明の改変GDF−8プロペプチドまたは改変BMP−11プロペプチドは、GDF−8タンパク質、成熟GDF−8、またはGDF−8ホモダイマーまたは他の活性GDF−8分子の、活性、発現、プロセシング、または分泌を阻害することができる。本発明の改変GDF−8プロペプチドまたは改変BMP−11プロペプチドは、筋組織の増加が治療上有益である医学的状態を処置または予防するために、治療上有効な用量で患者に投与され得る。この改変GDF−8プロペプチドまたは改変BMP−11プロペプチドにより処置され得る疾患および障害としては、筋障害または神経筋障害(例えば、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮症、うっ血性閉塞性肺疾患、筋るいそう症候群、筋肉減少症(sarcopenia)、または悪液質)、代謝疾患または代謝障害(例えば、2型糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、高血糖症、または肥満)、脂肪組織障害(例えば、肥満)、および骨変性疾患(例えば、骨粗鬆症)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0013】
(定義)
用語「GDF−8」、「GDF−8タンパク質」または「GDF−8ポリペプチド」とは、配列番号1に示されるもの、ならびに現在既知であるかまたは後に記載される、その任意のホモログ(他の種のホモログを含む)を含むがこれに限らない、特定の増殖および分化因子を指す。特に好ましいのは、哺乳動物ホモログであり、最も好ましいのは、ヒトホモログである。本発明はまた、GDF−8分子および他のすべての供給源に由来するホモログ(ウシ、イヌ、ネコ、ニワトリ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、シチメンチョウ、ヒヒ、および魚に由来する、GDF−8を含むが、これらに限定されない)を包含する。種々のGDF−8分子が、McPherronら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12457−12461に記載されている。ホモログは、当該分野で周知である。相同性は、当該分野で公知あるかまたは本明細書中に記載される任意の方法によって、決定され得る。このGDF−8またはGDF−8タンパク質は、天然に存在しても、合成であってもよい。これらの用語は、このタンパク質のプロセシングされていない全長前駆形態(「GDF−8前駆体タンパク質」)、ならびにそのプロペプチドの翻訳後切断から生じる成熟形態を包含する。この用語はまた、本明細書中で考察されるGDF−8タンパク質に関連する1つ以上の生物学的活性を維持する、GDF−8タンパク質の任意のフラグメントもしくは改変体(そのアミノ酸配列に対する保存的変化または非保存的変化により改変されている配列を含む)も指す。
【0014】
「成熟GDF−8」とは、GDF−8前駆体タンパク質のカルボキシ末端ドメインから切断された、タンパク質またはポリペプチドを指す。ヒト形態の成熟GDF−8タンパク質が、配列番号3に提供される。この成熟GDF−8は、天然に存在しても合成であってもよい。成熟GDF−8は、モノマー、ホモダイマーとして存在し得るか、またはGDF−8潜伏複合体の状態で存在し得る。インビボ条件またはインビトロ条件に依存して、成熟GDF−8は、これらの種々の形態のいずれかまたはすべての間の平衡を確立し得る。この機構に関する限定はしないが、成熟GDF−8は、ホモダイマーとして生物学的に活性であると考えられている。その生物学的に活性な形態で、成熟GDF−8もまた、「活性GDF−8」と呼ばれる。
【0015】
句「GDF−8活性」とは、活性GDF−8タンパク質に関連する、生理学的増殖調節活性または形態発生活性のうちの1つ以上を指す。例えば、活性GDF−8は、骨格筋量の負のレギュレーターである。活性GDF−8はまた、筋肉特異的酵素(例えば、クレアチンキナーゼ)の生成を調節し得、筋芽細胞増殖を刺激し得、そして脂肪細胞へのプレ脂肪細胞の分化を調節し得る。GDF−8はまた、末梢組織(特に、骨格筋または脂肪細胞)におけるインスリンおよびグルコースの取り込みに対する感受性を増加させると考えられる。従って、GDF−8の生物学的活性としては、筋肉形成の阻害、筋肉細胞増殖の阻害、筋肉発達の阻害、筋量の減少、筋肉特異的酵素の調節、筋芽細胞増殖の阻害、脂肪細胞へのプレ脂肪細胞の分化の調節、インスリンに対する感受性の増加、グルコース取込みの調節、グルコースホメオスタシス、およびニューロン細胞の発生および維持の調節が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト形態の全長GDF−8前駆体タンパク質が、配列番号1に提供される。
【0016】
「GDF−8プロペプチド」とは、GDF−8前駆体タンパク質のアミノ末端ドメインから切断されるポリペプチドを指す。このGDF−8プロペプチドは、1つ以上の生物学的活性(成熟GDF−8タンパク質またはホモダイマーに結合する能力、GDF−8の1つ以上の生物学的活性を阻害する能力、筋肉発達を増強する能力、筋量を増強する能力、筋形成を促進する能力、および筋細胞増殖を増強する能力が挙げられるが、これらに限定されない)に関連する。このGDF−8プロペプチドは、天然に存在しても合成であってもよい。GDF−8プロペプチドの例としては、配列番号5に提供されるヒト形態のGDF−8プロペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。1つの実施形態において、このGDF−8プロペプチドは、成熟GDF−8のプロペプチド結合ドメインに結合することができる。別の実施形態において、このGDF−8プロペプチドは、成熟GDF−8の1つ以上の活性を阻害することができる。
【0017】
用語「GDF−8インヒビター」は、GDF−8タンパク質、成熟GDF−8、もしくはGDF−8ホモダイマー、または他の活性GDF−8分子の、活性、発現、プロセシング、または分泌を阻害することができる任意の分子を包含し、このようなGDF−8インヒビターとしては、改変GDF−8プロペプチドおよび改変BMP−11プロペプチドが挙げられる。GDF−8インヒビターはまた、成熟GDF−8分子またはGDF−8ホモダイマーへのGDF−8プロペプチドの結合を増強することができる、任意の因子を包含する。このようなインヒビターとしては、タンパク質、抗体、ペプチド、ペプチド模倣物、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖RNA、および他の低分子が挙げられるが、これらに限定されない。1つの実施形態において、GDF−8タンパク質の活性が、実施例3〜6に記載される改変GDF−8プロペプチドにより阻害される。別の実施形態において、GDF−8タンパク質の活性が、改変BMP−11プロペプチドにより阻害される。
【0018】
「GDF−8潜伏複合体」とは、成熟GDF−8ホモダイマーとGDF−8プロペプチドとの間に形成されるタンパク質複合体を指す。機構に関して限定はしないが、2つのGDF−8プロペプチドが、ホモダイマー中の成熟GDF−8の2つの分子と結合して、不活性テトラマー(すなわち潜伏)複合体を形成する。この潜伏複合体は、GDF−8プロペプチドのうちの1つ以上の代わりにかまたはそれに加えて、他のGDFインヒビターを含み得る。
【0019】
用語「改変GDF−8プロペプチド」とは、GDF−8プロペプチドの1つ以上の生物学的活性を保持する改変GDF−8プロペプチド、そのフラグメントもしくは改変体を含み、さらに、本明細書中に示される安定化改変を含む、GDF−8インヒビターを指す。GDF−8プロペプチドの改変体形態としては、例えば、シグナルペプチドまたはプロペプチドタンパク質分解切断部位中にそれらの部位をタンパク質分解切断に対してより感受性でなくする変異(アミノ酸の挿入、欠失、および置換を含む)を含むように改変されている、GDF−8プロペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、この改変GDF−8プロペプチドは、対応する非改変GDF−8プロペプチドと比較して実質的に増加した半減期を有する。非常に好ましい実施形態において、本発明の改変GDF−8プロペプチドは、(例えば、実施例8に示される方法によって、測定された場合に)増加したインビボ半減期を有する。別の実施形態において、この改変GDF−8プロペプチドは、成熟GDF−8の1つ以上の活性を阻害することができる。
【0020】
用語「BMP−11」、「BMP−11タンパク質」または「BMP−11ポリペプチド」とは、配列番号7に示されるもの、ならびに現在既知であるかまたは後に記載される、その任意のホモログ(他の種のホモログを含む)を含むがこれに限らない、特定の増殖および分化因子を指す。特に好ましいのは、哺乳動物ホモログであり、最も好ましいのは、ヒトホモログである。本発明はまた、BMP−11分子および他のすべての供給源に由来するホモログ(ウシ、イヌ、ネコ、ニワトリ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、シチメンチョウ、ヒヒ、および魚に由来する、BMP−11を含むが、これらに限定されない)を包含する。種々のBMP−11分子が、McPherronら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12457−12461に記載されている。ホモログは、当該分野で周知である。相同性は、当該分野で公知あるかまたは本明細書中に記載される任意の方法によって、決定され得る。このBMP−11またはBMP−11タンパク質は、天然に存在しても、合成であってもよい。これらの用語は、このタンパク質のプロセシングされていない全長前駆形態(「BMP−11前駆体タンパク質」)、ならびにそのプロペプチドの翻訳後切断から生じる成熟形態を包含する。この用語はまた、本明細書中で考察されるBMP−11タンパク質に関連する1つ以上の生物学的活性を維持する、BMP−11の任意のフラグメントもしくは改変体(そのアミノ酸配列に対する保存的変化または非保存的変化により改変されている配列を含む)も指す。
【0021】
「成熟BMP−11」とは、BMP−11前駆体タンパク質のカルボキシ末端ドメインから切断された、タンパク質またはポリペプチドを指す。ヒト形態の成熟BMP−11タンパク質が、配列番号9に提供される。この成熟BMP−11は、天然に存在しても合成であってもよい。成熟BMP−11は、モノマー、ホモダイマーとして存在し得るか、またはBMP−11潜伏複合体の状態で存在し得る。インビボ条件またはインビトロ条件に依存して、成熟BMP−11は、これらの種々の形態のいずれかまたはすべての間の平衡を確立し得る。この機構に関する限定はしないが、成熟BMP−11は、ホモダイマーとして生物学的に活性であると考えられている。その生物学的に活性な形態で、成熟BMP−11もまた、「活性BMP−11」と呼ばれる。
【0022】
「BMP−11プロペプチド」とは、BMP−11前駆体タンパク質のアミノ末端ドメインから切断されるポリペプチドをいう。このBMP−11プロペプチドは、成熟GDF−8タンパク質またはホモ二量体に結合する能力、1つ以上のGDF−8の生物学的活性を阻害する能力、筋肉の発達を増強する能力、筋肉の質量を増大させる能力、筋肉の形成を促進する能力、および筋肉細胞増殖を促進する能力を含むがこれらに限定されない、1つ以上の生物学的活性と関係する。BMP−11プロペプチドは、天然物でもよいし、合成物でもよい。BMP−11プロペプチドの例としては、配列番号11で提供されるBMP−11のヒト形態が挙げられるがこれに限定されない。1つの実施形態では、BMP−11プロペプチドは、成熟GDF−8のプロペプチド結合ドメインに結合し得る。別の実施形態では、BMP−11プロペプチドは、成熟GDF−8の1つ以上の活性を阻害し得る。
【0023】
用語「改変BMP−11プロペプチド」とは、改変BMP−11プロペプチド、またはそのフラグメントもしくは改変体を含むGDF−8インヒビターをいい、これらは、BMP−11プロペプチドの1つ以上の生物学的活性を保持し、そして、さらに、本明細書中に示すような安定化改変を含む。BMP−11プロペプチドの改変体形態としては、例えば、BMP−11プロペプチドが挙げられるがこれに限定されない。このBMP−11プロペプチドは、タンパク質分解切断に対して、多少感受性の部位を作製するために、シグナルペプチドまたはプロペプチドのタンパク質分解切断部位に変異(アミノ酸の挿入、欠失、および置換を含む)を含むように改変されている。好ましい実施形態では、BMP−11プロペプチドインヒビターは、対応する非改変BMP−11プロペプチドのインビボ半減期に対して、増加したインビボ半減期(実施例8の1つの実施形態において測定された)を提供するように改変される。別の実施形態では、改変BMP−11プロペプチドは、成熟GDF−8の1つ以上の活性を阻害し得る。
【0024】
本発明のGDF−8プロペプチドおよび本発明のBMP−11プロペプチドは、まとめて、「GDFプロペプチド」といわれる。
【0025】
本発明のGDF−8タンパク質および本発明のBMP−11タンパク質は、まとめて、「GDFポリペプチド」または「GDFタンパク質」といわれる。
【0026】
本発明の方法および組成物は、GDFインヒビターを提供し、このGDFインヒビターは、インヒビターが結合しない同じGDFタンパク質と比較したGDFタンパク質の活性について、GDFタンパク質の活性を低下させる。特定の実施形態では、GDFタンパク質の活性は、改変GDFプロペプチドの1つ以上にが結合する場合、これらの改変プロペプチドが結合しない同じGDFタンパク質に対して、少なくとも約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、または55%、好ましくは、少なくとも約60%、62%、64%、66%、68%、70%、72%、74%、76%、78%、80%、82%、84%、86%、または88%、より好ましくは、少なくとも90%、91%、92%、93%、または94%、そしてさらにより好ましくは、少なくとも約95%〜100%減少される。1つの好ましい実施形態では、GDFインヒビターは、IgG分子のFc領域に共有的に連結した、改変GDF−8プロペプチドまたは改変BMP−11プロペプチドである。
【0027】
用語「安定化改変」は、タンパク質を安定化し得る、タンパク質のインビトロ半減期を増大し得る、タンパク質の循環半減期を増大し得る、および/またはタンパク質のタンパク質分解性分解を減少し得る、当該分野で公知のまたは本明細書中に示される任意の改変である。このような安定化改変としては、融合タンパク質(例えば、GDFプロペプチドおよび第2のタンパク質を含む融合タンパク質)、グリコシル化部位の改変(例えば、GDFプロペプチドへのグリコシル化部位の付加を含む)、および糖質部分の改変(例えば、GDFプロペプチドからの糖質部分の除去を含む)が挙げられるが、これらに限定されない。融合タンパク質を含む安定化改変の場合(例えば、第2のタンパク質がGDFプロペプチドに融合されるような場合)、第2のタンパク質は、「安定化部分」または「安定化タンパク質」といわれ得る。例えば、1つの実施形態では、本発明の改変GDF−8プロペプチドは、ヒトGDF−8プロペプチド(不活化された切断部位を有する)とIgG分子(これは、IgGが、安定化タンパク質または安定化部分として作用する)の間の融合物を含む。本明細書中で用いられる場合、融合部分の第2のタンパク質を言及することに加えて、「安定化部分」はまた、糖質部分または非タンパク質ポリマーのような、非タンパク質改変を含む。
【0028】
用語「単離された」または「精製された」とは、その天然の環境から実質的に独立している分子をいう。例えば、単離されたタンパク質は、このタンパク質が由来する細胞もしくは組織供給源由来の、細胞物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まない。句「細胞性物質を実質的に含まない」とは、単離されたタンパク質が、少なくとも70%〜80%(w/w)純粋、より好ましくは、少なくとも80〜89%(w/w)純粋、さらにより好ましくは、90〜95%純粋、そして最も好ましくは、少なくとも96%、97%、98%、99%、または100%(w/w)純粋である、調製物をいう。
【0029】
用語「切断部位」とは、ペプチド結合の切断を生じるタンパク質分解酵素が作用する、タンパク質またはポリペプチドのタンパク質分解部位をいう。1つの実施形態では、本発明の切断部位は、1文字アミノ酸コードで示した場合、「RSRR」である。
【0030】
用語「IgG分子のFc領域」とは、当業者に周知である、アイソタイプIgGの免疫グロブリンのFcドメインをいう。IgG分子のFc領域は、IgG分子のインビボ血清半減期を増大する原因となる、IgG分子の部分(IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4)である。好ましくは、IgG分子は、IgG1である。
【0031】
