TWI329129B - Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof - Google Patents
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五、發明説明(i ) 相關申請案 本案請求臨時中請案第術267,5_1請日 月8曰之權益’該案完整揭示以引用方式併入此處。 發明範疇 本發明係有關生長差異因子_8(GDF-8)蛋白質抑制劑 及其用法n本發明提供可㈣gdf_8之經修飾及經 穩定化的咖_8前⑽。本細㈣可㈣肋或治療肌 肉組織增加具有治療助益之人類或動物病症。此等病症包 括肌肉或相肌肉病症(例如肌萎縮性脊侧索硬化、肌肉營 養失調、肌肉萎縮、充血性阻塞性肺疾、肌肉消耗性症候 群、肌肉缺乏、惡病質)、代謝疾病或病症(例如第二型糖 K病非騰島素依賴型糖尿病、高血糖或肥胖)、脂肪組織 病症(例如肥胖)、以及骨退化病(如鬆骨病)。 發明背景 生長及差異因子-8(GDF-8)也稱做肌抑制素,屬於多種 結構相關生長因子之轉形生長因子,挪⑷超族,其全 部皆具有重要的生長調節及形態發生性質(反比以丨町等人 (1994)基因發展8 : 133·46 ; H〇〇d丨ess等人(1998)微生物免 疫學目前話題228 : 253-72)。GDF-8為骨骼肌質塊之負面調 節劑,對於識別可調節其生物活性之因子相當有興趣。例 如,GDF-8於發育中的以及成年骨骼肌高度表現。於轉移 基因小鼠GDF-8之無效突變其特徵為骨骼肌明顯肥大與增 生(McPhemm等人(1997)自然387: 83_9〇)。骨骼肌質塊類 似的增加於牛天然發生GDF-8突變時也明顯(Ashm〇re等人 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS〉A4規格(210X297公釐) 4 1329129 A7 ___B7_ 五、發明説明(2 ) (1974)生長 38 : 501-507 ; Swatland及 Kieffer(1994)動物科 學期刊38 : 752-757 ; McPherron及Lee( 1997)美國國家科學 院議事錄94 : 12457-12461 ;及Kambadur等人(1997)基因組 研究7 : 910-915)。晚近研究顯示於人類HIV-感染造成的肌 肉消耗伴隨有GDF-8蛋白質表現增加(Gonzalez-Cadavid等 人(1998)PNAS 95 : 14938-43)。此外,GDF-8可調節肌肉特 異性酶(例如肌胺酸激酶)的製造,以及調節肌母細胞的增 生(WO 00/43781)。 GDF-8除了骨骼肌的生長調節及形態發生性質外, GDF-8也涉及多種其它生理過程(例如葡萄糖體内平衡)以 及異常病情,例如出現第二型糖尿病及脂肪組織病症如肥 胖。例如,GDF-8調節前脂肪細胞分化成為脂肪細胞(Kim 等人(2001) B.B.R.C. 281 : 902-906)。 類似TGF-召-1、-2、及-3,GDF-8蛋白質合成為前驅 蛋白質,前驅蛋白質由胺基端前胜肽以及羧基端成熟領域 (McPherron及Lee,1997,參見上文)以及信號序列組成, 該信號序列導引蛋白質至胞外領域也由蛋白質割裂取出。 相信於前胜肽割裂前,前驅物GDF-8蛋白質形成同質二元 體。然後胺基端前胜肽由成熟領域割裂,割裂後的前胜肽 可維持非共價鍵結至成熟領域二元體,將其生物活性失活 化(Miyazono等人(1988)生物化學期刊 263 : 6407-6415 ; Wakefield等人(1988)生物化學期刊263 : 7646-7654 ;以及 Brown等人(1990)生長因子3 : 35-43)。相信二個GDF-8前胜 肽結合至GDF-8成熟二元體(Thies等人(2001)生長因子 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐〉 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
1329129 A7 ______Β7 五、發明説明(3 ) 18 . 251-259)。由於此種失活化性質,前胜肽被稱作為「潛 在組合胜肽」(LAP),成熟領域與前胜肽之複合物俗稱為 「小潛在複合物」(Gentry及Nash( 1990)生物化學29 : 6851-6857 ; Derynck 等人(1995)自然 316 : 701-705 ;以及
Massague( 1990)細胞生物學年度综論丨2 : 597_64丨)。相信當 前胜肽被去除時,成熟領域具有做為同質二元體之活性。 也已知其它蛋白質結合至GDF_8或結構相關蛋白質且抑制 其生物活性。此種抑制作用蛋白質包括濾泡抑制素(Gama 等人(1999)生物學發展2G8 : 222.232)及渡泡抑制素相關蛋 白質。 進步夕種人類及動物病症係與肌肉組織的耗損或 功能損傷有關,此等病症包括肌肉營養不良、肌肉萎縮、 充血性阻塞性肺疾、肌肉消耗性症候群、肌肉缺乏及惡病 質。至今為止,對此等病症極少存在有可靠而有效的治療 方法。此等病症引起的可怕的症狀可藉由採用增加患有此 種病症病人之肌肉組織量之治療而實質減少其可怕的症 狀此等冶療將顯著改善病人生活品質以及緩和疾病的多 方面影響。如此,業界需要找出可於患有此等病症病人促 成肌肉組織整體增加之新賴治療。 本發明經由提供可保有其生物活性以及抑制GDF蛋白 貝活〖生之經修飾且經穩定化的GDF前胜肽而滿足此項需 求。本發明之經修飾的前胜肽可用於治療肌肉組織增加具 有冶療效盈之人類或動物病症。 發明概要 本紙張尺度適用中國國家標準(⑽A4規格⑵0X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .餐- -6 - 1329129 A7 —«一 _____ B7 五、發明説明(4 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) GDF-8涉及多種關鍵性生物過程的調節。由於gDf_8 於此等生物過程具有關鍵功能,故(31)17_8為治療方法之預 定目標。雖然由功效及毒性觀點視之,天然GDF_8前胜肽 為GDF修飾的有吸引力的手段,但發明人發現天然前胜版 之循環半生.期過短而分子無法去除實際治療或預防用途。 如此,本發明至少部份係基於發現生長差異因子_8(gdf_8) 前胜肽抑制GDF-8蛋白質活性,以及其它結構與〇〇1?_8相 關的轉形生長因子-石(TGF-/S)蛋白質,例如骨形態發生蛋 白質-11(BMP-11 ;也稱做GDF_U)也受()〇1:_8前胜肽抑制。 如此本發明提供抑制GDF蛋白質之組合物及方法,以及鑑 別、製造及使用此種抑制劑之方法。 如前述,本發明至少部份係基於發現天sGDF_8前胜 肽之活體内半生期相當短,因而不具有實際治療或預防用 途。如此,本發明提供具有改良藥力學性質如循環半生期 延長或保濩不受蛋白質分解增加的經修飾之Gdf-8前胜肽 及經修飾之BMP-11前胜肽。 此處揭示之GDF-8前胜肽或BMP-11前胜肽可藉業界 已知之任一種手段穩定化。例如一具體實施例中,經修飾 的則胜肽為融合蛋白質包含GDF-8前胜肷及igG分子fc 區。GDF-8前胜肽融合蛋白質包含GDF-8蛋白質前胜肽, 或GDF-8前胜肽活性部份融合至IgG分子Fc區做為活性亞 單位。其它具體實施例中或此外,GDF-8前胜肽可經糖基 化或鍵聯至白蛋白或非蛋白質聚合物。 其它具體實施例中,經修飾之前胜肽為融合蛋白質豆 本紙張尺度適用中國國家標準(〇fS) A4規格(210X297公楚) 1329129 A7 B7 五、發明説明(5 ) 包含BMP-11前胜肽及IgG分子Fc區。BMP-11前胜肽融合蛋 白質包含BMP-11蛋白質前胜肽,或BMP-11前胜肽活性部 份融合至IgG分子Fc區做為活性亞單位。其它具體實施例 中或此外,BMP-11前胜肽可經糖基化或鍵聯至白蛋白或非 蛋白質聚合.物。 本發明之經修飾之GDF-8前胜肽或經修飾之BMP-11 前胜肽可抑制GDF-8蛋白質、成熟GDF-8、或GDF-8同質二 元體或其它活性GDF-8分子之活性、表現、處理或分泌。 本發明之經修飾之GDF-8前胜肽或經修飾之BMP-11前胜 版可以治療有效劑量投予病人治療增加肌肉組織具有治療 效益的病情。可藉經修飾之GDF-8前胜肽或經修飾之 BMP-11前胜肽治療之疾病及病症包括但非限於肌肉或神 經肌肉病症(例如肌萎縮性脊側索硬化、肌肉營養失調、肌 肉萎縮、充血性阻塞性肺疾、肌肉消耗性症候群、肌肉缺 乏、惡病質)、代謝疾病或病症(例如第二型糖尿病、非胰 島素依賴型糖尿病、高血糖或肥胖)、脂肪組織病症(例如 肥胖)、以及骨退化病(如鬆骨病)。 圖式之簡單說明 第1圖顯示GDF-8、BMP-11及活化素於通報子基因檢 定分析之相對生物活性。 第2圖顯示經純化後之生物素化人GDF-8於ActRIIB結 合檢定分析之結合性質。 第3圖顯示於GDF-8、BMP-11 '及活化素之ED50,於 GDF-8前胜肽存在下,pGL3(CAGA)12通報子活性之誘生。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
1329129 A7 B7 五、發明説明(6 ) 第4圖顯示藉GDF-8前胜肽抑制生物素化GDF-8結合 至ActRIIB之劑量相依性抑制作用。 第5圖顯示GDF-8結合至L6細胞。 第6圖顯示藉GDF-8前胜肽抑制GDF-8特異性結合至 L6細胞之劑.量相依性抑制作用。 第7A圖顯示屬GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質之胺基酸 序列。 第7B圖顯示屬GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質,其帶有短 甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸-絲胺酸(GSGS)鍵聯基分開GDF-8 前胜肽與Fc區。 第8A圖顯示於ActRIIB競爭ELISA,人類GDF-8前胜肽 及二種屬GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質對GDF-8結合的影 響。 第8B圖為表格其比較人類GDF-8前胜肽與二種屬 GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質之IC50。 第9圖顯示於通報子基因檢定分析,人GDF-8前胜肽與 屬GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質之相對生物活性。 第10圖顯示單次靜脈投予0.2微克/小鼠或2微克/小鼠 後,碘化GDF-8前胜肽及GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質之藥 力學。 第11A圖顯示人類GDF-8前胜肽-IgGl Fc融合蛋白質 之胺基酸序列。 第11B圖顯示經修改減低效應物功能之人類GDF-8前 胜肽-IgGl Fc融合蛋白質之胺基酸序列。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 9 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
1329129 系 系 已 可 後 述 A7 B7 五、發明説明( 第12圖顯示於ActRIIB競爭ELISA,藉人GDF-8前胜肽 及二種人GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質抑制GDF_8結合的劑 量相依性抑制作用。 弟13圖為線圖其顯示活體内投予經修飾之GDF 8前胜 肽可增加腓腸肌及四頭肌質量,減少脂肪質量,但比較未 經處理小鼠或使用對照蛋白質IgG2aFc處理小鼠,不影響腎 臟或肝臟質量。 第14A-P圖顯示對應序列ID編號1-16之胺基酸及核酸 序列及其附註。 定義 GDF-8」、「GDF-8蛋白質」、或「GDF_8多肽」等詞 表不特定生長及分化gj子,包括但非限於序_編號⑺ 舉之因子,及其任何今日已知或後來說明之同系物,包括 其匕種類同系物。特佳為哺乳動物同系物,最佳為人同 物。本發明也涵蓋得自全部其它來源之咖妨子及同 物,包括但非限於得自牛、犬、,、雞、鼠、大鼠、豬、 馬、火雞、狒狒、及备夕。办 及…之GDF-8。多種GDF_8分子敘述於
McPherron 等人门 qq7、$ m )吳國國家科學院議事錄94 : 61同系物為業界眾所周知。同源性可藉業界 ^或此處所述任_種料決定。咖韻卿 成蛋白質。此等術語包括蛋白質全長未經處理 割裂所得成孰形式以及由前胜肽之轉譯 卿-8蛋白質組合之一 ^術语也表示可維持此處所 或夕種生物活性之GDF-8之任何片 本紙張尺度翻中関雜 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
10 丄 五、發明説明(8 ) 段或變異株,包括帶右 飾之序列。 土 "序列之保守或非保守變化修 成AGDF-8」表示由咖_8前艇蛋白質缓端領域割 裂之蛋白質或多肽。成熟GDF_8蛋白質之人類形式示於序 脚編彭。成熟GDF_8可為天然或合成。成熟GDF_8可呈 早體、同質二元體存在,或可呈GDF-8潛在複合體存在。 依據活體内或試管内條件而定,成熟gdf_8可於此等不同 形式之任一種或全部中建立平衡。不欲受機轉所限,相信 成熟GDF-8具有做為同質二元體之生物活性。於其生物活 性形式,成熟GDF-8也稱做為「活性(3DF_8」。 GDF-8活性」一詞表示一或多種組合活性0DF-8蛋 白質之生理生長調節活性或形態發生活性。舉例言之活 性GDF-8為骨路肌質量之負面調節劑。活性gdf_8也調節 肌肉特異性酶(例如肌胺酸激酶)的製造,刺激肌母細胞增 生’及调節前脂肪細胞分化成為脂肪細胞。相信GDF_8也 於周邊組織,特別骨絡肌或脂肪細胞提高對騰島素或葡萄 糖吸收的敏感度。如此’ GDF-8生物活性包括但非限於抑 制肌肉的生成’抑制肌細包生長,抑制肌肉發育,減少肌 肉質量,調節肌肉特異性酶,抑制肌母細胞增生,調節前 脂肪細胞分化成為脂肪細胞,增加對胰島素的敏感度,調 節葡萄糖的吸收,葡萄糖的體内平衡以及調節神經元細胞 的發育與維持。全長GDF-8前驅蛋白質人形式示於序列ID 編號1。 「GDF-8前胜肽」表示由GDF-8前驅蛋白質之胺基端 11 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1329129 A7 B7 五、發明説明(9 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 領域割裂的多肽。GDF-8前胜肽具有一或多種生物活性, 包括但非限於結合成熟GDF-8蛋白質或同質二元體能力, 抑制一或多種GDF-8生物活性能力,促進肌肉發育能力, 增加肌肉質量能力,促進肌肉生成能力,以及促進肌肉細 胞增生能力.。GDF-8前胜肽可為天然或合成。GDF-8前胜 肽之一例包括但非限於序列ID編號5提供之GDF-8前胜肽 人形式。一具體實施例中,GDF-8前胜肽可結合成熟GDF-8 前胜肽結合領域。另一具體實施例中,GDF-8前胜肽可抑 制一或多種成熟GDF-8活性。 「GDF-8抑制劑」一詞包括任一種可抑制GDF-8蛋白 質、成熟GDF-8或GDF-8同質二元體或其它GDF-8分子其包 括但非限於經修飾之GDF-8前胜肽及經修飾之BMP-11前 胜版的活性、表現、處理或分泌之作用劑。GDF-8抑制劑 也包括任一種可增進GDF-8前胜肽結合至成熟GDF-8分子 或結合至GDF-8同質二元體之作用劑。此種GDF-8抑制劑 包括但非限於蛋白質、抗體、胜肽、擬胜肽、核糖酶、反 訊息寡核苷酸、雙股RNA及其它小分子。一具體實施例 中,GDF-8蛋白質活性係經由實例3-6所述經修飾之GDF-8 前胜肽抑制。另一具體實施例中,GDF-8蛋白質活性係由 經修飾之BMP-11前胜肽抑制。 「GDF-8潛在複合物」表示成熟GDF-8同質二元體與 GDF-8前胜肽間形成的蛋白質複合物。