CN109749990A - 人源脂肪干细胞外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种脂肪干细胞来源的外泌体以及制备所述外泌体的方法。本发明的脂肪干细胞来源的外泌体能够用于治疗急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化等肝病。本发明的脂肪干细胞来源的外泌体能够显著升高急性肝衰竭患者的存活率，在高浓度下，甚至能够使得急性肝衰竭患者的存活率达到100％。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞及生物医药领域。具体地说，本发明涉及人源脂肪干细胞(Human-Adipose Derived Stem Cell，hADSC)外泌体及其制备方法和在治疗急性肝衰竭等疾病中的应用。
背景技术
肝功能衰竭(Liver failure)严重威胁人类健康。原位肝移植是目前最有效的治疗手段，但治疗费用高且受肝源限制，难以作为终末期肝病患者的常用治疗方法[1-3]。随着干细胞(Stem cell)技术的成熟，已证实干细胞可通过“细胞替代”或“旁分泌作用”促进受损器官组织细胞再生[4-7]。脂肪干细胞(Human adipose-derived stem cells，hASC)作为成体干细胞的一种，具有更高的增殖速率和更强的分化能力，且其取材相对容易，有望用于急性肝衰竭(Acute liver failure，ALF)等重症肝病的治疗[8-10]。
起初研究者认为干细胞主要通过“细胞替代作用”修复组织损伤[11-13]，然而，近期的几项动物试验证实，外源性干细胞移植到体内后通常会在短期被受体免疫系统清除，分化成为目的细胞的数量非常少，说明干细胞真正的作用机制很可能在于其旁分泌能力[14-16]。本发明人在急性肝衰竭大鼠模型中也发现hASC有助于大鼠生存率的提高和肝功能的恢复，但hASC移植后短期内并不表达肝细胞相关蛋白，推测hASC的主要作用机制为“旁分泌作用”而非“细胞替代作用”[4]。
hASC可以通过外泌体(Exosome)的形式向胞外分泌大量蛋白和RNA，外泌体的双层膜性结构可保护其内的蛋白和RNA更不易被细胞外的各种酶所降解，还可通过与目的细胞表面受体的相互作用发挥功能[17-20]。目前已有研究小组，从干细胞条件培养基中分离其外泌体，用于心脏、肾脏疾病动物模型中，发现干细胞外泌体移植比干细胞移植疗效更佳，表现出更出色的促进组织修复和促进再生的作用[21-28]。然而，不同干细胞来源的外泌体或者同一干细胞来源的不同外泌体适用于何种组织的修复和再生未知，其是否均具有的促进组织修复和再生的作用以及促进组织修复和再生的作用是否显著也是未知的。
因此，本领域急需能够用于急性肝衰竭等疾病治疗的干细胞来源的外泌体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脂肪干细胞来源的外泌体，所述的外泌体能够用于治疗急性肝衰竭等疾病。
本发明还提供了这种脂肪干细胞来源的外泌体的制备方法及其用途。
在第一方面，本发明提供一种脂肪干细胞来源的外泌体，所述外泌体包含蛋白和lncRNA H19，并且所述外泌体具有以下一种或多种特征：
1)所述外泌体的直径为约30-200nm；
2)所述外泌体的平均尺寸约为100nm；
3)所述外泌体的强度约为0.5-6a.u.；
4)所述外泌体的表面具有以下一种或多种特征分子：CD81、ANXA5、ICAM、ALIX、TSG101、FLOT1、CM130、CD63、CD9。
在优选的实施方式中，所述脂肪干细胞是人源脂肪干细胞。
在具体的实施方式中，所述外泌体通过以下方法获得：
1)培养获得的脂肪干细胞；
2)收集步骤1)获得的培养液，离心除去细胞和细胞碎片；
3)向步骤2)获得的上清液中加入缓冲液，然后冷藏过夜；
4)将步骤3)得到的混合物离心，除去上清液，从而获得所述外泌体。
