JP2022514778A - 筋膜損傷の予防および治療におけるアネキシンの使用 - Google Patents

筋膜損傷の予防および治療におけるアネキシンの使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、アネキシンタンパク質の活性を増加させて、それを必要とする患者の細胞膜損傷を治療するための組成物および方法を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／７８３，６１９号および２０１９年９月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／９０３，５２５号の米国特許法第１１９条（ｅ）下の優先権の利益を主張し、それらの各々は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
政府の利益に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成番号Ｕ５４ ＡＲ０５２６４６およびＲ０１ ＮＳ０４７７２６の下で米国政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明におけるある特定の権利を有する。
電子的に提出された資料の参照による組込み
この出願には、本開示の別の部分として、コンピュータ読み取り可能な形式の配列表（ファイル名：２０１８－１１９Ｒ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ：１６８，８２６バイト；作成日：２０１９年１２月２０日）が含まれる。
原形質膜の修復は、膜の破壊後に起こり、高度に保存されたプロセスである。膜破壊の再封鎖に必要な活発なプロセスは、Ｃａ2+依存性の小胞融合および局所的な細胞骨格リモデリングに依存していると考えられている（ＭｃＮｅｉｌ ａｎｄ Ｋｈａｋｅｅ，１９９２；ＭｃＮｅｉｌ ａｎｄ Ｋｉｒｃｈｈａｕｓｅｎ，２００５）。他のモデルは、膜修復がリソソーム小胞の融合および／または損傷部位への膜の横方向拡散によって媒介されることを示唆している（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ、ＭｃＤａｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。これらのモデルは相互に排他的ではなく、損傷の種類および程度によって異なる場合がある。骨格筋は、修復タンパク質をコードする遺伝子の変異が筋肉疾患を引き起こすため、原形質膜修復に大きく依存している（Ｂａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，２００３、Ｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｄｅｆｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ，２０１６、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
アネキシンは、脂質結合、細胞骨格の再編成、およびブレブ形成、膜修復に必要なステップを調節するＣａ2+結合タンパク質である（Ｂｉｚｚａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｂｏｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｂｏｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｇｒｅｗａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｊｉｍｅｎｅｚ ａｎｄ Ｐｅｒｅｚ，２０１７、Ｌａｕｒｉｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。個々のアネキシン反復ドメインは、独自のアネキシン特異的ＩＩ型またはＩＩＩ型結合部位と、Ｃａ2+結合を配位結合させる。ＩＩ型およびＩＩＩ型結合部位のＣａ2+親和性の差異により、各アネキシンは、細胞内Ｃａ2+レベルおよびリン脂質結合の範囲に応答する独自の能力を有する（Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ ａｎｄ Ｅｒｎｓｔ，１９９０）。アネキシンは、自己オリゴマー化およびヘテロオリゴマー化する能力を有する（Ｚａｋｓ ａｎｄ Ｃｒｅｕｔｚ，１９９１）。Ａ１およびＡ２のような典型的なアネキシンには、４つのアネキシン反復ドメインで構成される１つのアネキシンコアが含まれている。対照的に、アネキシンＡ６には２つのアネキシンコアが含まれているため、８つのアネキシン反復ドメインが含まれている（Ｂｅｎｚ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。アネキシンＡ６の複製構造により、アミノ末端およびカルボキシル末端のアネキシンコアドメインが１つまたは２つの別個の膜に結合することが可能になり、アネキシンＡ６は、膜修復中に必要な膜の合体および折り畳みを促進するための主要なターゲットになる（Ｂｏｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｂｏｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｂｕｚｈｙｎｓｋｙｙ ｅｔ ａｌ．，２００９）。
アネキシンは、筋鞘が高度に濃縮されているホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、およびコレステロールに対して高い親和性を有する（Ｆｉｅｈｎ ｅｔ ａｌ．，１９７１、Ｇｅｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。複数のアネキシンが骨格筋、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞、ヒト栄養芽細胞、およびＨｅＬａ癌細胞の膜修復に関与しており、これは、保存されたメカニズムを示唆している（Ｂａｂｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｂｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｃａｒｍｅｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ、Ｌｅｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３、ＭｃＮｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｒｏｏｓｔａｌｕ ａｎｄ Ｓｔｒａｈｌｅ，２０１２）。アネキシンは、損傷した膜に順次動員され、膜病変で高分子修復複合体を形成する（Ｂｏｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ、Ｒｏｏｓｔａｌｕ ａｎｄ Ｓｔｒａｈｌｅ，２０１２）。
原形質膜を修復する細胞の能力の欠陥は、筋ジストロフィーおよび細胞死をもたらす他の病的状態を含む多くの病気につながる。膜損傷は、乱用、外傷、火傷、化学物質への曝露、慢性疾患などの事象から生じる可能性がある。現在、膜の損傷を予防または治療する薬剤はない（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ，２０１６）。アネキシンは、膜脂質に対して高い親和性を有するカルシウム結合タンパク質である。アネキシンは、筋肉、栄養芽細胞、ＨｅＬａ細胞、および卵母細胞を含む多くの細胞の種類での膜修復に関与しており、これは、アネキシンの広範な役割を示唆している（Ｂａｂｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｂｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｃａｒｍｅｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ、ＭｃＮｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｒｏｏｓｔａｌｕ ａｎｄ Ｓｔｒａｈｌｅ，２０１２）。アネキシンＡ１（「Ａ１」）、アネキシンＡ２（「Ａ２」）、アネキシンＡ５（「Ａ５」）、およびアネキシンＡ６（「Ａ６」）は、損傷部位に順次動員され、大きな修復複合体を形成する（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ、Ｒｏｏｓｔａｌｕ ａｎｄ Ｓｔｒａｈｌｅ，２０１２）。アネキシンＡ６の短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍ）を作製するＡｎｘａ６の多型が特定された（Ｓｗａｇｇａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。短縮型アネキシンＡ６の発現はドミナントネガティブに作用し、アネキシン修復複合体の形成を減少させた。これは、膜修復障害およびより重篤な筋肉疾患と相関していた（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６ａ、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ、Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７ｂ、Ｓｗａｇｇａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。逆に、アネキシンＡ６の過剰発現は、修復を改善し、膜損傷に対する感受性を低下させるのに十分であった（Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７ａ）。さらに、組換えアネキシンＡ６による治療は、細胞ベースの研究および動物全体の研究において筋肉の損傷を軽減するのに十分であった。
本開示の一態様は、細胞膜損傷を治療する方法であって、アネキシンタンパク質の活性を増加させる薬剤を含む治療有効量の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、細胞膜損傷を治療する方法に関する。本開示の別の態様は、発症を遅らせる、細胞膜損傷からの回復を増強する、または細胞膜損傷を予防する方法であって、アネキシンタンパク質の活性を増加させる薬剤を含む治療有効量の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法に関する。薬剤が、組換えタンパク質、ステロイド、およびアネキシンタンパク質を発現することができるポリヌクレオチドからなる群から選択される、これらの態様のそれぞれの実施形態が企図される。いくつかの実施形態において、ステロイドは、コルチコステロイドまたはグルココルチコイドである。いくつかの実施形態において、組換えタンパク質は、アネキシンタンパク質である。いくつかの実施形態において、アネキシンタンパク質は、アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）である。いくつかの実施形態において、組換えタンパク質は、野生型アネキシンタンパク質、修飾アネキシンタンパク質、アネキシン様タンパク質、または野生型アネキシンタンパク質もしくはアネキシン様タンパク質の断片である。いくつかの実施形態において、修飾アネキシンタンパク質は、アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）である。いくつかの実施形態において、患者は急性損傷に罹患している。いくつかの実施形態において、急性損傷は、手術、火傷、毒素、化学物質、放射線誘発損傷、急性心筋損傷、急性筋肉損傷、急性肺損傷、急性上皮損傷、急性表皮損傷、急性腎臓損傷、急性肝臓損傷、血管損傷、過度の機械的力（ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆｏｒｃｅ）、または外傷に起因する。いくつかの実施形態において、患者は、慢性障害に罹患している。いくつかの実施形態において、患者は、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型（Ｅｍｅｒｙ－Ｄｒｅｉｆｕｓｓ）筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、眼球咽頭型筋ジストロフィー、遠位筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、肺線維症、筋萎縮、脳性麻痺、上皮障害、表皮障害、腎臓障害、肝臓障害、サルコペニア、または心筋症（肥大型、拡張型、先天性、不整脈原性、拘束性、虚血性、心不全）などの慢性疾患に罹患している。いくつかの実施形態において、心筋症は、肥大型、拡張型、先天性、不整脈原性、拘束性、虚血性、または心不全である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、有効量の第２の薬剤を投与することをさらに含み、第２の薬剤は、ミツグミン（ｍｉｔｓｕｇｕｍｉｎ）５３（ＭＧ５３）、潜在型ＴＧＦ－β結合タンパク質４（ＬＴＢＰ４）のモジュレーター、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）活性のモジュレーター、アンドロゲン応答のモジュレーター、炎症応答のモジュレーター、筋成長のプロモーター、化学療法剤、線維症のモジュレーター、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ナノ粒子と結合している。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ベクターに含有される。いくつかの実施形態において、ベクターは、葉緑体内にある。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、組換えＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ７４であり、ＡＡＶ７４ベクターがＡＡＶｒｈ７４である実施形態を含む。
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、組成物は、アネキシンＡ１（配列番号１）、アネキシンＡ２（配列番号２もしくは配列番号３）、アネキシンＡ３（配列番号４）、アネキシンＡ４（配列番号５）、アネキシンＡ５（配列番号６）、アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、もしくはそれらの組み合わせ）、アネキシンＡ７（配列番号９もしくは配列番号１０）、アネキシンＡ８（配列番号１１もしくは配列番号１２）、アネキシンＡ９（配列番号１３）、アネキシンＡ１０（配列番号１４）、アネキシンＡ１１（配列番号１５もしくは配列番号１６）、アネキシンＡ１３（配列番号１７もしくは配列番号１８）、またはそれらの組み合わせの活性を増加させる。いくつかの実施形態において、組成物は、アネキシンＡ１（配列番号１）、アネキシンＡ２（配列番号２または配列番号３）、およびアネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）の活性を増加させる）。いくつかの実施形態において、組成物は、アネキシンＡ２（配列番号２または配列番号３）およびアネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）の活性を増加させる。いくつかの実施形態において、組成物は、アネキシンＡ１（配列番号１）およびアネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）の活性を増加させる。いくつかの実施形態において、組成物は、アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）の活性を増加させる。本開示の態様または実施形態のうちのいずれかにおいて、本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて使用するための組成物は、本明細書に開示される薬学的組成物である。
いくつかの態様において、本開示は、修飾アネキシンタンパク質、ならびに薬学的に許容される担体、緩衝液、および／または希釈剤を含む、薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、アネキシンタンパク質、ならびに薬学的に許容される担体、緩衝液、および／または希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、アネキシンタンパク質または修飾アネキシンタンパク質は、アネキシンＡ１（配列番号１）、アネキシンＡ２（配列番号２もしくは配列番号３）、アネキシンＡ３（配列番号４）、アネキシンＡ４（配列番号５）、アネキシンＡ５（配列番号６）、アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、もしくはそれらの組み合わせ）、アネキシンＡ７（配列番号９もしくは配列番号１０）、アネキシンＡ８（配列番号１１もしくは配列番号１２）、アネキシンＡ９（配列番号１３）、アネキシンＡ１０（配列番号１４）、アネキシンＡ１１（配列番号１５もしくは配列番号１６）、アネキシンＡ１３（配列番号１７もしくは配列番号１８）、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、アネキシンタンパク質または修飾アネキシンタンパク質は、アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）である。さらなる実施形態において、薬学的組成物は、アネキシンＡ１（配列番号１）、アネキシンＡ２（配列番号２または配列番号３）、およびアネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、アネキシンＡ２（配列番号２または配列番号３）およびアネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）を含む。さらなる実施形態において、薬学的組成物は、アネキシンＡ１（配列番号１）およびアネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、ステロイドをさらに含む。さらなる実施形態において、ステロイドは、コルチコステロイドまたはグルココルチコイドである。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、有効量の第２の薬剤を投与することをさらに含み、第２の薬剤は、ミツグミン５３（ＭＧ５３）、潜在型ＴＧＦ－β結合タンパク質４（ＬＴＢＰ４）のモジュレーター、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）活性のモジュレーター、アンドロゲン応答のモジュレーター、炎症応答のモジュレーター、筋成長のプロモーター、化学療法剤、線維症のモジュレーター、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。さらなる実施形態において、組成物中のアネキシンタンパク質の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、およびイムノブロット分析を含むがこれらに限定されない標準放出アッセイによって測定される場合、約９０％以上である。いくつかの実施形態において、組成物は、Ａ２８０アネキシンタンパク質のミリグラムあたり約０．５００００エンドトキシン単位（ＥＵ／ｍｇ）未満であるエンドトキシンレベルを有する。いくつかの実施形態において、修飾アネキシンタンパク質は、原核細胞中で産生される。
いくつかの態様において、本開示は、修飾アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）、ならびに薬学的に許容される担体、緩衝液、および／または希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）、ならびに薬学的に許容される担体、緩衝液、および／または希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、アネキシンＡ１（配列番号１）およびアネキシンＡ２（配列番号２または配列番号３）をさらに含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、アネキシンＡ２（配列番号２または配列番号３）をさらに含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、アネキシンＡ１（配列番号１）をさらに含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、ステロイドをさらに含む。さらなる実施形態において、ステロイドは、コルチコステロイドまたはグルココルチコイドである。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、有効量の第２の薬剤を投与することをさらに含み、第２の薬剤は、ミツグミン５３（ＭＧ５３）、潜在型ＴＧＦ－β結合タンパク質４（ＬＴＢＰ４）のモジュレーター、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）活性のモジュレーター、アンドロゲン応答のモジュレーター、炎症応答のモジュレーター、筋成長のプロモーター、化学療法剤、線維症のモジュレーター、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、組成物中のアネキシンタンパク質の純度は、標準放出アッセイによって測定される場合、約９０％以上である。いくつかの実施形態において、組成物は、ミリグラムあたり約０．５００００エンドトキシン単位（ＥＵ／ｍｇ）未満であるエンドトキシンレベルを有する。いくつかの実施形態において、修飾アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）は、原核細胞中で産生される。
本開示の他の特徴および利点は、図および例を含む以下の詳細な説明を参照することにより、よりよく理解されるであろう。
本特許または本出願ファイルには、カラーで制作された図面が少なくとも１つ含まれる。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、要請および必要な料金の支払いに応じて、米国特許商標庁により提供される。
Ｃａ2+ダイナミクスが損傷部位でのアネキシン修復キャップの動員に影響を与えたことを示している。Ｃａ2+インジケータＧＣａＭＰ５Ｇを発現する筋線維を生成し、タイムラプスシングルスライス画像を膜破壊後の時点で評価した。Ａ）ＧＣａＭＰ５Ｇ蛍光が、２秒で損傷部位に存在し、これは、損傷部位での損傷直後にＣａ2+が存在したことを示している。Ｂ）ＧＣａＭＰ５ＧおよびアネキシンＡ６－ｔｄＴｏｍａｔｏを共エレクトロポレーションした筋線維のタイムラプス画像。ＧＣａＭＰ５Ｇ蛍光が、アネキシンＡ６フリーゾーン（矢じり）の周囲に局在する損傷部位およびアネキシンＡ６キャップ（矢印）に存在した。ＧＣａＭＰ５Ｇは、アネキシンＡ６修復キャップと共局在した（マージ、矢印）。スケールバー５μｍ。Ｃ）蛍光標識されたアネキシンＡ１、Ａ２、またはＡ６を発現する筋線維に、複数のＣａ2+濃度で損傷を与えた。アネキシンＡ１およびＡ６修復キャップのサイズは、２ｍＭおよび０．５ｍＭと比較して０．１ｍＭのＣａ2+で減少した。アネキシンＡ２修復キャップ面積は、２ｍＭ、０．５ｍＭ、および０．１ｍＭのＣａ2+と比較して、０．０５ｍＭのＣａ2+で大幅に減少した。Ｄ）キャップ動態は、Ｃａ2+濃度の範囲にわたるキャップのフェレット直径としてプロットした。アネキシンＡ２は、Ｋｍ1/2で統計的に有意な左方向へのシフトがあり、次にアネキシンＡ６、次にＡ１が続いた。スケール５μｍ。 アネキシンの複数のＣａ2+結合部位のドメインモデリングを示している。アネキシンは通常、８つのアネキシンドメインを有するように複製されたアネキシンＡ６を除いて、４つのアネキシンドメインを含む。アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６は、複数のＣａ2+イオンを配位結合させ、各リボン図の上部に面して配置された凸面上の膜に結合する。アネキシンＡ１におけるＤ１７１残基およびアネキシンＡ２におけるＤ１６１残基は、Ｃａ2+結合を配位結合させるために必要な残基として以前に記載されていた（Ｊｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。Ｄ１７１およびＤ１６１はいずれも、アネキシンＡ１およびＡ２それぞれにおける２番目の（黄色の）アネキシンドメインに局在する。アネキシンＡ６の前半分に入るアネキシンＡ６のオーソロガス残基Ｄ１４９が、ウシＡ６においてＣａ2+を配位結合させることは観察されなかった（Ａｖｉｌａ－Ｓａｋａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。この研究では、アネキシンＡ６おいて、Ｅ２３３と同様にＤ１４９を調べた。これらは、それぞれ２番目および３番目のアネキシンドメインに分類される。 Ａ）修復キャップのＺスタックイメージングの最大投影（左）。回転させたＺスタック投影（右）。キャップサイズは、白い点線で表された中央のｚスタック２Ｄ画像から測定する。Ｂ）野生型アネキシン－ｔｄＴｏｍａｔｏおよび野生型アネキシン－ｔｕｒｂｏＧＦＰを筋線維に共エレクトロポレーションした。キャップサイズは、赤と緑の両方のチャネルにおいて評価した。蛍光タグの種類は、キャップサイズに影響しなかった。データは、平均±ＳＥＭとして表す。差異は、両側ｔ検定によって試験した（条件ごとにｎ≧１０本の線維）。 修復キャップ形成におけるアネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６の異なるＣａ2+感受性を示している。蛍光標識されたアネキシンＡ１、Ａ２、またはＡ６を発現する筋線維を、複数のＣａ2+濃度で損傷させた。Ａ＆Ｂ）アネキシンＡ１およびＡ６修復キャップのサイズは、Ｃａ2+濃度の減少と共に減少した。アネキシンＡ１およびＡ６修復キャップの面積および修復キャップの形成速度は、２ｍＭと比較して、０．５ｍＭのＣａ2+および０．１ｍＭで減少した。Ｃ）アネキシンＡ２修復キャップ面積は、２ｍＭ、０．５ｍμＭ、および０．１ｍＭのＣａ2+と比較して、０．０５ｍＭのＣａ2+で有意に減少した。アネキシンＡ２修復キャップの形成速度は、試験したＣａ2+濃度で同等であった。キャップが小さすぎて経時的に測定できないため、０．０５ｍＭ濃度からのデータはプロットされなかった。大きな矢印は、大きなキャップを示す。小さな矢印は、小さなキャップを示す。＊ｐ＜０．０５キャップ面積または時間、＃ｐ＜０．０５統計的に異なる勾配。スケールバー５μｍ。データは、平均±ＳＥＭとして表す。差異を、ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）の多重比較検定を使用した二元ＡＮＯＶＡによって試験した。＊ｐ＜０．０５キャップ面積または時間、＃ｐ＜０．０５統計的に異なる勾配（条件ごとにｎ＝４～７本の筋線維）。 Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ＋ＧａＳＰ共焦点およびＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ ＭＰ＋多光子共焦点上での筋線維のレーザー損傷が、膜損傷部位にて同等のアネキシンＡ６－ＧＦＰ修復キャップ（矢じり）を誘発したことを示している。スケール５μｍ。条件ごとにｎ≧３匹のマウスからの筋線維。 アネキシンの発現が筋線維修復部位からのブレブの放出を促進したことを示している。ｔｄＴｏｍａｔｏ標識アネキシンＡ１、アネキシンＡ２、またはアネキシンＡ６の有無にかかわらず、筋線維にＣａ2+インジケータＧＣａＭＰ５Ｇをエレクトロポレーションした。Ｃａ2+面積および蛍光を、膜損傷後に評価した。Ａ）高倍率のｚ投影画像は、アネキシンＡ１、Ａ２、またはＡ６が共発現したときに病変から放出されるＣａ2+インジケータで満たされた外部ブレブと、ＧＣａＭＰ５Ｇのみと比較した場合の、筋線維内のＣａ2+インジケータの対応する減少を示している。Ｂ）アネキシンＡ６またはＡ２の発現により、ＧＣａＭＰ５Ｇ陽性ブレブの数が増加した。Ｃ）アネキシンＡ６の発現により、最も大きなＧＣａＭＰ５Ｇ陽性ブレブが形成された。＊ｐ＜０．０５。（条件ごとにｎ≧３匹のマウスからの筋線維）。 アネキシンの発現が筋線維内のＣａ2+を減少させたことを示している。ｔｄＴｏｍａｔｏ標識アネキシンＡ１、アネキシンＡ２、またはアネキシンＡ６の有無にかかわらず、筋線維にＣａ2+インジケータＧＣａＭＰ５Ｇをエレクトロポレーションした（アネキシンチャネルは図示せず）。Ｃａ2+面積および蛍光を、膜損傷後に評価した。Ａ）タイムラプスシングルスライス画像は、アネキシンＡ１、Ａ２、またはＡ６のいずれかの共発現により、損傷部位の筋線維内で測定されたＧＣａＭＰ５Ｇ蛍光が有意に減少したことを示している。Ｂ）アネキシンＡ１、Ａ２、またはＡ６のいずれかの発現により、２４０秒のイメージングにわたって損傷部位の筋線維内で測定されたＧＣａＭＰ５Ｇ蛍光が有意に減少し、アネキシンＡ６がＧＣａＭＰ５Ｇ蛍光の最大の減少を誘発した。Ｃ）アネキシンＡ２とＡ６の両方が、損傷後の最初の２０秒間のイメージングによって見られるように、ＧＣａＭＰ５Ｇ蛍光の早期減少に寄与した。Ｄ）初期のＧＣａＭＰ５Ｇは、蛍光が群間で有意差がないことを意味する。スケールバー５μｍ。＊ｐ＜０．０５。条件ごとにｎ≧３匹のマウスからの筋線維。データは、平均±ＳＥＭとして表す。差異は、ボンフェローニの多重比較検定を使用した二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（Ｂ、Ｃ）、またはテューキー（Ｔｕｋｅｙ）の多重比較検定を使用した一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（Ｄ）によって試験した。＊ｐ＜０．０５、（条件ごとにｎ≧３匹のマウスからのｎ≧９本の筋線維）。 アネキシンＡ６を過剰発現している筋線維では、ベースラインのＣａ2+が変化していないことを示している。アネキシンＡ６－ＧＦＰまたはビヒクル対照をエレクトロポレーションした筋線維。単離された筋線維にＩｎｄｏ－１ＡＭ色素をロードし、筋線維を刺激してＣａ2+サイクリングおよび細胞短縮を測定した。Ａ）８０Ｈｚでの代表的なＣａ2+移行。Ｂ＆Ｃ）安静時のＣａ2+レベルおよびピーク時のＣａ2+移行値は、アネキシンＡ６－ＧＦＰまたはビヒクル対照をエレクトロポレーションした筋線維間で変化しなかった。Ｄ）代表的な筋節長短縮のトレース。Ｅ＆Ｆ）安静時の筋節長およびピーク時の無負荷の筋節長の短縮は、処理群間で異ならなかった。条件ごとにｎ≧３匹のマウスからの筋線維。データは、平均±ＳＥＭとして表す。差異は、二元ＡＮＯＶＡ（Ａ、Ｄ）または両側ｔ検定（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）によって試験した（条件ごとにｎ≧３匹のマウスからのｎ≧３０本の筋線維）。 Ａ）最初のＩＩ型Ｃａ2+結合部位が、アネキシンＡ１およびＡ２では保存されているが、アネキシンＡ６では保存されていないことを示している。Ｂ）筋線維に野生型＋野生型または野生型＋変異体アネキシン構築物を共エレクトロポレーションし、筋鞘損傷後にキャップサイズを評価した。括弧は、筋線維で共発現されているが、チャネル内で視覚化されていないタンパク質を示し、共発現されたアネキシンへの影響を決定する。キャップ動態は、０～２ｍＭのＣａ2+濃度の範囲にわたるキャップのフェレット直径としてプロットした。Ａ６Ｄ１４９Ａではなく、変異体アネキシンＡ１Ｄ１７１ＡおよびＡ２Ｄ１６１Ａの発現が、共発現された野生型アネキシンキャップの最大直径（ＤＭＡＸ）を大幅に減少させるのに十分であった。Ｃ）アネキシンＡ１Ｄ１７１ＡおよびＡ２Ｄ１６１Ａの発現は、共発現されたアネキシンＡ６のキャップ面積を有意に減少させるのに十分ではなかったが、アネキシンＡ２Ｄ１６１Ａの結果にはその傾向があった。＃、＊ｐ＜０．０５、ｎｓ＝有意でない。条件ごとにｎ≧３匹のマウスからの筋線維。データは、平均±ＳＥＭとして表す。差異は、ボンフェローニの多重比較検定（Ｂ）または両側ｔ検定（Ｃ）を使用した二元ＡＮＯＶＡによって試験した。＊ｐ＜０．０５＃、ｎｓ＝有意でない（条件ごとにｎ≧３匹のマウスからのｎ≧５本の筋線維）。 アネキシンＡ６のＣａ2+結合変異体が、アネキシン修復キャップの動員を減少させ、筋線維膜修復能力を低下させたことを示している。Ａ）筋線維に、野生型－ｔｄＴｏｍａｔｏおよび野生型－ＧＦＰまたは変異体－ＧＦＰアネキシン構築物のいずれかを共エレクトロポレーションした。キャップサイズは膜損傷後に評価し、野生型アネキシンへの影響を実証するために赤いチャネルのみが示されている。Ｂ）変異体アネキシンＡ６Ｅ２３３Ａの共発現は、野生型アネキシンＡ６のキャップアセンブリを減少させるのに十分であった。キャップ動態は、０～２ｍＭのＣａ2+濃度の範囲にわたるキャップのフェレット直径としてプロットした。Ｃ）アネキシンＡ６Ｅ２３３Ａの共発現は、共発現されたアネキシンＡ１、Ａ２およびＡ６のキャップ面積を有意に減少させるのに十分であった。＊ｐ＜０．０５ＷＴ（ＷＴ）対ＷＴ（ＭＵＴ）。Ｄ）筋線維にアネキシンＡ６－ＧＦＰまたは変異体Ａ６Ｅ２３３Ａ－ＧＦＰをエレクトロポレーションした。アネキシンＡ６Ｅ２３３Ａのキャップ面積は、アネキシンＡ６（大きな矢じり）と比較して有意に小さく（小さな矢印）、ＦＭ４－６４蛍光面積の増加（大きな矢じり）と相関している。スケールバー５μｍ。＊ｐ＜０．０５。条件ごとにｎ≧３匹のマウスからの筋線維。データは、平均±ＳＥＭとして表す。差異は、両側ｔ検定（Ａ、Ｃ、Ｄ）によって試験した。＊ｐ＜０．０５（条件ごとにｎ≧３匹のマウスからのｎ＝４～１８本の筋線維）。 アネキシンＡ６が筋線維膜修復能力を強化したことを示している。Ａ）野生型筋線維におけるアネキシンＡ６の過剰発現により、対照筋線維と比較して、レーザー誘発損傷後の、膜損傷マーカーであるＦＭ４－６４色素の取り込みが減少した。Ｂ）細胞外組換えアネキシンＡ６（ｒＡＮＸＡ６）の存在下で損傷した野生型筋線維は、対照筋線維よりもＦＭ４－６４色素の取り込みが有意に少なかった。Ｃ）免疫蛍光顕微鏡で視覚化された、全身注射の６時間後にｍｄｘ／ｈＬＴＢＰ４筋線維の原形質膜に局在するＣ末端ＨＩＳタグを有するｒＡＮＸＡ６。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注射したマウスの対照筋肉では、抗ＨＩＳ染色は見られなかった。Ｄ）細胞外ｒＡＮＸＡ６の存在下で損傷したｍｄｘ／ｈＬＴＢＰ４筋線維は、ＦＭ４－６４蛍光のＩｍａｒｉｓ表面レンダリングによって示される対照筋線維よりも、ＦＭ４－６４色素の取り込み（体積）が有意に少なかった。スケールバー５μｍ（Ａ、Ｂ、Ｄ）。スケールバー１ｍｍ（Ｃ）。＊ｐ＜０．０５。（条件ごとにｎ≧３匹のマウスからの筋線維）。 組換えアネキシンＡ６（ｒＡＮＸＡ６）の筋肉内注射が、インビボでの筋肉損傷から保護したことを示している。Ａ）野生型マウスの前脛骨筋にｒＡＮＸＡ６または対照溶液を事前に注射し、次に心臓毒で損傷を与えて筋肉損傷を誘発した。Ｂ）グロスイメージングは、反対側の対照筋肉と比較して、ｒＡＮＸＡ６で前処理した筋肉では色素取り込みが減少したことを明らかにした。Ｃ）免疫蛍光イメージングは、ｒＡＮＸＡ６で前処理した筋肉では色素取り込みが減少したことを明らかにした。色素取り込みの表面プロットは、ｒＡＮＸＡ６で前処理した筋肉で蛍光が減少したことを示している。白い点線は、筋切片の輪郭を示している。Ｄ）ｒＡＮＸＡ６で前処理した筋肉は、対照筋肉と比較して、筋肉領域全体で色素蛍光が約５０％有意に減少した。スケール１ｍｍ。＊ｐ＞０．０５（条件ごとにｎ＝３匹のマウスから）。データは、平均±ＳＥＭとして表す。差異は、両側ｔ検定によって試験した。＊ｐ＜０．０５（条件ごとにｎ＝３匹のマウス）。 組換えアネキシンＡ６（ｒＡＮＸＡ６）の全身注射が、インビボでの筋肉損傷から保護したことを示している。Ａ）野生型マウスに、心臓毒誘発筋肉損傷の前（事前注射）または心臓毒誘発筋肉損傷後（損傷後）にｒＡＮＸＡ６または対照溶液を全身注射した。Ｂ～Ｃ）免疫蛍光イメージングは、ビヒクル対照と比較して、ｒＡＮＸＡ６で前処理または後処理した前脛骨筋における色素取り込みが有意に減少したことを明らかにした。白い点線は、筋切片の輪郭を示している。色素取り込みの表面プロットは、ｒＡＮＸＡ６で前処理した筋肉で蛍光が減少したことを示している。スケール１ｍｍ。＊ｐ＞０．０５（条件ごとにｎ≧３匹のマウス、ｎ≧６本の脚から）。 組換えアネキシンＡ６（ｒＡＮＸＡ６）の全身注射が、インビボでの慢性的な筋肉損傷から保護したことを示している。Ａ）肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ（ＬＧＭＤ２Ｃ）のモデルであるＳｇｃｇ欠損マウスに、ｒＡＮＸＡ６または対照溶液を３日ごとに合計１２日間注射した。Ｂ～Ｃ）次に、筋肉損傷の臨床的に検証された血清バイオマーカーであるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）および乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を評価した。ｒＡＮＸＡ６による処理は、対照と比較して血清ＣＫおよびＬＤＨを減少させ、これは、慢性的に損傷した筋組織の修復が強化されたことを示している。 膜損傷直後の目に見えるｐＨ変化がないことを示している。ｐＨ蛍光インジケータｐＨ Ｒｏｄｏ ＡＭの存在下で、筋線維にレーザー損傷を与えた。ｐＨは、損傷前（０秒）と損傷後（１０秒）では変化せず、Ｆ／Ｆ０平均＝０．９７として表され、値１は同じである。スケール５μｍ。 筋線維が修復された場合、アネキシン発現が部位からのブレブの放出を促進したことを示している。ｔｄＴｏｍａｔｏ標識アネキシンＡ１、アネキシンＡ２、またはアネキシンＡ６の有無にかかわらず、筋線維にＣａ2+インジケータＧＣａＭＰ５Ｇ（緑）をエレクトロポレーションした。Ｃａ2+面積および蛍光を、膜損傷後に評価した。（Ａ）高倍率のｚ投影画像は、アネキシンＡ１、Ａ２、またはＡ６が共発現したときに病変から発するＣａ2+インジケータで満たされた外部ブレブと、ＧＣａＭＰ５Ｇのみと比較した場合の、筋線維内のＣａ2+インジケータの対応する減少を示している（Ｂ）。（Ｂ）ＦＭ４－６４でマークした膜は、アネキシンの過剰発現の非存在下でＧＣａＭＰ５Ｇ陰性小胞が形成されることを示している。（Ｃ）アネキシンＡ６またはＡ２の発現により、ＧＣａＭＰ５Ｇ陽性ブレブの数が増加した。（Ｄ）アネキシンＡ６の発現により、最も大きなＧＣａＭＰ５Ｇ陽性ブレブが形成された。データは、平均±ＳＥＭとして表す。差異は、テューキーの多重比較検定を使用した一元ＡＮＯＶＡによって試験した。＊ｐ＜０．０５（条件ごとにｎ≧３匹のマウスからのｎ≧１６本の筋線維）。 アネキシンＡ６の発現により、その損傷部位でＦｌｕｏ－４ Ｃａ2+レベルが低下したことを示している。筋線維には、蛍光Ｃａ2+インジケータ色素Ｆｌｕｏ－４を事前ロードし、その後、共焦点レーザーで筋鞘に損傷を与えた。アネキシンＡ６を過剰発現する筋線維は、タンパク質ベースのＣａ2+インジケータＧＣａＭＰ５Ｇで得られた結果と同様に、対照筋線維と比較して、膜損傷部位での内部Ｆｌｕｏ－４のＣａ2+蛍光レベルが大幅に低下した。スケール５μｍ。データは、平均±ＳＥＭとして表す。差異は、ボンフェローニの多重比較検定を使用した二元ＡＮＯＶＡによって試験した。＊ｐ＜０．０５（条件ごとにｎ＝３匹のマウス、ｎ≧８本の筋線維）。 アネキシンＡ６が、インビトロで健康な筋線維およびジストロフィー筋線維の膜修復能力を高めたことを示している。（Ａ）野生型（ＷＴ）筋線維におけるアネキシンＡ６のプラスミド発現により、対照筋線維と比較して、レーザー誘発損傷後の、膜損傷マーカーであるＦＭ４－６４色素の取り込みが減少した。（Ｂ）細胞外組換えアネキシンＡ６（ｒＡＮＸＡ６）の存在下で損傷した野生型筋線維は、対照筋線維と比較して、ＦＭ４－６４色素の取り込みが有意に少なかった。（Ｃ）組換えアネキシンＡ６（ｒＡＮＸＡ６）の存在下で損傷したジストロフィー（Ｄｙｓ）筋線維は、対照筋線維よりもＦＭ４－６４色素の取り込みが有意に少なかった。スケール５μｍ。データは、平均±ＳＥＭとして表す。差異は、両側ｔ検定＊ｐ＜０．０５によって試験した（条件ごとにｎ≧３匹のマウスからのｎ≧１０本の筋線維）。 組換えアネキシンＡ６の保護効果のＣａ2+依存性を示している。ＡおよびＢ）野生型筋線維を単離し、膜損傷の蛍光マーカーであるＦＭ１－４３（緑）をロードした。筋線維を組換えアネキシンＡ６（ｒＡＮＸＡ６）で前処理した後、１ｍＭのＣａ2+溶液または０ｍＭのＣａ2+＋カルシウムキレート剤ＥＧＴＡで筋線維に損傷を与えた。ＦＭ１－４３の蛍光取り込みは、ＥＧＴＡが存在する場合と比較して、１ｍＭのＣａ2+で有意に減少した。スケール５μｍ。データは、平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定を使用した二元ＡＮＯＶＡによって差異を試験した。＊ｐ＜０．０５（条件ごとにｎ≧１０本の筋線維、条件ごとにｎ＝３匹のマウス）。 組換えアネキシンＡ６の眼窩後方注射を使用した全身送達が、インビボでの筋肉損傷から保護したことを示している。（Ａ）野生型マウスに組換えヒトアネキシンＡ６（ｒＡＮＸＡ６）または対照溶液を静脈内注射した。これに続いて、心臓毒（ＣＴＸ）で筋肉に損傷を与えた。（Ｂ～Ｃ）免疫蛍光イメージングは、ｒＡＮＸＡ６で前処理した筋肉では色素取り込み（赤）が約３８％少ないことを明らかにした。点線は、前脛骨筋の輪郭を示している（上パネル）。ＤＡＰＩ（青）は、核をマークする。色素取り込みの表面プロットは、ｒＡＮＸＡ６で前処理した筋肉で蛍光が減少したことを示している。（Ｄ）損傷した腓腹筋／ヒラメ筋の全組織分光分析は、ｒＡＮＸＡ６による前処理によって、対照筋肉と比較して、色素取り込みが５８％減少したことを明らかにした。（Ｅ）野生型マウスにｒＡＮＸＡ６または対照溶液を静脈内注射した。２時間後、心臓毒で前脛骨筋に損傷を与えた。損傷の７日後に筋肉を採取した。（Ｆ＆Ｇ）ヘマトキシリンおよびエオシン画像を定量化した。これらの画像は、対照と比較して、ｒＡＮＸＡ６処理マウスでは筋線維損傷率（点線）が減少したことを示している。Ｂ、スケール１ｍｍ。Ｆ、スケール５００μｍ。データは、平均±ＳＥＭとして表す。差異は、両側ｔ検定によって試験した。＊ｐ＜０．０５（Ｂ、Ｃ、Ｄは、条件ごとにｎ≧３匹のマウス、ｎ≧６本の脚；Ｆ、Ｇは、条件ごとにｎ≧６匹のマウス、ｎ≧１１本の筋肉）。 アネキシンＡ６のアミノ酸保存を示している。 組換えアネキシンＡ６が、筋ジストロフィーのマウスモデルにおいてインビボでの筋肉損傷から保護したことを示している。（Ａ～Ｂ）肢帯型筋ジストロフィー２ＣのモデルであるＳｇｃｇ欠損マウスに、組換えヒトアネキシンＡ６（ｒＡＮＸＡ６）またはＢＳＡ対照溶液を４８時間かけて５回静脈内注射した。注射の前に、血清ＣＫを測定した。５回目の注射の２時間後、マウスを６０分間の下り坂ランニングに供した。運動の３０分後、血清ＣＫを測定した。ランニング後／前のＣＫの倍率変化は、ＢＳＡを注射した対照と比較して、ｒＡＮＸＡ６投与で有意に減少し、急性ランニングによる筋肉損傷の減少と一致した。（Ｃ～Ｄ）Ｓｇｃｇ欠損マウスに、ｒＡＮＸＡ６または対照を３日ごとに１４日間にわたって静脈内注射した。１４日目に、血清クレアチンキナーゼを評価した。ｒＡＮＸＡ６で処理したＳｇｃｇ欠損マウスにおける血清ＣＫは、ＰＢＳ対照よりも低かった。（Ｅ）Ｓｇｃｇ欠損マウスに、ｒＡＮＸＡ６または組換えアネキシンＡ２を３日ごとに１４日間静脈内注射した。血清ＣＫの処理後／前倍数変化（１４日目／０日目）は、アネキシンＡ２と比較して組換えアネキシンＡ６で処理したＳｇｃｇ欠損マウスにおいて有意に減少した。（Ｆ）ＰＢＳまたは組換えアネキシンＡ６を注射した、パートＤに示されているＳｇｃｇ欠損マウスの腓腹筋／ヒラメ筋の組織学的分析。囲み領域の左側が低倍率、右側が高倍率。Ｆ、スケール５００μｍ（左）、スケール５０μｍ（右）。データは、平均±ＳＥＭとして表す。差異は、両側ｔ検定によって試験した（Ｂ＆Ｅ）。＊ｐ＜０．０５（パートＤを除き、条件ごとにｎ≧３匹のマウス）。 損傷部位でのＣａ2+依存性アネキシン修復キャップの動員を示している。Ｃａ2+インジケータＧＣａＭＰ５Ｇ（緑）を発現する筋線維を生成し、膜破壊後の時点でタイムラプスシングルスライス画像を評価した。（Ａ）ＧＣａＭＰ５Ｇ蛍光は、２秒で損傷部位に存在し（矢印）、これは、損傷部位での損傷直後にＣａ2+が存在したことを示している（上パネル）。これらのデータを、非タンパク質Ｃａ2+インジケータであるＦｌｕｏ－４ＡＭ（緑、下パネル）で検証した。（Ｂ）ＧＣａＭＰ５ＧおよびアネキシンＡ６－ｔｄＴｏｍａｔｏ（Ａ６、赤）を共エレクトロポレーションした筋線維のタイムラプス画像。ＧＣａＭＰ５Ｇ蛍光が、アネキシンＡ６フリーゾーン（矢じり）の周囲に局在する損傷部位およびアネキシンＡ６キャップ（矢印）に存在した。ＧＣａＭＰ５Ｇは、アネキシンＡ６修復キャップと共局在した（マージ、黄色、矢印）。スケールバー５μｍ。（Ｃ）蛍光標識されたアネキシンＡ１、Ａ２、またはＡ６を発現する筋線維に、複数のＣａ2+濃度で損傷を与えた。アネキシンＡ１およびＡ６修復キャップのサイズは、２ｍＭおよび０．５ｍＭと比較して０．１ｍＭのＣａ2+で減少した。アネキシンＡ２修復キャップ面積は、２ｍＭ、０．５ｍＭ、および０．１ｍＭのＣａ2+と比較して、０．０５ｍＭのＣａ2+で大幅に減少した。（Ｄ）キャップ動態は、Ｃａ2+濃度の範囲にわたるキャップのフェレット直径としてプロットした。アネキシンＡ２は、Ｋｍ1/2で統計的に有意な左方向へのシフトがあり、次にアネキシンＡ６、次にＡ１が続いた。スケール５μｍ。データは、平均±ＳＥＭとして表す。差異は、テューキーの多重比較検定（Ｃ）を使用した一元ＡＮＯＶＡによって試験した。＊ｐ＜０．０５（条件ごとにｎ≧５本の筋線維）。 遺伝的にコードされたアネキシンＡ６ＧＦＰがプレドニゾン曝露に応答することを示している。Ａ）マウスにおいて遺伝的にコードされたアネキシンＡ６ＧＦＰを生成するためのターゲティング戦略。Ｂ）マウスにプレドニゾン（ｐｒｅｄ）または対照（Ｃｔｒｌ）を腹腔内注射した。注射の２４時間後、筋線維を単離し、レーザー損傷に供した。アネキシンＡ６ＧＦＰ修復キャップのサイズは、プレドニゾンの投与を受けて減少し、この減少は、損傷に対する保護を示している。スケール５μｍ。＊ｐ＜０．０５。ｔ検定、治療あたりｎ≧３匹のマウス。 組換えアネキシンＡ６前処理が、遺伝的にコードされたアネキシンＡ６ＧＦＰキャップサイズおよび色素流入を減少させることを示しており、これは、損傷に対する保護が増強されていることを示している。筋線維を単離し、組換えアネキシンＡ６（ｒＡＮＡＸＡ６）で前処理し、その後レーザー誘発膜損傷に供した。Ｚスタックイメージングにより、組換えアネキシンＡ６の存在下でアネキシンＡ６ＧＦＰ修復キャップのサイズが減少したことが明らかになり、この減少は、損傷に対する保護を示している。これは、ｒＡＮＸＡ６の存在下での膜損傷マーカーであるＦＭ４－６４取り込みの減少と相関していた。スケール５μｍ。＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。治療あたりｎ≧３匹のマウス。 遺伝的にコードされたアネキシンＡ６ＧＦＰが心筋細胞の膜損傷部位に局在することを示している。成体の心筋細胞をＡｎｘａ６em1(GFP)マウスから単離し、その後、心筋細胞にレーザー損傷を与えた。アネキシンＡ６ＧＦＰ（緑）は、損傷部位の修復キャップ（白い矢印、左の画像）に局在する。点線で囲った領域を、右側に拡大している。タイムラプスイメージングは、Ａｎｘａ６em1(GFP)マウスから単離した成体心筋細胞において、アネキシンＡ６ＧＦＰが５０秒間のイメージングにわたって損傷部位の修復キャップ（白い矢印）に局在することを示している。５μｍまたは１０μｍのスケール。 アネキシンＡ６がインビトロでジストロフィーのジスフェリン欠損筋線維の膜修復能力を高め、損傷から保護したことを示している。Ａ）ジスフェリン欠損（Ｄｙｓｆ１２９）筋線維におけるアネキシンＡ６のプラスミド発現により、対照筋線維（矢じり）と比較して、レーザー誘発損傷後の、膜損傷マーカーであるＦＭ４－６４色素取り込み（小さな矢印）が減少した。Ｂ）組換えアネキシンＡ６による前処理により、ジスフェリン欠損（Ｄｙｓｆ１２９）筋線維のレーザー損傷後、対照（矢じり）と比較してＦＭ４－６４取り込み（小さな矢印）が減少した。スケール５μｍ。データは、平均±ＳＥＭとして表す。差異は両側ｔ検定によって試験した。＊ｐ＜０．０５（条件ごとにｎ≧９本の筋線維）。 組換えアネキシンＡ６が肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ筋肉のジストロフィー筋鞘に局在することを示している。カルボキシ末端ＨＩＳタグを有する組換えアネキシンＡ６（ｒＡＮＸＡ６）を、健康な野生型マウス、または慢性的な膜破壊を受ける肢帯型筋ジストロフィー２ＣのＳｇｃｇ欠損マウスモデルに注射した。マウスは、１２９Ｓｖ／ＥｍｓＪのバックグラウンドであった。抗ＨＩＳ蛍光強度は、野生型対照と比較して、抗ラミニン染色によって視覚化されたＳｇｃｇ欠損筋肉の原形質膜で増加した。ヘキスト標識核。 哺乳動物細胞において発現した組換えアネキシンＡ６タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左パネル）およびウエスタンブロット分析（中央および右パネル）の結果を示している。組換えアネキシンＡ６は、検出および精製の目的でＣ末端ＨＩＳエピトープタグを使用して作製されたため、中央パネルには抗ＨＩＳがブロットされている。右パネルは、Ａ６自体に対してブロットされた。 原核細胞において発現した組換えアネキシンＡ６タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（クーマシー染色）（左パネル）およびウエスタンブロット分析（中央および右パネル）の結果を示している。左および中央パネルのレーンには、Ｔ（合計）、Ｓ（可溶性）、およびＥ（溶出液）のラベルが付いている。右側パネルのレーンの内容は、左側および中央パネルのレーンの内容を反映している。中央パネルは、アネキシンＡ６についてブロットされている。組換えアネキシンＡ６は、精製目的でＣ末端ＨＩＳタグを使用して作製されたため、右パネルは抗ＨＩＳについてブロットされている。 パネルＡ、Ｂ、Ｃでは、Ｅ ｃｏｌｉまたは哺乳動物ＨＥＫ細胞で産生された細胞外組換えアネキシンＡ６（ｒＡＮＸＡ６）の存在下で損傷した野生型筋線維が、ＢＳＡ対照で処理した筋線維と比較してＦＭ４－６４色素取り込みが有意に少なかったことを示しており、膜損傷に対する保護およびｒＡＮＸＡ６処理による修復の強化を示している。（Ｂ＆Ｃ）膜修復に対するｒＡＮＸＡ６の有益な効果は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓを通じて商業的に入手した、または医薬品開発業務受託機関（ＣＲＯ、Ｅｖｏｔｅｃ ＳＥ）によって生産されたＥ ｃｏｌｉで産生されたｒＡＮＸＡ６と、哺乳動物のＨＥＫ細胞で産生されたｒＡＮＸＡ６タンパク質との間に、１３μｇ／ｍｌおよび１３０μｇ／ｍｌで有意差はなかった。スケール＝５μｍ。データは、平均±ＳＥＭとして表す。差異は、両側ｔ検定によって試験した。＊ｐ＜０．０５（条件ごとにｎ≧３匹のマウスからのｎ≧８本の筋線維）。 アミノ酸配列ＶＡＡＥＩＬ（配列番号４７）を欠くアネキシンＡ６が、筋膜損傷部位に局在することを示している。Ａ）アネキシンＡ６の構造を示す概略図。アミノ酸配列ＶＡＡＥＩＬは、アネキシン反復ドメイン７、エクソン２１に位置する。Ｂ）筋線維に、ＶＡＡＥＩＬ（配列番号４７）を欠くＧＦＰ標識アネキシンＡ６およびｔｄＴｏｍａｔｏ標識アネキシンＡ６をエレクトロポレーションした。高倍率画像は、ＶＡＡＥＩＬ（配列番号４７）配列を欠くアネキシンＡ６が、筋膜損傷部位の修復キャップにおいてアネキシンＡ６と部分的に共局在することを示している。