不欲受特定機轉所 限,相信二種GDF-8前胜肽組合同質二元體之二成熟 GDF-8分子而形成失活性之四元體或潛在複合物。潛在複 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 12 1329129 A7 B7 五、發明說明(10 ) 合物包括其它GDF抑制劑替代或增加至一或多種gdF-8前 胜肽。 「經修飾之GDF-8前胜肽」一詞表示GDF_8抑制劑, 其包含保有一或多種GDF-8前胜肽生物活性之經修飾的 GDF-8前胜版、其片段或變異株,以及進一步包含如此處 所述穩定化修飾。GDF-8前胜肽之變異形式包括,但非限 於,例如已經經過修飾而於信號胜肽或前胜肽蛋白質分解 割裂位置包括突變(包含插入、刪除及取代胺基酸)讓該位 置對蛋白質分解割裂作用較為不敏感的GDF 8前胜肽。較 佳具體實施例中,經修飾之〇〇1?_8前胜肽比較對應未經修 飾之GDF-8前胜肽具有實質較長半生期。高度較佳具體實 施例中,本發明之經修飾之〇〇1?_8前胜肽於活體内之半生 期乙長(例如藉貫例8所述方法測量)。另一具體實施例中, 經修飾之GDF_8前胜肽可抑制_或多種成熟GDF_8活性。 ΒΜΡ-11」、「ΒΜίΜα白質」、或「ΒΜριι多版」 等。司表不特定生長及分化因+,包括但非限於序列出編號 7列舉之因子,及其任何今日已知或後來說明之同系物/ 括其匕種類同系物。特佳為哺乳動物同系物,最佳為人。 系物。本發明也涵蓋得自全部其它來源之BMP "分子及同 系物’包括但非限於得自牛、犬、描、雞、鼠、大鼠、猪°、 馬 '火雞 '狒狒、及魚2BMp_n。多種BMp u分子敛述 於McPherron等人(1997)美國國家科學院議事錄I 12461同系物為業界眾所周知。同源性可藉業界 知或此處所述任一種方法決定。BMP-11或BMP-U蛋白 包 同 已 質 中國國家標準^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1329129 A7 __B7__ 五、發明說明(u ) — 可為天然或合成蛋白質。此等術語包括蛋白質全長未經處 理前驅形式(「BMP-n前驅蛋白質」),以及由前胜版之轉 1。]裂所得成熟形式。該等術語也表示可維持此處所述 蛋白貝組合之一或多種生物活性之11之任何 片奴或麦異株,包括帶有胺基酸序列之保守或非保守變化 修飾之序列。 「成熟BMP-11」表示由BMp_u前驅蛋白質羧端領域 uj裂之蛋白質或多肽。成熟BMP-i 1蛋白質之人類形式示於 序列ID編號9。成熟BMP·11可為天然或合成。成熟BMP-11 可呈單體、同質二元體存在,或可呈Bmp_ 11潛在複合體存 在。依據活體内或試管内條件而定,成熟BMP·〗丨可於此等 不同形式之任一種或全部中建立平衡。不欲受機轉所限, 相k成熟BMP-11具有做為同質二元體之生物活性。於其生 物活性形式,成熟BMP-11也稱做為「活性BMp_n」。 BMP-11前胜肽」表示由bmp_ii前驅蛋白質之胺基 端領域割裂的多肽。BMP-11前胜肽具有一或多種生物活 性,包括但非限於結合成熟(}£)1?_8蛋白質或同質二元體能 力’抑制一或多種GDF-8生物活性能力,促進肌肉發育能 力’增加肌肉質量能力,促進肌肉生成能力’以及促進肌 肉細胞增生能力。ΒΜΡ-Π前胜肽可為天然或合成。BMP-11 前胜肽之一例包括但非限於序列ID編號丨丨提供之BMP-11 前胜肽人形式。一具體實施例中,Bmp-1 1前胜肽可結合成 熟GDF-8刖胜狀結合領域。另一具體實施例中’ BMP-11前 胜肽可抑制一或多種成熟GDF-8活性。 14 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公楚) 1329129 A7 B7 五、發明説明(12 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 「經修飾之BMP-11前胜肽」一詞表示GDF-8抑制劑, 其包含保有一或多種BMP-11前胜肽生物活性之經修飾的 BMP-11前胜肽、其片段或變異株,以及進一步包含如此處 所述穩定化修飾。BMP-11前胜肽之變異形式包括,但非限 於,例如已經經過修飾而於信號胜肽或前胜肽蛋白質分解 割裂位置包括突變(包含插入、刪除及取代胺基酸)讓該位 置或多或少對蛋白質分解割裂敏感。較佳具體實施例中, BMP-11前胜肽抑制劑經修飾而比較對應未經修飾之 BMP-11前胜肽,提供較長活體内半生期(於實例8具體實施 例測量)。另一具體實施例中,經修飾之BMP-11前胜肽可 抑制一或多種成熟GDF-8活性。 本發明之GDF-8前胜肽及本發明之BMP-11前胜肽合 稱為「DGF前胜肽」。 本發明之GDF-8蛋白質及本發明之BMP-11蛋白質合 稱為「GDF多肽」或「GDF蛋白質」。 本發明方法及組合物提供GDF抑制劑,其比較未由抑 制劑結合之相同GDF蛋白質,可降低GDF蛋白質活性相對 GDF蛋白質活性。某些具體實施例中,GDF蛋白質當由一 或多種經修飾之GDF前胜肽結合時,其活性比較相同GDF 蛋白質但未被經修飾之前胜肽結合之活性,降低至少約1 〇 %、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50% 或 55%,較好至少為 60%、62%、64%、66%、68%、70 %、72%、74%、76%、78%、80%、82%、84%、86% 或88%,更好至少為90%、91%、92%、93%或94%,及 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 15 1329129 A7 B7 五、發明説明(13 又更好至v於約95%至100% „較佳具體實施例中, 抑制劑為共價鍵聯至IgG分子Fc區的經修飾之咖_8前胜 肽或經修飾之BMP-11前胜肽。 I·疋化修佛」一 為業界已知或此處列舉可穩定化 蛋白質,提升蛋白質之試管内半生期,延長蛋白質之猶環 半生期及/或減少蛋白質之蛋白質分解的任—種修飾。此種 穩定化修飾包括但非限於融合蛋白質(包含例如含gdf前 胜肽及第二蛋白質之融合蛋白質)、修飾糖化位置(例如包 括添加糖化位置之GDF前胜肽)、及修飾碳水化合物部份 (包括例如由GDF前胜肽去除碳水化合物部份)。以包含融 合蛋白質之穩定化修飾為例(例如此種第二蛋白質融合至 GDF前胜肽)’第二蛋白質可稱做為「安定劑部份」或「安 定劑蛋白質」。例如,一具體實施例中,本發明之經修飾之 GDF-8前胜肽包含人GDF-8前胜肽(帶有失活化割裂位置) 及IgG分子(該IgG係做為安定劑蛋白質或安定劑部份)間的 融合。用於此處,「安定劑部份」除了表示蛋白質的第二蛋 白質之外,也包括非蛋白質修飾例如碳水化合物部份或非 蛋白質聚合物。 「分離」或「純化」等詞表示實質不含天然環境的分 子。例如,經分離蛋白質實質不含其衍生來源的細胞物質 或其它來自細胞或組織來源的污染蛋白質。「實質不含細胞 物質」一詞表示分離的蛋白質至少為70%至80% (w/w)純 質,更好至少80-89%(w/w)純質’又更好90-95%純質,及 最好至少96%、97%、98%、99%或l〇〇%(w/w)純質之製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公楚) 16 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂. 1329129
五、發明説明(14 ) 割裂位置」一詞表示蛋白質<多 貝次夕肽又蛋白質分解酶 作用九果導致肽鍵結割裂的蛋白質分解位置一罝體, 例中’本發明之割裂位置為以單字母胺基酸代碼表:: 「RSRR | 〇
IgG分子Fc區」_詞如業界人士眾所周知表示免 疫球蛋白同型IgG之Fe領域。igG分子以區為負責延長砂 分子活體内血清半生期的IgG分子(IgG1,贼,卿及 IgG4)部份。較佳,IgG分子為IgG1。 「試官内半生期」表示於活有機體外側測量蛋白質穩 定性。測量試管内半生期之檢定分析為業界眾所周知,包 括但非限於SDS-PAGE、EusA、基於細胞之檢定分析、脈 衝追蹤、西方墨點、北方墨點等。此等及其它有用的檢定 分析為業界眾所周知。 活體内半生期」表示蛋白質於有機體的穩定性。活 體内半生期可藉業界已知多種方法測量,包括但非限於活 體内血清半生期、循環半生期、以及本文實例列舉的檢定 分析測量。 活體内血清半生期」表示蛋白質於有機體血液循環 半生期。一具體實施例中,活體内半生期係如實例8測量。 其它業界已知方法可用於測量活體内半生期。 甫乳類」6司表括業界已知定義’也表示任一種屬 於哺乳類的動物包括人類、家畜及農場動物 '以及動物園 動物、運動動物、或寵物如犬、貓、羊、豬、牛等。較佳 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格⑵QX297公楚) 17 1329129 A7 ________B7_ 五、發明説明(15 ) 具體實施例中,哺乳類為人類。 「TGF-冷超質」一詞表示一族結構相關生長因子,其 皆具有生理重要的生長調節及形態發生性質。此族相關生 長因子為業界眾所周知(Kingsley等人(1994)基因發展8 : 133-46 ;以及Hoodless等人(1998)微生物免疫學流行話題 228 : 235-72) ° TGF- /3超質包括骨形態發生蛋白質 (BMPs)、活化素、抑制素、摩拉里(Muiierian)抑制物質、 神經焦衍生神經作用因子,以及其它數目仍在增加當中的 生長及分化因子(GDFs),例如GDF-8(肌抑制素)。多種此 寺蛋白質之結構與GDF-8有關’如BMP-11(也稱做 GDF-11) ’及/或活性與GDF-8有關,例如活化素。 「處理」一詞表示治療性處理或預防性或預防處置。 需要處理者包括已經有特定醫事病症個體以及最終可能患 有該病症個體(亦即需要預防措施的個體)。 「轉形」及「轉移感染」等詞表示多種業界已知技術, 該技術用於將液體核酸(例如DNA及RNA)引進宿主細胞, 包括但非限於填酸|弓或氣化辑共同沉澱、DEAE-葡萄聚糖_ 媒介轉移感染、脂肪感染及電泳。 本紙張尺度適用中國國家標卓(CNS > A4規格(210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
18 1329129 A7 B7 五、發明説明(16 ) ID編號 名稱 類別 1 人GDF-8前驅蛋白質 蛋白質 2 人GDF-8前驅蛋白質 DNA 3 人GDF-8成熟 蛋白質 4 人GDF-8成熟 DNA 5 人GDF-8前胜版 蛋白質 6 人GDF-8前胜版 DNA 7 人BMP-11前驅蛋白質 蛋白質 8 人BMP-11前驅蛋白質 DNA 9 人BMP-11成熟 蛋白質 10 人BMP-11成熟 DNA 11 人BMP-11前胜肽 蛋白質 12 人BMP-11前胜肽 DNA 13 GDF-8信號序列 蛋白質 14 BMP-11信號序列 蛋白質 15 IgG-Fc 蛋白質 16 IgG-Fc經修飾 蛋白質 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 發明之詳細說明 本發明至少部份係基於發現GDF前胜肽之活體内半生 期短,因而降低其做為GDF-8或BMP-11活性之藥理抑制劑 的效果。如此,於一特徵方面,本發明包含經修飾且經穩 定化的GDF-8或BMP-11前胜肽其具有改良藥力學性質,特 別循環半生期延長。 本發明提供新穎經修飾之DGF前胜肽其於試管試驗以 及活體試驗與GDF蛋白質(例如GDF-8及BMP-11蛋白質)形 19 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1329129 A7 B7 五、發明説明(17 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 成失活性複合物。本發明之經修飾GDF前胜肽較好結合至 成熟GDF蛋白質之前胜肽結合領域。如此,本發明之若干 具體實施例中,經修飾之GDF前胜肽包含GDF前胜肽與安 定劑蛋白質間之融合蛋白質。安定劑蛋白質可為任一種可 提升經修飾.之GDF前胜肽之整體安定性之任一種蛋白質。 如熟諳技藝人士已知,此種融合蛋白質可視需要地包含聯 結基胜肽介於前胜肽部份與穩定化部份間。如業界人士眾 所周知,融合蛋白質係製備成第二蛋白質於框構内融合第 一蛋白質,讓所得轉譯後之蛋白質包含第一及第二蛋白 質。例如,本發明中,融合蛋白質係製備成GDF前胜肽部 份融合至第二蛋白質(例如安定劑蛋白質部份)。此種融合 蛋白質經製備,讓結果所得轉譯後蛋白質含有前胜肽部份 及安定劑部份。 其它具體實施例中、GDF前胜狀包含經修飾而比較未 經修飾GDF前胜肽具有較長活體内循環半生期的GDF前胜 肽。雖然經修飾之GDF前胜肽的結合精確機轉及時序為未 知,但相信本發明之經修飾之GDF-8前胜狀及經修飾之 BMP-11前胜肽可結合至成熟GDF-8及BMP-11。一較佳具體 實施例中,本發明提供經修飾之GDF前胜肽,其於活體内 或於試管内與GDF-8或BMP-11蛋白質形成失活化複合 物。一具體實施例中,GDF前胜肽較好結合至成熟GDF-8 或成熟BMP-11蛋白質的前胜肽結合領域。此種結合可能出 現於GDF-8及BMP-11活性位置釋放出天然前胜肽之後,藉 經修飾之GDF-8及經修飾之BMP-11前胜肽置換天然前胜 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 20 1329129 A7 B7 五、發明説明(18 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 肽之後,及/或由GDF-8及BMP-11前驅蛋白質割裂前胜肽之 後。無論採用何種機轉,經修飾之GDF-8前胜肽及經修飾 之BMP-11前胜肽結合結果導致一或多種GDF-8相關生物 活性比較未被相同經修飾之前胜肽結合成熟GDF-8蛋白質 減低。較佳具體實施例中,經修飾之GDF-8及BMP-11前胜 肽降低GDF-8及BMP-11之與骨骼肌質量負面調節相關活 性。 另一較佳具體實施例中,本發明提供經修飾之GDF前 胜肽,其於活體内或試管内與BMP-11蛋白質形成失活化複 合物。一具體實施例中,GDF前胜肽較佳結合至成熟 BMP-11蛋白質的前胜肽結合領域。又另一具體實施例中, 經修飾之GDF前胜狀為包含GDF前胜版及IgG分子Fc區之 融合蛋白質(做為穩定性蛋白質)。此種GDF抑制劑包含 GDF前胜肽(如序列ID編號:5或11所示),或該前胜肽之保 有一或多種GDF前胜肽生物活性之片段或變異株。此種經 修飾之GDF前胜肽可抑制GDF蛋白質活性。本發明使用之 GDF-8或BMP-11前胜肽可以合成方式製造,可由天然出現 (天然)GDF-8或BMP-11前胜肽衍生,或可以以重組方式製 造,使用多種基因工程業界人士眾所周知的反應劑、宿主 細胞及方法以重組方式製造。一具體實施例中,經修飾之 GDF-8前胜肽或經修飾之BMP-11前胜肽包含人GDF-8或 BMP-11前胜肽共價鍵聯至IgG分子或其片段。GDF-8或 BMP-11前胜肽可毗鄰IgG分子Fc區融合,或透過聯結基胜 肽附接至IgG分子Fc區。此種聯結基胜肽之使用為蛋白質 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 21 1329129 A7 ____B7 五、發明説明(19 ) 生化業界眾所周知。