「インビトロ半減期」とは、生きている生物の状況の以外で測定されたタンパク質の安定性をいう。インビトロ半減期を測定するためのアッセイは、当該分野で周知であり、そしてSDS−PAGE、ELISA、細胞ベースのアッセイ、パルスチェイス(pulse chase)、ウェスタンブロット、ノーザンブロットなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのおよび他の有用なアッセイは、当該分野で周知である。
【0032】
「インビボ半減期」とは、生物内でのタンパク質の安定性をいう。インビボ半減期は、当該分野で公知の多数の方法(インビボ血清半減期、循環半減期、および本明細書中の実施例に示すアッセイを含むがこれらに限定されない)により測定され得る。
【0033】
「インビボ血清半減期」とは、生物の血液内を循環するタンパク質の半減期をいう。1つの実施形態では、インビボ半減期は、実施例8に示すように測定される。当該分野で公知の他の方法は、インビボ半減期を測定するために用いられ得る。
【0034】
用語「哺乳動物」は、当該分野で公知の定義を含み、そしてまた、ヒト、家畜(domestic)動物および家畜(farm)動物、ならびに動物園の(zoo)動物、競技用(sport)動物、または愛玩(pet)動物(例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシなど)を含む、哺乳動物として分類される任意の動物をいう。好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【0035】
用語「TGF−βスーパーファミリー」とは、構造的に関連した増殖因子のファミリーをいい、これらの全ては、生理学的に重要な増殖調節特性および形態形成特性を有する。関連した増殖因子のこのファミリーは、当該分野で周知である(Kingsleyら(1994)Genes Dev.8:133−46;およびHoodlessら(1998)Curr.Topics Microbiol.Immunol.228:235−72)。TGF−βスーパーファミリーとしては、骨形態形成タンパク質(BMP)、アクチビン、インヒビン、ミュラー管抑制物質(Mulleria Inhibiting Substance)、グリア由来神経栄養因子(Glial−Derived Neurotrophic Factor)、およびさらにより多くの増殖および分化因子(GDF)(例えば、GDF−8(ミオスタチン(myostatin)))が挙げられる。これらにタンパク質の多くは、GDF−8に対する構造(例えば、BMP−11(GDF−11としてもまた公知))および/または活性(例えば、アクチビン)に関係する。
【0036】
用語「処置」とは、治療的処置および予防的(prophylactic or preventative)手段の両方をいう。処置を必要とする者としては、特定の医学的障害を既に有する個体、および障害を最終的に獲得し得る者(すなわち、予防手段を必要とする者)が挙げられ得る。
【0037】
用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、宿主細胞へと外来核酸(例えば、DNAおよびRNA)を導入するための、当該分野で認識されている種々の技術をいい、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、およびエレクトロポレーションが挙げられるがこれらに限定されない。
【0038】
【表1】
(発明の詳細な説明)
本発明は、GDFプロペプチドが、短いインビボ半減期を有し、それにより、GDF−8活性またはBMP−11活性の薬理的インヒビターとしてのこのプロペプチドの有効性を低下させるという発見に一部基づく。従って、1つの局面では、本発明は、改善された薬物動態学的特性(詳細には、増加した循環半減期)を有する改変および安定化されたGDF−8またはBMP−11プロペプチドを特徴とする。
【0039】
本発明は、インビトロおよびインビボでGDFタンパク質(例えば、GDF−8タンパク質およびBMP−11タンパク質)と不活性複合体を形成する、新規の改変GDFプロペプチドを提供する。本発明の改変GDFプロペプチドは、好ましくは、成熟GDFタンパク質のプロペプチド結合ドメインに結合する。従って、本発明の特定の実施形態では、改変GDFプロペプチドは、GDFプロペプチドと安定化タンパク質との間の融合タンパク質を含む。安定化タンパク質は、改変GDFプロペプチドの全体的な安定性を増大する。当業者に認識されるように、このような融合タンパク質は、必要に応じて、プロペプチドと安定化部分との間のリンカーペプチドを含む。当該分野で周知であるように、融合タンパク質は、第2のタンパク質が、第1のタンパク質とインフレームで融合されて、その結果、第1のタンパク質および第2のタンパク質の両方を含む翻訳されたタンパク質を生じるように調製される。例えば、本発明において、融合タンパク質は、GDFプロペプチドが部分が、第2のタンパク質(例えば、安定化タンパク質部分)に融合されるように調製され得る。このような融合タンパク質は、得られた翻訳されたタンパク質が、プロペプチド部分および安定化部分の両方を含むように調製される。
【0040】
他の実施形態では、GDFプロペプチドは、非改変GDFプロペプチドと比較して、より長いインビボ循環半減期を有するように改変されているGDFプロペプチドを含む。改変GDFプロペプチド結合の正確な機構およびタイミングは分かっていないが、本発明の改変GDF−8プロペプチドおよび改変BMP−11プロペプチドは、成熟GDF−8および成熟BMP−11に結合すると考えられている。好ましい実施形態では、本発明は、インビボまたはインビトロでのGDF−8タンパク質またはBMP−11タンパク質と不活性複合体を形成する改変GDFプロペプチド提供する。1つの実施形態では、GDFプロペプチドは、好ましくは、成熟GDF−8タンパク質または成熟BMP−11タンパク質のプロペプチド結合ドメインに結合する。このような結合は、例えば、GDF−8活性部位およびBMP−11活性部位でのネイティブプロペプチドの放出の後、改変GDF−8プロペプチドおよび改変BMP−11プロペプチドによるネイティブプロペプチドの置換の後、および/またはGDF−8前駆体タンパク質およびBMP−11前駆体タンパク質からのプロペプチドの切断の後に生じ得る。機構にかかわらず、改変GDF−8プロペプチド結合および/または改変BMP−11プロペプチド結合は、同じ改変プロペプチドが結合しない、成熟GDF−8タンパク質に対して、GDF−8に関係する生物学的活性の1つ以上の低下を生じる。1つの好ましい実施形態では、改変GDF−8プロペプチドおよびBMP−11プロペプチドは、骨格筋質量の負の調節に関係するGDF−8活性およびBMP−11活性を低下させる。
【0041】
別の好ましい実施形態では、本発明は、インビボまたはインビトロでBMP−11タンパク質と不活性な複合体を形成する、改変GDFプロペプチドを提供する。1つの実施形態では、GDFプロペプチドは、好ましくは、成熟BMP−11タンパク質のプロペプチド結合ドメインに結合する。さらに別の実施形態では、改変GDFプロペプチドは、(安定化タンパク質として)GDFプロペプチドおよびIgG分子のFc領域を含む融合タンパク質である。このようなGDFインヒビターは、GDFプロペプチドの1つ以上の生物学的活性を保持する、(例えば、配列番号5または11に示されるような)GDFプロペプチド、またはプロペプチドのフラグメントもしくは改変体を含み得る。このような改変GDFプロペプチドは、GDFタンパク質の活性を阻害し得る。本発明で用いられるGDF−8プロペプチドまたはBMP−11プロペプチドは、遺伝子工学の分野で周知である、任意の種々の試薬、宿主細胞および方法を用いて、合成的に生成され得るか、天然に存在する(ネイティブの)GDF−8もしくはBMP−11プロペプチドに由来するか、または組み換え的に産生され得る。1つの実施形態では、改変GDF−8プロペプチドまたは改変BMP−11プロペプチドは、IgG分子に共有的に連結されるヒトGDF−8プロペプチドまたはBMP−11プロペプチド、またはそのフラグメントを含む。GDF−8プロペプチドまたはBMP−11プロペプチドは、IgG分子のFc領域に隣接して融合されるか、リンカーペプチドを介してIgGのFc領域に付着され得る。このようなリンカーペプチドの使用は、タンパク質生化学分野で周知である。
【0042】
特定の実施形態では、本発明の改変GDFプロペプチドが、融合タンパク質を含む場合、この融合タンパク質のGDFプロペプチド部分は、好ましくは、配列番号5または11に、少なくとも約75〜80%同一、より好ましくは、配列番号5または11に、少なくとも約81〜85%同一、さらにより好ましくは、配列番号5または11に、少なくとも約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、または94%同一、およびさらにより好ましくは、配列番号5または11に、少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一である。好ましい実施形態では、GDF−8プロペプチドまたはBMP−11プロペプチドは、配列番号5または11に示す配列と同一の配列を含む。さらに別の好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質のGDFプロペプチド部分は、フラグメントまたは改変体がGDFプロペプチドの生物学的活性の1つ以上を保持する限り、配列番号5または11に示すGDFプロペプチドの改変体のフラグメントを含み得る。別の好ましい実施形態では、改変GDF−8プロペプチドまたはBMP−11プロペプチドは、配列番号5または11の変異体バージョンを含み、ここで、この変異体は、フラグメントまたは改変体がGDFプロペプチドの生物学的活性の1つ以上を保持する限り、1つ以上の変異(挿入、欠失、または置換を含む)を含むように改変される。
【0043】
重大なことは、融合タンパク質を含む改変GDFプロペプチドを含む本発明の実施形態では、融合タンパク質は、GDFプロペプチドのネイティブのタンパク質分解部位(例えば、RSRR)が、得られた融合タンパク質内で、分裂、破壊、不活化または除去されるように産生または設計されることが必須である。当業者が認識するように、そうすることに失敗すると、融合タンパク質の第1のタンパク質(プロペプチド部分)から切断される融合タンパク質の第2の部分(例えば、安定化部分)を生じる。従って、本発明の重要な局面は、本発明の改変GDFプロペプチドである融合タンパク質を調製するために、このようなプロペプチドを用いる場合、GDFプロペプチドに対するネイティブの切断部位を不活化または排除することを提供する。このようなタンパク質分解切断部位を不活化する方法は、当業者に公知であり、そしてタンパク質分解切断部位のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の、変異、欠失、または挿入が挙げられるがそれらに限定されない。
【0044】
本発明のさらなる他の実施形態では、変異は、タンパク質分解切断にあまり感受性ではない部位を作製するようにGDF配列中で作製され得る。例えば、このような変異は、配列番号1のアミノ酸45、46、49、50、52、53、63、64、65、66、98または99、あるいは配列番号7のアミノ酸122、123、286または287での点変異を含み得る。別の実施形態では、このような点変異は、配列番号11のアミノ酸において作製され得る。好ましい実施形態では、点変異は、配列番号1のアミノ酸99での点変異である。特に好ましい実施形態では、点変異は、配列番号1のアミノ酸99の、AspからAlaへの点変異である。別の好ましい実施形態では、このような点変異は、配列番号11のアミノ酸で作製され得る。(市販のソフトウェア(例えば、MacVector、Omega、PCGene、Molecular Simulation,Inc.)を使用する)コンピューター分析もまた、タンパク質分解切断部位を同定するために用いられ得る。当業者に理解されるように、記載される任意の変異体、改変体(variant)または改変体(modification)は、核酸レベルで代替的に作製され得る。このような技術は、当該分野で周知である。
【0045】
(表2)
(ペプチドの切断を防止するために変異可能な例示的アミノ酸)
GDF−8(配列番号1で参照されるアミノ酸番号)
Arg−45
Gln−46
Lys−49
Ser−50
Arg−52
Ile−53
Lys−63
Leu−64
Arg−65
Leu−66
Arg−98
Asp−99
BMP−11(配列番号7で参照されるアミノ酸番号)
Asp−122
Ala−123
Glu−286
Leu−287
上記のように、本発明は、GDFプロペプチドが短いインビボ半減期を有するという発見を成し遂げた。従って、治療剤または予防剤として薬学的に有用であるためには、GDFプロペプチドは、生理学的条件下で増加した寿命について、化学的または物理的に安定化されなければならない。
【0046】
GDFプロペプチドは、改変GDFプロペプチドが、GDFタンパク質または変異体GDFタンパク質を阻害する能力を維持する限り、当該分野で公知の任意の手段により安定化または改変され得る。好ましい実施形態では、改変GDFプロペプチドは、その標的GDFタンパク質結合部位またはGDFプロペプチド結合部位に結合する能力を維持する。1つの好ましい実施形態では、改変GDFプロペプチドは、IgG分子のFc領域に、隣接してまたはリンカーを介して融合されたGDF−8プロペプチドまたはBMP−11プロペプチドを含む。このIgGのFc領域は、対応する非改変GDF−8プロペプチドまたは非改変BMP−11プロペプチドと比較した場合に、融合タンパク質の改善された薬物動態学的特性(すなわち、増加した血清半減期)において反映されるように、プロペプチドに対する保護効果または安定化効果を提供する(そして、これにより、安定化改変体として作用する)。
【0047】
特定の実施形態では、改変GDF−8プロペプチドは、ヒトGDF−8プロペプチドまたはヒトGDF−8プロペプチドの変異体を含み、そしてIgG分子は、IgG1もしくはIgG4のFc領域、またはエフェクター機能を低下させるために改変されたIgG1のFc領域である。1つの実施形態では、IgGフラグメントは、IgG1(配列番号15)である。別の実施形態では、IgGフラグメントは、エフェクター機能を低下させるために改変されたIgG1(配列番号16)である。エフェクター機能を低下させるために改変された分子の例としては、配列番号16に示されるようなアミノ酸位置14および17にアラニン(A)を含むようにヒトIgG1−Fc融合物の改変体が挙げられる。
【0048】
改変GDP−8プロペプチドまたはBMP−11プロペプチドは、当該分野で周知の標準的なタンパク質単離手順および精製手順に従って単離または精製され得る。
【0049】
別の実施形態では、改変GDFプロペプチドは、ヒトBMP−11プロペプチドまたはヒトBMP−11プロペプチドの変異体、およびIgG1もしくはIgG4のFc領域、またはエフェクター機能を低下させるために改変されたIgG1フラグメントであるIgG分子を含む。1つの好ましい実施形態では、安定部分は、ヒトIgG1(配列番号15)のFc領域であるか、またはエフェクター機能を低下させるために改変されたヒトIgG1のFc領域(配列番号16)である。BMP−11プロペプチドは、本明細書中に記載されるように、IgG分子のFc領域に、隣接してまたはリンカーを介して融合され得る。
【0050】
本発明はまた、増加したインビボまたはインビトロでの半減期を有する改変GDFプロペプチドを作製する方法を提供する。1つの好ましい実施形態では、この方法は、
(1)GDFプロペプチド(例えば、ヒトGDF−8プロペプチド、配列番号5、またはヒトBMP−11プロペプチド、配列番号11)(これらは、タンパク質分解切断部位およびIgG分子のFc領域(例えば、ヒトIgG1 Fc領域(配列番号15))を不活化するように改変される)をコードする、cDNA分子を調製する工程、
(2)適切な原核生物発現系または真核生物発現系において、適切な発現プラスミドおよび細胞を使用して、cDNAを発現する工程;および
(3)改変GDFプロペプチドを含む、発現された融合タンパク質を単離および精製する工程であって、ここで、改変GDFプロペプチドは、非改変GDFプロペプチドと比較して、インビボまたはインビトロで増加した半減期を有する、工程、
により、GDF−8/IgG1 Fc融合タンパク質またはBMP−11/IgG1 Fc融合タンパク質を含む改変GDFプロペプチドを調製する工程を包含する。
【0051】
本発明のこのような好ましい改変GDFプロペプチドの例は、図11Aに示される。
【0052】
cDNA発現系は、発現されたタンパク質の単離および精製についての方法と同様に、分子生物学分野において周知である(このような実施形態の例を提供する、本明細書中の実施例2および7)。
【0053】
代替の実施形態において、このような融合タンパク質の発現のために使用されるcDNA構築物は、GDFプロペプチドをコードするヌクレオチドとIgG Fc領域(または安定化部分)をコードするヌクレオチドとの間にリンカーペプチドをコードするヌクレオチドを含み得る。GDFまたはIgG Fc領域に対するリンカーペプチドの方向は、重要ではない。リンカーペプチドは、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30またはより長いアミノ酸の長さをコードするヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態において、このリンカーペプチドは、グリシン−セリン−グリシン−セリン(GSGS)からなるアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含む。