膜修復は、細胞の生存に不可欠であり、細胞の損傷を制限するための迅速かつ効率的なプロセスを必要とする。筋肉は、筋細胞の細長い形状および筋肉の収縮によって引き起こされる継続的なストレスのために、膜が破壊される傾向がある。膜関連タンパク質をコードする遺伝子の変異は、脆弱な膜を生成し、膜修復能力を低下させ、進行性の筋ジストロフィーを引き起こす。膜修復を増強し、膜損傷に対する感受性を低減するための本明細書に開示される治療法および方法は、急性損傷および慢性損傷の両方の状況において筋肉に利益をもたらすと考えられている。
本明細書で使用される場合、「アネキシンタンパク質の活性を増加させる」薬剤は、膜の完全性の回復を増強するカルシウム結合膜関連修復タンパク質としてのアネキシンタンパク質の特性を増加させる薬剤である。膜の完全性を回復するための増強は、アネキシンＡ１（配列番号１）、アネキシンＡ２（配列番号２または配列番号ＮＯ：３）、ＥＨＤ２、ジスフェリン、およびＭＧ５３などのタンパク質を含むがこれらに限定されない膜病変での高分子修復複合体の形成を促進することによる可能性がある。
本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療」という用語は、疾患もしくは感染症の病状のさらなる発症または変化を防ぐことを意図して行われる介入を指す。したがって、「治療」とは、治療処置（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）および予防的または予防措置の両方を指す。もちろん、「治療」が別個の用語「予防」の形態と共に使用される場合、「治療」は、疾患または状態の病状を変えるというより狭い意味を指すことが理解される。「予防する」とは、状態または疾患を持たない対象に対して講じられる予防措置を指す。治療薬は、疾患の病状を直接減少させるか、または別の治療薬または例えば、宿主自身の細胞膜修復システムによる治療に対して疾患をより感受性にする可能性がある。疾患の臨床的、生化学的、もしくは自覚的症状に罹患している患者の治療には、そのような症状のうちの１つもしくは複数を軽減すること、または疾患の素因を減らすことが含まれる場合がある。治療後の改善は、そのような症状のうちの１つ以上の減少または解消として現れる場合がある。
アネキシンタンパク質
アネキシンタンパク質ファミリーは、Ｃａ2+依存的にリン脂質とアクチンを結合する能力を特徴としている。アネキシンは、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、およびコレステロールに優先的に結合する（Ｇｅｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ヒトでは、アネキシン遺伝子の優性または劣性変異は筋肉疾患と関連していない。しかしながら、アネキシンＡ５の遺伝的バリアントは流産に関連している（ｄｅ Ｌａａｔ ｅｔ ａｌ．，２００６）。アネキシンファミリーは、６５を超える固有の種に存在する１６０を超える別個のタンパク質を含むことが知られている（Ｇｅｒｋｅ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，２００２）。ヒトは１２の異なるアネキシン遺伝子を持っており、別個の組織の発現および局在を特徴としている。アネキシンは、膜透過性、移動性、小胞融合、および膜屈曲など、さまざまな細胞プロセスに関与している。これらの特性は、Ｃａ2+に依存する。アネキシンにはＥＦハンドドメインは含まれていないが、カルシウムイオンは個々のアネキシン反復ドメインに結合する。異なるＣａ2+親和性により、各アネキシンタンパク質は、独自の時空間条件下で細胞内カルシウムレベルの変化に応答することができる（Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ ａｎｄ Ｅｒｎｓｔ，１９９０）。
構造的に、アネキシンファミリーのタンパク質には、複数のアネキシンリピートおよび可変アミノ末端ヘッドで構成される保存されたカルボキシ末端コアドメインが含まれている。アミノ末端は、アネキシンファミリーメンバー間で、長さおよびアミノ酸配列が異なる。さらに、翻訳後修飾は、タンパク質の機能およびタンパク質の局在を変化させる（Ｇｏｕｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２、Ｋａｅｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００１）。アネキシンタンパク質は、Ｃａ2+の存在下で自己オリゴマー化し、膜表面およびアクチンと相互作用する可能性がある（Ｚａｋｓ ａｎｄ Ｃｒｅｕｔｚ，１９９１、Ｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）、Ｊａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４））。アミノ末端領域は、Ｃａ2+依存的にアクチンまたは１つの脂質膜に結合すると考えられているが、アネキシンコア領域はさらなる脂質膜に結合する。
アネキシンは、小胞体を介した古典的な分泌のためにアネキシンを標的とする、予測される疎水性シグナル配列を含まないが、アネキシンは細胞の内部および外部のいずれにも見られる（Ｃｈｒｉｓｔｍａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１、Ｄｅｏｒａ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｗａｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。アネキシンが外在化されるプロセスは不明のままである。外在化の方法は細胞の種類によって異なり得るが、アネキシンはエキソサイトーシスまたは細胞溶解によって放出されると仮定されている。機能的には、細胞の内部および外部の両方に局在することで、組織および細胞の種類においてアネキシンが果たす役割の複雑さが増す。アネキシンＡ５は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に対する親和性が高いため、アポトーシスのマーカーとして一般的に使用されている。細胞死および細胞損傷の間、ＰＳは膜配向を内膜から外膜へと反転させ、細胞外からのアネキシン結合へのアクセスを提供する。アネキシンは、抗炎症作用、線維素溶解促進作用、および抗血栓作用を有することが示されている。アネキシンＡ１欠失マウスモデルは、チャレンジされると炎症応答の悪化を示し、グルココルチコイドの抗炎症作用に耐性がある（Ｈａｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。アネキシンＡ２欠損マウスは、微小血管系にフィブリンが蓄積し、動脈血栓の除去に欠陥がある（Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）。細胞外アネキシンの正確な機能についてはほとんど知られていないが、アネキシンの高発現レベルと疾患の臨床的重症度との間には強い相関関係があるため、アネキシンタンパク質の発現レベルは多くの疾患の診断マーカーとして機能する可能性がある（Ｃａｇｌｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
薬剤
いくつかの態様において、本開示は、細胞膜損傷を治療することを企図する本開示の方法であって、アネキシンタンパク質の活性を増加させる薬剤を含む治療有効量の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。さらなる態様において、発症を遅らせる、細胞膜損傷を予防する、または細胞膜損傷からの回復を増強する方法が提供され、この方法は、アネキシンタンパク質の活性を増加させる薬剤を含む治療有効量の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。「アネキシンタンパク質の活性を増加させる」とは、薬剤の投与により、本明細書に開示されるような１つ以上のアネキシンタンパク質の活性が全体的に増加する（すなわち、薬剤の投与によって得られる活性に加えて任意の内因性活性が増加する）ことを意味する。
本明細書で使用される場合、「薬剤」という用語は、組換えタンパク質（例えば、組換えアネキシンタンパク質）、ステロイド、アネキシンペプチド、およびアネキシンタンパク質を発現することができるポリヌクレオチドを指す。
タンパク質／組換えタンパク質
本開示の方法には、組換えタンパク質（例えば、１つ以上のアネキシンタンパク質）が、それを必要とする患者に治療有効量で投与される方法が含まれる。したがって、本開示の態様または実施形態のうちのいずれにおいても、アネキシンタンパク質の活性を増加させる薬剤は、組換えタンパク質（例えば、アネキシンタンパク質）である。本明細書中で使用する場合、「タンパク質」は、アミノ酸残基から構成されたポリマーを指す。本明細書で使用される場合、「アネキシンタンパク質」には、野生型アネキシンタンパク質、修飾アネキシンタンパク質、アネキシン様タンパク質、または断片、類似体、バリアント、融合物、もしくは模倣物（それぞれ本明細書に記載される）が含まれるが、これらに限定されない。「アネキシンペプチド」は、アネキシンペプチドが関連するアネキシンタンパク質の活性全体を増加させるのに十分な、野生型アネキシンタンパク質、アネキシン様タンパク質、または断片、類似体、バリアント、融合物もしくは模倣物のより短いバージョン（例えば、約５０アミノ酸以下）である。
本開示のポリペプチドは、天然または非天然のいずれかであり得る。天然タンパク質には、自然界に存在するかまたは、例えば、化学合成もしくは組換え発現技術によって自然界において認められる形態で生成することができる、生物活性のあるタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。天然タンパク質には、例えば、限定されないが、グリコシル化タンパク質などの翻訳後修飾タンパク質も含まれる。本開示によって企図される非天然タンパク質には、合成タンパク質、ならびに本明細書で定義される天然または非天然タンパク質の断片、類似体およびバリアントが含まれるが、これらに限定されない。非天然タンパク質には、Ｄ型アミノ酸、修飾された、誘導体化された、もしくは非天然のアミノ酸を構造の一部としてＤもしくはＬ立体配置および／またはペプチド模倣単位に有するタンパク質またはタンパク質物質も含まれる。「タンパク質」という用語は、典型的には、大きなポリペプチドを指す。「ペプチド」という用語は、一般に、短い（例えば、約５０アミノ酸以下の）ポリペプチドを指す。
非天然タンパク質は、例えば、自動タンパク質合成装置を用いて、または、これに代わるものとして、所望のタンパク質をコードする修飾されたオリゴヌクレオチドを使用する組換え発現技術を用いて調製される。
本明細書で使用する場合、タンパク質の「断片」は、全長のタンパク質発現産物よりも小さなタンパク質の何らかの部分を指すことを意味する。
本明細書で使用する場合、「類似体」は、分子全体またはその断片のいずれかに対して構造が実質的に類似し、同じ生物活性を有するが、種々の程度の活性を有することができる２種以上のタンパク質のうちのいずれかを指す。類似体は、そのアミノ酸配列の組成が、他のアミノ酸に対する１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を包含する１つ以上の変異に基づいて異なる。置換は、置き換えられるアミノ酸およびこのアミノ酸と置き換わるアミノ酸の物理化学的または機能的関連性に基づいて、保存的または非保存的であり得る。
本明細書中で使用する場合、「バリアント」は、通常は分子の一部ではない追加の化学的部分を含むように修飾されたタンパク質またはその類似体を指す。このような部分は、例えば、以下に限定するものではないが、分子の溶解度、吸収および／または生物学的半減期を調節することができる。このような効果を仲介することができる部分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に開示されている。このような部分を分子へカップリングするための手順は、当技術分野で周知である。さまざまな態様において、ポリペプチドは、ビオチン化、グリコシル化、ＰＥＧ化、および／またはポリシアル化によって修飾される。
１つの融合成分が断片または模倣物である融合タンパク質を含む融合タンパク質もまた企図される。本明細書で使用される場合、「模倣物」は、それが模倣物であるタンパク質に匹敵する生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を意味する。
本開示の態様または実施形態のうちのいずれかにおいて、組換えタンパク質は、アネキシンタンパク質（例えば、組換え野生型アネキシンタンパク質、修飾アネキシンタンパク質、アネキシン様タンパク質、またはアネキシンタンパク質の１つ以上の生物学的活性を示す、野生型アネキシンタンパク質もしくはアネキシン様タンパク質の断片）である。「アネキシン様タンパク質」とは、アネキシンタンパク質の活性、例えば、限定されないが、アネキシンＡ１（配列番号１）、アネキシンＡ２（配列番号２または配列番号３）、ＥＨＤ２、ジスフェリン、およびＭＧ５３などのタンパク質を含む膜病変での高分子修復複合体の形成を促進することにより、膜の完全性の回復を増強するカルシウム結合膜関連修復タンパク質としての活性を示すのに十分な、参照野生型アネキシンタンパク質に対するアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を意味する。いくつかの実施形態において、アネキシン様タンパク質は、参照野生型ヒトアネキシンタンパク質と、約もしくは少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質（アネキシンＡ１（配列番号１）、アネキシンＡ２（配列番号２もしくは配列番号３）、アネキシンＡ３（配列番号４）、アネキシンＡ４（配列番号５）、アネキシンＡ５（配列番号６）、アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、もしくはそれらの組み合わせ）、アネキシンＡ７（配列番号９もしくは配列番号１０）、アネキシンＡ８（配列番号１１もしくは配列番号１２）、アネキシンＡ９（配列番号１３）、アネキシンＡ１０（配列番号１４）、アネキシンＡ１１（配列番号１５もしくは配列番号１６）、またはアネキシンＡ１３（配列番号１７もしくは配列番号１８））である。さらなる実施形態において、アネキシン様タンパク質は、野生型ヒトアネキシンタンパク質と、約もしくは少なくとも約８０％、約もしくは少なくとも約８５％、約もしくは少なくとも約９０％、約もしくは少なくとも約９５％、または約９９％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質である。
いくつかの実施形態において、本開示の薬剤は、翻訳後修飾を含むアネキシンタンパク質である。さまざまな実施形態において、翻訳後修飾は、アネキシンもしくはアネキシン様タンパク質の産生を増加させる、アネキシンもしくはアネキシン様タンパク質の溶解性を増加させる、アネキシンもしくはアネキシン様タンパク質の凝集を減少させる、アネキシンもしくはアネキシン様タンパク質の半減期を増加させる、アネキシンもしくはアネキシン様タンパク質の安定性を増加させる、アネキシンもしくはアネキシン様タンパク質の標的膜結合を増強する、またはアネキシンもしくはアネキシン様タンパク質のコドン最適化バージョンである。
ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態において、本開示の薬剤は、本明細書に記載されるようなアネキシンタンパク質を発現することができるポリヌクレオチドである。本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語またはその複数形は、本明細書で論じられ、さもなければ当技術分野で知られている変形形態と交換可能である。ある特定の例では、当技術分野では、天然に存在するヌクレオチド、および修飾ヌクレオチドを含む天然に存在しないヌクレオチドを包含する「核酸塩基」という用語を使用する。したがって、ヌクレオチドまたは核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、およびＵを意味する。天然に存在しない核酸塩基には、例えばおよび限定するものではないが、キサンチン、ジアミノプリン、８－オキソ－Ｎ６－メチルアデニン、７－デアザキサンチン、７－デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４－エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’－エタノ－２，６－ジアミノプリン、５－メチルシトシン（ｍＣ）、５－（Ｃ３－Ｃ６）－アルキニル－シトシン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、２－ヒドロキシ－５－メチル－４－トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、ならびにＢｅｎｎｅｒらの米国特許第５，４３２，２７２号およびＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ－Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２５：ｐｐ ４４２９－４４４３に記載の「天然に存在しない」核酸塩基が含まれる。「核酸塩基」という用語には、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、その複素環類似体および互変異性体も含まれる。さらに、天然に存在するおよび天然に存在しない核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．）、Ｓａｎｇｈｖｉによる第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３－７２２（特に第６２２および６２３頁を参照のこと）、ならびにＣｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｃｏｏｋ，Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １９９１，６，５８５－６０７が含まれ、これらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。様々な態様では、オリゴヌクレオチドはまた、最も古典的な意味でのヌクレオシド塩基ではないがヌクレオシド塩基として機能する特定の「普遍的な塩基」を含む核酸塩基のように機能することができる、複素環式化合物などの化合物を含む天然に存在しないヌクレオチドのカテゴリーである１つ以上の「ヌクレオシド塩基」または「塩基単位」を含む。普遍的な塩基には、３－ニトロピロール、任意選択で置換されたインドール（例えば、５－ニトロインドール）、および任意選択で置換されたヒポキサンチンが含まれる。他の望ましい普遍的な塩基には、ピロール、ジアゾール、またはトリアゾール誘導体が含まれ、当技術分野で知られている普遍的な塩基が含まれる。
修飾ヌクレオチドは、ＥＰ１０７２６７９およびＷＯ９７／１２８９６に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。修飾ヌクレオチドには、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２－プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン、および２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、ならびに他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、ならびに他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンが含まれるが、これらに限定されない。さらなる修飾塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、置換フェノキサジンシチジンなどのＧクランプ（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキ－サジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）などの三環系ピリミジンが含まれる。修飾塩基には、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン、および２－ピリドンで置き換えられたものも含まれ得る。追加の核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３に開示されているもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されているものが含まれる。これらの塩基のいくつかは、結合親和性を高めるのに有用であり、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２、Ｎ－６、およびＯ－６置換プリンを含み、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンを含む。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６～１．２℃上昇させることが示されており、ある特定の態様では、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号、同第５，７５０，６９２号、および同第５，６８１，９４１号（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。。
所定の配列のオリゴヌクレオチドを作製する方法は周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．１９８９）およびＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，１ｓｔ Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）を参照されたい。固相合成法は、ポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドの両方に適している（ＤＮＡ合成の周知の方法は、ＲＮＡ合成にも有用である）。ポリヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドはまた、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して酵素的に調製することができる。天然に存在しない核酸塩基もオリゴヌクレオチドに組み込むことができる。例えば、米国特許第７，２２３，８３３号、Ｋａｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７４：２２３８（１９５１）、Ｙａｍａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８３：２５９９（１９６１）、Ｋｏｓｔｕｒｋｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：３９４９（１９７４）、Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６：６０３２（１９５４）、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：７４－７５（２００５）、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：１３６８４－１３６８５（２００２）を参照のこと。
ステロイド
いくつかの実施形態において、アネキシンタンパク質の活性を増加させる薬剤はステロイドである。さらなる実施形態において、ステロイドは、コルチコステロイド、グルココルチコイド、または鉱質コルチコイドである。さらに別の実施形態において、コルチコステロイドは、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンである。いくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、サルメテロール、フルチカゾン、またはブデソニドである。
いくつかの実施形態において、ステロイドはアナボリックステロイドである。さらなる実施形態において、アナボリックステロイドは、テストステロンまたは筋成長誘導特性を有する関連ステロイド化合物、例えば、シクロスタナゾールまたはメタドロステノール、プロホモンまたはそれらの誘導体、エストロゲンのモジュレーター、および選択的アンドロゲン受容体モジュレーター（ＳＡＲＭＳ）を含むが、これらに限定されない。
ベクター
本開示の方法において、適切な発現ベクターを使用して、外因性核酸をレシピエント筋細胞に送達することができる。効果的な遺伝子治療を達成するために、発現ベクターは、効率的な細胞取り込みおよび遺伝子産物発現のために設計されなければならない。いくつかの実施形態において、ベクターは、葉緑体内にある。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択される。
遺伝子送達のためのアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターの使用が記載されている［Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｕｎｏｌ．１５８ ３９－６６（１９９２）、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ－Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：２４１－２５６（１９９０）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ８：１４３－１４４（１９９２）、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ－Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６－６３０（１９９２）］。さまざまな実施形態において、アデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ７４である。いくつかの実施形態において、アデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶ９である。さらなる実施形態において、アデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶｒｈ７４である。
本開示の文脈において有用な遺伝子治療のための特定の方法は、使用される発現系に大きく依存する。しかしながら、大半の方法は、発現ベクター内の適切な位置へのコード配列の挿入、およびその後の、発現のための標的筋組織への発現ベクターの送達を伴う。
本開示の方法の実施に有用な追加の送達システムは、米国特許公開第２０１２／００４６３４５号および第２０１２／００３９８０６号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
障害／損傷
さまざまな態様において、本開示は、細胞膜損傷を治療する、発症を遅らせる、細胞膜損傷からの回復を増強する、または細胞膜損傷を予防するための組成物であって、それを必要とする患者に薬剤および任意選択的に追加の薬剤を投与することを含む、組成物を提供する。
このような患者は、例えば、デュシェンヌ筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型（Ｅｍｅｒｙ－Ｄｒｅｉｆｕｓｓ）筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、眼球咽頭型筋ジストロフィー、遠位筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、肺線維症、筋萎縮、脳性麻痺、上皮障害、表皮障害、腎臓障害、肝臓障害、サルコペニア、心筋症、筋障害、嚢胞性線維症、肺線維症、心筋症（肥大型、拡張型、先天性、不整脈原性、拘束性、虚血性、または心不全を含む）、急性肺損傷、急性筋肉損傷、急性心筋損傷、放射線誘発損傷、結腸癌、特発性肺線維症、特発性間質性肺炎、自己免疫性肺疾患、良性前立腺肥大、脳梗塞、筋骨格線維症、術後癒着、肝硬変、腎線維性疾患、線維性血管疾患、神経線維腫症、アルツハイマー病、糖尿病性網膜症、皮膚病変、ＨＩＶに関連するリンパ節線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性肺線維症、関節リウマチ；リウマチ性脊椎炎；変形性関節症；痛風、その他の関節炎の症状；敗血症；敗血症性ショック；内毒素性ショック；グラム陰性敗血症；毒素性ショック症候群；筋筋膜性疼痛症候群（ＭＰＳ）；細菌性赤痢；喘息；成人呼吸窮迫症候群；炎症性腸疾患；クローン病；乾癬；湿疹；潰瘍性大腸炎；糸球体腎炎；強皮症；慢性甲状腺炎；バセドウ病；オーモンド病；自己免疫性胃炎；重症筋無力症；自己免疫性溶血性貧血；自己免疫性好中球減少症；血小板減少症；膵臓線維症；肝線維症を含む慢性活動性肝炎；腎線維化、過敏性腸症候群；発熱（ｐｙｒｅｓｉｓ）；再狭窄；脳マラリア；脳卒中および虚血性傷害；神経的外傷；ハンチントン病；パーキンソン病；アレルギー性鼻炎およびアレルギー性結膜炎を含むアレルギー；悪液質；ライター症候群；急性滑膜炎；筋変性、滑液包炎；腱炎；腱滑膜炎；大理石骨病；血栓症；珪肺症；肺サルコイドーシス；骨粗鬆症または多発性骨髄腫関連骨障害などの骨吸収疾患；転移性乳癌、結腸直腸癌、悪性黒色腫、胃癌、および非小細胞肺癌を含むがこれらに限定されない癌；移植片対宿主反応；ならびに多発性硬化症、狼瘡、および線維筋痛症などの自己免疫疾患；帯状疱疹、単純ヘルペスＩまたはＩＩ、インフルエンザウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、およびサイトメガロウイルスなどのウイルス性疾患に罹患している患者である。
本明細書で使用される場合、「心筋症」は、心臓が異常に拡大、肥厚、および／または硬化する心筋（心臓筋肉）の任意の疾患または機能不全を指す。その結果、通常、血液を送り出す心筋の能力が弱まり、うっ血性心不全につながる場合が多い。疾患または障害は、例えば、炎症性、代謝性、毒性、浸潤性、線維性、血液学的、遺伝的、または起源が不明なものであり得る。このような心筋症は、酸素不足が原因である可能性がある。他の疾患には、疾患または外傷の結果としての心臓の壁の筋肉または心筋への損傷を伴う心筋損傷に起因する疾患が含まれる。心筋損傷は、心筋症、心筋梗塞、または先天性心疾患などの多くの原因に起因する可能性があるが、これらに限定されない。心臓障害は小児起源である可能性がある。心筋症には、心筋症（拡張型、肥大型、拘束性、不整脈原性、遺伝性、特発性、および未分類の心筋症）、突発性拡張型心筋症、Ｘ連鎖拡張型心筋症（ＸＬＤＣ）、急性および慢性心不全、右心不全、左心不全、両心室性心不全、先天性心臓欠陥、心筋線維症、僧帽弁狭窄症、僧帽弁閉鎖不全症、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、三尖弁狭窄症、三尖弁閉鎖不全症、肺動脈弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖不全症、混合型弁欠損（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｖａｌｖｅ ｄｅｆｅｃｔｓ）、心筋炎、急性心筋炎、慢性心筋炎、ウイルス性心筋炎、拡張期心不全、収縮期心不全、糖尿病性心不全、ならびに蓄積病が含まれるが、これらに限定されない。
追加の（第２の）薬剤
本開示のさまざまな実施形態において、第２の薬剤は、アネキシンタンパク質の活性を増加させる薬剤と共に投与されることが企図される。第２の薬剤の非限定的な例は、ミツグミン５３（ＭＧ５３）、マイクロジストロフィン、潜在型ＴＧＦ－β結合タンパク質４（ＬＴＢＰ４）のモジュレーター、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）活性のモジュレーター、アンドロゲン応答のモジュレーター、炎症応答のモジュレーター、筋成長のプロモーター、化学療法剤、線維症のモジュレーター、およびそれらの組み合わせである。さらに、本明細書に開示される方法は、さまざまな実施形態において、そのような薬剤のうちの１つ以上、または任意の他の活性薬剤と共に組成物中にそのような薬剤のうちの１つ以上を包含することができる。
ＬＴＢＰ４のモジュレーター
ＬＴＢＰ４は、ヒト染色体１９ｑ１３．１－ｑ１３．２に位置し、ＴＧＦβに結合してそれを隔離する細胞外マトリックスタンパク質である。ＬＴＢＰ４は、Ｌｔｂｐ４遺伝子の多型を介してマウスの筋ジストロフィーを調節する。米国特許第９，８７３，７３９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。マウスにはＬｔｂｐ４遺伝子の２つの一般的なバリアントがある。ｍｄｘマウスを含む大半のマウス系統は、Ｌｔｂｐ４挿入対立遺伝子（Ｌｔｂｐ４I/I）を有する。Ｌｔｂｐ４I/IによってコードされるＬＴＢＰ４のプロリンが豊富な領域への３６塩基対（１２アミノ酸）の挿入は、より軽い病気につながる。プロリンが豊富な領域での３６ｂｐ／１２ａａの欠失は、より重篤な疾患と関連している（Ｌｔｂｐ４D/D）。Ｌｔｂｐ４遺伝子型が、筋ジストロフィー病理の２つの異なる側面、すなわち膜漏出および線維症と強く相関し、これらの特徴がＤＭＤ病理を定義することが判明した。
ＬＴＢＰ４のモジュレーターが、米国特許第９，８７３，７３９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ＴＧＦ－β活性のモジュレーター
トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーは、アクチビン、ノード、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ならびに成長および分化因子（ＧＤＦ）を含む３０を超えるメンバーで構成される分泌タンパク質のファミリーである。スーパーファミリーのメンバーは、一般的に遍在的に発現され、成長、発達、および再生を含む多くの細胞プロセスを調節する。ＴＧＦ－βスーパーファミリーのメンバーの変異は、自己免疫疾患、心臓病、線維症、および癌を含む多くの疾患を引き起こす。
ＴＧＦ－βリガンドファミリーには、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３が含まれる。ＴＧＦ－βは、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）に結合した不活性形態で細胞外マトリックスに分泌される。ＴＧＦ－β／ＬＡＰ複合体に結合する潜在型ＴＧＦ－βタンパク質（ＬＴＢＰ）は、さらに別のレベルの調節を提供する。細胞外プロテアーゼは、ＬＴＢＰ／ＬＡＰ／ＴＧＦ－βを切断してＴＧＦ－βを放出する。その結果、ＴＧＦ－βはその受容体ＴＧＦＢＲＩまたはＴＧＦＢＲＩＩに自由に結合する。ＴＧＦ－β／受容体結合は、ＳＭＡＤ因子の活性化を含む、下流のカノニカルＳＭＡＤ経路および非カノニカルＳＭＡＤ経路を活性化し、遺伝子転写を引き起こす。ＴＧＦ－βシグナル伝達は、筋肉疾患における線維化反応および疾患進行の顕著なメディエーターとして浮上しており、その発現は、マウスとヒトの両方のジストロフィーで上方調節される。ドミナントネガティブ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩ）発現の発現によるマウスのＴＧＦ－βシグナル伝達の遮断は、筋ジストロフィーのマウスモデルであるδ－サルコグリカン欠損マウスのジストロフィー病理を改善し、再生を増強し、筋肉損傷を軽減した（Ａｃｃｏｒｎｅｒｏ，ＭｃＮａｌｌｙ ｅｔ ａｌ Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２０１４）。さらに、ｐａｎ抗ＴＧＦ－β抗体（ｐａｎ ａｎｔｉ－ＴＧＦ－β ａｎｔｉｂｏｄｙ）である１ｄ１１モノクローナル抗体によるＴＧＦ－βシグナル伝達の抗体媒介遮断は、デュシェンヌ筋ジストロフィーのマウスモデルにおける呼吸転帰測定を改善した（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２０１１）。したがって、本明細書では、修復を改善し、疾患の進行を遅らせるために、ＴＧＦ－βシグナル伝達に対する治療的アプローチが企図されている。
ＴＧＦ－βシグナル伝達に対して有効であると考えられる治療薬には、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９一水和物）、ＴＥＷ－７９１７、ＴＧＦ－βリガンドに対するモノクローナル抗体（ＴＧＦ－β１、２、３単独またはｐａｎ１、２、３）、フレソライムムブ（ＧＣ－１００８）、ＴＧＦ－βペプチドＰ１４４、ＬＹ２３８２７７０、小分子、ＳＢ－５２５３３４、およびＧＷ７８８３８８が含まれる。
アンドロゲン応答のモジュレーター
選択的アンドロゲン受容体モジュレーター（ＳＡＲＭ）は、アンドロゲンシグナル伝達を活性化し、非ステロイド性およびステロイド性の形態で存在するアンドロゲン受容体リガンドのクラスである。研究によると、ＳＡＲＭは筋肉と骨量の両方を増加させる可能性がある。テストステロンは最もよく知られているＳＡＲＭの１つであり、健康な組織や疾患組織における骨格筋の成長を促進する。テストステロンおよびジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）は、筋細胞の分化を促進し、フォリスタチンを上方調節すると同時に、ＴＧＦ－βシグナル伝達を下方調節し、筋成長をもたらす（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ ２００３、Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ ２００９、Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ ２００８）。ＳＡＲＭを介したＴＧＦ－β阻害は、筋肉損傷を防ぎ、修復を改善すると考えられる。ＳＡＲＭＳには、テストステロン、エストロゲン、ジヒドロテストステロン、エストラジオールが含まれ、ジヒドロナンドロロン、ナンドロロン、デカン酸ナンドロロン、オスタリン（Ｏｓｔａｒｉｎｅ）、リガンドロール（Ｌｉｇａｎｄｒｏｌ）、ＬＧＤ－３３０３、アンダリン、カルダリン、７－アルファメチル、１９－ノルテストステロンアリール－プロピオンアミド、二環式ヒダントイン、キノリン類似体、ベニズイミダゾール、イミダゾロピラゾール、インドール、およびピラゾリン誘導体、アザステロイド誘導体、およびアニリン、ジアリールアニリン、ならびにベゾキサゼピノン誘導体が含まれる。
炎症応答のモジュレーター
炎症応答のモジュレーターには、以下の薬剤が含まれる。本開示の一実施形態において、炎症応答のモジュレーターは、ベータ２－アドレナリン受容体アゴニスト（例えば、アルブテロール）である。ベータ２－アドレナリン受容体アゴニストという用語は、β２アドレナリン受容体に作用し、それによって平滑筋弛緩を引き起こし、気管支通路の拡張、筋肉および肝臓の血管拡張、子宮筋の弛緩およびインスリンの放出をもたらす薬物のクラスを定義するために本明細書で使用される。一実施形態において、本開示に従って使用するためのベータ２－アドレナリン受容体アゴニストは、喘息患者用に吸入形態で広く使用されている免疫抑制薬アルブテロールである。アルブテロールは、炎症性組織の喪失に寄与するマクロファージおよび他の免疫細胞の浸潤を抑制することにより、病気の進行を遅らせると考えられている。アルブテロールはまた、いくつかの同化作用を有するようであり、筋組織の成長を促進する。アルブテロールはまた、タンパク質分解を抑制する可能性がある（おそらくカルパイン阻害を介して）。
ＤＭＤでは、ジストロフィンが失われると筋細胞膜が破壊され、通常は一酸化窒素（ＮＯ）を生成するタンパク質である神経型一酸化窒素シンターゼ（ｎＮＯＳ）が不安定になる。ＤＭＤ患者で観察される筋変性の少なくとも一部は、筋膜関連神経型一酸化窒素シンターゼの産生低下に起因する可能性があると考えられている。この減少は、血管収縮反応の調節障害および最終的な筋肉損傷につながる可能性がある。
一実施形態において、本開示の組成物での使用に好適な炎症応答のモジュレーターは、核内因子カッパ－Ｂ（ＮＦ－κＢ）阻害剤である。ＮＦ－κＢは、細胞性免疫、炎症および増殖反応を調節する主要な転写因子である。ＮＦ－κＢは、活性化されたマクロファージで機能して炎症および筋壊死を促進し、骨格筋線維で機能して筋前駆細胞の阻害を通じて再生を制限する。ＤＭＤにおけるこの因子の活性化は、疾患の病理に寄与する。したがって、ＮＦ－κＢは筋ジストロフィーの進行に重要な役割を果たしており、ＩＫＫ／ＮＦ－κＢシグナル伝達経路は、ＴＧＦβ関連疾患の治療の潜在的な治療標的である。ＮＦ－κＢの阻害剤（例えば、ビタミンＥ類似体であるＩＲＦＩ０４２）は、筋肉機能を強化し、血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルおよび筋肉壊死を減少させ、筋肉再生を増強する。エダサロネクセント（Ｅｄａｓａｌｏｎｅｘｅｎｔ）は小分子阻害剤ＮＦ－κＢである。エダサロネクセントを１００ｍｇ／ｋｇとして経口投与すると、デュシェンヌ筋ジストロフィー男児の筋肉疾患の進行が遅くなった。さらに、ＩＫＫによるＮＦ－κＢを介したシグナル伝達の特異的阻害にも同様の利点がある。
さらなる実施形態において、炎症応答のモジュレーターは、腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストである。ＴＮＦ－αは、炎症応答を誘発し、維持する重要なサイトカインの１つである。本開示の１つの特定の実施形態において、炎症応答のモジュレーターは、ＴＮＦ－αアンタゴニストであるインフリキシマブである。
本開示に従って使用するためのＴＮＦ－αアンタゴニストには、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標））に加えて、マウスＶＫおよびＶＨドメインならびにヒト定常Ｆｃドメインを含むキメラモノクローナル抗体が含まれる。この薬物は、ＴＮＦ－αに結合し、細胞表面のＴＮＦ－α受容体にシグナルを伝達するのを防ぐことにより、ＴＮＦ－αの作用を遮断する。本開示に従って使用するための別のＴＮＦ－αアンタゴニストは、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（商標））である。アダリムマブは完全ヒトモノクローナル抗体である。本開示に従って使用するための別のＴＮＦ－αアンタゴニストは、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（商標））である。エタネルセプトは、ＩｇＧ１のＦｃ部分に結合した可溶性ヒトＴＮＦ受容体を含む二量体融合タンパク質である。これは、ＴＮＦ－αに結合してその作用を遮断する大きな分子である。エタネルセプトは、天然に存在する可溶性ＴＮＦ受容体の阻害効果を模倣するが、融合タンパク質として、血流中の半減期が大幅に延長されるため、より深遠かつ長期的な阻害効果がある。
本開示に従って使用するための別のＴＮＦ－αアンタゴニストは、ペントキシフィリン（Ｔｒｅｎｔａｌ（商標））、化学名１－（５－オキソヘキシル）－３，７－ジメチルキサンチンである。徐放性錠剤形態での通常の投与量は、食事と一緒に１日３回１錠（４００ｍｇ）である。
投薬：Ｒｅｍｉｃａｄｅは、通常２か月間隔で静脈内注入によって投与される。推奨用量は、静脈内注入として３ｍｇ／ｋｇを投与し、最初の注入から２週間後および６週間後、その後は８週間ごとに同様の用量を追加することである。応答が不完全な患者の場合、１０ｍｇ／ｋｇまでで用量を調整するか、４週間ごとに治療することを検討することができる。Ｈｕｍｉｒａは、プリロードされた０．８ｍｌ（４０ｍｇ）シリンジと、事前ロードされたペン型デバイスの両方で販売されており、どちらも通常は自宅の患者によって皮下注射される。エタネルセプトは、２５ｍｇ（週２回）または５０ｍｇ（週１回）の用量で投与することができる。
本開示の別の実施形態において、炎症応答のモジュレーターはシクロスポリンである。この薬物の主な形態であるシクロスポリンＡは、真菌Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ ｉｎｆｌａｔｕｍによって産生される１１アミノ酸から構成される環状非リボソームペプチドである。シクロスポリンは、免疫担当（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）リンパ球（特にＴリンパ球）の細胞質ゾルタンパク質であるシクロフィリン（イムノフィリン）に結合すると考えられている。シクロスポリンとシクロフィリンのこの複合体は、通常の状況下でインターロイキン－２の転写を活性化する役割を果たすカルシニューリンを阻害する。また、リンホカインの産生とインターロイキンの放出を阻害するため、エフェクターＴ細胞の機能が低下する。細胞増殖抑制活性には影響していない。また、ミトコンドリアにも影響を及ぼし、ミトコンドリアのＰＴ細孔が開くのを防ぎ、シトクロムｃの放出（強力なアポトーシス刺激因子）を阻害する。シクロスポリンは、１～１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与することができる。
筋成長の促進剤
本開示のいくつかの実施形態において、治療有効量の筋成長の促進剤が患者に投与される。本開示によって企図される筋成長の促進剤には、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、Ａｋｔ／プロテインキナーゼＢ、クレンブテロール、クレアチン、デコリン（米国特許公開第２０１２００５８９５５号を参照）、ステロイド（例えば、コルチコステロイドまたはグルココルチコイドステロイドであるが、これに限定されない）、テストステロン、およびミオスタチンアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
ミオスタチンアンタゴニスト
本開示の組み合わせでの使用に好適な筋成長の別のクラスのプロモーターは、ミオスタチンアンタゴニストである。成長／分化因子８（ＧＤＦ－８）としても知られるミオスタチンは、骨格筋量の調節に関与するトランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのメンバーである。ＴＧＦ－β－ＧＤＦファミリーのうちの大半のメンバーは広く発現しており、多面発現性である。しかしながら、ミオスタチンは主に骨格筋組織で発現し、ここで骨格筋の成長を負に制御する。ミオスタチンは、不活性なプレプロタンパク質として合成され、タンパク質分解によって活性化される。前駆体タンパク質は切断されて、約１０９アミノ酸のＣＯＯＨ末端タンパク質を生成する。これは、約２５ｋＤａのホモ二量体の形で、成熟した活性型である。成熟した二量体は、プロペプチドに結合した不活性な潜在型複合体として血中を循環しているように見える。本明細書で使用される場合、「ミオスタチンアンタゴニスト」という用語は、ミオスタチンの少なくとも１つの活性を阻害または遮断する、あるいは、ミオスタチンまたはその受容体の発現を遮断または低減する（例えば、ミオスタチンのその受容体への結合を妨害すること、および／またはミオスタチンのその受容体への結合に起因するシグナル伝達を遮断することによって）。したがって、そのような薬剤には、ミオスタチン自体またはその受容体に結合する薬剤が含まれる。
本開示に従って使用するためのミオスタチンアンタゴニストには、ＧＤＦ－８に対する抗体；ＧＤＦ－８受容体に対する抗体；可溶性ＧＤＦ－８受容体およびそれらの断片（例えば、米国特許公開第２００４／０２２３９６６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているようなＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢが免疫グロブリンのＦｃ部分に結合している可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ受容体を含む）；ＧＤＦ－８プロペプチドおよびその修飾形態（例えば、ＷＯ２００２／０６８６５０または米国特許第７，２０２，２１０号に記載されているようなもの、ＧＤＦ－８プロペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に結合している形態および／またはＧＤＦ－８がアスパラギン酸（ａｓｐ）残基で変異している形態を含む、例えば、マウスＧＤＦ－８プロペプチドのａｓｐ－９９およびヒトＧＤＦ－８プロペプチドのａｓｐ－１００）；ＧＤＦ－８の小分子阻害剤；フォリスタチン（例えば、米国特許第６，００４，９３７号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようなもの）、またはフォリスタチンドメイン含有タンパク質（例えば、ＧＡＳＰ－１、もしくは米国特許第７，１９２，７１７号および米国特許第７，５７２，７６３号（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような他のタンパク質）；ならびに、米国特許公開第２００４／０１３８１１８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような、ＧＤＦ－８活性化に影響を与えるメタロプロテアーゼ活性のモジュレーターが含まれる。