某些具體實施例中,本發明之經修飾之GDF前胜肽包 含融合蛋白質’該融合蛋白質之GDF前胜肽部份較好與序 列ID編號:5或11有至少75-80%相同性,更好與序列id編 號:5或11至少於81 %至約85 %相同性,又更好與序列ID 編號:5 或 11至少約 86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、93%或94%相同性,又更好與序列ID編號:5 或 11有至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 1〇〇% 相同 性。較佳具體貫施例中,GDF-8或BMP-11前胜肽包含與序 列ID編號:5或11列舉的序列相同序列。又另一較佳具體 實施例中,本發明之融合蛋白質之GDF前胜肽部份包含序 列ID編號:5或11列舉之GDF前胜肽之片段或變異株,只要 該片段或變異株保有一或多種GDF前胜肽之生物活性即 可。另一較佳具體實施例中,經修飾之GDF_8或BMH j前 胜肽包含序列ID編號:5或11之突變版本,其中突變株經 修飾而包括一或多種突變(包括插入、刪失或取代),只要 該片段或變異株保有一或多種(3£>17前胜肽之生物活性即 0 於關鍵上’本發明之涉及包含融合蛋白質經修飾之 GDF前胜肽之具體實施例中,要緊地,融合蛋白質可經製 造或設計讓GDF前胜肽之蛋白質分解割裂位置(例如rsr^ 被摧鍍 '破壞、失活化、或於所得融合蛋白質中去除。如 熟諳技藝人士已知’未能達成此項目的將導致融合蛋白質 之第二蛋白質(例如安定劑部份)由融合蛋白質之第一蛋白 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
22 1329129 A7 _________B7 五、發明説明(2〇 ) 質(前胜肽部份)割裂。如此,本發明之關鍵部份提供當使 用GDF前胜肽來製備本發明之經修飾之(31)1?前胜肽的融合 蛋白質時,失活化或去除GDF前胜肽之天然割裂位置。失 活化此種蛋白質割裂位置之方法為業界已知包括但非限 於突變、刪.失或插入蛋白質分解割裂位置之胺基酸或核苷 酸序列。 本發明之又另一特徵方面,可於(}]:^序列進行突變來 讓蛋白質分解割裂位置對蛋白質分解割裂較不敏感。例 如,於一具體實施例中,此等突變株包括於序列m編號: 1 胺基酸45、46、49、50、52、53、63、64、65、66、98 或99之點突變,或於序列ID編號:7胺基酸122、123、286 或287之點突變。另一具體實施例中,可與序列m編號: 11之胺基酸做點突變。較佳具體實施例中,點突變為序列 ID編號:1胺基酸99的點突變。特佳具體實施例中,點突 ’憂為序列ID編號· 1胺基酸99由Asp變成Ala之點突變。另 一較佳具體實施例中,可於序列ID編號:u之胺基酸做出 此種點突變。電腦分析(使用市售軟體例如MacVect〇r、 Omega、PCGene,分子模擬公司)用來鑑別蛋白質分解割裂 位置。如熟諳技藝人士已知,另外可於核酸層面做出所述 任一種突變、變異或修飾。此種技術為業界眾所周知。 本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS) A4規格(210 X 297公楚) 23 1329129 A7 B7 五、發明説明(21 ) 表2可突變而防止前胜肽割裂的範例胺基酸: GDF-8 (胺基酸編號參照序列ID編號:1)
Arg-45
Gln-46
Lys-49
Ser-50
Arg-52
Ile-53
Lys-63
Leu-64
Arg-65
Leu-66
Arg-98
Asp-99 BMP-11 (胺基酸編號參照序列ID編號:7)
Asp-122 Ala-123 Glu-286 Leu-287 如前述,發明人發現GDF前胜肽之活體内半生期短。 如此,為了做為醫藥有用的治療或預防劑,GDF前胜肽需 以化學方式或物理方式穩定化俾延長於生理條件下的壽 命。 GDF前胜肽可藉業界已知之任一種手段穩定化或修飾 化,只要修飾後的GDF前胜肽仍維持抑制GDF蛋白質或成 熟GDF蛋白質之能力可。較佳具體實施例中,經修飾之 GDF前胜肽維持其結合至目標GDF蛋白質或GDF前胜肽結 合位置的能力。較佳具體實施例中,經修飾之GDF前胜肽 包含毗鄰或透過聯結基融合至IgG分子Fc區之GDF-8前胜 24 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1329129 A7 B7 _ 五、發明説明(22 ) 肽或BMP-11前胜肽。lgG分子Fc區對前胜肽提供保護或穩 定效果(因而做為穩定化修飾),反映在比較對應未經修飾 GDF-8前胜肽或未經修飾BMP-11前胜狀,融合蛋白質之藥 力學性質改良(亦即血清半生期延長)。 特定具體實施例中,經修飾之GDF-8前胜肽包含人 GDF-8前胜肽或人GDF-8前胜肽突變株,IgG分子為IgGl或 IgG4之Fc區、或經修飾而減少效應物功能之igG丨Fc區。一 具體實施例中,IgG片段為IgGl(序列ID編號:15)。另一具 體實施例中’ IgG片段為經修飾而減少效應物功能之 IgG 1 (序列ID編號:16)。修飾用於減少效應物功能之分子 例如包括修飾人IgG 1 -Fc融合蛋白質而包括於序列id編 號:16列舉的位置14及17之胺基酸丙胺酸(A)。 修飾後之GDF-8或BMP-11前胜肽可根據業界眾所周 知之標準蛋白質分離及純化程序分離及純化。 另一具體實施例中,經修飾之GDF前胜肽包含人 BMP-11前胜肽或人BMP-11前胜肽突變株,以及IgG分子, 其為IgG 1或IgG4 Fc區’或經修飾而減少效應物功能之igG 1 片段。較佳具體實施例中,安定劑為人IgG l_Fc區(序列ID 編號:15)或經修飾以減少效應物功能之人jgGHc區(序列 ID編號:16)。BMP-11前胜肽可此鄰於或透過聯結基融合 至IgG分子Fc區,如此處說明。 本發明也提供製造具有延長活體内或試管内半生期 之經修飾之GDF前胜肽之方法《較佳具體實施例中,該方 法包含經由製備一種cDNA分子而製備經修飾之GDF前胜 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
25 1329129 A7 _____Β7_ 五、發明説明(23 ) 肽其包含GDF-8/IgGl Fc或BMP-l 1/IgGl Fc融合蛋白質,該 cDNA分子編碼: (1) GDF前胜肽(例如人GDF-8前胜汰,序列ID編號:5, 或人BMP-11前胜肽’序列ID編號:11),其經修飾而失活 化蛋白質分解割裂位置及IgG分子Fc區(例如人IgG 1 Fc 區’序列ID編號· 15); (2) 使用適當表現質體及細胞,於適當原核或真核表現 系統表現cDNA ;以及 (3) 分離及純化含經修飾之GDF前胜肽之經表現的融 合蛋白質’其中該經修飾之GDF前胜版比較未經修飾之 GDF前胜肽之活體内或試管内半生期延長。
此種較佳本發明之經修飾之GDF前胜肽列舉於第11A 圖。 cDNA表現系統為分子生物學業界眾所周知,表現後 蛋白質之分離及純化方法(此處實例2及7提供此種具體實 施例)亦為眾所周知。 另一具體實施例中,用以表現此種融合蛋白質之 cDNA構成品含有核苷酸編碼聯結基胜肽,該聯結基胜肽 係介於編碼GDF前胜肽之核苷酸與IgG Fc區(或安定劑部 份)間。聯結基胜版相對於GDF或IgG Fc區之方向並不重 要。聯結基胜肚·包含編碼長2、4、6、8、10、12、14、16、 18、20、22、24、26 ' 28、30或以上胺基酸之核苷酸。特 定具體實施例中,聯結基胜肽包含編碼甘胺酸-絲胺酸-甘 胺酸-絲胺酸(GSGS)胺基酸序列之核苷酸。 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
26 1329129 五、發明說明(24 另一具體實施例中,表現質體可視需要含有標鐵1 允許方便地分離與純化表現出的蛋白質。此種加標藏之; .現質體以及分離及純化加標籤之蛋白質產物之方法的使用 為業界眾所周知。 頁 訂 本發明之GDF祕肽㈣包括融合蛋自質其中分子 之咖前胜肽部份與得自特定種類之咖對應序列之同源 性等於或大於60% ;而安定劑部份如⑻分子^區斑得自 不同種類之IgG對應序列之同源性等於或大於_。例 如,人GDF-8前胜肽或其片段可融合至小鼠收分子&區, 反之亦然’如實例3_6舉例說明,只要所得融合蛋白質具有 所需生物活性’亦即可抑制GDF生物活性即可。本發明之 較佳具體實施例中’本發明之融合蛋白質為人類蛋白質嵌 合體。如業界所了解’人類蛋白質嵌合體或融合蛋白質用 於人類病人之治療上為較佳。 至於前述Fc-融合蛋白質之替代例或增加例,gdf前胜 肽可藉多種其它方法及來源物質穩定化,此等材料為眾所 周知且於蛋白質業界方便易得。此等方法及材料例如包括 糖基化,或鍵聯至白蛋白或非蛋白之聚合物,容後詳述。 經修飾後的GDF前胜肽可使用蛋白質業界眾所周知之標準 蛋白質分離及純化技術分離與純化。 GDF前胜肽或經修飾之gdf前胜肽可藉多種業界已知 技術製造。例如,此等前胜肽可使用此處描述方法為業界 已知方法合成(例如以化學方式或重組方式合成)、分離及 純化,以及試驗其與成熟GDF-8或成熟BMP-11蛋白質形成 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 27 1329129 A7 B7 五、發明説明(25 ) 複合物的能力。前胜肽可使用標準蛋白質化學技術合成, 例如述於Bodansky,M.胜肽合成原理,史賓維拉(Springer Verlag),柏林(1993)及Grant G_A_(編輯)合成胜肽:使用者 指南,W.H.福林曼公司,紐約(1992),其内容以引用方式 併入此處。此外,自動化肽合成儀為市面上可得(例如先進 化學技術型號:396 ;米利吉/百色曲(Milligen/Biosearch) 9600)。 另外,經修飾或未經修飾GDF前胜肽或其片段可如業 界眾所周知使用多種表現系統(如大腸桿菌、中國倉鼠卵巢 細胞、COS細胞、桿病毒)以重組方式製造。例如,GDF-8 及BMP-11經表現之前胜肽可使用Bottinger等人(1996) PNAS 93 : 5877-5882 及 Gentry 及 Nash(1990)生物化學 29 : 685 1-6857,其内容以引用方式併入此處,或業界已知純化 胜版之方法純化。另外,經修飾或未經修飾之GDF前胜肽 或其片段可使用FLAG或6-His加標籤用於隨後使用蛋白質 業界確立的技術純化。 經修飾或未經修飾GDF-8或BMP-11前胜版進一步可 經由使用例如蛋白酶消化天然或重組製造的GDF-8或 BMP-11製造,蛋白酶例如為胰蛋白酶、熱分解酶、乳麋胰 蛋白酶、胃蛋白酶或成對鹼性胺基酸轉化酶(PACE)。電腦 分析(使用市售軟體如MacVector、Omega、PCGene,分子 模擬公司)可用於鑑別蛋白質分解割裂位置。另外,此種 GDF前胜肽可由天然或重組製造的GDF-8或BMP-11製 造,採用例如業界已知標準技術,例如化學割裂(如溴化 28 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1329129 A7 ___B7 五、發明説明(26 ) 氰、羥胺)進行。 經修飾之GDF前胜肽之蛋白質分解或合成GDF-8及 BMP-11前胜肽部份可包含多個胺基酸殘基,如結合至目標 GDF蛋白質需要的胺基酸殘基,因而部份或完全抑制 GDF-8或BMP-11活性。此處實例4-6說明結合及抑制檢定分 析具體實施例。特別’維持調節或抑制GDF-8能力的GDF-8 及/或BMP-11前胜肽序列功能片段涵括於本發明之範圍。 GDF-8前胜肽部份較好包含至少5、1〇、20、30、40、50 ' 60、70、80或90個胺基酸;更好至少1〇〇、11〇、120、130、 140、150、160、170、180或190個胺基酸;及最佳至少200、 210、220、230或240個或240個以上胺基酸長度。較佳具體 實施例中,經修飾之GDF-8前胜肽之GDF-8前胜肽部份長 243胺基酸,亦即對應於序列ID編號:5 :其BMP-11前胜肽 之BMP-11前胜肽部份長274胺基酸,亦即對應於序列ID編 號:11。人GDF-8之信號序列示於序列ID編號:13,且包 括序列ID編號:1之前23個胺基酸。一具體實施例中, BMP-11前胜肽序列始於胺基酸序列AEGPAAA。 人BMP-11之信號序列述於序列ID編號:14且包括序列 ID編號:7之前24個胺基酸。部份GDF-8或BMP-11前胜肽 序列被識別為GDF-8或BMP-11前胜狀之功能片段,例如, 方便使用此處實例4-6所述檢定分析指定。 除了截頭前胜肽序列外,此處前胜版變異株特別包括 具有點突變或其它修飾(包括插入、刪失及取代)的GDF前 胜肽;只要此等變異株含有一或多種GDF前胜肽之預定生 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐〉 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
29 1329129 A7 B7 五、發明説明(27 ) 物或抑制活性即可。此等活性例如可如實例4-6所述測量。 此種修飾可引進分子俾增進GDF-8或BMP-11前胜肽活 性、循環或儲存半生期、或產量。舉例言之,點突變可被 導入一或多個蛋白質分解割裂位置,俾防止或抑制經修飾 之GDF-8前胜肽於活體内進行蛋白質分解。電腦分析(使用 市售軟體如MacVector、Omega、PCGene,分子模擬公司) 可用以鑑別蛋白質分解割裂位置。 如此,除了野生型cDNA編碼序列外,本發明製造前 胜肽方法特別包括cDNA編碼序列,其編碼野生型GDF前胜 肽,但因基因碼的簡併或因對偶基因變異(於物種族群天然 出現的氮鹼基變化,其可能或未能導致胺基酸變化)造成 cDNA序列與野生型GDF cDNA序列不同。本發明也預期包 含DNA序列,其於嚴格雜交條件(一具體實施例述於T. Maniatis等人(1982)分子選殖(實驗室手冊),冷泉港實驗 室,387-389頁)下,雜交至GDF前胜肽編碼核酸或編碼有 能力結合特定GDF蛋白質之蛋白質或前胜肽之核酸,如實 例4-6具體說明。因點突變或因誘發修飾(例如插入、删失 及取代)造成cDNA序列變異可增進所編碼的GDF-8或 BMP-11前胜肽活性、半生期或產量,因而於本發明也有 用。可用於測定DNA序列同源性之電腦程式為業界已知且 說明於此處。 經修飾後之GDF前胜肽與GDF蛋白質形成非共價複合 物的能力可藉業界已知多種方法評估,包括尺寸排除層析 術及/或交聯分析,述於此處實例2。如實例2所示,GDF-8 30 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1329129 A7 B7 五、發明説明(28 ) 前胜肽與成熟GDF-8蛋白質形成非共價結合。成熟 GDF-8/GDF-8前胜肽複合物具有名目分子量約75 kDa。 如前述,除了 Fc融合方法外,GDF前胜版也可藉多種 其匕技術穩定化。-具體實施例中,安定劑部份共價鍵聯 至GDF刚胜版部份而形成融合蛋白質。例如,gdf_8前胜 肽可鍵聯至一或多種非蛋白質聚合物,如聚乙二醇、聚丙 二醇 '或聚氧烯類,鍵聯方式述於美國專利第4,64〇,835 ; 4,496,689 ; 4,301,144 ; 4,670,417 ; 4,791,192 ^ 4,179,337 號,併述於此以供參考。某些具體實施例中,GDF前胜肽 藉共價軛合至聚合物以化學方式修飾俾延長其循環半生 期。較佳聚合物及其附接至胜版之方法也述於美國專利第 4,766,106 ; 4,179,337 ; 4,495,285及4,609,546號,以引用方 式併入此處。 另一具體實施例中,GDF-8前胜肽可經修飾而具有變 更後的糖基化樣式(亦即由野生型糖基化樣式變更)。用於 此處,「變更」一詞表示一或多個碳水化合物部份添加至野 生型GDF前胜肽或由其中刪除。蛋白質及前胜肽之糖基化 典型為N-鍵聯或〇-鍵聯。N-鍵聯表示碳水化合物部份附接 至天冬醯胺殘基之支鏈。三胜肽序列天冬醯胺_x_絲胺酸及 天冬醯胺-X-蘇胺酸’此處X為脯胺酸以外的胺基酸,為已 知可以酶作用附接碳水化合物部份至天冬醯胺支鏈之序 列。如此,前胜肽存在有此等三胜肽序列之一構成可能的 糖基化位置》0-鍵聯糖基化表示糖類N_乙醯基半乳糖胺、 半乳糖或木糖之一附接至羥基胺基酸,最常見為絲胺酸或 本紙張尺度適用中國國家標準(挪)A4規格(21〇><297公楚) 31 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -看. -、tr— 1329129 A7 _B7_ 五、發明説明(29 ) 蘇胺酸,但也可使用5-羥木胺酸或5-羥離胺酸。 