TW200526779A - Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof - Google Patents

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200526779 九、發明說明： 【發所屬^技術領域】 相關申請案 5 本案請求臨時申請案第6〇/267,5〇9號，申請曰湖年2 月8日之;^ ’該案完整揭示以引用方式併入此處。 發明範疇 本發明係有關生長差異因子一8(_8)蛋白質抑制劑 及其用法。特別，本發明提供可抑制gdf_8之經修飾及經 穩定化的·8前胜肽。本發明特別可用於預防或治療肌 10肉組織增加具有治療助益之人類或動物病症。此等病症包 括肌肉或神經肌肉病症（例如肌萎縮性脊側索硬化、肌肉營 養失調 '肌肉萎縮、充血性阻塞性肺疾、肌肉消耗性症候 群肌肉缺乏、惡病負）、代謝疾病或病症（例如第二型糖尿 病、非胰島素依賴型糖尿病、高血糖或肥胖）、脂肪組織病 15症（例如肥胖）、以及骨退化病（如鬆骨病）。 L· ]1 發明背景 生長及差異因子-8(GDF-8)也稱做肌抑制素，屬於多種 結構相關生長因子之轉形生長因子_冷（TGF_冷）超族，其全 20部皆具有重要的生長調節及形態發生性質（Kingsley等人 (1994)基因發展8 ·· 133_46 ; Hoodless等人（1998)微生物免疫 學目前話題228 : 253-72)。GDF-8為骨骼肌質塊之負面調節 劑，對於識別可調節其生物活性之因子相當有興趣。例如， GDF-8於發育中的以及成年骨骼肌高度表現。於轉移基因 200526779 5

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20 小鼠GDF-8之無效突變其特徵為骨骼肌明顯肥大與增生 (McPherron等人（1997)自然387 : 83-90)。骨骼肌質塊類似 的增加於牛天然發生GDF-8突變時也明顯（Ashmore等人 (1974)生長 38 : 501-507 ; Swatland 及 Kieffer(1994)動物科學 期刊38 : 752-757 ; McPherron及Lee( 1997)美國國家科學院 議事錄94 : 12457-12461 ;及Kambadur等人（1997)基因組研 究7 : 910-915)。晚近研究顯示於人類HIV-感染造成的肌肉 消耗伴隨有GDF-8蛋白質表現增加（Gonzalez-Cadavid等人 (1998)PNAS 95 : 14938-43)。此外，GDF-8可調節肌肉特異 性酶（例如肌胺酸激酶）的製造，以及調節肌母細胞的增生 (WO 00/43781)。 GDF-8除了骨骼肌的生長調節及形態發生性質夕卜， GDF-8也涉及多種其它生理過程（例如葡萄糖體内平衡）以 及異常病情，例如出現第二型糖尿病及脂肪組織病症如肥 胖。例如，GDF-8調節前脂肪細胞分化成為脂肪細胞（Kim 等人（2001) B.B.R.C· 281 : 902-906)。 類似TGF-yg-l、-2、及-3，GDF-8蛋白質合成為前驅蛋 白質，前驅蛋白質由胺基端前胜肽以及羧基端成熟領域 (McPherron及Lee，1997，參見上文）以及信號序列組成，該 信號序列導引蛋白質至胞外領域也由蛋白質割裂取出。相 信於前胜肽割裂前，前驅物GDF-8蛋白質形成同質二元 體。然後胺基端前胜肽由成熟領域割裂，割裂後的前胜肽 可維持非共價鍵結至成熟領域二元體，將其生物活性失活 化（Miyazono 等人（1988)生物化學期刊 263 : 6407-6415 ; 6 200526779

Wakefield等人（1988)生物化學期刊263 : 7646-7654 ;以及 Brown等人（1990)生長因子3 : 35-43)。相信二個GDF-8前胜 肽結合至GDF-8成熟二元體（Thies等人（2001)生長因子18 : 251-259)。由於此種失活化性質，前胜肽被稱作為「潛在組 5 合胜肽」（LAP)，成熟領域與前胜肽之複合物俗稱為「小潛 在複合物」（Gentry及Nash(1990)生物化學29 : 6851-6857 ;

Derynck等人（1995)自然 316: 701_705;以及Massague〇99〇) 細胞生物學年度綜論12 : 597-641)。相信當前胜肽被去除 時，成熟領域具有做為同質二元體之活性。也已知其它蛋 10白質結合至GDF-8或結構相關蛋白質且抑制其生物活性。 此種抑制作用蛋白質包括濾泡抑制素（Gamer等人（1999)生 物學發展208 : 222-232)及濾泡抑制素相關蛋白質。 進一步多種人類及動物病症係與肌肉組織的耗損或功 能損傷有關，此等病症包括肌肉營養不良、肌肉萎縮、充 15血性阻塞性肺疾、肌肉消耗性症候群、肌肉缺乏及惡病質。 至今為止，對此等病症極少存在有可靠而有效的治療方 法。此等病症引起的可怕的症狀可藉由採用增加患有此種 病症病人之肌肉組織量之治療而實質減少其可怕的症狀。 此等治療將顯著改善病人生活品質以及緩和疾病的多方面 20影響。如此，業界需要找出可於患有此等病症病人促成肌 肉組織整體增加之新穎治療。 本發明經由提供可保有其生物活性以及抑制GDF蛋白 質活性之經修飾且經穩定化的GDF前胜肽而滿足此項需 求。本發明之經修飾的前胜耿可用於治療肌肉組織增加具 7 200526779 有治療效益之人類或動物病症。 L發明内容】 發明概要

GDF-8涉及多種關鍵性生物過程的調節。由於gDF_8 於此等生物過程具有關鍵功能，故GDF-8為治療方法之預 定目標。雖然由功效及毒性觀點視之，天然gdf_8前胜肽 為GDF修飾的有吸引力的手段，但發明人發現天然前胜肽 之循環半生期過短而分子無法去除實際治療或預防用途。 如此，本發明至少部份係基於發現生長差異因子_8((}1317_8) 前胜肽抑制GDF-8蛋白質活性，以及其它結構與GDF_8相關 的轉形生長因子KTGFJ)蛋白質，例如骨形態發生蛋白 質-11(BMP-11 ;也稱做GDIM1)也受GDF_8前胜肽抑制。如 此本發明提供抑制GDF蛋白質之組合物及方法，以及鑑 別、製造及使用此種抑制劑之方法。 如前述，本發明至少部份係基於發現天然gdf_8前胜 肽之活體时生期相當短，目而不具有實際治療或預防用 途。如此，本發明提供具有改良藥力學性質如循環半生期 延長或保護不受蛋白質分解增加的經修飾之〇;〇]^8前胜肽 及經修飾之BMP-11前胜肽。 此處揭示之GDF-8前胜肽或BMP-11前胜肽可藉業界已 知之任一種手段穩定化。例如一具體實施例中，經修飾的 前胜肽為融合蛋白質包含0〇1^8前胜肽及IgG分子^區。 GDF-8前胜肽融合蛋白質包含GDF-8蛋白質前胜肽，或 GDF-8前胜肽活性部份融合至IgG分子&區做為活性亞單 8 200526779 位。其它具體貫施例中或此外，GDF-8前胜肽可經糖基化 或鍵聯至白蛋白或非蛋白質聚合物。 其它具體實施例中，經修飾之前胜肽為融合蛋白質其 包含BMP-11前胜肽及igG分子Fc區。bmp-11前胜肽融合蛋 5白質包含蛋白質前胜肽，或BMP-11前胜肽活性部份 融合至IgG分子Fc區做為活性亞單位。其它具體實施例中或 此外’ BMP-11前胜肽可經糖基化或鍵聯至白蛋白或非蛋白 質聚合物。

本發明之經修飾之GDF-8前胜肽或經修飾之BMP-11前 10胜肽可抑制GDF-8蛋白質、成熟GDF-8、或GDF-8同質二元 體或其它活性GDF-8分子之活性、表現、處理或分泌。本 發明之經修飾之GDF-8前胜肽或經修飾之BMP-11前胜肽可 以治療有效劑量投予病人治療增加肌肉組織具有治療效益 的病情。可藉經修飾之GDF-8前胜肽或經修飾之BMP-11前 15胜肽治療之疾病及病症包括但非限於肌肉或神經肌肉病症 (例如肌萎縮性脊側索硬化、肌肉營養失調、肌肉萎縮、充 血性阻塞性肺疾、肌肉消耗性症候群、肌肉缺乏、惡病質）、 代謝疾病或病症（例如第二型糖尿病、非膜島素依賴型糖尿 病、高血糖或肥胖）、脂肪組織病症（例如肥胖）、以及骨退 2〇 化病（如鬆骨病）。 圖式之簡單說明 第1圖顯示GDF-8、BMP-11及活化素於通報子基因檢定 分析之相對生物活性。 第2圖顯示經純化後之生物素化人GDF-8於ActRIIB結 9 200526779 合檢定分析之結合性質。 第3圖顯示於GDF-8、BMP-11、及活化素之ED5〇，於 GDF-8前胜肽存在下，pGL3(CAGA)12通報子活性之誘生。 第4圖顯示藉GDF-8前胜肽抑制生物素化GDF-8結合至 ActRIIB之劑量相依性抑制作用。 第5圖顯示GDF-8結合至L6細胞。 第6圖顯示藉GDF-8前胜肽抑制GDF-8特異性結合至L6 細胞之劑量相依性抑制作用。

第7A圖顯示屬GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質之胺基酸 10 序列。 第7B圖顯示屬GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質，其帶有短 甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸-絲胺酸（GSGS)鍵聯基分開GDF-8前 胜肽與Fc區。 第8A圖顯示於ActRIIB競爭ELISA，人類GDF-8前胜肽 15 及二種屬GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質對GDF-8結合的影 響。 第8B圖為表格其比較人類GDF-8前胜肽與二種屬 GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質之IC50。 第9圖顯示於通報子基因檢定分析，人GDF-8前胜肽與 20 屬GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質之相對生物活性。 第10圖顯示單次靜脈投予0.2微克/小鼠或2微克/小鼠 後，碘化GDF-8前胜肽及GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質之藥 力學。 第11八圖顯示人類〇〇18前胜肽-4〇1?0融合蛋白質之 ]〇 200526779 胺基酸序列。 第11B圖顯示經修改減低效應物功能之人類GDF-8前 胜肽-IgGl Fc融合蛋白質之胺基酸序歹,j。 第12圖顯示於ActRIIB競爭ELISA，藉人GDF-8前胜肽 及一種人GDF-8前胜肽_Fc融合蛋白質抑制GDF-8結合的劑 量相依性抑制作用。 第13圖為線圖其顯示活體内投予經修飾之GDF_8前胜

4 肽可增加腓腸肌及四頭肌質量，減少脂肪質量，但比較未 經處理小鼠或使用對照蛋白質IgG2aFc處理小鼠，不影響腎 10 臟或肝臟質量。 第HA-P圖顯示對應序_編號1-16之胺基酸及核酸 序列及其附註。 定義 蛋白質」、或rGDF-8多肽」等詞 表丁特疋生長及》化因子’包括但非限於序列①編號工列舉 • 之因子，及其任何今日已知或後來說明之同系物，包括其 它種類同系物。特佳為哺乳動物同系物，最佳為人同系物。 _ I發明也涵蓋得自全部其它來源之咖-8分子及同系物， 、包括但非限於得自牛、犬、猫、雞、鼠、大鼠、諸、馬、 20 火雞、狒狒、及&夕。 办 …、之GDF-8。多種GDF_8分子敘述於 祕⑽n等人(1997)美國國家物議事錄94: 。㈣物為業„所周知。同源性可藉業界已 知或此處料任―财法決定。咖·邮购蛋白質可為 天然或合成蛋白質。此等術語包括蛋白質全長未經處理前 11 200526779 v式（GDF-8 4驅蛋白質」），以及由前胜肽之轉譯後割 衣斤4于成热化式。该等術語也表示可維持此處所述 蛋白貝組合之-或多種生物活性之〇〇]^8之任何片段或變 異株，包括帶有胺基酸序列之保守或非保守變化修飾之序 5 列。