【0054】
別の実施形態において、発現プラスミドは、必要に応じて、発現されたタンパク質の簡便な単離および精製を可能にするタグを含み得る。このようなタグ化された発現プラスミドの使用ならびにタグ化されたタンパク質産物を単離および精製するための方法は、当該分野で周知である。
【0055】
本発明のGDFプロペプチドは、詳細には、分子のGDFプロペプチド部分が特定の種由来のGDF対応配列に同一であるかまたは60%より高く相同性であり、一方、安定化部分(例えば、IgG分子のFc領域)が、異なる種由来のIgG対応配列に同一であるかまたは60%より高く相同性であり得る、融合タンパク質を含む。例えば、ヒトGDF−8プロペプチドまたはそのフラグメントは、生じる融合タンパク質が所望の生物学的活性(すなわち、実施例3〜6に具体化されるGDF生物学的活性の阻害)を示す限り、マウスIgG分子のFc領域に融合され得る(またはその逆であり得る)。本発明の好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ヒトタンパク質のキメラである。当該分野で理解されるように、ヒトタンパク質のキメラタンパク質または融合タンパク質が、ヒト被験体の処置において好ましい。
【0056】
上記のFc融合タンパク質の代替としてか、または上記のFc融合タンパク質に加えて、GDFプロペプチドは、周知でありかつタンパク質分野において容易に利用可能な種々の他の方法および供給源材料によって、安定化され得る。このような方法および材料としては、以下に詳細に記載されるように、例えば、グリコシル化、またはアルブミンもしくは非タンパク質ポリマーへの連結が挙げられる。改変GDFプロペプチドは、タンパク質分野において周知の標準的なタンパク質単離技術および精製技術を用いて、単離および精製され得る。
【0057】
GDFプロペプチドまたは改変GDFプロペプチドは、種々の当該分野で公知の技術によって生成され得る。例えば、このようなプロペプチドは、本明細書中に記載される方法または当該分野で公知の方法を用いて、合成され(例えば、化学的にまたは組換え的に)、単離されおよび精製され、そして成熟GDF−8タンパク質または成熟BMP−11タンパク質と複合体を形成するそれらの能力について試験され得る。プロペプチドは、標準的なタンパク質化学技術を用いて合成され得る(例えば、Bodansky,M.Principles of Peptide Synthesis,Springer Verlag,Berlin(1993)およびGrant G.A.(編),Synthetic Peptides:A User’s Guide,W.H.Freeman and Compacy,New York(1992)に記載される技術(これらの内容は,本明細書中に参考として援用される)。さらに、自動化ペプチド合成機が、市販されている(例えば、Advanced Chem Tech Model 396;Milligen/Biosearch 9600)。
【0058】
あるいは、改変GDFプロペプチドもしくは未改変GDFプロペプチドまたはこれらのフラグメントは、当該分野で周知のように、種々の発現系(例えば、E.coli、チャイニーズハムスター卵巣細胞、COS細胞、バキュロウイルス)を用いて組換え産生され得る。例えば、GDF−8またはBMP−11の発現されたプロペプチドは、例えば、Bottingerら(1996)PNAS 93:5877−5882ならびにGentryおよびNash(1990)Biochemistry 29:6851−6857(これらの内容は、参考として本明細書中に援用される)に記載される方法またはペプチド精製のための当該分野で認識される任意の他の方法を用いて、精製され得る。あるいは、改変GDFプロペプチドもしくは未改変GDFプロペプチドまたはこれらのフラグメントは、タンパク質分野において確立された技術を用いる引続く精製のために、例えば、FLAGまたは6−Hisを用いてタグ化され得る。
【0059】
改変または未改変のGDF−8プロペプチドまたはBMP−11プロペプチドはさらに、例えば、プロテアーゼ(例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、または対形成(paired)塩基性アミノ酸変換酵素(PACE))を用いて、天然に存在するGDF−8もしくはBMP−11または組換え産生されたGDF−8もしくはBMP−11の消化によって産生され得る。コンピューター分析(市販のソフトウェア、例えば、Mac Vector,Omega,PCGene,Molecular Simulation,Inc.を用いるコンピューター分析)は、タンパク質分解切断部位を同定するために使用され得る。あるいは、このようなGDFプロペプチドは、例えば、当該分野で公知の標準的な技術(例えば、化学切断(例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミン))によって、天然に存在するGDF−8もしくはBMP−11または組換え産生されたGDF−8もしくはBMP−11から産生され得る。
【0060】
改変GDFプロペプチドのタンパク質分解GDF−8プロペプチド部分およびBMP−11プロペプチド部分または合成GDF−8プロペプチド部分およびBMP−11プロペプチド部分は、標的GDFタンパク質に結合するのに必要な数のアミノ酸残基を含み得、これによって、部分的にまたは完全に、GDF−8活性またはBMP−11活性を阻害する。本明細書中において、実施例4〜6は、結合アッセイおよび阻害アッセイの実施形態を例示する。特に、GDF−8を調節または阻害する能力を維持するGDF−8プロペプチド配列および/またはBMP−11プロペプチド配列の機能フラグメントが、本発明の範囲内に含まれる。GDF−8プロペプチド部分は、好ましくは、少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、もしくは90アミノ酸;より好ましくは、少なくとも100、110、120、130、140、150、160、170、180、もしくは190アミノ酸;そして最も好ましくは、少なくとも200、210、220、230、もしくは240アミノ酸またはこれより多くのアミノ酸の長さを含む。好ましい実施形態において、改変GDF−8プロペプチドのGDF−8プロペプチド部分は、243アミノ酸長(すなわち、配列番号5に対応する)であり;そして、BMP−11プロペプチドのBMP−11プロペプチド部分は、274アミノ酸長(すなわち、配列番号11に対応する)である。ヒトGDF−8のシグナル配列は、配列番号13に示され、そして配列番号1の最初の23アミノ酸を含む。1つの実施形態において、BMP−11プロペプチドの配列は、アミノ酸配列AEGPAAAで始まる。
【0061】
ヒトBMP−11に対するシグナル配列は、配列番号14に示され、そして配列番号7の最初の24アミノ酸を含む。GDF−8プロペプチドまたはBMP−11プロペプチドの機能フラグメントとしての、部分GDF−8プロペプチド配列または部分BMP−11プロペプチド配列の同定は、例えば、本明細書中の実施例4〜6に記載されるアッセイを用いて容易に決定され得る。
【0062】
短縮プロペプチド配列に加えて、本明細書中のプロペプチド改変体は、詳細には、その改変体がGDFプロペプチドの1つ以上の所望の生物学的活性または阻害活性を含む限り、点変異または他の改変(挿入、欠失、および置換を含む)を有するGDFプロペプチドを含む。このような活性は、例えば、実施例4〜6に記載されるように、測定され得る。このような改変が分子に導入されて、GDF−8プロペプチドまたはBMP−11プロペプチドの活性、循環もしくは保存半減期、または産生を増強し得る。例えば、点変異が1つ以上のタンパク質分解切断部位に導入されて、インビボにおいて改変GDF−8プロペプチドのタンパク質分解を妨害または阻害し得る。コンピューター分析(市販のソフトウェア、例えば、Mac Vector,Omega,PCGene,Molecular Simulation,Inc.を用いるコンピューター分析)が、タンパク質分解切断部位を同定するために使用され得る。
【0063】
従って、本発明のGDFプロペプチドを作製する方法は、詳細には、野生型cDNAコード配列に加えて、野生型GDFプロペプチドをコードするが、遺伝暗号の縮重または対立遺伝子バリエーション(アミノ酸の変化を生じ得るかまたは生じ得ない、その種の集団における天然に存在する塩基変化)に起因して野生型GDF cDNA配列とcDNA配列が異なるcDNAコード配列を含む。本発明はまた、実施例4〜6に具体化されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下(1つの実施形態において、T.Maniatisら(1982)Molecular Cloning(A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory,pp387−389)に記載されるような条件下)で、GDFプロペプチドをコードする核酸または特定のGDFタンパク質に結合する能力を有するタンパク質もしくはポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズするDNA配列を意図する。点変異または誘導された改変(例えば、挿入、欠失、および置換)によって生じるcDNA配列におけるバリエーション(これは、それらによってコードされるGDF−8プロペプチドまたはBMP−11プロペプチドの活性、半減期、または産生を増強する)もまた、本発明に対して有用である。DNA配列相同性の決定に有用なコンピュータープログラムが、当該分野で公知であり、そして本明細書中に記載される。
【0064】
GDFタンパク質と非共有結合複合体を形成する改変GDFプロペプチドの能力は、本明細書中の実施例2に記載されるように、当該分野で公知の種々の方法(サイズ排除クロマトグラフィーおよび/または架橋分析)によって評価され得る。実施例2に示されるように、GDF−8プロペプチドは、成熟GDF−8タンパク質と非共有結合の会合を形成する。この成熟GDF−8/GDF−8プロペプチド複合体は、約75kDaのおおよその分子量を有する。
【0065】
上記のように、Fc融合方法に加えて、GDFプロペプチドは、多数の他の技術によって安定化され得る。1つの実施形態において、安定化部分は、GDFプロペプチド部分に共有結合的に連結されて、融合タンパク質を生成する。例えば、GDF−8プロペプチドは、種々の非タンパク質ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン)のうちの1つ以上に、米国特許第4,640,835号;同第4,496,689号;同第4,301,144号;同第4,670,417号;同第4,791,192号または同第4,179,337号(これらは、本明細書中に参考として援用される)に記載される様式で、連結され得る。特定の実施形態において、GDFプロペプチドは、ポリマーへの共有結合での結合体化によって化学的に改変されて、その循環半減期を増大する。好ましいポリマー、およびこれらをペプチドに結合させるための方法もまた、米国特許第4,776,106号;同第4,179,337号;同第4,495,285号;および同第4,609,546号(これらは、本明細書中に参考として援用される)に記載される。
【0066】
別の実施形態において、GDF−8プロペプチドは、変更されたグリコシル化パターンを有する(すなわち、野生型グリコシル化パターンから変更される)ように改変され得る。本明細書中に使用される場合、「変更された」は、1つ以上の炭水化物部分が野生型GDFプロペプチドに付加されるかまたは野生型GDFプロペプチドから欠失されることを意味する。タンパク質およびポリペプチドのグリコシル化は、代表的にN連結またはO連結のいずれかである。N連結は、炭水化物部分のアルパラギン残基の側鎖への結合をいう。トリペプチド配列、アスパラギン−X−セリンおよびアスパラギン−X−トレオニン(ここで、Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸である)は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素学的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらいずれかのトリペプチド配列の存在は、可能性のあるグリコシル化部位を生成する。O連結グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸(最も一般的には、セリンまたはトレオニンであるが、5−ヒドロキシプロリンまたは5−ヒドロキシリジンもまた、使用され得る)への糖N−アシルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの1つの結合をいう。
【0067】
グリコシル化部位のGDFプロペプチドへの付加または欠失は、(N連結グリコシル化部位について)上記のトリペプチド配列のうちの1つ以上を含むかまたは排除するようにアミノ酸配列を変更することによって、好都合に達成される。この変更はまた、(O連結グリコシル化部位について)野生型GDFプロペプチドの配列への1つ以上のセリン残基もしくはトレオニン残基の付加または置換によって、作製され得る。各場合について、GDFプロペプチドアミノ酸配列は、好ましくは、DNAレベルでの変更(この技術は、当該分野で周知である)を介して変更される。
【0068】
GDFプロペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、GDFプロペプチドへのグリコシドの化学カップリングまたは酵素カップリングによる手段である。これらの手順は、N連結グリコシル化またはO連結グリコシル化についてのグリコシル化能力を有する宿主細胞において、GDFプロペプチドの産生を必要としないという点で、有利である。使用されるカップリング様式に依存して、糖は、(a)アルギニンおよびヒスチジン;(b)遊離カルボキシル基;(c)遊離スルフヒドリル基(例えば、システインの遊離スルフヒドリル基);(d)遊離ヒドロキシル基(例えば、セリン、トレオニンまたはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基);(e)芳香族残基(例えば、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの芳香族残基);あるいは(f)グルタミンのアミド基に結合され得る。これらの方法は、WO87/05330(1987年9月11日発行)、ならびにAplinおよびWriston(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.,pp259−306(これらは、本明細書中に参考として援用される)に記載される。
【0069】
GDFプロペプチド上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、GDFプロペプチドの化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物への曝露を必要とする。この処理は、連結糖(N−アセチルグルコサミンまたはN−アセチルガラクトサミン)以外のほとんど糖または全ての糖の切断を生じるが、アミノ酸配列はインタクトなままにする。
【0070】
化学的脱グリコシル化は、Hakimuddinら(1987)Arch.Biochem.Biophys.259:52およびEdgeら(1981)Anal.Biochem.118:131によって記載される。GDFプロペプチド上の炭水化物部分の酵素学的切断は、Thotakuraら(1987)Meth.Enzymol.138:350によって記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。
【0071】
上記のように、改変GDFプロペプチドがGDFプロペプチド−Fc融合タンパク質である場合、IgG分子のFc領域はまた、変更されたグリコシル化パターンを有するように改変され得る。
【0072】
別の実施形態において、GDFプロペプチドは、タンパク質アルブミンまたはアルブミンの誘導体に連結される。タンパク質またはポリペプチドをタンパク質アルブミンまたはアルブミン誘導体に連結するための方法は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第5,116,944号(Sivamら)(これは、本明細書中に参考として援用される)を参照のこと。
【0073】
