CN112618696B

CN112618696B - Annexin A5在制备治疗胆汁淤积药物中的应用

Info

Publication number: CN112618696B
Application number: CN202011464172.6A
Authority: CN
Inventors: 吴旭东; 徐强; 黄伟; 张宇轩; 罗康康
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2020-12-14
Filing date: 2020-12-14
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2040-12-14
Also published as: CN112618696A

Abstract

本发明公开了一种Annexin A5在制备治疗胆汁淤积药物中的应用。属于生物制药技术领域，本发明叙述了一种分子量大小约为35kDa，能够以Ca2+依赖的方式结合于带负电荷的磷脂表面的蛋白Annexin A5在治疗胆汁淤积中的应用；本发明的目的在于探索Annexin A5作为胆汁酸平衡调控的有效药物在相关肝脏疾病中的功能研究；本发明能够改善胆汁淤积症，缓解胆汁淤积所导致的肝细胞坏死和炎性细胞的浸润，减轻肝纤维化程度，同时还能降低血清中的总胆红素和直接胆红素的含量。对于胆汁淤积所导致的相关疾病，特别是对肝脏的炎症、坏死、纤维化和脂代谢紊乱损伤有着显著的疗效。

Description

Annexin A5在制备治疗胆汁淤积药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种以Ca²⁺为依赖性的膜磷脂结合蛋白Annexin A5，它能够改善胆汁酸淤积从而缓解肝脏损伤。

背景技术

胆汁酸(BAs)是肝脏中的主要组成成分，它们是由胆固醇合成的两亲性类固醇分子。BAs分为初级BAs和次级BAs，初级BAs由肝脏直接合成，而次级BAs是在结肠中通过与肠道微生物之间的相互作用而转化而来。在正常情况下，BAs储存在胆囊中，并在胃肠道对膳食脂肪作出反应时排入肠组织中，在肠道中帮助脂肪、胆固醇和脂溶性纤维素的消化和吸收。当BAs的稳态遭到破坏时会引发各种肝脏类疾病，例如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，NAFLD包括了各种肝脏类疾病，从单纯的脂肪变性发展为非酒精性脂肪肝炎(NASH)，并且伴随着肝脏不同程度的炎症和纤维化，最终发展为肝硬化。目前NAFLD已经成为了最主要的肝脏类疾病，在美国青少年中的患病率高达11％，成年人中高达20％，并且每年的直接医疗费用高达1020亿美元。同样，高脂肪的饮食、熬夜、酗酒和药物滥用等不良生活习惯所引起的BAs代谢的紊乱将会重塑肠道菌群，破坏肠道菌群的稳态，导致肠道生态失调、肥胖和代谢紊乱等疾病的产生。因此，寻找调控胆汁酸稳态相关的药物对于治疗NAFLD等相关疾病具有重要的指导意义。

Annexin A5是膜联蛋白家族中的一员，它的分子量大小约为35kDa，能够以Ca²⁺依赖的方式结合于带负电荷的磷脂表面，由于其与磷脂酰丝氨酸(PS)的高亲和力而被广泛应用于细胞凋亡的检测。Annexin A5具有多种多样的功能，有文献报导Annexin A5可以通过与革兰氏阴性菌的膜表面脂多糖(LPS)相结合从而抑制其对细胞的毒性，Annexin A5在T细胞活化所参与的适应性免疫应答过程中将PKCθ招募到细胞上发挥着重要的作用。同时Annexin A5还可以通过直接靶向PKM2对机体代谢进行重编程，调节巨噬细胞的极化，从而改善NASH。然而关于Annexin A5是否能够通过靶向胆汁酸或其受体和转运体等来改善胆汁淤积的研究还未报导。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种以Ca²⁺为依赖性的膜磷脂结合蛋白Annexin A5，特别是Annexin A5在治疗胆汁淤积的应用，从而改善胆汁酸淤积从而缓解肝脏损伤。