成热GDF-8」表示由GDF-8前驅蛋白質羧端領域割裂 之蛋白質或多肽。成熟GDF_8蛋白質之人類形式示於序列 山、扁號3成熟GDF_8可為天然或合成。成熟GDF_8可呈單 體、同質二元體存在，或可呈GDF_8潛在複合體存在。依 據活體内或試管内條件而定，成熟GDF_8可於此等不同形 式之任一種或全部中建立平衡。不欲受機轉所限，相信成 熟GDF-8具有做為同質二元體之生物活性。於其生物活性 形式’成熟GDF-8也稱做為「活性gdF-8」。 「GDF-8活性」一詞表示一或多種組合活性gdf-8蛋白 15質之生理生長調節活性或形態發生活性。舉例言之，活性 GDF-8為骨骼肌質量之負面調節劑。活性gdF-8也調節肌肉 特異性酶（例如肌胺酸激酶）的製造，刺激肌母細胞增生，及 調節前脂肪細胞分化成為脂肪細胞。相信GDF-8也於周邊 組織’特別骨絡肌或脂肪細胞提高對胰島素或葡萄糖吸收 20 的敏感度。如此，GDF-8生物活性包括但非限於抑制肌肉 的生成’抑制肌細包生長，抑制肌肉發育，減少肌肉質量， 調節肌肉特異性酶，抑制肌母細胞增生，調節前脂肪細胞 分化成為脂肪細胞，增加對胰島素的敏感度，調節葡萄糠 的吸收，葡萄糖的體内平衡以及調節神經元細胞的發育與 12 200526779 維持。全長GDF-8前驅蛋白質人形式示於序列m編號j。 「GDF-8前胜肽」表示由gDF_8前驅蛋白質之胺基端領 域割裂的多月太。GDF-8前胜肽具有_或多種生物活性，包 括但非限於結合成熟GDF-8蛋白質或同質二元體能力，抑 5制《多種GDF-8生物活性能力，促進肌肉發育能力，增 加肌肉質量能力，促進肌肉生成能力，以及促進肌肉細胞 增生能力。GDF-8前胜肽可為天然或合成。隱_8前胜肽之 例包括但非限於序列ID編號5提供之GDF_8前胜肽人形 式。一具體實施例中，GDF_8前胜肽可結合成熟gDF_8前胜 10肽結合領域。另一具體實施例中，〇}131^8前胜肽可抑制一 或多種成熟GDF-8活性。 GDF-8抑制劑」一詞包括任一種可抑制蛋白 貝、成沾GDF-8或GDF-8同質二元體或其它GDF-8*子其包 括但非限於經修飾之GDF-8前胜肽及經修飾2BMP-丨丨前胜 15肽的活性、表現、處理或分泌之作用劑。GDF_8抑制劑也 包括任一種可增進GDF-8前胜肽結合至成熟GDF-8分子或 結合至GDF-8同質二元體之作用劑。此種GDF-8抑制劑包括 但非限於蛋白質、抗體、胜肽、擬胜肽、核糖酶、反訊息 募核苷酸、雙股RNA及其它小分子。一具體實施例中， 20 GDF-8蛋白質活性係經由實例3_6所述經修飾之〇1)^8前胜 肽抑制。另一具體實施例中，GDF-8蛋白質活性係由經修 飾之BMP-11前胜肽抑制。 「GDF-8潛在複合物」表示成熟GDF-8同質二元體與 GDF-8前胜肽間形成的蛋白質複合物。不欲受特定機轉所 13 200526779 限，相信二種GDF_8前胜肽組合同質二元體之二成熟gdf_8 分子而形成失活性之四元體或潛在複合物。潛在複合物包 括其它GDF抑制劑替代或增加至一或多種GDF-8前胜肽。 10 15 20 「經修飾之GDF-8前胜肽」一詞表*GDF_8抑制劑，其 包含保有一或多種GDF-8前胜肽生物活性之經修飾的 GDF-8前胜肽、其片段或變異株，以及進一步包含如此處 所述穩定化修飾。GDF-8前胜肽之變異形式包括，但非限 於，例如已經經過修飾而於信號胜肽或前胜肽蛋白質分解 割裂位置包括突變（包含插入、刪除及取代胺基酸）讓該位置 對蛋白質分解割裂作用較為不敏感的GDF-8前胜肽。較佳 八月豆μ施例中，經修飾之GDF-8前胜肽比較對應未經修飾 之GDF-8刚胜肽具有實質較長半生期。高度較佳具體實施 例中，本發明之經修飾之GDF-8前胜肽於活體内之半生期 延長（例如藉實例8所述方法測量）。另-具體實施例中，經 修姊之GDF-8前胜肽可抑制一或多種成熟gdf_8活性。 「BMP-U」、「BMIMi蛋白質」、或「BMP-11多肽」等 3表不特疋生長及分化因子，包括但非限於序列山編號7 列舉之因子’及其任何今曰已知或後來說明之同系物，包 括其匕種類同系物。特佳為哺乳動物同㈣，最佳為人同 系物本發明也涵蓋得自全部其它來源之BMP-11分子及同 系物，包括但非限於得自牛、犬、|苗、雞、鼠、大鼠、豬°、 馬、火雞、狒狒、及魚之BMIM1。多種.u分子敘述於 等人（1997)美國國家科學院議事錄94:、 12457 ]2461。同系物為業界眾所周知。同源性可藉業界已 14 200526779 知或此處所述任_種方法決定。蛋白質可 為天然或合成蛋白f。此等術語包括蛋白質全長未經處理 丽驅形式（「ΒΜΡ·η前驅蛋白質」），以及由前胜肽之轉譯 後割裂所得成熟形式。該等術語也表示可維持此處所述 BMP 11蛋白質組合之—或多種生物活性之β⑽η之任何 片ί又或义異株’包括帶有胺基酸序列之保守或非保守變化 修飾之序列。 10 15 20 成.”、BMP-li」表不由BMp_u前驅蛋白質缓端領域割 裂之蛋白質或多肽。成熟BMp_u蛋白質之人類形式示於序 列1〇編號9。成熟BMP-U可為天然或合成。成熟BMP-n可 呈單體1質二元體存在，或可呈BMp_u潛在複合體存 在。依據活體内或試管内條件而定，成熟BMP-11可於此等 不同形式之任-種或全部中建立平衡。不欲受機轉所限， 相信成熟BMIM1具有做為同質二元體之生物活性。於其生 物活性形式’成熟BMIM1也稱做為「活性BMp七」。 BMP 11刖胜狀」表示由BM{mi前驅蛋白質之胺基端 領域割裂的多肽。BMIM1前胜肽具有—或多種生物活性， 包括但非限於結合成熟GDF_8蛋白質或同質二元體能力， 抑制-或多種G购生物活性能力，促進肌肉發育能力， 增加肌肉質量能力，促進肌肉生成能力，以及促進肌肉細 胞增生能力。BMP-U前胜肽可為天然或合成。BMM前胜 之例i括i_非限於序列ID編號！ ！提供之腿m前胜 肽人形式。一具體實施例中，u前胜肽可結合成熟 GDF_8前錢結合領域。另—具體實施财，歷—㈣胜 15 200526779 肽可抑制—或多種成熟(3DF-8活性。 =經修飾前胜肽」一詞表示GDF-8抑制劑， 其包含保有一或多種醫七前胜月太生物活性之經修飾的 ΒΜίΜΙ^肽、其片段或變異株，以及進—步包含如此處 5所述穩定化修#。ΒΜρ_η前胜肽之變異形式包括，但非限 於，例如已經經過修飾而於信號胜肽或前胜肽蛋白質分解 割裂位置包括突變（包含插入、刪除及取代胺基酸）讓該位置 或多或少對蛋白質分解割裂敏感。較佳具體實施例中， BMP-11前胜肽抑制劑經修飾而比較對應未經修飾之 10 ΒΜΡ-11前胜肽，提供較長活體内半生期（於實例8具體實施 例測里）。另一具體實施例中，經修飾之BMP-11前胜肽可抑 制一或多種成熟GDF-8活性。 本發明之GDF-8前胜肽及本發明之BMP-11前胜肽合稱 為「DGF前胜月太」。 15 本發明之GDF-8蛋白質及本發明之BMP-11蛋白質合稱 為「GDF多肽」或「GDF蛋白質」。 本發明方法及組合物提供GDF抑制劑，其比較未由抑 制劑結合之相同GDF蛋白質，可降低GDF蛋白質活性相對 GDF蛋白質活性。某些具體實施例中，GdF蛋白質當由一 20 或多種經修飾之GDF前胜肽結合時，其活性比較相同GDF 蛋白質但未被經修飾之前胜肽結合之活性，降低至少約10 %、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50% 或 55%，較好至少為 60%、62%、64%、66%、68%、70 %、72%、74%、76%、78%、80%、82%、84%、86% 16 200526779 或88%，更好至少為90%、91%、92%、93%或94%，及 又更好至少於約95%至1〇〇%。較佳具體實施例中，抑 制劑為共價鍵聯至IgG》子Fc區的經修飾之gdf_8前胜狀 或經修飾之BMP-11前胜肽。 5 「穩定化修飾」一詞為業界已知或此處列舉可穩定化 蛋白貝，提升蛋白質之試管内半生期，延長蛋白質之循環 半生期及/或減少蛋白質之蛋白質分解的任一種修飾。此種 穩定化修部包括但非限於融合蛋白質（包含例如含GDF前 胜肽及第一蛋白質之融合蛋白質）、修飾糖化位置（例如包括 1〇添加糖化位置之GDF前胜月太）、及修飾石炭水化合物部份（包括 例如由GDF前胜肽去除碳水化合物部份）。以包含融合蛋白 質之穩定化修飾為例（例士口此種第二蛋白質融合至咖前 胜肽），第二蛋白質可稱做為「安定劑部份」或「安定劑蛋 白質」。例如，一具體實施例中，本發明之經修飾之gdf_8 15前胜肽包含人G则前胜月太（帶有失活化割裂位置）及⑽分 子（該IgG係做為安定劑蛋白質或安定劑部份）間的融合。用 於此處，「安定劑部份」除了表示蛋白質的第二蛋白質之 外，也包括非蛋白質修飾例如碳水化合物部份或非蛋白質 聚合物。 20 「分離」或「純化」等詞表示實質不含天然環境的分 子’如’經㈣蛋白質實質不含其衍生來源的細胞物質 或其它來自細胞或組織來源的污染蛋白質。「實質不含細胞 物質」-詞表示分離的蛋白質至少為7〇%至8〇%(w/w)純 質’更好至少8〇-89%(w/w)純質，又更好9〇_95%純質，及 17 200526779 最好至少96%、97%、98%、99%或l〇〇%(w/w)純質之製 劑。 「割裂位置」一詞表示蛋白質或多肽受蛋白質分解酶 作用結果導致肽鍵結割裂的蛋白質分解位置。一具體實施 5例中，本發明之割裂位置為以單字母胺基酸代碼表示的 「RSRR」。 「IgG分子Fc區」一詞如業界人士眾所周知，表示免疫 球蛋白同型IgG之Fc領域。IgG分子Fc區為負責延長IgG分子 活體内血清半生期的分子（IgGl，IgG2，IgG3及IgG4) ，10 部份。較佳，IgG分子為IgGl。 「試管内半生期」表示於活有機體外側測量蛋白質穩 疋性。測量試管内半生期之檢定分析為業界眾所周知，包 括但非限於SDS-PAGE、ELISA、基於細胞之檢定分析、脈 衝追蹤、西方墨點、北方墨點等。此等及其它有用的檢定 15 分析為業界眾所周知。 /舌體内半生期」表示蛋白質於有機體的穩定性。活 體内半生期可藉業界已知多種方法測量，包括但非限於活 月豆内血β半生期、循環半生期、以及本文實例列舉的檢定 , 分析測量。 … 活體内血清半生期」表示蛋白質於有機體血液循環 半生期。一具體實施例中，活體内半生期係如實例8測量。 其它業界已知方法可用於測量活體内半生期。 「哺乳類」_詞表括業界已知定義，也表示任一種屬 於哺乳類的動物包社 — 刃匕括人類、家畜及農場動物、以及動物園 ]8 200526779 動物、運動動物、或寵物如犬、貓、羊、豬、牛等。較卢 具體實施例中，哺乳類為人類。 「TGF- 超質」一詞表示一族結構相關生長因子，其 皆具有生理重要的生長調節及形態發生性質。此族相關生 5長因子為業界眾所周知（Kingsley等人（1994)基因發展8 : 133-46 ;以及Hoodless等人（1998)微生物免疫學流行話題 228 z 235-72) cTGF-/3超質包括骨形態發生蛋白質（BMps)、 活化素 '抑制素、摩拉里（Mullerian)抑制物質、神經焦衍生 神經作用因子，以及其它數目仍在增加當中的生長及分化 10因子（GDFs)，例如GDF-8(肌抑制素）。多種此等蛋白質之結 構與00^8有關，如：6]\4?-11(也稱做〇0^11)，及/或活性與 GDF-8有關，例如活化素。 「處理」一詞表示治療性處理或預防性或預防處置。 需要處理者包括已經有特定醫事病症個體以及最終可能患 15 有該病症個體（亦即需要預防措施的個體）。 「轉形」及「轉移感染」等詞表示多種業界已知技術， 該技術用於將液體核酸（例如DNA及RNA)引進宿主細胞， 包括但非限於磷酸鈣或氣化鈣共同沉澱、DEAE-葡萄聚糖-媒介轉移感染、脂肪感染及電泳。 20 19 200526779 序列ID編號 名稱 類別 1 人GDF-8前驅蛋白質 蛋白質 2 人GDF-8前驅蛋白質 DNA 3 人GDF-8成熟 蛋白質 4 人GDF-8成熟 DNA 5 人GDF-8前胜肽 蛋白質 6 人GDF-8前胜肽 DNA 7 人BMP-11前驅蛋白質 蛋白質 8 人BMP-11前驅蛋白質 DNA 9 人BMP-11成熟 蛋白質 10 人BMP-11成熟 DNA 11 人BMP-11前胜肽 蛋白質 12 人BMP-11前胜肽 DNA 13 GDF-8信號序列 蛋白質 14 BMP-11信號序列 蛋白質 15 IgG-Fc 蛋白質 16 IgG-Fc經修飾 蛋白質

發明之詳細說明 本發明至少部份係基於發現GDF前胜肽之活體内半生 5 期短，因而降低其做為GDF-8或BMP-11活性之藥理抑制劑 的效果。如此，於一特徵方面，本發明包含經修飾且經穩 定化的GDF-8或BMP-11前胜肽其具有改良藥力學性質，特 別循環半生期延長。 本發明提供新穎經修飾之DGF前胜肽其於試管試驗以 10 及活體試驗與GDF蛋白質（例如GDF-8及BMP-11蛋白質）形 成失活性複合物。本發明之經修飾GDF前胜肽較好結合至 20 200526779 則胜狀結合領域。如此，

一種可 一蛋白質， 本發明之若干 )F前胜肽與安 成熟GDF蛋白質之 具體貫施例中，經 之整體安定性之任一種蛋白質。 此種融合蛋白質可視需要地包含聯 份與穩定化部份間。如業界人士眾 蛋白質，讓所得轉譯後之蛋白質包含第 一及第二蛋白