特定のアミノ酸が、タンパク質の活性に有害に影響を与えることなく、タンパク質構造中の他のアミノ酸の代わりに置換され得ることが、当業者によって理解される。従って、本発明によって、種々の変更が、改変GDFプロペプチドもしくは未改変GDFプロペプチドのアミノ酸配列、またはこのようなプロペプチドをコードするDNA配列中に、それらの生物学的有用性または活性の測定可能な損失なしに、作製され得ることが、意図される。1つの実施形態において、このような活性は、実施例4〜6において測定されている。このような変更としては、欠失、挿入、短縮、置換、融合などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、改変GDFプロペプチド内のタンパク質分解切断部位におけるアミノ酸配列の変更は、本発明内に明確に含まれる。
【0074】
このような変更を作製する際、アミノ酸のヒドロパシー指標(hydropathic index)が考慮され得る。タンパク質に相互作用に影響する生物学的機能の付与におけるヒドロパシーアミノ酸指標の重要性は、一般的に当該分野で理解されている(KyteおよびDoolittle(1982)J.Mol.Biol.157:105−132)。アミノ酸の相対的なヒドロパシー特徴が、生じるタンパク質の二次構造に寄与し、これは次に、他の分子(例えば、酵素、基質、レセプター、DNA、抗体、抗原など)とのタンパク質の相互作用を規定することは、是認されている。
【0075】
各アミノ酸は、その疎水性特徴および荷電特徴に基づくヒドロパシー指標が割当てられている(KyteおよびDoolittle、1982、前出);イソロイシン(+4.5)、バリン(+4.2)、ロイシン(+3.8)、フェニルアラニン(+2.8)、システイン/シスチン(+2.5)、メチオニン(+1.9)、アラニン(+1.8)、グリシン(−0.4)、トレオニン(−0.7)、セリン(−0.8)、トリプトファン(−0.9)、チロシン(−1.3)、プロリン(−1.6)、ヒスチジン(−3.2)、グルタミン酸(−3.5)、グルタミン(−3.5)、アスパラギン酸(−3.5)、アスパラギン(−3.5)、リジン(−3.9)、およびアルギニン(−4.5)が存在する。
【0076】
このような変更を作製する際、そのヒドロパシー指標が±2内であるアミノ酸の置換が好ましく、ヒドロパシー指標が±1内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてヒドロパシー指標が±0.5内であるアミノ酸の置換がなおより好ましい。
【0077】
このようなアミノ酸の置換が親水性に基づいてより効率的に作製され得ることもまた、当該分野で理解される。例えば、米国特許第4,554,101号は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最も大きい局所的な平均親水性を記載し、そのタンパク質の生物学的特性と関連付けている。
【0078】
米国特許第4,554,101号に詳述されるように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に割当てられている:アルギニン(+3.0)、リジン(+3.0)、アスパラギン酸(+3.0±1)、グルタミン酸(+3.0±1)、セリン(+0.3)、アスパラギン(+0.2)、グルタミン(+0.2)、グリシン(0)、トレオニン(−0.4)、プロリン(−0.5±1)、アラニン(−0.5)、ヒスチジン(−0.5)、システイン(−1.0)、メチオニン(−1.3)、バリン(−1.5)、ロイシン(−1.8)、イソロイシン(−1.8)、チロシン(−2.3)、フェニルアラニン(−2.5)、およびトリプトファン(−3.4)。
【0079】
このような変更を作製する際、その親水性値が±2内であるアミノ酸の置換が好ましく、親水性値が±1内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そして親水性値が±0.5内であるアミノ酸の置換がなおより好ましい。
【0080】
改変は、そのタンパク質の構造または生物学的機能がその変化によって影響されないような保存的改変であり得る。このような保存的アミノ酸改変は、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性(例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさなど)に基づく。種々の上記の特徴を考慮に入れた例示的な保存的置換は、当業者に周知であり、そしてこれらとしては、以下が挙げられる:アルギニンおよびリジン;グルタミン酸およびアスパラギン酸;セリンおよびトレオニン;グルタミンおよびアスパラギン;ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。改変GDFプロペプチドのアミノ酸配列は、その標的GDFタンパク質への改変GDFプロペプチドの結合が不利に影響を受けない限り、任意の数の保存的変化を有するように改変され得る。
【0081】
相対的な配列類似性または配列同一性(配列相同性に関してタンパク質分野および分子生物学的分野においても公知である)は、好ましくは、Sequence Analysis Software PackageTMの「Best Fit」または「Gap」プログラム(Version 10;Genetics Computer Group,Inc.,University of Wisconsin Biotechnology Center,Madison,WI)を用いて決定される。「Gap」は、一致の数を最大化し、かつギャップの数を最小化する2つの配列のアラインメントを見出すために、NeedlemanおよびWunschのアルゴリズム(NeedlemanおよびWunsch,1970)を利用する。「BestFit」は、2つの配列間の類似性の最良セグメントの最適アラインメントを実行する。最適アラインメントは、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズム(SmithおよびWaterman、1981;Smithら、1983)を用いて、一致の数を最大化するためにギャップを挿入することによって見出される。
【0082】
上記の配列分析ソフトウェアパッケージは、現在開示されているヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の相同性を同定するための多数の他の有用な配列分析ツールを含む。例えば、「BLAST」プログラム(Altschulら、1990)は、特定されたデータベース(例えば、National Center for Biotechnology Information(NCBI)(Bethesda,Maryland,USA)において維持されている配列データベース)において問い合わせ配列(ペプチドまたは核酸のいずれか)に対する配列類似性について検索し;「FastA」(LipmanおよびPearson,1985;PearsonおよびLipman、1988もまた参照のこと;Pearson、1990)は、問い合わせ配列と同じ型の配列の群(核酸またはタンパク質)との間の類似性についてPearsonおよびLipmanの検索を実行し;「TfastA」は、タンパク質問い合わせ配列とヌクレオチド配列の任意の群との間の類似性についてPearsonおよびLipmanの検索を実行し(これは、これらのヌクレオチド配列を、比較を実行する前に、6つ全てのリーディングフレームで翻訳する);「FastX」は、フレームシフトを考慮に入れて、ヌクレオチド問い合わせ配列とタンパク質配列の群との間の類似性についてPearsonおよびLipmanの検索を実行する。「TfastX」は、フレームシフトを考慮に入れて、タンパク質問い合わせ配列とヌクレオチド配列の任意の群との間の類似性についてPearsonおよびLipmanの検索を実行する(これは、比較を実行する前に、核の配列の両方の鎖を翻訳する)。
【0083】
当業者は、改変GDFプロペプチドまたは未改変GDFプロペプチドが、それらの生物学的特性を変更することなく、それらのアミノ酸配列に対して任意の数の置換を含み得ることを認識する。好ましい実施形態において、このような変化は、当該分野で周知の保存的アミノ酸置換である。種々の上記の特徴を考慮に入れた例示的な保存的置換は、タンパク質生物化学分野の当業者に周知であり、そしてこれらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:アルギニンおよびリジン;グルタミン酸およびアスパラギン酸;セリンおよびトレオニン;グルタミンおよびアスパラギン;ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【0084】
本発明の特定の実施形態において、タンパク質のインビボ安定性は、多数の方法において測定され得る。1つの実施形態において、血清サンプルまたは組織サンプルは、当業者に周知の方法を用いて、静脈内もしくは腹腔内のいずれかでタンパク質を送達した後か、またはタンパク質を放射性標識した後(すなわち、ヨウ素−125を用いて)に、種々の時点で回収される。各血清サンプルまたは組織サンプル中に存在する放射性標識の量は、ガンマカウンターを用いて決定され得る。別の実施形態において、血清中のタンパク質の完全性/安定性は、SDS−PAGE、その後のオートラジオグラフィーまたはウエスタンブロット分析のいずれかによって評価され得る。別の実施形態において、タンパク質の生物学的活性は、多数の機能アッセイ(当該分野で公知のELISAまたは細胞に基づくアッセイを含む)のうちのいずれか1つを用いて測定され得る。
【0085】
(疾患の処置方法)
本発明のGDFプロペプチドは、ヒトまたは動物における種々の医療障害を予防または処置するために有用である。GDFプロペプチドは、好ましくは、GDFタンパク質に関連する1つ以上の活性を阻害または低減させるために使用される。かなり好ましい1つの実施形態において、改変GDFプロペプチドは、同一のプロペプチドによって結合されない成熟GDF−8タンパク質に関連する、成熟GDF−8の1つ以上の活性を阻害または低減する。好ましい実施形態において、成熟GDF−8タンパク質の活性は、1つ以上の改変GDFプロペプチドによって結合される場合、1つ以上の改変GDFプロペプチドによって結合されない成熟GDF−8タンパク質と比較して、少なくとも50%、好ましくは、60%、62%、64%、66%、68%、70%、72%、74%、76%、78%、80%、82%、84%、86%または88%、より好ましくは、少なくとも90%、91%、92%、93%または94%、さらにより好ましくは、少なくとも95%〜100%阻害される。
【0086】
改変GDFプロペプチドによって処置または予防される医療障害は、好ましくは、筋肉障害または神経筋障害(例えば、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮、うっ血性閉塞性肺疾患、筋るいそう症候群、筋欠乏(sarcopenia)または悪液質)、代謝性疾患(例えば、二型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、高血糖または肥満)、脂肪組織障害(例えば、肥満)あるいは骨変性疾患(例えば、骨粗しょう症)である。医療障害は、最も好ましくは、筋肉障害または神経筋障害(例えば、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮、うっ血性閉塞性肺疾患、筋るいそう症候群、筋欠乏(sarcopenia)または悪液質)である。別の好ましい実施形態において、医療障害は、代謝性疾患または代謝性障害(例えば、機能不全グルコース代謝および/またはインスリン耐性(例えば、二型糖尿病またはインスリン非依存性糖尿病)、または高血糖もしくは肥満のような代謝性障害)である。GDFプロペプチドは、好ましくは、哺乳動物、最も好ましくは、ヒトにおけるこのような医療障害を予防または処置するために使用される。
【0087】
本発明のGDFプロペプチドまたはプロペプチド組成物は、治療的有効量で投与される。本明細書中で使用される場合、「有効量」の改変GDFプロペプチドは、GDFタンパク質の活性を低減させて所望の生物学的成果(例えば、骨格筋質量)を達成するに十分な投薬量である。1つの実施形態において、所望の生物学的成果は、任意の治療利益(筋肉質量の増加、筋肉強度の増加、代謝改善、肥満の低減またはグルコースホメオスタシスの改善)であり得る。このような改善は、種々の方法によって測定され得る。やせたボディマスおよび肥えたボディマスを測定する方法(例えば、二重X線操作分析)、筋肉強度、血清脂質、血清レプチン、血清グルコース、糖化ヘモグロビン、ブドウ糖耐性、および糖尿病の二次的合併症の改善を測定する方法によって、測定され得る。一般に、治療有効量は、被験体の年齢、体重、身体状態および性別ならびに被験体における医療状態の重篤度で、変動し得る。投薬量は、必要ならば、観察された処置効果に適するように医師によって決定され得、そして投与され得る。一般に、組成物は、GDFプロペプチドが50μg/kgと20mg/kgとの間の用量で与えられるように投与される。好ましくは、GDFプロペプチドは、投与後最大の期間にわたってGDFプロペプチドの循環レベルを最小化するように、ボーラス用量として与えられる。連続注入はまた、ボーラス用量後に使用され得る。
【0088】
本発明はまた、異常なグルコースホメオスタシスを生じる代謝性疾患または代謝性障害を予防または処置するための方法を提供する。正常なグルコースホメオスタシスは、とりわけ、血糖レベルでのかすかな変化に応じる膵臓β細胞によるインスリン分泌の見事に調節された統合を必要とする。インスリンの基本作用の1つは、組織(特に、筋組織および脂肪組織)への血液からのグルコースの取り込みを刺激することである。
【0089】
従って、1つの実施形態において、本発明は、改変GDFプロペプチドまたはGDFプロペプチド組成物を、疾患の徴候を改善させるに十分な量で被験体に投与することによって、糖尿病および関連障害(例えば、肥満または高血糖)を処置するための方法を提供する。二型糖尿病またはインスリン非依存性糖尿病(NIDDM)は、特に、以下の3つによって特徴付けられる:(1)末梢組織(特に、骨格筋および脂肪細胞)におけるグルコース取り込みにおけるインスリン作用に対する耐性、(2)肝臓のグルコース産生を阻害するための減損したインスリン作用、および(3)インスリン分泌調節不全(DeFronzo,(1997)Diabetes Rev.5:177−269)。よって、二型糖尿病を罹患する被験体は、本発明に従って、細胞によるインスリンおよびグルコースの取り込みに対する感受性を増加させる改変GDFプロペプチドの投与によって処置され得る。
【0090】
同様に、インスリン機能不全(例えば、耐性、不活性または欠損)および/または細胞への不完全なグルコース輸送によって特徴付けられる他の疾患および代謝性障害はまた、本発明に従って、改変GDFプロペプチドの投与によって処置され得、この改変GDFプロペプチドは、細胞によるインスリンおよびグルコースの取り込みに対する感受性を増加させた。
【0091】
本発明の改変GDFプロペプチドまたは改変GDFプロペプチド組成物は、治療有効量で投与される。糖尿病および関連障害の処置に使用される場合、「有効量」の改変GDFプロペプチドは、GDFタンパク質の活性を低減させて、1つ以上の所望の治療結果(例えば、インスリン感受性または細胞によるグルコースの取り込みの増加、肥えたボディマスの低減または血清脂質、血清レプチン、血清グルコース、糖化ヘモグロビン、ブドウ糖耐性の所望の変化、または糖尿病の二次的合併症における改善)を達成するに十分な投薬量である。一般に、治療有効量は、被験体の年齢、状態および性別、ならびに被験体におけるインスリン機能不全の重篤度で変動し得る。投薬量は、必要ならば、観察された処置効果に適するように医師によって決定され得、そして投与され得る。一般に、組成物は、GDFプロペプチドが50μg/kgと20mg/kgとの間の用量で与えられるように投与される。好ましくは、GDFプロペプチドは、投与後最大の期間にわたってGDFプロペプチドの循環レベルを最小化するように、ボーラス用量として与えられる。連続注入はまた、ボーラス用量後に使用され得る。
【0092】
本発明はまた、GDFプロペプチドのインビボでの産生のための遺伝子治療を提供する。このような治療は、上記に列挙されたような障害を有する細胞または組織に、GDFプロペプチドポリヌクレオチド配列を導入することによって、その治療効果を達成する。GDFプロペプチドポリヌクレオチド配列の送達は、キメラウイルスのような組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を使用して達成され得る。標的化されたリポソームの使用が、GDFプロペプチドポリヌクレオチド配列の治療的送達に、特に好ましい。
【0093】