追加のミオスタチンアンタゴニストには、ミオスタチン（単量体もしくは二量体形態のミオスタチンプロタンパク質および／または成熟タンパク質を含む）に結合し、それらを阻害または中和するミオスタチン抗体が含まれる。ミオスタチン抗体は、哺乳動物または非哺乳動物由来の抗体、例えば、サメに由来するＩｇＮＡＲ抗体、もしくはヒト化抗体であるか、または抗体に由来する機能的断片を含む。そのような抗体は、例えば、ＷＯ２００５／０９４４４６およびＷＯ２００６／１１６２６９に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ミオスタチン抗体には、ミオスタチンプロタンパク質に結合し、成熟した活性型への切断を防ぐ抗体も含まれる。追加の抗体アンタゴニストには、米国特許第６，０９６，５０６号および米国特許第６，４６８，５３５号（これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗体が含まれる。いくつかの実施形態において、ＧＤＦ－８阻害剤は、その受容体へのＧＤＦ－８の結合を遮断するモノクローナル抗体またはその断片である。さらなる実施形態には、マウスモノクローナル抗体ＪＡ－１６（米国特許第７，３２０，７８９号に記載されるようなもの（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ－４２３６）、そのヒト化誘導体、ならびに（米国特許第７，２６１，８９３号に記載され参照により本明細書に組み込まれるような、完全ヒトモノクローナル抗ＧＤＦ－８抗体（例えば、Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８およびＭｙｏ２２、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ－４７４１、ＰＴＡ－４７４０およびＰＴＡ－４７３９それぞれ、またはそれらの誘導体）が含まれる。
さらに別の実施形態において、ミオスタチンアンタゴニストは、ミオスタチンに結合し、その少なくとも１つの活性を阻害する可溶性受容体を含む。本明細書における「可溶性受容体」という用語は、ミオスタチンに特異的に結合し、それによってミオスタチンシグナル伝達を遮断または阻害するミオスタチン受容体の短縮型または断片を含む。例えば、ミオスタチン受容体の短縮型には、天然に存在する可溶性ドメイン、およびＮ末端またはＣ末端のタンパク質分解によって産生されるバリエーションが含まれる。可溶性ドメインは、受容体の細胞外ドメインの全部または一部を、単独で、または追加のペプチドもしくは他の部分に結合して含む。ミオスタチンは、アクチビン受容体（アクチビンＩＥＢ型受容体（ＡｃｔＲＨＢ）およびアクチビンＨＡ型受容体（ＡｃｔＲＨＡ）を含む）に結合するため、アクチビン受容体は可溶性受容体アンタゴニストの基礎を形成することができる。可溶性受容体Ｆｃを含む可溶性受容体融合タンパク質も使用することができる（米国特許公開第２００４／０２２３９６６号およびＷＯ２００６／０１２６２７を参照。これらは両方とも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ミオスタチン受容体に基づく他のミオスタチンアンタゴニストは、ＡＬＫ－５および／またはＡＬＫ－７阻害剤である（例えば、ＷＯ２００６／０２５９８８およびＷＯ２００５／０８４６９９を参照。これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。ＴＧＦ－βサイトカインとして、ミオスタチンは単一の膜貫通型セリン／スレオニンキナーゼ受容体のファミリーを介してシグナルを伝達する。これらの受容体は、Ｉ型またはアクチビン様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体およびＩＩ型受容体の２つのクラスに分類できる。ＡＬＫ受容体は、（ａ）セリン／スレオニンが豊富な細胞内尾部を欠き、（ｂ）Ｉ型受容体間で高度に相同なセリン／スレオニンキナーゼドメインを有し、（ｃ）グリシン残基およびセリン残基が豊富な領域からなる、ＧＳドメインと呼ばれる共通の配列モチーフを共有するという点で、ＩＩ型受容体とは区別される。ＧＳドメインは細胞内キナーゼドメインのアミノ末端にあり、ＩＩ型受容体による活性化に重要であると考えられている。いくつかの研究は、ＴＧＦ－βシグナル伝達がＡＬＫ（Ｉ型）とＩＩ型受容体の両方を必要とすることを示している。具体的には、ＩＩ型受容体は、ＴＧＦβの存在下で、ＴＧＦβ ＡＬＫ５の１型受容体のＧＳドメインをリン酸化する。次に、ＡＬＫ５は、２つのカルボキシ末端セリンで細胞質タンパク質ｓｍａｄ２およびｓｍａｄ３をリン酸化する。一般に、多くの種では、ＩＩ型受容体が細胞増殖を調節し、Ｉ型受容体がマトリックス産生を調節すると考えられている。さまざまなＡＬＫ５受容体阻害剤が記載されている（例えば、米国特許第６，４６５，４９３号、米国特許第６，９０６，０８９号、米国特許公開第２００３／０１６６６３３号、第２００４／００６３７４５号および第２００４／００３９１９８号（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。したがって、本開示に従って使用するためのミオスタチンアンタゴニストは、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７受容体のミオスタチン結合ドメインを含み得る。
他のミオスタチンアンタゴニストには、ミオスタチン受容体への結合についてミオスタチンと競合する可溶性リガンドアンタゴニストが含まれる。本明細書における「可溶性リガンドアンタゴニスト」という用語は、ミオスタチン受容体（例えば、アクチビン型ＨＢ受容体（ＡｃｔＲＨＡ））に非生産的に結合し、それによってミオスタチン受容体シグナル伝達を競合的に遮断することができる可溶性ペプチド、ポリペプチドまたはペプチド模倣物を指す。可溶性リガンドアンタゴニストには、ミオスタチンと相同性を有するが、ミオスタチンの活性を有さない、「ミオスタチン類似体」とも呼ばれるミオスタチンのバリアントが含まれる。そのような類似体には、短縮物（ｔｒｕｎｃａｔｅｓ）（Ｎ末端またはＣ末端の短縮、置換、欠失、および非アミノ酸置換を有するバリアントなどのアミノ酸配列における他の変化など）が含まれる。
本開示によって企図される追加のミオスタチンアンタゴニストには、本明細書に記載されるような阻害性核酸が含まれる。これらのアンタゴニストには、標的ｍＲＮＡ（センス）またはＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合することができる一本鎖ポリヌクレオチド配列（ＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンスまたはセンスポリヌクレオチドが含まれる。したがって、特定の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入によって産生されるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）も、ミオスタチンの活性を阻害または排除するために使用できる。
特定の実施形態において、ミオスタチンアンタゴニストには、フォリスタチン、ミオスタチンプロドメイン、成長および分化因子１１（ＧＤＦ－１１）プロドメイン、プロドメイン融合タンパク質、ミオスタチンに結合するアンタゴニスト抗体または抗体断片、アクチビンＩＥＢ型受容体に結合するアンタゴニスト抗体または抗体断片、可溶性アクチビンＩＨＢ型受容体、可溶性アクチビンＩＥＢ型受容体融合タンパク質、可溶性ミオスタチン類似体（可溶性リガンド）、ポリヌクレオチド、小分子、ペプチド模倣体、およびミオスタチン結合剤が含まれるが、これらに限定されない。他のアンタゴニストには、米国特許第６，３６９，２０１号およびＷＯ２００１／０５８２０（それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）に記載のペプチド免疫原、ならびに免疫応答を誘発し、それによってミオスタチン活性を遮断することができるミオスタチン多量体および免疫複合体が含まれる。他のアンタゴニストには、ＷＯ２００２／０８５３０６（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるミオスタチンのタンパク質阻害剤が含まれ、これには、短縮型アクチビンＩＩ型受容体、ミオスタチンプロドメイン、およびフォリスタチンが含まれる。他のミオスタチン阻害剤には、ミオスタチンを過剰発現する細胞から培養物に放出されるもの（ＷＯ２０００／４３７８１を参照）、ピエモンテ対立遺伝子によってコードされるタンパク質を含むドミナントネガティブなミオスタチンタンパク質（ＷＯ２００１／５３３５０を参照）、およびアミノ酸位置３３５もしくは３７５のいずれかまたはアミノ酸位置３３５～３７５の位置にＣ末端短縮を有する成熟ミオスタチンペプチドが含まれる。アミノ酸配列ＷＭＣＰＰを含む米国特許公開第２００４／０１８１０３３号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている小さなペプチドもまた、本開示の組成物での使用に好適である。
化学療法薬
使用が企図される化学療法薬には、次のものが含まれるが、これらに限定されない：以下を含むアルキル化剤；ナイトロジェンマスタード、例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、およびクロラムブシル；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、およびセムスチン（メチルＣＣＮＵ）；エチレンイミン／メチルメラミン、例えば、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホルアミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン；トリアジン、例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）；葉酸類似体、例えば、メトトレキサートおよびトリメトレキサート、ピリミジン類似体、例えば、５－フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５－アザシチジン、２，２´－ジフルオロデオキシシチジン、プリン類似体、例えば、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、アザチオプリン、２’－デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリトロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、および２－クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２－ＣｄＡ）を含む代謝拮抗剤；有糸分裂阻害剤を含む天然物、例えば、パクリタキセル、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、およびビノレルビンを含む）、タキソテール、エストラムスチン、およびリン酸エストラムスチン；エピポドフィロトキシン、例えば、エトポシドおよびテニポシド；抗生物質、例えば、アクチモマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、およびアクチノマイシン；酵素、例えば、Ｌ－アスパラギナーゼ；生物学的応答修飾物質、例えば、インターフェロン－アルファ、ＩＬ－２、Ｇ－ＣＳＦ、およびＧＭ－ＣＳＦ；白金配位錯体（シスプラチンおよびカルボプラチンなど）、アントラセンジオン（ミトキサントロンなど）、置換尿素（ヒドロキシ尿素など）、メチルヒドラジン誘導体（Ｎ－メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジンを含む）、副腎皮質抑制剤（ミトタン（ｏ，ｐ´－ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドなど）を含む種々の薬剤；副腎皮質ステロイドアンタゴニスト（プレドニゾンおよび等価物、デキサメタゾンおよびアミノグルテチミドなど）を含むホルモンおよびアンタゴニスト；プロゲスチン、例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール；エストロゲン、例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール等価物；抗エストロゲン剤、例えば、タモキシフェン；アンドロゲン（プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン／等価物を含む）；抗アンドロゲン剤、例えば、フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、およびロイプロリド；ならびに非ステロイド系抗アンドロゲン剤、例えば、フルタミド。
線維症のモジュレーター
本明細書で使用される「線維症のモジュレーター」は、抗線維化剤と同義である。「抗線維化剤」という用語は、哺乳動物において抗線維化活性を有する（すなわち、線維症を予防または低減する）化合物を指す。これは、通常コラーゲンで構成される線維性結合組織の異常な形成を考慮に入れている。これらの化合物は、異なる作用機序を有する可能性があり、コラーゲンまたは別のタンパク質の形成を減少させるものもあれば、体の患部における異化作用またはコラーゲンの除去を高めるものもある。線維性組織の存在の減少において活性を有するそのようなすべての化合物は、そのような各薬物が機能する特定の作用機序に関係なく、本明細書に含まれる。本開示の方法および組成物に有用な抗線維化剤には、米国特許第５，７２０，９５０号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが含まれる。本開示によって企図される追加の抗線維化剤には、ＩＩ型インターフェロン受容体アゴニスト（例えば、インターフェロン－ガンマ）、ピルフェニドンおよびピルフェニドン類似体、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、ｂＦＧＦアンタゴニスト、ｂＦＧＦ受容体アンタゴニスト、ＴＧＦβアンタゴニスト、ＴＧＦβ受容体アンタゴニストなどの抗血管新生剤、抗炎症剤、ＩＬ－１ＲａなどのＩＬ－１アンタゴニスト、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、アンジオテンシン受容体遮断薬、およびアルドステロンアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
遺伝子修正アプローチ
遺伝子修正アプローチは、本明細書に記載の方法および組成物と併せて使用されることが本開示によって企図されている。本明細書で使用される場合、「遺伝子修正」アプローチには、遺伝子編集に関連する技術（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ技術）、エクソンスキッピング、およびｍＲＮＡを修飾するための当技術分野で知られている他の技術が含まれるが、これらに限定されない。したがって、いくつかの実施形態において、本開示の薬剤を使用して、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、すべての肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）１型サブタイプ、すべてのＬＧＭＤ２型サブタイプ、先天性筋ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、眼球咽頭型筋ジストロフィー、および遠位筋ジストロフィーに罹患している個体においてアネキシンタンパク質の活性を増加させる方法が提供され、患者は、前述の障害のうちのいずれか１つに関与する遺伝子の修正をもたらす組成物を投与される、同時に投与されている、または前もって投与されている。さらなる実施形態において、本開示の薬剤を使用して、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、すべての肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）１型サブタイプ、すべてのＬＧＭＤ２型サブタイプ、先天性筋ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、眼球咽頭型筋ジストロフィー、および遠位筋ジストロフィーに罹患している個体においてアネキシンタンパク質の活性を増加させる方法が提供され、患者は、前述の障害のうちのいずれか１つに関与する遺伝子の修正をもたらすウイルスベースまたは非ウイルスベースの組成物を投与される、同時に投与されている、または前もって投与されている。
遺伝子修正アプローチは当技術分野で知られている（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０１３０６０８号および米国特許第９，４９９，８１７号（各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）をそれぞれ参照のこと）。このような方法の詳細は、Ｅｃｈｉｇｏｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｅｒｓ Ｍｅｄ ８，２０１８、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ３９：９８２－９９４，２０１８、Ｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ，２０１８、およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ ９８：１２０５－１２４０，２０１８に見ることができる。
組成物
本明細書に記載の薬剤および／または追加の薬剤のうちのいずれか（または本明細書に記載の薬剤および／または追加の薬剤のうちのいずれかをコードする核酸）もまた、組成物で提供される。これに関して、薬剤および／または追加の薬剤は、本明細書にさらに記載されるように、生理学的に許容される（すなわち、薬理学的に許容される）担体、緩衝液、または希釈剤と共に処方される。任意選択で、タンパク質ポリマーは、生理学的に許容される塩の形態であり、これは、本開示に含まれる。「生理学的に許容される塩」とは、薬学的に許容される任意の塩を意味する。適切な塩のいくつかの例には、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、およびシュウ酸塩が含まれる。したがって、いくつかの態様において、本開示は、１つ以上のアネキシンタンパク質、ならびに薬学的に許容される担体、緩衝液、および／または希釈剤を含む、薬学的組成物を提供する。本開示の態様または実施形態のうちのいずれかにおいて、組成物中の１つ以上（またはすべて）のアネキシンタンパク質は、修飾アネキシンタンパク質である。本開示の態様または実施形態のうちのいずれかにおいて、組成物中の１つ以上（またはすべて）のアネキシンタンパク質は、天然に存在する哺乳動物アネキシンタンパク質である。いくつかの実施形態において、修飾アネキシンタンパク質は、原核細胞（例えば、限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）中で発現される。一般に、修飾タンパク質は、自然界に通常存在するタンパク質のバージョンと比較して変更されたタンパク質である。いくつかの実施形態において、修飾タンパク質は、修飾タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸が、天然に存在する哺乳動物タンパク質と比較して、変更された翻訳後修飾を有するものである。例として、天然に存在する哺乳動物タンパク質は、リン酸化されたアミノ酸を含み得るが、一方で、修飾タンパク質中の同じアミノ酸は、異なる翻訳後修飾を有するか、または翻訳後修飾を有さない。いくつかの実施形態において、アネキシンタンパク質は、アネキシンＡ１（配列番号１）、アネキシンＡ２（配列番号２もしくは配列番号３）、アネキシンＡ３（配列番号４）、アネキシンＡ４（配列番号５）、アネキシンＡ５（配列番号６）、アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、もしくはそれらの組み合わせ）、アネキシンＡ７（配列番号９もしくは配列番号１０）、アネキシンＡ８（配列番号１１もしくは配列番号１２）、アネキシンＡ９（配列番号１３）、アネキシンＡ１０（配列番号１４）、アネキシンＡ１１（配列番号１５もしくは配列番号１６）、アネキシンＡ１３（配列番号１７もしくは配列番号１８）、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、アネキシンタンパク質は、アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）である。いくつかの実施形態において、そして本明細書に記載されるように、薬学的組成物は、アネキシンタンパク質の１つ以上が修飾アネキシンタンパク質であるアネキシンタンパク質の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、アネキシンタンパク質の組み合わせを含み、各アネキシンタンパク質は、天然に存在する哺乳動物のアネキシンタンパク質である。１つ以上のアネキシンタンパク質を含む本開示の薬学的組成物は、１つ以上のアネキシンタンパク質が高レベルの純度で組成物中に存在するように処方される。「純度」とは、薬学的組成物に使用されるタンパク質（例えば、アネキシンタンパク質）が、発現された全長タンパク質（例えば、アネキシンタンパク質）から主に構成され、短縮または分解されたタンパク質産物をほとんど含まないことを意味する。さまざまな実施形態において、薬学的組成物中に存在する１つ以上のアネキシンタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、およびイムノブロット分析のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない標準放出アッセイによって測定される場合、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％純粋である。本開示の薬学的組成物もまた、エンドトキシンを比較的含まない。さまざまな実施形態において、本開示の薬学的組成物は、標準的な方法で測定した場合、Ａ２８０アネキシンタンパク質１ミリグラムあたり、約１０エンドトキシン単位（ＥＵ／ｍｇ）またはそれ未満、約５エンドトキシン単位（ＥＵ／ｍｇ）またはそれ未満、約１エンドトキシン単位（ＥＵ／ｍｇ）またはそれ未満、約０．５００００エンドトキシン単位（ＥＵ／ｍｇ）またはそれ未満、約０．４００００エンドトキシン単位（ＥＵ／ｍｇ）またはそれ未満、約０．３００００エンドトキシン単位（ＥＵ／ｍｇ）またはそれ未満であるエンドトキシンレベルを有する。
本明細書に開示されるように、本開示は、アネキシンタンパク質の活性を増加させる１つ以上の薬剤および／または追加の薬剤を含む組成物を提供する。さまざまな実施形態において、アネキシンタンパク質は、アネキシンＡ１（配列番号１）、アネキシンＡ２（配列番号２および／もしくは配列番号３）、アネキシンＡ３（配列番号４）、アネキシンＡ４（配列番号５）、アネキシンＡ５（配列番号６）、アネキシンＡ６（配列番号７および／もしくは配列番号８）、アネキシンＡ７（配列番号９および／もしくは配列番号１０）、アネキシンＡ８（配列番号１１および／もしくは配列番号１２）、アネキシンＡ９（配列番号１３）、アネキシンＡ１０（配列番号１４）、アネキシンＡ１１（配列番号１５および／もしくは配列番号１６）、アネキシンＡ１３（配列番号１７および／もしくは配列番号１８）、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、組成物は、アネキシンＡ１（配列番号１）、アネキシンＡ２（配列番号２および／または配列番号３）、ならびにアネキシンＡ６（配列番号７および／または配列番号８）の活性を増加させる。さらなる実施形態において、組成物は、アネキシンＡ２（配列番号２および／または配列番号３）、ならびにアネキシンＡ６（配列番号７および／または配列番号８）の活性を増加させる。さらに別の実施形態において、組成物は、アネキシンＡ１（配列番号１）、ならびにアネキシンＡ６（配列番号７および／または配列番号８）の活性を増加させる。
本開示はまた、さまざまな実施形態において、アネキシンタンパク質は、任意の組み合わせで、アネキシンＡ１（配列番号１）、アネキシンＡ２（配列番号２および／もしくは配列番号３）、アネキシンＡ３（配列番号４）、アネキシンＡ４（配列番号５）、アネキシンＡ５（配列番号６）、アネキシンＡ６（配列番号７および／もしくは配列番号８）、アネキシンＡ７（配列番号９および／もしくは配列番号１０）、アネキシンＡ８（配列番号１１および／もしくは配列番号１２）、アネキシンＡ９（配列番号１３）、アネキシンＡ１０（配列番号１４）、アネキシンＡ１１（配列番号１５および／もしくは配列番号１６）、ならびにアネキシンＡ１３（配列番号１７および／もしくは配列番号１８）の活性を増加させる組成物を企図している。なお、本明細書でアネキシンタンパク質を同定するために複数の配列識別子が使用される（例えば、アネキシンＡ２が本明細書で配列番号２および／または配列番号３によって同定される）場合、異なる配列識別子が、特定のアネキシンタンパク質のアイソフォームを同定する、アイソフォームが本開示の方法および組成物において交換可能にまたは組み合わせて使用され得ることを特定するのに役立つことが理解される。
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿０００６９１．１ アネキシンＡ１［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号１）：ＭＡＭＶＳＥＦＬＫＱＡＷＦＩＥＮＥＥＱＥＹＶＱＴＶＫＳＳＫＧＧＰＧＳＡＶＳＰＹＰＴＦＮＰＳＳＤＶＡＡＬＨＫＡＩＭＶＫＧＶＤＥＡＴＩＩＤＩＬＴＫＲＮＮＡＱＲＱＱＩＫＡＡＹＬＱＥＴＧＫＰＬＤＥＴＬＫＫＡＬＴＧＨＬＥＥＶＶＬＡＬＬＫＴＰＡＱＦＤＡＤＥＬＲＡＡＭＫＧＬＧＴＤＥＤＴＬＩＥＩＬＡＳＲＴＮＫＥＩＲＤＩＮＲＶＹＲＥＥＬＫＲＤＬＡＫＤＩＴＳＤＴＳＧＤＦＲＮＡＬＬＳＬＡＫＧＤＲＳＥＤＦＧＶＮＥＤＬＡＤＳＤＡＲＡＬＹＥＡＧＥＲＲＫＧＴＤＶＮＶＦＮＴＩＬＴＴＲＳＹＰＱＬＲＲＶＦＱＫＹＴＫＹＳＫＨＤＭＮＫＶＬＤＬＥＬＫＧＤＩＥＫＣＬＴＡＩＶＫＣＡＴＳＫＰＡＦＦＡＥＫＬＨＱＡＭＫＧＶＧＴＲＨＫＡＬＩＲＩＭＶＳＲＳＥＩＤＭＮＤＩＫＡＦＹＱＫＭＹＧＩＳＬＣＱＡＩＬＤＥＴＫＧＤＹＥＫＩＬＶＡＬＣＧＧＮ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿００１００２８５８．１ アネキシンＡ２アイソフォーム１［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号２）：ＭＧＲＱＬＡＧＣＧＤＡＧＫＫＡＳＦＫＭＳＴＶＨＥＩＬＣＫＬＳＬＥＧＤＨＳＴＰＰＳＡＹＧＳＶＫＡＹＴＮＦＤＡＥＲＤＡＬＮＩＥＴＡＩＫＴＫＧＶＤＥＶＴＩＶＮＩＬＴＮＲＳＮＡＱＲＱＤＩＡＦＡＹＱＲＲＴＫＫＥＬＡＳＡＬＫＳＡＬＳＧＨＬＥＴＶＩＬＧＬＬＫＴＰＡＱＹＤＡＳＥＬＫＡＳＭＫＧＬＧＴＤＥＤＳＬＩＥＩＩＣＳＲＴＮＱＥＬＱＥＩＮＲＶＹＫＥＭＹＫＴＤＬＥＫＤＩＩＳＤＴＳＧＤＦＲＫＬＭＶＡＬＡＫＧＲＲＡＥＤＧＳＶＩＤＹＥＬＩＤＱＤＡＲＤＬＹＤＡＧＶＫＲＫＧＴＤＶＰＫＷＩＳＩＭＴＥＲＳＶＰＨＬＱＫＶＦＤＲＹＫＳＹＳＰＹＤＭＬＥＳＩＲＫＥＶＫＧＤＬＥＮＡＦＬＮＬＶＱＣＩＱＮＫＰＬＹＦＡＤＲＬＹＤＳＭＫＧＫＧＴＲＤＫＶＬＩＲＩＭＶＳＲＳＥＶＤＭＬＫＩＲＳＥＦＫＲＫＹＧＫＳＬＹＹＹＩＱＱＤＴＫＧＤＹＱＫＡＬＬＹＬＣＧＧＤＤ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿００１１２９４８７．１ アネキシンＡ２アイソフォーム２［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号３）：ＭＳＴＶＨＥＩＬＣＫＬＳＬＥＧＤＨＳＴＰＰＳＡＹＧＳＶＫＡＹＴＮＦＤＡＥＲＤＡＬＮＩＥＴＡＩＫＴＫＧＶＤＥＶＴＩＶＮＩＬＴＮＲＳＮＡＱＲＱＤＩＡＦＡＹＱＲＲＴＫＫＥＬＡＳＡＬＫＳＡＬＳＧＨＬＥＴＶＩＬＧＬＬＫＴＰＡＱＹＤＡＳＥＬＫＡＳＭＫＧＬＧＴＤＥＤＳＬＩＥＩＩＣＳＲＴＮＱＥＬＱＥＩＮＲＶＹＫＥＭＹＫＴＤＬＥＫＤＩＩＳＤＴＳＧＤＦＲＫＬＭＶＡＬＡＫＧＲＲＡＥＤＧＳＶＩＤＹＥＬＩＤＱＤＡＲＤＬＹＤＡＧＶＫＲＫＧＴＤＶＰＫＷＩＳＩＭＴＥＲＳＶＰＨＬＱＫＶＦＤＲＹＫＳＹＳＰＹＤＭＬＥＳＩＲＫＥＶＫＧＤＬＥＮＡＦＬＮＬＶＱＣＩＱＮＫＰＬＹＦＡＤＲＬＹＤＳＭＫＧＫＧＴＲＤＫＶＬＩＲＩＭＶＳＲＳＥＶＤＭＬＫＩＲＳＥＦＫＲＫＹＧＫＳＬＹＹＹＩＱＱＤＴＫＧＤＹＱＫＡＬＬＹＬＣＧＧＤＤ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿００５１３０．１ アネキシンＡ３［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号４）：ＭＡＳＩＷＶＧＨＲＧＴＶＲＤＹＰＤＦＳＰＳＶＤＡＥＡＩＱＫＡＩＲＧＩＧＴＤＥＫＭＬＩＳＩＬＴＥＲＳＮＡＱＲＱＬＩＶＫＥＹＱＡＡＹＧＫＥＬＫＤＤＬＫＧＤＬＳＧＨＦＥＨＬＭＶＡＬＶＴＰＰＡＶＦＤＡＫＱＬＫＫＳＭＫＧＡＧＴＮＥＤＡＬＩＥＩＬＴＴＲＴＳＲＱＭＫＤＩＳＱＡＹＹＴＶＹＫＫＳＬＧＤＤＩＳＳＥＴＳＧＤＦＲＫＡＬＬＴＬＡＤＧＲＲＤＥＳＬＫＶＤＥＨＬＡＫＱＤＡＱＩＬＹＫＡＧＥＮＲＷＧＴＤＥＤＫＦＴＥＩＬＣＬＲＳＦＰＱＬＫＬＴＦＤＥＹＲＮＩＳＱＫＤＩＶＤＳＩＫＧＥＬＳＧＨＦＥＤＬＬＬＡＩＶＮＣＶＲＮＴＰＡＦＬＡＥＲＬＨＲＡＬＫＧＩＧＴＤＥＦＴＬＮＲＩＭＶＳＲＳＥＩＤＬＬＤＩＲＴＥＦＫＫＨＹＧＹＳＬＹＳＡＩＫＳＤＴＳＧＤＹＥＩＴＬＬＫＩＣＧＧＤＤ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿００１１４４．１ アネキシンＡ４アイソフォームａ［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号５）：ＭＡＭＡＴＫＧＧＴＶＫＡＡＳＧＦＮＡＭＥＤＡＱＴＬＲＫＡＭＫＧＬＧＴＤＥＤＡＩＩＳＶＬＡＹＲＮＴＡＱＲＱＥＩＲＴＡＹＫＳＴＩＧＲＤＬＩＤＤＬＫＳＥＬＳＧＮＦＥＱＶＩＶＧＭＭＴＰＴＶＬＹＤＶＱＥＬＲＲＡＭＫＧＡＧＴＤＥＧＣＬＩＥＩＬＡＳＲＴＰＥＥＩＲＲＩＳＱＴＹＱＱＱＹＧＲＳＬＥＤＤＩＲＳＤＴＳＦＭＦＱＲＶＬＶＳＬＳＡＧＧＲＤＥＧＮＹＬＤＤＡＬＶＲＱＤＡＱＤＬＹＥＡＧＥＫＫＷＧＴＤＥＶＫＦＬＴＶＬＣＳＲＮＲＮＨＬＬＨＶＦＤＥＹＫＲＩＳＱＫＤＩＥＱＳＩＫＳＥＴＳＧＳＦＥＤＡＬＬＡＩＶＫＣＭＲＮＫＳＡＹＦＡＥＫＬＹＫＳＭＫＧＬＧＴＤＤＮＴＬＩＲＶＭＶＳＲＡＥＩＤＭＬＤＩＲＡＨＦＫＲＬＹＧＫＳＬＹＳＦＩＫＧＤＴＳＧＤＹＲＫＶＬＬＶＬＣＧＧＤＤ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿００１１４５．１ アネキシンＡ５［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号６）：ＭＡＱＶＬＲＧＴＶＴＤＦＰＧＦＤＥＲＡＤＡＥＴＬＲＫＡＭＫＧＬＧＴＤＥＥＳＩＬＴＬＬＴＳＲＳＮＡＱＲＱＥＩＳＡＡＦＫＴＬＦＧＲＤＬＬＤＤＬＫＳＥＬＴＧＫＦＥＫＬＩＶＡＬＭＫＰＳＲＬＹＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥＤＤＶＶＧＤＴＳＧＹＹＱＲＭＬＶＶＬＬＱＡＮＲＤＰＤＡＧＩＤＥＡＱＶＥＱＤＡＱＡＬＦＱＡＧＥＬＫＷＧＴＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫＶＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩＤＲＥＴＳＧＮＬＥＱＬＬＬＡＶＶＫＳＩＲＳＩＰＡＹＬＡＥＴＬＹＹＡＭＫＧＡＧＴＤＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤＬＦＮＩＲＫＥＦＲＫＮＦＡＴＳＬＹＳＭＩＫＧＤＴＳＧＤＹＫＫＡＬＬＬＬＣＧＥＤＤ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿００１１４６．２ アネキシンＡ６アイソフォーム１［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号７）：ＭＡＫＰＡＱＧＡＫＹＲＧＳＩＨＤＦＰＧＦＤＰＮＱＤＡＥＡＬＹＴＡＭＫＧＦＧＳＤＫＥＡＩＬＤＩＩＴＳＲＳＮＲＱＲＱＥＶＣＱＳＹＫＳＬＹＧＫＤＬＩＡＤＬＫＹＥＬＴＧＫＦＥＲＬＩＶＧＬＭＲＰＰＡＹＣＤＡＫＥＩＫＤＡＩＳＧＩＧＴＤＥＫＣＬＩＥＩＬＡＳＲＴＮＥＱＭＨＱＬＶＡＡＹＫＤＡＹＥＲＤＬＥＡＤＩＩＧＤＴＳＧＨＦＱＫＭＬＶＶＬＬＱＧＴＲＥＥＤＤＶＶＳＥＤＬＶＱＱＤＶＱＤＬＹＥＡＧＥＬＫＷＧＴＤＥＡＱＦＩＹＩＬＧＮＲＳＫＱＨＬＲＬＶＦＤＥＹＬＫＴＴＧＫＰＩＥＡＳＩＲＧＥＬＳＧＤＦＥＫＬＭＬＡＶＶＫＣＩＲＳＴＰＥＹＦＡＥＲＬＦＫＡＭＫＧＬＧＴＲＤＮＴＬＩＲＩＭＶＳＲＳＥＬＤＭＬＤＩＲＥＩＦＲＴＫＹＥＫＳＬＹＳＭＩＫＮＤＴＳＧＥＹＫＫＴＬＬＫＬＳＧＧＤＤＤＡＡＧＱＦＦＰＥＡＡＱＶＡＹＱＭＷＥＬＳＡＶＡＲＶＥＬＫＧＴＶＲＰＡＮＤＦＮＰＤＡＤＡＫＡＬＲＫＡＭＫＧＬＧＴＤＥＤＴＩＩＤＩＩＴＨＲＳＮＶＱＲＱＱＩＲＱＴＦＫＳＨＦＧＲＤＬＭＴＤＬＫＳＥＩＳＧＤＬＡＲＬＩＬＧＬＭＭＰＰＡＨＹＤＡＫＱＬＫＫＡＭＥＧＡＧＴＤＥＫＡＬＩＥＩＬＡＴＲＴＮＡＥＩＲＡＩＮＥＡＹＫＥＤＹＨＫＳＬＥＤＡＬＳＳＤＴＳＧＨＦＲＲＩＬＩＳＬＡＴＧＨＲＥＥＧＧＥＮＬＤＱＡＲＥＤＡＱＶＡＡＥＩＬＥＩＡＤＴＰＳＧＤＫＴＳＬＥＴＲＦＭＴＩＬＣＴＲＳＹＰＨＬＲＲＶＦＱＥＦＩＫＭＴＮＹＤＶＥＨＴＩＫＫＥＭＳＧＤＶＲＤＡＦＶＡＩＶＱＳＶＫＮＫＰＬＦＦＡＤＫＬＹＫＳＭＫＧＡＧＴＤＥＫＴＬＴＲＩＭＶＳＲＳＥＩＤＬＬＮＩＲＲＥＦＩＥＫＹＤＫＳＬＨＱＡＩＥＧＤＴＳＧＤＦＬＫＡＬＬＡＬＣＧＧＥＤ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿００１１８０４７３．１ アネキシンＡ６アイソフォーム２［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号８）：ＭＫＧＦＧＳＤＫＥＡＩＬＤＩＩＴＳＲＳＮＲＱＲＱＥＶＣＱＳＹＫＳＬＹＧＫＤＬＩＡＤＬＫＹＥＬＴＧＫＦＥＲＬＩＶＧＬＭＲＰＰＡＹＣＤＡＫＥＩＫＤＡＩＳＧＩＧＴＤＥＫＣＬＩＥＩＬＡＳＲＴＮＥＱＭＨＱＬＶＡＡＹＫＤＡＹＥＲＤＬＥＡＤＩＩＧＤＴＳＧＨＦＱＫＭＬＶＶＬＬＱＧＴＲＥＥＤＤＶＶＳＥＤＬＶＱＱＤＶＱＤＬＹＥＡＧＥＬＫＷＧＴＤＥＡＱＦＩＹＩＬＧＮＲＳＫＱＨＬＲＬＶＦＤＥＹＬＫＴＴＧＫＰＩＥＡＳＩＲＧＥＬＳＧＤＦＥＫＬＭＬＡＶＶＫＣＩＲＳＴＰＥＹＦＡＥＲＬＦＫＡＭＫＧＬＧＴＲＤＮＴＬＩＲＩＭＶＳＲＳＥＬＤＭＬＤＩＲＥＩＦＲＴＫＹＥＫＳＬＹＳＭＩＫＮＤＴＳＧＥＹＫＫＴＬＬＫＬＳＧＧＤＤＤＡＡＧＱＦＦＰＥＡＡＱＶＡＹＱＭＷＥＬＳＡＶＡＲＶＥＬＫＧＴＶＲＰＡＮＤＦＮＰＤＡＤＡＫＡＬＲＫＡＭＫＧＬＧＴＤＥＤＴＩＩＤＩＩＴＨＲＳＮＶＱＲＱＱＩＲＱＴＦＫＳＨＦＧＲＤＬＭＴＤＬＫＳＥＩＳＧＤＬＡＲＬＩＬＧＬＭＭＰＰＡＨＹＤＡＫＱＬＫＫＡＭＥＧＡＧＴＤＥＫＡＬＩＥＩＬＡＴＲＴＮＡＥＩＲＡＩＮＥＡＹＫＥＤＹＨＫＳＬＥＤＡＬＳＳＤＴＳＧＨＦＲＲＩＬＩＳＬＡＴＧＨＲＥＥＧＧＥＮＬＤＱＡＲＥＤＡＱＶＡＡＥＩＬＥＩＡＤＴＰＳＧＤＫＴＳＬＥＴＲＦＭＴＩＬＣＴＲＳＹＰＨＬＲＲＶＦＱＥＦＩＫＭＴＮＹＤＶＥＨＴＩＫＫＥＭＳＧＤＶＲＤＡＦＶＡＩＶＱＳＶＫＮＫＰＬＦＦＡＤＫＬＹＫＳＭＫＧＡＧＴＤＥＫＴＬＴＲＩＭＶＳＲＳＥＩＤＬＬＮＩＲＲＥＦＩＥＫＹＤＫＳＬＨＱＡＩＥＧＤＴＳＧＤＦＬＫＡＬＬＡＬＣＧＧＥＤ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿００１１４７．１ アネキシンＡ７アイソフォーム１［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号９）：ＭＳＹＰＧＹＰＰＴＧＹＰＰＦＰＧＹＰＰＡＧＱＥＳＳＦＰＰＳＧＱＹＰＹＰＳＧＦＰＰＭＧＧＧＡＹＰＱＶＰＳＳＧＹＰＧＡＧＧＹＰＡＰＧＧＹＰＡＰＧＧＹＰＧＡＰＱＰＧＧＡＰＳＹＰＧＶＰＰＧＱＧＦＧＶＰＰＧＧＡＧＦＳＧＹＰＱＰＰＳＱＳＹＧＧＧＰＡＱＶＰＬＰＧＧＦＰＧＧＱＭＰＳＱＹＰＧＧＱＰＴＹＰＳＱＰＡＴＶＴＱＶＴＱＧＴＩＲＰＡＡＮＦＤＡＩＲＤＡＥＩＬＲＫＡＭＫＧＦＧＴＤＥＱＡＩＶＤＶＶＡＮＲＳＮＤＱＲＱＫＩＫＡＡＦＫＴＳＹＧＫＤＬＩＫＤＬＫＳＥＬＳＧＮＭＥＥＬＩＬＡＬＦＭＰＰＴＹＹＤＡＷＳＬＲＫＡＭＱＧＡＧＴＱＥＲＶＬＩＥＩＬＣＴＲＴＮＱＥＩＲＥＩＶＲＣＹＱＳＥＦＧＲＤＬＥＫＤＩＲＳＤＴＳＧＨＦＥＲＬＬＶＳＭＣＱＧＮＲＤＥＮＱＳＩＮＨＱＭＡＱＥＤＡＱＲＬＹＱＡＧＥＧＲＬＧＴＤＥＳＣＦＮＭＩＬＡＴＲＳＦＰＱＬＲＡＴＭＥＡＹＳＲＭＡＮＲＤＬＬＳＳＶＳＲＥＦＳＧＹＶＥＳＧＬＫＴＩＬＱＣＡＬＮＲＰＡＦＦＡＥＲＬＹＹＡＭＫＧＡＧＴＤＤＳＴＬＶＲＩＶＶＴＲＳＥＩＤＬＶＱＩＫＱＭＦＡＱＭＹＱＫＴＬＧＴＭＩＡＧＤＴＳＧＤＹＲＲＬＬＬＡＩＶＧＱ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿００４０２５．１ アネキシンＡ７アイソフォーム２［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号１０）：ＭＳＹＰＧＹＰＰＴＧＹＰＰＦＰＧＹＰＰＡＧＱＥＳＳＦＰＰＳＧＱＹＰＹＰＳＧＦＰＰＭＧＧＧＡＹＰＱＶＰＳＳＧＹＰＧＡＧＧＹＰＡＰＧＧＹＰＡＰＧＧＹＰＧＡＰＱＰＧＧＡＰＳＹＰＧＶＰＰＧＱＧＦＧＶＰＰＧＧＡＧＦＳＧＹＰＱＰＰＳＱＳＹＧＧＧＰＡＱＶＰＬＰＧＧＦＰＧＧＱＭＰＳＱＹＰＧＧＱＰＴＹＰＳＱＩＮＴＤＳＦＳＳＹＰＶＦＳＰＶＳＬＤＹＳＳＥＰＡＴＶＴＱＶＴＱＧＴＩＲＰＡＡＮＦＤＡＩＲＤＡＥＩＬＲＫＡＭＫＧＦＧＴＤＥＱＡＩＶＤＶＶＡＮＲＳＮＤＱＲＱＫＩＫＡＡＦＫＴＳＹＧＫＤＬＩＫＤＬＫＳＥＬＳＧＮＭＥＥＬＩＬＡＬＦＭＰＰＴＹＹＤＡＷＳＬＲＫＡＭＱＧＡＧＴＱＥＲＶＬＩＥＩＬＣＴＲＴＮＱＥＩＲＥＩＶＲＣＹＱＳＥＦＧＲＤＬＥＫＤＩＲＳＤＴＳＧＨＦＥＲＬＬＶＳＭＣＱＧＮＲＤＥＮＱＳＩＮＨＱＭＡＱＥＤＡＱＲＬＹＱＡＧＥＧＲＬＧＴＤＥＳＣＦＮＭＩＬＡＴＲＳＦＰＱＬＲＡＴＭＥＡＹＳＲＭＡＮＲＤＬＬＳＳＶＳＲＥＦＳＧＹＶＥＳＧＬＫＴＩＬＱＣＡＬＮＲＰＡＦＦＡＥＲＬＹＹＡＭＫＧＡＧＴＤＤＳＴＬＶＲＩＶＶＴＲＳＥＩＤＬＶＱＩＫＱＭＦＡＱＭＹＱＫＴＬＧＴＭＩＡＧＤＴＳＧＤＹＲＲＬＬＬＡＩＶＧＱ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿００１２５８６３１．１ アネキシンＡ８アイソフォーム１［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号１１）：ＭＡＷＷＫＳＷＩＥＱＥＧＶＴＶＫＳＳＳＨＦＮＰＤＰＤＡＥＴＬＹＫＡＭＫＧＩＧＶＧＳＱＬＬＳＨＱＡＡＡＦＡＦＰＳＳＡＬＴＳＶＳＰＷＧＱＱＧＨＬＣＣＮＰＡＧＴＮＥＱＡＩＩＤＶＬＴＫＲＳＮＴＱＲＱＱＩＡＫＳＦＫＡＱＦＧＫＤＬＴＥＴＬＫＳＥＬＳＧＫＦＥＲＬＩＶＡＬＭＹＰＰＹＲＹＥＡＫＥＬＨＤＡＭＫＧＬＧＴＫＥＧＶＩＩＥＩＬＡＳＲＴＫＮＱＬＲＥＩＭＫＡＹＥＥＤＹＧＳＳＬＥＥＤＩＱＡＤＴＳＧＹＬＥＲＩＬＶＣＬＬＱＧＳＲＤＤＶＳＳＦＶＤＰＧＬＡＬＱＤＡＱＤＬＹＡＡＧＥＫＩＲＧＴＤＥＭＫＦＩＴＩＬＣＴＲＳＡＴＨＬＬＲＶＦＥＥＹＥＫＩＡＮＫＳＩＥＤＳＩＫＳＥＴＨＧＳＬＥＥＡＭＬＴＶＶＫＣＴＱＮＬＨＳＹＦＡＥＲＬＹＹＡＭＫＧＡＧＴＲＤＧＴＬＩＲＮＩＶＳＲＳＥＩＤＬＮＬＩＫＣＨＦＫＫＭＹＧＫＴＬＳＳＭＩＭＥＤＴＳＧＤＹＫＮＡＬＬＳＬＶＧＳＤＰ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿００１０３５１７３．１ アネキシンＡ８アイソフォーム２［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号１２）：ＭＡＷＷＫＳＷＩＥＱＥＧＶＴＶＫＳＳＳＨＦＮＰＤＰＤＡＥＴＬＹＫＡＭＫＧＩＧＴＮＥＱＡＩＩＤＶＬＴＫＲＳＮＴＱＲＱＱＩＡＫＳＦＫＡＱＦＧＫＤＬＴＥＴＬＫＳＥＬＳＧＫＦＥＲＬＩＶＡＬＭＹＰＰＹＲＹＥＡＫＥＬＨＤＡＭＫＧＬＧＴＫＥＧＶＩＩＥＩＬＡＳＲＴＫＮＱＬＲＥＩＭＫＡＹＥＥＤＹＧＳＳＬＥＥＤＩＱＡＤＴＳＧＹＬＥＲＩＬＶＣＬＬＱＧＳＲＤＤＶＳＳＦＶＤＰＧＬＡＬＱＤＡＱＤＬＹＡＡＧＥＫＩＲＧＴＤＥＭＫＦＩＴＩＬＣＴＲＳＡＴＨＬＬＲＶＦＥＥＹＥＫＩＡＮＫＳＩＥＤＳＩＫＳＥＴＨＧＳＬＥＥＡＭＬＴＶＶＫＣＴＱＮＬＨＳＹＦＡＥＲＬＹＹＡＭＫＧＡＧＴＲＤＧＴＬＩＲＮＩＶＳＲＳＥＩＤＬＮＬＩＫＣＨＦＫＫＭＹＧＫＴＬＳＳＭＩＭＥＤＴＳＧＤＹＫＮＡＬＬＳＬＶＧＳＤＰ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿００３５５９．２ アネキシンＡ９［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号１３）：ＭＳＶＴＧＧＫＭＡＰＳＬＴＱＥＩＬＳＨＬＧＬＡＳＫＴＡＡＷＧＴＬＧＴＬＲＴＦＬＮＦＳＶＤＫＤＡＱＲＬＬＲＡＩＴＧＱＧＶＤＲＳＡＩＶＤＶＬＴＮＲＳＲＥＱＲＱＬＩＳＲＮＦＱＥＲＴＱＱＤＬＭＫＳＬＱＡＡＬＳＧＮＬＥＲＩＶＭＡＬＬＱＰＴＡＱＦＤＡＱＥＬＲＴＡＬＫＡＳＤＳＡＶＤＶＡＩＥＩＬＡＴＲＴＰＰＱＬＱＥＣＬＡＶＹＫＨＮＦＱＶＥＡＶＤＤＩＴＳＥＴＳＧＩＬＱＤＬＬＬＡＬＡＫＧＧＲＤＳＹＳＧＩＩＤＹＮＬＡＥＱＤＶＱＡＬＱＲＡＥＧＰＳＲＥＥＴＷＶＰＶＦＴＱＲＮＰＥＨＬＩＲＶＦＤＱＹＱＲＳＴＧＱＥＬＥＥＡＶＱＮＲＦＨＧＤＡＱＶＡＬＬＧＬＡＳＶＩＫＮＴＰＬＹＦＡＤＫＬＨＱＡＬＱＥＴＥＰＮＹＱＶＬＩＲＩＬＩＳＲＣＥＴＤＬＬＳＩＲＡＥＦＲＫＫＦＧＫＳＬＹＳＳＬＱＤＡＶＫＧＤＣＱＳＡＬＬＡＬＣＲＡＥＤＭ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿００９１２４．２ アネキシンＡ１０［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号１４）：ＭＦＣＧＤＹＶＱＧＴＩＦＰＡＰＮＦＮＰＩＭＤＡＱＭＬＧＧＡＬＱＧＦＤＣＤＫＤＭＬＩＮＩＬＴＱＲＣＮＡＱＲＭＭＩＡＥＡＹＱＳＭＹＧＲＤＬＩＧＤＭＲＥＱＬＳＤＨＦＫＤＶＭＡＧＬＭＹＰＰＰＬＹＤＡＨＥＬＷＨＡＭＫＧＶＧＴＤＥＮＣＬＩＥＩＬＡＳＲＴＮＧＥＩＦＱＭＲＥＡＹＣＬＱＹＳＮＮＬＱＥＤＩＹＳＥＴＳＧＨＦＲＤＴＬＭＮＬＶＱＧＴＲＥＥＧＹＴＤＰＡＭＡＡＱＤＡＭＶＬＷＥＡＣＱＱＫＴＧＥＨＫＴＭＬＱＭＩＬＣＮＫＳＹＱＱＬＲＬＶＦＱＥＦＱＮＩＳＧＱＤＭＶＤＡＩＮＥＣＹＤＧＹＦＱＥＬＬＶＡＩＶＬＣＶＲＤＫＰＡＹＦＡＹＲＬＹＳＡＩＨＤＦＧＦＨＮＫＴＶＩＲＩＬＩＡＲＳＥＩＤＬＬＴＩＲＫＲＹＫＥＲＹＧＫＳＬＦＨＤＩＲＮＦＡＳＧＨＹＫＫＡＬＬＡＩＣＡＧＤＡＥＤＹ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿６６５８７５．１ アネキシンＡ１１アイソフォーム１［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号１５）：ＭＳＹＰＧＹＰＰＰＰＧＧＹＰＰＡＡＰＧＧＧＰＷＧＧＡＡＹＰＰＰＰＳＭＰＰＩＧＬＤＮＶＡＴＹＡＧＱＦＮＱＤＹＬＳＧＭＡＡＮＭＳＧＴＦＧＧＡＮＭＰＮＬＹＰＧＡＰＧＡＧＹＰＰＶＰＰＧＧＦＧＱＰＰＳＡＱＱＰＶＰＰＹＧＭＹＰＰＰＧＧＮＰＰＳＲＭＰＳＹＰＰＹＰＧＡＰＶＰＧＱＰＭＰＰＰＧＱＱＰＰＧＡＹＰＧＱＰＰＶＴＹＰＧＱＰＰＶＰＬＰＧＱＱＱＰＶＰＳＹＰＧＹＰＧＳＧＴＶＴＰＡＶＰＰＴＱＦＧＳＲＧＴＩＴＤＡＰＧＦＤＰＬＲＤＡＥＶＬＲＫＡＭＫＧＦＧＴＤＥＱＡＩＩＤＣＬＧＳＲＳＮＫＱＲＱＱＩＬＬＳＦＫＴＡＹＧＫＤＬＩＫＤＬＫＳＥＬＳＧＮＦＥＫＴＩＬＡＬＭＫＴＰＶＬＦＤＩＹＥＩＫＥＡＩＫＧＶＧＴＤＥＡＣＬＩＥＩＬＡＳＲＳＮＥＨＩＲＥＬＮＲＡＹＫＡＥＦＫＫＴＬＥＥＡＩＲＳＤＴＳＧＨＦＱＲＬＬＩＳＬＳＱＧＮＲＤＥＳＴＮＶＤＭＳＬＡＱＲＤＡＱＥＬＹＡＡＧＥＮＲＬＧＴＤＥＳＫＦＮＡＶＬＣＳＲＳＲＡＨＬＶＡＶＦＮＥＹＱＲＭＴＧＲＤＩＥＫＳＩＣＲＥＭＳＧＤＬＥＥＧＭＬＡＶＶＫＣＬＫＮＴＰＡＦＦＡＥＲＬＮＫＡＭＲＧＡＧＴＫＤＲＴＬＩＲＩＭＶＳＲＳＥＴＤＬＬＤＩＲＳＥＹＫＲＭＹＧＫＳＬＹＨＤＩＳＧＤＴＳＧＤＹＲＫＩＬＬＫＩＣＧＧＮＤ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿００１２６５３３８．１ アネキシンＡ１１アイソフォーム２［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号１６）：ＭＰＰＩＧＬＤＮＶＡＴＹＡＧＱＦＮＱＤＹＬＳＧＭＡＡＮＭＳＧＴＦＧＧＡＮＭＰＮＬＹＰＧＡＰＧＡＧＹＰＰＶＰＰＧＧＦＧＱＰＰＳＡＱＱＰＶＰＰＹＧＭＹＰＰＰＧＧＮＰＰＳＲＭＰＳＹＰＰＹＰＧＡＰＶＰＧＱＰＭＰＰＰＧＱＱＰＰＧＡＹＰＧＱＰＰＶＴＹＰＧＱＰＰＶＰＬＰＧＱＱＱＰＶＰＳＹＰＧＹＰＧＳＧＴＶＴＰＡＶＰＰＴＱＦＧＳＲＧＴＩＴＤＡＰＧＦＤＰＬＲＤＡＥＶＬＲＫＡＭＫＧＦＧＴＤＥＱＡＩＩＤＣＬＧＳＲＳＮＫＱＲＱＱＩＬＬＳＦＫＴＡＹＧＫＤＬＩＫＤＬＫＳＥＬＳＧＮＦＥＫＴＩＬＡＬＭＫＴＰＶＬＦＤＩＹＥＩＫＥＡＩＫＧＶＧＴＤＥＡＣＬＩＥＩＬＡＳＲＳＮＥＨＩＲＥＬＮＲＡＹＫＡＥＦＫＫＴＬＥＥＡＩＲＳＤＴＳＧＨＦＱＲＬＬＩＳＬＳＱＧＮＲＤＥＳＴＮＶＤＭＳＬＡＱＲＤＡＱＥＬＹＡＡＧＥＮＲＬＧＴＤＥＳＫＦＮＡＶＬＣＳＲＳＲＡＨＬＶＡＶＦＮＥＹＱＲＭＴＧＲＤＩＥＫＳＩＣＲＥＭＳＧＤＬＥＥＧＭＬＡＶＶＫＣＬＫＮＴＰＡＦＦＡＥＲＬＮＫＡＭＲＧＡＧＴＫＤＲＴＬＩＲＩＭＶＳＲＳＥＴＤＬＬＤＩＲＳＥＹＫＲＭＹＧＫＳＬＹＨＤＩＳＧＤＴＳＧＤＹＲＫＩＬＬＫＩＣＧＧＮＤ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿００４２９７．２ アネキシンＡ１３アイソフォームａ［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号１７）：ＭＧＮＲＨＡＫＡＳＳＰＱＧＦＤＶＤＲＤＡＫＫＬＮＫＡＣＫＧＭＧＴＮＥＡＡＩＩＥＩＬＳＧＲＴＳＤＥＲＱＱＩＫＱＫＹＫＡＴＹＧＫＥＬＥＥＶＬＫＳＥＬＳＧＮＦＥＫＴＡＬＡＬＬＤＲＰＳＥＹＡＡＲＱＬＱＫＡＭＫＧＬＧＴＤＥＳＶＬＩＥＶＬＣＴＲＴＮＫＥＩＩＡＩＫＥＡＹＱＲＬＦＤＲＳＬＥＳＤＶＫＧＤＴＳＧＮＬＫＫＩＬＶＳＬＬＱＡＮＲＮＥＧＤＤＶＤＫＤＬＡＧＱＤＡＫＤＬＹＤＡＧＥＧＲＷＧＴＤＥＬＡＦＮＥＶＬＡＫＲＳＹＫＱＬＲＡＴＦＱＡＹＱＩＬＩＧＫＤＩＥＥＡＩＥＥＥＴＳＧＤＬＱＫＡＹＬＴＬＶＲＣＡＱＤＣＥＤＹＦＡＥＲＬＹＫＳＭＫＧＡＧＴＤＥＥＴＬＩＲＩＶＶＴＲＡＥＶＤＬＱＧＩＫＡＫＦＱＥＫＹＱＫＳＬＳＤＭＶＲＳＤＴＳＧＤＦＲＫＬＬＶＡＬＬＨ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿００１００３９５４．１ アネキシンＡ１３アイソフォームｂ［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号１８）：ＭＧＮＲＨＳＱＳＹＴＬＳＥＧＳＱＱＬＰＫＧＤＳＱＰＳＴＶＶＱＰＬＳＨＰＳＲＮＧＥＰＥＡＰＱＰＡＫＡＳＳＰＱＧＦＤＶＤＲＤＡＫＫＬＮＫＡＣＫＧＭＧＴＮＥＡＡＩＩＥＩＬＳＧＲＴＳＤＥＲＱＱＩＫＱＫＹＫＡＴＹＧＫＥＬＥＥＶＬＫＳＥＬＳＧＮＦＥＫＴＡＬＡＬＬＤＲＰＳＥＹＡＡＲＱＬＱＫＡＭＫＧＬＧＴＤＥＳＶＬＩＥＶＬＣＴＲＴＮＫＥＩＩＡＩＫＥＡＹＱＲＬＦＤＲＳＬＥＳＤＶＫＧＤＴＳＧＮＬＫＫＩＬＶＳＬＬＱＡＮＲＮＥＧＤＤＶＤＫＤＬＡＧＱＤＡＫＤＬＹＤＡＧＥＧＲＷＧＴＤＥＬＡＦＮＥＶＬＡＫＲＳＹＫＱＬＲＡＴＦＱＡＹＱＩＬＩＧＫＤＩＥＥＡＩＥＥＥＴＳＧＤＬＱＫＡＹＬＴＬＶＲＣＡＱＤＣＥＤＹＦＡＥＲＬＹＫＳＭＫＧＡＧＴＤＥＥＴＬＩＲＩＶＶＴＲＡＥＶＤＬＱＧＩＫＡＫＦＱＥＫＹＱＫＳＬＳＤＭＶＲＳＤＴＳＧＤＦＲＫＬＬＶＡＬＬＨ
Ｒｅｆｓｅｑ受託番号ＮＰ＿００１３５００４３．１ アネキシンＡ６アイソフォーム３［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（配列番号４５）：ＭＡＫＰＡＱＧＡＫＹＲＧＳＩＨＤＦＰＧＦＤＰＮＱＤＡＥＡＬＹＴＡＭＫＧＦＧＳＤＫＥＡＩＬＤＩＩＴＳＲＳＮＲＱＲＱＥＶＣＱＳＹＫＳＬＹＧＫＤＬＩＡＤＬＫＹＥＬＴＧＫＦＥＲＬＩＶＧＬＭＲＰＰＡＹＣＤＡＫＥＩＫＤＡＩＳＧＩＧＴＤＥＫＣＬＩＥＩＬＡＳＲＴＮＥＱＭＨＱＬＶＡＡＹＫＤＡＹＥＲＤＬＥＡＤＩＩＧＤＴＳＧＨＦＱＫＭＬＶＶＬＬＱＧＴＲＥＥＤＤＶＶＳＥＤＬＶＱＱＤＶＱＤＬＹＥＡＧＥＬＫＷＧＴＤＥＡＱＦＩＹＩＬＧＮＲＳＫＱＨＬＲＬＶＦＤＥＹＬＫＴＴＧＫＰＩＥＡＳＩＲＧＥＬＳＧＤＦＥＫＬＭＬＡＶＶＫＣＩＲＳＴＰＥＹＦＡＥＲＬＦＫＡＭＫＧＬＧＴＲＤＮＴＬＩＲＩＭＶＳＲＳＥＬＤＭＬＤＩＲＥＩＦＲＴＫＹＥＫＳＬＹＳＭＩＫＮＤＴＳＧＥＹＫＫＴＬＬＫＬＳＧＧＤＤＤＡＡＧＱＦＦＰＥＡＡＱＶＡＹＱＭＷＥＬＳＡＶＡＲＶＥＬＫＧＴＶＲＰＡＮＤＦＮＰＤＡＤＡＫＡＬＲＫＡＭＫＧＬＧＴＤＥＤＴＩＩＤＩＩＴＨＲＳＮＶＱＲＱＱＩＲＱＴＦＫＳＨＦＧＲＤＬＭＴＤＬＫＳＥＩＳＧＤＬＡＲＬＩＬＧＬＭＭＰＰＡＨＹＤＡＫＱＬＫＫＡＭＥＧＡＧＴＤＥＫＡＬＩＥＩＬＡＴＲＴＮＡＥＩＲＡＩＮＥＡＹＫＥＤＹＨＫＳＬＥＤＡＬＳＳＤＴＳＧＨＦＲＲＩＬＩＳＬＡＴＧＨＲＥＥＧＧＥＮＬＤＱＡＲＥＤＡＱＥＩＡＤＴＰＳＧＤＫＴＳＬＥＴＲＦＭＴＩＬＣＴＲＳＹＰＨＬＲＲＶＦＱＥＦＩＫＭＴＮＹＤＶＥＨＴＩＫＫＥＭＳＧＤＶＲＤＡＦＶＡＩＶＱＳＶＫＮＫＰＬＦＦＡＤＫＬＹＫＳＭＫＧＡＧＴＤＥＫＴＬＴＲＩＭＶＳＲＳＥＩＤＬＬＮＩＲＲＥＦＩＥＫＹＤＫＳＬＨＱＡＩＥＧＤＴＳＧＤＦＬＫＡＬＬＡＬＣＧＧＥＤ
本開示はまた、前述のアネキシンタンパク質のそれぞれをコードする対応するポリヌクレオチドを企図している。以下のポリヌクレオチドは、本開示による使用が企図されている。具体的には、以下のポリヌクレオチドは、アネキシンタンパク質の活性を増加させるために本開示のベクターと共に使用することが企図されているメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列である。上記のように、本明細書の同じアネキシン種に関連するｍＲＮＡ配列を同定するために複数の配列識別子が使用される場合（例えば、アネキシンＡ２に関連するｍＲＮＡ配列は、本明細書において配列番号２０および配列番号２１によって同定される）、異なる配列識別子は、特定のアネキシンタンパク質に翻訳される本開示のベクターと共に利用され得る転写バリアントを同定するのに役立つこと、および転写バリアントは、本開示の方法および組成物において互換的にまたは組み合わせて使用され得ることが理解される。