白質經製備， 讓結果所得轉譯後蛋白質含有前胜肽部份及 第二蛋白質於框構内融合第 安定劑部份。 其它具體實施例中，GDF前胜肽包含經修飾而比較未 經修飾GDF丽胜月太具有較長活體内循環半生期的GDF前胜 15肽。雖然經修飾之GDF前胜肽的結合精確機轉及時序為未 知，但相信本發明之經修飾之GDF-8前胜肽及經修飾之 BMP-Π前胜肽可結合至成熟gDF_8及bmp-u。一較佳具體 實施例中，本發明提供經修飾iGDF前胜肽，其於活體内 或於試管内與GDF-8或BMP-11蛋白質形成失活化複合物。 一具體實施例中，GDF前胜肽較好結合至成熟GDF-8或成熟 BMP-11蛋白質的前胜肽結合領域。此種結合可能出現於 GDF-8及BMP-11活性位置釋放出天然前胜肽之後，藉經修 飾之GDF-8及經修飾之BMP-11前胜肽置換天然前胜肽之 後’及/或由GDF-8及BMP-11前驅蛋白質割裂前胜肽之後。 21 200526779 …^木用何種機轉’經修飾之GDF-8前胜肽及經修飾之 耐]m胜肽結合結果導致—或多種gdf_8㈣生物活性 幸乂未被相同經修飾之前胜月太結合成熟GDF.8蛋白質減 -車乂佺具貝施例中，經修飾之GDF-8及BMP-11前胜肽 降低GDF.8及ΒΜΡ·11之與骨絡肌f量負面調節相關活性。 另K土具體貫施例中，本發明提供經修飾之GDF前 胜狀’其於活體内或試管内與·Ρ·11蛋白質形成失活化複 合物。-具體實施例中’ GDF前胜肽較佳結合至成熟 黯-U蛋白f的前胜肽結合領域。又另—具體實施例中， • 10 15 20 '工6飾之GDF别胜肽為包含GDF前胜肽及邮分子&區之 融合蛋白質（做為穩定性蛋白質）。此種咖抑制劑包含GDF 前胜狀（如序列ID編號：5或11所示），或該前胜肽之保有-或多種GDF前胜肽生物活性之片段或變異株。此種經修飾 之咖前胜肽可抑制GDF蛋白質活性。本發明使用之g购 或歸-H前胜肽可以合成方式製造，可由天然出現（天然） GDF-8或BMIM1前胜肽衍生，或可以以重組方式製造，使 用多種基因工程業界人士眾所周知的反應劑、宿主細胞及 方法以重組方式製造 具體實施例中，經修飾之GDF-8 前胜肽或經修飾之BMP-U前胜肤包含人GDF8或ΒΜρ山 前胜肽共價鍵聯至IgG分子或其片段。咖^或着^前胜 肽可就鄰IgG分子Fe區融合，或透過聯結基胜肽附接至邮 分子Fc區。此種聯結基胜肽之使用為蛋白質生化業界眾所 周知。 某些具體實施例中 本發明之經修飾之GDF前胜肽包 22 200526779 含融合蛋白質，該融合蛋白質之GDF前胜肽部份較好與序 列ID編號：5或11有至少75-80%相同性，更好與序列ID編 號·· 5或11至少於81 %至約85%相同性，又更好與序列ID編 號：5 或 11至少約 86%、87%、88%、89%、90%、91%、 5 92 %、93 %或94%相同性，又更好與序列ID編號：5或11 有至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性。 較佳具體實施例中，GDF-8或BMP_11前胜肽包含與序列ID 編號：5或11列舉的序列相同序列。又另一較佳呈體實施例 中，本發明之融合蛋白質之GDF前胜肽部份包含序列10編 ’ 10號· 5或11列舉之GDF前胜肽之片段或變異株，只要該片段 或^:異株保有一或多種GDF前胜肽之生物活性即可。另一 較佳具體實施例中，經修飾之Gdf-8或BMP-11前胜肽包含 序列ID編號：5或11之突變版本，其中突變株經修飾而包括 或多種犬變（包括插入、刪失或取代），只要該片段或變異 15 株保有一或多種GDF前胜肽之生物活性即可。 灸於關鍵上，本發明之涉及包含融合蛋白質經修飾之 GDF前胜肽之具體實施例中，要緊地，融合蛋白質可經製 • 造或設計讓GDF前胜肽之蛋白質分解割裂位置（例如rsrr) ^ 被摧毀、破壞、失活化、或於所得融合蛋白質中去除。如 2〇熟諳技藝人士已知，未能達成此項目的將導致融合蛋白質 之第二蛋白質（例如安定劑部份）由融合蛋白質之第一蛋白 質（前胜肽部份）割裂。如此，本發明之關鍵部份提供當使用 GDF^a來製備本發明之經㈣之咖前㈣的融合蛋 白質時，失活化或去除GDF前胜肽之天然割裂位置。失活 23 200526779 化此種蛋白質割裂位 置之方法為業界已知 ，包括但非限於 突變、序列。 刪失或插入蛋白質分解割 裂位置之胺基酸或核 苷酸 本發明之又另一特徵方面，可於GDF序列進行突變來 5讓蛋白貝刀解副裂位置對蛋白f分解割裂較不敏感。例 如方、具肢貝轭例中，此等突變株包括於序列ID編號：j 胺基酸 45、46、49、50、52、53、63、64、65、66、98或 99之點犬，交，或於序列ID編號·· 7胺基酸或 287之點犬麦。另一具體實施例中，可與序列編號··" 10之胺基酸做點突變。較佳具體實施例中，點突變為序列ID 編號：1胺基酸99的點突變。特佳具體實施例中，點突變為 序列ID編號：1胺基酸99由Asp變成Ala之點突變。另一較佳 具體實施例中，可於序列ID編號··丨丨之胺基酸做出此種點 犬受。電月自分析（使用市售軟體例如Mac Vector、Omega、 15 PCGene，分子模擬公司）用來鑑別蛋白質分解割裂位置。如 熟諳技藝人士已知，另外可於核酸層面做出所述任一種突 變、變異或修飾。此種技術為業界眾所周知。 24 200526779 表2可突變而防止前胜肽割裂的範例胺基酸： GDF-8 (胺基酸編號參照序列ID編號：1)

Arg-45

Gln-46

Lys-49

Ser-50

Arg-52

Ile-53

Lys-63

Leu-64

Arg-65

Leu-66

Arg-98

Asp-99 BMP-11 (胺基酸編號參照序列ID編號：7)

Asp-122

Ala-123

Glu-286

Leu-287 如前述，發明人發現GDF前胜肽之活體内半生期短。 如此，為了做為醫藥有用的治療或預防劑，GDF前胜肽需 5 以化學方式或物理方式穩定化俾延長於生理條件下的壽 命。 GDF前胜肽可藉業界已知之任一種手段穩定化或修飾 化，只要修飾後的GDF前胜肽仍維持抑制GDF蛋白質或成 熟GDF蛋白質之能力即可。較佳具體實施例中，經修飾之 10 GDF前胜肽維持其結合至目標GDF蛋白質或GDF前胜肽結 合位置的能力。較佳具體實施例中，經修飾之GDF前胜肽 包含毗鄰或透過聯結基融合至IgG分子Fc區之GDF-8前胜 肽或BMP-11前胜肽。IgG分子Fc區對前胜肽提供保護或穩 25 200526779 定效果（因而做為穩定化修飾），反映在比較對應未經修飾 GDF-8前胜肽或未經修飾bmp-11前胜肽，融合蛋白質之藥 力學性質改良（亦即血清半生期延長）。

特定具體實施例中，經修飾之GDF-8前胜肽包含人 5 GDF-8前胜肽或人GDF_8前胜肽突變株，IgG分子為“⑴或 IgG4之Fc區、或經修飾而減少效應物功能之IgG1 Fc區。一 具體實施例中，IgG片段為IgGl (序列ID編號：15)。另一具 體實施例中，IgG片段為經修飾而減少效應物功能之 IgGl(序列ID編號：16)。修飾用於減少效應物功能之分子 10例如包括修飾人IgG 1 -Fc融合蛋白質而包括於序列id編 號：16列舉的位置14及17之胺基酸丙胺酸（A)。 修飾後之GDF-8或BMP-11前胜肽可根據業界眾所周知 之標準蛋白質分離及純化程序分離及純化。 另一具體實施例中，經修飾之GDF前胜肽包含人 15 BMP-11前胜肽或人BMP-11前胜肽突變株，以及igG分子， 其為IgGl或IgG4Fc區，或經修飾而減少效應物功能之IgG1 片段。較佳具體實施例中，安定劑為人IgG 1 -Fc區（序列ID 編號：15)或經修飾以減少效應物功能之人IgG 1 _Fc區（序列 ID編號：16)。BMP-11前胜肽可毗鄰於或透過聯結基融合至 20 IgG分子Fc區，如此處說明。 本發明也提供製造具有延長活體内或試管内半生期之 經修飾之GDF前胜肽之方法。較佳具體實施例中，該方法 包含經由製備一種cDNA分子而製備經修飾之GDF前胜肽 其包含GDF-8/IgGl Fc或BMP-11/IgGl Fc融合蛋白質，該 26 200526779 cDNA分子編碼： (1) GDF前胜肽（例如人GDF-8前胜肽，序列ID編號·· 5， 或人BMP-11前胜肽，序列ID編號：11)，其經修飾而失活化 蛋白質分解割裂位置及IgG分子Fc區（例如AIgGl Fc區，序 5 ?〗ID編號：15); (2) 使用適當表現質體及細胞，於適當原核或真核表現 系統表現cDNA ;以及 (3)分離及純化含經修飾之GDF前胜肽之經表現的融合 蛋白質，其中該經修飾之GDF前胜肽比較未經修飾之GDF ，10 前胜肽之活體内或試管内半生期延長。 此種較佳本發明之經修飾之GDF前胜肽列舉於第丨i a 圖。 cDNA表現糸統為分子生物學業界眾所周知，表現後蛋 白質之为離及純化方法（此處貫例2及7提供此種具體實施 15 例）亦為眾所周知。 另一具體實施例中，用以表現此種融合蛋白質<cDNA 構成品含有核苔酸編碼聯結基胜肽’該聯結基胜肽係介於 編碼GDF前胜肽之核苷酸與igG Fc區（或安定劑部份）間。聯 結基胜肽相對於GDF或IgG Fc區之方向並不重要。聯、纟士美胜 20 月太包含編碼長 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 24、26、28、30或以上胺基酸之核苔酸。特定具體實施例 中，聯結基胜肽包含編碼甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸_絲胺酸 (GSGS)胺基酸序列之核苷酸。 另一具體實施例中，表現質體可視需要含有標錢，其 27 200526779 允許方便地分離與純化表現出 現質體以及分離及純化加標鐵 為業界眾所周知。 的蛋白質。此種加標籤之表 之蛋白質產物之方法的使用 10 本發明之GDF前胜肽特別包括融合蛋白f1中八子 之咖前胜肽部份與得自特定種類之_對應序列之:源 性等於或大於嶋；而安定劑部份如邮分子邮與得自= 同種類之IgG對應序列之同源性等於或大於啊。例如，人 GDF-8前胜肽或其片段可融合至小鼠收分子^區，反之亦 然’如實例3_6舉職明，只要所得融合蛋白質具有所需生' 物活性’亦即可抑制GDF生物活性即可。本發明之較:具 體實施射，本發明之融合蛋白f為人類蛋白質嵌合體了 如業界所了解，人類蛋白質嵌合體或融合蛋白質用於人類 病人之治療上為較佳。 至於前述Fc_融合蛋白質之替代例或增加例，gdf前胜 15肽可藉多種其它方法及來源物質穩定化，此等材料為眾所 周知且於蛋白質業界方便易得。此等方法及材料例如包括 糖基化’或鍵聯至白蛋白或非蛋白之聚合物，容後詳述。 經修飾後的GDF前胜肽可使用蛋白質業界眾所周知之標準 蛋白質分離及純化技術分離與純化。 20 GDF前胜肽或經修飾之GDF前胜肽可藉多種業界已知 技術製造。例如，此等前胜肽可使用此處描述方法為業界 已知方法合成（例如以化學方式或重組方式合成）、分離及純 化’以及試驗其與成熟GDF-8或成熟BMP-11蛋白質形成複 合物的能力。前胜肽可使用標準蛋白質化學技術合成，例 28 200526779 如述於Bodansky，Μ.胜肽合成原理，史賓維拉（Springer Verlag)，柏林（1993)及Grant G.A·(編輯）合成胜肽：使用者 指南，W.H.福林曼公司，紐約（1992)，其内容以引用方式 併入此處。此外，自動化肽合成儀為市面上可得（例如先進 5 化學技術型號：396 ;米利吉/百色曲（Milligen/Biosearch) 9600)。

另夕卜，經修飾或未經修飾GDF前胜肽或其片段可如業 界眾所周知使用多種表現系統（如大腸桿菌、中國倉鼠卵巢 細胞、COS細胞、桿病毒）以重組方式製造。例如，GDF-8 10 及BMP-11經表現之前胜肽可使用Bottinger等人（1996) PNAS 93 : 5877-5882 及 Gentry 及 Nash(1990)生物化學 29 : 6851-6857，其内容以引用方式併入此處，或業界已知純化 胜肽之方法純化。另外，經修飾或未經修飾之GDF前胜肽 或其片段可使用FLAG或6-His加標籤用於隨後使用蛋白質 15 業界確立的技術純化。 經修飾或未經修飾GDF-8或BMP-11前胜肽進一步可經 由使用例如蛋白酶消化天然或重組製造的GDF-8或BMP-11 製造，蛋白酶例如為胰蛋白酶、熱分解酶、乳麋胰蛋白酶、 胃蛋白酶或成對鹼性胺基酸轉化酶（PACE)。電腦分析（使用 20 市售軟體如MacVector、Omega、PCGene，分子模擬公司） 可用於鑑別蛋白質分解割裂位置。另外，此種GDF前胜肽 可由天然或重組製造的GDF-8或BMP-11製造，採用例如業 界已知標準技術，例如化學割裂（如溴化氰、經胺）進行。 經修飾之GDF前胜肽之蛋白質分解或合成GDF-8及 29 200526779 BMP-11前胜肽部份可包含多個胺基酸殘基，如結合至目標 GDF蛋白質需要的胺基酸殘基，因而部份或完全抑制gdf_8 或BMP-11活性。此處實例4-6說明結合及抑制檢定分析具體 貫施例。特別，維持調節或抑制GDF-8能力的GDF-8及/或 5 BMP-11鈾胜肽序列功能片段涵括於本發明之範圍。gdf-8 如胜肽部份較好包含至少5、1〇、20、30、40、50、60、70、 80或 90個胺基酸；更好至少 1〇〇、11〇、12〇、13〇、14〇、15〇、