添加或刪除GDF前胜肽之糖基化位置可方便地經由變 更胺基酸序列,讓胺基酸序列含有或刪除一或多個前述三 胜肽序列(對N-鍵聯糖化位置)達成。變更也可經由刪除、 或取代野生型GDF前胜肽(用於〇-鍵聯糖基化位置)之絲胺 酸或蘇胺酸殘基達成。為求方便,GDF前胜肽胺基酸序列 較佳係經由DNA層面的改變變更,該項技術為業界眾所周 知。 另一種增加GDF前胜肽之碳水化合物部份數目之手段 係以化學或酶催化耦合糖苷至GD前胜肽。此等程序之優點 在於其無須於宿主細胞產生GDF前胜肽,該宿主細胞具有 N-或〇-鍵聯糖基化的糖基化能力,依據使用的耦合模式決 定’糖類可附接至(a)精胺酸及組胺酸;(b)游離羧基;(c) 游離疏基如半胱胺酸之巯基;(d)游離羥基如絲胺酸、蘇胺 酸或經胺酸之羥基;(e)芳香族殘基如苯基丙胺酸、酪胺酸 或絲胺酸之殘基;或⑴麵胺之醯胺殘基。此等方法述於W0 87/05330么告日1987年9月11日,以及述於Aplin及Wriston (1981)CRC Crit. Rev. Biochem.,259-306頁,以引用方式 併入此處。 去除任何存在於GDF前胜肽之碳水化合物部份可以化 學或酶催化方式達成。化學脫去糖基化要求GDF前胜肽曝 露於化合物三氟曱烷磺酸或相當化合物。結果導致大部份 或王。卩糖被割裂,鍵聯糖(N-乙醯基葡萄糖胺或N-乙醯基半 礼糖胺)除外’同時留下胺基酸序列完整不變。 本紙張尺度適用中國國⑽· .f (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂— 32 五、發明説明(30 ) 化學脫去糖基化反應述於^^10111110(1丨11等人(1987)生物 化學生物物理檔案259 : 52以及Edge等人(1981)分析生物化 學Π8 : 131。酶催化割裂GDF前胜肽之碳水化合物部份可 使用多種糖苷内切酶或外切酶達成,述於Thotakura等人 (1987)酶學方法 138 : 350。 如前述’當經修飾之GDF前胜肽為GDF前胜肽-Fc融合 蛋白質時,IgG分子Fc區也可經修飾而具有變更的糖基化 樣式。 另一具體實施例中,GDF前胜肽鍵聯至蛋白質白蛋白 或白蛋白衍生物。鍵聯蛋白質及前胜肽至蛋白質白蛋白或 白蛋白衍生物之方法為業界眾所周知。例如參考美國專利 第5,1 16,944號(Sivam等人),以引用方式併入此處。 熟諳技藝人士了解某些胺基酸可取代蛋白質結構其 它胺基酸而未對蛋白質活性造成不良影響。如此發明人預 期可於經修飾或未經修飾GDF前胜肽胺基酸序列或編碼此 種蝻胜肽之DNA序列做出多種變化,而其生物利用性或活 性並無可察覺的喪失。一具體實施例中,此等活性係於實 例4-6測量。此等變化包括但非限於刪失、插入、截頭、取 代、融合等。例如,經修飾後(31)1;前胜肽之蛋白質分解割 裂位置的胺基酸序列變化明白涵括於本發明範圍。 做出此等變化時,可考慮胺基酸之疏水指數。疏水胺 基酸指數對賦予蛋白質交互作用生物功能之重要性通常為 業界已知(Kyte及Doolittle(1982)分子生物學期刊μ?: 105-132)。已知胺基酸之相對疏水特性促成所得蛋白質之
1329129 A7 B7 2 五、發明説明(31 ) 次級結構,該次級結構又界定蛋白質與其它分子如酶酶 基質、受器、DNA、抗體、抗原等間的交互作用。 各個胺基酸基於其疏水性以及電荷特性被指定一個 疏水指數(Kyte及Doolitt丨e,1982,參見上文);分別為異白 胺酸(+4.5);擷胺酸(+4_2);白胺酸(+ 3 8);笨基丙胺酸 (+2.8);半胱胺酸/胱胺酸(+2.5);蛋胺酸(+1 9);丙胺酸 (+1‘8”甘胺酸(-0.4);蘇胺酸(_〇 7);絲胺酸(·〇 8);色胺 酸(-0.9);路胺酸(-1.3);脯胺酸㈠6);組胺酸(_3 2);麵胺 M-3.5),麩胺(-3.5),天冬酸(胃3_5);天冬醯胺(_3 5);離胺 酸(-3.9)及精胺酸(_4.5)。 進行此等改變時,以取代胺基酸其疏水指數於±2以内 者為佳。± 1以内為特佳,土 〇 · 5以内又更特佳。 業界也需了解基於親水性可讓類似胺基酸之取代變 有效。例如美國專利4,554,101陳述藉毗鄰胺基酸親水性控 制’蛋白質之最大局部平均親水性與蛋白質之生物性質有 交互關聯。 如美國專利第4,554,101號說明,下列胺基酸殘基分別 具有指定親水性數值:精胺酸(+3.0),離胺酸(+ 3.〇),天冬 酸(+3·0± 1) ’麵胺g曼(+3_0± 1},絲胺酸(+〇 3),天冬醯胺 (+〇·2) ’麵胺(+0.2),甘胺酸(0) ’蘇胺酸(-〇·4),脯胺酸(-0.5 土 Π ’丙胺酸(-0.5),組胺酸(-0.5),半胱胺酸(-1.0),蛋胺 酸(-1.3) ’擷胺酸(-1 5),白胺酸(-1 8),異白胺酸(-1 8),酪 胺酸(-2.3) ’笨基丙胺酸(_2.5),及色胺酸(-3.4)。 進行此等變化時,以取代胺基酸其親水性數值於± 本紙張尺度適财國國家標準(CNS) Α4規格(21GX297公釐) 34 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •訂· 1329129 A7 __B7 五、發明説明(32 ) 以内者為佳。± 1以内為特佳,± 〇 · 5以内又更特佳。 修飾可為保守修飾’讓蛋白質之結構或生物功能不受 改變影響。此等保守胺基酸修飾係基於胺基酸支鏈取代基 的類似性例如疏水性、親水性、電荷、大小等。將前述多 種特性皆列入考慮之保守取代範例為業界眾所周知,包括 精胺酸及離胺酸;麩胺酸及天冬酸;絲胺酸及蘇胺酸;麵 I 胺及天冬酸胺,及操胺酸、白胺酸及異白胺酸。經修飾後 GDF前胜肽之胺基酸序列可經修飾而有任何數目的保守變 化,只要經修飾GDF性質結合至其目標GDF蛋白質不會受 到不良影響即可。 相對序列類似或相同性(於蛋白質及分子生物業界也 稱做序列同源性)較佳使用序列套裝分析軟體(第丨〇版;遺 傳計算機集團公司,威斯康辛州馬里森,威斯康辛大學生 技中心)之「最佳匹配」或「間隙」程式測定。「間隙」係 利用Needleman及Wunsch之演繹法則(Needleman及 Wunsch,1970),找出可獲得最大匹配數目及最小間隙數 目的二個序列對準。「最佳匹配」程式進行二序列間最佳類 似性節段的最理想對準。最理想對準係使用Smith及 waterman(Smit]^Waterman,1981 ; Smhh等人,19叫之 局部同源性演繹法則讓匹配數目獲得最大值。 刖述序列分析特徵軟體含有多種其它有用的序列分 析工具用來識別此處揭示核苷酸及胺基酸序列之同源性。 例如’「BLAST」程式(Altschu丨等人,199〇)搜尋於特定資 料庫(例如美國馬里蘭州貝斯拉國家生技資訊中心(ncbi) &尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格⑵〇χ297公釐)----
1329129 A7 -__B7_ 五、發明説明(33 ) :mwi (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 維持的序列資料庫)與查詢序列(肽或核酸)類似的序列; 「FastA」(Lipman 及 Pearson,1985 ;也參考Pearson 及 Lipman ’ 1988 ; Pearson等人,1990)程式進行 Pearson 及 Lipman搜尋’搜尋查詢序列與一組同型序列(核酸或蛋白質) 間的類似性.;「TfastA j程式執行Pearson及Lipman搜尋, 搜尋蛋白質查詢序列與任一組核苷酸序列(於進行比較前 將核苷酸序列轉譯於全部6個讀取架構)間的類似性; 「FastX」進行pearson及Lipman搜尋’搜尋核答酸查詢序 列與一組蛋白質序列間的類似性,將架構位移列入考慮。 「TfastX」執行Pearson及Lipman搜尋,搜尋蛋白質查詢序 列與任一組核苷酸序列間的類似性,將架構位移列入考慮 (進行比較前轉譯核酸序列之二股)。 熟諳技藝人士了解經修飾或未經修飾GDF前胜肽其胺 基酸序列可含有任何數目的取代,而未變更其生物性質。 較佳具體實施例中’此種變化為保守胺基酸取代,其為業 界眾所周知。考慮前述多種特性之範例保守性取代為蛋白 貝生化業界人士眾所周知,包括但非限於精胺酸及離胺 酸,麩胺酸及天冬酸;絲胺酸及蘇胺酸;麩胺及天冬醯胺; 及擷胺酸、白胺酸及異白胺酸。 本發明之若干具體實施例中,蛋白質之活體内穩定性 可以多種方式測量。一具體實施例中,血清或組織樣本係 於靜脈或腹内輸送蛋白質後或蛋白質經放射性標記後,例 如使用碘-125標記後之多個時間點,使用業界人士眾所周 知之方法收獲。各血清或組織樣本的放射性存在量可使用 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 36 1329129 A7 _________Β7____ 五、發明説明(S4 ) 珈瑪計數器測定。另一具體實施例中,血清之蛋白質完整 性/安疋性可於自動放射性攝影或西方墨點分析後藉 SDS-PAGE評估。另—具體實施例中,蛋白質生物活性可 使用業界已知多種功能檢定分析包括ELISA及基於細胞的 檢定分析中之任一種測定。 疾病治療方法 本發明之GDF前胜肽可用於人類或動物預防或治療多 種醫事病症。GDF前胜狀較好用於抑制或減少一或多種 GDF蛋白質相關活性。高度較佳具體實施例中,經修飾之 GDF刖胜肽比較未被相同前胜肽結合的成熟gdf_8蛋白 質,可抑制或減少一或多種成熟GDF_8活性。較佳具體實 施例中,成熟GDF-8蛋白質當被一或多種經修飾的GDF前 胜版結合時’其活性被抑制至少5〇%,較好至少6〇,62, 64 ’66, 68 ’70 ’72 ’74, 76, 78, 80, 82, 84, 86或88 %,更好至少90,91,92,93或94%,及又更好至少95% 至1〇〇%,此種活性抑制係與未被一或多種經修飾之gDF 刖胜版結合的成熱GDF-8蛋白質做比較。 藉經修飾之GDF前胜肽治療或預防之醫事病症較好為 肌肉或神經肌肉病症(例如肌萎縮性脊側索硬化、肌肉營養 失調、肌肉萎縮、充血性阻塞性肺疾、肌肉消耗性症候群、 肌肉缺乏、惡病質)、代謝疾病或病症(例如第二型糖尿病、 非胰島素依賴型糖尿病、高血糖或肥胖)、脂肪組織病症(例 如肥胖)、以及骨退化病(如鬆骨病)。醫事病情最佳為肌肉 或神經肌肉病症如肌萎縮性脊側索硬化、肌肉營養失調、 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(21〇><297公楚) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .、ΐτ· 37 1329129 A7 ---------52____ 五、發明説明(35 ) "~- 肌肉萎縮、充血性阻塞性肺疾、肌肉消耗性症候群、肌肉 缺乏或惡病質。另一較佳具體實施例中,醫事病情為代謝 疾病或病症例如由於葡萄糖代謝功能不良及/或胰導素抗 性導致的疾病,例如第二型糖尿病或非胰島素依賴型糖尿 病,或代謝.病症如高血糖或肥胖。GDF前胜肽較好用於哺 乳類來預防或治療此種醫事病症,最好用於人類。 本發明之GDF前胜肽或前胜肽複合物其於治療有效量 投予。用於此處,「有效量」經改性之GDF前胜版為可有效 降低GDF蛋白質活十生而達成預定生物結果(例如增加骨路 肌質量)之劑量。一具體實施例中,所需生物結果可為任一 種治療效果包括肌肉質量增加,肌肉強度增加,代謝改善, 肥胖減少或葡萄糖體内平衡改良。此等改進可藉多種方法 測量,包括測量痩肉及肥肉身體質量(例如^光掃描分 析)、肌肉強度、企清脂質、血清痩素、血清葡萄糖糖化血 色素、葡萄糖耐性以及糖尿病繼發併發症的改善。通常, 治療有效量可隨個體年齡、體重、身體情況、及性別以及 個體病情嚴重程度改變。劑量由醫生決定,視需要調整而 配合觀察得的治療效果。通常,組合物之投藥劑量給予GDF 刖胜肽50微克/千克至2〇毫克/千克。較佳,〇1^前胜肽係 以大劑量投藥,俾獲得給藥後GDF前胜肽循環濃度最高經 歷最長時間。大劑量投藥之後也可使用連續輸注。 本發明也提供預防或治療因異常葡萄糖體内平衡造 成的代謝疾病或病症。正常葡萄糖體内平衡要求由姨臟貝 它細胞回應於血糖濃度的些微變化而微調胰島素分泌量。 本紙張尺度適用中國國家標準(〇iS) A4規格(210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -'e 38 1329129 A7 _B7 五、發明説明(36 ) 騰島素基本作用之一係刺激葡萄糖由血液攝取入組織,特 別為肌肉及脂肪。 如此,一具體實施例中,本發明提供一種治療糖尿病 及相關病症如肥胖或高血糖之方法,經由對個體投予足夠 改善疾病症狀有效量之經修飾之GDF前胜肽或經修飾之 GDF前胜肽組合物。第二型或非胰島素依賴型糖尿病 (NIDDM)特別具有下列三重特徵:(1)於周邊組織具有抗 性,特別於骨骼肌及脂肪細胞’(2)胰島素抑制肝糖製造的 作用X損,以及(3)膜島素分泌失調(DeFronzo , (1997)糖尿 病综論)。因此,第二型糖尿病病人根據本發明可經由投予 經修飾之GDF前胜肽提高對胰島素以及葡萄糖被細胞攝取 的敏感度而予治療。 同理,其它疾病及代謝病症具有胰島素功能不良(例如 抗f生、無活性或缺乏)及/或葡萄糖輸送入細胞不足的疾病 可可根據本發明經由投予經修飾之GDF前胜肽提高對胰島 素以及葡萄糖由細胞攝取之敏感度而予治療。 本發明之經修飾之GDF前胜肽或經修飾之GDF前胜肽 組合物可以治療有效量投藥。當用於治療糖尿病及相關病 症時’「有效量」經改性GDF前胜肽為足夠降低gdf蛋白質 活性而達成一或多種預定療效的劑量,此等治療效果敏感 度例如胰島素敏感度或葡萄糖由細胞攝取増加,脂肪身體 質量減少或血清脂質 '血清痩素、血清葡萄糖、糖化血色 素、葡萄糖耐性的預定變化,或寄發糖尿病併發症的改進。 通常’治療有效量將隨個體年齡、情況及性別,以及個體 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公董) :…餐 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂— -39 - 1329129 A7 B7 五、發明説明(37 ) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 之胰島素功能不良嚴重程度改變。劑量係由醫師決定以及 視需要調整而適合觀察得的治療效果。通常,組合物之投 藥劑量投予GDF前胜肽50微克/千克至20毫克/千克。較 好,GDF前胜肽係以大劑量投藥,俾於投藥後獲得最大GDF 前胜肽循環.濃度經歷最長時間。大劑量投藥後也可採用連 續輸注。 本發明也提供活體内製造GDF前胜肽之基因治療。此 種治療可藉由將GDF前胜肽聚核苷酸序列導引入由前文列 舉病症之細胞或組織而達成其治療效果。GDF前胜肽聚核 苷酸序列的輸送可使用重組表現載體如嵌合體病毒或膠體 分散系統達成。特佳治療性輸送GDF前胜肽聚核苷酸序列 係使用鎖定目標之微脂粒。 多種可用於此處教示基因治療之病毒載體包括腺病 毒、⑴療病毒、水痘病毒、或較好RN A病毒如反錄病毒。 較好,反錄病毒為鼠或禽反錄病毒衍生病毒。其中可插入 單一外來基因之反錄病毒範例包括但非限於:木洛尼 (Moloney)鼠白血病病毒(MoMuLV),哈維(Harvey)鼠肉瘤 病毒(HaMuSV),鼠乳腫瘤病毒(MuMTV),及勞司(Rous) 肉瘤病毒(RSV)。多種其它反錄病毒載體可結合多重基 因。全部載體可移轉或結合可選擇標記的基因,讓轉移後 的細胞可經識別及產生。經由將感興趣之GDF前胜肽聚核 苷酸序列插入病毒載體連同另一個編碼特定目標細胞(舉 例)受器的配體基因,今日載體可被基因鎖定。反錄病毒可 利用附接,例如糖、糖脂質或蛋白質而做為特定目標。較 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 40 丄 A7 -----------B7__ 五、發明說明(38 ) - ,鎖疋目;^係使用抗體達成^熟諳技藝人士 了解特定聚核 苷駄序列可插入反錄病毒基因體,或附接至病毒膜衣,俾 ^許以鎖定目標方式輸送含GDF前胜肽聚核苷酸至反錄病 毋載體。較佳具體實施例中,載體係對肌肉細胞或肌肉組 織鎖定目標。 由於重組反錄病毒為缺陷病毒,其需要助手細胞系, 助手細胞系含有質體編碼全部反錄病毒結構基因且處於 LTR内部調節序列控制之下。質體喪失一個核苷酸序列, 讓封裝機轉可辨識RNA轉錄本而套上衣殼。助手細胞系其 具有封裝信號刪失之細胞系,包括但非限於例如psi2, PA317及PA12。此等細胞系產生空白病毒粒子,原因在於 其中未封裝基因體。若反錄載體被引導入封裝信號完整的 細胞,則結構基因被其它感興趣的基因替代,載體可被封 裝而產生載體病毒粒子。 另外,其它組織培養細胞可藉習知磷酸鈣轉移感染而 直接轉移感染編碼反錄病毒結構基因gag、p〇丨及env之質 體。然後此等細胞轉移感染含有感興趣基因之載體質體。 結果所得細胞將反錄病毒載體釋放於培養基。 另一種GDF前胜肽聚核苷酸之鎖定目標輸送系統為膠 體分散糸統。膠體分散系統包括巨分子複合物 '奈母膠囊、 微球、珠粒,及基於脂質的系統包括水包油乳液、膠粒、 混合膠粒及微脂粒。較佳本發明膠體系統為微脂粒。微脂 粒為人工膜囊其可用做為試管試驗及活體的輸送媒劑。 RNA、DNA及完整病毒粒子可被包囊於水性内部且以生物 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS> A4規格(210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