本发明的技术方案是：Annexin A5在制备治疗胆汁淤积药物中的应用。

进一步的，所述的Annexin A5用于改善胆汁酸淤积导致的肝细胞坏死。

进一步的，所述的Annexin A5用于改善胆汁酸淤积导致的肝细胞炎症浸润。

进一步的，所述的Annexin A5用于改善胆汁酸淤积导致的肝脏纤维化。

进一步的，所述的Annexin A5用于降低胆汁酸淤积导致的体内直接胆红素和总胆红素的值的升高。

本发明的目的在于探索Annexin A5作为胆汁酸平衡调控的有效药物在NAFLD以及相关肝脏疾病中的功能研究。

Annexin A5的生物学功能主要取决于它的膜磷脂结合特性，其中包括凝血、抗炎、膜转运和信号转导等；通过建立小鼠胆管结扎(BDL)模型来检测其作用功效；HE切片染色结果显示，与模型组和空白对照组相比，Annexin A5通过尾静脉注射的方式在60μg/kg，200μg/kg和600μg/kg的剂量给药时能够显著缓解BDL所导致的肝组织细胞的损伤，炎性细胞浸润的增强，并且这种改善效果随着给药浓度的增加而增加；天狼星红染色结果同样也证明了Annexin A5以剂量依赖的方式缓解了由于BDL所导致的肝组织病变和胶原纤维的异常；同时，还检测了胆汁酸淤积症状相关的生化指标，结果显示，BDL模型组的小鼠血清中的直接胆红素和总胆红素的含量明显升高(这两种指标的升高通常出现在胆汁代谢、排泄或者胆道梗阻出现异常等情况下)。与对照组相比，Annexin A5能够显著降低血清中直接胆红素和总胆红素的含量，从而维持肝脏和血清中的胆汁酸含量的稳态。

本发明的有益效果是：本发明能够改善胆汁酸淤积症，缓解胆汁酸淤积所导致的肝细胞坏死和炎性细胞的浸润，减轻肝纤维化程度，同时还能降低血清中的总胆红素和直接胆红素的含量。对于胆汁淤积所导致的相关疾病，特别是对肝脏类疾病的治疗有着显著的疗效。

附图说明：

图1是本发明中Annexin A5改善胆汁淤积的操作流程示意图；

图2是本发明中使用Annexin A5缓解胆汁淤积所致的肝组织损伤(肝细胞坏死、炎症浸润和肝脏纤维化)的示意图；

图3是本发明中使用Annexin A5抑制由胆管结扎所导致的直接胆红素和总胆红素含量的升高的对比图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面结合附图对本发明的技术方案做进一步的详细说明：

如图所述；Annexin A5在制备治疗胆汁淤积药物中的应用。

具体实施例：

如图1-3所述，其中，图1是Annexin A5改善胆汁淤积的操作流程示意图；图2是使用Annexin A5缓解胆汁淤积所致的肝组织损伤(肝脏坏死、炎症和纤维化)的示意图；选取6-8周龄的C57BL/6公鼠用于BDL模型的建立，并在伤口愈合后每天按时进行Annexin A5(浓度依次为60μg/kg、200μg/kg和600μg/kg)尾静脉注射，连续给药10天，收取雄鼠时禁食12h。(A)、取空白组、模型组和给药组小鼠的肝脏组织，切片，进行H&E染色；任意选取切片的部位进行拍照，图示是三次重复的代表结果；比例尺＝50μm；(B)、取空白组、模型组和给药组小鼠的肝脏组织，切片，进行天狼星红染色；任意选取切片的部位进行拍照，图示是三次重复的代表结果；比例尺＝50μm；

图3是本发明中使用Annexin A5抑制由胆管结扎所导致的直接胆红素和总胆红素含量的升高的对比图取空白组、模型组和实验组小鼠的血清，通过购买的胆红素检测试剂盒来检测血清中这两种组分的含量。数据以平均SD表示，每组10只小鼠。#P<0.05对比正常组，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001对比BDL组。

具体的；以下通过具体实施方式对发明内容做进一步详细说明：

实施例1、BDL模型的建立：

(1)、动物准备：一般选取6-8周龄的C57BL/6公鼠，手术前可禁食12h；

(2)、实验动物麻醉：麻醉剂选用1％的戊巴比妥钠，称量小鼠体重，每20g体重的小鼠腹腔注射100μl的麻醉剂；待小鼠麻醉成功后，腹部喷洒75％的酒精进行消毒，同时用剃刀小心翼翼的刮净腹部毛发，上至胸骨柄，下至会阴，左右分别至腋前线或腋中线；

(3)、术前消毒：对手术中需要的剪刀、镊子、骨针等器械进行酒精消毒，将小鼠通过胶带和大头针固定在已经消毒了的泡沫板上；

(4)、实施手术：在小鼠的腹中线处剪下一个小口，然后通过眼科剪逐层剪开皮肤和肌肉等组织，以能够暴露肝脏等组织为宜。用镊子小心将肝叶、胃和肠等器官向两边拨开，找到在肝门部位发出的与门脉伴行的透明胆管；然后用眼科镊小心分离与胆管相结合的一些脂肪组织，待分离完全后，用两根手术缝线进行打结，胆管上下各打一个死结，留出的线头不宜过长，并且两个死结中间留有一定长度的胆管，然后用手术剪轻轻剪断两个死结中间的胆管；确认在实验过程中没有对腹腔中的组织造成结构性损伤和出血后，将腹腔内的组织器官放为原位，并用手术缝线依次将肌肉和表皮层缝好，在伤口上涂上一层氯霉素软膏以防细菌感染，将实验鼠放于温暖干燥的盒子中静养；