ＮＭ＿０００７００．３ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ アネキシンＡ１（ＡＮＸＡ１）、ｍＲＮＡ（配列番号１９）
ＡＧＴＧＴＧＡＡＡＴＣＴＴＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＴＴＴＣＴＣＴＴＴＡＧＴＴＣＴＴＴＧＣＡＡＧＡＡＧＧＴＡＧＡＧＡＴＡＡＡＧＡＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＧＧＣＡＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＧＣＣＴＧＧＴＴＴＡＴＴＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＴＡＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＴＧＡＡＧＴＣＡＴＣＣＡＡＡＧＧＴＧＧＴＣＣＣＧＧＡＴＣＡＧＣＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＴＡＴＣＣＴＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＣＡＴＣＣＴＣＧＧＡＴＧＴＣＧＣＴＧＣＣＴＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＡＡＴＧＧＴＴＡＡＡＧＧＴＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣＡＡＣＣＡＴＣＡＴＴＧＡＣＡＴＴＣＴＡＡＣＴＡＡＧＣＧＡＡＡＣＡＡＴＧＣＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡＣＡＧＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＣＡＴＡＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＡＣＡＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＴＴＡＣＡＧＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＧＧＡＧＧＴＴＧＴＴＴＴＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＧＣＧＣＡＡＴＴＴＧＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＡＣＴＣＴＡＡＴＴＧＡＧＡＴＴＴＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＡＧＡＧＡＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＧＴＣＴＡＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＴＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＡＡＣＣＴＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＡＴＴＴＴＣＧＧＡＡＣＧＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＴＡＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＴＴＧＧＴＧＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＣＴＴＧＧＣＴＧＡＴＴＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＣＡＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＡＴＡＣＣＡＴＣＣＴＴＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＣＴＡＴＣＣＡＣＡＡＣＴＴＣＧＣＡＧＡＧＴＧＴＴＴＣＡＧＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＡＧＴＡＣＡＧＴＡＡＧＣＡＴＧＡＣＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧＴＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＴＴＧＡＡＡＧＧＴＧＡＣＡＴＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＣＴＣＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＴＧＡＡＧＴＧＣＧＣＣＡＣＡＡＧＣＡＡＡＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＡＧＡＧＡＡＧＣＴＴＣＡＴＣＡＡＧＣＣＡＴＧＡＡＡＧＧＴＧＴＴＧＧＡＡＣＴＣＧＣＣＡＴＡＡＧＧＣＡＴＴＧＡＴＣＡＧＧＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＡＴＧＡＡＴＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＣＡＴＴＣＴＡＴＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＡＴＧＧＴＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＡＧＡＴＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＴＴＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＡＡＡＣＡＴＴＣＣＣＴＴＧＡＴＧＧＴＣＴＣＡＡＧＣＴＡＴＧＡＴＣＡＧＡＡＧＡＣＴＴＴＡＡＴＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＣＡＴＣＣＴＡＴＡＡＧＣＴＴＡＡＡＴＡＧＧＡＡＡＧＴＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＣＡＧＴＧＴＡＧＣＴＡＣＣＴＡＣＡＴＧＣＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＡＴＡＡＣＴＣＴＧＴＡＴＡＡＴＡＧＡＧＡＴＡＡＧＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧＴＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣＣＡＴＡＡＡＡＣＣＣＴＡＴＡＣＡＡＧＴＴＧＴＴＣＴＡＧＴＡＡＣＡＡＴＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＧＡＴＧＴＣＴＡＴＧＴＡＧＣＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＣＧＴＣＡＣＡＡＧＡＣＡＡ
ＮＭ＿００１００２８５８．２ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ アネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）、転写バリアント１、ｍＲＮＡ（配列番号２０）
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ＮＭ＿００１１３６０１５．２ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ アネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）、転写バリアント４、ｍＲＮＡ（配列番号２１）
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ＮＭ＿００１１５４．４ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ アネキシンＡ５（ＡＮＸＡ５）、ｍＲＮＡ（配列番号２４）
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ＮＭ＿００１１５５．５ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ アネキシンＡ６（ＡＮＸＡ６）、転写バリアント１、ｍＲＮＡ（配列番号２５）
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ＮＭ＿００１１９３５４４．１ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ アネキシンＡ６（ＡＮＸＡ６）、転写バリアント２、ｍＲＮＡ（配列番号２６）
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ＮＭ＿００１１５６．５ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ アネキシンＡ７（ＡＮＸＡ７）、転写バリアント１、ｍＲＮＡ（配列番号２７）
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ＮＭ＿００４０３４．３ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ アネキシンＡ７（ＡＮＸＡ７）、転写バリアント２、ｍＲＮＡ（配列番号２８）
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ＮＭ＿００１２７１７０２．１ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ アネキシンＡ８（ＡＮＸＡ８）、転写バリアント１、ｍＲＮＡ（配列番号２９）
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ＮＭ＿００７１９３．４ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ アネキシンＡ１０（ＡＮＸＡ１０）、ｍＲＮＡ（配列番号３２）
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ＮＭ＿１４５８６８．２ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ アネキシンＡ１１（ＡＮＸＡ１１）、転写バリアントｂ、ｍＲＮＡ（配列番号３３）
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ＮＭ＿００１２７８４０９．１ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ アネキシンＡ１１（ＡＮＸＡ１１）、転写バリアントｆ、ｍＲＮＡ（配列番号３４）
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ＮＭ＿００１３６３１１４．２ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ アネキシンＡ６（ＡＮＸＡ６）、転写バリアント３、ｍＲＮＡ（配列番号４６）：ＧＣＧＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＡＣＧＧＧＣＴＣＣＧＡＴＣＣＡＧＣＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＧＴＧＣＧＴＣＣＧＴＣＴＧＣＧＡＣＣＣＧＡＧＧＣＣＴＣＣＧＣＴＧＣＧＣＧＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＣＣＧＧＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＡＣＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴＣＣＡＴＧＡＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＡＣＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＧＧＣＡＧＴＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＡＣＴＧＧＡＣＡＴＡＡＴＣＡＣＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＴＡＣＡＡＧＴＣＣＣＴＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＴＧＣＴＧＡＴＴＴＡＡＡＧＴＡＴＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＣＡＡＧＴＴＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧＡＴＴＧＴＧＧＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＣＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＣＴＣＧＧＧＣＡＴＴＧＧＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＡＡＧＴＧＣＣＴＣＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＣＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＴＡＣＡＡＡＧＡＴＧＣＣＴＡＣＧＡＧＣＧＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＣＡＴＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＡＣＣＴＣＴＧＧＣＣＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＣＴＴＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＣＧＴＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＴＡＣＡＡＣＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＡＴＡＣＧＡＧＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＴＧＧＧＧＡＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＴＴＣＡＴＴＴＡＣＡＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＴＣＧＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＧＧＴＴＧＧＴＧＴＴＣＧＡＴＧＡＧＴＡＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＡＣＡＧＧＧＡＡＧＣＣＧＡＴＴＧＡＡＧＣＣＡＧＣＡＴＣＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＴＧＴＣＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＧＡＧＡＡＧＣＴＡＡＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＡＧＴＧＡＡＧＴＧＴＡＴＣＣＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＧＧＡＡＴＡＴＴＴＴＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＣＴＡＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＴＣＧＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＣＣＧＣＡＴＣＡＴＧＧＴＣＴＣＣＣＧＴＡＧＴＧＡＧＴＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＧＡＣＡＴＴＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＧＡＣＣＡＡＧＴＡＴＧＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＴＧＡＴＣＡＡＧＡＡＴＧＡＣＡＣＣＴＣＴＧＧＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＧＴＴＣＴＴＣＣＣＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＣＡＧＧＴＧＧＣＣＴＡＴＣＡＧＡＴＧＴＧＧＧＡＡＣＴＴＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＣＣＧＡＧＴＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＡＡＴＧＡＣＴＴＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＡＡＡＧＣＣＡＴＧＡＡＧＧＧＡＣＴＣＧＧＧＡＣＴＧＡＣＧＡＡＧＡＣＡＣＡＡＴＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＡＴＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＧＴＣＴＣＡＣＴＴＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＡＡＴＧＡＣＴＧＡＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＡＧＡＴＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＣＧＧＣＣＣＡＴＴＡＣＧＡＴＧＣＣＡＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＧＡＧＣＣＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＡＴＴＧＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＣＡＣＴＣＧＧＡＣＣＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＣＣＧＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＣＣＴＡＴＡＡＧＧＡＧＧＡＣＴＡＴＣＡＣＡＡＧＴＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＴＧＧＣＣＡＣＴＴＣＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＴＣＴＣＴＧＧＣＣＡＣＧＧＧＧＣＡＴＣＧＴＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＧＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＣＡＧＧＡＡＡＴＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＣＣＴＡＧＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＴＧＧＡＧＡＣＡＣＧＴＴＴＣＡＴＧＡＣＧＡＴＣＣＴＧＴＧＴＡＣＣＣＧＧＡＧＣＴＡＴＣＣＧＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＣＴＡＴＧＡＣＧＴＧＧＡＧＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＡＴＧＴＣＡＧＧＧＡＴＧＣＡＴＴＴＧＴＧＧＣＣＡＴＴＧＴＴＣＡＡＡＧＴＧＴＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣＣＴＣＴＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＧＡＣＡＡＡＣＴＴＴＡＣＡＡＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＧＧＴＧＣＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＡＴＣＡＴＧＧＴＡＴＣＣＣＧＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＡＧＡＡＡＴＡＴＧＡＣＡＡＧＴＣＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＣＣＡＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＧＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＧＡＣＴＡＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＴＴＧＧＣＧＧＧＣＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＴＧＧＴＴＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＡＴＴＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＴＡＡＧＧＡＡＧＧＧＧＣＡＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＣＴＣＴＴＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＧＡＧＣＴＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＧＧＧＣＣＡＴＣＧＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＡＣＧＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＡＡＡＣＣＧＴＡＧＣＣＡＴＡＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＴＣＴＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＴＴＣＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＣＴＴＧＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＴＴＧＧＧＣＴＡＴＧＴＣＡＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣＣＴＣＴＧＴＣＴＧＴＡＡＡＡＴＧＡＧＴＡＧＴＧＴＣＴＧＴＡＣＴＴＴＧＡＡＴＧＡＧＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＣＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＴＧＡＡＴＧＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＧＡＴＡＧＴＡＡＡＴＧＴＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＡＣＴＧＡＣＡＡＡＴＣＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＴＴＴＣＡＣＣＡＣＣＣＡＴＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＧＣＧＣＴＡＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＴＴＧＧＡＴＧＣＣＴＧＧＧＴＴＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＣＣＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＡＧＴＣＴＣＴＡＴＴＴＴＣＴＴＡＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＣＡＧＴＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＧＧＣＴＴＣＣＣＴＴＣＴＡＡＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＣＴＡＡＡＧＴＡＴＧＣＣＴＣＣＧＡＴＴＣＡＴＴＣＣＣＴＴＧＡＣＡＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＣＴＡＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＡＡＡＧＡＧＡＴＡＣＡＣＡＡＡＣＡＣＡＴＡＡＡＣＡＣＡ
治療エンドポイント
本開示のさまざまな態様において、本明細書に記載されるような薬剤および任意の追加薬剤の使用により、薬剤および／または追加薬剤を投与されていない患者と比較して、特定の治療エンドポイントに関連する１つ以上の利益が得られる。
クレアチンキナーゼ（ＣＫ）は、骨格筋、心臓、腎臓、および脳の損傷の臨床的に検証された血清バイオマーカーである。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、骨格筋、心臓、腎臓、肝臓、肺、および脳の損傷の臨床的に検証された血清バイオマーカーである。血清中のクレアチンキナーゼおよび乳酸脱水素酵素のレベルは、急性組織損傷および慢性組織損傷の両方により上昇する。同等の筋肉量レベルの理論的または検証された条件では、クレアチンキナーゼおよび／または乳酸脱水素酵素の減少は、損傷の修復または損傷に対する保護が増強されたことを示している可能性がある。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）は、骨格筋、心臓、腎臓、肝臓、および脳の損傷のさらに別の臨床的に検証された血清バイオマーカーである。さらに、血清トロポニンの増加は心臓損傷を示し、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の上昇は肝損傷のバイオマーカーである。損傷後の急性期におけるＡＳＴ、ＡＬＴ、またはトロポニンの減少は、損傷の修復または損傷に対する保護が増強されたことを示している可能性がある。エバンスブルーデューは、血清アルブミンに結合する重要な色素であり、通常、健康で無傷の筋肉から排除される。急性損傷または慢性損傷による膜の破壊は、損傷した細胞への色素の流入を促進する。エバンスブルー色素は、実験環境での細胞損傷を定量するため、固有の色素蛍光を測定するため、および／または放射性標識色素の取り込みの測定により、一般的に使用される。急性損傷後または慢性損傷のモデルにおける色素取り込みの減少は、損傷に対する保護および／または修復の増強を示す。インドシアニングリーン（ＩＣＧ）は、血漿タンパク質に結合する近距離色素であり、心臓、肝臓、腎臓、皮膚、血管系、肺、筋肉、および眼を含む臓器の血流および組織損傷（虚血、壊死）を評価するために臨床的に使用される。血流の改善および虚血領域の減少は、損傷に対する保護および／または修復の改善を示す。
膜の完全性および修復の増加は、プレチスモグラフィー、心エコー検査、筋力、６分間の歩行試験を含む複数のモダリティを通じて測定される機能を増強させると考えられている。さらに、壊死の減少、炎症の減少、線維症の減少、脂肪浸潤の減少、浮腫の減少などの組織学的利益が認められる場合がある。これらの有益な効果は、ＭＲおよびＰＥＴイメージングでも確認できる。
投薬／投与／キット
特定の対象に対する特定の投与レジメンは、部分的に、使用される薬剤および任意の追加薬剤、投与される薬剤および任意の追加薬剤の量、投与経路、治療される特定の疾患、ならびにあらゆる副作用の原因および程度に依存するであろう。対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与される薬剤および任意の追加薬剤の量は、所望の応答をもたらすのに十分である。投与量は、通常、使用される特定の薬剤および／または追加の薬剤、対象の年齢および体重、ならびに対象における任意の疾患または障害の存在および重症度を含む、さまざまな要因に依存する。用量の大きさは、投与の経路、タイミング、および頻度によっても決定されるであろう。したがって、臨床医は、最適な療法効果を得るために、投与量の力価を定め、投与経路を調節する。従来の範囲探索の技術は、当業者に既知である。純粋に例示として、いくつかの実施形態において、この方法は、上記の要因に応じて、例えば、約０．１μｇ／ｋｇ～最大約１００ｍｇ／ｋｇ以上の薬剤（例えば、タンパク質）を投与することを含む。他の実施形態では、投与量は、１μｇ／ｋｇ～最大約７５ｍｇ／ｋｇ、または５μｇ／ｋｇ～最大約５０ｍｇ／ｋｇ、または１０μｇ／ｋｇ～最大約２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。特定の実施形態において、用量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ）の薬剤および任意の追加薬剤を含む。薬剤および追加の薬剤が投与される実施形態において、上記の投与量は、投与される各薬剤の量を表すことが企図され、またはさらなる実施形態において、投与量は、投与される総投与量を表す。慢性状態が治療されるいくつかの実施形態において、対象は、数週間、数ヶ月、または数年続く治療過程にわたって薬剤および／または追加の薬剤を受け取り、毎日または毎週１回以上の用量を必要とし得ることが想定される。本開示の態様または実施形態のうちのいずれにおいても、薬学的組成物中のアネキシンタンパク質の量は、上記の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ～最大約１００ｍｇ／ｋｇ以上である。他の実施形態では、投与量は、１μｇ／ｋｇ～最大約７５ｍｇ／ｋｇ、または５μｇ／ｋｇ～最大約５０ｍｇ／ｋｇ、または１０μｇ／ｋｇ～最大約２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、用量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ）のアネキシンタンパク質を含む。投薬はまた、１日１回、１日２回（ＢＩＤ）または１日３回（ＴＩＤ）の投薬についても企図される。単位用量は、カプセルまたは錠剤のいずれかの形態で処方することができる。他の実施形態において、薬剤および任意の追加薬剤は、比較的短い治療期間、例えば、１日から１４日の間、急性状態（例えば、急性筋肉損傷または急性心筋損傷）を治療するために投与される。
本明細書に記載の薬剤（例えば、組換えタンパク質）および任意の追加薬剤を含む薬学的組成物などの生理学的に許容される組成物を投与する適切な方法は、当技術分野で周知である。２つ以上の経路を使用して化合物を投与することができるが、特定の経路は別の経路よりも迅速かつ効果的な手段となり得る。状況に応じて、薬学的組成物は、体腔に適用または滴下注入され、皮膚もしくは粘膜を通じて吸収され、摂取され、吸入され、かつ／または循環血液中に導入される。いくつかの実施形態において、薬剤および／または追加の薬剤を含む組成物は、静脈内、動脈内、または腹腔内に投与されて、薬剤および任意の追加薬剤を循環に導入する。特に低分子量治療に関しては、非静脈内投与も適切である。特定の状況において、薬剤および／または追加の薬剤を含む薬学的組成物を、経口的に、局所的に、舌下的に、膣内に、直腸に、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、門脈内、病変内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、鼻腔内、尿道、または経腸手段による注射によって；徐放性システムによって；または埋め込みデバイスによって送達することが望ましい。必要に応じて、薬剤および／または追加の薬剤は、目的の領域への動脈内または静脈内投与を介して、例えば、脚への送達のために大腿動脈を介して局所的に投与される。一実施形態において、組成物は、膜、スポンジ、または別の適切な材料の移植を介して投与され、その中に、またはその上に、所望の薬剤および任意の追加薬剤が吸収またはカプセル化されている。移植デバイスが使用される場合、一態様でのデバイスは、任意の好適な組織に移植され、所望の薬剤および／または追加薬剤の送達は、さまざまな実施形態において、拡散、徐放ボーラス、または連続投与を介して行われる。他の実施形態において、薬剤および任意の追加薬剤は、外科的処理または損傷の治療中に露出した組織に直接投与されるか、または血液製剤の輸血を介して投与される。治療的送達アプローチは当業者に周知であり、そのいくつかは、例えば、米国特許第５，３９９，３６３号にさらに記載されている。
投与を容易にするいくつかの実施形態において、一実施形態における薬剤および任意の追加薬剤は、担体（すなわち、ビヒクル、アジュバント、緩衝液、または希釈剤）を含む生理学的に許容される組成物に処方される。使用される特定の担体は、溶解度ならびに薬剤および／または追加薬剤との反応性の欠如などの化学的物理的考慮事項、投与経路、および必要条件によってのみ制限される。生理学的に許容される担体は、当技術分野で周知である。注射可能物の使用に好適な例示的薬学的形態には、滅菌水溶液または分散液、および注射可能な滅菌溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれるが、これらに限定されない（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照のこと）。注射可能な製剤は、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ．Ｐａ．，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ ２３８－２５０（１９８２）、およびＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ．，ｐａｇｅｓ ６２２－６３０（１９８６）（参照により本明細書に組み込まれる）にさらに記載されている。
本明細書で提供される薬剤（例えば、組換えタンパク質）および任意の追加薬剤を含む薬学的組成物は、そのような薬学的組成物の使用に関する指示を提供するパッケージ材料と共に、任意選択的に容器／キット内に配置される。一般に、そのような指示には、試薬濃度、ならびにある特定の実施形態において、薬学的組成物を再構成するのに必要であり得る賦形剤成分または希釈剤の相対量を説明する具体的な表現が含まれる。
したがって、本開示は、対象に、１つ以上の薬剤を、各々がその薬剤に好適なレジメンに従って投与される１つ以上の追加薬剤と組み合わせて投与することを含む。いくつかの実施形態において、薬剤は、アネキシンタンパク質（例えば、アネキシンＡ６）などの組換えタンパク質である。この態様には、薬剤および１つ以上の追加薬剤の同時投与（すなわち、実質的に同時の投与）および非同時投与（すなわち、重複するか否かにかかわらず、任意の順序で異なる時点での投与）が含まれる。ある特定の態様では、異なる成分が、同じまたは別個の組成物で、同じまたは異なる投与経路によって任意選択的に投与されることが理解されよう。
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、および特許出願は、各々の個別の出版物または特許出願が参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示されるように、参照によって本明細書に組み込まれる。文書全体は、統一された開示として関連することが意図されており、特徴の組み合わせがこの文書と同じ文章、または段落、またはセクションで一緒に見られない場合でも、本明細書に記載される特徴のすべての組み合わせが企図されることを理解されたい。例えば、タンパク質療法が記載されている場合、（タンパク質をコードするポリヌクレオチド／ベクターを使用する）ポリヌクレオチド療法を含む実施形態が具体的に企図され、その逆もまた真である。セット内の１つ以上のメンバーとして記載される要素に関して、セット内のすべての組み合わせが企図されることを理解されたい。
次の実施例は、レーザー誘発損傷後のアネキシンキャップ形成およびＣａ2+ダイナミクスを視覚化するために、リアルタイムの高解像度イメージングにより筋膜修復を監視した実験の結果を示している。本明細書では、アネキシンタンパク質の過剰発現が、細胞内Ｃａ2+蓄積の減少と相関する、膜損傷部位での細胞外ブレブ形成を誘導したことが実証される。組換えアネキシンＡ６による前処理は、インビトロおよびインビボでの筋肉損傷を防いだ。組換えアネキシンＡ６による後処理は、インビボでの筋肉修復を増強した。アネキシンＡ６の過剰発現は、筋線維膜修復を増強し、一方、ドミナントネガティブなアネキシンＡ６変異体タンパク質の過剰発現は、膜修復能力を低下させた。さらに、細胞外組換えアネキシンＡ６タンパク質による治療は、野生型筋線維およびジストロフィー筋線維の両方のレーザー誘発筋肉損傷を軽減した。さらに、組換えアネキシンＡ６の投与は、複数の投与経路を使用して、インビボでの毒素誘発筋肉損傷から保護した。さらに、ジストロフィーマウスにおいて、組換えアネキシンＡ６を投与することにより、クレアチンキナーゼおよび乳酸脱水素酵素の循環レベルが低下し、これは、膜修復が増強されたことを示している。本明細書で提供されるデータは、アネキシンタンパク質が膜修復の重要なアゴニストであり、組換えアネキシンＡ６が、筋肉損傷および筋ジストロフィーのような膜の脆弱性に起因する状態を治療するための治療標的であることを示している。
アネキシンＡ６をコードする遺伝子であるＡｎｘａ６の多型は、筋肉修復障害と相関するいくつかの一般的に使用される実験マウス系統において以前に同定された（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６ａ、Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７ｂ、Ｓｗａｇｇａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。この多型は、筋鞘の修復を妨害する短縮型アネキシンＡ６タンパク質を生成した。マウスでのさらなる研究では、アネキシンＡ２の喪失により、筋線維の修復が不十分になることが示されている（Ｄｅｆｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
筋膜修復中のアネキシンＣａ2+結合を調査し、損傷後のアネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６修復キャップ形成の動態を評価した。アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６のＣａ2+配位残基の変異は、通常のアネキシン修復キャップの形成を妨害した。アネキシンの過剰発現は、膜損傷部位での外部ブレブの形成を促進し、ブレブが修復キャップから放出された。アネキシンＡ６の過剰発現によって、より大きなブレブが形成され、ブレブが修復キャップから放出された。これらの小胞は、Ｃａ2+結合タンパク質であるＧＣａＭＰ５Ｇが豊富であり、これは、損傷部位での細胞内Ｃａ2+蛍光の減少と相関していた。アネキシンＡ６の過剰発現は膜損傷を減少させ、一方、アネキシンＡ６における重要なＣａ2+配位残基であるＥ２３３の変異は、アネキシン修復複合体形成を妨害し、修復能力の低下と相関していた。組換えアネキシンＡ６による局所治療および全身治療は、筋肉損傷を軽減し、インビボでの膜修復を促進した。本明細書で提供されるデータは、膜修復中の筋膜病変からのブレブ放出におけるアネキシンの新たな役割を特定し、膜修復能力を増強するための治療標的としてアネキシンＡ６を特定する。
実施例１
材料および方法
動物。１２９Ｔ２／ＳｖＥｍｓＪバックグラウンドの野生型マウスを、特定病原体除去施設において１２時間の明暗サイクルで飼育・収容し、ノースウェスタン大学の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の規則に従って自由に餌を与えた。１２９Ｔ２／ＳｖＥｍｓＪ（１２９Ｔ２）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州ベンハーバー（Ｂｅｎ Ｈａｒｂｏｒ）；ストック番号００２０６５）から購入した。ｍｄｘ／ｈＬＴＢＰ４マウスは、（Ｃｅｃｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７ｂ）に記載されているように生成し、ｓｇｃｇ欠損マウスは、（Ｈａｃｋ ｅｔ ａｌ １９９８）に記載されているように生成した。すべての実験には、生後２～３か月のオスおよびメスを使用した。
プラスミド。カルボキシル末端ｔｕｒｂｏＧＦＰタグを有するアネキシンＡ１、Ａ２およびＡ６をコードするプラスミドは、Ｏｒｉｇｅｎｅ（メリーランド州ロックビル）から入手した。ＧＦＰタグをｔｄＴｏｍａｔｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ）に置き換えるためのアネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６のサブクローニングを、Ｍｕｔａｇｅｎｉｘ（ジョージア州スワニー）によって実行した。アネキシンＡ１－ＧＦＰ、Ａ２－ＧＦＰ、およびＡ６－ＧＦＰに対する部位特異的変異誘発を、Ｍｕｔａｇｅｎｉｘによって実行して、Ｃａ2+結合変異体Ａ１－Ｄ１７１Ａ－ＧＦＰ、Ａ２－Ｄ１６１Ａ－ＧＦＰ、Ａ６－Ｄ１４９Ａ－ＧＦＰ、およびＡ６－Ｅ２３３Ａ－ＧＦＰを作製した。変異誘発を検証するために、構築物を配列決定した。ＱｉａｇｅｎのＥｎｄｏ－Ｆｒｅｅ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ＃１２３６２）を使用してプラスミドＤＮＡを単離した。Ｃａ2+センサーＧＣａＭＰ５Ｇは、（Ａｄｄｇｅｎｅ＃３１７８８）から購入した。
配列の比較およびタンパク質の概略図。タンパク質リボン図を、ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇで入手可能なアネキシンＡ１（１ＭＣＸ）、Ａ２（２ＨＹＷ）、およびアネキシンＡ６（１ＡＶＣ）の解決された（ｓｏｌｖｅｄ）結晶構造を使用してＳｗｉｓｓ－ＰｄｂＶｉｅｗｅｒを使用して生成した。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）のＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからのアネキシンマウス配列であるアネキシンＡ１（ＮＭ＿０１０７３０、配列番号３７）、Ａ２（ＮＭ＿００７５８５、配列番号３８）およびＡ６（ＮＭ＿０１３４７２、配列番号３９）をアラインメントした。
エレクトロポレーション、筋線維の単離、レーザー損傷、キャップおよび小胞の測定。インビボでのエレクトロポレーションによって、短趾屈筋（ＦＤＢ）線維に、エンドフリープラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。方法は、以前に（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ，２０１５、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ、ＤｉＦｒａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．，２００９）に記載されている。Ｚスタック投影を、最後のタイムラプスフレーム後、損傷から約４分後、スライス間のステップサイズが０．１２５μＭの連続取得から取得した。ＺスタックのレンダリングはＦＩＪＩにおいて構築された。キャップ面積およびフェレット直径の測定は、ＦＩＪＩイメージングツールを使用して、ｚスタックの中央近くの単一のスライスから行った。同様のレベルのタグ付きまたはＧＣａＭＰ５Ｇタンパク質を発現する線維を比較した。ＧＣａＭＰ５ＧのＣａ2+蛍光は、ＦＩＪＩを使用して損傷部位の下の筋線維内に配置された標準の長方形ＲＯＩを使用して、取得したタイムラプス画像から測定した。蛍光はＦ／Ｆ０として表した。外部小胞数およびＧＣａＭＰ５Ｇ面積は、ＦＩＪＩを使用してエンドポイントｚスタックおよび最大投影画像から測定した。小胞は、明視野および蛍光チャネルにおいて評価された筋鞘の外側で見つかった場合、外部と見なされた。すべての測定値は、少なくともｎ≧３匹のマウス（マウスあたりｎ≧３本の筋線維）から単離した筋線維から取得した。
組換え筋線維研究のために、筋線維を、上記のようにｍｄｘ／ｈＬＴＢＰ４マウスから単離した。２５μｇ／ｍｌの組換えアネキシンＡ６（５１８６－Ａ６－０５０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むまたは含まないリンゲル培地（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｍｅｄｉａ）中で筋線維をインキュベートした。ＦＭ４－６４（２．５μｍ）を、イメージングの直前に筋線維に添加した。上記のように画像を取得し、定量化した。ＦＭ４－６４領域を、Ｚスタックの中央近くの単一スライスからイメージングエンドポイントでＦＩＪＩを使用して測定した。Ｚスタックのステップサイズ（０．１２５μｍ）を、キャップの端から端まで取得した。
筋線維の品質管理は、明視野イメージングによって検出された無傷の筋節構造を有する付着性筋線維の使用を含む多くの特性に基づいていた。筋線維は、単離プロトコル中に誘発された裂け目または破裂がないように見えた。損傷のために選択された筋線維の領域は線形であり、核または神経筋接合部に位置していなかった。さらに、赤と緑の両方のチャネル内の蛍光強度は、損傷前に同様の発現レベルであったことを示唆した。
多光子レーザー損傷およびイメージング。Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ－ＭＰ多光子顕微鏡を使用して、線維を室温でレーザー誘発損傷に供した。イメージングは、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲイメージングソフトウェアによって指示された２５ｘ１．１ＮＡの対物レンズを使用して実行した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびＦＭ４－６４を、９２０ｎｍの波長のレーザーを使用して励起し、５７５ｎｍおよび６２９ｎｍの発光波長をそれぞれ収集した。単離した筋線維にレーザー損傷を誘発するために、１０～１５％のレーザー出力で１秒間９２０ｎｍの波長のレーザーを使用して、筋線維の側膜に回折限界スポット（直径約４１０ｎｍ）を作製した。タイムラプス画像を次のように収集した。損傷前に１枚、損傷時に１枚、その後８秒ごとに８０秒間（１０枚）、３０秒ごとに５分間（１０枚）収集した。一連のタイムラプス画像の最後に、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲイメージングソフトウェアによって指示された筋線維の損傷部位から２５０ｎｍ間隔でｚスタック画像を収集した。
心臓毒損傷および分析。野生型マウスの前脛骨筋に、鎮静化したマウスにおいて２５μｇ／ｍｌの組換えアネキシンＡ６（５１８６－Ａ６－０５０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）またはリンゲル（３％イソフルラン、０．８ｌ／分Ｏ2）を注射した。さらに、マウスに、リン酸緩衝生理食塩水に溶解した５μｌ／ｇ体重のエバンスブルー色素（Ｅ－２１２９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を１０ｍｇ／ｍＬで腹腔内注射した。全身投与のために、野生型マウスに、１ｍｇ／ｋｇの組換えアネキシンＡ６（５１８６－Ａ６－０５０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＥＢＤで希釈したＰＢＳ（５μｌ／ｇ体重）を鎮静化したマウスの眼窩後腔に注射した（３％イソフルラン）、０．８ｌ／分Ｏ2）。前処理の２時間後に、鎮静化した動物の前脛骨筋にＰＢＳ中の１０μＭ心臓毒（製造中止、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液２０μｌを注入して（３％イソフルラン、０．８ｌ／分Ｏ2）心臓毒損傷を実行した。心臓毒は、筋肉の正中線に沿って放出され、筋肉の中心に均一な損傷領域を誘発した。心臓毒注射の３時間後に筋肉を採取し、液体窒素で凍結した。
慢性損傷およびバイオマーカー分析。全身投与のために、ｓｇｃｇ欠損マウスまたは野生型マウスに、１ｍｇ／ｋｇの組換えアネキシンＡ６（５１８６－Ａ６－０５０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰＢＳを鎮静化したマウスの眼窩後腔に注射した（３％イソフルラン、０．８ｌ／分Ｏ2）。３日に１回、１２日間マウスに注射した。血清は、以前に記載されたように（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ ２０１６ａ）取得した。製造元の指示に従ってＥｎｚｙＣｈｒｏｍ Ｃｒｅａｔｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ（カタログＥＣＰＫ－１００、ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、各マウスの血清ＣＫを分析した。製造元の指示に従って（ＬＤＨ細胞毒性キットＭＫ４０１、Ｔａｋａｒａ）を使用して、各マウスの乳酸脱水素酵素を分析した。Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸマルチモードプレートリーダー（ＢｉｏＴｅＫ）を使用して結果を取得した。