160、170、180或190個胺基酸；及最佳至少2〇〇、210、220、 23 0或240個或240個以上胺基酸長度。較佳具體實施例中， 10 經修飾之GDF-8前胜肽之GDF-8前胜肽部份長243胺基酸， 亦即對應於序列ID編號：5 ;其BMP-11前胜肽之BMP-11前 胜叙部份長274胺基酸，亦即對應於序列ID編號：丨丨。人 GDF-8之信號序列示於序列id編號：13，且包括序列ID編 號：1之前23個胺基酸。一具體實施例中，BMP-11前胜肽 15 序列始於胺基酸序列AEGPAAA。 人BMP-11之信號序列述於序列ID編號·· 14且包括序列 ID編號：7之前24個胺基酸。部份GDF-8或BMP-11前胜肽序 列被識別為GDF_8或BMP-11前胜肽之功能片段，例如，方 便使用此處實例4-6所述檢定分析指定。 除了截頭前胜肽序列外，此處前胜肽變異株特別包括 具有點突變或其它修飾（包括插入、刪失及取代）的GDF前胜 肽；只要此等變異株含有一或多種GDF前胜肽之預定生物 或抑制活性即可。此等活性例如可如實例4-6所述測量。此 種修飾可引進分子俾增進GDF-8或BMP-11前胜肽活性、循 30 200526779 壞或儲存半生期、或產量。舉例言之，點突變可被導入一 或多個蛋白質分解割裂位置，俾防止或抑制經修飾之 GDF-8前胜肽於活體内進行蛋白質分解。電腦分析（使用市 售軟體如MacVector、〇mega、PCGene，分子模擬公司）可 5 用以鑑別蛋白質分解割裂位置。 如此，除了野生型cDNA編碼序列外，本發明製造前胜 肽方法特別包括cDNA編碼序列，其編碼野生型GDF前胜 肽，但因基因碼的簡併或因對偶基因變異（於物種族群天然 出現的氮驗基變化，其可能或未能導致胺基酸變化）造成 10 CDNA序列與野生型GDF cDNA序列不同。本發明也預期包 含DNA序列，其於嚴格雜交條件（一具體實施例述於τ. Maniatis等人（1982)分子選殖（實驗室手冊），冷泉港實驗 室，387-389頁）下，雜交至GDF前胜肽編碼核酸或編碼有能 力結合特定GDF蛋白質之蛋白質或前胜肽之核酸，如實例 15 4-6具體說明。因點突變或因誘發修飾（例如插入、刪失及取 代）造成cDNA序列變異可增進所編碼的GDF-8或BMp_丨1前 胜肽活性、半生期或產量，因而於本發明也有用。可用於 測定DNA序列同源性之電腦程式為業界已知且說明於此 處。 20 經修飾後之GDF前胜肽與GDF蛋白質形成非共價複合 物的能力可藉業界已知多種方法評估，包括尺寸排除層析 術及/或交聯分析，述於此處實例2。如實例2所示，gdf_8 前胜肽與成熟GDF-8蛋白質形成非共價結合。成熟 GDF-8/GDF-8前胜肽複合物具有名目分子量約75 kDa。 31 200526779 如刖述，除了 Fc融合方法外，GDF前月生肽也可藉多種 ”匕技術t疋化。一具體實施例中，安定劑部份共價鍵聯 至GDF丽胜肽部份而形成融合蛋白質。例如，㈤^前胜月太 可鍵聯至一或多種非蛋白質聚合物，如聚乙二醇、聚丙二 5醇、或♦氧稀類，鍵聯方式述於美國專利第4,64〇,835 ·， 4,496,689，4,301，144 ; 4,670,417 ; 4,791，192或4，179,337號， 併述於此以供參考。某些具體實施例中，GDF前胜肽藉共 饧軛合至聚合物以化學方式修飾俾延長其循環半生期。較 佳聚合物及其附接至胜肽之方法也述於美國專利第 10 4,766，106 ; 4，179,337 ; 4,495,285及4,609,546號，以引用方 式併入此處。 另一具體實施例中，GDF-8前胜肽可經修飾而具有變 更後的糖基化樣式（亦即由野生型糖基化樣式變更）。用於此 處’受更」一詞表示一或多個碳水化合物部份添加至野生 15型GDF前胜肽或由其中刪除。蛋白質及前胜肽之糖基化典 型為N-鍵聯或〇-鍵聯。鍵聯表示碳水化合物部份附接至 天冬醯胺殘基之支鏈。三胜肽序列天冬醯胺_x_絲胺酸及天 冬醯胺-X-蘇胺酸，此處X為脯胺酸以外的胺基酸，為已知 可以酶作用附接碳水化合物部份至天冬醯胺支鏈之序列。 20 如此，前胜肽存在有此等三胜肽序列之一構成可能的糖基 化位置。0-鍵聯糖基化表不糖類N-乙酿基半乳糖胺、半乳 糖或木糖之一附接至羥基胺基酸，最常見為絲胺酸或蘇胺 酸，但也可使用5-羥木胺酸或5-羥離胺酸。 添加或刪除GDF前胜肽之糖基化位置可方便地經由變 32 200526779 更胺基酸序列，讓胺基酸序列含有或刪除一或多個前述二 胜肽序列（對N-鍵聯糖化位置）達成。變更也可經由刪除、 或取代野生型GDF前胜肽（用於〇-鍵聯糖基化位置）之絲胺 酸或蘇胺酸殘基達成。為求方便，GDF前胜肽胺基酸序列 較佳係經由DNA層面的改變變更，該項技術為業界眾所周 知。

另一種增加GDF前胜肽之碳水化合物部份數目之手段 係以化學或酶催化耦合糖苔至GD前胜肽。此等程序之優點 在於其無須於宿主細胞產生GDF前胜肽，該宿主細胞具有 10 N-或鍵聯糖基化的糖基化能力。依據使用的耦合模式決 定，糖類可附接至（a)精胺酸及組胺酸；（b)游離竣基；（c) 游離巯基如半胱胺酸之巯基·’（d)游離羥基如絲胺酸、蘇胺 酸或羥胺酸之羥基；（e)芳香族殘基如苯基丙胺酸、酪胺酸 或絲胺酸之殘基；或（f)麵胺之醯胺殘基。此等方法迷於WQ 15 87/05330公告日1987年9月11日，以及述於Aplin及Wdston (1981)CRC Crit· Rev· Biochem·，259-306頁，以引用方式併 入此處。 去除任何存在於GDF前胜肽之碳水化合物部份可以化 學或酶催化方式達成。化學脫去糖基化要求Gr)F，胜肽曝 20 露於化合物三氟甲烷磺酸或相當化合物。結果導致大部份 或全部糖被割裂，鍵聯糖（N-乙醯基葡萄糖胺或N-乙醯基半 乳糖胺）除外，同時留下胺基酸序列完整不變。 化學脫去糖基化反應述於Hakimuddin等人（1987)生物 化學生物物理檔案259 : 52以及Edge等人（1981)分析生物化 33 200526779 學11 8 ·· 13 1。酶催化割裂GDF前胜肽之碳水化合物部份可 使用多種糖苷内切酶或外切酶達成，述於Thotakura等人 (1987)酶學方法 138 : 35〇。 如前述，當經修飾之GDF前胜肽為GDF前胜肽-Fc融合 5蛋白質時，1gG分子Fc區也可經修飾而具有變更的糖基化樣 式。 另一具體實施例中，GDF前胜肽鍵聯至蛋白質白蛋白 或白蛋白衍生物。鍵聯蛋白質及前胜肽至蛋白質白蛋白或 白蛋白衍生物之方法為業界眾所周知。例如參考美國專利 1〇第5，116,944號（Sivam等人），以引用方式併入此處。 熟諳技藝人士了解某些胺基酸可取代蛋白質結構其它 胺基酸而未對蛋白質活性造成不良影響。如此發明人預期 可於經修H戈未經修飾GDF前胜肽胺基酸序列或編碼此種 前胜肽之DNA序列做出多種變化，而其生物利用性或活性 15並無可察覺的喪失。一具體實施例中，此等活性係於實例 ‘6測量。此等變化包括但非限於刪失、插入、截頭、取代、 融合等。例如，經修飾後GDF前胜肽之蛋白質分解割裂位 置的胺基酸序列變化明白涵括於本發明範圍。 做出此等變化時，可考慮胺基酸之疏水指數。疏水胺 基酸指數對賦予蛋白質交互作用生物功能之重要性通常為 業界已知（Kyte及Doollttle⑽2)分子生物學期刊157 : 奶-132)。已知胺基酸之相對疏水特性促成所得蛋白質之次 級結構，該次級結構又界定蛋白質與其它分子如峰、酶基 質、受器、DNA、抗體、抗原等間的交互作用。 34 200526779 5

-10 各個胺基酸基於其疏水性以及電荷特性被指定一個疏 水指數（Kyte及Doolittle，1982，參見上文）；分別為異白胺 酸（+4·5);操胺酸（+4.2);白胺酸（+3·8)，苯基丙胺酸（+2.8); 半胱胺酸/胱胺酸（+2.5);蛋胺酸（+1.9);丙胺酸（+1·8);甘 胺酸（-0.4);蘇胺酸（-0.7);絲胺酸（·〇·8);色胺酸（-〇 9);路 胺酸（-1.3);脯胺酸（-1.6);組胺酸（-3.2);麩胺酸（_3·5);楚 胺（-3.5);天冬酸（-3.5);天冬醯胺（-3.5);離胺酸（·39)及精 胺酸（-4.5)。 進行此等改變時，以取代胺基酸其疏水指數於± 2以内 者為佳。± 1以内為特佳，± 〇·5以内又更特佳。 業界也需了解基於親水性可讓類似胺基酸之取代變有 效。例如美國專利4,554,101陳述藉毗鄰胺基酸親水性控 制，蛋白質之最大局部平均親水性與蛋白質之生物性質有 交互關聯。 15 如美國專利第4,554，101號說明，下列胺基酸殘基分別 具有指定親水性數值：精胺酸（+3.0)，離胺酸（+3·…，天冬 酸（ + 3·0± 1) ’麵胺酸（+3〇±丨），絲胺酸（+〇.3)，天冬醯胺 (+0.2) ’麩胺（+〇·2)，甘胺酸（〇)，蘇胺酸（-〇.4)，脯胺酸（·〇·5 ± 1)，丙胺酸（-0.5)，組胺酸（·〇·5)，半胱胺酸㈠·〇)，蛋胺 2〇酸㈠·3) ’擷胺酸㈠·5)，白胺酸（-1.8)，異白胺酸（-1.8)，酪 月女酸（_2·3) ’笨基丙胺酸（_2·5)，及色胺酸（_3·4)。 進行此等變化時，以取代胺基酸其親水性數值於± 2以 内者為佳。± 1以内為特佳，± 〇 5以内又更特佳。 修飾可為保守修飾，讓蛋白質之結構或生物功能不受 35 200526779 改變影響。此㈣守胺基酸㈣係基於絲酸支鏈取代基 的類似性例如疏水性、親水性、電荷、大小等。將前述多 種特性皆列人考慮之保守取代範例為業界眾所周知，包括 精胺酸及離胺酸；楚胺 妝馼及天冬酸，絲胺酸及蘇胺酸；麵 胺及天冬醯胺；及擷胺酸、 曰妝®文及異白胺酸。經修飾後 GDF前胜肽之胺基酸序列 j j、、’二1>飾而有任何數目的保守變 化’只要經修飾GDF性質結合至其目標gdf蛋白質不會受 到不良影響即可。

10 相對序列類似或相同性（於蛋白質及分子生物業界也 稱：序列同源性)較佳使用序列套裝分析軟體(第ι〇版;遺傳 計算機集團公司，威斯康辛州馬里森，朗康辛大學生技 中〜）之「取佳匹配」或「間隙」程式測定。「間隙」係利 用Needleman及Wunsch之演繹法則（驗心_及，

1970)，找出可獲得最大匹配數目及最小間隙數目的二個序 15列對準。「最佳匹配」程式進行二序列間最佳類似性節段的 最理想對準。最理想對準係使用如池及Waterman(smitj^

Waterman，1981 ; Smith等人，1983)之局部同源性演釋法 則讓匹配數目獲得最大值。 前述序列分析特徵軟體含有多種其它有用的序列分析 20工具用來識別此處揭示核蒈酸及胺基酸序列之同源性。例 如，「BLAST」程式（Altschul等人，1990)搜尋於特定資料 庫（例如美國馬里蘭州貝斯拉國家生技資訊中心（ncbi)維 持的序列資料庫）與查詢序列（肽或核酸）類似的序列； 「FastA」（Lipman 及 Pearson，1985 ;也參考Pears〇n 及 36 200526779