本明細書中で教示されるような遺伝子治療に利用され得る種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスまたは、好ましくはRNAウイルス(例えば、レトロウイルス)が挙げられる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリのレトロウイルスの誘導体である。単一の外因性遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:モロニーマウス白血病ウイルス(MoMuLV)、Harveyマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MuMTV)およびラウス肉腫ウイルス(RSV)。多くのさらなるレトロウイルスベクターは、複数の遺伝子を組込み得る。これらのベクターの全ては、適切なマーカーについての遺伝子を移入または組み込み得、その結果、導入された細胞は同定および生成され得る。特定の標的細胞(例えば、ベクター)上のレセプターに対するリガンドをコードする別の遺伝子とともに、目的のGDFプロペプチドポリヌクレオチド配列をウイルスベクターに挿入することは、現在、標的特異的である。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質の付着によって標的特異的にされ得る。好ましい標的化は、抗体を使用することによって達成される。当業者は、GDFプロペプチドポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にするために、特定のポリヌクレオチド配列がレトロウイルスゲノムに挿入され得るかまたはウイルスエンベロープに付着され得ることを、認識する。1つの好ましい実施形態において、ベクターは、筋肉細胞または筋肉組織に標的化される。
【0094】
組換えレトロウイルスは不完全であるので、組換えレトロウイルスは、LTR内の調節配列の制御下でレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含有するヘルパー細胞株を必要とする。これらのプラスミドは、パッケージング機構に、カプシド化のためのRNA転写物を認識し得るようにするヌクレオチド配列を欠いている。パッケージングシグナルの欠失を有するヘルパー細胞株としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:例えば、PSI.2、PA317およびPA12。これらの細胞は、空のビリオンを産生する。なぜなら、ゲノムが全くパッケージングされないからである。このような細胞にレトロウイルスベクターが導入される場合(ここで、パッケージングシグナルはインタクトであるが、構造遺伝子は、他の目的の遺伝子によって置換されている)、ベクターは、パッケージングされ得、そしてベクタービリオンが産生され得る。
【0095】
あるいは、他の組織培養細胞は、慣用的なリン酸カルシウムトランスフェクションによって、レトロウイルス構造遺伝子gag、polおよびenvをコードするプラスミドを用いて直接トランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、目的の遺伝子を含有するベクタープラスミドでトランスフェクトされる。生じた細胞は、培養培地中にレトロウイルスベクターを放出する。
【0096】
GDFプロペプチドポリヌクレオチドについての別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフィア、ビーズおよび脂質ベース系(水中油乳濁液、ミセル、混合ミセルおよびリポソーム)が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、人工膜ビヒクルであり、インビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとして有用である。RNA、DNAおよびインタクトなビリオンは、水溶液(aqueous)内部にカプセル化され得、そして生物学的に活性な形態において細胞に送達され得る(例えば、Fraleyら、Trends Biochem.Sci.,6:77,1981を参照のこと)。リポソームビヒクルを使用する効率的な遺伝子移入の方法は、当該分野において公知である(例えば、Manninoら、Biotechniques,6:682,1988を参照のこと)。リポソームの組成物は、通常、リン脂質の組合わせであり、通常、ステロイド(特に、コレステロール)との組合わせである。他のリン脂質または他の脂質がまた、使用され得る。リポソームの物理的特性は、pH、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。
【0097】
リポソーム産生において有用な脂質の例示としては、ホスファチジル化合物(例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン)、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドが挙げられる。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。
【0098】
リポソームの標的化はまた、例えば、器官特異性、細胞特異性および小器官特異性に基づき得、そして当該分野において公知である。
【0099】
改変GDFプロペプチドを用いて上記の医療状態を処置または予防する方法はまた、TGF−β1スーパーファミリー中の他のタンパク質を阻害するために使用され得る。多くのこれらのタンパク質は、構造において、GDF−8(例えば、BMP−11)に関連する。よって、別の実施形態において、本発明は、GDF−8ではないタンパク質を阻害し得る改変GDFプロペプチドを、単独でかまたはGDF−8に対して改変GDFプロペプチドと組合わせて被験体に投与することによって上述の障害を処置する方法を提供する。
【0100】
(改変GDFプロペプチド組成物)
本発明は、改変GDFプロペプチドを含む組成物を提供する。このような組成物は、患者に対する薬学的用途および投与に適切であり得る。組成物は、典型的には、1つ以上の本発明の改変GDFプロペプチドおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含む。本明細書中で使用される場合、句「薬学的に受容可能な賦形剤」としては、薬学的投与に匹敵する以下が挙げられる:溶媒、分散媒体、コーティング、抗微生物剤および抗真菌剤、等張性剤および吸収遅延剤など。薬学的に活性な物質についてのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。例示的な薬学的に受容可能な賦形剤は、「The Handbook of Pharmaceutical Excipients」第3編、2000、Am.Pharmaceutical Press,A.E.Kibbe編に見出され得る。組成物はまた、補助的機能、付加的機能または増強された治療的機能を提供する他の活性化合物を含み得る。薬学的組成物はまた、投与のための指示書とともに容器、パックまたはディスペンサー中に含まれ得る。
【0101】
本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路に適合して処方される。投与を達成するための方法は、当業者に公知である。局所的または経口で投与され得る組成物、または粘膜を越えて透過され得る組成物を得ることもまた、可能であり得る。投与は、例えば、静脈内(I.V.)、腹腔内(I.P.)、筋肉内(I.M.)、腔内、皮下(S.C.)または経皮であり得る。好ましい実施形態としては、I.V.注入、I.P.注入、I.M.注入およびS.C.注入が挙げられる。1つの好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は、静脈内投与される。
【0102】
皮内適用または皮下適用に使用される溶液または懸濁物としては、典型的には、1つ以上の以下の成分が挙げられる:滅菌希釈剤(例えば、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒;抗菌剤(例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン);抗生物質(例えば、アスコルビン酸または二硫酸ナトリウム;キレート剤(例えば、エチレンジアミン四酢酸);緩衝液(例えば、酢酸、クエン酸またはリン酸);ならびに張度の調整のための薬剤(例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース)。pHは、酸または塩基(例えば、塩酸または水酸化ナトリウム)で調整され得る。このような調製物は、ガラス性またはプラスティック性のアンプル、ディスポーサブル注射器または複数用量のバイアル中に含まれ得る。
【0103】
注射に適切な薬学的組成物は、滅菌した注射可能な溶液または分散物の即席調製物のための、滅菌水溶液または分散物および滅菌粉末を含む。静脈内投与について、適切なキャリアとしては、生理食塩水、静菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)またはリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌されていなければならず、そして容易な注入可能性(syringability)が存在する程度まで流動性であるべきである。組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定であらねばならず、そして、微生物(例えば、細菌及び真菌)の夾雑する作用から保護されねばならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)、およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性が、例えば、コーティング(例えば、レチシン)の使用によって、分散物の場合では必要とされる粒子サイズの保持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物作用からの保護は、種々の抗微生物剤および抗真菌剤(例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど)によって達成され得る。多くの場合、等張剤(例えば、糖、ポリアルコール(例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム))を組成物中に含むことが、好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤(例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン)を組成物中に含むことによってもたらされ得る。
【0104】
経口組成物は、一般に、不活性な希釈剤または食用のキャリアを含む。例えば、これらは、ゼラチンカプセル中に含まれ得るかまたは錠剤中に含まれ得る。経口治療投与の目的で、GDFプロペプチドは、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチまたはカプセルの形態で使用され得る。薬学的に受容可能な結合剤、および/またはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分、または類似の性質の化合物のいずれかを含み得る;バインダー(例えば、微晶質セルロース、ゴムトラガカントまたはゼラチン);賦形剤(例えば、澱粉またはラクトース)、崩壊剤(例えば、アルギン酸)、プリモゲル(Primogel)またはコーンスターチ;潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロート(Sterote);滑走剤(glidant)(例えば、コロイド状二酸化シリコン);甘味剤(例えば、スクロースまたはサッカリン);あるいは、香味剤(例えば、ペパーミント、メチルサリチレート)またはオレンジ香味剤。
【0105】
吸入による投与について、GDFプロペプチドは、適切な推進剤(例えば、二酸化炭素のような気体)またはネブライザーを含む、加圧された容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレーの形態で送達され得る。
【0106】
全身性投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透されるバリアに対して適切な浸透剤が、処方物中に使用される。このような浸透剤は、一般に当該分野において公知であり、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーおよび坐剤の使用を介して達成され得る。経皮投与について、活性な化合物は、当該分野において一般に公知であるように、軟膏(ointment)、軟膏(salve)、ゲルまたはクリーム中に処方される。
【0107】
GDFプロペプチドはまた、坐剤または直腸送達のための保持浣腸の形態で(例えば、慣用的な坐剤ベース(例えば、カカオバターおよび他のグリセリド)とともに)調製され得る。
【0108】
1つの実施形態において、改変GDFプロペプチドは、その化合物を身体からの迅速な排出から保護するキャリア(例えば、徐放性処方物(移植物および微小カプセル化送達系を含む)とともに調製される。生分解性、生体適合性のポリマー(例えば、エチレンビニル酢酸、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ酪酸)が、使用され得る。このような処方物の調製法は、当業者に明らかである。これらの材料もまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals,Inc.より商業的に得られ得る。改変GDFプロペプチドを含むリポソーム懸濁物はまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って、調製され得る。
【0109】
投薬単位形態中に経口組成物または非経口組成物を調製することは、投与の容易性および投薬量の均一性のために特に有利である。本明細書中で使用される場合、投薬単位形態は、処置されるべき被験体に対する単位投薬量として適切な物理的分散型単位をいい;各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共同して所望の治療効果を産生するために計算された予め決められた量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、活性化合物の独特な特徴、および達成される特定の治療効果、そして個々の処置のためにこのような活性化合物を混合する分野において固有の制限によって示され、そして活性化合物の独特な特徴、および達成される特定の治療効果、そして個々の処置のためにこのような活性化合物を混合する分野において固有の制限に直接依存する。
【0110】
このような化合物の毒性および治療効率は、例えば、LD50(集団の50%に対する致死量)およびED50(集団の50%における治療的に効果的な用量)を決定するために、細胞培養物または実験動物中の標準的な薬学的手順により決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指標であり、そしてLD50/ED50の比として示され得る。大きな治療指数を示すGDFプロペプチドが、好ましい。
【0111】
細胞培養アッセイおよび動物研究より得られるデータが、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を処方する際に使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、ほとんど毒性を有さないかまたは全く毒性がないED50を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、利用される任意の投薬形態および使用される投与経路に依存する範囲内で変動し得る。本発明において使用される改変GDFプロペプチドについて、治療的に効果的な用量が、細胞培養アッセイより最初に見積もられ得る。細胞培養物中で決定されるようなIC50(すなわち、症状の半分最大阻害(half−maximal inhibition)を達成する、試験された、改変GDFプロペプチドの濃度)を含む循環血清濃度範囲を達成するために、用量は、動物モデルにおいて処方され得る。血清レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。任意の特定の投薬量の効果が、適切なバイオアッセイによってモニタリングされ得る。適切なバイオアッセイの例としては、DNA複製アッセイ、転写ベースのアッセイ、GDFタンパク質/レセプター結合アッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、プレ脂肪細胞の分化に基づくアッセイ、脂肪細胞におけるクルコース取り込みに基づくアッセイ、および免疫学的アッセイが挙げられる。
【0112】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を提供する。当業者は、本発明の範囲または精神を変更することなく実施され得る多くの改変および変化を認識する。このような改変および変化は、本発明の範囲内に含まれると考えられている。実施例は、本発明の限定の目的ではない。
【0113】
本出願を通して引用された全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容の全体は、本明細書中に参考として援用される。
【0114】
(実施例)
(実施例1:GDF−8の精製)