免疫蛍光顕微鏡検査法。凍結包埋した筋肉の中心からの切片（厚さ１０μｍ）を、免疫染色のためにクリオスタット（チャンバー：－２０℃、サンプル：－１５℃、カタログ番号ＣＭ１９５０、Ｌｅｉｃａ、ドイツ、ヴェッツラー）上で収集した。組織を４％パラホルムアルデヒドで氷上に１０分間固定した。ブロックおよび透過処理は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（カタログ番号Ｘ－１００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０％ウシ胎児血清、およびＰＢＳを使用して６０分間行った。ジストロフィンの検出には、抗ジストロフィン（ａｂ１５２７７、Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を１：１００の希釈率で４℃で一晩使用した。切片をＰＢＳでリンスし、二次抗体ヤギ抗ウサギ（Ａ１１００８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１時間インキュベートし、ＰＢＳでリンスし、ＤＡＰＩ（Ｈ－１２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むベクタシールドにマウントした。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ａ１顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ、オーバーコッヘン）を使用し、１０倍の対物レンズを使用してイメージングを実行した。画像の取得には、ＺＥＮソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ、イェーナ）を使用した。蛍光定量および筋肉面積を、ＦＩＪＩ（ＮＩＨ）を使用して実行した。表面プロットをＦＩＪＩ（ＮＩＨ）で作成した。蛍光量を、Ｉｍａｒｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ９．１．２を使用して定量化した。
カルシウム動態。ＦＤＢ筋肉をエレクトロポレーションし、上記のように単離した。Ｃａ2+濃度が２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．１７５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０５０ｍＭ、および０ｍＭのリンゲル液中で筋線維に損傷を与えた。０ｍＭのＣａ2+リンゲルにのみ、Ｃａ2+キレート剤としてＥＤＴＡを添加した。それらの実験のために、それぞれ２ｍＭ、１ｍＭ、および０．５ｍＭのリンゲル中で筋線維を直接単離した。０．５ｍＭ未満のＣａ2+を使用した実験では、筋線維を０．５ｍＭのＣａ2+リンゲル中で単離し、０ｍＭ ＥＤＴＡを含まないＣａ2+リンゲルで希釈した。０ｍＭの実験では、筋線維を０．５ｍＭのＣａ2+リンゲル中で単離し、イメージングの直前に０ｍＭのＣａ2+＋ＥＤＴＡリンゲルに交換した。野生型アネキシン＋野生型アネキシン構築物の共エレクトロポレーションを１本のマウスの足で実行し、反対側の足には野生型アネキシン＋変異体アネキシンを共エレクトロポレーションした。すべての測定値は、少なくともｎ≧２匹のマウス（各Ｃａ2+濃度でマウスあたりｎ≧３本の筋線維）から単離した筋線維から取得した。面積－Ｃａ2+曲線は、０～２ｍＭの範囲のＣａ2+濃度でＨｉｌｌ Ｃｕｒｖｅに適合した。動態パラメータは、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄを使用して計算した。
単一セルのＣａ2+および短縮測定。ラミニンでコーティングされたガラス底の３５ｍｍ皿に、単離したＦＤＢ線維を１時間播種し、１０％ＣＯ2インキュベーター内にて、３７℃で、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で一晩培養した。データ収集の１時間前に、培地を除去し、１０％ＣＯ2インキュベーター内にて、３７℃で１時間、１０μＭのＩｎｄｏ－１ ＡＭ（ＴｅｆＬａｂｓ）を含むＴｙｒｏｄｅ緩衝液（１１９ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ2、２ｍＭのＭｇＣｌ2）中で細胞をインキュベートした。次に、皿にＴｙｒｏｄｅ緩衝液を充填し、カスタムステージに取り付け、プラチナペーシング電極を皿に挿入した。９５０Ａソフトウェア（Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって制御される７０１Ｃ高出力刺激装置を使用して、刺激を誘発した。刺激は、４０Ｈｚおよび８０Ｈｚ、５ミリ秒のパルス幅、１００ミリ秒の持続時間で実行した。レシオメトリックなＣａ2+シグナルを、２本の光電子増倍管およびＦｌｕｏｒｏＤａｑコントローラを使用して収集した。ビデオ筋節長（Ｖｉｄｅｏ ｓａｒｃｏｍｅｒｅ ｌｅｎｇｔｈ）を、Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ９００Ｂ－ＶＳＬシステム（オンタリオ州オーロラ）を使用して、高速度カメラおよび高速フーリエ変換で記録した。２０秒間で１０個の移行が収集され、周波数ごとにセルごとに平均化された。
統計的分析。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して実行した。比較はＡＮＯＶＡに依拠した（（１変数の場合には一元ＡＮＯＶＡ、２変数（通常は、面積とＣａ2+濃度）の場合には二元ＡＮＯＶＡ））。それ以外の場合は、対応のないｔ検定を実行した。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
実施例２
Ｃａ2+は、膜が損傷すると修復キャップに局在する。
筋膜修復の活性化には、外部Ｃａ2+の存在が必要である（Ｂａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，２００３）。アネキシンタンパク質が、修復キャップの下の細胞質内のアネキシンフリーゾーンに隣接する損傷部位で修復キャップに凝集することは以前に示された（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６ａ、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ、Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７ａ、Ｓｗａｇｇａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。損傷部位でのＣａ2+ダイナミクスをリアルタイムで視覚化するために、インビボ蛍光Ｃａ2+インジケータタンパク質であるＧＣａＭＰ５Ｇを利用した。ＧＣａＭＰ５Ｇは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、カルシウム結合タンパク質であるカルモジュリン、およびカルモジュリンＭ１３結合ペプチドで構成される融合タンパク質である。ＧＣａＭＰ５Ｇは、Ｃａ2+に結合していない場合、蛍光が最小限に抑えられ、Ｃａ2+結合により、タンパク質内のコンフォメーションが変化し、ＧＦＰの蛍光強度が増加する（Ａｋｅｒｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。野生型短趾屈筋（ＦＤＢ）の筋肉にＧＣａＭＰ５Ｇプラスミドをエレクトロポレーションし、レーザーアブレーションを使用して原形質膜を損傷した（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ，２０１５、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ）。膜損傷から２秒以内に、ＧＣａＭＰ５Ｇ蛍光が損傷部位の細胞質内に蓄積した。ＧＣａＭＰ５Ｇの蛍光強度は、９０秒間のイメージングを通じて徐々に増加した（図１Ａ、矢印）。カルボキシル末端ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タグを有するアネキシンＡ６およびＧＣａＭＰ５Ｇを発現するプラスミドを共エレクトロポレーションされた筋線維において、ＧＣａＭＰ５Ｇ蛍光は、アネキシンＡ６フリーゾーンの周りのリングに局在し（図１Ｂ、矢じり）、修復キャップではアネキシンＡ６と共局在した（図１Ｂ、矢印、マージ）。この時系列は、損傷部位で増加するＣａ2+と一致しており、アネキシンの転座および修復キャップへのアセンブリを促進する可能性がある。
アネキシン修復キャップは、修復キャップの動員中に異なるＣａ2+感度を示す。
アネキシンタンパク質は、Ｃａ2+依存性のリン脂質およびアクチン結合タンパク質であり、４つのアネキシン反復ドメイン（アネキシンＡ６の場合は８つ）を含む（図２）。アネキシン反復ドメインは、Ｃａ2+に結合するが、他のクラスの修復タンパク質に見られるＥＦハンドおよびＣ２ドメインのＣａ2+結合とは別個のものである（Ｇｅｒｋｅ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，２００２）。アネキシンはＣａ2+に配位結合し、その凸面から膜に結合し（図２）、ＩＩ型とＩＩＩ型の両方のＣａ2+結合部位はアネキシンタンパク質に記載されている。筋線維でのアネキシン媒介筋鞘修復におけるＣａ2+要件をさらに定義するために、アネキシンＡ１、Ａ２、またはＡ６修復キャップ形成をＣａ2+濃度の範囲にわたって調べた。キャップサイズはｚスタックの中心から測定し、蛍光タグの種類（ｔｕｒｂｏＧＦＰまたはｔｄＴｏｍａｔｏ）では、パラメータの評価は変わらなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。アネキシンＡ１およびＡ６修復キャップのサイズはＣａ2+に依存し、最大の修復キャップは２ｍＭで形成され、それよりも小さい修復キャップは０．１ｍＭで形成されたが、アネキシンＡ２修復キャップは０．０５ｍＭのＣａ2+まで有意に減少しなかった（図１Ｃおよび１Ｄ）。修正されたＨｉｌｌの式を使用して、修復キャップ面積をＣａ2+濃度の関数としてプロットした。アネキシンＡ２は、Ｃａ2+の最低濃度０．０５ｍＭで修復キャップを形成したが、アネキシンＡ１およびＡ６は、０．１ｍＭ Ｃａ2+未満のＣａ2+濃度では識別可能なキャップを形成しなかった。これは、それぞれ０．１２ｍＭおよび０．１７ｍＭのＫm1/2を示すＡ６およびＡ１（図１Ｄ）と比較して、０．０６７ｍＭのＫm1/2を有するアネキシンＡ２の曲線が著しく左側にあることからわかる。アネキシンＡ１およびＡ６の修復キャップのサイズおよび速度は、Ｃａ2+濃度に大きく依存していた（図４）。アネキシンＡ２キャップの形成速度およびキャップのサイズは、２ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭのＣａ2+で類似していたが、アネキシンＡ１およびＡ６の速度は、Ｃａ2+濃度が低いほど減少し、これは、アネキシンＡ２に対するＣａ2+親和性が高いことを示唆している（図４）。レーザー損傷の種類が原因で修復キャップの形成がアーティファクトではないことを確認するために、Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ ＧａＳＰ共焦点およびＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ ＭＰ＋多光子共焦点の両方でレーザー損傷を誘発した。多光子レーザーによって誘発された損傷は、理論的にはより焦点が絞られており、側副膜の損傷が少なくなっている。アネキシンＡ６修復キャップは、いずれの種類のレーザーでも同等であるように見えた（図５）。これらのデータは、アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６修復キャップの形成が、筋線維修復中に存在するＣａ2+のレベルに影響を受け、アネキシンＡ２が、研究された３つのアネキシンの中で最もＣａ2+感受性であることを示している。
アネキシンの過剰発現は、膜損傷部位でのブレブ形成を促進する。
Ｌｙｔｅｃｈｉｎｕｓ ｐｉｃｔｕｓおよびＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞における膜修復アッセイは、膜構造が膜修復部位で融合して出現することを示唆した（Ｂｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。さらに、細胞外組換えアネキシンは、Ｃａ2+依存的に、膜の欠陥部位での人工膜パッチの膜折り畳みおよびブレブ形成を促進した（Ｂｏｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｂｏｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。次に、生きた骨格筋線維において、膜の欠陥部位である筋膜損傷部位で同様の所見が観察され得るかどうかを調査した。ＧＣａＭＰ５Ｇは、骨格筋線維において、単独で、またはアネキシンＡ１、Ａ２、もしくはＡ６と組み合わせて発現した。アネキシンの過剰発現は、膜病変のアネキシン修復キャップから放出される細胞外ブレブの形成を促進することが見出された（図６Ａ）。これらのブレブは、アネキシン修復キャップの形成後に現れ、修復キャップの細胞外先端に見られた（図６Ａ）。アネキシンＡ６およびアネキシンＡ２の過剰発現は、アネキシンＡ１の過剰発現またはＧＣａＭＰ５Ｇ単独の後に観察されたよりも有意に多くのブレブを誘発した（図６Ａおよび６Ｂ）。さらに、アネキシン誘発ブレブは有意なＧＣａＭＰ５Ｇシグナルを含み、アネキシンＡ６は、アネキシンＡ１、Ａ２、またはＧＣａＭＰ５Ｇ単独と比較して、有意に大きなＧＣａＭＰ５Ｇ含有ブレブの形成を誘発した（図６Ａおよび６Ｃ）。これらのデータは、アネキシンが膜破壊の部位で修復キャップを形成するだけでなく、これらのキャップがＣａ2+結合タンパク質が豊富な細胞外ブレブの排出のための部位として機能することを示した。
アネキシン過剰発現による損傷部位での細胞内Ｃａ2+蛍光の減少。
レーザー損傷後のＣａ2+インジケータＧＣａＭＰ５Ｇのタイムラプスイメージングは、細胞外Ｃａ2+が細胞外ブレブ形成に伴って減少していることを示唆し、これらのブレブが細胞内Ｃａ2+蓄積および／または損傷部位から放出される細胞質タンパク質含有量の排出を減少させるのに役立つことを示唆している。アネキシンにより誘発される細胞内Ｃａ2+蛍光の減少は、３つのアネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６のすべてで見られたが、アネキシンＡ２およびＡ６で最も顕著であった（図７Ａ）。２４０秒間のイメージングで、アネキシンＡ６の過剰発現は、細胞内Ｃａ2+の最も有意な減少を誘発し、この減少は、内部ＧＣａＭＰ５ＧのＣａ2+蛍光として視覚化された（図７Ｂ）。損傷後の最初の２０秒間の詳細な分析では、ＧＣａＭＰ５Ｇのみと比較した場合、アネキシンＡ１ではなくアネキシンＡ２およびＡ６による内部ＧＣａＭＰ５ＧのＣａ2+蛍光の有意な減少が示された（図７Ｃ）。損傷前のベースラインＧＣａＭＰ５Ｇ蛍光強度は、群間で有意差はなかった（図７Ｄ）。したがって、アネキシンの発現は、損傷した筋線維内でのＣａ2+シグナルの低下を誘発し、同時にＣａ2+結合タンパク質で満たされたブレブの排出が増強される。さらに、アネキシンＡ６は、試験された３つのアネキシンの中で、この応答を維持するのに最も効果的であった。
次に、対照と比較して、アネキシンＡ６を過剰発現する単離された筋線維のＣａ2+処理および収縮特性を評価した。アネキシンＡ６を発現する単離された筋線維に、レシオメトリックなＣａ2+インジケータ色素Ｉｎｄｏ－１をロードした。アネキシンＡ６または対照線維間で、４０Ｈｚまたは８０Ｈｚの刺激周波数でのＣａ2+サイクリングの差異は観察されなかった（図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃ）。無負荷の細胞短縮も、過剰発現したアネキシンＡ６の存在に影響を受けなかった（図８Ｄ、８Ｅ、および８Ｆ）。これらの結果は、アネキシンＡ６の過剰発現が筋線維によって十分に許容されることを示した。
アネキシンＡ６のＣａ2+結合は、修復キャップの形成および筋線維の修復に必要である。
アネキシンＡ１Ｄ１７１およびＡ２Ｄ１６１の変異は、ＨＥＫ細胞におけるアネキシン膜の転座を阻害することが以前に示された（Ｊｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２、ＭｃＮｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）。これらの変異が、筋膜損傷後に形成された高分子アネキシン修復キャップの転座および形成を阻害するかどうかが問われた。アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６タンパク質配列のアラインメントにより、３つすべてのアネキシンタンパク質における、ＩＩ型Ｃａ2+結合部位のコンセンサス配列内の保存残基が特定された（図２）。アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６のＣａ2+結合を破壊するために、部位特異的変異誘発を行って、最初のＩＩ型Ｃａ2+結合部位にあるアスパラギン酸残基をアラニン残基（それぞれＡ１Ｄ１７１Ａ、Ａ２Ｄ１６１Ａ、Ａ６Ｄ１４９Ａ）に変換した（図９Ａ）。Ｅ２３３ＡはアネキシンＡ６でも生成され、アネキシンＡ６の２番目のアネキシン反復ドメインのＣａ2+結合部位においても同様の変化をもたらした。各構築物には、Ｃ末端にｔｕｒｂｏＧＦＰまたはｔｄＴｏｍａｔｏも含まれていた。修復キャップ形成中の同型アネキシン相互作用の影響を評価するために、野生型＋野生型（Ａ６＋Ａ６）または野生型＋変異体（Ａ６＋Ａ６Ｅ２３３Ａ）のアネキシンの組み合わせを筋線維に共エレクトロポレーションした。アネキシンＡ６におけるＥ２３３の変異はドミナントネガティブに作用し、共発現した野生型アネキシンＡ６タンパク質のキャップサイズを大幅に減少させた（図１０Ａ）。以前の構造研究では、アネキシンＡ６における最初のアネキシン反復ドメインのＤ１４９がＣａ2+に結合しないことが示唆されており（Ａｖｉｌａ－Ｓａｋａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、これと一致して、アネキシンＡ６におけるＤ１４９Ａ変異体はキャップサイズにほとんど影響を与えなかった（図９Ｂ、右パネル）。修復キャップフェレットの直径を、修正されたＨｉｌｌの式を使用して、Ｃａ2+濃度の関数としてプロットした。変異体アネキシンＡ６Ｅ２３３Ａの発現は、共発現した野生型アネキシンＡ６タンパク質のキャップ直径（ＤＭＡＸ）を大幅に減少させるのに十分であった（図１０Ｂ）。修復キャップ形成に対する異型アネキシン相互作用の影響を評価するために、野生型および変異体アネキシン構築物のさまざまな組み合わせを筋線維に共エレクトロポレーションした。変異体アネキシンＡ６Ｅ２３３Ａの共発現により、それぞれＡ１＋Ａ６、Ａ２＋Ａ６、Ａ６＋Ａ６対照と比較して、アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６のキャップサイズが大幅に減少した（図１０Ｃ）。一緒に、これらのデータは、アネキシンタンパク質がアネキシン修復複合体アセンブリに影響を与える同型および異型様式で相互作用し、変異体アネキシンＡ６タンパク質が修復中にアネキシン複合体アセンブリを負に調節するのに十分であることを示した。
アネキシンＡ１とＡ２の両方のＣａ2+結合も、修復キャップの形成に必要であった。Ａ１Ｄ１７１ＡおよびＡ２Ｄ１６１Ａ変異体のキャップサイズは、それぞれ野生型アネキシンＡ１およびＡ２対照と比較して減少した。変異体アネキシンＡ１Ｄ１７１ＡおよびＡ２Ｄ１６１Ａの発現は、それぞれ共発現した野生型アネキシンタンパク質の修復キャップ直径（ＤＭＡＸ）を大幅に減少させるのに十分であった（図９Ｂ、左および中央パネル）。変異体アネキシンＡ１Ｄ１７１ＡおよびＡ２Ｄ１６１Ａがそれぞれ共発現する野生型アネキシンＡ１およびＡ２キャップサイズを大幅に減少させる能力を有しているにもかかわらず、Ａ１Ｄ１７１ＡまたはＡ２Ｄ１７１Ａの、野生型アネキシンＡ６キャップサイズへの影響は最小であった（図９Ｃ）。これらのデータは、アネキシンＡ１およびＡ２が同型様式で相互作用し、セルフキャップアセンブリに影響を与える一方で、修復キャップへのＡ６の局在はアネキシンＡ１とＡ２の局在によって最小限に調節されることを示した。
修復キャップおよび膜修復能力でのアネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６のアセンブリに対するドミナントネガティブアネキシンＡ６の効果を決定するために、ＦＭ４－６４の存在下で単離された筋線維に対して同様にレーザー損傷を実行した。ＦＭ４－６４は、水溶液中では非蛍光性であり、損傷中に露出した膜リン脂質に結合するときに蛍光強度を増加させる膜不透過性色素であり、膜損傷マーカーとして一般的に使用される（Ｂａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，２００３、Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ，２０１５、Ｙｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｚｗｅｉｆａｃｈ，２０００）。アネキシンＡ６Ｅ２３３Ａ－ＧＦＰを発現する筋線維は、野生型アネキシンＡ６－ＧＦＰを発現する対照筋線維と比較して、レーザー損傷後のＦＭ４－６４蛍光領域が増加した（図１０Ｄ）。これらの結果は、機能的なアネキシン修復複合体が適切な膜修復に必要であり、アネキシンＡ６が複合体形成の調整に関与していることを示した。
アネキシンＡ６は、インビトロでレーザー誘発筋線維損傷から保護した。
アネキシンＡ６は高分子修復キャップ複合体の形成を促進し、膜損傷部位での大きなＣａ2+充填ブレブの形成に最も効率的であったため、アネキシンＡ６の過剰発現が野生型筋線維の膜損傷を軽減するかどうかを評価した。野生型筋線維にアネキシンＡ６－ＧＦＰをエレクトロポレーションするか、模擬エレクトロポレーションした後、ＦＭ４－６４の存在下でレーザー損傷を与えて、損傷領域をマークした。アネキシンＡ６を過剰発現する野生型筋線維では、対照筋線維と比較して、レーザー誘発膜損傷後のＦＭ４－６４色素取り込みが減少した（図１１Ａ）。これらの結果は、アネキシンＡ６の過剰発現が単離された筋線維の膜修復を改善するのに効果的であることを示唆した。
次に、細胞外組換えアネキシンＡ６が野生型筋線維の膜損傷からも保護できるかどうかを試験した。野生型筋線維を単離し、組換えアネキシンＡ６（ｒＡＮＸＡ６）またはビヒクル対照とインキュベートした。ＦＭ４－６４の存在下でレーザー損傷を実施した。細胞外組換えアネキシンＡ６による前処理は、ビヒクル対照で処理した筋線維と比較してＦＭ４－６４蛍光領域を減少させた（図１１Ｂ）。これらのデータは、組換えアネキシンＡ６が細胞外曝露による膜損傷から保護することを示した。
組換えアネキシンＡ６は、慢性筋肉疾患のモデルにおいて筋線維損傷から保護する。
筋ジストロフィーは、重要な細胞骨格または膜関連タンパク質における機能喪失型変異による進行性の筋消耗性疾患であり、膜の脆弱化を引き起こす。ｍｄｘマウスは、内在性膜タンパク質ジストロフィンを欠いており、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のモデルである（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７、Ｐｅｔｒｏｆ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。ヒト潜在型ＴＧＦβ結合タンパク質４（ｍｄｘ／ｈＬＴＢＰ４）を発現するｍｄｘマウスは、ＤＭＤを有するヒトに見られるものと同様に、より重症の筋ジストロフィーを有する（Ｃｅｃｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７ｂ）。組換えアネキシンＡ６は野生型筋肉のレーザー誘発膜損傷から保護したので、次に組換えアネキシンＡ６への曝露が慢性筋肉疾患の状況で膜損傷から保護するかどうかを評価した。抗ＨＩＳ（緑）免疫染色は、全身注射後のｍｄｘ／ｈＬＴＢＰ４ジストロフィー筋肉の筋鞘に組換えアネキシンＡ６－ＨＩＳが存在するが、ビヒクル対照筋肉には抗ＨＩＳ染色が存在しなかったことを明らかにした（図１１Ｃ）。単離された野生型筋線維と同様に、細胞外組換えアネキシンＡ６による前処理は、ビヒクル対照で処理した筋線維と比較して、ｍｄｘ／ｈＬＴＢＰ４筋線維におけるレーザー誘発損傷後のＦＭ４－６４蛍光を減少させた（図１１Ｄ）。これらの組み合わされたデータは、細胞外アネキシンＡ６が損傷した膜を標的とし、より効率的な修復を促進し、健康な筋線維およびジストロフィー筋線維の損傷から保護することを示した。
組換えアネキシンＡ６は、インビボでの筋線維損傷から保護した。
次に、組換えアネキシンＡ６がインビボでの筋肉損傷から保護できるかどうかを評価した。組換えアネキシンＡ６またはビヒクル対照を野生型マウスの前脛骨筋（ＴＡ）に筋肉内注射した。また、マウスには、エバンスブルー色素を腹腔内注射した。この色素は、無傷の健康な筋線維によって排除されるが、損傷した透過性筋線維には容易に取り込まれる重要なトレーサである（Ｊｅｎｎｉｓｃｈｅ ａｎｄ Ｈａｎｓｓｏｎ，１９８６）。組換えアネキシンＡ６の注射の２時間後、心臓毒でＴＡ筋肉に損傷を与えた。心臓毒損傷の３時間後に筋肉を採取し、エバンスブルー色素の取り込みを評価した（図１２Ａ）。グロスイメージングは、対照と比較して色素取り込みの減少によってわかるように、組換えアネキシンＡ６による前処理が、インビボでの心臓毒誘発筋肉損傷を減少させることを示した（図１２Ｂ）。蛍光イメージングは、組換えアネキシンＡ６による前処理によって、対照筋肉と比較して、色素取り込みが５０％減少することを示した（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。表面プロットプロファイルは、筋肉内組換えアネキシンＡ６で前処理した前脛骨筋における色素蛍光が減少していることを示している（図１２Ｃ）。これらの結果は、筋肉内組換えアネキシンＡ６が膜損傷を軽減し、インビボでの膜修復を促進できることを示している。
アネキシンＡ６の筋肉内注射は損傷を軽減するのに効果的であったが、この適用経路は、大きな筋肉群、内部組織、または慢性疾患の治療には最適ではない。したがって、眼窩後方（ＲＯ）全身注射を介して投与された組換えアネキシンＡ６の有効性を調べた。組換えアネキシンＡ６または対照溶液を、心臓毒誘発型前脛骨筋損傷（前治療）の２時間前に注射した。あるいは、心臓毒で前脛骨筋（ＴＡ）に損傷を与えた直後に、組換えアネキシンＡ６を投与した（治療後）。さらに、エバンスブルー色素を、損傷前に注射した。心臓毒損傷の３時間後に筋肉を採取し、色素の取り込みを評価した（図１３Ａ）。蛍光イメージングは、ビヒクル対照と比較して、組換えアネキシンＡ６前処理および後処理により色素取り込みが有意に減少することを示した（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。表面プロットプロファイルは、全身組換えアネキシンＡ６で前処理および後処理した前脛骨筋における色素蛍光が減少していることを示している（図１３Ｃ）。これらの結果は、組換えアネキシンＡ６が、筋肉損傷前と筋肉損傷後の両方にインビボで投与される静脈内全身投与を通じて、膜損傷を低減し、膜修復を促進することを示した。
組換えアネキシンＡ６は、インビボでの慢性的な筋肉損傷から保護した。
組換えアネキシンＡ６は、インビボでの野生型筋肉の急性膜損傷から保護したので、次に組換えアネキシンＡ６への曝露が慢性筋肉疾患の状況で膜損傷から保護するかどうかを評価した。遺伝子γ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）の変異は、マウスとヒトの両方で肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ（ＬＧＭＤ２Ｃ）を引き起こす。組換えアネキシンＡ６が慢性損傷環境での修復を促進できるかどうかを判断するために、ｓｇｃｇ欠損マウスに組換えタンパク質または対照溶液を３日ごとに１２日間注射し、次に筋肉損傷の血清バイオマーカーであるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）および乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を定量化した（図１４Ａ）。組換えアネキシンＡ６による全身治療は、ｓｇｃｇ欠損マウスの血清ＣＫおよびＬＤＨレベルの両方を低下させた（図１４Ｂおよび１４Ｃ）。これらの結果は、全身組換えアネキシンＡ６が慢性筋肉疾患のモデルにおいて膜修復を促進することを示した。
考察
アネキシンは、膜損傷部位でのブレブの形成を促進する。筋線維におけるアネキシンの発現の増加は、筋線維内の損傷に関連するＣａ2+蛍光蓄積を減少させることが見出された。この減少は、アネキシン修復キャップの部位で生じる細胞外ブレブ形成と相関していた。アネキシンＡ２およびＡ６が、修復キャップから放出されるＣａ2+結合タンパク質ＧＣａＭＰ５Ｇを含む膜状ブレブの形成を誘発することを見出した。さらに、アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６の過剰発現はそれぞれ、損傷後の筋線維内のエンドポイントＣａ2+蛍光蓄積を減少させた。アネキシンＡ６の過剰発現は、損傷に関連するＣａ2+蓄積の減少に最も持続的な効果をもたらし、大きなＧＣａＭＰ５Ｇを含むブレブの形成を誘発した。アネキシンＡ６がＣａ2+およびタンパク質のブレブへの排出を促進し、その形成がアネキシンＡ１およびアネキシンＡ２によってさらに誘導されるモデルが企図されている。人工膜パッチでは、アネキシンＡ１またはアネキシンＡ２の存在により、膜の欠陥部位でブレブ形成が誘導された（Ｂｏｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。対照的に、アネキシンＡ６の存在により、Ｃａ2+依存的に、人工膜の大きなひだへの収縮が誘発された（Ｂｏｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。生きた筋線維のブレブまたは人工膜のひだを誘発するアネキシンＡ６の差異は、人工膜研究における単一の組換えアネキシンタンパク質への曝露と比較して、単離された筋線維における内因的に発現されたアネキシンＡ１およびＡ２の存在に関係している可能性がある。理論に拘束されることなく、高分子修復複合体内で、アネキシンが、創傷閉鎖、損傷した膜の切除、および損傷部位でのＣａ2+の減少を促進する大きな膜病変を除去するように作用する、ブレブ形成に積極的に関与すると仮定される。
本明細書に記載のデータと同様に、他のデータでも、損傷したＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞において、ＧＣａＭＰ５Ｇ蛍光が膜破壊部位の周りのリングに急速に局在し、治癒が進むにつれて損傷後約５分で衰退することを示した（Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。損傷したＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞におけるアネキシンＡ１－ＧＦＰの過剰発現は、損傷部位に由来するアネキシンＡ１陽性ブレブをもたらした（Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。しかしながら、ＧＣａＭＰ５Ｇ蛍光に対するアネキシン過剰発現の影響は評価されなかった。これらのデータを組み合わせると、膜修復のメカニズムとしてのブレブ形成は、種および組織の種類を超えて保存されており、アネキシンタンパク質の存在によって促進されることが示唆されている。
アネキシンＡ６は、筋膜損傷から保護し、膜の修復を増強する。本明細書に示されるように、アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６を含めたアネキシンタンパク質は、膜損傷部位に局在し、膜修復キャップおよびブレブ形成を促進する。アネキシンＡ６の変異は、修復キャップの形成を妨げ、修復能力を低下させ、色素の取り込みを増加させた。一方、組換えアネキシンＡ６による前処理は、インビボでのレーザー誘発筋肉損傷後および毒素誘発筋肉損傷後の色素取り込みを減少させた。しかしながら、このデータは、膜修復を増強する、膜損傷を低減する、または両方のメカニズムの組み合わせを強化するアネキシンＡ６を区別していない。治療ツールとして、細胞膜を安定化することによって損傷を修復および／または低減する細胞の能力を強化することは、いずれも、細胞の生存を改善することにつながる可能性のある有益な手段である。以前の研究では、アネキシンＡ６が慢性筋ジストロフィーのモデルからの筋肉において上方調節されることが示されている（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６ａ、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｓｗａｇｇａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ｍｄｘマウスモデルにおけるさらなるプロテオミクスアプローチは、アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６がｍｄｘ筋膜に豊富に存在することを示しており、これもやはり、損傷した細胞の膜におけるアネキシンの役割を示唆している（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。アネキシンは、膜破壊中に露出するホスファチジルセリンを含む膜リン脂質に結合する。損傷時のホスファチジルセリン再配列は、細胞外アネキシンの結合標的となる可能性が高く、膜の損傷および欠陥部位での膜の折り畳み、ブレブ形成、およびローリングを促進する（Ｂｏｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。本明細書のデータに基づくと、アネキシンＡ６の上方調節は、慢性的な損傷を受けている線維における欠陥膜の切除を容易にする代償メカニズムである。さらに、組換えアネキシンＡ６は、慢性疾患モデルおよび骨格筋を超えた組織において、膜修復を促進し、損傷に対する感受性を長期的に低下させることができると考えられている。
膜修復を改善するための組み合わせアプローチ。本明細書に示されるように、組換えアネキシンＡ６は、正常な筋肉およびジストロフィー筋肉をレーザー誘発型膜損傷から保護した。さらに、組換えアネキシンＡ６の筋肉内投与と全身投与の両方が、インビボでの毒素誘発筋膜損傷から保護した。興味深いことに、グルココルチコイド投与は筋肉のアネキシン発現を増加させ、これはｍｄｘ（ＤＭＤ）、ジスフェリン欠損（ＬＧＭＤ２Ｂ）、およびγ－サルコグリカン欠損（ＬＧＭＤ２Ｃ）マウスを含む筋ジストロフィーの複数のマウスモデルにおける筋肉修復の増強と相関していた（Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７ａ、Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７ｃ）。重要なことに、グルココルチコイド治療は、膜損傷部位に局在し、細胞の創傷治癒を改善する「分子バンドエイド」と見なされる修復タンパク質であるミツグミン５３（ＭＧ５３またはＴｒｉｍ７２としても知られる）の発現も増加させた。アネキシンと同様に、ＭＧ５３は慢性的な筋肉損傷で上方調節され、ジストロフィー筋肉ならびに心臓、肺、腎臓などの他の組織における修復を強化する（Ｗａｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。（Ｄｕａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｗｅｉｓｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＭＧ５３は、アネキシン媒介型修復複合体の構成要素であり、アネキシン修復キャップに並置されて局在する（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ）。組換えアネキシンＡ６とグルココルチコイドおよび／またはＭＧ５３との同時投与は、膜病変に起因する状態に対するこれらの治療法の臨床的関連性をさらに強化すると考えられる。
要約すると、本明細書で提供されるデータは、アネキシンが筋膜損傷の部位で放出されるブレブの形成を促進し、アネキシンＡ６がこのプロセスを促進するのに最も効果的であることを示している。さらに、組換えアネキシンＡ６は、正常な筋肉およびジストロフィー筋肉の膜損傷から保護する。これらのデータにより、健康な筋肉および疾患のある筋肉における膜修復能力を高める治療標的としてアネキシンＡ６が特定されている。
実施例３
本実施例では、実行されたさらなる実験およびアップデートされた実験の結果について詳しく説明する。
膜修復は、細胞の生存に不可欠である。骨格筋では、損傷は、しばしば原形質膜の破壊と関連している。さらに、筋ジストロフィーは、脆弱な膜を生成するか、または膜の修復を低下させる遺伝子の変異に関連している。修復を増強し、損傷に対する感受性を低下させる方法は、急性損傷および慢性損傷の両方の状況において筋肉に利益をもたらし得る。アネキシンは、修復に関与する膜関連Ｃａ2+結合タンパク質のファミリーであり、アネキシンＡ６は、筋肉の損傷および疾患の遺伝的修飾因子として以前に同定された。アネキシンＡ６は、膜破壊部位にわたって修復キャップを形成する。アネキシンがどのように修復を促進するかを解明するために、損傷中にアネキシンキャップの形成を視覚化した。アネキシンキャップのサイズは、Ｃａ2+濃度の増加と正の相関があることが判明した。アネキシンの過剰発現は、Ｃａ2+蛍光が豊富な外部ブレブを促進し、損傷部位での細胞内Ｃａ2+蛍光の減少と相関することも判明した。アネキシンＡ６の過剰発現は、修復の増強と一致して、膜損傷を減少させた。組換えアネキシンＡ６による治療は、インビトロおよびインビボでの急性筋肉損傷から保護した。さらに、筋ジストロフィーのモデルに組換えアネキシンＡ６を投与すると、疾患のバイオマーカーである血清クレアチンキナーゼが減少した。これらのデータにより、膜修復中の膜関連Ｃａ2+放出のメディエーターとしてアネキシンが同定され、膜修復能力を増強するための治療標的としてアネキシンＡ６が同定された。
アネキシンＡ６は、筋膜破壊部位で修復キャップを形成する。本明細書中のデータは、外因性の組換えアネキシンＡ６（ｒＡＮＸＡ６）を加えると、膜の再封鎖および損傷からの回復が促進されることを示している。
導入
原形質膜の修復は、膜の破壊後に起こり、高度に保存されたプロセスである。膜破壊の再封鎖に必要である活発なプロセスは、Ｃａ2+依存性の小胞融合および局所的な細胞骨格リモデリングに依存していると考えられている（ＭｃＮｅｉｌ ＰＬ，ａｎｄ Ｋｈａｋｅｅ Ｒ．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ ｆｉｂｅｒ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｒｏｌｅ ｉｎ ｅｘｅｒｃｉｓｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄａｍａｇｅ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１９９２；１４０（５）：１０９７－１０９、ＭｃＮｅｉｌ ＰＬ，ａｎｄ Ｋｉｒｃｈｈａｕｓｅｎ Ｔ．Ａｎ ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｅａｍ ｆｏｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００５；６（６）：４９９－５０５）。他のモデルは、膜修復がリソソーム小胞の融合、損傷部位への膜の横方向拡散、および膜ブレブの押し出しによって媒介されることを示唆している（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ａ，Ｗｅｂｓｔｅｒ Ｐ，Ｏｒｔｅｇｏ Ｊ，ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗｓ ＮＷ．Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ ｂｅｈａｖｅ ａｓ Ｃａ２＋－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｏｃｙｔｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９７；１３７（１）：９３－１０４、Ｒｅｄｄｙ Ａ，Ｃａｌｅｒ ＥＶ，ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗｓ ＮＷ．Ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ｃａ（２＋）－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ．Ｃｅｌｌ．２００１；１０６（２）：１５７－６９、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ Ｍ，Ｂａｒｅｆｉｅｌｄ ＤＹ，Ａｌｌｅｎ ＭＶ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＥ，ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ ＥＭ．Ａｎ ａｃｔｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｎｅｘｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１６；２１３（６）：７０５－１８、ＭｃＤａｄｅ ＪＲ，Ａｒｃｈａｍｂｅａｕ Ａ，ａｎｄ Ｍｉｃｈｅｌｅ ＤＥ．Ｒａｐｉｄ ａｃｔｉｎ－ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ ａｔ ｗｏｕｎｄｓ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｍｕｓｃｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０１４；２８（８）：３６６０－７０、Ｂａｂｉｙｃｈｕｋ ＥＢ，Ｍｏｎａｓｔｙｒｓｋａｙａ Ｋ，Ｐｏｔｅｚ Ｓ，ａｎｄ Ｄｒａｅｇｅｒ Ａ．Ｂｌｅｂｂｉｎｇ ｃｏｎｆｅｒｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．２０１１；１８（１）：８０－９）。これらのモデルは相互に排他的ではなく、損傷の種類および程度によって異なる場合がある。骨格筋は、修復タンパク質をコードする遺伝子の変異が筋肉疾患を引き起こすため、原形質膜修復に大きく依存している（Ｂａｎｓａｌ Ｄ，Ｍｉｙａｋｅ Ｋ，Ｖｏｇｅｌ ＳＳ，Ｇｒｏｈ Ｓ，Ｃｈｅｎ ＣＣ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ．２００３；４２３（６９３６）：１６８－７２、Ｂａｓｈｉｒ Ｒ，Ｂｒｉｔｔｏｎ Ｓ，Ｓｔｒａｃｈａｎ Ｔ，Ｋｅｅｒｓ Ｓ，Ｖａｆｉａｄａｋｉ Ｅ，Ｌａｋｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｇｅｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｆｅｒ－１ ｉｓ ｍｕｔａｔｅｄ ｉｎ ｌｉｍｂ－ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｔｙｐｅ ２Ｂ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９８；２０（１）：３７－４２、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＥ，Ｒｏｓｓｉ ＡＥ，Ｄｅｖｅａｕｘ ＨＫ，Ｅａｒｌｅｙ ＪＵ，Ａｌｌｅｎ ＭＶ，ｅｔ ａｌ．Ｅｐｓ １５ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｄｏｍａｉｎ（ＥＨＤ）－１ Ｒｅｍｏｄｅｌｓ Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ Ｔｕｂｕｌｅｓ ｉｎ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（９）：ｅ０１３６６７９、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ ＥＭ．Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｒｅｐａｉｒ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｍｂｒ．２０１６；７７：６７－９６、Ｄｅｆｏｕｒ Ａ，Ｍｅｄｉｋａｙａｌａ Ｓ，Ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ ＪＨ，Ｈｏｇａｒｔｈ ＭＷ，Ｈｏｌｄｒｅｉｔｈ Ｎ，Ｍａｌａｔｒａｓ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ２ ｌｉｎｋｓ ｐｏｏｒ ｍｙｏｆｉｂｅｒ ｒｅｐａｉｒ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｊｕｒｅｄ ｍｕｓｃｌｅ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１７；２６（１１）：１９７９－９１、Ｃａｉ Ｃ，Ｍａｓｕｍｉｙａ Ｈ，Ｗｅｉｓｌｅｄｅｒ Ｎ，Ｍａｔｓｕｄａ Ｎ，Ｎｉｓｈｉ Ｍ，Ｈｗａｎｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ＭＧ５３ ｎｕｃｌｅａｔｅｓ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１１（１）：５６－６４）。
アネキシンは、脂質結合、細胞骨格の再編成、および膜の折り畳み、膜修復に必要なステップを調節するＣａ2+結合タンパク質のファミリーである（Ｊｉｍｅｎｅｚ ＡＪ，ａｎｄ Ｐｅｒｅｚ Ｆ．Ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ：ｔｈｅ ａｄａｐｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｆｅ－ｉｎｓｕｒａｎｃｅ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１７；４７：９９－１０７、Ｌａｕｒｉｔｚｅｎ ＳＰ，Ｂｏｙｅ ＴＬ，ａｎｄ Ｎｙｌａｎｄｓｔｅｄ Ｊ．Ａｎｎｅｘｉｎｓ ａｒｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｓｅｍｉｎ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２０１５；４５：３２－８、Ｂｉｚｚａｒｒｏ Ｖ，Ｐｅｔｒｅｌｌａ Ａ，ａｎｄ Ｐａｒｅｎｔｅ Ｌ．Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ１：ｎｏｖｅｌ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１２；２２７（８）：３００７－１５、Ｇｒｅｗａｌ Ｔ，Ｈｏｑｕｅ Ｍ，Ｃｏｎｗａｙ ＪＲＷ，Ｒｅｖｅｒｔｅｒ Ｍ，Ｗａｈｂａ Ｍ，Ｂｅｅｖｉ ＳＳ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ６－Ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｉｎ ｃｅｌｌ ｍｏｔｉｌｉｔｙ．Ｃｅｌｌ Ａｄｈ Ｍｉｇｒ．２０１７；１１（３）：２８８－３０４、Ｂｏｙｅ ＴＬ，Ｊｅｐｐｅｓｅｎ ＪＣ，Ｍａｅｄａ Ｋ，Ｐｅｚｅｓｈｋｉａｎ Ｗ，Ｓｏｌｏｖｙｅｖａ Ｖ，Ｎｙｌａｎｄｓｔｅｄ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎｓ ｉｎｄｕｃｅ ｃｕｒｖａｔｕｒｅ ｏｎ ｆｒｅｅ－ｅｄｇｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１８；８（１）：１０３０９、Ｂｏｙｅ ＴＬ，Ｍａｅｄａ Ｋ，Ｐｅｚｅｓｈｋｉａｎ Ｗ，Ｓｏｎｄｅｒ ＳＬ，Ｈａｅｇｅｒ ＳＣ，Ｇｅｒｋｅ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ４ ａｎｄ Ａ６ ｉｎｄｕｃｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｕｒｖａｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７；８（１）：１６２３）。個々のアネキシン反復ドメインは、独自のアネキシン特異的ＩＩ型またはＩＩＩ型結合部位と、Ｃａ2+結合を配位結合させる。ＩＩ型およびＩＩＩ型結合部位のＣａ2+親和性の差異により、各アネキシンは、細胞内Ｃａ2+レベルおよびリン脂質結合の範囲に応答する独自の能力を有する（Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ ＲＡ，ａｎｄ Ｅｒｎｓｔ ＪＤ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ２（＋）－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ，ｖｅｓｉｃｌｅ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｂｙ ａｎｎｅｘｉｎｓ．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ．１９９０；２６６（１）：１９５－２００）。アネキシンは自己オリゴマー化およびヘテロオリゴマー化する能力を有する（Ｚａｋｓ ＷＪ，ａｎｄ Ｃｒｅｕｔｚ ＣＥ．Ｃａ（２＋）－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｎｅｘｉｎ ｓｅｌｆ－ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｕｒｆａｃｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９１；３０（４０）：９６０７－１５）。Ａ１およびＡ２のような典型的なアネキシンには、４つのアネキシン反復ドメインで構成される１つのアネキシンコアが含まれている。対照的に、アネキシンＡ６には２つのアネキシンコアが含まれているため、８つのアネキシン反復ドメインが含まれている（Ｂｅｎｚ Ｊ，Ｂｅｒｇｎｅｒ Ａ，Ｈｏｆｍａｎｎ Ａ，Ｄｅｍａｎｇｅ Ｐ，Ｇｏｔｔｉｇ Ｐ，Ｌｉｅｍａｎｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｎｅｘｉｎ ＶＩ ｉｎ ｃｒｙｓｔａｌｓ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９６；２６０（５）：６３８－４３）。アネキシンＡ６の複製構造により、アミノ末端およびカルボキシル末端のアネキシンコアドメインが１つまたは２つの異なる膜に結合できるようになり、アネキシンＡ６は、膜修復中に必要な膜の合体および折り畳みを促進するための主要な標的になる（Ｂｏｙｅ ＴＬ，Ｊｅｐｐｅｓｅｎ ＪＣ，Ｍａｅｄａ Ｋ，Ｐｅｚｅｓｈｋｉａｎ Ｗ，Ｓｏｌｏｖｙｅｖａ Ｖ，Ｎｙｌａｎｄｓｔｅｄ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎｓ ｉｎｄｕｃｅ ｃｕｒｖａｔｕｒｅ ｏｎ ｆｒｅｅ－ｅｄｇｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１８；８（１）：１０３０９、Ｂｏｙｅ ＴＬ，Ｍａｅｄａ Ｋ，Ｐｅｚｅｓｈｋｉａｎ Ｗ，Ｓｏｎｄｅｒ ＳＬ，Ｈａｅｇｅｒ ＳＣ，Ｇｅｒｋｅ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ４ ａｎｄ Ａ６ ｉｎｄｕｃｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｕｒｖａｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７；８（１）：１６２３、Ｂｕｚｈｙｎｓｋｙｙ Ｎ，Ｇｏｌｃｚａｋ Ｍ，Ｌａｉ－Ｋｅｅ－Ｈｉｍ Ｊ，Ｌａｍｂｅｒｔ Ｏ，Ｔｅｓｓｉｅｒ Ｂ，Ｇｏｕｎｏｕ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎ－Ａ６ ｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｗｏ ｍｏｄｅｓ ｏｆ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＱＣＭ－Ｄ，ＡＦＭ ａｎｄ ｃｒｙｏ－ＴＥＭ ｓｔｕｄｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．２００９；１６８（１）：１０７－１６）。