Llpman，1988 ; pearson 等人，199〇)程式進行 Pears〇n& Lipman搜尋，搜尋查詢序列與一組同型序列（核酸或蛋白質） 間的頜似性，「TfastA」程式執行pearson及Lipman搜尋，搜 尋蛋白質查詢序列與任一組核苷酸序列（於進行比較前將 5核苷酸序列轉譯於全部6個讀取架構）間的類似性；「Fastx」 進行Pearson及Lipman搜尋，搜尋核苷酸查詢序列與一組蛋 白質序列間的類似性，將架構位移列入考慮。「Tfastx」執 行Pearson及Lipman搜尋，搜尋蛋白質查詢序列與任一組核 菩酸序列間的類似性，將架構位移列入考慮（進行比較前轉 10 譯核酸序列之二股）。 熟諳技藝人士了解經修飾或未經修飾GDF前胜肽其胺 基酸序列可含有任何數目的取代，而未變更其生物性質。 較佳具體實施例中，此種變化為保守胺基酸取代，其為業 界眾所周知。考慮前述多種特性之範例保守性取代為蛋白 15質生化業界人士眾所周知，包括但非限於精胺酸及離胺 酸；麩胺酸及天冬酸；絲胺酸及蘇胺酸；麩胺及天冬醯胺； 及擷胺酸、白胺酸及異白胺酸。 20 本發明之若干具體實施例中，蛋白質之活體内穩定性 可以夕種方式測里…具體實施例中，血清或組織樣本係 於靜脈或腹内輸送蛋白質後或蛋白f經放射性標記後，例 如使用碘]25標記後之多個時間點，使用業界人士眾所周 知之方法收獲。各血清或組織樣本的放射性存在量可使用 你瑪計數器測定。另-具體實施例中，血清之蛋白質完整 性/安定性可於自動放射性攝影或西方墨點分析後藉 37 200526779 SDS-PAGE評估。另一具體實施例中，蛋白質生物活性可使 用業界已知多種功能檢定分析包括EUSA&基於細胞的檢 定分析中之任一種測定。 疾病治療方法 5 本發明之GDF前胜肽可用於人類或動物預防或治療多 種醫事病症。GDF前胜肽較好用於抑制或減少一或多種 GDF蛋白質相關活性。高度較佳具體實施例中，經修飾之 GDF $胜肽比較未被相同前胜肽結合的成熟蛋白 貝’可抑制或減少一或多種成熟GDF4活性。較佳具體實 10施例中，成熟GDF-8蛋白質當被一或多種經修飾的gDF前胜 肽結合時，其活性被抑制至少5〇%，較好至少6〇，62，64， 66 ’ 68 ’ 70 ’ 72 ’ 74 ’ 76，78，80，82，84，86或 88%， 更好至少90，91，92，93或94%，及又更好至少95%至1〇() /6，此種活性抑制係與未被一或多種經修飾之GDF前胜肽 15 結合的成熟GDF-8蛋白質做比較。 藉經修飾之GDF前胜肽治療或預防之醫事病症較好為 肌肉或神經肌肉病症（例如肌萎縮性脊側索硬化、肌肉營養 失調、肌肉萎縮、充血性阻塞性肺疾、肌肉消耗性症候群、 肌肉缺乏心病貝）、代謝疾病或病症（例如第二型糖尿病、 20非胰島素依賴型糖尿病、高血糖或肥胖）、脂肪組織病症（例 如肥胖）、以及骨退化病（如鬆骨病）。醫事病情最佳為肌肉 或神經肌肉病症如肌萎縮性脊側索硬化、肌肉營養失調、 肌肉萎縮、充血性阻塞性肺疾、肌肉消耗性症候群、肌肉 缺乏或惡病質。另一較佳具體實施例中，醫事病情為代謝 38 200526779 疾病或病症例如由於葡萄糖代謝功能不良及/或胰導素广 性導致的疾病，例如第二型糖尿病或非胰島素依賴型糖尿 病，或代謝病症如高血糖或肥胖。GDF前胜肽較好用於哺 乳類來預防或治療此種醫事病症，最好用於人類。 5 本發明2GDF前胜肽或前胜肽複合物其於治療有效量 投予。用於此處，「有效量」、經改性之GDF前胜月太為可有效 降低GDF蛋白f活性而達成預定生物結果（例如增加骨絡 肌質量）之劑量。-具體實施例中，所需生物結果可為任一 種治療效果包括肌肉質量增加，肌肉強度增加，代謝改善， 1〇肥胖減少或葡萄糖體内平衡改良。此等改進可藉多種方法 測量，包括測量痩肉及肥肉身體質量（例如χ_光掃描分析卜 肌肉強度、血清脂質、血清痩素、血清葡萄糖糖化血色素、 «萄糖耐性以及糖尿病繼發併發症的改善。通常，治療有 效1可隨個體年齡、體重、身體情況、及性別以及個體病 情嚴重程度改變。劑量由醫生決定，視需要調整而配合觀 察得的治療效果。通常，組合物之投藥劑量給予gdf前胜 月曰大50微克/千克至2〇毫克/千克。較佳，咖前胜肽係以大劑 里才又藥’俾獲知’給藥後GDF前胜肽循環濃度最高經歷最長 時間。大劑量投藥之後也可使用連續輸注。 20 纟發明也提供預防或治療因異常葡萄糖體内平衡造成 的代謝疾病或病症。正常葡萄糖體内平衡要求由騰臟貝它 細胞回應於血糖濃度的些微變化而微調姨島素分泌量。騰 島素基本作用之一係刺激葡萄糖由血液攝取入組織，特別 為肌肉及脂肪。 39 200526779 如此，一具體實施例中，本發明提供一種治療糖尿病 及相關病症如肥胖或南血糖之方法，經由對個體投予足夠 改善疾病症狀有效量之經修飾之GDF前胜肽或經修飾之 GDF前胜肽組合物。第二型或非胰島素依賴型糖尿病 5 (NIDDM)特別具有下列三重特徵：（1)於周邊組織具有抗 性，特別於骨骼肌及脂肪細胞，（2)胰島素抑制肝糖製造的 作用受損，以及（3)胰島素分泌失調（DeFr〇nz〇，（1997)糖尿 病綜論）。因此，第二型糖尿病病人根據本發明可經由投予 經修飾之GDF前胜肽提高對胰島素以及葡萄糖被細胞攝取 10 的敏感度而予治療。 同理，其它疾病及代謝病症具有胰島素功能不良（例如 杬性、無活性或缺乏）及/或葡萄糖輸送入細胞不足的疾病可 可根據本發明經由投予經修飾之GDF前胜肽提高對胰島素 以及葡萄糖由細胞攝取之敏感度而予治療。 15 本發明之經修飾之GDF前胜肽或經修飾之gDF前胜肽 組合物可以治療有效量投藥。當用於治療糖尿病及相關病 症時，「有效量」經改性(31)?前胜肽為足夠降低gDF蛋白質 活性而達成一或多種預定療效的劑量，此等治療效果敏感 度例如胰島素敏感度或葡萄糖由細胞攝取增加，脂肪身體 2〇貝里減少或血清脂質、血清痩素、血清葡萄糖、糖化血色 素、葡萄糖耐性的預定變化，或寄發糖尿病併發症的改進。 通常，治療有效量將隨個體年齡、情況及性別，以及個體 之胰島素功能不良嚴重程度改變。劑量係由醫師決定以及 視需要調整而適合觀察得的治療效果。通常，組合物之投 40 200526779 藥劑量投予GDF前胜肽50微克/千克至20亳克/千克。較好， GDF前胜肽係以大劑量投藥，俾於投藥後獲得最大GDF前 胜肽循環濃度經歷最長時間。大劑量投藥後也可採用連續 輸注。 5 本發明也提供活體内製造GDF前胜肽之基因治療。此 種治療可藉由將GDF前胜肽聚核荅酸序列導引入由前文列 舉病症之細胞或組織而達成其治療效果。GDF前胜肽聚核 苷酸序列的輸送可使用重組表現載體如嵌合體病毒或膠體 分散系統達成。特佳治療性輸送GDF前胜肽聚核苷酸序列 10 係使用鎖定目標之微脂粒。 多種可用於此處教示基因治療之病毒載體包括腺病 毒、⑴疹病毒、水痘病毒、或較好RNA病毒如反錄病毒。 較好，反錄病毒為鼠或禽反錄病毒衍生病毒。其中可插入 單一外來基因之反錄病毒範例包括但非限於；木洛尼 15 (Moloney)鼠白血病病毒（MoMuLV)，哈維（Harvey)鼠肉瘤病 毒（HaMuSV)，鼠乳腫瘤病毒（MuMTV)，及勞司（R〇us)肉瘤 病毒（RSV)。多種其它反錄病毒載體可結合多重基因。全部 載體可移轉或結合可選擇標記的基因，讓轉移後的細胞可 經識別及產生。經由將感興趣之GDF前胜肽聚核；酸序列 2〇插入病毒載體連同另一個編碼特定目標細胞（舉例）受器的 配體基因，今日載體可被基因鎖定。反錄病毒可利用附接， 例如糖、糖脂質或蛋白質而做為特定目標。較佳鎖定目標 係使用抗體達成。熟諳技藝人士了解特定聚核笞酸序列可 插入反錄病毒基因體，或附接至病毒膜衣，俾允許以鎖定 41 200526779 5

目土標方式輸送含GDF前胜肽聚核苔酸至反錄病毒載體。較 ^月丑貝知例中，載體係對肌肉細胞或肌肉組織鎖定目標。 由方、重組反錄病毒為缺陷病毒，其需要助手細胞系， 助手細胞系Ή質體編碼全部&錄病#結構基因且處於 R内邛凋即序列控制之下。質體喪失一個核苷酸序列，讓 封裝機轉可辨識RNA轉錄本而套上衣殼。助手細胞系其具 有封裝信號刪失之細胞系，包括但非限於例如psi.2，pA3i7 及PA12。此等細胞系產生空白病毒粒子，原因在於其中未 封裝基因體。若反錄載體被引導入封裝信號完整的細胞， - 10 則結構基因被其它感興趣的基因替代，載體可被封裝而產 生载體病毒粒子。 另外，其它組織培養細胞可藉習知磷酸鈣轉移感染而 直接轉移感染編碼反錄病毒結構基因糾、_及_之質 體。然後此等細胞轉移感染含有感興趣基因之載體質體。 15結果所得細胞將反錄病毒載體釋放於培養基。 另一種GDF前胜肽聚核菩酸之鎖定目標輸送系統為膠 體分散系統。膠體分散系統包括巨分子複合物、奈母膠囊、 微球、珠粒，及基於脂質的系統包括水包油乳液、膠粒、 混合谬粒及微脂粒。較佳本發明膠體系統為微脂粒。微脂 20粒為人工膜囊其可用做為試管試驗及活體的輸送媒劑。 舰、DNA及完整病毒粒子可被包囊於水性内部且以生物 活性形式輸送至細胞（例如參考Fraiey等人，生化科學趨 勢，6 · 77 1981)。使用微脂粒媒劑之有效基因移轉方法 為業界已知，例如參考Manmn〇等人，生物技術，6 :邮， 42 200526779 1988。微脂粒組成通常為磷脂質組合，通常微磷脂質組合 類固醇，特別膽固醇。也可使用其它磷脂質或其它脂質。 微脂粒之物理性質依據pH、離子強度及二價陽離子的存在 決定。

可用製造微脂粒之脂質例如包括磷脂基化合物，如鱗 脂基甘油、磷脂基膽鹼、磷脂基絲胺酸、磷脂基乙醇胺、 鞘磷脂、腦苷脂類及神經節苷脂類。磷脂質例如包括即鱗 脂基膽鹼、二棕櫚醯基磷脂基膽鹼及二硬脂醯基磷脂基膽 驗0 1 〇 微脂粒的鎖定目標亦係基於器官特異性、細胞特異性 及小器官特異性且為業界已知。 已經修飾之GDF前胜肽治療或預防前述醫療病情之方 法也可用於抑制TGF- ySl超族的其它蛋白質。其中多種蛋白 質之結構係與GDF-8有關，如BMP-11。如此，另一具體實 15施例中，本發明提供經由對個體投予可抑制非-GDF-8蛋白 質之經修釋之GDF前胜肽（單獨投藥或組合抗GDF-8之經修 釋之GDF前胜肽）而治療前述病症之方法。 經修釋之GDF前胜肽組合物 本發明提供經修釋之GDF前胜肽組合物。此種組合物 2〇適合醫藥用途及投予病人。組合物典型包含一或多種本發 明經修釋之GDF前胜肽及醫藥可接受性賦形劑。用於此 處，「醫藥可接受性賦形劑」一詞包括任一種及全部溶劑、 刀放’丨貝、塗層、抗菌及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑等， 此等添加劑係於醫藥投藥相容。此等醫藥活性物質之媒介 43 200526779 之使用為業界眾所周知。範例醫藥可接受性賦形劑可參考 「醫樂賦形劑手冊」第3版，2000年，美國製藥出版社，A.E.

Klbbe編輯。組合物也含有其它提供補充、增加或提升治療 功能的化合物。醫藥組合物也連同投藥指示封在容器、包 5 裝或配送器内。

• 10 本發明之醫藥組合物可調配成與其預期投藥途徑相 容。達成投藥方法為熟諳技藝人士已知。也可獲得組合物 其可局部投藥或經口投藥，或可通過黏膜投藥。投藥例如 為靜脈（ι·ν.)、腹内（LP)、肌肉（LM )、空腔内、皮下内（s c.) 或經皮途徑。較佳具體實施例包括ι·ν·、Ι·ρ·、Ι·Μ.及s.c. 注射。較佳具體實施例中，本發明之醫藥組合物係經靜脈 投藥。 用方、皮内或皮下之溶液劑或懸浮液劑典型包括一或多 種下列成份：無菌稀釋劑如注射用水、鹽水、固定油、聚 15乙一醇甘油丙一醇或其它合成溶劑；抗菌劑如苯甲醇 或經曱基苯甲酸抗氧化劑如抗壞血酸及亞硫酸氮納； f合鈉如伸乙基一胺四乙酸；緩衝劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽 及輕鹽；以及張力調節劑如氣化鈉及葡萄糖。阳可使用 酸或鹼如鹽酸或氫氧化鈉調整。此等製劑可封在玻璃或塑 2〇膠製之安瓿、拋棄式注射器或多劑量小航。 注射用之醫藥組合物包括無菌水性溶液劑或分散液， 以及臨時準備無菌注射溶液或分散液劑之無菌粉末。供靜 脈投藥，適當載劑包括生理鹽水、抑菌水、卡萊蒙 (c_ph0r)EL(BASF公司，紐澤西州巴希潘尼）或賴鹽緩 44 200526779 衝鹽水（PBS)。各例中，組合物 奶乂肩無囷也必須流體至溶液 抽取注射的程度。組合物於製造及儲存條件下必須安定， 必須可保藏不受微生物如細菌及真菌污染。載劑也為例如 含水、乙醇、多元醇（如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇等） 5及其適當混合物之溶劑或分散介質。適當流動性，例如可 使用包衣如㈣脂維持，分散液案例藉維持所需粒” 持、及使用界面活性劑維持。預防微生物作用可藉多種抗 菌及抗真菌劑達成，例如對經笨甲酸醋類、氯丁醇、盼、 抗壞血酸及硫柳乘等。多種情況下，較好涵括等張劑如糖 "、多元醇類如甘露糖醇、山梨糖醇、氣化鈉於組合物。 經由於組合物涵括延遲吸收劑例如一硬脂酸铭及明膠可延 長注射組合物的吸收。 口服組合物通常包括惰性稀釋劑或食用載劑。例如， 可包括於明膠膠囊或壓盤Λ , 15