組換えヒトGDF−8タンパク質(成熟GDF−8+GDF−8プロペプチド)を発現する選択された細胞株からの馴化培地を、pH6.5に酸性化し、そして80×50mmのPOROS SP陽イオン交換カラムと直列の80×50mmのPOROS HQ陰イオン交換カラム(Perseptive Biosystems)にアプライした。フォロースルーを、pH5.0に調整し、75×20mmのPOROS SP陽イオン交換カラム(Perseptive Biosystems)にアプライし、NaCl勾配で溶出した。ドデシル硫酸ナトリウムゲルポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)で示されるような、GDF−8を含む画分を、プールし、トリフルオロ酢酸(TFA)でpH2〜3に酸性化し、次いで、粘度より低くするために0.1%TFAで200mlまで増やした。次いで、このプールを、60×21.2mmガードカラム(Phenomenex)が先行する250×21.2mm C5カラム(Phenomenex)にアプライし、TFA/CH3CN勾配で溶出し、GDF−8プロペプチドから成熟GDF−8を分離した。成熟GDF−8を含有するプールした画分を、凍結乾燥によって濃縮してアセトニトリルを除去し、20mlの0.1% TFAを添加した。次いで、サンプルを、分離の目的で60℃に過熱された250×10mm C5カラム(Phenomenex)にアプライした。これを、さらなる分離がもはや達成され得なくなるまで反復した。次いで、成熟GDF−8を含む画分を、プールし、40%アセトニトリルまで増やし、そして60×21.2mmガードカラム(Phenomenex)が先行する600×21.2mm BioSep S−3000サイズ排除カラム(Phenomenex)にアプライした。精製された成熟GDF−8を含む画分をプールし、次の実験における使用のために濃縮した。成熟GDF−8ダイマーの典型的な収量は、馴化培地1リットル当たり0.33mgタンパク質であった。
【0115】
GDF−8プロペプチドを含むC5カラム画分をプールし、アセトニトリルを蒸発により除去し、20mlの0.1%TFAを加え、次いで、このサンプルを、60℃で250×10mm C5カラム上に注入した。これを、さらなる分離がもはや達成され得なくなるまで反復した。次いで、GDF−8プロペプチドを含む画分をプールし、40%アセトニトリルまで増やし、そして60×21.2mmガードカラムが先行する600×21.2mm BioSep S−3000サイズ排除カラム(Phenomenex)にアプライした。精製されたGDF−8を含む画分をプールし、次の実験における使用のために濃縮した。GDF−8プロペプチドの典型的な収量は、馴化培地1リットル当たり0.24mgタンパク質であった。
【0116】
SDS−PAGE上で、精製した成熟GDF−8は、非還元状態で25kDaでのブロードなバンド、そして還元状態で13kDaとして移動した。類似のSDS−PAGEプロファイルが、マウスGDF−8について報告されており(McPherronら(1997)Nature 387:83−90)、成熟タンパク質のダイマー特性を反映している。
【0117】
精製GDF−8プロペプチドの見かけの分子量は、還元条件下および非還元条件下の両方で38kDaであった。このことは、GDF−8プロペプチドが、モノマーであることを示している。GDF−8プロペプチドの見かけの分子量と推定分子量(約26kDa)との間の差異は、糖質の付加を反映し得る。なぜなら、そのアミノ酸配列は、潜在的なN結合型グリコシル化部位を含むからである(McPherronら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12457−12461)。従って、上記のプロセスは、精製されかつ活性な成熟GDF−8ダイマーおよびGDF−8プロペプチドの生成をもたらす。
【0118】
(実施例2:精製組換えヒトGDF−8の特徴づけ)
精製成熟GDF−8および精製GDF−8プロペプチドの各々50μgを混合し、50mM リン酸ナトリウム(pH7.0)に透析し、300×7.8mm BioSep S−3000サイズ排除カラム(Phenomenex)に対してクロマトグラフィーにかけた。成熟GDF−8/プロペプチド複合体の分子量は、同じカラムに対してクロマトグラフィーにかけた分子量標準(Bio−Rad Laboratories,Hercules,CA)を用いて、溶出時間から決定した。
【0119】
精製GDF−8プロペプチドを精製成熟GDF−8とともに中性pHでインキュベートした場合、2つのタンパク質は、サイズ排除プロフィールにより示されたように、複合体化するようであった。12.7分にて溶出された主要なタンパク質ピークは、同じカラムに対してクロマトグラフィーにかけた分子量標準(Bio−Rad Laboratories,Hercules,CA)から78kDaの予測分子量を有した。複合体のサイズは、プロペプチドの2つのモノマーと会合し、従ってテトラマー複合体を形成する、成熟GDF−8の1つのダイマーと極めて一致する。
【0120】
この観察を確認するために、成熟GDF−8およびGDF−8プロペプチド両方を含む調製物を、100mM 1−エチル 3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロリド(EDC,Pierce)とともに、またはこれを伴わずに、室温にて1時間インキュベートし、HClによりpH2〜3に酸性化し、トリシン緩衝化10%アクリルアミドゲルを使用するSDS−PAGEのためにMicron−10濃縮器(Amicon)で濃縮した。タンパク質を、クーマシーブルー染色により可視化した。約75kDの分子量に対応するバンドを、EDCを添加したサンプル中でのみ観察し、コントロールレーンにおいては観察しなかった。これにより、GDF−8成熟/GDF−8プロペプチド複合体の存在が確認された。このことは、このアッセイが、精製成熟GDF−8ダイマーの活性および濃度を測定するために有用であると立証する。
【0121】
(実施例3:精製GDF−8のインビトロ生物学的活性)
GDF−8の活性を実証するために、レポーター遺伝子アッセイ(RGA)を、ルシフェラーゼに連結したレポーターベクターpGL3(CAGA)12配列を用いて開発した。CAGA配列は、以前、TGF−β誘導性遺伝子PAI−1のプロモーター内のTGF−β応答性配列であると報告されている(Dennlerら(1998)EMBO J.17:3091−3100)。
【0122】
12のCAGAボックスを含むレポーターベクターを、基本的なレポータープラスミドpGL3(Promega Corporation,Madison,WI,USA,カタログ番号E1751)を使用して作製した。アデノウイルス主要後期プロモーターからのTATAボックスおよび転写開始部位(−35/+10)を、BglII部位とHindIII部位との間に挿入した。CAGAボックス(AGCCAGACA)の12の反復を含むオリゴヌクレオチドをアニールして、XhoI部位にクローニングした。ヒト横紋筋肉腫細胞株A204(ATCC HTB−82)を、FuGENE6トランスフェクション試薬(Roche Diagnostics,Indianapolis,USA、カタログ番号1814443)を使用して、pGL3(CAGA)12で一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞を、2mM グルタミン、100U/mlストレプトマイシン、100μg/mlペニシリンおよび10%ウシ胎仔血清を補充したマッコイ5A培地(Life Technologies、Rockville,Maryland,USA、カタログ番号21500−079)中で48ウェルプレートにて16時間培養した。次いで、細胞を、グルタミン、ストレプトマイシン、ペニシリンおよび1mg/mlウシ血清アルブミンを含有するマッコイ5A培地中、GDF−8、BMP−11またはアクチビンを用いて、37℃にて6時間処理した。ルシフェラーゼをLuciferase Assay System(Promega Corporation,Madison,WI,USA,カタログ番号E1483)を用いて処理細胞中で定量した。アッセイ結果を、図1に例示する。GDF−8については、結果を、3つの別々の実験についての平均±S.E.として表した。BMP−11およびアクチビンについては、結果は、2つの別々の実験の代表である。
【0123】
結果は、GDF−8が、最大でレポーター構築物を10倍活性化した(10ng/ml GDF−8のED50)ことを示す。このことは、精製組換えGDF−8が生物学的に活性であったことを示す。BMP−11(これは、アミノ酸レベルでGDF−8に90%同一である(Gamerら(1999)Dev.Biol.208:222−232およびNakashimaら(1999)Mech.Dev.80:185−189))およびアクチビンは、類似の生物学的応答を誘発した。このことは、レポーター遺伝子アッセイが、GDF−8、BMP−11またはアクチビンのインビボでの生物学的活性を検出するに適切なアッセイであることを示す。
【0124】
(実施例4:精製GDF−8の結合特性)
GDF−8潜在性複合体(latent complex)を、20モルのEZ−結合スルホ−NHS−ビオチン(Pierce,Rockford、Illinois,USA、カタログ番号21217) 対 1モルのGDF−8複合体の比にて、2時間氷上でビオチン化して、0.5% TFAで不活性化し、C4 Jupiter 250×4.6mmカラム(Phenomenex)に対してクロマトグラフィーに供して、成熟GDF−8をGDF−8プロペプチドから分離した。TFA/CH3CN勾配で溶出したビオチン化成熟GDF−8画分をプールし、濃縮し、MicroBCAタンパク質アッセイ試薬キット(Pierce,Rockford,IL,USA、カタログ番号23235)により定量した。
【0125】
組換えActRIIB−Fcキメラ(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA、カタログ番号339−RB/CF)を96ウェル平底アッセイプレート(Costar,NY,カタログ番号3590)に、0.2M 炭酸ナトリウム緩衝液中に1μg/mlで、一晩4℃にてコーティングした。次いで、プレートを、1mg/mlウシ血清アルブミンでブロックし、標準的なELISAプロトコルに従って洗浄した。種々の濃度のビオチン化GDF−8のアリコート100μlを、ブロッキングしたELISAプレートに添加し、1時間インキュベートし、洗浄し、結合したGDF−8の量を、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(SA−HRP,BD PharMingen,San Diego,CA,USA、カタログ番号13047E)、続いて、TMB(KPL,Gaithersburg,Maryland,USA,カタログ番号50−76−04)の添加により検出した。比色測定を、450nMにて、Molecular Devicesマイクロプレートリーダーで行った。
【0126】
図2に示されるように、ActRIIB(12ng/mlのED50を有する推定GDF−8II型レセプター)に結合したビオチン化GDF−8は、ActRII結合アッセイがGDF−8についてのインビトロ結合アッセイにおいて感受性であることを示す。
【0127】
(実施例5:GDF−8プロペプチドによるGDF−8およびBMP−11の阻害)
GDF−8をGDF−8プロペプチドと室温にて1時間予めインキュベートした場合、GDF−8の生物学的活性が減少した。図3は、GDF−8プロペプチドの存在下で、GDF−8についてのED50(10ng/ml)でのpGL3(CAGA)12レポーター活性の誘導を示す。GDF−8プロペプチドは、用量依存性様式にてGDF−8誘導を減少させた(25ng/ml(0.6nM)のIC50)。GDF−8プロペプチドはまた、同程度までBMP−11の生物学的活性を阻害した。対照的に、このアッセイにおけるアクチビンの活性は、おそらく、GDF−8とアクチビンとの間の比較的低い相同性に起因して、GDF−8およびBMP−11と比較して、GDF−8プロペプチドにより影響を受けなかった。
【0128】
同様に、図4は、GDF−8プロペプチドと5ng/mlのビオチン化GDF−8とを予めインキュベートしたことにより、実施例4に記載されるように、ActRIIB結合アッセイにおいてActRIIBへのGDF−8結合が阻害された(0.3nMのIC50)ことを示す。結論として、本発明のGDF−8プロペプチドは、レポーター遺伝子アッセイおよびActRIIB結合アッセイにおいて測定されるように、インビトロでのGDF−8活性およびBMP−11活性の強力なnM未満で有効な(subnanomolar)インヒビターである。従って、このアッセイは、GDF−8プロペプチドが活性でありかつこのアッセイにおけるGDF−8活性の強力なインヒビターであることを示す。
【0129】
(実施例6:GDF−8プロペプチドによるGDF−8−レセプター結合の阻害)
GDF−8を、100〜200μCi/μgの比活性へとFrolikら(1984)J.Biol.Chem.259:10995−10999により記載されるようにクロラミンTでヨウ化した。ヨウ化GDF−8は、実施例3に記載される(CAGA)12レポーターアッセイにおいて非標識GDF−8と匹敵する生物学的活性を示した。125I標識GDF−8を筋芽細胞株L6に対する特異的結合について評価した。
【0130】
L6筋芽細胞(ATCC CRL−1458)を、ゼラチン化24ウェルプレートにてダルベッコ改変イーグル培地(10%熱非働化ウシ胎仔血清を補充)中でコンフルエントになるまで増殖させた。平衡結合をSongら(1995)Endocrinology 136:4293−4297(その全体が本明細書中に参考として援用される)に記載されるように行った。1ng/mlの125I GDF−8(非標識GDF−8ありまたはなし)をコンフルエントなL6細胞と4℃にて4時間インキュベートした。細胞を洗浄した後、結合した[125I]GDF−8を抽出し、γカウンターで定量した。結果を三連の測定の平均±S.E.として表し、3つの別個の実験の代表である。
【0131】
図5に示されるように、125I−GDF−8は、L6細胞に高親和性で結合した。注意すべきことは、TGF−β1ではなくBMP−11が125I GDF−8結合に取って代わり、このことは、GDF−8およびBMP−11(TGF−β1ではない)がこれらの細胞上の共通のレセプターを共有することを示す(データは示さず)。GDF−8結合のスキャッチャード分析から、Kdが140pMであると予測した。さらに、1ng/mlの125I−GDF−8を、GDF−8プロペプチドと室温にて1時間予めインキュベートした場合、L6細胞への特異的GDF−8結合は、漸増濃度の非標識GDF−8プロペプチドにより阻害され得た(図6)。結果を、三連の測定の平均±S.E.として表し、2つの別個の実験の代表である。1ng/mlのGDF−8のIC50は、140ng/mlのGDF−8プロペプチドであった。これらのデータにより立証されるように、GDF−8プロペプチドは、GDF−8レセプター結合をブロックすることによりGDF−8生物学的活性を阻害する。
【0132】
(実施例7:GDF−8プロペプチド−Fc融合タンパク質によるGDF−8活性の阻害)
以下の実施例8に示されるように、マウスGDF−8プロペプチドは、インビボにて比較的短い半減期を有する。GDF−8プロペプチドのバイオアベイラビリティーを増大させるために、GDF−8プロペプチドとマウスIgG2a Fc領域との間の融合物を、標準的な遺伝子操作技術を使用して構築した。
【0133】
Steurerら(1995)J.Immunol.155:1165−1174に記載のように、4つの変異をFc領域に導入して、エフェクター機能を減少させた。標準的なPCR方法論を使用して、2つの融合構築物を、マウスGDF−8プロペプチド(アミノ酸1〜267)をコードするcDNAをマウスIgG2a Fc領域に融合することにより調製した(図7)。融合物1(図7A)は、ヒンジ部分の最初のアミノ酸にて開始するマウスIgG2a Fc領域の233アミノ酸にインフレームにて融合されたマウスGDF−8プロペプチド(24アミノ酸の分泌リーダーを含む)の最初の265アミノ酸をコードする。融合物2(図7B)は、短いグリシン−セリン−グリシン−セリン(GSGS)リンカーがGDF−8プロペプチドをマウスFc領域から分離することを除いて、融合物1に類似の様式で構築される。
【0134】