アネキシンは、筋鞘中に非常に豊富に存在するホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、およびコレステロールに対して高い親和性を有する（Ｇｅｒｋｅ Ｖ，Ｃｒｅｕｔｚ ＣＥ，ａｎｄ Ｍｏｓｓ ＳＥ．Ａｎｎｅｘｉｎｓ：ｌｉｎｋｉｎｇ Ｃａ2+ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｔｏ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００５；６（６）：４４９－６１、Ｆｉｅｈｎ Ｗ，Ｐｅｔｅｒ ＪＢ，Ｍｅａｄ ＪＦ，ａｎｄ Ｇａｎ－Ｅｌｅｐａｎｏ Ｍ．Ｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａ，ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９７１；２４６（１８）：５６１７－２０）。アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６を含む複数のアネキシンは、骨格筋、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞、ヒト栄養膜、およびＨｅＬａ癌細胞の膜修復に関与しており、これは、保存されたメカニズムを示唆している（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ Ｍ，Ｂａｒｅｆｉｅｌｄ ＤＹ，Ａｌｌｅｎ ＭＶ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＥ，ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ ＥＭ．Ａｎ ａｃｔｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｎｅｘｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１６；２１３（６）：７０５－１８、Ｂａｂｂｉｎ ＢＡ，Ｌａｕｋｏｅｔｔｅｒ ＭＧ，Ｎａｖａ Ｐ，Ｋｏｃｈ Ｓ，Ｌｅｅ ＷＹ，Ｃａｐａｌｄｏ ＣＴ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｎｊｕｒｙ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｒｅｐａｉｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８１（７）：５０３５－４４、 Ｌｅｎｎｏｎ ＮＪ，Ｋｈｏ Ａ，Ｂａｃｓｋａｉ ＢＪ，Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ ＳＬ，Ｈｙｍａｎ ＢＴ，ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ ＲＨ，Ｊｒ．Ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ａｎｎｅｘｉｎｓ Ａ１ ａｎｄ Ａ２ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ ｗｏｕｎｄ－ｈｅａｌｉｎｇ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００３；２７８（５０）：５０４６６－７３、ＭｃＮｅｉｌ ＡＫ，Ｒｅｓｃｈｅｒ Ｕ，Ｇｅｒｋｅ Ｖ，ａｎｄ ＭｃＮｅｉｌ ＰＬ．Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ａｎｎｅｘｉｎ Ａ１ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００６；２８１（４６）：３５２０２－７、Ｒｏｏｓｔａｌｕ Ｕ，ａｎｄ Ｓｔｒａｈｌｅ Ｕ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｔ ｄａｍａｇｅｄ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａ．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ．２０１２；２２（３）：５１５－２９、Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ＮＲ，Ｓｏｎｎｅｍａｎｎ ＫＪ，Ｅｌｉｃｅｉｒｉ ＫＷ，ａｎｄ Ｂｅｍｅｎｔ ＷＭ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｗｏｕｎｄ ｒｅｐａｉｒ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１６；２７（１４）：２２７２－８５、Ｃａｒｍｅｉｌｌｅ Ｒ，Ｄｅｇｒｅｌｌｅ ＳＡ，Ｐｌａｗｉｎｓｋｉ Ｌ，Ｂｏｕｖｅｔ Ｆ，Ｇｏｕｎｏｕ Ｃ，Ｅｖａｉｎ－Ｂｒｉｏｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎ－Ａ５ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｓｅａｌｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ．２０１５；１８５３（９）：２０３３－４４、Ｂｅｍｅｎｔ ＷＭ，Ｍａｎｄａｔｏ ＣＡ，ａｎｄ Ｋｉｒｓｃｈ ＭＮ．Ｗｏｕｎｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｃｌｏｓｕｒｅ ｏｆ ａｎ ａｃｔｏｍｙｏｓｉｎ ｐｕｒｓｅ ｓｔｒｉｎｇ ｉｎ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．１９９９；９（１１）：５７９－８７）。アネキシンは、損傷した膜に順次動員され、膜病変で高分子修復複合体（修復キャップと呼ばれる）を形成する（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ Ｍ，Ｂａｒｅｆｉｅｌｄ ＤＹ，Ａｌｌｅｎ ＭＶ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＥ，ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ ＥＭ．Ａｎ ａｃｔｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｎｅｘｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１６；２１３（６）：７０５－１８、Ｂｏｙｅ ＴＬ，Ｍａｅｄａ Ｋ，Ｐｅｚｅｓｈｋｉａｎ Ｗ，Ｓｏｎｄｅｒ ＳＬ，Ｈａｅｇｅｒ ＳＣ，Ｇｅｒｋｅ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ４ ａｎｄ Ａ６ ｉｎｄｕｃｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｕｒｖａｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７；８（１）：１６２３、Ｒｏｏｓｔａｌｕ Ｕ，ａｎｄ Ｓｔｒａｈｌｅ Ｕ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｔ ｄａｍａｇｅｄ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａ．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ．２０１２；２２（３）：５１５－２９）。アネキシンＡ６をコードする遺伝子であるＡｎｘａ６の多型は、筋肉修復障害と相関するいくつかの一般的に使用される実験マウス系統において以前に同定された（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，Ａｌｌｅｎ ＭＶ，Ｗａｒｎｅｒ ＪＬ，Ｂａｒｅｆｉｅｌｄ ＤＹ，Ｋｒｉｓｈｎａｎ Ｓ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＥ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｆｒｏｍ Ｌｏｓｓ ｏｆ Ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ Ｉｓ Ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｂｙ Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ６ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ Ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０１６；１８６（６）：１６１０－２２、Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ Ｍ，Ｃａｐｏｔｅ Ｊ，Ｏｈｉｒｉ ＪＣ，Ｗａｒｎｅｒ ＪＬ，Ｖｏ ＡＨ，Ｅａｒｌｅｙ ＪＵ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ａｃｔ ｏｎ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ ｒｅｓｅａｌｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ｉｎｊｕｒｙ．ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．２０１７；１３（１０）：ｅ１００７０７０、Ｓｗａｇｇａｒｔ ＫＡ，Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，Ｖｏ ＡＨ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＥ，Ｋｉｍ ＥＹ，Ｆａｈｒｅｎｂａｃｈ ＪＰ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ６ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｂｙ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ ｒｅｐａｉｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．２０１４；１１１（１６）：６００４－９）。この多型は、ドミナントネガティブな方法で作用して修復キャップの形成を減らし、筋鞘の修復を妨げる短縮型アネキシンＡ６タンパク質を生成する。マウスでのさらなる研究では、アネキシンＡ２の喪失により、筋線維の修復が不十分になることが示されている（Ｄｅｆｏｕｒ Ａ，Ｍｅｄｉｋａｙａｌａ Ｓ，Ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ ＪＨ，Ｈｏｇａｒｔｈ ＭＷ，Ｈｏｌｄｒｅｉｔｈ Ｎ，Ｍａｌａｔｒａｓ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ２ ｌｉｎｋｓ ｐｏｏｒ ｍｙｏｆｉｂｅｒ ｒｅｐａｉｒ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｊｕｒｅｄ ｍｕｓｃｌｅ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１７；２６（１１）：１９７９－９１）。これらのデータは、動的タンパク質間相互作用によって促進される修復キャップへのアネキシンタンパク質の協調的な動員があることを示唆している。
本明細書では、アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６の動態を、複数のＣａ2+濃度での膜損傷後の修復キャップ形成で評価した。アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６によって形成される修復キャップは、Ｃａ2+濃度の増加と共に増加したが、Ｃａ2+配位残基の変異は、通常のアネキシン修復キャップの形成を妨害した。アネキシンの過剰発現は、修復キャップから放出された膜損傷部位での外部ブレブの形成を促進した。アネキシンＡ６の過剰発現によって、より大きなブレブが形成され、ブレブが修復キャップから放出された。これらの小胞は、Ｃａ2+結合マーカータンパク質ＧＣａＭＰ５Ｇが豊富であり、このようにＣａ2+が豊富に存在することは、損傷部位近くの細胞内Ｃａ2+蛍光の減少と相関していた。アネキシンＡ６の過剰発現は膜修復を促進し、一方、アネキシンＡ６の重要なＣａ2+配位残基である残基Ｅ２３３の変異は、アネキシン修復複合体の形成を妨害し、修復能力を低下させた。組換えアネキシンＡ６の局所および全身投与は、インビボでの筋肉損傷を軽減した。これらのデータは、膜修復中の筋膜病変からのブレブ放出におけるアネキシンの新しい役割を特定し、筋肉損傷から保護するための治療標的としてアネキシンＡ６を特定する。
方法
動物１２９Ｔ２／ＳｖＥｍｓＪバックグラウンドの野生型マウスを、特定病原体除去施設において１２時間の明暗サイクルで飼育・収容し、ノースウェスタン大学の動物実験委員会の規則に従って自由に餌を与えた。１２９Ｔ２／ＳｖＥｍｓＪ（１２９Ｔ２）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州ベンハーバー、ストック番号００２０６５）から購入した。ｍｄｘ／ｈＬＴＢＰ４マウスを、（Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ Ｍ，Ｃａｐｏｔｅ Ｊ，Ｏｈｉｒｉ ＪＣ，Ｗａｒｎｅｒ ＪＬ，Ｖｏ ＡＨ，Ｅａｒｌｅｙ ＪＵ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ａｃｔ ｏｎ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ ｒｅｓｅａｌｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ｉｎｊｕｒｙ．ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．２０１７；１３（１０）：ｅ１００７０７０、Ｃｅｃｏ Ｅ，Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃｈ Ｓ，Ｇａｒｄｎｅｒ Ｂ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｔ，ＤｅＪｅｓｕｓ Ａ，Ｅａｒｌｅｙ ＪＵ，ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦｂｅｔａ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１４；６（２５９）：２５９ｒａ１４４）に記載されるように生成した。Ｓｇｃｇ欠損マウスを、（Ｈａｃｋ ＡＡ，Ｃｏｒｄｉｅｒ Ｌ，Ｓｈｏｔｕｒｍａ ＤＩ，Ｌａｍ ＭＹ，Ｓｗｅｅｎｅｙ ＨＬ，ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ ＥＭ．Ｍｕｓｃｌｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．１９９９；９６（１９）：１０７２３－８）に記載されるように生成した．すべての野生型マウスの実験には、生後２～３か月のオスおよびメスを使用した。Ｓｇｃｇ欠損コホートは、２～５か月齢のマウスと年齢および性別が一致していた。
プラスミド。カルボキシル末端ｔｕｒｂｏＧＦＰタグを有するアネキシンＡ１、Ａ２およびＡ６をコードするプラスミドは、Ｏｒｉｇｅｎｅ（メリーランド州ロックビル）から入手した。ＧＦＰタグをｔｄＴｏｍａｔｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ）に置き換えるためのアネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６のサブクローニングを、Ｍｕｔａｇｅｎｉｘ（ジョージア州スワニー）によって実行した。アネキシンＡ１－ＧＦＰ、Ａ２－ＧＦＰ、およびＡ６－ＧＦＰに対する部位特異的変異誘発を、Ｍｕｔａｇｅｎｉｘによって実行して、Ｃａ2+結合変異体Ａ１－Ｄ１７１Ａ－ＧＦＰ、Ａ２－Ｄ１６１Ａ－ＧＦＰ、Ａ６－Ｄ１４９Ａ－ＧＦＰ、およびＡ６－Ｅ２３３Ａ－ＧＦＰを作製した。変異誘発を検証するために、構築物を配列決定した。ＱｉａｇｅｎのＥｎｄｏ－Ｆｒｅｅ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ＃１２３６２）を使用してプラスミドＤＮＡを単離した。Ｃａ2+センサーＧＣａＭＰ５Ｇは、（Ａｄｄｇｅｎｅ＃３１７８８）から購入した。
配列比較およびタンパク質の概略図 タンパク質リボン図を、ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇで入手可能なアネキシンＡ１（１ＭＣＸ）、Ａ２（２ＨＹＷ）、およびアネキシンＡ６（１ＡＶＣ）の解決された（ｓｏｌｖｅｄ）結晶構造を使用してＳｗｉｓｓ－ＰｄｂＶｉｅｗｅｒを使用して生成した。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）のＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからのアネキシン配列であるアネキシンＡ１（ＮＭ＿０１０７３０、配列番号３７）、アネキシンＡ２（ＮＭ＿００７５８５、配列番号３８）、アネキシンＡ６（ＮＭ＿０１３４７２、配列番号３９）、ならびに複数種からのアネキシンＡ６コード配列（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ＡＡＨ１７０４６．１、配列番号４０、ｍａｃａｃａ（ＡＦＥ６５３１５．１、配列番号４１））、ｃａｎｉｓ（ＸＰ＿００５６１９３３１．１、配列番号４２）、ｒａｔｔｕｓ（ＮＰ＿０７７０７０．２、配列番号４３）およびｍｕｓ（ＮＰ＿０３８５００．２、配列番号４４）をアラインメントした。
エレクトロポレーション、筋線維の単離、レーザー損傷、キャップおよび小胞の測定。インビボでのエレクトロポレーションによって、短趾屈筋（ＦＤＢ）線維に、エンドフリープラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。方法は、以前に（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ Ｍ，Ｂａｒｅｆｉｅｌｄ ＤＹ，Ａｌｌｅｎ ＭＶ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＥ，ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ ＥＭ．Ａｎ ａｃｔｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｎｅｘｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１６；２１３（６）：７０５－１８、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ ＥＭ．ＤＮＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｍｙｏｆｉｂｅｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ＪｏＶＥ．２０１５；１０６（１０６）：ｅ５３５５１、ＤｉＦｒａｎｃｏ Ｍ，Ｑｕｉｎｏｎｅｚ Ｍ，Ｃａｐｏｔｅ Ｊ，ａｎｄ Ｖｅｒｇａｒａ Ｊ．ＤＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ＪｏＶＥ．２００９；３２（３２））に記載された。Ｚスタック投影を、最後のタイムラプスフレーム後、損傷から約４分後、スライス間のステップサイズが０．１２５μＭの連続取得から取得した。ＺスタックのレンダリングはＦＩＪＩにおいて構築された。キャップ面積およびフェレット直径の測定は、ＦＩＪＩイメージングツールを使用して、ｚスタックの中央近くの単一のスライスから行った。同様のレベルのタグ付きまたはＧＣａＭＰ５Ｇタンパク質を発現する線維を比較した。ＧＣａＭＰ５ＧのＣａ2+蛍光は、ＦＩＪＩを使用して損傷部位の下の筋線維内に配置された標準の長方形ＲＯＩを使用して、取得したタイムラプス画像から測定した。蛍光はＦ／Ｆ０として表した。外部小胞数およびＧＣａＭＰ５Ｇ面積は、ＦＩＪＩを使用してエンドポイントｚスタックおよび最大投影画像から測定した。小胞は、明視野および蛍光チャネルにおいて評価された筋鞘の外側で見つかった場合、外部と見なされた。すべての測定値は、少なくともｎ≧３匹のマウス（マウスあたりｎ≧３本の筋線維）から単離した筋線維から取得した。
組換え筋線維研究のために、筋線維を、上記のようにｍｄｘ／ｈＬＴＢＰ４マウスから単離した。２５μｇ／ｍｌの組換えアネキシンＡ６（５１８６－Ａ６－０５０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むまたは含まないリンゲル培地（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｍｅｄｉａ）中で筋線維をインキュベートした。ＦＭ４－６４（２．５μｍ）を、イメージングの直前に筋線維に添加した。上記のように画像を取得し、定量化した。ＦＭ４－６４領域を、Ｚスタックの中央近くの単一スライスからイメージングエンドポイントでＦＩＪＩを使用して測定した。Ｚスタックのステップサイズ（０．１２５μｍ）を、キャップの端から端まで取得した。
筋線維の品質管理は、明視野イメージングによって検出された無傷の筋節構造を有する付着性筋線維の使用を含む多くの特性に基づいていた。筋線維は、単離プロトコル中に誘発された裂け目または破裂がないように見えた。損傷のために選択された筋線維の領域は線形であり、核または神経筋接合部に位置していなかった。さらに、赤と緑の両方のチャネル内の蛍光強度は、損傷前に同様の発現レベルであったことを示唆した。
多光子レーザー損傷およびイメージング。Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ－ＭＰ多光子顕微鏡を使用して、線維を室温でレーザー誘発損傷に供した。イメージングは、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲイメージングソフトウェアによって指示された２５ｘ１．１ＮＡの対物レンズを使用して実行した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびＦＭ４－６４を、９２０ｎｍの波長のレーザーを使用して励起し、５７５ｎｍおよび６２９ｎｍの発光波長をそれぞれ収集した。単離した筋線維にレーザー損傷を誘発するために、１０～１５％のレーザー出力で１秒間９２０ｎｍの波長のレーザーを使用して、筋線維の側膜に回折限界スポット（直径約４１０ｎｍ）を作製した。タイムラプス画像を次のように収集した。損傷前に１枚、損傷時に１枚、その後８秒ごとに８０秒間（１０枚）、３０秒ごとに５分間（１０枚）収集した。一連のタイムラプス画像の最後に、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲイメージングソフトウェアによって指示された筋線維の損傷部位から２５０ｎｍ間隔でｚスタック画像を収集した。多光子を使用して、図５、図１０Ｄ、および図１９に提示するデータを取得した。
組換えタンパク質カルシウム研究のために、筋線維を上記のように野生型マウスから単離した。筋線維を、１ｍＭのＣａ2+リンゲルまたは０ｍＭのＣａ2+＋ＥＧＴＡ中の２０μｇ／ｍｌ組換えアネキシンＡ６（５１８６－Ａ６－０５０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）においてインキュベートした。ＦＭ１－４３（２．５μｍ）を、イメージングの直前に筋線維に添加した。上記のように画像を取得し、定量化した。経時的なＦＭ１－４３蛍光を、ＦＩＪＩを使用して測定し、Ｆ／Ｆ０として経時的にプロットした。
心臓毒損傷および分析。野生型マウスの前脛骨筋に、２５μｇ／ｍｌの組換えアネキシンＡ６（５１８６－Ａ６－０５０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）または鎮静化したマウスのリンゲル（３％イソフルラン、０．８ｌ／分Ｏ2）を注射した。全身投与のために、野生型マウスに、１ｍｇ／ｋｇの組換えアネキシンＡ６（５１８６－Ａ６－０５０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＥＢＤで希釈したＰＢＳ（５μｌ／ｇ体重）を鎮静化したマウスの眼窩後腔に注射した（３％イソフルラン、０．８ｌ／分Ｏ2）。さらに、エバンスブルー色素（Ｅ－２１２９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を１０ｍｇ／ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に溶解して５μｌ／ｇ体重でマウスに注射し、前処理の２時間後、ＰＢＳ中の１０μＭ心臓毒溶液２０μｌを、鎮静化した動物の前脛骨筋または腓腹筋／ヒラメ筋（３％イソフルラン、０．８ｌ／分Ｏ2）に注射して心臓毒損傷を実行した。心臓毒は、筋肉の正中線に沿って放出され、筋肉の中心に均一な損傷領域を誘発した。心臓毒注射の３時間後に筋肉を採取した。
エバンスブルー色素の取り込み。凍結包埋した筋肉の中心からの切片（厚さ１０μｍ）を、クリオスタット（チャンバー：－２０℃、サンプル：－１５℃、カタログ番号ＣＭ１９５０、Ｌｅｉｃａ、ドイツ、ヴェッツラー）上で収集した。組織切片をメタノールで２分間固定し、リンスし、ＤＡＰＩ（Ｈ－１２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むベクタシールドと共にマウントした。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ａ１顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ、オーバーコッヘン）を使用し、１０倍の対物レンズを使用してイメージングを実行した。画像の取得には、ＺＥＮソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ、イェーナ）を使用した。蛍光定量、表面プロット、および筋肉面積を、ＦＩＪＩ（ＮＩＨ）を使用して実行した。全組織色素を定量化するために、全組織を解剖し、細かく刻み、秤量し、５５℃で１ｍＬのホルムアミド中で２時間インキュベートした。分光光度吸光度を６２０ｎｍで測定した。
血清収集およびＣＫ分析。マウスを鎮静化し（３％イソフルラン、０．８ｌ／分Ｏ2）、ヘパリン処理したキャピラリーチューブ（２０－３６２－５６６、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いた眼窩後方穿刺により、Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（商標）Ｇｏｌｄ Ｔｏｐ Ｓｅｒｕｍ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（３６５９６７ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）内に採血し、８，０００×ｇで１０分間遠心分離した。血漿画分を凍結し、－８０℃で保存した。血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）は、ＥｎｚｙＣｈｒｏｍ Ｃｒｅａｔｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ（ＥＣＰＫ－１００；ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州ヘイワード）を使用して、記載されているように（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，Ａｌｌｅｎ ＭＶ，Ｗａｒｎｅｒ ＪＬ，Ｂａｒｅｆｉｅｌｄ ＤＹ，Ｋｒｉｓｈｎａｎ Ｓ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＥ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｆｒｏｍ Ｌｏｓｓ ｏｆ Ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ Ｉｓ Ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｂｙ Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ６ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ Ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０１６；１８６（６）：１６１０－２２）、製造元の指示に従って、各マウスについて２回ずつ分析した。ＳｙｎｅｒｇｙのＨＴＸマルチモードプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）、バーモント州ウィヌースキー）を使用して結果を取得した。
短期間の慢性投薬レジメン。Ｓｇｃｇ欠損マウスを鎮静化し（３％イソフルラン、０．８ｌ／分Ｏ2）、上記のように採血した。鎮静化している間、マウスに１ｍｇ／ｋｇの組換えアネキシンＡ６（５１８６－Ａ６－０５０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰＢＳを右眼窩後腔に３日に１回、合計５回注射し、最初の注射後１４日目に採血した。Ｓｇｃｇ欠損マウスの追加のコホートから、最初のタンパク質注射の直前に上記のように採血した。次に、１ｍｇ／ｋｇの組換えアネキシンＡ６またはアネキシンＡ２（両方ともＮｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎのＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏｒｅにより産生）を鎮静化したマウスの右眼窩後腔に３日に１回、合計５回注射し、最初の注射後１４日目に採血した。
運動による損傷。Ｓｇｃｇ欠損マウスを鎮静化し（３％イソフルラン、０．８ｌ／分Ｏ2）、上記のように左眼窩後方穿刺により運動前の血液を採取した。鎮静化している間、マウスに１ｍｇ／ｋｇの組換えアネキシンＡ６（５１８６－Ａ６－０５０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰＢＳ＋１ｍｇ／ｋｇのＢＳＡを、午前９時および午後５時に右眼窩後腔に４８時間にわたって５回連続注射した。５回目のＲＯ注射の２時間後、１０ｍ／分、下り傾斜１５°での６０分間のトレッドミルランニングにマウスを供した。運動の３０分後、左眼窩後腔から血液を採取した。血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）を上記のように分析した。注射、運動、および採血は、処理群を伏せて行った。
タンパク質の生産。組換えマウスアネキシンＡ６およびマウスアネキシンＡ２は、ノースウェスタン大学の組換えタンパク質生産コアによって生産および精製された。簡単に説明すると、マウスアネキシンＡ６（ＭＧ２２２６４５、Ｏｒｉｇｅｎｅ、メリーランド州ロックビル）およびアネキシンＡ２（ＭＧ２０５０６４、Ｏｒｉｇｅｎｅ、メリーランド州ロックビル）を、ｐＣＭＶ６－ＡＣ－ＨＩＳバックボーン（ＰＳ１００００２、Ｏｒｉｇｅｎｅ、メリーランド州ロックビル）にサブクローニングした。プラスミドをトランスフェクトし、ＥｘｐｉＣＨＯ発現系（Ａ２９１３３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）で発現させた。カルボキシ末端にタグ付けされた組換えタンパク質を、Ｎｉ荷電ＭａｇＢｅａｄｓ（Ｌ００２９５、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で精製し、ＳＤＳ－Ｐａｇｅにより純度を評価した。タンパク質の純度は、抗ＨＩＳ（ＭＡＢ０５０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）および抗アネキシンＡ６（ａｂ３１０２６、Ａｂｃａｍ）または抗アネキシンＡ２（ａｂ１５４１１３、Ａｂｃａｍ）抗体を使用したイムノブロットによってさらに検証した。タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水で希釈し、－８０℃で保存した。
カルシウム動態。ＦＤＢ筋肉をエレクトロポレーションし、上記のように単離した。Ｃａ2+濃度が２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．１７５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０５０ｍＭ、および０ｍＭのリンゲル液中で筋線維に損傷を与えた。０ｍＭのＣａ2+リンゲルにのみ、Ｃａ2+キレート剤としてＥＤＴＡを添加した。それらの実験のために、それぞれ２ｍＭ、１ｍＭ、および０．５ｍＭのリンゲル中で筋線維を直接単離した。０．５ｍＭ未満のＣａ2+を使用した実験では、筋線維を０．５ｍＭのＣａ2+リンゲル中で単離し、０ｍＭ ＥＤＴＡを含まないＣａ2+リンゲルで希釈した。０ｍＭの実験では、筋線維を０．５ｍＭのＣａ2+リンゲル中で単離し、イメージングの直前に０ｍＭのＣａ2+＋ＥＤＴＡリンゲルに交換した。野生型アネキシン＋野生型アネキシン構築物の共エレクトロポレーションを１本のマウスの足で実行し、反対側の足には野生型アネキシン＋変異体アネキシンを共エレクトロポレーションした。すべての測定値は、少なくともｎ≧２匹のマウス（各Ｃａ2+濃度でマウスあたりｎ≧３本の筋線維）から単離した筋線維から取得した。面積－Ｃａ2+曲線は、０～２ｍＭの範囲のＣａ２＋濃度でＨｉｌｌ Ｃｕｒｖｅに適合した。動態パラメータは、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄを使用して計算した。
カルシウムおよびｐＨインジケータ色素の測定。野生型ＦＤＢを単離し、上記のようにＭａｔｅｋガラス底皿上でリンゲルに播種した。イメージングの２０分前に、取扱説明書に記載されているように、３７℃でＦｌｕｏ－４ ＡＭ（Ｆ１０４８９、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）またはｐＨｒｏｄｏ ＡＭ（Ｐ３５３７３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を筋線維にロードした。上記のように、線維をリンゲルで１回リンスした後、損傷を与え、Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ ＧａＳＰで画像化した。蛍光強度は、ＦＩＪＩ（ＮＩＨ）を使用して測定した。蛍光強度のｐｈＲｏｄｏ変化をＦ／Ｆ０として計算した。データは、マウスあたり複数の筋線維からの実験あたりｎ＝３匹のマウスから取得した。さらに、野生型筋線維を、０ｍＭのＣａ2+中で１時間インキュベートし、イメージングの前にＦｌｕｏ－４ ＡＭを２０分間事前ロードし、リンスし、次いで、外部リンゲル液中、ＥＧＴＡの有無にかかわらず、０ｍＭの外部Ｃａ2+の存在下、ＭＰ＋で損傷を与えた。
心臓毒注射および組織学。野生型マウスを鎮静化し（３％イソフルラン、０．８ｌ／分Ｏ2）、１ｍｇ／ｋｇの組換えアネキシンＡ６（５１８６－Ａ６－０５０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰＢＳ＋１ｍｇ／ｋｇ ＢＳＡを右後眼窩腔に注射し、回復させた。注射の２時間後、マウスを再度鎮静化した。鎮静化している間、前脛骨筋に、上記のように、２０ｕｌのＰＢＳ中の１０μｍの心臓毒を正中線に沿って注射した。注射の７日後、筋肉を単離して凍結した。筋腱から中腹まで１００μｍごとに筋切片を採取し、固定し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ａ１顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ、オーバーコッヘン）を使用し、１０倍の対物レンズを使用してイメージングを実行した。タイル画像の取得には、ＺＥＮソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ、イェーナ）を使用した。損傷面積の割合は、平均損傷面積（内部筋核を含む）を筋肉あたり３つの切片の総筋肉面積で割ったものとして計算した。組織処理の技術的エラーのため、各群から１つの筋肉を除外した。損傷面積は、ＦＩＪＩ（ＮＩＨ）を使用して測定した。
単一セルのＣａ2+および短縮測定。ラミニンでコーティングされたガラス底の３５ｍｍ皿に、単離したＦＤＢ線維を１時間播種し、１０％ＣＯ2インキュベーター内にて、３７℃で、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で一晩培養した。データ収集の１時間前に、培地を除去し、１０％ＣＯ2インキュベーター内にて、３７℃で１時間、１０μＭのＩｎｄｏ－１ ＡＭ（ＴｅｆＬａｂｓ）を含むＴｙｒｏｄｅ緩衝液（１１９ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ2、２ｍＭのＭｇＣｌ2）中で細胞をインキュベートした。次に、皿にＴｙｒｏｄｅ緩衝液を充填し、カスタムステージに取り付け、プラチナペーシング電極を皿に挿入した。９５０Ａソフトウェア（Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって制御される７０１Ｃ高出力刺激装置を使用して、刺激を誘発した。刺激は、４０Ｈｚおよび８０Ｈｚ、５ミリ秒のパルス幅、１００ミリ秒の持続時間で実行した。レシオメトリックなＣａ2+シグナルを、２本の光電子増倍管およびＦｌｕｏｒｏＤａｑコントローラを使用して収集した。ビデオ筋節長（Ｖｉｄｅｏ ｓａｒｃｏｍｅｒｅ ｌｅｎｇｔｈ）を、Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ９００Ｂ－ＶＳＬシステム（オンタリオ州オーロラ）を使用して、高速度カメラおよび高速フーリエ変換で記録した。２０秒間で１０個の移行が収集され、周波数ごとにセルごとに平均化された。
統計的分析。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して実行した。比較はＡＮＯＶＡに依拠した（（１変数の場合には一元ＡＮＯＶＡ、２変数（通常は、面積とＣａ2+濃度）の場合には二元ＡＮＯＶＡ））。それ以外の場合は、対応のない両側ｔ検定を実行した。０．０５以下のＰ値は有意であると見なした。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
研究の承認。この研究は、ノースウェスタン大学の動物実験委員会（イリノイ州シカゴ）の承認を得て実施した。
結果
Ｃａ2+は、膜が損傷すると修復キャップに局在する。筋膜修復の活性化には、外部Ｃａ2+の存在が必要である（Ｂａｎｓａｌ Ｄ，Ｍｉｙａｋｅ Ｋ，Ｖｏｇｅｌ ＳＳ，Ｇｒｏｈ Ｓ，Ｃｈｅｎ ＣＣ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ．２００３；４２３（６９３６）：１６８－７２）。アネキシンタンパク質は、修復キャップの下の細胞質内のアネキシンフリーゾーンに隣接する損傷部位で修復キャップに凝集することが以前に示されている（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ Ｍ，Ｂａｒｅｆｉｅｌｄ ＤＹ，Ａｌｌｅｎ ＭＶ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＥ，ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ ＥＭ．Ａｎ ａｃｔｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｎｅｘｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１６；２１３（６）：７０５－１８、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，Ａｌｌｅｎ ＭＶ，Ｗａｒｎｅｒ ＪＬ，Ｂａｒｅｆｉｅｌｄ ＤＹ，Ｋｒｉｓｈｎａｎ Ｓ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＥ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｆｒｏｍ Ｌｏｓｓ ｏｆ Ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ Ｉｓ Ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｂｙ Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ６ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ Ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０１６；１８６（６）：１６１０－２２、Ｓｗａｇｇａｒｔ ＫＡ，Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，Ｖｏ ＡＨ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＥ，Ｋｉｍ ＥＹ，Ｆａｈｒｅｎｂａｃｈ ＪＰ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ６ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｂｙ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ ｒｅｐａｉｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．２０１４；１１１（１６）：６００４－９、Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ Ｍ，Ｂａｒｅｆｉｅｌｄ ＤＹ，Ｗａｒｎｅｒ ＪＬ，Ｖｏ ＡＨ，Ｈａｄｈａｚｙ Ｍ，Ｅａｒｌｅｙ ＪＵ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｓｔｅｒｏｉｄ ｄｏｓｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｒｅｐａｉｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｌｉｃｉｔｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ ａｔｒｏｐｈｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１７；１２７（６）：２４１８－３２）。損傷部位でのＣａ2+ダイナミクスをリアルタイムで視覚化するために、インビボ蛍光Ｃａ2+インジケータタンパク質であるＧＣａＭＰ５Ｇを利用した。ＧＣａＭＰ５Ｇは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、カルシウム結合タンパク質であるカルモジュリン、およびカルモジュリンＭ１３結合ペプチドで構成される融合タンパク質である。ＧＣａＭＰ５Ｇは、Ｃａ2+に結合していない場合、蛍光が最小限に抑えられ、Ｃａ2+結合により、タンパク質内のコンフォメーションが変化し、ＧＦＰの蛍光強度が増加する（Ａｋｅｒｂｏｏｍ Ｊ，Ｃｈｅｎ ＴＷ，Ｗａｒｄｉｌｌ ＴＪ，Ｔｉａｎ Ｌ，Ｍａｒｖｉｎ ＪＳ，Ｍｕｔｌｕ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＧＣａＭＰ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｆｏｒ ｎｅｕｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｍａｇｉｎｇ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１２；３２（４０）：１３８１９－４０）。野生型短趾屈筋（ＦＤＢ）の筋肉にＧＣａＭＰ５Ｇプラスミドをエレクトロポレーションし、レーザーアブレーションを使用して原形質膜を損傷した（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ Ｍ，Ｂａｒｅｆｉｅｌｄ ＤＹ，Ａｌｌｅｎ ＭＶ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＥ，ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ ＥＭ．Ａｎ ａｃｔｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｎｅｘｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１６；２１３（６）：７０５－１８、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ ＥＭ．ＤＮＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｍｙｏｆｉｂｅｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ＪｏＶＥ．２０１５；１０６（１０６）：ｅ５３５５１）。膜損傷から２秒以内に（矢印）、ＧＣａＭＰ５Ｇ蛍光が損傷部位の細胞質内に蓄積した。ＧＣａＭＰ５Ｇの蛍光強度は、２６０秒のイメージングを通じて徐々に増加した（図２３Ａ、上パネル）。
これらの結果がＧＣａＭＰ５Ｇセンサーのタンパク質凝集を反映していないことを確認するために、Ｆｌｕｏ－４ＡＭの存在下で野生型筋線維に損傷を与えた。ＦＬＵＯ－４ ＡＭは、Ｃａ2+に結合すると蛍光強度を増し、Ｃａ2+動態を測定するために常套的に使用される、非タンパク質Ｃａ2+インジケータ色素である。ＧＣａＭＰ５Ｇ蛍光と同様に、Ｆｌｕｏ－４ ＡＭの蛍光強度は、損傷の２秒後にレーザー誘発膜損傷の部位で増加し（矢印）、２６０秒のイメージングを通じて強度を増加させ続けた（図２３Ａ、下パネル）。カルボキシル末端ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タグを有するアネキシンＡ６およびＧＣａＭＰ５Ｇを発現するプラスミドを共エレクトロポレーションされた筋線維において、ＧＣａＭＰ５Ｇ蛍光は、アネキシンＡ６フリーゾーンの周りのリングに局在し（図２３Ｂ、矢じり）、修復キャップではアネキシンＡ６と共局在した（図２３Ｂ、矢印、マージ）。また、異なるｐＨレベルで蛍光が変わる非タンパク質ｐＨインジケータ色素であるｐＨｒｏｄｏ蛍光を使用して、損傷によってｐＨが変化するかどうかを評価した。Ｃａ2+インジケータの蛍光が損傷部位で既に増加している場合、損傷後１０秒と比較して損傷前の状態（０秒）からの変化は認められなかった（図１５）。この時系列は、損傷部位でのＣａ2+蓄積と一致しており、アネキシンの転座および修復キャップへのアセンブリを促進する。