飞壓衣成叙劑。供口服治療投藥，GDF 前㈣可攙混賦形劑而錢劑、片劑或膠囊劑劑型使用。 醫藥相容結合劑’及/或佐劑可涵括做為組成的-部份。鍵 劑、丸劑、膠囊劑、片劑等可含有後述任一種成份或具有 類似性質之化合物；黏結劑如微晶纖維素、西黃箸膠或明 20 膠；更好賦形劑如搬粉或乳糖；崩散劑如褐藻酸，佩莫吉 (Primogel)，或玉米澱粉·、、叫 教物，潤滑劑如硬脂酸鎂或史代洛 (Sterotes);滑動劑如膠體-畜 膠體一氧化石夕；填味劑如蔗糖或沙卡 林；或橋味劑如薄荷、水楊酸甲S旨或柳橙口味。 t、吸k # GDF則胜肽可呈氣霧劑噴霧形式投藥， “㈣##㈣例如二氧化碳氣體之壓縮容器或配送器 45 200526779 或霧化器喷霧投藥。 系統性投藥也可採經黏膜或經皮手段。用於經黏膜或 經皮投藥，適合欲穿透的障壁的穿透劑用於配方。此種穿 透劑為業界所周知’包括例如供經黏膜投藥清潔劑、膽酸 5及褐黴酸衍生物。經黏膜投藥可使用比喷霧劑或栓劑達 成。供經皮投藥，如業界已知，活性化合物被調配成軟膏 劑、硬膏劑、膠漿劑或乳膏劑。 GDF前胜肽也可製備成栓劑劑型（使用習知栓劑基劑 如可可脂及其它甘油酯類）或直腸投藥的駐流浣腸劑。 1〇 一具體貫施例中，經修飾之GDF前胜肽係以可保護化 a物不會被身體快速清除的載劑製備，例如控制釋放調配 WJ，包括吳體及微包囊輸送系統。可使用生物可分解生物 相谷性聚合物例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、 膠原、聚原酸酯類、以及聚乳酸。此種調配劑之製法為熟 15諳技蟄人士顯然易知。材料可於市面上得自艾龍（Alza)公司 及3瓦（Nova)製藥公司。含經修釋之GDF前胜肽之微脂粒 懸〉予液也可用做為醫藥可接受性載劑。可根據熟諳技藝人 士已知方法製備，例如述於美國專利第4,522,811號。 特佳，為方便投藥及劑量均一，將口服或注射組合物 2〇調配成單位劑型。此處使用之單位劑型表示適合用於接受 治療個體做為單位劑量之物理個別單位；各單位含經過計 ^r 了產生預疋療效之預疋置活性化合物組合所需製藥載 劑。本發明之單位劑型係依據活性化合物獨特特性以及預 達成之特定療效，以及混料業界特有限制例如處理個體之 46 200526779 活性化合物直接決定。 化合物毒性及療效係由標準製藥程序於細胞培養或使 用動物決定，例如測定LD^(對50 %族群致死劑量）及 ED5〇(於50%族群治療有效劑量）。毒性與療效間之劑量比為 5治療指數，可表示為[〇5〇/£〇5〇比。以具有較大治療指數之 GDF前胜肽為佳。 由細胞培養檢定分析及動物研究所得資料可用於調配 供人類使用之劑量範圍。此種化合物劑量較好係於包括 ED”之循環濃度範圍而極少或不具有毒性。劑量可依據使 10用的劑型以及採用的投藥途徑而於此範圍改變。對任何本 發明使用之經修飾之GDF前胜肽而言，治療有效劑量最初 由細胞培養檢定分析估計。劑量於動物模式調配成可達成 涵括細胞培養測定的IC^(亦即可達成症狀最大抑制之一半 程度的接受試驗經修飾之GDF前胜肽濃度）之循環血槳濃 15度。血漿濃度可藉咼效液相層析術測量。任何特定劑量之 影響係由適當生物檢定分析監視。適當生物檢定分析例如 包括DNA複製檢定分析、基於轉錄之檢定分析、GDF蛋白 質/¾:裔結合檢定分析、肌胺酸激酶檢定分析、基於前-脂肪 細胞分化之檢定分析、基於脂肪細胞之葡萄糖攝取之檢定 20 分析、及免疫檢定分析。 I：實施方式3 下列實例提供本發明之較佳具體實施例。熟諳技藝人 士了解可未悖離本發明之精髓或範圍做出多種修改及變 化。此等修改及變化相信皆屬於本發明之範圍。實例絕非 47 200526779 5

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20 意圖囿限本發明。 本案全案引述之參考文獻、專利案及公開專利申請案 全體内容以引用方式併入此處。 實例 實例1 : GDF-8之純化 得自選定的可表現重組人GDF-8蛋白質（成熟 GDF-8 + GDF-8前胜月大）之細胞系之經條件處理的培養基酸 化至pH 6.5及施用至80x50毫米POROS HQ陰離子交換管 柱銜接一根80x50毫米POROS SP陽離子交換管柱（透視生 物系統公司）。通過之流調整至pH 5.0及施用至75x20毫米 POROS SP陽離子交換樹月旨（透視生物系統公司）且使用氯化 鈉梯度洗滌。藉十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)指示含GDF-8之洗提份，經匯集的以三氟乙酸 (TFA)酸化至pH 2.3，然後使用0.1%TFA調整至200毫升而 降低黏度。然後匯集物施用至一根前方有60x21.2毫米防衛 管柱（賓諾米司（卩1^11〇11^1^乂）公司）的25(^21.2毫米（：5管柱 (賓諾米司公司），使用TFA/CH3CN梯度洗提而由GDF-8前胜 肽分離成熟GDF-8。含成熟GDF-8之匯集洗提份藉凍乾濃縮 去除乙腈及加入20亳升0.1% TFA。然後樣本施用於250x10 毫米C5管柱（賓諾米司公司），加熱至60°C輔助分離。重複至 無法進一步分離為止。然後匯集含成熟GDF-8之洗提份， 調整至40 %乙腈，施用至一根600x21.2貝爾赛皮 (BioSep)S-3000尺寸排除管柱（賓諾米司公司），該管柱前方 有一根60x21.2防衛管柱。匯集含純化後之成熟GDF-8之洗 48 200526779 5

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20 提份，濃縮供隨後實驗使用。成熟GDF-8二元體之典型產 率為0.33亳克蛋白質/升經調理的培養基。 含GDF-8前胜肽之C5管柱洗提份經匯集，蒸發去除乙 腈，加入20毫升0.1%TFA，然後樣本注入60°C之250x10毫 米C5管柱。重複至無法進一步分離為止。然後匯集含GDF-8 前胜肽之洗提份，調整至40%乙腈，施用至一根600x21.2 貝爾賽皮S-3000尺寸排除管柱（賓諾米司公司）前方有一根 60x21.2防衛管柱。匯集含經純化後的GDF-8前胜肽洗提份 及濃縮用於隨後用於隨後實驗。GDF-8前胜肽典型產率為 0.24毫克蛋白質/升經調理的培養基。 進行SDS-PAGE時，純化後之成熟GDF-8於非還原條際 下於25 kDa呈寬帶遷移，以及於還原條件下於13 kDa呈寬 帶遷移。對GDF-8也報告有類似SDS-PAGE情況（McPherron 等人（1997)自然387 : 83-90)，反映出成熟蛋白質之嵌合體 性質。 經純化後GDF-8前胜肽之名目分子量於還原及非還原 條件下皆為38 kDa。如此指示GDF-8前胜肽為單體。GDF-8 前胜肽之名目分子量與預測分子量約26 kDa間的差異反應 出添加碳水化合物，原因在於其胺基酸序列含有一個潛在 N-鍵聯糖化位置（McPherron等人（1997)美國國家科學院議 事錄94 : 12457-12461)。如此，前述方法可製造經純化的及 活性成熟GDF-8二元體及GDF-8前胜肽。 實例2 :經純化之重組人GDF-8特性 各50微克經純化之成熟GDF-8及經純化之GDF-8前胜 49 200526779 肽混合及透析入50 mM磷酸鈉pH 7.0，及於300x7.8亳米貝 爾賽皮S-3000尺寸排除管柱（賓諾米司公司）層析。由洗提時 間決定GDF-8/前胜肽複合物分子量，分子量決定係使用於 同一根管柱層析的分子量標準（貝雷（Bio-Rad)實驗室，加州 5 賀克里斯）。

當純化後之GDF-8前胜肽與純化後之成熟GDF-8於中 性pH培育時，二種蛋白質顯然複合，如尺寸排除情況指示。 於12.7分鐘洗提的主蛋白質尖峰，由同一根管柱上層析的 分子量標準（貝雷實驗室，加州賀克里斯）估計分子量為78 10 kDa。複合物大小最為符合成熟GDF-8結合二個前胜肽單體 之二元體，如此形成四元體複合物。 為了證實此項觀察，含成熟GDF-8及GDF-8前胜肽之製 劑與或未與1〇〇 mM 1-乙基3-[3-二甲基胺基丙基]甲二醯胺 鹽酸鹽（EDC，皮爾司（Pierce)公司）於室溫共同培育1小時， 15 使用鹽酸酸化至pH 2-3，使用邁克隆（Micron)-10濃縮器（阿 米空（Amicon)公司）濃縮用於進行SDS-PAGE，SDS-PAGE係 使用經過崔辛（tricine)緩衝的10%丙烯醯胺凝膠。蛋白質藉 庫馬司藍染色目測觀察。唯有於樣本添加EDC才觀察到對 應於分子量約75 kD之氮，對照行道未見該帶，證實存在有 20 GDF-8成熟/GDF-8前胜肽複合物。如此證實該檢定分析可 用於測量純化後成熟GDF-8二元體活性及濃度。 實例3 :經純化後GDF-8之試管内生物活性 為了證實GDF-8活性，通報子基因檢定分析（RGA)係使 用通報子載體pGL3(CAGA)12序列耦合蟲螢光素酶發展。 50 200526779 CAGA序列先前報告為TGF- yS-誘生基因之啟動基因，PAI-1 的 TGF- yS -反應序列（Dennler 等人（1998)EMBO J. 17 : 3091-3100)。 含12 CAGA框的通報子載體係使用基本通報子質體， 5 pGL3(普米加公司，美國威斯康辛州馬里森，型號E1751) 製造。得自腺病毒主要後期啟動基因（-35/+10)的TATA框及 轉錄起點位置被插入於Bglll與Hindlll間。含CAGA框

AGCCAGACA十二次重覆的寡核苷酸經配對且轉殖於Xhol 位置。人類橫紋肌肉瘤細胞系，A204(ATCC HTB-82)使用 10 FuGENE 6轉移感染劑（羅氏診斷公司，美國印地安那玻里， 型號1814443)以pGL3(CAGA)12—過性轉移感染。轉移感染 後，細胞於馬克依（McCoy)5A培養基（生命技術公司，美國 馬里蘭州洛克維，型號21500-079)於48孔平板上培養16小 時，培養基補充2 mM麩胺100單位/毫升鏈黴素，1〇〇微克/ 15 毫升青黴素及10%胎牛血清。然後細胞於馬克依5 A培養基 使用GDF-8、BMP-11或活化素處理，培氧基補充麩胺、鏈 黴素、青黴素及1毫克/毫升牛血清白蛋白，處理係於3 7 °C 進行6小時。使用蟲螢光素酶檢定分析系統（普米加公司， 美國威斯康辛州馬里森，型號E1483)定量接受處理細胞的 20 蟲螢光素酶。檢定分析結果示於第1圖。對GDF-8，結果為 三次分開實驗之平均±標準差表示。對BMP-11及活化素， 結果為二次分開實驗的代表數值。 結果顯示GDF-8最大活化通報子構成體10倍，ED50為 10毫微克/毫升GDF-8，指示純化後之重組GDF-8具生物活 51 200526779 性。BMP-11與GDF-8之相同性達90 % (Gamer等人（1999)發 展生物學208 : 222-232及Nakashima等人（1999)機械發展 80 : 185-189)，活化素提引出類似生物反應，指示通報子基 因檢定分析為檢測GDF-8、BMP-11或活化素之試管試驗生 5 物活性之適當檢定分析。 實例4:經純化後GDF-8之結合性質

GDF-8潛在複合物於冰上以20莫耳EZ-鍵聯磺基-NHS-生物素（皮爾司公司，美國伊利諾州洛克福，型號21217)對1 莫耳GDF-8複合物之比例接受生物素化2小時，使用0.5% 10 TFA失活化，於C4朱比特（Jupiter)250x4.6毫米汞柱（賓諾米 司公司）接受層析而由GDF-8前胜肽分離成熟GDF-8。使用 TFA/CH3CN梯度洗提出的生物素化成熟GDF-8洗提份經匯 集，濃縮，以及藉微BCA蛋白質檢定分析試劑套件組（皮爾 司公司，美國伊利諾州洛克福，型號23235)定量。 15 重組ActRIIB-Fc嵌合體（R&D系統公司，美國明尼蘇達 州明那玻里，型號339-RB/CF)於4°C以1微克/毫升於〇·2 Μ 碳酸鈉緩衝液塗覆於96孔平底檢定分析板（科司達 (Costar)，紐約，型號3590)塗覆隔夜。然後平板使用1毫克/ 毫升牛血清白蛋白封阻，遵照標準ELISA方案洗滌。添加 20 不同濃度之生物素化GDF-8整份100微升至經過封阻之 ELISA平板，培育1小時，經洗滌，結合的GDF-8量係藉鏈 絲菌抗生物素-辣根過氧化酶（SA-HRP，BD法明吉（BD PharMingen)，美國加州聖地牙哥，型號13047E)接著加入 TMB(KPL，美國馬里蘭州蓋瑟堡，型號50-76-04)偵測。比 52 200526779 5