2つのキメラを、真核生物発現ベクターpED(Kaufmanら(1991)Nucleic Acids Res.19:4485−4490)に導入し、製造業者のプロトコルに従って、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬(Gibco BRL,Life Technologies,Rockville,Maryland,USA,カタログ番号11668−019)を使用して、COS−1 M6細胞(Horowitzら(1983)Journal of Molecular and Applied Genetics 2:147−159)において一過性に発現させた。24時間インキュベートした後、R1CD1(改変DMEM/F12無血清培養培地)を添加した。馴化培地(CM)をプールし、新たなR1CD1と交換し、CMを60時間後に再び採取した。次いで、馴化培地をプールし、1/10容量の1M Tris pH8.0を添加した後に、プロテインAセファロースCL−4B(Amersham Pharmacia Biotech,Buckinghamshire,HP7 9NA,England,カタログ番号17−07080−01)に通して精製した。精製タンパク質を、0.1M 酢酸、150mM NaClにて溶出し、1/20容量の3M Tris pH9.0で直ぐに中和した。タンパク質を、標準的なマウスIgG ELISAプロトコルを使用して定量し、実施例5に記載されるように、精製ヒトGDF−8プロペプチドを伴ったActRIIB競合ELISAにおいてアッセイした。結果を図8に示す。GDF−8プロペプチド−Fc融合物のIC50は、低いナノモル範囲にあり、融合物1と融合物2との間には差異はない。融合物1(GDF−8プロペプチドとマウスIgG2aとの間にリンカーなし)を、安定なCHO細胞株を作製する際に使用するために選択し、RGAアッセイにおいてGDF−8の阻害を試験した。
【0135】
GDF−8プロペプチド−Fc cDNAを、Thiesら(2001)Growth Factors 18:251−259(その全体が本明細書中に参考として援用される)に記載されるように、CHO発現プラスミドpHTopにサブクローニングし、CHO/A2細胞にトランスフェクトした。安定な細胞株(PF−4/0.02)を、0.02M メトトレキセート中で細胞を選択することにより樹立した。選択された株由来のGDF−8プロペプチド−Fc融合タンパク質を含む馴化培地を採取し、10% v/v 1M Tris pH8.0を添加することによりそのpHを合わせ、50mM Tris 150mM NaCl pH7.5で予め平衡化したPharmacia rProteinA Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech,Buckinghamshire,HP7 9NA,England,カタログ番号17−1279−02)に通して精製した。画分を、100mM 酢酸、150mM NaCl pH2.5で溶出し、5% v/v 3M Tris pH9.0を添加することにより直ぐ中和した。ピーク画分をプールし、Pharmacia Superdex 200サイズ排除カラム(Amersham Pharmacia Biotech,Buckinghamshire,HP7 9NA,England,カタログ番号17−1069−01))にロードした。0.05% Tween80を画分に添加して、凝集を防止した。画分を、Novex 10% トリシンゲル(Novex,San Diego,CA,USA,カタログ番号EC66755)上でSDS−PAGEにより評価した。
【0136】
プールした画分を、分光光度計により定量し、実施例4に記載されるActRIIB結合アッセイ、およびレポーター遺伝子アッセイにおいて活性についてアッセイした(図9)。精製GDF−8プロペプチド−Fc融合物のIC50は、1.3nMであった。このデータは、GDF−8プロペプチド−Fc融合タンパク質を含む本発明の改変GDF−8プロペプチドが、GDF−8プロペプチドと比較して、強力な阻害性(中和)活性を保持していることを示す。
【0137】
(実施例8:薬物動態)
GDF−8プロペプチド(本明細書中「GDF8−Pro」といわれる)およびGDF−8プロペプチド−FC融合タンパク質(本明細書中「GDF8−ProFc」といわれる)の薬物動態(PK)を、1回の静脈内投与の後に、0.2μg/マウス(GDF8−Pro)または2μg/マウス(GDF8−ProFc)の用量にて、C57Bl/6Jマウスにおいて評価した。動物に、非標識GDF8−Proおよび125I標識GDF8−Proの混合物または非標識GDF8−ProFcおよび125I標識GDF8−ProFcの混合物を上記の用量にて与え、血清中の125I放射活性および注射用量の比活性に基づいて、血清濃度を決定した。図10は、GDF8−ProおよびGDF8−ProFc両方についての血清濃度 対 時間曲線を示す。表1は、1回の静脈内注射(2μg/マウス)の後にGDF8−ProおよびGDF8−ProFcについてのPKパラメーターを示す。GDF8−Proについての血清濃度およびPKパラメーターを、比較目的のために、2μg/マウスの用量に対して正規化した。
【0138】
【表2】
T1/2:終期排泄相の間の半減期
Cmax:ピーク血清濃度
MRT:平均残留時間
V1:分布の開始容量
Vss:定常状態の分布の容量
註:GDF−8−Pro PKパラメーターは、2μg/マウスの容量に対して正規化した。
【0139】
図10に認められ得るように、GDF8−Proと比較してGDF8−ProFcは、クリアランスが400倍遅く、半減期が100倍長かった。分布の開始容量および定常状態の分布の容量の両方は、GDF8−ProFcと比較して、GDF8−Proが約3倍大きかった。このことは、GDF8−Proが、GDF8−ProFcと比較して、血管空間の外側により大きな程度まで分布することを示す。
【0140】
IgG分子のFc領域のGDFプロペプチドに対する安定化効果は、マウスGDFプロペプチド−Fc融合タンパク質(すなわち、両方の成分がマウス由来)を使用して例示されるが、本発明の方法は、特定の前駆体タンパク質にもIgG成分が由来する動物種にも関係なく、融合タンパク質が適切に構築されて、(すなわち、本明細書中に記載されるように)活性を保持するのであれば、GDFプロペプチドおよびIgG成分の任意の組み合わせに適用され得る。
【0141】
(実施例9:2つのヒトGDF−8プロペプチドFc融合物の誘導および活性)
2つのGDF−8プロペプチド−Fc融合構築物を、標準的なPCR方法論を使用して、治療可能性の評価のために調製した。ヒトGDF−8プロペプチド(配列番号5)をコードするcDNAを、ヒトIgG1 Fc領域(配列番号15;図11A)またはエフェクター機能の減少のために改変したヒトIgG1Fc領域(配列番号16;図11B)に融合した。
【0142】
1.ヒトGDF−8プロペプチド−IgG1 wt Fc融合タンパク質(図11A):
ヒトGDF−8プロペプチド(配列番号5のアミノ酸1〜241および配列番号13に示される23アミノ酸のシグナルペプチドを含む)の最初の264アミノ酸を、ヒンジ領域の最初のアミノ酸にて開始する、ヒトIgG1定常領域の232アミノ酸(配列番号15)とインフレームで融合した。
【0143】
2.ヒトGDF−8プロペプチド−IgG1変異体(図11B):
上記のように、ヒトGDF−8プロペプチドの最初の264アミノ酸を、変異したヒトIgG1 Fc領域の227アミノ酸(配列番号16)とインフレームで融合した。2つの変異(配列番号16に示されるアラニン残基(Ala−14およびAla−17))を、Lundら(1991)J.Immun.147:2657−2662およびMorganら(1995)Immunology 86:319−324に記載されるように、エフェクター機能を減少させるために導入した。
【0144】
2つの融合タンパク質を、真核生物発現ベクターpED(Kaufmanら(1991)Nucleic Acids Res.19:4485−4490)に導入し、製造業者のプロトコルに従って、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬(Gibco BRL,Life Technologies,Rockville,Maryland,USA,カタログ番号11668−019)を使用して、COS−1 M6細胞(Horowitzら(1983)Journal of Molecular and Applied Genetics 2:147−159)において一過性に発現させた。24時間インキュベートした後、R1CD1(改変DMEM/F12無血清培養培地)を添加した。馴化培地(CM)をプールし、新たなR1CD1と交換し、CMを60時間後に再び採取した。次いで、馴化培地をプールし、1/10容量の1M Tris pH8.0を添加した後に、プロテインAセファロースCL−4B(Amersham Pharmacia Biotech,Buckinghamshire,HP7 9NA,England,カタログ番号17−07080−01)に通して精製した。精製タンパク質を、0.1M 酢酸、150mM NaClにて溶出し、1/20容量の3M Tris pH9.0で直ぐに中和した。タンパク質を、標準的なヒトIgG ELISAプロトコルを使用して定量し、実施例5に記載されるように、精製ヒトGDF−8プロペプチドを伴ったActRIIB結合アッセイにおいてアッセイした。結果を図12に示す。結論として、両方のヒトプロペプチドFc融合タンパク質が、ActRIIBへのGDF−8結合の強力なインヒビターである。
【0145】
(実施例10:GDF−8プロペプチド−Fc融合タンパク質のインビボ試験)
マウスGDF−8プロペプチド−Fc融合タンパク質(実施例9から)を、成体マウスにおいて試験した。7〜9週齡の成体雌性BALB/cマウスを体重に関して無作為化し、7つの群にした(処置なし群は、6匹のマウスであることを除く)。マウスを5週間にわたり、動物1匹あたり、10μg、100μg、または1000μgの1週間の総量を伴って、I.P.注射により1週間に2回投薬した。コントロール注射は、高用量のプロペプチド−Fcに対して等モル量のマウスIgG2a−Fcとした。この研究の終わりに、腓腹筋、四頭筋、精巣上体脂肪パッド、腎臓、および肝臓を取り出し、秤量した。図13は、平均組織質量(エラーバーは、平均の標準誤差を示す)を示す。アスタリスク(*)は、コントロールタンパク質IgG2aFcを用いて処置したマウスと比較した場合の、統計的有意差(p<0.01(ステューデントT検定を使用))を示す。GDF−8プロペプチド−Fc融合タンパク質のI.P.注射(1mg/週)(処置マウス)によるインビボでのGDF−8活性のブロッキングは、GDF−8プロペプチド−Fc融合タンパク質を与えなかったコントロールマウスと比較して、腓腹筋質量において6.2%の増加、および四頭筋質量において11.3%の増加を生じた。さらに、GDF−8プロペプチド−Fc融合タンパク質のI.P.注射(100μg/週)(処置マウス)によるインビボでのGDF−8活性のブロッキングは、脂肪パッド質量において23.0%の増加を生じた。高用量(1mg/週)の処置はまた、脂肪パッド質量の減少をもたらしたが、脂肪パッド質量の変動性に起因して、統計学的有意差はあまりなかった(p=0.047)。試験した他の組織(肝臓および腎臓を含む)の質量に対する処置の効果はなかった。まとめると、改変GDF−8プロペプチドは、インビボでGDF−8活性をブロックし、筋肉質量の増加および脂肪質量の減少をもたらす。まとめると、GDF−8プロペプチド−Fc融合タンパク質のI.P.注射(処置マウス)によるインビボでのGDF−8活性のブロッキングは、GDF−8プロペプチド−Fc融合タンパク質を与えなかったコントロールマウスと比較して、腓腹筋および四頭筋の質量の増加を生じた。
【0146】
(等価物)
当業者は、本明細書中に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、慣用的な実験法のみを使用して認識しまたは確認し得る。このような等価物は、特許請求の範囲により含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【0147】
【図1】図1は、レポーター遺伝子アッセイにおける、GDF−8、BMP−11、およびアクチビンの相対的生物学的活性を示す。
【図2】図2は、ActRIIB結合アッセイにおける、精製ビオチニル化ヒトGDF−8の結合特性を示す。
【図3】図3は、GDF−8プロペプチドの存在下での、GDF−8、BMP−11、およびアクチビンについてED50でのpGL3(CAGA)12レポーター活性の誘導を示す。
【図4】図4は、GDF−8プロペプチドによる、ActRIIBへのビオチニル化GDF−8結合の用量依存性阻害を示す。
【図5】図5は、L6細胞へのGDF−8の結合を示す。
【図6】図6は、GDF−8プロペプチドによる、L6細胞へのGDF−8特異的結合の用量依存性阻害を示す。
【図7】図7Aは、成熟GDF−8プロペプチド−Fc融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。図7Bは、Fc領域からGDF−8プロペプチドを隔てる短いグリシン−セリン−グリシン−セリン(GSGS)リンカーを備えた、マウスGDF−8プロペプチド−Fc融合タンパク質を示す。
【図8】図8Aは、ActRIIB競合ELISAにおけるGDF−8結合に対する、ヒトGDF−8プロペプチドおよび2つのマウスGDF−8プロペプチド−Fc融合タンパク質の効果を示す。図8Bは、ヒトGDF−8プロペプチドと2つのマウスGDF−8プロペプチド−Fc融合タンパク質のIC50を比較する表である。
【図9】図9は、レポーター遺伝子アッセイにおける、ヒトGDF−8プロペプチドおよびマウスGDF−8プロペプチド−Fc融合タンパク質の相対的生物学的活性を示す。
【図10】図10は、それぞれ、0.2μg/マウスまたは2μg/マウスの単回静脈投与後の、ヨウ化GDF−8プロペプチドおよびGDF−8プロペプチド−Fc融合タンパク質の薬理動態を示す。
【図11A】図11Aは、ヒトGDF−8プロペプチド−IgG1 Fc融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図11B】図11Bは、エフェクター機能の減少のために改変した、ヒトGDF−8プロペプチド−IgG1 Fc融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図12】図12は、ヒトGDF−8プロペプチドおよび2つのヒトGDF−8プロペプチド−Fc融合タンパク質による、ActRIIB競合ELISAにおけるGDF−8結合の用量依存性阻害を示す。
【図13】図13は、インビボで投与した改変GDF−8プロペプチドが、未処理マウスまたはコントロールタンパク質IgG2aFc処理マウスと比較して、腓腹四頭筋量を増加させ、脂肪量を減少させるが、腎臓量にも肝臓量にも影響しないことを示す、グラフである。
【図14A】図14Aは、配列番号1〜16に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図14B】図14Bは、配列番号1〜16に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図14C】図14Cは、配列番号1〜16に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図14D】図14Dは、配列番号1〜16に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図14E】図14Eは、配列番号1〜16に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図14F】図14Fは、配列番号1〜16に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図14G】図14Gは、配列番号1〜16に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図14H】図14Hは、配列番号1〜16に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図14I】図14Iは、配列番号1〜16に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図14J】図14Jは、配列番号1〜16に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図14K】図14Kは、配列番号1〜16に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図14L】図14Lは、配列番号1〜16に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図14M】図14Mは、配列番号1〜16に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図14N】図14Nは、配列番号1〜16に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図14O】図14Oは、配列番号1〜16に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図14P】図14Pは、配列番号1〜16に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
Claims (124)
- GDF−8プロペプチドを含む改変GDF−8プロペプチドであって、ここで、該改変GDF−8プロペプチドは、対応する未改変GDF−8プロペプチドと比較して増大したインビボ半減期またはインビトロ半減期を有する、改変GDF−8プロペプチド。
- 前記GDF−8プロペプチドが、配列番号5に対して少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の改変GDF−8プロペプチド。