アネキシン修復キャップは、修復キャップの動員中に異なるＣａ2+感度を示す。アネキシンタンパク質は、Ｃａ2+依存性のリン脂質およびアクチン結合タンパク質であり、４つのアネキシン反復ドメイン（アネキシンＡ６の場合は８つ）を含む（図２）。アネキシン反復ドメインは、Ｃａ2+に結合するが、他のクラスの修復タンパク質に見られるＥＦハンドおよびＣ２ドメインのＣａ2+結合とは別個のものである（Ｇｅｒｋｅ Ｖ，ａｎｄ Ｍｏｓｓ ＳＥ．Ａｎｎｅｘｉｎｓ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ．２００２；８２（２）：３３１－７１）。アネキシンはＣａ2+に配位結合し、その凸面から膜に結合し（図２）、ＩＩ型とＩＩＩ型の両方のＣａ2+結合部位はアネキシンタンパク質に記載されている。筋線維でのアネキシン媒介筋鞘修復におけるＣａ2+要件をさらに定義するために、アネキシンＡ１、Ａ２、またはＡ６修復キャップ形成を複数のＣａ2+濃度で調べた。キャップサイズはｚスタックの中心から測定し、蛍光タグの種類（ｔｕｒｂｏＧＦＰまたはｔｄＴｏｍａｔｏ）では、パラメータの評価は変わらなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。アネキシンＡ１およびＡ６修復キャップのサイズはＣａ2+に依存し、最大の修復キャップは２ｍＭで形成され、それよりも小さい修復キャップは０．１ｍＭで形成されたが、アネキシンＡ２修復キャップは０．０５ｍＭのＣａ2+まで有意に減少しなかった（図２３Ｃおよび２３Ｄ）。修正されたＨｉｌｌの式を使用して、修復キャップ面積をＣａ2+濃度の関数としてプロットした。アネキシンＡ２は、Ｃａ2+の最低濃度０．０５ｍＭで修復キャップを形成したが、アネキシンＡ１およびＡ６は、０．１ｍＭ Ｃａ2+未満のＣａ2+濃度では識別可能なキャップを形成しなかった。これは、それぞれ０．１２ｍＭおよび０．１７ｍＭのＫｍ1/2を示すＡ６およびＡ１（図２３Ｄ）と比較して、０．０６７ｍＭのＫｍ1/2を有するアネキシンＡ２の曲線が著しく左側にあることからわかる。アネキシンＡ１およびＡ６の修復キャップのサイズおよび速度は、Ｃａ2+濃度に大きく依存していた（図４）。アネキシンＡ２キャップの形成速度およびキャップのサイズは、２ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭのＣａ2+で類似していたが、アネキシンＡ１およびＡ６の速度は、Ｃａ2+濃度が低いほど減少し、これは、アネキシンＡ２に対するＣａ2+親和性が高いことを示唆している（図４）。レーザー損傷の種類が原因で修復キャップの形成がアーティファクトではないことを確認するために、Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ ＧａＳＰ共焦点およびＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ ＭＰ＋多光子共焦点の両方でレーザー損傷を誘発した。多光子レーザーによって誘発された損傷は、より焦点が絞られており、側副損傷（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ｄａｍａｇｅ）が少なくなっている。アネキシンＡ６修復キャップは、いずれの種類のレーザーでも同等であるように見えた（図５）。これらのデータは、アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６修復キャップの形成が、筋線維修復中に存在するＣａ2+のレベルに影響を受け、アネキシンＡ２が、研究された３つのアネキシンの中で最もＣａ2+感受性であることを示している。
アネキシンの過剰発現は、膜損傷部位でのブレブ形成を促進する。Ｌｙｔｅｃｈｉｎｕｓ ｐｉｃｔｕｓおよびＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞の膜修復研究では、膜修復部位から出現し、放出される膜構造が観察されている（Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ＮＲ，Ｓｏｎｎｅｍａｎｎ ＫＪ，Ｅｌｉｃｅｉｒｉ ＫＷ，ａｎｄ Ｂｅｍｅｎｔ ＷＭ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｗｏｕｎｄ ｒｅｐａｉｒ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１６；２７（１４）：２２７２－８５、Ｂｉ ＧＱ，Ａｌｄｅｒｔｏｎ ＪＭ，ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｈａｒｄｔ ＲＡ．Ｃａｌｃｉｕｍ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｓｅａｌｉｎｇ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．１９９５；１３１（６ Ｐｔ ２）：１７４７－５８）。さらに、人工膜調製物では、組換えアネキシンの添加により、膜の欠陥部位でＣａ2+依存的に膜の折り畳みまたはブレブ形成が誘発された（Ｂｏｙｅ ＴＬ，Ｊｅｐｐｅｓｅｎ ＪＣ，Ｍａｅｄａ Ｋ，Ｐｅｚｅｓｈｋｉａｎ Ｗ，Ｓｏｌｏｖｙｅｖａ Ｖ，Ｎｙｌａｎｄｓｔｅｄ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎｓ ｉｎｄｕｃｅ ｃｕｒｖａｔｕｒｅ ｏｎ ｆｒｅｅ－ｅｄｇｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１８；８（１）：１０３０９、Ｂｏｙｅ ＴＬ，Ｍａｅｄａ Ｋ，Ｐｅｚｅｓｈｋｉａｎ Ｗ，Ｓｏｎｄｅｒ ＳＬ，Ｈａｅｇｅｒ ＳＣ，Ｇｅｒｋｅ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ４ ａｎｄ Ａ６ ｉｎｄｕｃｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｕｒｖａｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７；８（１）：１６２３）。生きた骨格筋線維において、筋膜損傷部位で同様の所見が観察され得るかどうかを調査した。ＧＣａＭＰ５Ｇは、骨格筋線維において、単独で、またはアネキシンＡ１、Ａ２、もしくはＡ６と組み合わせて発現した。アネキシンの過剰発現は、膜病変のアネキシン修復キャップから放出される細胞外ブレブの形成を促進することが見出された（図１６Ａ、赤いチャネル）。これらのブレブは、修復キャップの形成後に現れ、修復キャップの細胞外先端に見られ、これはＦＭ４－６４蛍光と一致していた（図１６Ａおよび１６Ｂ）。ＦＭ４－６４は、水溶液中では非蛍光性であり、損傷中に露出した膜リン脂質に結合するときに蛍光強度を増加させる膜不透過性色素であり、ＦＭ４－６４は膜損傷マーカーとして一般的に使用される（Ｂａｎｓａｌ Ｄ，Ｍｉｙａｋｅ Ｋ，Ｖｏｇｅｌ ＳＳ，Ｇｒｏｈ Ｓ，Ｃｈｅｎ ＣＣ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ．２００３；４２３（６９３６）：１６８－７２、Ｃａｉ Ｃ，Ｍａｓｕｍｉｙａ Ｈ，Ｗｅｉｓｌｅｄｅｒ Ｎ，Ｍａｔｓｕｄａ Ｎ，Ｎｉｓｈｉ Ｍ，Ｈｗａｎｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ＭＧ５３ ｎｕｃｌｅａｔｅｓ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１１（１）：５６－６４、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ ＥＭ．ＤＮＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｍｙｏｆｉｂｅｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ＪｏＶＥ．２０１５；１０６（１０６）：ｅ５３５５１、Ｙｅｕｎｇ Ｔ，Ｈｅｉｔ Ｂ，Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎ ＪＦ，Ｆａｉｒｎ ＧＤ，Ｃｈｉｕ Ｂ，Ｉｎｍａｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ ｔｏ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｈａｒｇｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｐｈａｇｏｓｏｍｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．２００９；１８５（５）：９１７－２８、Ｚｗｅｉｆａｃｈ Ａ．ＦＭ１－４３ ｒｅｐｏｒｔｓ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ ｉｎ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ．２０００；３４９（Ｐｔ １）：２５５－６０）。アネキシンＡ６およびアネキシンＡ２の過剰発現は、アネキシンＡ１の過剰発現またはＧＣａＭＰ５Ｇ単独の後に観察されたよりも有意に多くのブレブを誘発した（図１６Ｃおよび１６Ｄ）。さらに、アネキシン誘発ブレブはＧＣａＭＰ５Ｇが豊富であり、アネキシンＡ６は、アネキシンＡ１、Ａ２、またはＧＣａＭＰ５Ｇ単独と比較して、有意に大きなＧＣａＭＰ５Ｇ含有ブレブの形成を誘発した（図１６Ａ、緑のチャネル、および図１６Ｄ）。ｚスタックコンパイルは、損傷部位から放出される大きなアネキシンＡ６誘発ＧＣａＭＰ５Ｇ陽性ブレブを実証した。対照的に、アネキシンＡ２により、修復キャップから小さなブレブが押し出された。これらのデータは、アネキシンが膜破壊の部位で修復キャップを形成するだけでなく、これらのキャップがＣａ2+結合タンパク質が豊富な細胞外成分の排出のための部位として機能することを示している。
アネキシン過剰発現による損傷部位での細胞内Ｃａ2+蛍光の減少。レーザー損傷後のＣａ2+インジケータＧＣａＭＰ５Ｇのタイムラプスイメージングは、細胞外Ｃａ2+が細胞外ブレブ形成に伴って減少していることを示唆し、これらのブレブが、排出により細胞内Ｃａ2+蓄積を減少させるのに役立つことを示唆している。アネキシンにより誘発される細胞内Ｃａ2+蛍光の減少は、３つのアネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６のすべてで見ることができたが、アネキシンＡ２およびＡ６で最も顕著であった（図７Ａ）。２４０秒間のイメージングで、アネキシンＡ６の過剰発現は、細胞内Ｃａ2+の最も有意な減少を誘発し、この減少は、内部ＧＣａＭＰ５ＧのＣａ2+蛍光として視覚化された（図７Ｂ）。損傷後の最初の２０秒間の詳細な分析では、ＧＣａＭＰ５Ｇのみと比較した場合、アネキシンＡ１ではなくアネキシンＡ２およびＡ６による内部ＧＣａＭＰ５ＧのＣａ2+蛍光の有意な減少が示された（図７Ｃ）。損傷前のベースラインＧＣａＭＰ５Ｇ蛍光強度は、群間で有意差はなかった（図７Ｄ）。アネキシンＡ６発現による病変での内部Ｃａ2+蛍光の減少を、Ｆｌｕｏ－４ ＡＭを使用して確認した（図１７）。したがって、アネキシンの発現は、損傷した筋線維内でのＣａ2+シグナルの低下を誘発し、同時にＣａ2+結合タンパク質で満たされたブレブの排出が増強された。さらに、アネキシンＡ６は、試験された３つのアネキシンの中で、この応答を維持するのに最も効果的であった。
アネキシンのようなＣａ2+結合タンパク質の過剰発現は、細胞内Ｃａ2+シグナル伝達および細胞機能に予期しない影響を与える可能性がある。したがって、アネキシンＡ６を過剰発現する単離された筋線維のＣａ2+処理および収縮特性を対照と比較して評価した。アネキシンＡ６を発現する単離された筋線維に、レシオメトリックなＣａ2+インジケータ色素Ｉｎｄｏ－１をロードした。アネキシンＡ６または対照線維間で、４０Ｈｚまたは８０Ｈｚの刺激周波数でのＣａ2+サイクリングの差異は観察されなかった（図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃ）。無負荷の細胞短縮も、過剰発現したアネキシンＡ６の存在に影響を受けなかった（図８Ｄ、８Ｅ、および８Ｆ）。これらの結果は、アネキシンＡ６の過剰発現が筋線維によって十分に許容されることを実証した。
アネキシンＡ６のＣａ2+結合は、修復キャップの形成および筋線維の修復に必要である。アネキシンＡ１残基Ｄ１７１およびアネキシンＡ２残基Ｄ１６１の変異は、ＨＥＫ細胞におけるアネキシン膜の転座を阻害することが以前に示された（ＭｃＮｅｉｌ ＡＫ，Ｒｅｓｃｈｅｒ Ｕ，Ｇｅｒｋｅ Ｖ，ａｎｄ ＭｃＮｅｉｌ ＰＬ．Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ａｎｎｅｘｉｎ Ａ１ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００６；２８１（４６）：３５２０２－７、Ｊｏｓｔ Ｍ，Ｔｈｉｅｌ Ｃ，Ｗｅｂｅｒ Ｋ，ａｎｄ Ｇｅｒｋｅ Ｖ．Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｕｎｉｑｕｅ Ｃａ（２＋）－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２；２０７（３）：９２３－３０）。これらの変異が、生きた筋線維における、筋膜損傷後に形成された高分子アネキシン修復キャップの転座および形成を阻害するかどうかが問われた。アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６タンパク質配列のアラインメントを使用して、３つすべてのアネキシンタンパク質における、ＩＩ型Ｃａ2+結合部位のコンセンサス配列内の保存残基を特定した（図２）。アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６のＣａ2+結合を破壊するために、部位特異的変異誘発を行って、最初のＩＩ型Ｃａ2+結合部位にあるアスパラギン酸残基をアラニン残基（それぞれＡ１Ｄ１７１Ａ、Ａ２Ｄ１６１Ａ、Ａ６Ｄ１４９Ａ）に変換した（図９Ａ）。Ｅ２３３ＡはアネキシンＡ６でも生成され、アネキシンＡ６の２番目のアネキシン反復ドメインのＣａ2+結合部位においても同様の変化をもたらした。各構築物には、Ｃ末端にｔｕｒｂｏＧＦＰまたはｔｄＴｏｍａｔｏも含まれていた。修復キャップ形成中の同型アネキシン相互作用の影響を評価するために、野生型＋野生型（Ａ６＋Ａ６）または野生型＋変異体（Ａ６＋Ａ６Ｅ２３３Ａ）のアネキシンの組み合わせを筋線維に共エレクトロポレーションした。アネキシンＡ６におけるＥ２３３の変異はドミナントネガティブに作用し共発現した野生型アネキシンＡ６タンパク質のキャップサイズを大幅に減少させた（図１０Ａ）。以前の構造研究は、アネキシンＡ６の最初のアネキシン反復ドメインのＤ１４９がＣａ2+に結合しないことを示唆し（Ａｖｉｌａ－Ｓａｋａｒ ＡＪ，Ｃｒｅｕｔｚ ＣＥ，ａｎｄ Ｋｒｅｔｓｉｎｇｅｒ ＲＨ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ａｎｎｅｘｉｎ ＶＩ ｉｎ ａ ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｏｕｎｄ ｓｔａｔｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ．１９９８；１３８７（１－２）：１０３－１６）、これと一致して、アネキシンＡ６のＤ１４９Ａ変異体はキャップサイズにほとんど影響を与えなかった（図９Ｂ、右パネル）。修復キャップフェレットの直径を、修正されたＨｉｌｌの式を使用して、Ｃａ2+濃度の関数としてプロットした。変異体アネキシンＡ６Ｅ２３３Ａの発現により、共発現した野生型アネキシンＡ６タンパク質のキャップ径（ＤＭＡＸ）が大幅に減少した（図１０Ｂ）。修復キャップ形成に対する異型アネキシン相互作用の影響を評価するために、野生型および変異型アネキシン構築物のさまざまな組み合わせを筋線維に共エレクトロポレーションした。変異型アネキシンＡ６Ｅ２３３Ａの共発現により、それぞれＡ１＋Ａ６、Ａ２＋Ａ６、Ａ６＋Ａ６対照と比較して、アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６のキャップサイズが大幅に減少した（図１０Ｃ）。一緒に、これらのデータは、アネキシンタンパク質がアネキシン修復複合体アセンブリに影響を与える同型および異型様式で相互作用し、変異体アネキシンＡ６タンパク質が修復中にアネキシン複合体アセンブリを負に調節するのに十分であることを示した。
アネキシンＡ１とＡ２の両方のＣａ2+結合も、修復キャップの形成に必要であった。Ａ１Ｄ１７１ＡおよびＡ２Ｄ１６１Ａ変異体のキャップサイズは、それぞれ野生型アネキシンＡ１およびＡ２対照と比較して減少した。変異体アネキシンＡ１Ｄ１７１ＡおよびＡ２Ｄ１６１Ａの発現により、それぞれ共発現した野生型アネキシンタンパク質の修復キャップ直径（ＤＭＡＸ）が大幅に減少した（図９Ｂ、左および中央パネル）。変異体アネキシンＡ１Ｄ１７１ＡおよびＡ２Ｄ１６１Ａがそれぞれ共発現する野生型アネキシンＡ１およびＡ２キャップサイズを大幅に減少させる能力を有しているにもかかわらず、Ａ１Ｄ１７１ＡまたはＡ２Ｄ１７１Ａの、野生型アネキシンＡ６キャップサイズへの影響は最小であった（図９Ｃ）。これらのデータは、アネキシンＡ１およびＡ２が同型様式で相互作用し、セルフキャップアセンブリに影響を与える一方で、修復キャップへのＡ６の局在はアネキシンＡ１とＡ２の局在によって最小限に調節されることを示した。
修復キャップおよび膜修復能力でのアネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６のアセンブリに対するドミナントネガティブアネキシンＡ６の効果を決定するために、ＦＭ４－６４の存在下で単離された筋線維に対して同様にレーザー損傷を実行した。アネキシンＡ６Ｅ２３３Ａ－ＧＦＰを発現する筋線維は、野生型アネキシンＡ６－ＧＦＰを発現する対照筋線維と比較して、レーザー損傷後のＦＭ４－６４蛍光領域が増加した（図１０Ｄ）。これらの結果は、機能的なアネキシン修復複合体が適切な膜修復に必要であり、アネキシンＡ６が複合体形成の調整に関与していることを示した。
アネキシンＡ６は、Ｃａ2+依存的にインビトロでレーザー誘発筋線維損傷から保護した。アネキシンＡ６は高分子修復キャップ複合体の形成を促進し、膜損傷部位での大きなＣａ2+充填ブレブの形成に最も効率的であったため、アネキシンＡ６の過剰発現が野生型筋線維の膜損傷を軽減するかどうかを評価した。野生型筋線維にアネキシンＡ６－ＧＦＰをエレクトロポレーションするか、模擬エレクトロポレーションした後、ＦＭ４－６４の存在下でレーザー損傷を与えて、損傷領域をマークした。アネキシンＡ６を過剰発現する野生型筋線維では、対照筋線維と比較して、レーザー誘発膜損傷後のＦＭ４－６４色素取り込みが減少した（図１８Ａ）。これらの結果は、アネキシンＡ６の細胞内過剰発現が、膜修復の改善および／または単離された筋線維におけるレーザー誘発膜損傷に対する保護に効果的であることを示している。
細胞内アネキシンＡ６は、膜損傷部位に露出したリン脂質を標的とし、膜修復能力を高めるため、細胞外組換えアネキシンＡ６（ｒＡＮＸＡ６）も損傷部位に局在し、膜損傷から保護すると仮定した。筋ジストロフィーは、重要な細胞骨格または膜関連タンパク質における機能喪失型変異から生じる進行性の筋消耗性疾患であり、しばしば膜の脆弱化を引き起こす。組換えアネキシンＡ６が健康な筋肉とジストロフィー筋肉の両方において膜損傷から保護できるかどうかを判断するために、デュシェンヌ筋ジストロフィーを表すモデルから野生型筋線維およびジストロフィー筋線維を単離し、組換えアネキシンＡ６またはビヒクル対照とインキュベートした。損傷の程度を視覚化するために、ＦＭ４－６４の存在下でレーザー損傷を実施した。細胞外組換えアネキシンＡ６による治療は、ビヒクル対照で治療した筋線維と比較して、ＦＭ４－６４蛍光領域を減少させ、これは、健康な筋線維とジストロフィー筋線維の両方で修復が増強されたことを示している（図１８Ｂおよび１８Ｃ）。
組換えアネキシンＡ６の保護効果が外部Ｃａ2+を必要とするかどうかを評価するために、野生型筋線維を、ＦＭ４－６４と同様の膜損傷の蛍光マーカーであるＦＭ１－４３をロードした組換えアネキシンＡ６で前処理し、その後、１ｍＭのＣａ2+または０ｍＭのＣａ2+＋ＥＧＴＡ（Ｃａ2+キレート剤）を含む溶液で損傷させた。経時的な病変でのＦＭ１－４３蛍光蓄積（Ｆ／Ｆ０）は、１ｍＭのＣａ2+の存在下と比較して、Ｃａ2+の非存在下で有意に増加した（図１９Ａおよび１９Ｂ）。これらのデータは、細胞外組換えアネキシンＡ６が膜損傷から保護し、および／またはＣａ2+依存的に細胞外曝露を通じて修復を増強することを示した。
組換えアネキシンＡ６は、インビボでの急性筋肉損傷から保護した。インビボでの筋肉損傷から保護するための組換えアネキシンＡ６の治療可能性を決定するために、組換えアネキシンＡ６をツール化合物として利用した。組換えアネキシンＡ６またはビヒクル対照を、毒素誘発損傷の２時間前に野生型マウスの前脛骨筋（ＴＡ）に筋肉内注射した。マウスにエバンスブルー色素を腹腔内注射した。これは、無傷の健康な筋線維によって排除されるが、損傷した透過性筋線維に容易に取り込まれる重要なトレーサである（Ｊｅｎｎｉｓｃｈｅ Ｅ，ａｎｄ Ｈａｎｓｓｏｎ ＨＡ．Ｐｏｓｔｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎｊｕｒｙ：ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ａｄｅｑｕａｃｙ ｏｆ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．１９８６；４４（３）：２７２－８０）。心臓毒損傷の３時間後、エバンスブルー色素の取り込みについて筋肉を評価した（図１２Ａ）。グロスイメージングは、対照と比較して色素（青）取り込みが少ないことからわかるように、組換えアネキシンＡ６による前処理が、インビボでの心臓毒誘発筋肉損傷を減少させることを示した（図１２Ｂ）。蛍光イメージングは、組換えアネキシンＡ６による前処理によって、対照筋肉と比較して、色素（赤）取り込みが５０％減少することを示した（図１２Ｃ）。表面プロットプロファイルは、筋肉内組換えアネキシンＡ６で前処理した前脛骨筋における色素蛍光が減少していることを示している（図１２Ｄ）。
アネキシンＡ６の筋肉内注射は急性損傷を軽減するのに効果的であったが、この適用経路は、大きな筋肉群、内部組織、または慢性疾患の治療には最適ではない。したがって、急性筋肉損傷に対する保護における眼窩後（ＲＯ）注射を介して全身投与された組換えアネキシンＡ６の有効性を調べた。組換えアネキシンＡ６またはビヒクルを、毒素誘発損傷の２時間前に眼窩後腔に注射した。エバンスブルー色素をマウスに同時に注射した。心臓毒損傷の３時間後、エバンスブルー色素の取り込みについて筋肉を評価した（図２０Ａ）。蛍光イメージングは、組換えアネキシンＡ６による前処理によって、ビヒクル対照と比較して、色素（緑）取り込みが３８％減少することを示した（図２０Ｂおよび２０Ｃ）。表面プロットプロファイルは、全身組換えアネキシンＡ６で前処理した筋肉における色素蛍光が減少していることを示している（図２０Ｃ）。さらに、損傷した腓腹筋／ヒラメ筋の全組織分光分析により、ビヒクル処理したものと比較して、ｒＡＮＸＡ６による前処理によって色素取り込みが５８％減少していることが明らかになった（図２０Ｄ）。これらの結果は、組換えアネキシンＡ６の局所投与および全身投与がインビボでの急性筋肉損傷から保護することを実証した。
組換えアネキシンＡ６投与が筋細胞の生存および／または損傷からの回復を増強するかどうかを判断するために、組換えアネキシンＡ６またはＢＳＡ対照を１ｍｇ／ｋｇで眼窩後方全身注射によりマウスに投与した。タンパク質投与の２時間後、前脛骨筋に心臓毒を注射して、限局性の筋肉損傷を誘発した。損傷の７日後に筋肉を採取し、損傷領域について組織学評価した（図２０Ｅ）。組換えアネキシンＡ６による前処理は、発作後７日で、内部筋核（黒い点線の輪郭）によってマークされた損傷筋肉の割合を減少させた（図２０Ｆおよび２０Ｇ）。これらのデータは、組換えアネキシンＡ６の全身投与が急性筋肉損傷から保護し、筋細胞の生存／損傷からの回復を促進することを例証している。
組換えアネキシンＡ６は、インビボでの慢性的な筋肉損傷から保護した。次に、全身投与された組換えアネキシンＡ６が、肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ（ＬＧＭＤ２Ｃ）のＳｇｃｇ欠損マウスモデルにおける筋肉損傷から保護する能力を評価した（Ｈａｃｋ ＡＡ，Ｃｏｒｄｉｅｒ Ｌ，Ｓｈｏｔｕｒｍａ ＤＩ，Ｌａｍ ＭＹ，Ｓｗｅｅｎｅｙ ＨＬ，ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ ＥＭ．Ｍｕｓｃｌｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．１９９９；９６（１９）：１０７２３－８）。Ｓｇｃｇ欠損マウスは、膜の安定性および機能に必要なジストロフィン糖タンパク質複合体の内在性膜成分であるγ－サルコグリカンを欠いている。γ－サルコグリカンを欠いたヒトおよびマウスでは、進行性の筋肉疾患、筋肉機能の低下、ならびに筋肉損傷および膜漏出の血清バイオマーカーである血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）の上昇が起こる。組換えアネキシンＡ６がジストロフィー筋肉において保護するかどうかを判断するために、Ｓｇｃｇ欠損マウスを組換えアネキシンＡ６またはＢＳＡ対照で４８時間全身処理した（図２２Ａ）。次に、マウスを６０分間のトレッドミルランニングに供して、生理学的筋肉損傷およびＣＫ放出を誘発した。組換えアネキシンＡ６は、運動後のＣＫキナーゼの治療前への変化倍率を低下させ、これは、膜再封鎖の改善と一致した（図２２Ａおよび２２Ｂ）。組換えアネキシンＡ６も、Ｓｇｃｇ欠損マウスに２週間にわたって注射した。１ｍｇ／ｋｇの組換えアネキシンＡ６を３日に１回、１４日間注射した（図２２Ｃ）。組換えアネキシンＡ６の投与は、１４日目の対照治療と比較して血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）のレベルを有意に低下させた（図２２Ｄ）。アネキシンＡ６は、損傷後の細胞内Ｃａ2+の減少に関して、アネキシンＡ２よりも効果的であった（図１６Ｄ）。Ｓｇｃｇ欠損マウスで同じ１４日間の投薬レジメンを使用すると、組換えアネキシンＡ６の短期全身投与は、組換えアネキシンＡ２と比較して血清ＣＫレベルを有意に低下させた（図２２Ｅ）。組換えアネキシン処理マウスからの腓腹筋／ヒラメ筋は、質的に低い損傷を示した（図２２Ｆ）。これらのデータによれば、細胞外組換えアネキシンＡ６が、慢性的に損傷を受けたジストロフィーマウスにおけるインビボでの筋肉損傷を防ぎ、修復を増強する。
考察
アネキシンは、カルシウムで満たされたブレブの膜損傷部位での形成を促進する。原形質膜の不安定性は、多くの筋ジストロフィー形態に固有であり、Ｃａ2+恒常性の調節不全および疾患の病因に寄与すると考えられている。Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎらは、ＴＲＰＣ３のトランスジェニック過剰発現が、筋線維へのＣａ2+の流入を増加させ、ジストロフィー様表現型をもたらすのに十分であることを示した（Ｍｉｌｌａｙ ＤＰ，Ｇｏｏｎａｓｅｋｅｒａ ＳＡ，Ｓａｒｇｅｎｔ ＭＡ，Ｍａｉｌｌｅｔ Ｍ，Ａｒｏｎｏｗ ＢＪ，ａｎｄ Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ ＪＤ．Ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎｆｌｕｘ ｉｓ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ＴＲＰＣ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．２００９；１０６（４５）：１９０２３－８）。同様に、ＳＥＲＣＡ１のトランスジェニック過剰発現は、細胞質ゾルのＣａ2+レベルを低下させ、Ｃａ2+が疾患の進行に関与しているジストロフィー筋肉病変を軽減した（Ｇｏｏｎａｓｅｋｅｒａ ＳＡ，Ｌａｍ ＣＫ，Ｍｉｌｌａｙ ＤＰ，Ｓａｒｇｅｎｔ ＭＡ，Ｈａｊｊａｒ ＲＪ，Ｋｒａｎｉａｓ ＥＧ，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ＳＥＲＣＡ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１１；１２１（３）：１０４４－５２）。本明細書に示され、記載されるように、筋線維におけるアネキシンの発現の増加により、筋線維内の損傷に関連するＣａ2+蛍光が減少した。Ｃａ2+関連蛍光のこの減少は損傷部位で生じ、アネキシン修復キャップから放出される細胞外ブレブの形成と相関していた。アネキシンＡ２またはＡ６はいずれも、Ｃａ2+結合タンパク質ＧＣａＭＰ５Ｇを含む膜性ブレブの形成を誘導することができた。さらに、アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６の過剰発現はそれぞれ、損傷後の筋線維内のエンドポイントＣａ2+蛍光蓄積を減少させた。試験した３つのアネキシンのうち、アネキシンＡ６の過剰発現は、損傷に関連するＣａ2+蓄積の減少に最も持続的な効果をもたらし、大きなＧＣａＭＰ５Ｇ含有ブレブの形成を誘導した。ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）により損傷させたＨＥＫ２９３細胞では、細胞外膜状ブレブの存在が、細胞生存の増加および細胞質Ｃａ2+レベルの低下と相関し、このプロセスがアネキシンＡ１によって促進された（Ｂａｂｉｙｃｈｕｋ ＥＢ，Ｍｏｎａｓｔｙｒｓｋａｙａ Ｋ，Ｐｏｔｅｚ Ｓ，ａｎｄ Ｄｒａｅｇｅｒ Ａ．Ｂｌｅｂｂｉｎｇ ｃｏｎｆｅｒｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．２０１１；１８（１）：８０－９）。Ｄａｖｅｎｐｏｒｔらは、損傷したＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞でのアネキシンＡ１－ＧＦＰの過剰発現が、損傷部位に由来するアネキシンＡ１陽性ブレブをもたらすことを示した（Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ＮＲ，Ｓｏｎｎｅｍａｎｎ ＫＪ，Ｅｌｉｃｅｉｒｉ ＫＷ，ａｎｄ Ｂｅｍｅｎｔ ＷＭ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｗｏｕｎｄ ｒｅｐａｉｒ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１６；２７（１４）：２２７２－８５）。しかしながら、アネキシンＡ２またはＡ６の過剰発現の影響はいずれの研究でも評価されていない。これらのデータを組み合わせると、膜修復のメカニズムとしてのブレブ形成は、種および組織の種類を超えて保存されており、アネキシンタンパク質の存在によって促進されることが示唆されている。
理論に拘束されることなく、アネキシンＡ６が、細胞質Ｃａ2+および細胞外ブレブへのタンパク質排出を促進し、その形成が、アネキシンＡ１およびアネキシンＡ２によってさらに誘導されると考えられる。人工膜パッチでは、アネキシンＡ１またはアネキシンＡ２の存在により、膜欠陥部位でのブレブ形成が誘発された（Ｂｏｙｅ ＴＬ，Ｊｅｐｐｅｓｅｎ ＪＣ，Ｍａｅｄａ Ｋ，Ｐｅｚｅｓｈｋｉａｎ Ｗ，Ｓｏｌｏｖｙｅｖａ Ｖ，Ｎｙｌａｎｄｓｔｅｄ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎｓ ｉｎｄｕｃｅ ｃｕｒｖａｔｕｒｅ ｏｎ ｆｒｅｅ－ｅｄｇｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１８；８（１）：１０３０９）。対照的に、アネキシンＡ６の存在は、人工膜の大きなひだへのＣａ2+依存性収縮を誘発した（Ｂｏｙｅ ＴＬ，Ｊｅｐｐｅｓｅｎ ＪＣ，Ｍａｅｄａ Ｋ，Ｐｅｚｅｓｈｋｉａｎ Ｗ，Ｓｏｌｏｖｙｅｖａ Ｖ，Ｎｙｌａｎｄｓｔｅｄ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎｓ ｉｎｄｕｃｅ ｃｕｒｖａｔｕｒｅ ｏｎ ｆｒｅｅ－ｅｄｇｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１８；８（１）：１０３０９）。生きた筋線維のブレブまたは人工膜のひだを誘発するアネキシンＡ６の差異は、人工膜研究における単一の組換えアネキシンタンパク質への曝露と比較して、単離された筋線維における内因的に発現されたアネキシンＡ１およびＡ２の存在を反映している可能性がある。理論に拘束されることなく、高分子修復複合体内で、複数のアネキシンが、創傷閉鎖、損傷した膜の切除、および損傷部位でのＣａ2+の減少を促進する大きな膜病変を除去するように作用する、ブレブ形成に積極的に関与すると企図される。
アネキシンＡ６は、筋膜損傷から保護し、膜の修復を増強する。アネキシンＡ１、Ａ２、およびＡ６を含めたアネキシンタンパク質が、膜損傷部位に局在し、膜修復キャップおよびブレブ形成を促進することを示した。アネキシンＡ６の変異は、修復キャップの形成を妨げ、修復能力を低下させ、色素の取り込みを増加させた。一方、組換えアネキシンＡ６による前処理は、インビボでのレーザー誘発筋肉損傷後および毒素誘発筋肉損傷後の色素取り込みを減少させた。治療ツールとして、細胞膜を安定化することによって損傷を修復および／または低減する細胞の能力を強化することは、いずれも、細胞の生存を改善することにつながる可能性のある有益な手段である。以前の研究では、アネキシンＡ６が慢性筋ジストロフィーのモデルからの筋肉で上方調節されていることが示されている（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，Ａｌｌｅｎ ＭＶ，Ｗａｒｎｅｒ ＪＬ，Ｂａｒｅｆｉｅｌｄ ＤＹ，Ｋｒｉｓｈｎａｎ Ｓ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＥ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｆｒｏｍ Ｌｏｓｓ ｏｆ Ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ Ｉｓ Ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｂｙ Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ６ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ Ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０１６；１８６（６）：１６１０－２２、Ｓｗａｇｇａｒｔ ＫＡ，Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，Ｖｏ ＡＨ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＥ，Ｋｉｍ ＥＹ，Ｆａｈｒｅｎｂａｃｈ ＪＰ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ６ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｂｙ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ ｒｅｐａｉｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．２０１４；１１１（１６）：６００４－９、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，Ｒｏｓｓｉ ＡＥ，Ａｌｖａｒｅｚ ＭＧ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＥ，Ｄｅｖｅａｕｘ ＨＫ，Ｅａｒｌｅｙ ＪＵ，ｅｔ ａｌ．Ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ ａｎｄ ｍｙｏｆｅｒｌｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｔｕｂｕｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０１４；１８４（１）：２４８－５９）。ｍｄｘマウス筋肉のプロテオミクスプロファイリングは、アネキシンＡ１およびＡ２がｍｄｘ筋膜中に豊富に存在することを示し、これは損傷した筋細胞の膜でのアネキシンの役割と一致している（Ｍｕｒｐｈｙ Ｓ，Ｚｗｅｙｅｒ Ｍ，Ｈｅｎｒｙ Ｍ，Ｍｅｌｅａｄｙ Ｐ，Ｍｕｎｄｅｇａｒ ＲＲ，Ｓｗａｎｄｕｌｌａ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｄｘ－４ｃｖ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１８）。アネキシンは、膜破壊中に露出するホスファチジルセリンを含む膜リン脂質に結合する。損傷後のホスファチジルセリンの再配列は、細胞外アネキシンに最適な結合標的を提供して、膜損傷部位および膜欠陥部位での膜の折り畳み、ブレブ形成、およびローリングを促進する（Ｂｏｙｅ ＴＬ，Ｊｅｐｐｅｓｅｎ ＪＣ，Ｍａｅｄａ Ｋ，Ｐｅｚｅｓｈｋｉａｎ Ｗ，Ｓｏｌｏｖｙｅｖａ Ｖ，Ｎｙｌａｎｄｓｔｅｄ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎｓ ｉｎｄｕｃｅ ｃｕｒｖａｔｕｒｅ ｏｎ ｆｒｅｅ－ｅｄｇｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１８；８（１）：１０３０９）。アネキシンの上方調節は、慢性的な損傷を受けている線維における欠陥膜の切除を容易にする代償メカニズムであると企図されている。
心筋損傷のさらなる研究により、修復応答の調節におけるアネキシンタンパク質の役割がさらに示唆される。組換えアネキシンＡ１またはＮ末端アネキシンＡ１ペプチド（ＡＣ２－２６）の投与は、心筋虚血再灌流誘発損傷のラットモデルにおいて心臓保護応答を誘発した（Ｌａ Ｍ，Ｄ’Ａｍｉｃｏ Ｍ，Ｂａｎｄｉｅｒａ Ｓ，Ｄｉ Ｆｉｌｉｐｐｏ Ｃ，Ｏｌｉａｎｉ ＳＭ，Ｇａｖｉｎｓ ＦＮ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎ １ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００１；１５（１２）：２２４７－５６）。Ｍｅｎｇらは、アネキシンＡ３の下方調節により、心臓が保護され、ＡＫＴシグナル伝達の活性化を通じてラット心筋梗塞サイズが減少することを実証した（Ｍｅｎｇ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ａｎ ＳＴ，ａｎｄ Ｃｈｅｎ Ｙ．Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ３ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌ ｒｅｐａｉｒ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１９；２３４（７）：１０５３５－４６）。膜の再編成に加えて、アネキシンは、損傷からの修復を調整するために重要な複数の下流の細胞内シグナル伝達カスケードを調節する足場として機能する。アネキシンタンパク質の治療可能性を評価する際には、アネキシンタンパク質の細胞内機能および細胞外機能の両方を考慮する必要がある。
本明細書に提示された研究は、ヒト組換えアネキシンＡ６タンパク質が、急性筋肉損傷から保護するための適切な生物学的製剤であることを示している。本明細書では、ヒト組換えアネキシンＡ６が、マウスモデルにおいて損傷膜を再封鎖することができ、マウス前臨床モデルにおけるヒト組換えタンパク質の機能的活性を確認したことが示されている。ヒトとマウスのアネキシンＡ６タンパク質はアミノ酸レベルで９４．３５％同一であり、ヒトとラット（９４．６５％）、イヌ（９５．５４％）、およびサル（９８．９６％）のアミノ酸保存率は増加しており、この高い類似性は、マウスモデルで有効性を有するヒト組換えタンパク質と一致する（図２１）。現在の研究は利用可能な組換えタンパク質によって制限されており、組換えアネキシンＡ６が膜修復を促進し、筋肉疾患の慢性モデルおよび骨格筋を超えた組織における損傷に対する感受性を長期的に低下させることができるかどうかを判断するには、さらなる研究が必要である。アネキシンＡ６は、筋ジストロフィーのマウスモデルにおいて筋膜漏出の遺伝的修飾因子として最初に同定され、その後、アネキシンＡ６は、健康なマウス筋肉における損傷応答を修飾することが示された（Ｓｗａｇｇａｒｔ ＫＡ，Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，Ｖｏ ＡＨ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＥ，Ｋｉｍ ＥＹ，Ｆａｈｒｅｎｂａｃｈ ＪＰ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ６ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｂｙ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ ｒｅｐａｉｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．２０１４；１１１（１６）：６００４－９）。本明細書では、組換えアネキシンＡ６タンパク質の投与による修復の増強が、ジストロフィー筋肉において同様の保護を提供するが、長期間の断続的な投薬を必要とすることが企図されている。将来の研究では、十分な量の精製タンパク質を生成するために、哺乳動物の組換えアネキシンＡ６タンパク質の産生を最適化する必要がある。
膜修復を改善するための組み合わせアプローチ。本明細書では、組換えアネキシンＡ６と、正常な筋肉およびジストロフィー筋肉をレーザー誘発膜損傷から保護するその能力について説明し、それを示す。さらに、組換えアネキシンＡ６の筋肉内投与と全身投与の両方が、インビボでの毒素誘発筋膜損傷から保護した。グルココルチコイド投与が筋肉におけるアネキシン発現を増加させることが以前に発見され、これは、ｍｄｘ（ＤＭＤ）、ジスフェリン欠損（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ）、およびγ－サルコグリカン欠損（肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ）マウスを含む筋ジストロフィーの複数のマウスモデルにおける強化された筋肉修復と相関した（Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ Ｍ，Ｂａｒｅｆｉｅｌｄ ＤＹ，Ｗａｒｎｅｒ ＪＬ，Ｖｏ ＡＨ，Ｈａｄｈａｚｙ Ｍ，Ｅａｒｌｅｙ ＪＵ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｓｔｅｒｏｉｄ ｄｏｓｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｒｅｐａｉｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｌｉｃｉｔｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ ａｔｒｏｐｈｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１７；１２７（６）：２４１８－３２、Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ Ｍ，Ｓａｌａｍｏｎｅ ＩＭ，Ｐａｇｅ ＰＧ，Ｗａｒｎｅｒ ＪＬ，Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ ＥＭ．Ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ Ｄｏｓｉｎｇ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｍｕｓｃｌｅ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ Ｌｉｍｂ－Ｇｉｒｄｌｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０１７；１８７（１１）：２５２０－３５）。グルココルチコイド治療はまた、膜損傷部位に局在し、細胞の創傷治癒を改善するための「分子バンドエイド」と見なされる修復タンパク質であるミツグミン５３（ＭＧ５３として知られる）をコードするＴｒｉｍ７２遺伝子の発現を増加させた。アネキシンと同様に、ＭＧ５３は、慢性的な筋肉損傷で上方調節され、ジストロフィー筋肉、および心臓、肺、腎臓などの他の組織の修復を増強する（Ｗａｄｄｅｌｌ ＬＢ Ｌｅｍｃｋｅｒｔ ＦＡ，Ｚｈｅｎｇ ＸＦ，Ｔｒａｎ Ｊ，Ｅｖｅｓｓｏｎ ＦＪ，Ｈａｗｋｅｓ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ，ａｎｎｅｘｉｎ Ａ１，ａｎｄ ｍｉｔｓｕｇｕｍｉｎ ５３ ａｒｅ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚｅ ｔｏ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｔｕｂｕｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ－ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｓｔｒｅｔｃｈ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１１；７０（４）：３０２－１３、Ｄｕａｎｎ Ｐ，Ｌｉ Ｈ，Ｌｉｎ Ｐ，Ｔａｎ Ｔ，Ｗａｎｇ Ｚ，Ｃｈｅｎ Ｋ，ｅｔ ａｌ．ＭＧ５３－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１５；７（２７９）：２７９ｒａ３６、Ｈｅ Ｂ，Ｔａｎｇ ＲＨ，Ｗｅｉｓｌｅｄｅｒ Ｎ，Ｘｉａｏ Ｂ，Ｙｕａｎ Ｚ，Ｃａｉ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｂｙ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＭＧ５３ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ｉｎ ｄｅｌｔａ－Ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｈａｍｓｔｅｒｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１２；２０（４）：７２７－３５、Ｊｉａ Ｙ，Ｃｈｅｎ Ｋ，Ｌｉｎ Ｐ，Ｌｉｅｂｅｒ Ｇ，Ｎｉｓｈｉ Ｍ，Ｙａｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＭＧ５３－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４；５：４３８７、Ｌｉｕ Ｊ，Ｚｈｕ Ｈ，Ｚｈｅｎｇ Ｙ，Ｘｕ Ｚ，Ｌｉ Ｌ，Ｔａｎ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＭＧ５３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ａ ｐｏｒｃｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉａ ａｎｄ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ．２０１５；８０：１０－９、Ｗｅｉｓｌｅｄｅｒ Ｎ，Ｔａｋｉｚａｗａ Ｎ，Ｌｉｎ Ｐ，Ｗａｎｇ Ｘ，Ｃａｏ Ｃ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＭＧ５３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２；４（１３９）：１３９ｒａ８５）。ＭＧ５３は、アネキシン媒介型修復複合体の成分であり、アネキシン修復キャップに隣接して局在している（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ＡＲ，Ｑｕａｔｔｒｏｃｅｌｌｉ Ｍ，Ｂａｒｅｆｉｅｌｄ ＤＹ，Ａｌｌｅｎ ＭＶ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＥ，ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ ＥＭ．Ａｎ ａｃｔｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｎｅｘｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１６；２１３（６）：７０５－１８）。
実施例４
内因性アネキシンＡ６、心臓におけるアネキシンＡ６、および筋ジストロフィーの追加モデルにおけるアネキシンＡ６の役割を評価するために、さらなる実験を設計して実施した。
方法