1329129 A7 _________B7_ 五、發明説明(39 ) 活性形式輸送至細胞(例如參考Fraley等人,生化科學趨 勢,6 : 77,1981)。使用微脂粒媒劑之有效基因移轉方法 為業界已知,例如參考Mannino等人,生物技術,6 : 682, 1988。微脂粒組成通常為磷脂質組合,通常微磷脂質組合 類固醇’特別膽固醇。也可使用其它磷脂質或其它脂質。 微脂粒之物理性質依據pH、離子強度及二價陽離子的存在 決定。 可用製造微脂粒之脂質例如包括磷脂基化合物,如鱗 脂基甘油、填脂基膽驗、填脂基絲胺酸、填脂基乙醇胺、 勒填脂、腦苷脂類及神經節苷脂類。磷脂質例如包括印鱗 脂基膽鹼、二棕櫊醯基磷脂基膽鹼及二硬脂醯基磷脂基膽 鹼。 微脂粒的鎖定目標亦係基於器官特異性、細胞特異性 及小器官特異性且為業界已知。 已經修飾之GDF前胜肽治療或預防前述醫療病情之方 法也可用於抑制TGF- 超族的其它蛋白質。其中多種蛋 白質之結構係與GDF-8有關,如BMP-11。如此,另一具體 實施例中’本發明提供經由對個體投予可抑制非_GDF_8蛋 白質之經修釋之GDF前胜肽(單獨投藥或組合抗gdF-8之 經修釋之GDF前胜肽)而治療前述病症之方法。 經修釋之GDF前胜肽組合物 本發明提供經修釋之GDF前胜肽組合物。此種組合物 適合醫藥用途及投予病人。組合物典型包含一或多種本發 明經修釋之GDF前胜肽及醫藥可接受性賦形劑。用於此 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) ;f (請先閲讀背面之注意事"再填窝本頁) ’訂— 42 、發明説明 八:醫藥可接受性賦形劑」一詞包括任一種及全部溶劑、 ^放介f、塗層、抗菌及抗真_、等張及吸收延遲劑等, 、此等添加劑係於醫藥投藥相容。此等醫藥活性物質之媒介 ^使:為業界眾所周知。範例醫藥可接受性賦形劑可參考 醫藥賦賴手冊」第3版,2_年,美國製藥出版社, lbbe,爲輯。組合物也含有其它提供補充、增加或提 :/口療功此的化合物。醫藥組合物也連同投藥指示封在容 器、包裝或配送器内。 本發明之醫藥組合物可調g己成與其預期投藥途徑相 合達成技藥方法為熟諸技冑Λ 士已去σ。也可獲得組合物 了:局部投藥或經口投藥,或可通過黏膜投藥。投藥例如 為靜脈(I.V·)、腹内(I Ρ )、肌肉(ΙΜ)、空腔内、皮下内(sc) 或經皮途徑。較佳具體實施例包括1¥、ΙΡ '〗Μ•及s c. 主射。較佳具體貫施例中,本發明之醫藥組合物係經靜 投藥。 用於皮内或皮下之溶液劑或懸浮液劑典型包括一 多種下列成份:無菌稀釋劑如注射用水、鹽水'固定油 聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑;抗菌劑如苯, 醇或每甲基笨曱酸酯;抗氧化劑如抗壞血酸及亞硫酸氫 鈉;螯合劑如伸乙基二胺四乙酸;緩衝劑如乙酸鹽、檸檬 酸鹽及填酸鹽,以及張力調節劑如氣化納及葡萄糖。pH可 使用酸或鹼如鹽酸或氫氧化鈉調整。此等製劑可封在玻璃 或塑膠製之安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶。 注射用之醫藥組合物包括無菌水性溶液劑或分散 脈 或 甲 Ί4 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂— 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公楚) 43 丄 A7 ---~--— B7__ 五、發明説明(41 ) --- 液,以及臨時準備無菌注射溶液或分散液劑之無菌粉末。 供靜脈投藥,適當載劑包括生理鹽水、抑菌水、卡萊蒙 Ί1 (請先閲讀背面之注意事-再填寫本頁) (C_Ph。卿(BASF公司,纪澤西州巴希潘尼)或填酸踏 緩衝鹽水(PBS)。各例中,相人私、,π — > ^ 、·且口物必須無菌也必須流體至溶 液抽取注㈣程度。組合物於製造及儲存條件下必須安 定,必須可保藏不受微生物如細菌及真菌污染。載劑也為 例如含水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇 等)及其適當混合物之溶劑或分散介質。適當流動性,例如 可使用ο衣如即q月曰維持,分散液案例藉維持所需粒徑維 持、及使用界面活性劑維持。預防微生物作用可藉多種抗 菌及抗真菌劑達成,例如對經笨甲酸醋類、氣H、 抗壞金酸及硫柳汞等。多種情況下,較好涵括等張劑如糖 類、多元醇類如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化納於組合物。 經由於組合物涵括延遲吸收劑例如一硬脂酸紹及明勝可延 長注射組合物的吸收。 口服組合物通常包括惰性稀釋劑或食用載劑。例如, 可包括於明膠膠囊或壓製成錠劑。供口服治療投藥,GDF 前胜肽可攙混賦形劑而以鏡劑、片劑或膠囊劑劑型使用。 醫藥相容結合劑,及/或佐劑可涵括做為組成的一部份。鍵 劑、丸劑 '膠囊劑、片劑等可含有後述任一種成份或具有 類似性質之化合物;黏結劑如微晶纖維素、西黃蓍膠或明 膠,更好賦形劑如澱粉或乳糖;崩散劑如褐藻酸佩莫吉 (Primogel),或玉米澱粉;潤滑劑如硬脂酸鎂或史代洛 (Ste_s);滑動劑如膠體二氧化矽;填味劑如嚴糖 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公楚) 44 1329129 42 A7 B7 五、發明説明( 林,或矯味劑如薄荷、水楊酸甲酯或柳橙口味。 供吸入投藥’ GDf前胜肽可呈氣霧劑喷霧形式投藥, 由含有適當推進劑例如二氧化碳氣體之壓縮容器或配送器 或霧化器噴霧投藥。 系統性.投藥也可採經黏膜或經皮手段。用於經黏膜或 經皮投藥’適合欲穿透的障壁的穿透劑用於配方。此種穿 透劑為業界所周知,包括例如供經黏膜投藥清潔劑、膽酸 及褐徵酸衍生物。經黏膜投藥可使用比喷霧劑或栓劑達 成。供經皮投藥,如業界已知,活性化合物被調配成軟膏 劑、硬膏劑、膠漿劑或乳膏劑。 GDF前胜肽也可製備成栓劑劑型(使用習知栓劑基劑 如可可脂及其它甘油酯類)或直腸投藥的駐流浣腸劑。 一具體實施例中,經修飾之GDF前胜肽係以可保護化 合物不會被身體快速清除的載劑製備,例如控制釋放調配 劑,包括質體及微包囊輸送系統。可使用生物可分解生物 相容性聚合物例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、 膠原、聚原酸酯類、以及聚乳酸。此種調配劑之製法為熟 諳技藝人士顯然易知。材料可於市面上得自艾龍(八匕勾公 司及諾瓦(Nova)製藥公司。含經修釋之GDF前胜肽之微脂 粒懸浮液也可用做為醫藥可接受性載劑。可根據熟諳技藝 人士已知方法製備,例如述於美國專利第4 522 8n號。 特佳,為方便投藥及劑量均一,將口服或注射組合物 調配成單位劑型。此處使用之單位劑型表示適合用於接受 治療個體做為單位劑量之物理個別單位;各單位含經過計 本紙張尺度適用申國國家標準(CNS) A4規格(210X297公着)
,\lr· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 45 1329129 A7 --------_____ 五、發明説' ' 算可產生預定療效之預定量活性化合物組合所需製藥載 釗。本發明之單位劑型係依據活性化合物獨特特性以及預 達成之特定療效,以及混料業界特有限制例如處理個體之 活性化合物直接決定。 化合物毒性及療效係由標準製藥程序於細胞培養或 使用動物決定,例如測定LD5〇(對50%族群致死劑量)及 ED5〇(於50%族群治療有效劑量)。毒性與療效間之劑量比 為…療扣數,可表不為LDm/EDm比。以具有較大治療指數 之GDF前胜肽為佳。 由細胞培養檢定分析及動物研究所得資料可用於調 配供人類使用之劑量範圍。此種化合物劑量較好係於包括 £〇5〇之循環濃度範圍而極少或不具有毒性。劑量可依據使 用的劑型以及採用的投藥途徑而於此範圍改變。對任何本 發明使用之經修飾之GDF前胜肽而言,治療有效劑量最初 由細胞培養檢定分析估計。劑量於動物模式調配成可達成 涵括細胞培養測定的ICW亦即可達成症狀最大抑制之一 半程度的接受試驗經修飾之GDF前胜肽濃度)之循環血渡 濃度。血漿濃度可藉高效液相層析術測量。任何特定劑量 之影響係由適當生物檢定分析監視。適當生物檢定分析例 如包括DNA複製檢定分析、基於轉錄之檢定分析、gdf蛋 白質/受器結合檢定分析、肌胺酸激酶檢定分析、基於前_ 脂肪細胞分化之檢定分析、基於脂肪細胞之葡萄糖攝取之 檢定分析、及免疫檢定分析。 下列實例提供本發明之較佳具體實施例。熟諸技蔽人 ^__ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) ' * 46 -
Ί…·… (請先閲讀背面之注意事-再填寫本頁) .、?τ— 1329129 A7 B7 五、發明説明(44 ) (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 士了解可未悖離本發明之精髓或範圍做出多種修改及變 化。此等修改及變化相信皆屬於本發明之範圍。實例絕非 意圖囿限本發明。 本案全案引述之參考文獻、專利案及公開專利申請案 全體内容以引用方式併入此處。 實例 實例1 : GDF-8之純化 得自選定的可表現重組人GDF-8蛋白質(成熟 GDF-8+GDF-8前胜肽)之細胞系之經條件處理的培養基酸 化至pH 6.5及施用至80x50毫米POROS HQ陰離子交換管 柱銜接一根80x50毫米POROS SP陽離子交換管柱(透視生 物系統公司)。通過之流調整至pH 5.0及施用至75x20毫米 POROS SP陽離子交換樹脂(透視生物系統公司)且使用氣 化鈉梯度洗滌。藉十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)指示含GDF-8之洗提份,經匯集的以三氟乙酸 (TFA)酸化至pH 2.3,然後使用0.1%TFA調整至200毫升而 降低黏度。然後匯集物施用至一根前方有60x21.2毫米防衛 管柱(賓諾米司(Phenomenex)公司)的250\21.2毫米€5管柱 (賓諾米司公司),使用TFA/CH3CN梯度洗提而由GDF-8前 胜肽分離成熟GDF-8。含成熟GDF-8之匯集洗提份藉凍乾 濃縮去除乙腈及加入20毫升0.1% TFA。然後樣本施用於 250x10毫米C5管柱(賓諾米司公司),加熱至60 °C輔助分 離。重複至無法進一步分離為止。然後匯集含成熟GDF-8 之洗提份,調整至40%乙腈,施用至一根600x21.2貝爾賽 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 47 1329129 A7 B7 五、發明説明(45 ) 皮(BioSep)S-3000尺寸排除管柱(賓諾米司公司),該管柱前 方有一根60x21.2防衛管柱。匯集含純化後之成熟GDF-8之 洗提份,濃縮供隨後實驗使用。成熟GDF-8二元體之典型 產率為0.33毫克蛋白質/升經調理的培養基。 含GDF-8前胜肽之C5管柱洗提份經匯集,蒸發去除乙 腈,加入20毫升0.1%TFA,然後樣本注入60°C之250x10毫 米C5管柱。重複至無法進一步分離為止。然後匯集含GDF-8 前胜肽之洗提份,調整至40%乙腈,施用至一根600x21.2 貝爾賽皮S-3000尺寸排除管柱(賓諾米司公司)前方有一根 60x2 1.2防衛管柱。匯集含經純化後的GDF-8前胜肽洗提份 及濃縮用於隨後用於隨後實驗。GDF-8前胜肽典型產率為 0.24毫克蛋白質/升經調理的培養基。 進行SDS-PAGE時,純化後之成熟GDF-8於非還原條際 下於25 kDa呈寬帶遷移,以及於還原條件下於13 kDa呈寬 帶遷移。對GDF-8也報告有類似SDS-PAGE情況(McPherron 等人(1997)自然387 : 83-90),反映出成熟蛋白質之嵌合體 性質。 經純化後GDF-8前胜肽之名目分子量於還原及非還原 條件下皆為38 kDa。如此指示GDF-8前胜肽為單體。GDF-8 前胜肽之名目分子量與預測分子量約26 kDa間的差異反應 出添加碳水化合物,原因在於其胺基酸序列含有一個潛在 N-鍵聯糖化位置(McPherron等人(1997)美國國家科學院議 事錄94 : 12457-12461)。如此,前述方法可製造經純化的 及活性成熟GDF-8二元體及GDF-8前胜肽。 48 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1329129 A7 B7 五、發明説明(46 ) 實例2 :經純化之重組人GDF-8特性 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 各50微克經純化之成熟GDF-8及經純化之GDF-8前胜 肽混合及透析入50 mM磷酸鈉pH 7.0,及於300x7.8毫米貝 爾賽皮S-3000尺寸排除管柱(賓諾米司公司)層析。由洗提 時間決定GDF-8/前胜肽複合物分子量,分子量決定係使用 於同一根管柱層析的分子量標準(貝雷(Bio-Rad)實驗室,加 州賀克里斯)。 當純化後之GDF-8前胜肽與純化後之成熟GDF-8於中 性pH培育時,二種蛋白質顯然複合,如尺寸排除情況指 示。於12.7分鐘洗提的主蛋白質尖峰,由同一根管柱上層 析的分子量標準(貝雷實驗室,加州賀克里斯)估計分子量 為78 kDa。複合物大小最為符合成熟GDF-8結合二個前胜 肽單體之二元體,如此形成四元體複合物。 為了證實此項觀察,含成熟GDF-8及GDF-8前胜肽之 製劑與或未與1〇〇 mM 1-乙基3-[3-二曱基胺基丙基]曱二酿 胺鹽酸鹽(EDC,皮爾司(Pierce)公司)於室溫共同培育1小 時,使用鹽酸酸化至pH 2-3,使用邁克隆(Micron)-lO濃縮 器(阿米空(Amicon)公司)濃縮用於進行SDS-PAGE, SDS-PAGE係使用經過崔辛(tricine)緩衝的10%丙烯醯胺 凝膠。蛋白質藉庫馬司藍染色目測觀察。唯有於樣本添加 EDC才觀察到對應於分子量約75 kD之氮,對照行道未見該 帶,證實存在有GDF-8成熟/GDF-8前胜肽複合物。如此證 實該檢定分析可用於測量純化後成熟GDF-8二元體活性及 濃度。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 49 1329129 A7 B7 五、發明説明(47 ) 實例3 :經純化後GDF-8之試管内生物活性 為了證實GDF-8活性,通報子基因檢定分析(RGA)係 使用通報子載體卩〇1^3(€八0八)12序列耦合蟲螢光素酶發 展。