(5)、建模完成：在没有其它干预手段的情况下，小鼠能够自由活动并且伤口组织已有明显的愈合症状，可以进行下面的试验。

实施例2、尾静脉注射Annexin A5：

将造模成功的小鼠进行尾静脉注射，准备好1ml的无菌注射器和酒精棉球，将小鼠固定，尾巴拉直并绷紧；在注射药物之前可用酒精棉球擦拭小鼠的尾巴，使得尾部静脉扩张，易于注射；注射时选择距离尾尖1/3处缓慢进针，通过观察有无回血来判断针尖是否在静脉中，有回血说明进脉成功；Annexin A5注射浓度依次为60μg/kg，200μg/kg和600μg/kg，注射结束后使用消毒棉球进行止血，按时连续给药10天。

实施例3、HE和天狼星红染色：

(1)、HE染色：分别取空白组、模型组和实验组已经处死的小鼠的肝脏组织，用10％的福尔马林溶液进行固定，常规石蜡包埋，4μm切片；苏木精—伊红染料进行染色，观察肝脏组织结构以及炎性细胞的浸润；

(2)、天狼星红染色：将肝脏组织固定于10％的福尔马林溶液中，常规脱水包埋；切片的厚度约6μm，天狼星红染色液滴染1h，流水冲洗去除表面多余的染液，通过Mayer苏木素染色液染细胞核8～10min，流水冲洗，脱水后再用中性树胶固封；在普通光学显微镜下，肝脏等组织的胶原纤维被染成红色，观察实验组和对照组的肝脏胶原纤维异常或者纤维增生的情况。

实施例4、生化指标的检测：

实验组、模型组和空白组的小鼠进行摘眼球取血，注意采血过程中要预防溶血现象；每只小鼠约取500μl的血液，采集的血液静置于EP管中，待上层血清析出后，用移液枪将上层血清采集到新的EP管中，用于后续实验的检测；

通过购买的胆红素检测试剂盒来检测血清中的直接胆红素和总胆红素的含量，具体实验方法根据商家提供的试剂盒使用说明书来进行操作。

结果显示：

HE染色结果显示，小鼠胆管结扎后肝细胞出现细胞损伤坏死，并且肝脏中的炎性细胞浸润增强，这会增加肝脏相关或者不相关的疾病风险；而通过60μg/kg，200μg/kg和600μg/kg浓度的Annexin A5注射后，上述肝脏组织的损伤得到了缓解，并且这种缓解是伴随着Annexin A5的浓度提高而更加显著；同样的，天狼星红结果显示，BDL模型组小鼠肝组织中的胶原蛋白的含量也发生了变化，意味着BDL模型组小鼠发生了肝脏纤维化，而Annexin A5注射之后，也有效缓解了肝纤维化。

直接胆红素和总胆红素是反应肝脏胆汁代谢的一种重要评价指标，直接胆红素和总胆红素含量的增加通常会伴随着黄疸等疾病的发生；。通过研究发现，Annexin A5能够有效的抑制由于胆管结扎胆汁淤积所导致的血清中这两种生化指标的升高。

综上结果都证明了Annexin A5具有能够有效抑制胆汁淤积症的能力，改善胆汁淤积导致的肝脏损伤，缓解肝脏炎症和纤维化。

最后，应当理解的是，本发明中所述实施例仅用以说明本发明实施例的原则；其他的变形也可能属于本发明的范围；因此，作为示例而非限制，本发明实施例的替代配置可视为与本发明的教导一致；相应地，本发明的实施例不限于本发明明确介绍和描述的实施例。

Claims

1.Annexin A5在制备治疗胆汁淤积药物中的应用；其特征在于：

所述的Annexin A5用于改善胆汁酸淤积导致的肝细胞坏死；

所述的Annexin A5用于改善胆汁酸淤积导致的肝细胞炎症浸润；

所述的Annexin A5用于改善胆汁酸淤积导致的肝脏纤维化；

所述的Annexin A5用于降低胆汁酸淤积导致的体内直接胆红素和总胆红素的值的升高。