- 前記GDF−8プロペプチドが、配列番号5と同一である、請求項1に記載の改変GDF−8プロペプチド。
- 前記GDF−8プロペプチドが、不活性化されたタンパク質分解切断部位を含む、請求項1に記載の改変GDF−8プロペプチド。
- 前記タンパク質分解切断部位が、該部位への変異によって不活性化されている、請求項4に記載の改変GDF−8プロペプチド。
- 請求項1に記載の改変GDF−8プロペプチドであって、ここで、該改変GDF−8プロペプチドは、前記GDF−8プロペプチドに融合される安定化部分をさらに含む、改変GDF−8プロペプチド。
- 前記安定化部分が、IgG分子のFc領域を含む、請求項6に記載の改変GDF−8プロペプチド。
- 前記IgG分子が、IgG1もしくはIgG4、またはこれらの誘導体である、請求項7に記載の改変GDF−8プロペプチド。
- 前記IgG分子が、IgG1である、請求項7に記載の改変GDF−8プロペプチド。
- 前記IgG分子のアミノ酸配列が、配列番号15に対して少なくとも75%同一である、請求項7に記載の改変GDF−8プロペプチド。
- 前記IgG分子のアミノ酸配列が、配列番号15である、請求項7に記載の改変GDF−8プロペプチド。
- 前記IgG分子のアミノ酸配列が、配列番号16に対してに少なくとも75%同一である、請求項7に記載の改変GDF−8プロペプチド。
- 前記IgG分子のアミノ酸配列が、配列番号16である、請求項7に記載の改変GDF−8プロペプチド。
- 前記GDF−8プロペプチドが、リンカーペプチドを介して前記IgG分子のFc領域と融合した、請求項6に記載の改変GDF−8プロペプチド。
- 変更されたグリコシル化部位を有する、請求項1に記載の改変GDF−8プロペプチド。
- 少なくとも1つの炭水化物部分を含む、請求項1に記載の改変GDF−8プロペプチド。
- 前記安定化部分が、アルブミンまたはアルブミン誘導体を含む、請求項6に記載の改変GDF−8プロペプチド。
- 前記安定化部分が、非タンパク質ポリマーを含む、請求項6に記載の改変GDF−8プロペプチド。
- 請求項1に記載の改変GDF−8プロペプチドであって、該改変GDF−8プロペプチドは、1つ以上の点変異をさらに含み、該点変異は、タンパク質分解切断を阻害する、改変GDF−8プロペプチド。
- 精製タグをさらに含む、請求項1に記載の改変GDF−8プロペプチド。
- 改変GDF−8プロペプチドをコードする核酸であって、該改変GDF−8プロペプチドは、対応する未改変GDF−8プロペプチドと比較して、増大したインビボ半減期またはインビトロ半減期を有する、核酸。
- 配列番号2に示される少なくとも20個連続するヌクレオチドを含む、請求項21に記載の核酸。
- 配列番号6に示される少なくとも20個連続するヌクレオチドを含む、請求項21に記載の核酸。
- 配列番号2に示される少なくとも50個連続するヌクレオチドを含む、請求項21に記載の核酸。
- 配列番号6に示される少なくとも50個連続するヌクレオチドを含む、請求項21に記載の核酸。
- 安定化部分をコードする核酸をさらに含む、請求項21に記載の核酸。
- 前記安定化部分が、IgGタンパク質をコードする、請求項26に記載の核酸。
- 前記安定化部分が、アルブミンまたはアルブミン誘導体をコードする、請求項26に記載の核酸。
- 変更されたグリコシル化部位を有する改変GDF−8プロペプチドをコードする、請求項21に記載の核酸。
- 変更された炭水化物部分を有する改変GDF−8プロペプチドをコードする、請求項21に記載の核酸。
- 請求項1に記載の改変GDF−8プロペプチドおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
- 請求項21に記載の核酸および薬学的に受容可能なキャリアまたはベクターを含む、薬学的組成物。
- 改変GDF−8プロペプチドを作製する方法であって、該方法は、以下:
(a)該GDF−8プロペプチドをコードするcDNA分子を調製する工程であって、ここで、タンパク質分解切断部位が改変される、工程;
(b)IgG分子のFc領域をコードするcDNA分子を調製する工程;ならびに
(c)工程(a)および工程(b)からのcDNA分子を融合して、改変GDF−8プロペプチドを生成する工程、
を包含する、方法。 - 請求項33に記載の方法であって、リンカーペプチドをコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを調製する工程、ならびに工程(a)および工程(b)からのcDNA分子を、該リンカーペプチドをコードする二本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に融合する工程をさらに包含する、方法。
- 前記リンカーペプチドが、GSGSからなるアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の方法。
- 改変GDF−8プロペプチドをコードする核酸を含む、組換え細胞。
- 前記核酸が、安定化部分をコードする核酸配列を含む、請求項36に記載の組換え細胞。
- 医学的障害または医学的疾患に罹患する患者を処置する方法であって、該方法は、治療有効量の改変GDF−8プロペプチドおよび薬学的に受容可能な賦形剤を該患者に投与する工程であって、ここで、該改変GDF−8プロペプチドは、対応する未改変GDF−8プロペプチドと比較して増大したインビボ半減期またはインビトロ半減期を有する、工程、を包含する、方法。
- 前記GDF−8プロペプチドが、配列番号5に対して少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項38に記載の方法。
- 前記GDF−8プロペプチドが、配列番号5である、請求項38に記載の方法。
- 前記GDF−8プロペプチドが、1つ以上のタンパク質分解切断部位に変異を含む、請求項38に記載の方法。
- 前記改変GDF−8プロペプチドが、IgG分子のFc領域をさらに含む、請求項38に記載の方法。
- 前記IgG分子が、IgG1もしくはIgG4、またはこれらの誘導体である、請求項42に記載の方法。
- 前記IgG分子が、IgG1である、請求項42に記載の方法。
- 前記IgG分子が、配列番号15に対して少なくとも75%同一である、請求項42に記載の方法。
- 前記IgG分子のFc領域が、配列番号15と同一である、請求項42に記載の方法。
- 前記IgG分子が、配列番号16に対して少なくとも75%同一である、請求項42に記載の方法。
- 前記IgG分子のFc領域が、配列番号16と同一である、請求項42に記載の方法。
- 前記改変GDF−8プロペプチドが、変更されたグリコシル化部位を有する、請求項38に記載の方法。
- 前記改変GDF−8プロペプチドが、少なくとも1つの炭水化物部分を含む、請求項38に記載の方法。
- 前記改変GDF−8プロペプチドが、アルブミンまたはアルブミン誘導体をさらに含む、請求項38に記載の方法。
- 前記改変GDF−8プロペプチドが、非タンパク質ポリマーをさらに含む、請求項38に記載の方法。
- 前記医学的障害が、筋障害、神経筋障害、代謝障害または骨変性障害である、請求項38に記載の方法。
- 前記医学的障害が、筋障害または神経筋障害である、請求項38に記載の方法。
- 前記医学的障害が、代謝障害である、請求項38に記載の方法。
- 前記医学的障害が、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮、うっ血性閉塞性肺疾患、筋るいそう症候群、筋肉減少症または悪液質である、請求項38に記載の方法。
- 前記医学的障害が、筋萎縮性側索硬化症または筋ジストロフィーである、請求項38に記載の方法。
- 前記医学的障害が、肥満、脂肪組織障害、非インスリン依存性糖尿病、または2型糖尿病である、請求項38に記載の方法。
- 前記医学的障害が、骨粗鬆症である、請求項38に記載の方法。
- BMP−11プロペプチドを含む改変BMP−11プロペプチドであって、ここで、該改変BMP−11プロペプチドは、対応する未改変BMP−11プロペプチドと比較して増大したインビボ半減期またはインビトロ半減期を有する、改変BMP−11プロペプチド。
- 前記BMP−11プロペプチドが、配列番号11に対して少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項60に記載の改変BMP−11プロペプチド。
- 前記BMP−11プロペプチドが、配列番号11と同一である、請求項60に記載の改変BMP−11プロペプチド。
- 前記BMP−11プロペプチドが、不活性化されたタンパク質分解切断部位を含む、請求項60に記載の改変BMP−11プロペプチド。
- 前記タンパク質分解切断部位が、該部位への変異によって不活性化される、請求項62に記載の改変BMP−11プロペプチド。
- 請求項60に記載の改変BMP−11プロペプチドであって、ここで、該改変BMP−11プロペプチドは、前記BMP−11プロペプチドに融合される安定化部分をさらに含む、改変BMP−11プロペプチド。
- 前記安定化部分が、IgG分子のFc領域を含む、請求項65に記載の改変BMP−11プロペプチド。
- 前記IgG分子が、IgG1もしくはIgG4、またはこれらの誘導体である、請求項66に記載の改変BMP−11プロペプチド。
- 前記IgG分子が、IgG1である、請求項66に記載の改変BMP−11プロペプチド。
- 前記IgG分子のアミノ酸配列が、配列番号15に対して少なくとも75%同一である、請求項66に記載の改変BMP−11プロペプチド。
- 前記IgG分子のアミノ酸配列が、配列番号15である、請求項66に記載の改変BMP−11プロペプチド。
- 前記IgG分子のアミノ酸配列が、配列番号16に対して少なくとも75%同一である、請求項66に記載の改変BMP−11プロペプチド。
- 前記IgG分子のアミノ酸配列が、配列番号16である、請求項66に記載の改変BMP−11プロペプチド。
- 前記BMP−11プロペプチドが、リンカーペプチドを介して前記IgG分子のFc領域に融合される、請求項65に記載の改変BMP−11プロペプチド。
- 変更されたグリコシル化部位を有する、請求項60に記載の改変BMP−11プロペプチド。
- 少なくとも1つの炭水化物部分を含む、請求項60に記載の改変BMP−11プロペプチド。
- 前記安定化部分が、アルブミンまたはアルブミン誘導体を含む、請求項65に記載の改変BMP−11プロペプチド。
- 前記安定化部分が、非タンパク質ポリマーを含む、請求項65に記載の改変BMP−11プロペプチド。
- 請求項60に記載の改変BMP−11プロペプチドであって、該改変BMP−11プロペプチドは、1つ以上の点変異をさらに含み、ここで該点変異は、タンパク質分解切断を阻害する、改変BMP−11プロペプチド。
- 精製タグをさらに含む、請求項60に記載の改変BMP−11プロペプチド。
- 改変BMP−11プロペプチドをコードする核酸であって、該改変BMP−11プロペプチドは、対応する未改変BMP−11プロペプチドと比較して、増大したインビボ半減期またはインビトロ半減期を有する、核酸。
- 配列番号8に示される少なくとも20個連続するヌクレオチドを含む、請求項80に記載の核酸。
- 配列番号12に示される少なくとも20個連続するヌクレオチドを含む、請求項80に記載の核酸。
- 配列番号8に示される少なくとも50個連続するヌクレオチドを含む、請求項80に記載の核酸。
- 配列番号12に示される少なくとも50個連続するヌクレオチドを含む、請求項80に記載の核酸。
- 安定化部分をコードする核酸をさらに含む、請求項80に記載の核酸。
- 前記安定化部分が、IgGタンパク質をコードする、請求項85に記載の核酸。
- 前記安定化部分が、アルブミンまたはアルブミン誘導体をコードする、請求項85に記載の核酸。
- 変更されたグリコシル化部位を有する改変BMP−11プロペプチドをコードする、請求項80に記載の核酸。
- 変更された炭水化物部分を有する改変BMP−11プロペプチドをコードする、請求項80に記載の核酸。
- 請求項61に記載の改変BMP−11プロペプチドおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
- 請求項80に記載の核酸および薬学的に受容可能なキャリアまたはベクターを含む、薬学的組成物。
- 改変BMP−11プロペプチドを作製する方法であって、該方法は、以下:
(a)BMP−11プロペプチドをコードするcDNA分子を調製する工程であって、ここで、タンパク質分解切断部位が改変される、工程;
(b)IgG分子のFc領域をコードするcDNA分子を調製する工程;ならびに
(c)工程(a)および工程(b)からのcDNA分子を融合して、改変BMP−11プロペプチドを生成する工程、
を包含する、方法。 - 請求項92に記載の方法であって、リンカーペプチドをコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを調製する工程、ならびに工程(a)および工程(b)からのcDNA分子を、該リンカーペプチドをコードする二本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に融合する工程をさらに包含する、方法。
- 前記リンカーペプチドが、GSGSからなるアミノ酸配列を含む、請求項92に記載の方法。
- 改変BMP−11プロペプチドをコードする核酸を含む、組換え細胞。
- 前記核酸が、安定化部分をコードする核酸配列を含む、請求項95に記載の組換え細胞。
- 医学的障害または医学的疾患に罹患する患者を処置する方法であって、該方法は、治療有効量の改変BMP−11プロペプチドおよび薬学的に受容可能な賦形剤を該患者に投与する工程であって、ここで、該改変BMP−11プロペプチドは、対応する未改変BMP−11プロペプチドと比較して増大したインビボ半減期またはインビトロ半減期を有する、工程、を包含する、方法。
- 前記BMP−11プロペプチドが、配列番号11に対して少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項97に記載の方法。
- 前記BMP−11プロペプチドが、配列番号11である、請求項97に記載の方法。
- 前記BMP−11プロペプチドが、1つ以上のタンパク質分解切断部位に変異を含む、請求項97に記載の方法。
- 前記改変BMP−11プロペプチドが、IgG分子のFc領域をさらに含む、請求項97に記載の方法。
- 前記IgG分子が、IgG1もしくはIgG4、またはこれらの誘導体である、請求項101に記載の方法。
- 前記IgG分子が、IgG1である、請求項101に記載の方法。
- 前記IgG分子が、配列番号15に対して少なくとも75%同一である、請求項101に記載の方法。
- 前記IgG分子のFc領域が配列番号15と同一である、請求項101に記載の方法。
- 前記IgG分子が、配列番号16に対して少なくとも75%同一である、請求項101に記載の方法。
- 前記IgG分子のFc領域が、配列番号16と同一である、請求項101に記載の方法。
- 前記改変BMP−11プロペプチドが、変更されたグリコシル化部位を有する、請求項97に記載の方法。
- 前記改変BMP−11プロペプチドが、少なくとも1つの炭水化物部分を含む、請求項97に記載の方法。
- 前記改変BMP−11プロペプチドが、アルブミンまたはアルブミン誘導体をさらに含む、請求項97に記載の方法。
- 前記改変BMP−11プロペプチドが、非タンパク質ポリマーをさらに含む、請求項97に記載の方法。
- 前記医学的障害が、筋障害、神経筋障害、代謝障害または骨変性障害である、請求項97に記載の方法。
- 前記医学的障害が、筋障害または神経筋障害である、請求項97に記載の方法。
- 前記医学的障害が、代謝障害である、請求項97に記載の方法。
- 前記医学的障害が、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮、うっ血性閉塞性肺疾患、筋るいそう症候群、筋肉減少症または悪液質である、請求項97に記載の方法。
- 前記医学的障害が、筋萎縮性側索硬化症または筋ジストロフィーである、請求項97に記載の方法。
- 前記医学的障害が、肥満、脂肪組織障害、非インスリン依存性糖尿病、または2型糖尿病である、請求項97に記載の方法。
- 前記医学的障害が、骨粗鬆症である、請求項97に記載の方法。
- 請求項1〜20のいずれか1項に記載の改変GDF−8プロペプチドであって、ここで、前記GDF−8プロペプチドは、配列番号1のAsp−99に対応するアミノ酸が変異している、改変GDF−8プロペプチド。
- 請求項119に記載のポリペプチドを含む、薬学的組成物。
- 請求項21〜30のいずれか1項に記載の核酸であって、ここで、前記改変GDF−8プロペプチドは、配列番号1のAsp−99に対応するアミノ酸が変異している、核酸。
- 請求項121に記載の核酸を含む、ベクター。
- 請求項121に記載の核酸を含む、宿主細胞。
- 請求項38〜59のいずれか1項に記載の方法であって、ここで、前記改変GDF−8プロペプチドは、配列番号1のAsp−99に対応するアミノ酸が変異している、方法。
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