CAGA序列先前報告為TGF-/3-誘生基因之啟動基因, PAI-1 的 TGF- /5 -反應序列(Dennler 等人(1998)EMBO J. 17 : 3091-3100)。 含12 CAGA框的通報子載體係使用基本通報子質體, pGL3(普米加公司,美國威斯康辛州馬里森,型號E1751) 製造。得自腺病毒主要後期啟動基因(-35/+10)的TATA框及 轉錄起點位置被插入於Bglll與Hindlll間。含CAGA框 AGCCAGACA十二次重覆的寡核苷酸經配對且轉殖於 Xhol位置。人類橫紋肌肉瘤細胞系,A204(ATCC HTB-82) 使用FuGENE 6轉移感染劑(羅氏診斷公司,美國印地安那 玻里,型號1814443)以pGL3(CAGA)12-過性轉移感染。轉 移感染後,細胞於馬克依(McCoy)5A培養基(生命技術公 司,美國馬里蘭州洛克維,型號21500-079)於48孔平板上 培養16小時,培養基補充2 mM麩胺100單位/毫升鏈黴素, 100微克/毫升青黴素及10%胎牛血清。然後細胞於馬克依 5八培養基使用00[-8、:61^?-11或活化素處理,培氧基補充 麩胺、鏈黴素、青黴素及1毫克/毫升牛血清白蛋白,處理 係於37°C進行6小時。使用蟲螢光素酶檢定分析系統(普米 加公司,美國威斯康辛州馬里森,型號E1483)定量接受處 理細胞的蟲螢光素酶。檢定分析結果示於第1圖。對 GDF-8,結果為三次分開實驗之平均±標準差表示。對 50 I f (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1329129 A7 B7 五、發明説明(48 ) BMP-11及活化素,結果為二次分開實驗的代表數值。 結果顯示GDF-8最大活化通報子構成體10倍,ED50為 10毫微克/毫升GDF-8,指示純化後之重組GDF-8具生物活 性。81^?-11與〇〇?-8之相同性達90%(〇&11^1'等人(1999)發 展生物學208 : 222-232及Nakashima等人(1999)機械發展 80 : 185-189),活化素提引出類似生物反應,指示通報子 基因檢定分析為檢測GDF-8、BMP-11或活化素之試管試驗 生物活性之適當檢定分析。 實例4 :經純化後GDF-8之結合性質 GDF-8潛在複合物於冰上以20莫耳EZ-鍵聯磺基-NHS-生物素(皮爾司公司,美國伊利諾州洛克福,型號21217) 對1莫耳GDF-8複合物之比例接受生物素化2小時,使用0.5 %TFA失活化,於C4朱比特(Jupiter)250x4.6毫米汞柱(賓諾 米司公司)接受層析而由GDF-8前胜肽分離成熟GDF-8。使 用TFA/CH3CN梯度洗提出的生物素化成熟GDF-8洗提份 經匯集,濃縮,以及藉微BCA蛋白質檢定分析試劑套件組 (皮爾司公司,美國伊利諾州洛克福,型號23235)定量。 重組ActRIIB-Fc嵌合體(R&D系統公司,美國明尼蘇達 州明那玻里,型號339-RB/CF)於4°C以1微克/毫升於0.2 Μ 碳酸鈉緩衝液塗覆於96孔平底檢定分析板(科司達 (Costar),紐約,型號3590)塗覆隔夜。然後平板使用1毫克 /毫升牛血清白蛋白封阻,遵照標準ELISA方案洗滌。添加 不同濃度之生物素化GDF-8整份100微升至經過封阻之 ELISA平板,培育1小時,經洗滌,結合的GDF-8量係藉鏈 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、tr· 1329129 A7 B7 五、發明説明(49 絲菌抗生物素-辣根過氧化酶(SA-HRP,BD法明吉(Bd PharMingen) ’美國加州聖地牙哥,型號13047E)接著加入 TMB(KPL ’美國馬里蘭州蓋瑟堡,型號50-76-04)偵測。比 色測量係於分子裝置微平板讀取器於450 nM進行。 如第2圖所示,生物素化GDF-8結合至ActRIIB,推定 為GDF-8II型受器,具有ED50 12毫微克/毫升,指示ActRII 結合檢定分析為敏感的試管試驗GDF-8結合檢定分析。 實例5:藉00?-8前胜肽抑制00?-8及81^?-11 GDF-8與GDF-8前胜肽於室溫前培育1小時時,GDF-8 之生物活性減低。第3圖顯示於GDF-8前胜版存在下於 GDF-8的ED5〇, 10毫微克/毫升誘發?01^(0八0八)12通報子活 性。GDF-8前胜肽係以劑量反應方式減少GDF-8的誘生, IC5() = 25毫微克/毫升(0.6 nM)。GDF-8前胜肽也抑制 BMP-11生物活性至同等程度。相反地,本檢定分析之活化 素活性不受GDF-8前胜肽影響,推定原因係比較GDF-8及 BMP-11,GDF-8及活化素間的同源性相當低。 同理,第4圖顯示GDF-8前胜版與生物素化GDF-8於5 毫微克/毫升前培育’於ActRIIB結合檢定分析抑制GDF-8 結合至ActRIIB,如實例4所示,IC5❶為0.3 nM。獲得結論, 本發明之GDF-8前胜肽為試管試驗GDF-8及BMP-11活性之 強力次毫微莫耳濃度抑制劑,此項性質係於通報子基因檢 定分析及ActRIIB結合檢定分析測量。如此’本檢定分析顯 示GDF-8前胜肷為活性’於本檢定分析為GDF-8活性強力 抑制劑。 ^紙張纽適用中關家標準(哪)M規格⑵0X297公釐) 52 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂· 1329129 A7 B7 五、發明説明(50 ) 實例6 :藉GDF-8前胜肽抑制GDF-8-受器的結合 GDF-8如Frolik等人(1984)生物化學期刊259 : 10995-10999所述使用可拉明(chloramine)T破化至比活性 100-200 " Ci/" g。碘化GDF-8顯示於實例 3所述(CAGA)12 通報子檢定分析中,可媲美未經標示GDF-8之生物活性。 125I-標示GDF-8評估其對肌母細胞系L6之特異性結合作 用。 L6肌母細胞(ATCC CRL-145 8)於杜貝可改性鷹氏培養 基(補充10%熱失活化胎牛血清)於明膠化24孔平板上生長 至融合。如Song等人(1995)内分泌學136 : 4293-4297所述, 全文以引用方式併入此處,進行平衡結合。1毫微克/毫升 125I GDF-8(含或未含未經標示的GDF-8)與融合L6細胞於4 °C培育4小時。洗滌細胞後結合的125I GDF-8經萃取且使用 珈瑪計數器定量。結果以重覆三次測定的平均±標準差表 示代表三次分開實驗。 如第5圖所示,125I GDF-8以高度親和力結合至L6細 胞。發現BMP-11(但非TGF-yS 1),可置換125I GDF-8結合, 指示GDF-8及BMP-ll(但非TGF-ySl)共享此種細胞上的一 個共通受器(資料未顯示)。由GDF-8結合的史特曲 (Scatchard)分析,估計Kd為140 pM。此外,當1毫微克/毫 升125I GDF-8與GDF-8前胜肽於室溫前培育1小時時, GDF-8與L6細胞之特異性結合可以遞增濃度至未經標記的 GDF-8前胜肽抑制(第6圖)。結果以重覆三次測定之平均土 標準差表示,代表二次分開實驗。1毫微克/毫升GDF-8之 53 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1329129 A7 B7 五、發明説明(51 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) IC5〇為140毫微克/毫升GDF-8前胜肽。如資料顯然易知, GDF-8前胜肽經由遮斷GDF-8受器結合而抑制GDF-8生物 活性。 實例7 :藉GDF-8前胜肽Fc融合蛋白質抑制GDF-8活性 如下實.例8所示,鼠GDF-8前胜肽於活體内半生期相當 短。為了增加GDF-8前胜肽的生物利用性,使用標準基因 工程技術建構GDF-8前胜肽與鼠IgG2a Fc區間的融合。 四種突變被引進Fc區俾減少效應物功能,述於Steurer 等人(1995)免疫學期刊155 : 1 165-1 174。使用標準PCR方 法,經由融合編碼鼠GDF-8前胜肽(胺基酸1-267)之cDNA 至鼠IgG2aFc區(第7圖)製備二種融合構成體。融合構成體 1(第7A圖)編碼鼠GDF-8前胜肽之前26個胺基酸(包括24胺 基酸分泌前導基因),該鼠GDF-8前胜肽係合乎架構融合至 鼠IgG2aFc區233胺基酸,始於樞鈕區第一個胺基酸。融合 構成體2(第7B圖)係以類似融合構成體1之方式構成,但有 個短的甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸-絲胺酸(GSGS)聯結基分開 GDF-8前胜肽於鼠Fc區。 二個嵌合體被引進真核表現載體pED(Kaufman等人 (1991)核酸研究19 : 4485-4490),根據製照商的方案使用利 寶非特明(Lipofectamine)2000轉移感染試劑(吉寇 (Gibco)BRL,生命技術公司,美國馬里蘭州洛克維,型號 11668-019),於 COS-1 M6 細胞一過性表現(Horowitz 等人 (1983)分子及應用基因學期刊2: 147-159)。培育24小時後, 加入R1CD1(經修飾之DMEM/F12無血清培養基)。匯集經調 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 54 1329129 A7 B7 五、發明説明(52 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 理的培養基(CM),以新鮮R1CD1替代,60小時後再度收獲 經調理的培養基。然後匯集經調理的培養基且於添加1/10 容積1 M Tris pH 8.0後以蛋白質A西法羅司 (Sepharose)CL-4B(阿莫山(Amersham)法瑪西亞生技公 司,英國,HP7 9NA,巴金罕西亞,型號17-07080-01)純化。 純化後的蛋白質於0.1 Μ乙酸、150 mM氣化鈉洗滌,即刻 使用1/20容積3MTrispH 9.0中和。蛋白質使用標準鼠IgG ELISA方案定量,於ActRIIB競爭ELISA連同經純化的人 GDF-8前胜版檢定分析,如實例5所述。結果示於第8圖。 GDF-8前胜肽-Fc融合複合物之IC50係於低毫微莫耳濃度 範圍,融合1與2間並無差異。融合l(GDF-8前胜肽與鼠 IgG2a間並無聯結基)選用於製造穩定CHO細胞系,試驗於 RGA檢定分析抑制GDF-8。 GDF-8-前胜肽-Fc cDNA次轉殖於CHO表現質體 pHTop,且轉移感染CHO/A2細胞,如Thies等人(2001)生長 因子18 : 251-259所述,全文以引用方式併入此處。穩定細 胞系(PF-4/0.02)係於0.02 Μ米索崔賽(methotrexate)選擇細 胞建立。收獲含有得自選定細胞系之GDF-8前胜肽-Fc融合 蛋白質之經調理培養基,其pH藉加入10% v/v 1M Tris pH 8.0調整,及以事先使用50mM Tris 150mM NaCl pH 7.5平 衡的法瑪西亞r蛋白質A西法羅司快速流(阿莫山法瑪西亞 生技公司,英國,HP7 9NA,巴金罕西亞,型號17-1279-02) 純化。洗提份使用100mM乙酸、150mM氣化鈉pH 2.5洗提, 即刻加入5% v/v 3M Tris pH 9·0中和。匯集尖峰洗提份及 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 55 1329129 A7 _ B7 五、發明説明(53 ) 載荷於法瑪西亞蘇特代(Superdex)200尺寸排除管柱(阿莫 山法瑪西亞生技公司.,英國,HP7 9NA,巴金罕西亞,型 號17-1069-01)。0.05 %吞恩(Tween)80加至洗提份防止聚 集。洗提份係於諾維司(Novex)10%Tricine凝膠(諸維司公 司,美國加州聖地牙哥,型號EC6675 5)藉SDS-PAGE評估。 匯集之洗提份藉分光光譜術分析,如實例4所述於 ActRIIB結合檢定分析檢定分析其活性,以及於通報子基因 檢定分析(第9圖)分析活性。純化後GDF-8前胜肽-Fc融合蛋 白質之IC5〇為1.3 nM。資料顯示本發明之包含GDF-8前胜肽 -Fc融合蛋白質之經修飾的GDF-8前胜肽比GDF-8前胜肽保 有強力抑制(中和)活性。 實例8 :藥力學 GDF-8前胜肽(此處稱做「GDF8-Pro」)之藥力學(PK) 以及GDF-8前胜肚_-Fc融合蛋白質(此處稱做「GDF8-ProFc」) 之藥力學係以0.2微克/小鼠(GDF8-Pro)或2微克/小鼠 (GDF8-ProFc)單次靜脈投藥劑量而於C57B1/6J小鼠評估。 動物以上列劑量接受未經標記以及125I-標記的-GDF8-Pro 或GDF8-ProFc混合物,基於血清之1251放射性以及注射劑 量之比活性測定血清濃度。第10圖顯示GDF8-Pro及 GDF8-ProFc二者之血清濃度相對時間作圖曲線。表1顯示 單次靜脈投予2微克/小鼠後GDF8-Pro及GDF8-PrOFc之藥 力學參數。GDF8-Pro之藥力學參數血清濃度經規度化成為 2微克/小鼠劑量以供比較。 56 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1329129 A7 B7 五、發明説明(54 ) 表1 T,/2 cmax 廓清力 MRT V, Vss (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (小時)(毫微克/毫升)(毫升/小時)(小時)(毫升)(毫升) GDF8-ProFc 232 1392 0.03 286 1.4 8.7 GDF-8-Pro 2.2 390 12.4 2.3 5.1 28.3 τι/2 :终端清除相半生期 :尖峰血清濃度 MRT :平均駐留時間 V,:初分布容積 Vss :穩態分布容積 備註:GDF8-Pro藥力學參數規度化成為2微克/小時劑量》 如第10圖可知,GDF8-ProFc比GDF8-Pro廓清力減慢 400倍,半生期延長100倍。初分布容積及穩態分布容積對 GDF8-Pro 而言比 GDF8-ProFc 高約 3 倍,指示 GDF8-Pro 比 GDF8-ProFc分布至血管空間外侧至較大程度。 雖然IgG分子Fc區對GDF前胜肽之穩定效果係使用小 鼠GDF前胜肽-Fc融合蛋白質(二種成份皆衍生自小鼠)舉例 說明,但本發明方法可應用至GDF前胜肽及IgG組成份之任 一種組合,而與衍生各組成份之特定前驅蛋白質或動物種 類無關,只要融合蛋白質經適當構成而保有活性(換言之, 如此處所述)即可。 實例9 :二種人GDF-8前胜肽Fc融合物之衍生及活性 使用標準PCR方法製備二種GDF-8前胜肽Fc融合構成 體供評估治療潛力。編碼人GDF-8前胜肽之cDNA(序列ID 編號:5)融合至人IgGl Fc區(序列ID編號:15 ;第11A圖), 或人IgGl Fc經修飾俾降低效應物功能(序列ID編號:16 ; 第11B圖)。 1_人GDF-8前胜肽-IgGl wt Fc融合蛋白質(第11A圖): 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 57 J^129
A7 五、發明説明(55 ) 人GDF-8前胜肽之前264個胺基酸(包括序列ID編號:5 <胺基酸1-241以及23個胺基酸信號生態示於序列ID編 號:13)以合乎架構方式融合至人IgGl恒定區之232個胺基 酸’始於樞鈕區的第一個胺基酸(序列ID編號:15)。 2·人GDF-8前胜肽-IgGl突變株(第UB圖): 如前述,人GDF-8前胜肽頭264個胺基酸以合乎架構方 式融合突變後人IgGl Fc區的227個胺基酸(序列ID編號: 16)。二突變,序列ID編號:16所示丙胺酸殘基(Ala-14及 Ala-17)被引進俾減低效應物功能,如Lund等人(1991)免疫 學期刊 147 : 2657-2662 及 Morgan 等人(1995)免疫學 86 : 3 19-324所述。