動物。遺伝的にコードされたアネキシンＡ６ＧＦＰマウスを生成し、１２９Ｔ２／ＳｖＥｍｓＪバックグラウンドに戻し交配させた。１２９Ｔ２／ＳｖＥｍｓＪバックグラウンドのジスフェリン欠損マウスは以前に作製された（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．ＨＭＧ ２０１１）。Ｓｇｃｇ欠損マウスを、（Ｈａｃｋ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ １９９９）に記載されているように生成した。マウスを、特定病原体除去施設において１２時間の明暗サイクルで飼育・収容し、ノースウェスタン大学の動物実験委員会の規則に従って自由に餌を与えた。１２９Ｔ２／ＳｖＥｍｓＪ（１２９Ｔ２）マウスは、もともとＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州ベンハーバー、ストック番号００２０６５）から購入した。すべての実験には、生後２～３か月のオスおよびメスを使用した。すべての動物実験は、ノースウェスタン大学の動物実験委員会の規則に従って承認された。
ゲノム構造の概略図。アネキシンＡ６ゲノム構造を、ＵＣＳＣゲノムブラウザーを使用して視覚化した。
筋線維の単離。短趾屈筋（ＦＤＢ）線維を、以前に（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ａｎｄ ＭｃＮａｌｌｙ，２０１５、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ、ＤｉＦｒａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．，２００９）で説明されている方法で単離した。簡単に説明すると、０．２％ＢＳＡ＋コラゲナーゼＩＩ型（カタログ番号１７１０１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）中で、１０％ＣＯ2中３７度で６０分間、線維を解離させた。次に、線維をリンゲル液に移し、ＭａｔＴｅｋ共焦点顕微鏡皿（カタログ番号Ｐ３５Ｇ－１．５－１４－Ｃ、ＭａｔＴｅｋ、マサチューセッツ州アッシュランド）に配置した。
免疫蛍光顕微鏡検査法。Ｃ末端ＨＩＳタグ（Ｒ＆Ｄ）を有する組換えアネキシンＡ６をマウスに全身注射した。筋肉を採取し、瞬間冷凍した。凍結包埋した筋肉の中心からの筋肉切片（厚さ１０μｍ）を、免疫染色のためにクリオスタット（チャンバー：－２０℃、サンプル：－１５℃、カタログ番号ＣＭ１９５０、Ｌｅｉｃａ、ドイツ、ヴェッツラー）上で収集した。組織を４％パラホルムアルデヒドで氷上に１０分間固定した。ブロックおよび透過処理は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（カタログ番号Ｘ－１００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０％ウシ胎児血清、およびＰＢＳを使用して６０分間行った。ラミニン検出には、抗ラミニン抗体を１：１００の希釈率で使用し、ＨＩＳ検出には、抗ＨＩＳ抗体を１：１００で４℃で一晩使用した。ヘキスト標識核。切片をＰＢＳでリンスし、二次抗体と１時間インキュベートし、ＰＢＳでリンスし、マウントした。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ａ１顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ、オーバーコッヘン）を使用してイメージングを実行した。
心筋細胞の単離。犠牲にする２０分前に、マウスを５０Ｕのヘパリンで腹腔内処理した。１００％酸素と混合した５％気化イソフルラン下でマウスに麻酔した。開胸術を行い、心臓および肺を迅速に切除して、カルシウムを含まない氷冷Ｔｙｒｏｄｅ溶液（１４３ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１６ｍＭのＭｇＣｌ2、１１ｍＭのグルコース、２５ｍＭのＮａＨＣＯ3、ｐＨを７．４に調整）に浸漬した。上行大動脈を周囲組織から切断し、動物用給餌針（７９００、Ｃａｄｅｎｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、バージニア州スタントン）でカニューレ挿入し、６－０絹縫合糸で固定した。最初に１ｍｌの氷冷カルシウムを含まないＴｙｒｏｄｅ溶液で心臓を灌流した後、Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ装置（Ｒａｄｎｏｔｉ、カリフォルニア州コビーナ）に移した。心臓を、一定の圧力（緩衝液容器とカニューレ先端の垂直距離：６５ｃｍ）を使用して３７℃のカルシウムを含まないＴｙｒｏｄｅ溶液で１～２分間灌流した後、消化液（０．１５％のコラゲナーゼ２型［Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、ニュージャージー州レイクウッド］、０．１％の２，３－ブタンジオンモノオキシム、０．１％のグルコース、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１１２ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、０．６ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、４０μＭのＣａＣｌ2、０．６ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１．２ｍＭのＭｇＳＯ4、３０μＭのフェノール、２１．４ｍＭのＮａＨＣＯ3、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および３０ｍＭのタウリン、ｐＨを７．４に調整）で５．５分間灌流した。カニューレから心臓を取り出し、トランスファーピペットで粉砕し、１００μｍセルストレーナーでろ過した。心筋細胞を重力により７分間ペレット化させ、続いて消化培地を吸引し、停止緩衝液（コラゲナーゼを含まず、１％ウシ血清アルブミンを含むことを除いて消化液と同じように処方）で洗浄した。細胞を再び重力ペレット化させた後、ウシ血清アルブミンを含まない停止緩衝液で洗浄した。０．３ｍＭのＣａＣｌ2を含むＴｙｒｏｄｅ緩衝液を滴下することによって、心筋細胞をカルシウム耐性にした。細胞培養皿を２０μｇ／ｍｌのラミニン（２３０１７－０１５、Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）で室温で１時間コーティングした。ラミニン溶液を吸引した後、心筋細胞を１時間播種して、実験前に細胞を接着させた。
多光子レーザー損傷およびイメージング。単離した線維を、Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ－ＭＰ多光子顕微鏡を使用して室温でレーザー誘発損傷に供した。イメージングは、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲイメージングソフトウェアによって指示された２５ｘ１．１ＮＡの対物レンズを使用して実行した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびＦＭ４－６４を、９２０ｎｍの波長のレーザーを使用して励起し、５７５ｎｍおよび６２９ｎｍの発光波長をそれぞれ収集した。単離した筋線維にレーザー損傷を誘発するために、１０～１５％のレーザー出力で１秒間９２０ｎｍの波長のレーザーを使用して、筋線維の側膜に回折限界スポット（直径約４１０ｎｍ）を作製した。タイムラプス画像を次のように収集した。損傷前に１枚、損傷時に１枚、その後８秒ごとに８０秒間（１０枚）、３０秒ごとに５分間（１０枚）収集した。一連のタイムラプス画像の最後に、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲイメージングソフトウェアによって指示された筋線維の損傷部位から２５０ｎｍ間隔でｚスタック画像を収集した。蛍光強度とキャップ面積を、フィジー（ＮＩＨ）を使用して測定した。
組換えタンパク質研究のために、筋線維を上記のようにマウスから単離した。筋線維を、１ｍＭのＣａ2+リンゲルまたはＢＳＡ対照中の１０～４０μｇ／ｍｌ組換えアネキシンＡ６（５１８６－Ａ６－０５０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）においてインキュベートした。キャップサイズは、ＦＩＪＩで取得した画像から評価した。ＦＭ４－６４（２．５μｍ）を、イメージングの直前に筋線維に添加した。上記のように画像を取得し、定量化した。エンドポイントでのＦＭ４－６４蛍光を、ＦＩＪＩを使用して測定した。
プレドニゾン研究のために、プレドニゾン（カタログＰ６２５４）をＤＭＳＯ（カタログＤ２６５０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に５ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。投薬は、３０μｌの総ＰＢＳ中の前処理重量（１ｍｇ／ｋｇ体重）に基づいていた。イメージングの前日の午前７時にマウスに注射した。注射日に、－２０℃で保存されたストック溶液を、滅菌ＰＢＳ（カタログ１４１９０、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む滅菌Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内に希釈した。滅菌ＢＤ Ｍｉｃｒｏ－Ｆｉｎｅ ＩＶ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｓｙｒｉｎｇｅ（カタログ１４－８２９－１Ａ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、鎮静化していない動物のＩＰ腔に注射した。注射の２４時間後に筋線維を採取し、同日に画像化した。
統計的分析。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して実行した。比較はＡＮＯＶＡ（１変数の場合には、一元ＡＮＯＶＡ）に依拠した。それ以外の場合は、対応のない両側ｔ検定を実行した。０．０５以下のＰ値は有意であると見なした。データは、単一の値が適切であるとして提示した。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
実験結果を図２４～２８に示す。
グルココルチコイドステロイドは、内因性アネキシンＡ６ＧＦＰの局在を調節し、損傷から保護する。遺伝子編集を使用して、マウスにおけるＡｎｘａ６遺伝子座のカルボキシル末端にＧＦＰタグを導入し、Ａｎｘａ６em1(GFP)マウスを作製した。これらのマウスは、Ａｎｘａ６プロモーターおよび調節配列の制御下でゲノム的にコードされたアネキシンＡ６を調べるという利点を提供する。Ａｎｘａ６em1(GFP)マウスはＡｎｘａ６遺伝子の制御下でアネキシンＡ６タンパク質を発現するため、発現レベルは、プラスミドにコードされたアネキシンＡ６－ＧＦＰよりも正常時には低レベルである。この動物モデルでは、さまざまなアネキシンＡ６タンパク質の発現をリアルタイムで調べることができる。プレドニゾンを含むグルココルチコイドステロイドは、アネキシンＡ１およびＡ６の発現を上方調節することが示されている。さらに、プレドニゾン投与は膜損傷から保護し、レーザー損傷後のプラスミド過剰発現アネキシンＧＦＰキャップ形成を減少させた。プレドニゾンがゲノム的にコードされたアネキシンＡ６ＧＦＰキャップ動態を調節したかどうかを判断するために、Ａｎｘａ６em1(GFP)マウスに１ｍｇ／ｋｇのプレドニゾンまたは対照ＤＭＳＯを腹腔内注射した。注射の２４時間後、筋線維を単離し、レーザー損傷に供した。アネキシンＡ６ＧＦＰキャップサイズは、対照と比較してプレドニゾンで処理した筋線維で減少し（図２４）、これは、ステロイド投与に対するアネキシンＡ６ＧＦＰタンパク質の応答性を示している。これにより、損傷に対する保護を引き出すために内因性アネキシンＡ６発現を調節する外部薬剤の可能性を示した。
組換えアネキシンＡ６は、骨格筋修復を促進する。組換えアネキシンＡ６は、健康な筋線維およびジストロフィー筋線維におけるＦＭ色素の取り込みを減少させることにより、レーザー誘発損傷から保護することが示された。組換えアネキシンＡ６が保護を与えるメカニズムをさらに解明するために、Ａｎｘａ６em1(GFP)筋線維を組換えアネキシンＡ６タンパク質または対照で前処理した。続いて、筋線維をＦＭ４－６４色素中でインキュベートし、レーザー損傷に供した。組換えアネキシンＡ６で前処理した筋線維は、対照筋線維と比較して、アネキシンＡ６ＧＦＰ修復キャップが小さく、同時にＦＭ色素の取り込みが減少した（図２５）。これらのデータは、組換えアネキシンＡ６が内因性修復複合体の調整に関与し、膜の保護および修復を増強し、膜漏出を減らすことを示している。
アネキシンＡ６ＧＦＰは心臓で発現し、損傷した心筋細胞において修復キャップを形成する。アネキシンＡ６は心臓における膜漏出の修飾因子として同定されたが、心筋細胞の修復を評価する方法は以前にはなかった。内因性アネキシンＡ６ＧＦＰが心臓で発現した場合、この新たなＡｎｘａ６em1(GFP)マウスモデルを内因性心筋細胞膜修復を評価するためのツールとして使用できるとの仮説が立てられた。内因性アネキシンＡ６ＧＦＰが骨格筋を超えた組織の膜修復に役割を果たしているかどうかを判断するために、Ａｎｘａ６em1(GFP)心筋細胞を単離し、レーザー損傷に供した。内因性アネキシンＡ６ＧＦＰは、骨格筋線維と同様に、生きた単離心筋細胞に筋節パターンで局在していた（図２６）。レーザー誘発損傷から数秒以内に、アネキシンＡ６ＧＦＰは膜病変に局在し、心筋細胞の修復キャップに組織化した（図２６、白い矢印）。明るいアネキシンＡ６ＧＦＰ修復キャップを描いた白い点線で囲った部分の拡大画像が右側の画像に示されている（図２６）。単離された心筋細胞における修復キャップ（矢印）へのアネキシンＡ６ＧＦＰ局在の進行を示すタイムラプス画像が、損傷後５０秒まで示されている（図２６）。これらのデータは、内因性アネキシンＡ６ＧＦＰが膜損傷部位に局在し、生きた成体心筋細胞の膜病変に修復キャップを形成することを示し、これは、膜修復におけるアネキシンＡ６の幅広い役割を示唆している。
アネキシンＡ６は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ（ＬＧＭＤ２Ｂ）のモデルにおいて修復を増強する。ジスフェリンは、膜修復に関与するＣａ２＋結合膜関連タンパク質である。機能喪失型変異は、ジスフェリンが膜修復能力を低下させ、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ（ＬＧＭＤ２Ｂ）を引き起こす。修復を増強するか、または損傷の感受性を低下させる薬剤は、ＬＧＭＤ２Ｂの治療に治療上の利益をもたらす可能性があるとの仮説が立てられた。この仮説を試験するために、１２９バックグラウンド（Ｄｙｓｆ１２９）にジスフェリンを欠くマウスに、アネキシンＡ６プラスミドをエレクトロポレーションし、ＦＭ４－６４の存在下でレーザー損傷を与えた。アネキシンＡ６を過剰発現する筋線維は、損傷後のＦＭ４－６４色素の取り込みが大幅に減少した（図２７Ａ）。プラスミドの過剰発現はジスフェリン欠損筋線維を損傷から保護したので、次に、組換えアネキシンＡ６の有効性を試験した。組換えアネキシンＡ６が、ジストロフィーのジスフェリン欠損筋肉において膜損傷から保護できるかどうかを判断するために、Ｄｙｓｆ１２９マウスからの筋線維を単離し、組換えアネキシンＡ６またはビヒクル対照とインキュベートした。損傷の程度を視覚化するために、ＦＭ４－６４の存在下でレーザー損傷を実施した。細胞外組換えアネキシンＡ６による処理は、ビヒクル対照で処理した筋線維と比較してＦＭ４－６４蛍光領域を減少させた（図２７Ｂ）。これらのデータは、アネキシンＡ６が修復を増強し、ジストロフィーＬＧＭＤ２Ｂ筋線維の損傷から保護することを示している。
組換えアネキシンＡ６は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ（ＬＧＭＤ２Ｃ）モデルの筋鞘に局在する。組換えアネキシンＡ６は、膜損傷から保護するため、全身投与された組換えアネキシンＡ６の局在能力を、野生型対照と比較してＬＧＭＤ２ＣのＳｇｃｇ欠損マウスモデルで評価した。Ｓｇｃｇ欠損マウスは、膜の安定性および機能に必要なジストロフィン糖タンパク質複合体の内在性膜成分であるγ－サルコグリカンを欠いている。慢性的に損傷したＳｇｃｇ欠損マウスの筋膜に局在する組換えアネキシンＡ６は、抗ラミニン膜染色と共局在する強力な抗ＨＩＳ免疫蛍光シグナルによって視覚化される（図２８）。比較すると、最小の筋鞘抗ＨＩＳ蛍光は、無傷の野生型筋膜に存在していた（図２８）。これらのデータは、組換えアネキシンＡ６が慢性的に損傷した筋肉の膜に局在することを示していた。
実施例５
本実施例では、哺乳動物細胞と原核細胞の両方においてプラスミドから発現した組換えアネキシンＡ６タンパク質（ｒＡＮＸＡ６）の産生について詳しく説明する。
哺乳動物細胞におけるｒＡＮＸＡ６タンパク質の産生
ｒＡＮＸＡ６タンパク質の産生は、２つの哺乳動物細胞株（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）ＣｅｌｌｓおよびＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ－Ｓ Ｃｅｌｌｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して総容量４リットルで実施した。推定収量（クーマシー染色（図２９）で測定）は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞から１５ｍｇ／Ｌ、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ－Ｓ細胞から２．３ｍｇ／Ｌであった。組換えタンパク質は、アネキシンＡ６を検出するためのイムノブロット分析、および組換えによって産生されたｒＡＮＸＡ６タンパク質上に見られるＣ末端ＨＩＳタグを検出するための抗ＨＩＳ抗体によっても評価した（図２９）。
緩衝液および固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）プロトコルを以下の表１に示す。
Figure 2022514778000001
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞からのアネキシン６（ＡＮＸＡ６）の精製。タンパク質溶解物をＩＭＡＣカラムにロードし、５００ｍＭイミダゾールで溶出した。この段階での収量は約２７０ｍｇであると測定された。関連する画分をプールしてイオン交換Ｑ（ＩＥｘＱ）カラムにロードし、示された画分をプールした。この段階での収量は約２０８ｍｇであった。これらのプールを、１ＸＰＢＳのＳ２００ ２６／６０カラムにロードした。最終収量は約７７ｍｇであった。組換えタンパク質の純度は９５％を超えると測定された。
絶対サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）は、タンパク質が単量体状態にあることを示し、質量分析（ＭＳ）は複数の修飾を示した。
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ－Ｓ細胞からのアネキシン６（ＡＮＸＡ６）の精製。タンパク質溶解物をＩＭＡＣカラムにロードし、５００ｍＭイミダゾールで溶出した。この時点での収量は約７８ｍｇであった。関連する画分をプールしてイオン交換Ｑ（ＩＥｘＱ）カラムにロードし、示された画分を２つの別々のプールにまとめた。この段階での収量は約２４ｍｇ（各プールで約１２ｍｇ）であった。これらのプールをＳ２００ ２６／６０カラム上で試験した（ｒｕｎ）（Ｐｏｏｌ１およびＰｏｏｌ２に対してＳＥＣを実行）。最終収量は、Ｐｏｏｌ１＝２．２５ｍｇおよびＰｏｏｌ２＝１．９ｍｇであると測定された。
絶対サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）およびＭＳでは、Ｐｏｏｌ１とＰｏｏｌ２の間に差異はなく、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞およびＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ－Ｓ細胞において発現した組換えタンパク質間にも差異は検出されなかった。
原核細胞中でのｒＡＮＸＡ６タンパク質の産生
ｒＡＮＸＡ６タンパク質も原核細胞から精製した。ｒＡＮＸＡ６タンパク質の産生は、ＴＢ培地中のＥ ｃｏｌｉ細胞（Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）コンピテントセル）において４リットルの低エンドトキシン精製法で実施した。細胞を３０Ｃで４時間および１８時間増殖させた。イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）インデューサーを０．４ｍＭで使用した。使用したさまざまな緩衝液の組成を表２に示す。この方法を使用して得られた総収量は３０８ｍｇ（約２．５ｍｇ／ｍＬ）であった。
Figure 2022514778000002
図３０に示すように、組換えタンパク質を、クーマシー染色およびイムノブロット分析によって分析した。
Ｅ ｃｏｌｉ細胞からのアネキシン６（ＡＮＸＡ６）の精製。タンパク質溶解物をＩＭＡＣカラムにロードし、５００ｍＭイミダゾールで溶出した。この段階での収量は約５４６ｍｇであると測定された。関連する画分をプールしてイオン交換Ｑ（ＩＥｘＱ）カラムにロードし、示された画分をプールした。この段階での収量は約４０８ｍｇであった。これらのプールを、１ＸＰＢＳのＳ２００ ２６／６０カラムにロードした。３回の試験後、最終収量は約３０６ｍｇであった。最終的なエンドトキシンレベルは約４ＥＵ／ｍｇ／１０．５ＥＵ／ｍＬであった。組換えタンパク質の純度は９５％を超えると測定された。
絶対サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）は、タンパク質が単量体状態にあることを示し、質量分析（ＭＳ）は複数の修飾を示した。
実施例６
本実施例では、哺乳動物細胞で産生されたｒＡＮＸＡ６と原核細胞で産生されたｒＡＮＸＡ６の機能を比較する実験について詳しく説明する。これらの実験は、アネキシンタンパク質（この場合はｒＡＮＸＡ６）の活性が、哺乳動物細胞で産生されるか、原核細胞で産生されるかに基づいて異なるかどうかを試験するために実施した。アネキシンＡ６の予測される翻訳後修飾シグネチャは、ＰＴＭｃｏｄｅ（ｈｔｔｐ：／／ｐｔｍｃｏｄｅ．ｅｍｂｌ．ｄｅ）を使用して決定され、表３に示されている。質量分析（ＭＳ）によって同定されたさまざまな形態の翻訳後修飾（ＰＴＭ）（例、アセチル化、ニトロシル化、リン酸化）を表３に示す。
Figure 2022514778000003
Figure 2022514778000004
Figure 2022514778000005
Figure 2022514778000006
Figure 2022514778000007
表３に示すように、アネキシンＡ６の翻訳後修飾シグネチャは、タンパク質が原核細胞において発現するか哺乳動物細胞において発現するかによって異なる。したがって、変更された翻訳後修飾シグネチャは、原核細胞で産生されたアネキシンＡ６タンパク質と哺乳動物細胞で産生されたアネキシンＡ６タンパク質との間の活性の変化をもたらすことが予想される。しかしながら、予期せぬことに、原核細胞で産生されたアネキシンＡ６タンパク質が、以下に説明する筋線維損傷実験で哺乳動物細胞において産生されたタンパク質と同様に機能することが判明した。
筋線維の単離、レーザー損傷、および色素測定。組換え筋線維研究のために、筋線維を野生型マウスから単離した。１３μｇ／ｍｌまたは１３０μｇ／ｍｌのヒト組換えアネキシン、Ｅ ｃｏｌｉ、またはＨＥＫ細胞が産生されたリンゲル培地において、筋線維をインキュベートした。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を陰性対照として使用した。ＦＭ４－６４（２．５μｍ）を、イメージングの直前に筋線維に添加した。Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ－ＭＰ多光子顕微鏡を使用して、線維を室温でレーザー誘発損傷に供した。イメージングは、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲイメージングソフトウェアによって指示された２５ｘ１．１ＮＡの対物レンズを使用して実行した。ＦＭ４－６４を、９２０ｎｍの波長のレーザーを使用して励起し、５７５ｎｍおよび６２９ｎｍの発光波長をそれぞれ収集した。単離した筋線維にレーザー損傷を誘発するために、１０～１５％のレーザー出力で１秒間９２０ｎｍの波長のレーザーを使用して、筋線維の側膜に回折限界スポット（直径約４１０ｎｍ）を作製した。ＦＭ４－６４領域は、Ｚスタックの中央近くの単一スライスからＦＩＪＩを使用して測定した。筋線維の品質管理は、無傷の筋節構造を有する付着性筋線維の使用を含む多くの特性に基づいていた。筋線維は、単離プロトコル中に誘発された裂け目または破裂がないように見えた。損傷のために選択された筋線維の領域は線形であり、核または神経筋接合部に位置していなかった。
統計分析は、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して実行した。比較はＡＮＯＶＡ（１変数の場合には、一元ＡＮＯＶＡ）に依拠した。０．０５以下のＰ値は有意であると見なした。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。結果を図３１に示す。
これらの実験は、Ｅ ｃｏｌｉまたは哺乳動物細胞で産生された細胞外組換えアネキシンＡ６（ｒＡＮＸＡ６）の存在下で損傷を受けた筋線維が、膜修復の増強および損傷に対する保護に同様の有益な効果を有することを実証した。これは、複数の投与量（１３ｍｇ／ｍｌおよび１３０ｍｇ／ｍｌ）にわたって実証されており、ＢＳＡ対照で処理した筋線維と比較したレーザー損傷後のＦＭ４－６４色素取り込みの減少として測定された。
実施例７
本実施例は、膜損傷部位でのアネキシン修復キャップの局在および組織化を促進する上でのアミノ酸配列ＶＡＡＥＩＬ（アネキシンＡ６のエクソン２１）（配列番号４７）の必要性を試験するために設計した。
方法
動物。１２９Ｔ２／ＳｖＥｍｓＪバックグラウンドの野生型マウスを、特定病原体除去施設において１２時間の明暗サイクルで飼育・収容し、ノースウェスタン大学の動物実験委員会の規則に従って自由に餌を与えた。１２９Ｔ２／ＳｖＥｍｓＪ（１２９Ｔ２）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州ベンハーバー、ストック番号００２０６５）から購入した。すべての野生型マウスの実験には、生後２～３か月のオスおよびメスを使用した。
プラスミド。カルボキシル末端ｔｕｒｂｏＧＦＰタグを有するアネキシンＡ６をコードするプラスミドは、Ｏｒｉｇｅｎｅ（メリーランド州ロックビル）から入手した。ＧＦＰタグをｔｄＴｏｍａｔｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ）に置き換えるためのアネキシンＡ６のサブクローニングを、Ｍｕｔａｇｅｎｉｘ（ジョージア州スワニー）によって実行した。部位特異的変異誘発を、アネキシンＡ６－ＧＦＰに対してＭｕｔａｇｅｎｉｘによって実行し、ＶＡＡＥＩＬ（配列番号４７）配列を欠く構築物を生成した。ＱｉａｇｅｎのＥｎｄｏ－Ｆｒｅｅ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ＃１２３６２）を使用してプラスミドＤＮＡを単離した。
エレクトロポレーション、筋線維の単離、レーザー損傷、キャップおよび小胞の測定。インビボでのエレクトロポレーションによって、短趾屈筋（ＦＤＢ）線維に、エンドフリープラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。方法は、Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ ＪｏＶＥ ２０１５において以前に記載された。簡単に説明すると、後肢のフットパッドに１０μｌのヒアルロニダーゼ（８ユニット）（Ｈ４２７２、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を注射した。注射の２時間後、最大２０μｌの２μｇ／μｌのエンドトキシンフリープラスミドをフットパッドに注射した。エレクトロポレーションを、２０パルス、持続時間２０ミリ秒／回、１Ｈｚ、１００Ｖ／ｃｍを適用することによって実施した。損傷した筋肉の検査を回避し、プラスミド発現に十分な時間を与えるために、エレクトロポレーション後、動物を最低７日間、１０日以内の間回復させた。
ＦＤＢ筋肉を除去し、個々の筋線維を単離し、画像化した（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，ＪｏＶＥ，２０１５）。記載されているように（Ｄｅｍｏｎｂｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，ＪｏＶＥ２０１５、Ｓｗａｇｇａｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０１４）、線維を解剖し、レーザー損傷を与えた。簡単に説明すると、１０％のＣＯ2中３７度で断続的に粉砕しつつ、最大９０分間、０．２％ＢＳＡ＋コラゲナーゼＩＩ型（カタログ＃１７１０１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で、線維を解離させた。次に、線維をリンゲル液に移し、ＭａｔＴｅｋ共焦点顕微鏡皿（カタログ番号Ｐ３５Ｇ－１．５－１４－Ｃ、ＭａｔＴｅｋ、マサチューセッツ州アッシュランド）に配置した。１時間後、線維を接着し、リンゲルを１ｍｌの新たなリンゲル液と交換した。イメージングおよびアブレーションは、Ｎｉｋｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲソフトウェアによって駆動される６０×Ａｐｏ ｌａｍｂｄａ １．４ＮＡ対物レンズを介して、ＧａＳＰ検出器を装備したＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒレーザー走査型共焦点で実行した。１２０ｎｍ（０．０１４４μｍ2）として設定された単一画素を、４０５ｎｍのレーザーを１００％の出力で最大５秒間用いてアブレーションした。Ｚスタック投影を、最後のタイムラプスフレーム後、損傷から約４分後、スライス間のステップサイズが０．１２５μＭの連続取得から取得した。ＺスタックのレンダリングはＦＩＪＩにおいて構築された。同様のレベルのタグ付きタンパク質を発現する線維を比較した。
結果
次に、アネキシンＡ６におけるＶＡＡＥＩＬ（配列番号４７）配列の存在が、筋膜損傷時のアネキシンＡ６の局在に影響を及ぼすかどうかを疑問視した。筋線維に、完全長のアネキシンＡ６－ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＶＡＡＥＩＬを欠くＡ６－ＧＦＰ（配列番号４７）をエレクトロポレーションし、その後レーザー損傷を与えた。ＶＡＡＥＩＬ（配列番号４７）配列を含むアネキシンＡ６アイソフォームおよび伴わないアネキシンＡ６アイソフォームが、修復キャップを形成する筋膜損傷部位に局在した（図３２）。ＶＡＡＥＩＬを欠くアネキシンＡ６（配列番号４７）は、完全長のアネキシンＡ６と部分的に共局在し、膜病変でより平坦な修復キャップを形成する。これらのデータは、アミノ酸ＶＡＡＥＩＬの有無にかかわらず、複数のアネキシンＡ６アイソフォームが筋肉損傷応答に関与していることを示している。


追加の参考資料
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Ｌｉ Ｄ，Ｍａｓｔａｇｌｉａ ＦＬ，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ Ｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｔｏｎ ＳＤ．Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｅｘｏｎ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ３９：９８２－９９４，２０１８．
Ｌｉｎｇ，Ｑ．，Ａ．Ｔ．Ｊａｃｏｖｉｎａ，Ａ．Ｄｅｏｒａ，Ｍ．Ｆｅｂｂｒａｉｏ，Ｒ．Ｓｉｍａｎｔｏｖ，Ｒ．Ｌ．Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，Ｗ．Ｈ．Ｍａｒｋ，ａｎｄ Ｋ．Ａ．Ｈａｊｊａｒ．２００４．Ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｆｉｂｒｉｎ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．１１３：３８－４８．
Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｈ．Ｚｈｕ，Ｙ．Ｚｈｅｎｇ，Ｚ．Ｘｕ，Ｌ．Ｌｉ，Ｔ．Ｔａｎ，Ｋ．Ｈ．Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｈｏｕ，Ｃ．Ｚｈａｎｇ，Ｄ．Ｌｉ，Ｒ．Ｌｉ，Ｚ．Ｌｉｕ，Ｎ．Ｗｅｉｓｌｅｄｅｒ，Ｄ．Ｚｈｕ，Ｐ．Ｌｉｎ，ａｎｄ Ｊ．Ｍａ．２０１５．Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＭＧ５３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ａ ｐｏｒｃｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉａ ａｎｄ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ．８０：１０－１９．
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Ｗａｌｌｎｅｒ，Ｂ．Ｐ．，Ｒ．Ｊ．Ｍａｔｔａｌｉａｎｏ，Ｃ．Ｈｅｓｓｉｏｎ，Ｒ．Ｌ．Ｃａｔｅ，Ｒ．Ｔｉｚａｒｄ，Ｌ．Ｋ．Ｓｉｎｃｌａｉｒ，Ｃ．Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｅ．Ｐ．Ｃｈｏｗ，Ｊ．Ｌ．Ｂｒｏｗｉｎｇ，Ｋ．Ｌ．Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，ａｎｄ ｅｔ ａｌ．１９８６．Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｐｏｃｏｒｔｉｎ，ａ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ．３２０：７７－８１．
Ｗｅｉｓｌｅｄｅｒ，Ｎ．，Ｎ．Ｔａｋｉｚａｗａ，Ｐ．Ｌｉｎ，Ｘ．Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｃａｏ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｔ．Ｔａｎ，Ｃ．Ｆｅｒｒａｎｔｅ，Ｈ．Ｚｈｕ，Ｐ．Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｒ．Ｙａｎ，Ｍ．Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｘ．Ｚｈａｏ，Ｍ．Ｈｗａｎｇ，Ｍ．Ｔａｋｅｓｈｉｍａ，Ｃ．Ｃａｉ，Ｈ．Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．Ｔａｋｅｓｈｉｍａ，Ｒ．Ｐ．Ｘｉａｏ，ａｎｄ Ｊ．Ｍａ．２０１２．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＭＧ５３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．４：１３９ｒａ１８５．
Ｙｅｕｎｇ，Ｔ．，Ｂ．Ｈｅｉｔ，Ｊ．Ｆ．Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎ，Ｇ．Ｄ．Ｆａｉｒｎ，Ｂ．Ｃｈｉｕ，Ｒ．Ｉｎｍａｎ，Ａ．Ｋａｐｕｓ，Ｍ．Ｓｗａｎｓｏｎ，ａｎｄ Ｓ．Ｇｒｉｎｓｔｅｉｎ．２００９．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ ｔｏ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｈａｒｇｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｐｈａｇｏｓｏｍｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．１８５：９１７－９２８．
Ｚａｋｓ，Ｗ．Ｊ．，ａｎｄ Ｃ．Ｅ．Ｃｒｅｕｔｚ．１９９１．Ｃａ（２＋）－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｎｅｘｉｎ ｓｅｌｆ－ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｕｒｆａｃｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３０：９６０７－９６１５．
Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｌｏｎｇ Ｃ，Ｂａｓｓｅｌ－Ｄｕｂｙ Ｒ，ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ ＥＮ．Ｍｙｏｅｄｉｔｉｎｇ：Ｔｏｗａｒｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｂｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ ９８：１２０５－１２４０，２０１８．
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Claims (46)

  1. 細胞膜損傷を治療する方法であって、アネキシンタンパク質の活性を増加させる薬剤を含む治療有効量の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
  2. 発症を遅らせる、細胞膜損傷からの回復を増強する、または細胞膜損傷を予防する方法であって、アネキシンタンパク質の活性を増加させる薬剤を含む治療有効量の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
  3. 前記薬剤が、組換えタンパク質、ステロイド、およびアネキシンタンパク質を発現することができるポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記ステロイドが、コルチコステロイドまたはグルココルチコイドである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記組換えタンパク質が、アネキシンタンパク質である、請求項３に記載の方法。
  6. 前記アネキシンタンパク質が、アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記患者が、急性損傷に罹患している、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記急性損傷が、手術、火傷、毒素、化学物質、放射線誘発損傷、急性心筋損傷、急性筋肉損傷、急性肺損傷、急性上皮損傷、急性表皮損傷、急性腎臓損傷、急性肝臓損傷、血管損傷、過度の機械的力（ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆｏｒｃｅ）、または外傷に起因する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記患者が、慢性障害に罹患している、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記慢性障害が、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型（Ｅｍｅｒｙ－Ｄｒｅｉｆｕｓｓ）筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、眼球咽頭型筋ジストロフィー、遠位筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、肺線維症、筋萎縮、脳性麻痺、上皮障害、表皮障害、腎臓障害、肝臓障害、サルコペニア、または心筋症（肥大型、拡張型、先天性、不整脈原性、拘束性、虚血性、心不全）である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記心筋症が、肥大型、拡張型、先天性、不整脈原性、拘束性、虚血性、または心不全である、請求項１０に記載の方法。
  12. 有効量の第２の薬剤を投与することをさらに含み、前記第２の薬剤が、ミツグミン（ｍｉｔｓｕｇｕｍｉｎ）５３（ＭＧ５３）、潜在型ＴＧＦ－β結合タンパク質４（ＬＴＢＰ４）のモジュレーター、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）活性のモジュレーター、アンドロゲン応答のモジュレーター、炎症応答のモジュレーター、筋成長のプロモーター、化学療法剤、線維症のモジュレーター、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記ポリヌクレオチドが、ナノ粒子と結合している、請求項３～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記ポリヌクレオチドが、ベクターに含有される、請求項３～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ベクターが、葉緑体内にある、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記ウイルスベクターが、ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ＡＡＶベクターが、組換えＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ７４である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ＡＡＶ７４ベクターが、ＡＡＶｒｈ７４である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記組成物が、アネキシンＡ１（配列番号１）、アネキシンＡ２（配列番号２もしくは配列番号３）、アネキシンＡ３（配列番号４）、アネキシンＡ４（配列番号５）、アネキシンＡ５（配列番号６）、アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、もしくはそれらの組み合わせ）、アネキシンＡ７（配列番号９もしくは配列番号１０）、アネキシンＡ８（配列番号１１もしくは配列番号１２）、アネキシンＡ９（配列番号１３）、アネキシンＡ１０（配列番号１４）、アネキシンＡ１１（配列番号１５もしくは配列番号１６）、アネキシンＡ１３（配列番号１７もしくは配列番号１８）、またはそれらの組み合わせの前記活性を増加させる、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記組成物が、アネキシンＡ１（配列番号１）、アネキシンＡ２（配列番号２または配列番号３）、およびアネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）の前記活性を増加させる、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記組成物が、アネキシンＡ２（配列番号２または配列番号３）およびアネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）の前記活性を増加させる、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記組成物が、アネキシンＡ１（配列番号１）およびアネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）の前記活性を増加させる、請求項２０に記載の方法。
  24. 前記組成物が、アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）の前記活性を増加させる、請求項２０に記載の方法。
  25. 前記組成物が、請求項２４～４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 修飾アネキシンタンパク質、ならびに薬学的に許容される担体、緩衝液、および／または希釈剤を含む、薬学的組成物。
  27. 前記アネキシンタンパク質が、アネキシンＡ１（配列番号１）、アネキシンＡ２（配列番号２もしくは配列番号３）、アネキシンＡ３（配列番号４）、アネキシンＡ４（配列番号５）、アネキシンＡ５（配列番号６）、アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、もしくはそれらの組み合わせ）、アネキシンＡ７（配列番号９もしくは配列番号１０）、アネキシンＡ８（配列番号１１もしくは配列番号１２）、アネキシンＡ９（配列番号１３）、アネキシンＡ１０（配列番号１４）、アネキシンＡ１１（配列番号１５もしくは配列番号１６）、アネキシンＡ１３（配列番号１７もしくは配列番号１８）、またはそれらの組み合わせである、請求項２６に記載の薬学的組成物。
  28. 前記アネキシンタンパク質が、アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）である、請求項２６または請求項２７に記載の薬学的組成物。
  29. 前記薬学的組成物が、アネキシンＡ１（配列番号１）、アネキシンＡ２（配列番号２または配列番号３）、およびアネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）を含む、請求項２６または請求項２７に記載の薬学的組成物。
  30. 前記薬学的組成物が、アネキシンＡ２（配列番号２または配列番号３）およびアネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）を含む、請求項２６または請求項２７に記載の薬学的組成物。
  31. 前記薬学的組成物が、アネキシンＡ１（配列番号１）およびアネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）を含む、請求項２６または請求項２７に記載の薬学的組成物。
  32. ステロイドをさらに含む、請求項２６～３１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  33. 前記ステロイドが、コルチコステロイドまたはグルココルチコイドである、請求項３２に記載の薬学的組成物。
  34. 有効量の第２の薬剤をさらに含み、前記第２の薬剤が、ミツグミン５３（ＭＧ５３）、潜在型ＴＧＦ－β結合タンパク質４（ＬＴＢＰ４）のモジュレーター、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）活性のモジュレーター、アンドロゲン応答のモジュレーター、炎症応答のモジュレーター、筋成長のプロモーター、化学療法剤、線維症のモジュレーター、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６～３３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  35. 前記組成物中の前記アネキシンタンパク質の純度が、標準放出アッセイによって測定される場合、約９０％以上である、請求項２６～３４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  36. 前記組成物が、ミリグラムあたり約０．５００００エンドトキシン単位（ＥＵ／ｍｇ）未満であるエンドトキシンレベルを有する、請求項２６～３５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  37. 修飾アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、もしくはそれらの組み合わせ）、ならびに薬学的に許容される担体、緩衝液、および／または希釈剤を含む、薬学的組成物。
  38. アネキシンＡ１（配列番号１）およびアネキシンＡ２（配列番号２または配列番号３）をさらに含む、請求項３７に記載の薬学的組成物。
  39. アネキシンＡ２（配列番号２または配列番号３）をさらに含む、請求項３７に記載の薬学的組成物。
  40. アネキシンＡ１（配列番号１）をさらに含む、請求項３７に記載の薬学的組成物。
  41. ステロイドをさらに含む、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  42. 前記ステロイドが、コルチコステロイドまたはグルココルチコイドである、請求項４１に記載の薬学的組成物。
  43. 有効量の第２の薬剤をさらに含み、前記第２の薬剤が、ミツグミン５３（ＭＧ５３）、潜在型ＴＧＦ－β結合タンパク質４（ＬＴＢＰ４）のモジュレーター、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）活性のモジュレーター、アンドロゲン応答のモジュレーター、炎症応答のモジュレーター、筋成長のプロモーター、化学療法剤、線維症のモジュレーター、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３７～４２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  44. 前記組成物中の前記アネキシンタンパク質の純度が、標準放出アッセイによって測定される場合、約９０％以上である、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  45. 前記組成物が、ミリグラムあたり約０．５００００エンドトキシン単位（ＥＵ／ｍｇ）未満であるエンドトキシンレベルを有する、請求項３７～４４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  46. 前記修飾アネキシンＡ６（配列番号７、配列番号８、配列番号４５、またはそれらの組み合わせ）が、原核細胞中で産生される、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
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