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20 色測量係於分子裝置微平板讀取器於450 nM進行。 如第2圖所示，生物素化GDF-8結合至ActRIIB，推定為 GDF-8 II型受器，具有ED50 12毫微克/毫升，指示ActRII結 合檢定分析為敏感的試管試驗GDF-8結合檢定分析。 實例5:藉00^8前胜肽抑制00?-8及31\4?-11 GDF-8與GDF-8前胜肽於室溫前培育1小時時，GDF-8 之生物活性減低。第3圖顯示於GDF-8前胜肽存在下於 GDF_8的ED5〇，10毫微克/毫升誘發pGL3(CAGA)12it報子活 性。GDF-8前胜肽係以劑量反應方式減少GDF-8的誘生， IC5〇=25毫微克/毫升（0.6 nM)°GDF-8前胜肽也抑制BMP-11 生物活性至同等程度。相反地，本檢定分析之活化素活性 不受GDF-8前胜肽影響，推定原因係比較GDF-8及 BMP-11，GDF-8及活化素間的同源性相當低。 同理，第4圖顯示GDF-8前胜肽與生物素化GDF-8於5 毫微克/毫升前培育，於ActRIIB結合檢定分析抑制GDF-8 結合至ActRIIB，如實例4所示，IC5〇為0.3 nM。獲得結論， 本發明之GDF-8前胜肽為試管試驗GDF-8及BMP-11活性之 強力次毫微莫耳濃度抑制劑，此項性質係於通報子基因檢 定分析及ActRIIB結合檢定分析測量。如此，本檢定分析顯 示GDF-8前胜肽為活性，於本檢定分析為GDF-8活性強力抑 制劑。 實例6 ··藉GDF-8前胜肽抑制GDF-8-受器的結合 GDF-8如Frolik等人（1984)生物化學期子ij 259 ： 10995-10999所述使用可拉明（chloramine)T硬化至比活性 53 200526779 100-200 // Ci//z g。換化 GDF-8顯示於實例 3所述（caga)i2 通報子檢疋分析中，可娘美未經標示gdf_8之生物活性。 〗25I-標示GDF-8評估其對肌母細胞系L6之特異性結合作用。 L6肌母細胞（ATCC CRL-1458)於杜貝可改性鷹氏培養 5基（補充10%熱失活化胎牛血清）於明膠化24孔平板上生長 至融合。如Song等人（1995)内分泌學136: 4293-4297所述， 全文以引用方式併入此處，進行平衡結合。〗毫微克/毫升 GDF-8(含或未含未經標示的GDF-8)與融合L6細胞於培 育4小時。洗滌細胞後結合的】25j GDF_8經萃取且使用珈瑪 10計數器定量。結果以重覆三次測定的平均±標準差表示代 表三次分開實驗。 如第5圖所示，i25；f GDF_8以高度親和力結合至“細 胞。發現BMP-11(但非TGF-e!)，可置換125IGDF_8結合， 指示GDF-8及BMP-11 (但非TGF-石i)共享此種細胞上的一 15個共通文器（資料未顯示）。由GDF-8結合的史特曲 (Scatchard)分析，估計Kd為140 PM。此外，#1毫微克/毫 升】25I GDF-8與GDF-8前胜肽於室溫前培育丨小時時，gDF-8 與L6細胞之特異性結合可以遞增濃度至未經標記的gdf_8 前胜肽抑制（第6圖）。結果以重覆三次測定之平均+標準差 20表示，代表二次分開實驗。1毫微克/毫升GDF-8之IC5()為140 毫微克/亳升GDF-8前胜肽。如資料顯然易知，GDF_8前胜 肽經由遮斷GDF-8受器結合而抑制GDF-8生物活性。 實例7 ··藉GDF-8前胜肽Fc融合蛋白質抑制(3£)1^8活性 如下實例8所示，鼠GDF_8前胜肽於活體内半生期相合 54 200526779 短。為了增加GDF-8前胜肽的生物利用性，使用標準基因 工程技術建構GDF-8前胜肽與鼠IgG2a Fc區間的融合。

四種突變被引進Fc區俾減少效應物功能，述於Steurer 等人（1995)免疫學期刊155 : 1 165· 1174。使用標準PCR方 5 法，經由融合編碼鼠GDF-8前胜肽（胺基酸1-267)之cDNA至 鼠IgG2a Fc區（第7圖）製備二種融合構成體。融合構成體 1(第7A圖）編碼鼠GDF-8前胜肽之前26個胺基酸（包括24胺 基酸分泌前導基因），該鼠GDF-8前胜肽係合乎架構融合至 鼠IgG2a Fc區233胺基酸，始於樞鈕區第一個胺基酸。融合 10 構成體2(第7B圖）係以類似融合構成體1之方式構成，但有 個短的甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸-絲胺酸（GSGS)聯結基分開 GDF-8前胜肽於氛Fc區。 二個嵌合體被引進真核表現載體pED(Kaufman等人 (1991)核酸研究19 : 4485-4490)，根據製照商的方案使用利 15 寶非特明（Lipofectamine)2000轉移感染試劑（吉寇 (Gibco)BRL，生命技術公司，美國馬里蘭州洛克維，型號 11668-019)，於 COS-1 M6細胞一過性表現（Horowitz 等人 (1983)分子及應用基因學期刊2 : 147-159)。培育24小時後， 加入R1C D1 (經修飾之D Μ E M / F12無血清培養基）。匯集經調 20 理的培養基（CM)，以新鮮R1CD1替代，60小時後再度收獲 經調理的培養基。然後匯集經調理的培養基且於添加1/10 容積1 M Tris pH 8.0後以蛋白質A西法羅司 (Sepharose)CL-4B(阿莫山（Amersham)法瑪西亞生技公司， 英國，HP7 9NA，巴金罕西亞，型號17-07080-01)純化。純 55 200526779 化後的蛋白質於0· 1 Μ乙酸、1 50 mM氣化鈉洗滌，即刻使用 1/20容積3M Tris pH 9.0中和。蛋白質使用標準鼠IgG ELISA方案定量，於ActRIIB競爭ELISA連同經純化的人 GDF-8前胜肽檢定分析，如實例5所述。結果示於第8圖。 GDF_8前胜肽-Fc融合複合物之IC50係於低毫微莫耳濃度範 圍，融合1與2間並無差異。融合l(GDF-8前胜肽與鼠IgG2a 間並無聯結基）選用於製造穩定CHO細胞系，試驗於RGA檢 定分析抑制GDF-8。

GDF-8-前胜肽-Fc cDNA次轉殖於CHO表現質體 • 10 pHTop，且轉移感染CHO/A2細胞，如Thies等人（2001)生長 因子18 : 25 1-259所述，全文以引用方式併入此處。穩定細 胞系（PF-4/0· 〇2)係於〇· 02 Μ米索崔赛（methotrexate)選擇細 胞建立。收獲含有得自選定細胞系2GDF-8前胜肽_Fc融合 蛋白質之經調理培養基，其pH藉加入10% v/v 1M Tris pH 15 8.0調整，及以事先使用5〇mMTris 150mMNaClpH7.5平衡

的法瑪西亞r蛋白質A西法羅司快速流（阿莫山法瑪西亞生 技公司，英國，HP7 9NA，巴金罕西亞，型號17-1279-02) 純化。洗提份使用10〇1111^乙酸、15〇11^氣化鈉1^2.5洗提’ 即刻加入5% v/v 3M Tris pH 9.0中和。匯集尖峰洗提份及 20 載荷於法ί馬西亞蘇特代（Superdex)200尺寸排除管柱（阿莫 山法瑪西亞生技公司，英國’ HP7 9NA，巴金罕西亞，型 號17·1〇69-〇1)。〇·〇5%吞恩（Tween)80加至洗提份防止聚 集。洗提份係於諾維司（N〇vex)10%Tdcine凝膠（諾維司公 司，美國加州聖地牙哥，型號EC66755)藉SDS_PAGE評估。 56 200526779 匯集之洗提份藉分光光譜術分析，如實例4所述於 ActRIIB結合檢定分析檢定分析其活性，以及於通報子基因 檢定分析（第9圖）分析活性。純化後GDF-8前胜肽-Fc融合蛋 白質之IC5〇為1.3 nM。資料顯示本發明之包含GDF-8前胜肽 5 _Fc融合蛋白質之經修飾的GDF-8前胜肽比GDF-8前胜肽保 有強力抑制（中和）活性。 實例8 :藥力學

GDF-8前胜肽（此處稱做「GDF8-Pro」）之藥力學（PK) 以及GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質（此處稱做「GDF8-ProFc」） 10 之藥力學係以0·2微克/小鼠（GDF8-Pro)或2微克/小鼠 (GDF8-ProFc)單次靜脈投藥劑量而於C57B1/6J小鼠評估。 動物以上列劑量接受未經標記以及Ι25Ι-標記的-GDF8-Pro 或GDF8-ProFc混合物，基於血清之1251放射性以及注射劑量 之比活性測定血清濃度。第10圖顯示GDF8-Pro及 15 GDF8-ProFc二者之血清濃度相對時間作圖曲線。表1顯示單 次靜脈投予2微克/小鼠後GDF8-Pro及GDF8-PrOFc之藥力 學參數。GDF8-Pro之藥力學參數血清濃度經規度化成為2 微克/小鼠劑量以供比較。 表1 (¾ (毫_/毫 If、（^ (毫^ GDF8-Pro 232 1392 0.03 286 1.4 8.7 GDF-8-Pr 2.2 390 12.4 2.3 5.1 28.3 20 Τι/2 :終端清除相半生期

Cmax :尖+血清濃度 MRT :平均駐留時間 V::初分布容積 Vss :穩態分布容積 57 200526779 備註：GDF8-Pro藥力學參數規度化成為2微克/小時劑量。 如第10圖可知，GDF8-ProFc比GDF8-Pro廓清力減慢 400倍，半生期延長1〇〇倍。初分布容積及穩態分布容積對 GDF8-Pro 而言比 GDF8-ProFc 高約 3 倍，指示 GDF8-Pro 比 5 GDF8-ProFc分布至血管空間外側至較大程度。 雖然IgG分子Fc區對GDF前胜肽之穩定效果係使用小 鼠GDF前胜肽-Fc融合蛋白質（二種成份皆衍生自小鼠）舉例

說明，但本發明方法可應用至GDF前胜肽及IgG組成份之任 一種組合，而與衍生各組成份之特定前驅蛋白質或動物種 10 類無關，只要融合蛋白質經適當構成而保有活性（換言之， 如此處所述）即可。 實例9 ··二種人GDF-8前胜肽Fc融合物之衍生及活性 使用標準PCR方法製備二種GDF-8前胜肽Fc融合構成 體供評估治療潛力。編碼人GDF-8前胜肽之cDNA(序列ID 15 編號：5)融合至人IgGl Fc區（序列ID編號：15 ;第11A圖）， 或人IgG 1 Fc經修飾俾降低效應物功能（序列ID編號：16;第 11B圖）。 1.人GDF-8前胜肽-IgGl wtFc融合蛋白質（第11A圖）： 人GDF-8前胜肽之前264個胺基酸（包括序列id編號：5 20 之胺基酸1-241以及23個胺基酸信號生態示於序列ID編 號：13)以合乎架構方式融合至人IgGl恒定區之232個胺基 酸，始於樞鈕區的第一個胺基酸（序列ID編號：15)。 2·人GDF-8前胜肽-IgGl突變株（第11B圖）： 如前述，人GDF-8前胜肽頭264個胺基酸以合乎架構方 58 200526779 式融合突變後人1§G1 Fc區的227個胺基酸（序列1]〇編號： 16)。二突變，序列ID編號：16所示兩胺酸殘基（Ala-14及 Ala-17)被引進俾減低效應物功能，如Lund等人（1991)免疫 學期刊 147 : 2657-2662 及 Morgan 等人（1995)免疫學 86 : 5 319-324 所述。

二融合蛋白質被引進真核表現栽體pED(Kaufman等人 (1991)核酸研究19 : 4485-4490)，根據製造商的方案使用利 寶非特明2〇〇〇轉移感染試劑（吉寇BRL，生命技術公司，美 國馬里蘭州洛克維’型號11668_019)，一過性於COS-1 M6 10 細胞表現（Horowitz等人（1983)分子及應用基因學期刊2 : 147-159)。培育24小時後，加入R1CD1 (經修飾之DMEM/F12 無血清培養基）。匯集經調理的培養基（CM)，替換新鮮 R1CD1，00小時後再度收獲經調理的培養基。然後匯集經 調理的培養基且於添加1/10倍容積1 M Tris pH 8.0後以蛋 15 白質A西法羅司CL-4B(阿莫山法瑪西亞生技公司，英國， HP7 9NA ,巴金罕西亞，型號1 7-〇7〇80-01)純化。純化後的 蛋白質於0·1 Μ乙酸、150 mM氯化鈉洗提，即刻使用1/20 倍容積3M Tris pH 9.0中和。蛋白質使用標準人ELISA 方案定量，於ActRIIB結合檢定分析連同經純化的人GDF·8 20 前胜肽檢定分析，述於實例5。結果顯示於第12圖。歸結二 種人前胜肽-Fc融合蛋白質皆為GDF-8結合ActRIIB的強力 抑制劑。 實例10 : GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質之活體試驗 鼠GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質（得自實例9)於成小鼠 59 200526779 進订貫驗。7至9周齡成年雌性balb/c小鼠就體重隨機分 組’每組7頭（但未處理組除外，該組為6頭小鼠）。小鼠每周 藉腹内注射二次投藥，每頭動物每周總計量1〇微克、1〇〇微 克或1〇〇〇微克經歷5周時間。對照注射鼠IgG2a-Fc，其莫耳 5數係相當於高劑量前胜肽-Fc。研究結束時取出腓腸肌、四 頭肌、副睪脂肪墊、腎臟及肝臟稱重。第13圖顯示平均組 織質1 ’誤差柱指示平均之標準差。星號（*)指示比較接受 對照蛋白質IgG2aFc處理組小鼠之差異有統計學意義（使用 學生T試驗ρ < 0·01)。藉腹内注射1毫克/周（處理組小 10机）GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質封阻GDF-8之活體内活 性’比較未接受GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質之對照組小 鼠’腓腸肌增加6.2%及四頭肌肌肉質量增加113%。此外， 藉腹内注射100微克/周GDF-8前胜肽_Fc融合蛋白質（處理 組小鼠）於活體内遮斷GDF-8活性，結果導致脂肪墊質量增 15加23.0%。高劑量（1毫克/周）處理導致脂肪墊質量減少，但 由於脂肪墊質量的變化，該差異並非具有高度統計學意義 (P-0.047)。處理對其它試驗組織，包括肝及腎質量並無影 各。要5之，經修飾之GDF-8前胜肽於活體内遮斷gdf-8 活性，結果導致肌肉質量增加以及脂肪質量減少。要言之， 20藉腹内注射GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質（處理組小鼠）於活 體内遮斷GDF-8活性，結果導致腓腸肌及四頭肌肌肉質量 比未接受GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質處理之對照組小鼠增 加0 相當範圍 60 200526779 熟諳技藝人士了解或確定無須經由例行實驗即可對此 處所述之本發明之特定具體實施例做出多種相當變化。此 等相當例意圖皆涵蓋於如下申請專利範圍。 L圖式簡單說明】 第1圖顯示GDF-8、BMP-11及活化素於通報子基因檢定 分析之相對生物活性。 第2圖顯示經純化後之生物素化人GDF-8於ActRIIB結 合檢定分析之結合性質。