二融合蛋白質被引進真核表現載體pED(Kaufman等人 (1991)核酸研究19: 4485-4490),根據製造商的方案使用利 寶非特明2000轉移感染試劑(吉寇BRL,生命技術公司,美 國馬里蘭州洛克維,型號1 1668-019),一過性於COS-1 M6 細胞表現(Horowitz等人(1983)分子及應用基因學期刊2 : 147-159)。培育24小時後,加入R1CD1(經修飾之DMEM/F12 無血清培養基)。匯集經調理的培養基(CM),替換新鮮 R1 CD 1,60小時後再度收獲經調理的培養基。然後匯集經 調理的培養基且於添加1/10倍容積1 M Tris pH 8.0後以蛋 白質A西法羅司CL-4B(阿莫山法瑪西亞生技公司,英國, HP7 9NA,巴金罕西亞,型號17-07080-01)純化。純化後的 蛋白質於0.1_ Μ乙酸、150 mM氯化鈉洗提,即刻使用1/20 倍容積3M Tris pH 9.0中和。蛋白質使用標準人IgG ELISA 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
58 五、發明説明(56 方案疋量,於ActRIIB結合檢定分析連同經純化的 人 GDF-8 前胜肽檢定分析,述於實例5。結果顯示於第12圖。歸結二 種人前胜肽-Fc融合蛋白質皆為(}1)17_8結合ActRnB的強力 抑制劑。 貝例10 · GDF-8月ij胜狀-Fc融合蛋白質之活體試驗 鼠GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質(得自實例9)於成小鼠 進行實驗。7至9周齡成年雌性BALB/C小鼠就體重隨機分 組,每組7頭(但未處理組除外,該組為6頭小鼠)。小鼠每 周藉腹内注射二次投藥,每頭動物每周總計量丨〇微克、丨 微克或1000微克經歷5周時間。對照注射鼠igG2a_Fc,其莫 耳數係相當於高劑量前胜肽-Fc。研究結束時取出腓腸肌、 四頭肌、副睪脂肪塾、腎臟及肝臟稱重。第13圖顯示平均 組織質量,誤差柱指示平均之標準差。星號(*)指示比較接 受對照蛋白質IgG2aFc處理組小鼠之差異有統計學意義(使 用學生T試驗p< 〇.〇1)。藉腹内注射1毫克/周(處理組小 鼠)GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質封阻GDF-8之活體内活 性’比較未接受GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質之對照組小 鼠,腓腸肌增加6,2 %及四頭肌肌肉質量增加11.3%。此 外’藉腹内注射100微克/周GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質(處 理組小鼠)於活體内遮斷GDF-8活性,結果導致脂肪墊質量 增加23.0%。高劑量(1毫克/周)處理導致脂肪墊質量減少, 但由於脂肪墊質量的變化,該差異並非具有高度統計學意 義(p=0_047)。處理對其它試驗組織,包括肝及腎質量並無 影響。要言之,經修飾之GDF-8前胜肽於活體内遮斷GDF-8 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 59 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
1329129 A7 B7 五、發明説明(57 ) 活性,結果導致肌肉質量增加以及脂肪質量減少。要言之, 藉腹内注射GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質(處理組小鼠)於活 體内遮斷GDF-8活性,結果導致腓腸肌及四頭肌肌肉質量 比未接受GDF-8前胜肽-Fc融合蛋白質處理之對照組小鼠 增加。 相當範圍 熟諳技藝人士了解或確定無須經由例行實驗即可對 此處所述之本發明之特定具體實施例做出多種相當變化。 此等相當例意圖皆涵蓋於如下申請專利範圍。 60 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)
Claims (1)
- 修正曰期:99年4月 1. 一種經修飾之GDF-8前胜肽,其包含一胺基酸序列,該 胺基酸序列具有突變位於對應序列ID編號·· 5之位置76 殘基處’其中該經修飾之GDF-8前胜狀相對於一對應未 經修飾之GDF-8前胜肽具有活體内或試管内半生期延 長。 2. 如申請專利範圍第1項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該胺基酸序列係至少75%相同於序列ID編號:5或其生 物活性片段。 3. 如申請專利範圍第2項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該胺基酸序列係至少75%相同於序列ID編號:5。 4. 如申請專利範圍第1項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該經修飾之GDF-8前胜肽除了具有突變位於對應序列 ID編號:5之位置76殘基處之外,該經修飾之GDF-8前 胜肽包含該序列ID編號:5之胺基酸序列或其功能性片 5. 如申請專利範圍第4項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該經修飾之GDF-8前胜肽除了具有突變位於對應序列 ID編號:5之位置76殘基處之外,該經修飾之GDF-8前 胜肽包含該序列ID編號:5之胺基酸序列。 6. 如申請專利範圍第1項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該胺基酸對應序列ID編號:5之位置76殘基處之突變係 1329129 一取代突變。 7.如申請專利範圍第6項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該對應於序列ID編號:5之位置76的殘基係丙胺酸。 8·如申請專利範圍第1項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 一蛋白質分解割裂位置係經由該位置之突變而被失活 化0 9.如申請專利範圍第1項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該經修飾之GDF-8前胜肽進一步包含被融合至該 GDF-8前胜肽之安定劑部份。 10·如申請專利範圍第9項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該安定劑部份包含IgG分子Fc區》 11. 如申請專利範圍第10項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該IgG分子為IgGl或IgG4或其衍生物。 12. 如申請專利範圍第1〇項之經修飾之gdF-8前胜肽,其中 該IgG分子為IgGl。 13. 如申請專利範圍第10項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該IgG分子之胺基酸序列係至少75 %相同於序列ID編 號:15 〇 14. 如申請專利範圍第10項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該IgG分子之胺基酸序列為序列id編號:15。 15. 如申請專利範圍第10項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該IgG分子之胺基酸序列係至少75%相同於序列ID編 號:16。 16. 如申請專利範圍第10項之經修飾之GDF-8前胜肽’其中 2該IgG分子之胺基酸序列為序列m編號:i6。 17.如申βΒ專利範圍第1〇項之經修飾之gDF 8前胜肽,其中 邊GDF-8前胜肽係透過鍵聯基胜肽融合至IgG分子Fc 區。 18.如申请專利範圍第1項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 该經修飾之GDF-8前胜肽具有經變更的糖化位置。 •如申凊葶利範圍第1項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該經修飾之GDF-8前胜肽包含至少一個碳水化合物部 份。 20. 如申請專利範圍第9項之經修飾之gdf_8前胜肽,其中 該安定劑部份包含白蛋白或白蛋白衍生物。 21. 如申請專利範圍第9項之經修飾之GDF 8前胜肽,其中 該安定劑部份包含非蛋白質聚合物。 22. 如申請專利範圍第丨項之經修飾之GDF 8前胜肽,其中 該經修飾之GDF-8前胜肽進一步包含純化標籤。 23. —種編碼經修飾之GDF_8前胜肽之核酸分子該經修飾 之GDF-8前胜肽係如申請專利範圍第1至22項十任一 者。 24. 如申請專利範圍第23項之核酸分子,其包含如序列山 編號:2列舉之至少20個連續核苷酸,但是包括一編碼 對應序列ID編號:5之位置76的胺基酸之核苷酸突變。 25. 如申請專利範圍第23項之核酸分子,其包含如序列出 編號:6列舉之至少20個連續核苷酸,但是包括一編碼 對應序列ID編號:5之位置76的胺基酸之核苷酸突變。 1329129 26. 如申請專利範圍第24項之核酸分子,其包含如序列ID 編號:2列舉之至少50個連續核苷酸,但是包括一編碼 對應序列ID編號:5之位置76的胺基酸之核苷酸突變。 27. 如申請專利範圍第24項之核酸分子,其包含如序列1〇 編號.6列舉之至少5 0個連續核答酸,但是包括一編碼 對應序列ID編號:5之位置76的胺基酸之核苷酸突變。28_ —種醫藥組合物,包含如申請專利範圍第1至22項中任 一項之經修飾之GDF-8前胜肽及醫藥可接受性賦形劑。 29. —種醫藥組合物,包含如申請專利範圍第23至27項中任 一項之核酸分子及醫藥可接受性載劑或載體。 30. —種製造經修飾之GDF-8前胜肽之方法,包含: (a) 製備一編碼如申請專利範圍第!項之前胜 肽之cDNA分子,其中該蛋白質分解割裂位置經修飾; (b) 製備一編碼IgG分子Fc區之cDNA分子;以及(c) 融合得自步驟(a)及(b)之CDNA分子而製造經修 飾之GDF-8前胜肽。 31. 如申請專利範圍第30項之方法,其進一步包含製備一編 碼鍵聯基胜肽之雙股寡核苷酸,以及融合得自步驟(a) 及(b)之cDNA分子至編碼該鍵聯基胜肽之雙股募核苷 酸任一端。 32. 如申請專利範圍第3丨項之方法,其中該鍵聯基胜肽包含 GSGS組成的胺基酸序列。 33. —種重組細胞,其包含一編碼如申請專利範圍第^至u 項中任一項之經修飾之GDF-8前胜肽之核酸。U2912934.如申請專利範圍第33項之重組細胞,其中該核酸包含一 編碼一安定劑部份之核酸序列。 35.如申請專利範圍第丨至22項中任一項之經修飾之 前胜肽’其係用作為一藥品。 36'種使用如申請專利範圍第1至22項中任一項之經修飾 之GDF-8前胜肽於製備藥品之用途,該藥品係用於治療成夕住is tj丨· yg〜抽況:脱肉病症、神經肌肉病症、 代謝性病症以及骨退化病症。 37. —種使用如申請專利範圍第1至22項十任一項之經修飾 之GDF-8前胜肽於製備藥品之用途,該藥品係用於治療 一或多種選自下列之病況:肌萎縮性脊侧索硬化、肌肉 營養失調、肌肉萎縮 '充血性阻塞性肺疾、肌肉消耗性 症候群、肌肉缺乏及惡病質。 38. —種使用如申請專利範圍第i至22項_任一項之經修飾 之GDF-8前胜肽於製備用以治療骨質疏鬆症的藥品之 用途。39. —種使用如申請專利範圍第丨至22項中任一項之經修飾 之GDF-8前胜肽於製備用以增加肌肉質量的藥品之用 途。 40. —種經修飾之GDF_8前胜肽,其包含: (a) —至少75%相同於序列ID編號:5之胺基酸序列; 以及 (b) —被融合至該(a)胺基酸序列之安定劑部份; 其中該經修飾之G D F _ 8前胜肽相對於一對應未經修飾 5 之GDF-8前胜肽具有活體内或試管内半生期延長。 41. 如申請專利範圍第4〇項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該安定劑部份包含IgG分子Fc區。 42. 如申請專利範圍第41項之經修飾之GdF-8前胜肽,其中 該IgG分子為IgG 1或IgG4或其衍生物。 43. 如申請專利範圍第41項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該IgG分子為IgGl。 44. 如申請專利範圍第41項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該IgG分子之胺基酸序列係至少75 %相同於序列ID編 號:15。 45. 如申請專利範圍第41項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該IgG分子之胺基酸序列為序列ID編號:15。 46. 如申請專利範圍第41項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該IgG分子之胺基酸序列係至少75 %相同於序列ID編 號:16。 47. 如申請專利範圍第41項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該IgG分子之胺基酸序列為序列ID編號:16。 48. 如申請專利範圍第41項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該前胜肽係透過鍵聯基胜肽融合至IgG分子Fc區。 49. 如申請專利範圍第40項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該經修飾之前胜肽進一步包含經變更的糖化位置。 50. 如申請專利範圍第40項之經修飾之GDF-8前胜肽,其中 該經修飾之前胜肽進一步包含至少一個碳水化合物部 51. 如申請專利範圍第4〇項之經修飾2GDF 8前胜肽,其中 該女疋劑部份包含白蛋白或白蛋白衍生物。 52. 如申請專利範圍第4〇項之經修飾之GDF 8前胜肽,其中 該安定劑部份包含非蛋白質聚合物。 53. 如申請專利範圍第4〇項之經修飾2GDF 8前胜肽,其中 該經修飾之GDF-8前胜肽進一步包含純化標籤。 54. —種編碼經修飾之GDF_8前胜肽之核酸分子,該經修飾 之GDF-8前胜肽係如申請專利範圍第牝至兄項中任一 者。 55. 如申請專利範圍第54項之核酸分子,其包含如序列工〇 編號:6列舉之至少2〇個連續核苷酸。 56. 如申請專利範圍第54項之核酸分子,其包含如序列工〇 編號:6列舉之至少5〇個連續核穿酸。 57. —種醫藥組合物,包含如申請專利範圍第扑至”項中任 一項之經修飾之GDF-8前胜肽及醫藥可接受性賦形劑。 58. —種醫藥組合物,包含如申請專利範圍第“至%項中任 一項之核酸分子及醫藥可接受性載劑或載體。 59. —種重組細胞’其包含一編碼如申請專利範圍第仂至” 項中任一項之經修飾之GDF_8前胜肽之核酸。 60. 如申請專利範圍第59項之重組細胞,其中該核酸包含一 編碼一安定劑部份之核酸序列。 61. 如申請專利範圍第40至53項中任一項之經修飾之 GDF-8前胜肽,其係用作為一藥品。 62. -種使用如申請專利範圍第4〇至53項中任一項之經修 1329129飾之GDF-8前胜肽於製備藥品 之用途,該藥品係用於治症、代謝性病症以及骨退化病症。 63. —種使用如申諸專利筋.囹笙4r» e η,i .療一或多種選自下列之病況:肌萎縮性脊側索硬化、肌 肉營養失調、肌肉萎縮、充血性阻塞性肺疾、肌肉消耗 性症候群、肌肉缺乏及惡病質。 64. —種使用如申請專利範圍第40至53項中任一項之經修 飾之GDF-8前胜肽於製備用以治療骨質疏鬆症的藥品 之用途。 65. —種使用如申請專利範圍第40至53項中任一項之經修 飾之GDF-8前胜肽於製備用以增加肌肉質量的藥品之 用途。 .
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US8128933B2 (en) | 2005-11-23 | 2012-03-06 | Acceleron Pharma, Inc. | Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody |
US20070190056A1 (en) * | 2006-02-07 | 2007-08-16 | Ravi Kambadur | Muscle regeneration compositions and uses therefor |
EP2502628B1 (en) * | 2006-06-23 | 2016-12-14 | Alethia Biotherapeutics Inc. | Polynucleotides and polypeptide sequences involved in cancer |
AU2007282224B2 (en) | 2006-08-11 | 2013-08-29 | Vico Therapeutics B.V. | Methods and means for treating DNA repeat instability associated genetic disorders |
US20100028332A1 (en) * | 2006-12-18 | 2010-02-04 | Acceleron Pharma Inc. | Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels |
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TWI548647B (zh) * | 2007-02-02 | 2016-09-11 | 艾瑟勒朗法瑪公司 | 衍生自ActRIIB的變體與其用途 |
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CN101980726A (zh) * | 2008-02-08 | 2011-02-23 | 普罗森那控股公司 | 治疗与dna重复不稳定性相关的遗传病症的方法和装置 |
WO2009137880A1 (en) | 2008-05-14 | 2009-11-19 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Use of angiogenin or angiogenin agonists for treating diseases and disorders |
EP2119783A1 (en) | 2008-05-14 | 2009-11-18 | Prosensa Technologies B.V. | Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means |
NZ590327A (en) * | 2008-06-26 | 2013-12-20 | Acceleron Pharma Inc | Methods for dosing an activin-actriia antagonist and monitoring of treated patients |
US8216997B2 (en) | 2008-08-14 | 2012-07-10 | Acceleron Pharma, Inc. | Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators |
PT3494986T (pt) | 2008-08-14 | 2020-07-14 | Acceleron Pharma Inc | Armadilhas para gdf |
US9855291B2 (en) | 2008-11-03 | 2018-01-02 | Adc Therapeutics Sa | Anti-kidney associated antigen 1 (KAAG1) antibodies |
CA2749544A1 (en) | 2009-01-13 | 2010-07-22 | Acceleron Pharma Inc. | Methods for increasing adiponectin |
NZ595955A (en) | 2009-04-24 | 2012-10-26 | Prosensa Technologies Bv | Oligonucleotide comprising an inosine for treating dmd |
EP2440576A4 (en) | 2009-06-08 | 2013-11-20 | Acceleron Pharma Inc | PROCESS FOR INCREASING THE NUMBER OF THERMOUS ADIPOCYTES |
KR20120028358A (ko) | 2009-06-12 | 2012-03-22 | 악셀레론 파마 인코포레이티드 | 절두된 ActRIIB-FC 융합 단백질 |
KR20120062874A (ko) * | 2009-09-09 | 2012-06-14 | 악셀레론 파마 인코포레이티드 | ActRIIb 길항제들와 이의 투약 및 용도 |
AU2010315245B2 (en) * | 2009-11-03 | 2016-11-03 | Acceleron Pharma Inc. | Methods for treating fatty liver disease |
TW201120210A (en) * | 2009-11-05 | 2011-06-16 | Hoffmann La Roche | Glycosylated repeat-motif-molecule conjugates |
EP2501400B1 (en) * | 2009-11-17 | 2017-11-01 | Acceleron Pharma, Inc. | Actriib proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy |
EP2516647B1 (en) | 2009-12-24 | 2016-12-14 | BioMarin Technologies B.V. | Molecule for treating an inflammatory disorder |
CA2807607A1 (en) | 2010-08-20 | 2012-02-23 | Wyeth Llc | Cell culture of growth factor-free adapted cells |
AU2011326586A1 (en) | 2010-11-08 | 2013-05-30 | Acceleron Pharma, Inc. | ActRIIA binding agents and uses thereof |
AU2012234754B2 (en) | 2011-03-31 | 2016-09-29 | Adc Therapeutics Sa | Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof |
AU2012324495B2 (en) | 2011-10-21 | 2016-04-21 | Pfizer Inc. | Addition of iron to improve cell culture |
JP6282597B2 (ja) | 2012-01-09 | 2018-02-21 | アー・デー・ツェー・セラピューティクス・エス・アー | 乳癌を治療する方法 |
CN104203289B (zh) | 2012-01-27 | 2020-11-03 | 比奥马林技术公司 | 用于治疗杜兴型肌营养不良症和贝克型肌营养不良症的具有改善特性的rna调节性寡核苷酸 |
EP2830646B1 (en) | 2012-03-27 | 2018-03-07 | NGM Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders |
AU2013204740C1 (en) | 2012-05-10 | 2015-10-01 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Methods of treating cancer using angiogenin or an angiogenin agonist |
WO2014000042A1 (en) * | 2012-06-27 | 2014-01-03 | Prince Henry's Institute Of Medical Research | COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODIFYING TGF-β FAMILY LIGANDS |
WO2014039189A1 (en) | 2012-08-01 | 2014-03-13 | Mcnally Elizabeth | Mitigating tissue damage and fibrosis via latent transforming growth factor beta binding protein (ltbp4) |
JP2015531244A (ja) | 2012-10-15 | 2015-11-02 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーBristol−Myers Squibb Company | タンパク質を製造するための哺乳動物細胞培養方法 |
NZ747350A (en) | 2012-10-24 | 2020-07-31 | Celgene Corp | Methods for treating anemia |
WO2014066486A2 (en) * | 2012-10-24 | 2014-05-01 | Celgene Corporation | Biomarker for use in treating anemia |
WO2014071158A1 (en) | 2012-11-02 | 2014-05-08 | Celgene Corporation | Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders |
JP6272907B2 (ja) | 2013-01-30 | 2018-01-31 | エヌジーエム バイオファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 代謝障害の処置における組成物及び使用方法 |
US9161966B2 (en) | 2013-01-30 | 2015-10-20 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | GDF15 mutein polypeptides |
JP6143270B2 (ja) * | 2013-01-31 | 2017-06-07 | 学校法人東京薬科大学 | マイオスタチン阻害ペプチド |
JP2016518357A (ja) | 2013-04-08 | 2016-06-23 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 骨格筋幹細胞を若返らせる方法および組成物 |
US20160220640A1 (en) * | 2013-06-11 | 2016-08-04 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and compositions for increasing neurogenesis and angiogenesis |
UA116665C2 (uk) * | 2013-07-31 | 2018-04-25 | Емджен Інк. | Гібридний білок, що містить область фактора диференціації та росту 15 (gdf-15) |
CN104725513A (zh) * | 2013-12-20 | 2015-06-24 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 融合蛋白及其在治疗多发性硬化中的用途 |
EP3154566B1 (en) | 2014-06-13 | 2022-08-03 | Acceleron Pharma Inc. | Actrii antagonist for the treatment or prevention of a cutaneous ulcer in a subject that has anemia |
PE20170771A1 (es) | 2014-07-30 | 2017-07-04 | Ngm Biopharmaceuticals Inc | Composiciones y metodos de uso para tratar trastornos metabolicos |
MA41052A (fr) | 2014-10-09 | 2017-08-15 | Celgene Corp | Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii |
EP3701969A1 (en) | 2014-10-31 | 2020-09-02 | NGM Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders |
PT3227675T (pt) | 2014-12-03 | 2023-05-30 | Celgene Corp | Antagonistas da ativina-actrii e utilizações para tratamento da síndrome mielodisplásica |
CN116059320A (zh) | 2016-01-06 | 2023-05-05 | 哈佛学院校长同事会 | 使用gdf11的治疗防止体重增加、提高葡萄糖耐量并减轻脂肪肝 |
KR102370762B1 (ko) | 2016-03-31 | 2022-03-04 | 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. | 결합 단백질 및 이의 사용 방법 |
JP2022514778A (ja) | 2018-12-21 | 2022-02-15 | ノースウェスタン ユニバーシティ | 筋膜損傷の予防および治療におけるアネキシンの使用 |
WO2020139977A1 (en) | 2018-12-26 | 2020-07-02 | Northwestern University | Use of glucocorticoid steroids in preventing and treating conditions of muscle wasting, aging and metabolic disorder |
Family Cites Families (91)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
EP0105014B1 (en) | 1982-09-24 | 1992-05-20 | THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce | Repair of tissue in animals |
US4588684A (en) | 1983-04-26 | 1986-05-13 | Chiron Corporation | a-Factor and its processing signals |
NZ210699A (en) | 1984-01-04 | 1989-06-28 | Int Genetic Eng | Isolation of an osteogenic protein of the p3 immunologically related family |
DK518384A (da) | 1984-01-31 | 1985-07-01 | Idaho Res Found | Vektor til fremstilling af et gen-produkt i insektceller, fremgangsmaade til dens fremstilling samt dens anvendelse |
CA1341617C (en) * | 1984-06-08 | 2011-06-28 | Henry George Burger | Inhibin isolated from ovarian follicular fluid |
DE188479T1 (de) | 1984-07-06 | 1987-05-21 | Sandoz-Patent-Gmbh, 7850 Loerrach, De | Herstellung und reinigung von lymphokinen. |
DE3588058T3 (de) | 1984-07-16 | 2005-04-07 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto | Knorpel-induzierende Polypeptid-Faktoren aus Knochen |
US4740587A (en) | 1985-07-18 | 1988-04-26 | The Salk Institute For Biological Studies | Inhibin and method of purifying same |
US5215893A (en) * | 1985-10-03 | 1993-06-01 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
NZ231899A (en) | 1985-10-03 | 1991-07-26 | Genentech Inc | Human or porcine inhibin peptide compositions and dna encoding them |
US4798885A (en) * | 1986-02-07 | 1989-01-17 | Genentech, Inc. | Compositions of hormonally active human and porcine inhibin containing an α chain and 62 chain |
US5089396A (en) * | 1985-10-03 | 1992-02-18 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US4737578A (en) * | 1986-02-10 | 1988-04-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Human inhibin |
ZA874681B (en) * | 1986-07-01 | 1988-04-27 | Genetics Inst | Novel osteoinductive factors |
US5106748A (en) * | 1986-07-01 | 1992-04-21 | Genetics Institute, Inc. | Dna sequences encoding 5 proteins |
US5187076A (en) * | 1986-07-01 | 1993-02-16 | Genetics Institute, Inc. | DNA sequences encoding BMP-6 proteins |
US5013649A (en) * | 1986-07-01 | 1991-05-07 | Genetics Institute, Inc. | DNA sequences encoding osteoinductive products |
IL83003A (en) | 1986-07-01 | 1995-07-31 | Genetics Inst | Factors that soak bone formation |
US5041538A (en) * | 1987-08-28 | 1991-08-20 | The Salk Institute For Biological Studies | Mammalian follistatin |
EP0408649A4 (en) | 1988-04-08 | 1991-11-27 | Genetics Institute, Inc. | Bone and cartilage inductive compositions |
US5071834A (en) * | 1988-09-16 | 1991-12-10 | Genentech, Inc. | Purified activin B composition |
ATE162223T1 (de) | 1989-03-28 | 1998-01-15 | Genetics Inst | Osteoinduktive zusammensetzungen |
EP0394827A1 (en) * | 1989-04-26 | 1990-10-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Chimaeric CD4-immunoglobulin polypeptides |
CA2020729A1 (en) | 1989-07-19 | 1991-01-20 | Michael C. Kiefer | Bone morphogenetic protein |
US5194596A (en) * | 1989-07-27 | 1993-03-16 | California Biotechnology Inc. | Production of vascular endothelial cell growth factor |
US5350836A (en) * | 1989-10-12 | 1994-09-27 | Ohio University | Growth hormone antagonists |
US5116944A (en) * | 1989-12-29 | 1992-05-26 | Neorx Corporation | Conjugates having improved characteristics for in vivo administration |
US5166190A (en) | 1990-01-08 | 1992-11-24 | Genentech, Inc. | Method for increasing fertility in males |
DE69132823T2 (de) | 1990-05-16 | 2002-07-18 | Genetics Inst | Knochen- und knorpel-bildung hervorrufende proteine |
ATE253589T1 (de) | 1990-09-26 | 2003-11-15 | Inst Genetics Llc | Bmp-5-derivate |
JP3356775B2 (ja) | 1990-11-30 | 2002-12-16 | セルトリックス ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | TGF―βとの共同的組合せによる骨修復のための骨形成タンパク質の使用 |
US5208219A (en) | 1991-02-14 | 1993-05-04 | Celtrix Pharmaceuticals Inc. | Method for inducing bone growth |
US6162896A (en) | 1991-05-10 | 2000-12-19 | The Salk Institute For Biological Studies | Recombinant vertebrate activin receptors |
CA2102808A1 (en) | 1991-05-10 | 1992-11-11 | Hanne Bentz | Targeted delivery of bone growth factors |
AU652472B2 (en) | 1991-06-25 | 1994-08-25 | Genetics Institute, Llc | BMP-9 compositions |
WO1993000431A1 (en) * | 1991-06-27 | 1993-01-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Ctl4a receptor, fusion proteins containing it and uses thereof |
US5171579A (en) * | 1991-10-11 | 1992-12-15 | Genetics Institute, Inc. | Formulations of blood clot-polymer matrix for delivery of osteogenic proteins |
ATE238417T1 (de) | 1991-11-04 | 2003-05-15 | Inst Genetics Llc | Rekombinante knochenmorphogenetische protein heterodimere, zusammensetzungen und verfahren zur verwendung |
DK0653942T3 (da) | 1992-07-31 | 2003-10-20 | Curis Inc | Morphogen-induceret nerve-regenerering og -reparation |
US20030074680A1 (en) * | 1993-03-19 | 2003-04-17 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor-8 |
US6673534B1 (en) * | 1995-10-26 | 2004-01-06 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods for detection of mutations in myostatin variants |
US6465239B1 (en) * | 1993-03-19 | 2002-10-15 | The John Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptides from aquatic species and non-human transgenic aquatic species |
US5994618A (en) | 1997-02-05 | 1999-11-30 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor-8 transgenic mice |
US6607884B1 (en) * | 1993-03-19 | 2003-08-19 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods of detecting growth differentiation factor-8 |
EP0690873B1 (en) | 1993-03-19 | 2003-06-11 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor-8 |
US7393682B1 (en) * | 1993-03-19 | 2008-07-01 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides |
KR100227406B1 (ko) | 1993-05-12 | 1999-12-01 | 브루스 엠. 에이센 | Bmp-11 조성물 |
KR100329409B1 (ko) | 1993-08-26 | 2002-03-20 | 브루스 엠. 에이센, 토마스 제이 데스로저 | 인간 골 형태발생 단백질을 사용한 신경 재생법 |
US7332575B2 (en) * | 1994-03-18 | 2008-02-19 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptide from aquatic species, and transgenic aquatic species |
WO1996001845A1 (en) | 1994-07-08 | 1996-01-25 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor-11 |
US6008434A (en) | 1994-07-08 | 1999-12-28 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor-11 transgenic mice |
US5466190A (en) * | 1994-07-25 | 1995-11-14 | Deere & Company | Precleaner for a cleaning shoe |
US5545616A (en) * | 1994-09-22 | 1996-08-13 | Genentech, Inc. | Method for predicting and/or preventing preterm labor |
JPH10262688A (ja) * | 1994-11-30 | 1998-10-06 | Univ Rockefeller | 体重のモジュレーター、対応する核酸およびタンパク質、ならびにそれらの診断および治療用途 |
US5723125A (en) * | 1995-12-28 | 1998-03-03 | Tanox Biosystems, Inc. | Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide |
EP1364655B1 (en) | 1996-03-22 | 2010-12-29 | Stryker Corporation | Method for enhancing functional recovery of motor coordination, speech or sensory perception after central nervous system ischemia or trauma |
US6696557B1 (en) * | 1996-04-19 | 2004-02-24 | Genentech, Inc. | AL-2 neurotrophic factor nucleic acid |
PE99498A1 (es) * | 1996-07-26 | 1999-01-21 | Novartis Ag | Polipeptidos de fusion |
AU6274298A (en) | 1997-02-05 | 1998-08-25 | Johns Hopkins University School Of Medicine, The | Growth differentiation factor-8 |
WO1999002667A1 (en) * | 1997-07-14 | 1999-01-21 | University Of Liege | Mutations in the myostation gene cause double-muscling in mammals |
US6891082B2 (en) * | 1997-08-01 | 2005-05-10 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor |
US6696260B1 (en) | 1997-08-01 | 2004-02-24 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods to identify growth differentiation factor (GDF) binding proteins |
US6656475B1 (en) | 1997-08-01 | 2003-12-02 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same |
WO1999006559A1 (en) | 1997-08-01 | 1999-02-11 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods to identify growth differentiation factor (gdf) receptors |
US6396201B1 (en) * | 1997-08-19 | 2002-05-28 | Miyota Co., Ltd. | Piezoelectric vibrator |
AU8921698A (en) | 1997-08-29 | 1999-03-16 | Human Genome Sciences, Inc. | Follistatin-3 |
AU1276399A (en) * | 1997-11-07 | 1999-05-31 | Genetics Institute Inc. | Neuronal uses of bmp-11 |
WO1999024618A1 (en) | 1997-11-10 | 1999-05-20 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods for detection of mutations in myostatin variants |
WO1999040181A1 (en) | 1998-02-05 | 1999-08-12 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor-8 |
US6369201B1 (en) | 1998-02-19 | 2002-04-09 | Metamorphix International, Inc. | Myostatin multimers |
US6004937A (en) | 1998-03-09 | 1999-12-21 | Genetics Institute, Inc. | Use of follistatin to modulate growth and differentiation factor 8 [GDF-8] and bone morphogenic protein 11 [BMP-11] |
ES2330062T3 (es) | 1998-05-06 | 2009-12-03 | Metamorphix, Inc. | Procedimientos para tratar la diabetes por inhibicion de gdf-8. |
US6660499B1 (en) * | 1998-08-20 | 2003-12-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | DCR5, a BMP-binding protein, and applications thereof |
JP2003517580A (ja) * | 1999-01-21 | 2003-05-27 | メタモーフイクス・インコーポレーテツド | 増殖分化因子インヒビター及びそれらの用途 |
WO2000073337A1 (en) * | 1999-06-01 | 2000-12-07 | Biogen, Inc. | Polymer conjugates of hedgehog proteins and uses |
CA2379852A1 (en) | 1999-07-20 | 2001-01-25 | Pharmexa A/S | Method for down-regulating gdf-8 activity |
WO2001064888A2 (en) | 2000-02-29 | 2001-09-07 | Zymogenetics, Inc. | Kunitz domain polypeptide zkun8 |
US7037501B2 (en) * | 2001-01-04 | 2006-05-02 | Regents Of The University Of Minnesota | Myostatin immnoconjugate |
TWI329129B (en) | 2001-02-08 | 2010-08-21 | Wyeth Corp | Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof |
US7320789B2 (en) | 2001-09-26 | 2008-01-22 | Wyeth | Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof |
PL350983A1 (en) * | 2001-11-30 | 2003-06-02 | Advanced Digital Broadcast Ltd | Method of scanning a high-frequency signal band and apparatus therefor |
KR20040096592A (ko) | 2002-02-21 | 2004-11-16 | 와이어쓰 | 폴리스타틴 도메인을 포함하는 단백질 |
IL163525A0 (en) | 2002-02-21 | 2005-12-18 | Wyeth Corp | A follistatin domain containing protein |
CA2498044A1 (en) | 2002-09-16 | 2004-03-25 | Wyeth | Metalloprotease activation of myostatin, and methods of modulating myostatin activity |
US7261893B2 (en) | 2002-10-22 | 2007-08-28 | Wyeth | Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor |
US20040223966A1 (en) | 2002-10-25 | 2004-11-11 | Wolfman Neil M. | ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor |
PT1581649E (pt) | 2002-12-20 | 2011-04-13 | Amgen Inc | Agentes de ligação que inibem a miostatina |
BRPI0410927A (pt) | 2003-06-02 | 2006-06-27 | Wyeth Corp | métodos terapêuticos e profiláticos para distúrbios neuromusculares |
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