10 15

第3圖顯示於GDF-8、BMP-11、及活化素之ED5〇，於 GDF-8前胜肽存在下，pGL3(CAGA)12通報子活性之誘生。 第4圖顯示藉GDF-8前胜肽抑制生物素化GDF-8結合至 ActRIIB之劑量相依性抑制作用。 第5圖顯示GDF-8結合至L6細胞。 第6圖顯示藉GDF-8前胜肽抑制GDF-8特異性結合至L6 細胞之劑量相依性抑制作用。 第7A圖顯示屬GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質之胺基酸 序列。 第7B圖顯示屬GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質，其帶有短 甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸-絲胺酸（GSGS)鍵聯基分開GDF-8前 20 胜肽與Fc區。 第8A圖顯示於ActRIIB競爭ELISA，人類GDF-8前胜肽 及二種屬GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質對GDF-8結合的影 響。 第8B圖為表格其比較人類GDF-8前胜肽與二種屬 61 200526779 GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質之IC50。 第9圖顯示於通報子基因檢定分析，人GDF-8前胜肽與 屬GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質之相對生物活性。 第10圖顯示單次靜脈投予0.2微克/小鼠或2微克/小鼠 5 後，碘化GDF-8前胜肽及GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質之藥 力學。

10 15

20 第11A圖顯示人類GDF-8前胜肽-IgGl Fc融合蛋白質之 胺基酸序列。 第11B圖顯示經修改減低效應物功能之人類GDF-8前 胜肽-IgGl Fc融合蛋白質之胺基酸序列。 第12圖顯示於ActRIIB競爭ELISA，藉人GDF-8前胜肽 及二種人GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質抑制GDF-8結合的劑 量相依性抑制作用。 第13圖為線圖其顯示活體内投予經修飾之GDF-8前胜 肽可增加腓腸肌及四頭肌質量，減少脂肪質量，但比較未 經處理小鼠或使用對照蛋白質IgG2aFc處理小鼠，不影響腎 臟或肝臟質量。 第14A-P圖顯示對應序列ID編號1-16之胺基酸及核酸 序列及其附註。 【主要元件符號說明】 (無） 序列表 < 110> American Home Products Wolfman，Neil Μ. Khor, Soo Peang 62 200526779 <120>修飾化和穩定化之GDF前脞呔以及其之用途 <]30〉01997.002000 <140>尙未指定 <141〉2001-0 卜 30 <150> US 60/267,509 <151> 2001-02-08 <160> 16

<170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 375 <212> PRT <213>人類 <400> 1

Met Gin Lys Leu Gin Leu Cys Val Tyr lie Tyr Leu Phe Met Leu lie 1 5 10 15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gin Lys Glu Asn 20 25 30

Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gin Asn Thr 35 40 45

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Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 15 10 15

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Gly His Trp Gin Ser lie Asp Phe Lys Gin Val Leu His Ser Trp Phe 210 215 220

Arg Gin Pro Gin Ser Asn Trp Gly lie Glu lie Asn Ala Phe Asp Pro 225 230 235 240

Ser Gly Thr Asp Leu Ala Val Thr Ser Leu Gly Pro Gly Ala Glu Gly 245 250 255

Leu His Pro Phe Met Glu Leu Arg Val Leu Glu Asn Thr Lys Arg Ser 260 265 270

Arg Arg <210> 12 <211> 822 <212> DNA <213>人類 <400〉 12 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 gccgagggcc ccgcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcagcggc gggggtcggg ggggagcgct ccagccggcc agccccgtcc gtggcgcccg agccggacgg ctgccccgtg tgcgtttggc ggcagcacag ccgcgagctg cgcctagaga gcatcaagtc gcagatcttg agcaaactgc ggctcaagga ggcgcccaac atcagccgcg aggtggtgaa gcagctgctg cccaaggcgc cgccgctgca gcagatcctg gacctacacg acttccaggg cgacgcgctg cagcccgagg acttcctgga ggaggacgag taccacgcca ccaccgagac cgtcattagc atggcccagg agacggaccc agcagtacag acagatggca gccctctctg ctgccatttt cacttcagcc ccaaggtgat gttcacaaag gtactgaagg cccagctgtg ggtgtaccta cggcctgtac cccgcccagc cacagtctac ctgcagatct tgcgactaaa acccctaact ggggaaggga ccgcaggggg agggggcgga ggccggcgtc acatccgtat ccgctcactg aagattgagc tgcactcacg ctcaggccat tggcagagca tcgacttcaa gcaagtgcta cacagctggt tccgccagcc acagagcaac tggggcatcg agatcaacgc ctttgatccc agtggcacag acctggctgt cacctccctg gggccgggag ccgaggggct gcatccattc atggagcttc gagtcctaga gaacacaaaa cgttcccggc gg <2]0> 13 <211> 23 74 822 200526779 <2】2> PRT <213>人類 <400 13

Met Gin Lys Leu Gin Leu Cys Val Tyr lie Tyr Leu Phe Met Leu lie 15 10 15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu 20 <210> 14

<211> 24 <212> PRT <213>人類 <400> 14

Met Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15

Glu Leu Arg Pro Arg Gly Glu Ala 20 <210〉 15 <211〉 232 <212> PRT <213>人類 <400> 15

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 75 200526779

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110

Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 115 120 125

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160

Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 210 21$ 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 16 <2]1> 227 76 200526779 <212> PRT <213>人類 <400> 16

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly 15 10 15

Ala Pro Ser Va] Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He 100 105 110

Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser 130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu 145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 77 200526779

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220

Pro Gly Lys 225

78

Claims (1)

1. 200526779 十、申請專利範圍： 1. 一種包含BMP-Π前胜肽之經修飾之BMP-11前胜肽，其中該 經修飾之BMP-11前胜肽相對於對應未經修飾之BMP-11前 胜肽具有活體内及試管内半生期延長。 2. 如申請專利範圍第1項之經修飾之BMP-11前胜肽，其中該 BMP-11前胜肽包含胺基酸序列與序列ID編號：5至少75%相 同性。

   3. 如申請專利範圍第1項之經修飾之BMP-11前胜肽，其中該 BMP-11前胜肽係與序列ID編號：11完全相同。 4. 如申請專利範圍第1項之經修飾之BMP-11前胜肽，其中該 BMP-11前胜肽含有失活化之蛋白質分解割裂位置。 5. 如申請專利範圍第3項之經修飾之BMP-11前胜肽，其中該蛋 白質分解割裂位置係經由該位置之突變而被失活化。 6. 如申請專利範圍第1項之經修飾之BMP-11前胜肽，其中該經 修飾之BMP-11前胜肽進一步包含安定劑部份融合至該 BMP-11前胜肽。 7. 如申請專利範圍第6項之經修飾之BMP-11前胜肽，其中該安 定劑部份包含IgG分子Fc區。 8. 如申請專利範圍第7項之經修飾之BMP-11前胜肽，其中該 IgG分子為IgGl或IgG4或其衍生物。 9. 如申請專利範圍第7項之經修飾之BMP-11前胜肽，其中該 IgG分子為IgGl。 10. 如申請專利範圍第7項之經修飾之BMP-11前胜肽，其中該 IgG分子胺基酸與序列ID編號：15至少約75%相同。 79 200526779 11·如申請專利範圍第7項之經修飾之BMP-11前胜肽，其中該 IgG分子之胺基酸序列為序列ID編號：15。 12.如申請專利範圍第7項之經修飾之BMP-11前胜肽，其中該 IgG分子胺基酸與序列ID編號：16至少約75%相同。 13·如申請專利範圍第7項之經修飾之BMP-11前胜肽，其中該 IgG分子之胺基酸序列為序列ID編號：16。 14·如申請專利範圍第6項之經修飾之BMP-11前胜肽，其中該 BMP-11前胜肽係透過鍵聯基胜肽融合至IgG分子Fc區。 15.如申請專利範圍第1項之經修飾之BMP-U前胜肽，其中該經 修飾之BMP-11前胜肽具有經變更的糖化位置。 16·如申請專利範圍第1項之經修飾之BMp_u前胜肽，其中該妙 修飾之BMP-11前胜肽包含至少一個碳水化合物部份。 17·如申請專利範圍第6項之經修飾之BMP-U前胜肽，其中兮^ 定劑部份包含白蛋白或白蛋白衍生物。 18·如申請專利範圍第6項之經修飾之ΒΜρ_ιι前胜肽，其中$ a 定劑部份包含非蛋白質聚合物。 9·如申凊專利範圍第丨項之經修飾之BMP-Η前胜肽，其中汐鈐 修傅之腦⑽前胜肽額外包含_或多個點突變，其中=經 突變可抑制蛋白質分解割裂。 ^ 5亥點 20. 如申請專利範圍第1項之經修都之BMIM1前胜耿， 2修挪之歷·11前胜肽進1包含純化標籤。〃趣 21. ―種編瑪經修飾之BMP-U前胜肽之核酸，其中該經佟 ♦η前胜肽相對於對應未經修飾之娜丨1前=飾之 較長活體内或試管内半生期。 具有 80 200526779 22. 如申請專利範圍第21項之核酸，包含至少20個如序列ID編 號：8列舉之核苷酸。 23. 如申請專利範圍第21項之核酸，包含至少20個如序列ID編 號：12列舉之核苔酸。 24. 如申請專利範圍第21項之核酸，包含至少50個如序列ID編 號：8列舉之核苔酸。 25. 如申請專利範圍第21項之核酸，包含至少50個如序列ID編 號：12列舉之核苔酸。

   26. 如申請專利範圍第21項之核酸，其進一步包含一個編碼安 定劑蛋白質之核酸。 27. 如申請專利範圍第26項之核酸，其中該安定劑部份編碼IgG 蛋白質。 28. 如申請專利範圍第26項之核酸，其中該安定劑部份編碼白 蛋白或白蛋白衍生物。 29. 如申請專利範圍第21項之核酸，其中該核酸編碼帶有經變 更的糖化位置之經修飾之BMP-11前胜肽。 30. 如申請專利範圍第21項之核酸，其中該核酸編碼帶有經變 更的碳水化合物部份之經修飾之BMP-11前胜肽。 31. —種醫藥組合物，包含如申請專利範圍第2項之經修飾之 BMP-11前胜肽及醫藥可接受性賦形劑。 32. —種醫藥組合物，包含如申請專利範圍第21項之核酸及醫 藥可接受性載劑或載體。 33. —種製造經修飾之BMP-11前胜肽之方法，包含： (a)製備編碼BMP-11前胜肽之cDNA分子，其中該蛋白 81 200526779 質分解割裂位置經修I丰； ⑻製備編碼IgG分子以區之出财分子；以及 (C)融合得自步驟（a)及（b)之cDNA分子而製造經修飾之 BMP-11前胜肽。

   如申請專利範圍第33項之方法，其進一步包含製備編碼鍵 聯基胜肽之雙股寡核苔g复，以及融合得自纟驟⑷及⑻之 cDNA分子至編碼該鍵聯基胜肽之雙股寡核苔酸任一端。 如申請專利範圍第33項之方法，其中該鍵聯基胜肽包含 GSGS組成的胺基酸序列。 36· 一種重組細胞，其包含編碼經修飾之BMP-11前胜肽之核 酸。 37·如申4專利範圍第36項之重組細胞，其中該核酸包含編碼 安定劑部份之核酸序列。 38. —種使用轉錦之BMIM1前胜肽來製備一用以治療患有醫 事病症或疾病的藥品之用途，其中該經修飾之BMp-u前胜 肽比較對應未經修飾之BMP_U前胜肽具有較長活體内或試 管内半生期。 39·如申清專利範圍第38項之用途，其中該bmp-11前胜肽包含 一種與序列1D編號·· 11至少有75%相同性之胺基酸序列。 40·如申请專利範圍第38項之用途，其中該bmp-11前胜肽為序 歹|JID編號：11。 41. 如申請專利範圍第38項之用途，其中該bmp-U前胜肽於一 或多個蛋白質分解割裂位置含有突變。 42. 如申請專利範圍第38項之用途，其中該經修飾之BMP-11前 82 200526779 胜肽進一步包含IgG分子Fc區。 43. 如申請專利範圍第42項之用途，其中該IgG分子為IgGl或 IgG4或其衍生物。 44. 如申請專利範圍第42項之用途，其中該IgG分子為IgGl。 45. 如申請專利範圍第42項之用途，其中該IgG分子至少有75% 與序列ID編號：15相同。 46. 如申請專利範圍第42項之用途，其中該IgG分子Fc區係與序 歹UID編號：15完全相同。

   47. 如申請專利範圍第42項之用途，其中該IgG分子至少有75% 與序列ID編號：16相同。 48. 如申請專利範圍第42項之用途，其中該IgG分子Fc區係與序 歹》JID編號：16完全相同。 49. 如申請專利範圍第38項之用途，其中該經修飾之BMP-11前 胜肽具有改變的糖化位置。 50. 如申請專利範圍第38項之用途，其中該經修飾之BMP-11前 胜肽包含至少一個碳水化合物部份。 51. 如申請專利範圍第38項之用途，其中該經修飾之BMP-11前 胜肽進一步包含白蛋白或白蛋白衍生物。 52. 如申請專利範圍第38項之用途，其中該經修飾之BMP-11前 胜肽進一步包含非蛋白質聚合物。 53. 如申請專利範圍第38項之用途，其中該醫事病症為肌肉病 症、神經肌肉病症、代謝病症或骨退化病症。 54. 如申請專利範圍第38項之用途，其中該醫事病症為肌肉或 神經肌肉病症。 83 200526779 55. 如申請專利範圍第38項之用途，其中該醫事病症為代謝病 症。 56. 如申請專利範圍第38項之用途，其中該醫事病症為肌萎縮 性脊側索硬化、肌肉營養失調、肌肉萎縮、充血性阻塞性 肺疾、肌肉消耗性症候群、肌肉缺乏或惡病質。 57. 如申請專利範圍第38項之用途，其中該醫事病症為肌萎縮 性脊側索硬化或肌肉營養失調。

   58. 如申請專利範圍第38項之用途，其中該醫事病症為肥胖、 脂肪組織病症、非胰島素依賴型糖尿病或第二型糖尿病。 59. 如申請專利範圍第38項之用途，其中該醫事病症為鬆骨病。

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