在优选的实施方式中，获得所述脂肪干细胞来源的外泌体包括：培养获得的脂肪干细胞以获得培养液，并以3000×g离心15分钟以除去细胞和细胞碎片。将上清液转移到无菌容器中，并将适量的ExoQuick-TC(System Biosciences，美国)加入生物液体中。通过颠倒或轻弹试管作良好混合。在4℃冷藏过夜。以1500×g离心30分钟。以1500×g离心5分钟将残留的ExoQuick-TC溶液旋下。通过抽吸去除所有痕量的液体。将外泌体沉淀重悬于500μl无菌1X PBS中。
在具体的实施方式中，所述方法还包括鉴定获得的外泌体的上述一种或多种特征。
在第二方面，本发明提供本发明第一方面所述的脂肪干细胞来源的外泌体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)培养获得的脂肪干细胞；
2)收集步骤1)获得的培养液，离心除去细胞和细胞碎片；
3)向步骤2)获得的上清液中加入缓冲液，然后冷藏过夜；
4)将步骤3)得到的混合物离心，除去上清液，从而获得所述外泌体。
在优选的实施方式中，获得所述脂肪干细胞来源的外泌体包括：培养获得的脂肪干细胞以获得培养液，并以3000×g离心15分钟以除去细胞和细胞碎片。将上清液转移到无菌容器中，并将适量的ExoQuick-TC(System Biosciences，美国)加入生物液体中。通过颠倒或轻弹试管作良好混合。在4℃冷藏过夜。以1500×g离心30分钟。以1500×g离心5分钟将残留的ExoQuick-TC溶液旋下。通过抽吸去除所有痕量的液体。将外泌体沉淀重悬于500μl无菌1X PBS中。
在具体的实施方式中，所述方法还包括鉴定获得的外泌体的上述一种或多种特征的步骤。
在优选的实施方式中，所述脂肪干细胞来源的外泌体用于治疗急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化等肝病；优选急性肝衰竭。
在第三方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的脂肪干细胞来源的外泌体以及任选的药学上可接受的载体。
在具体的实施方式中，所述药物组合物是将本发明第一方面所述的脂肪干细胞来源的外泌体溶解于右旋糖苷溶液得到的液体制剂。
在优选的实施方式中，所述药物组合物中包含高浓度的脂肪干细胞来源的外泌体；例如，所述药物组合物中脂肪干细胞来源的外泌体的浓度量使得给予受试者时，给药量达到100-1000μg/kg受试者体重；优选140-800μg/kg受试者体重；最优选500-750μg/kg受试者体重。
在第四方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒装有：
1)本发明第一方面所述的脂肪干细胞来源的外泌体，或第三方面所述的药物组合物；和
2)任选的使用说明书。
在具体的实施方式中，所述使用说明书注明将所述的脂肪干细胞来源的外泌体或所述药物组合物给予受试者时，给药量为100-1000μg/kg受试者体重；优选140-800μg/kg受试者体重；最优选500-750μg/kg受试者体重。
在第五方面，本发明提供第一方面所述的脂肪干细胞来源的外泌体在制备治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病包括但不限于急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化等肝病；所述疾病优选急性肝衰竭。
在第六方面，本发明提供一种疾病的治疗方法，所述方法包括利用第一方面所述的脂肪干细胞来源的外泌体，或第三方面所述的药物组合物，或第四方面所述的试剂盒来治疗有此需要的对象的步骤，其中所述疾病包括但不限于急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化；优选急性肝衰竭。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示hASC的分离与鉴定；其中，A：显微镜下观察到hASC的形态呈长梭形，排列紧密；P5代细胞形态、大小、密度和P0相比均无显著变化；B：流式细胞仪检测hASC的免疫表型，可见CD90、CD44、CD105、CD73等表面标记呈阳性表达；C：hASC成脂分化后油红O染色后可见红色脂滴(400×)，hASC成骨分化后茜素红染色呈现红色(400×)。
图2显示hASC外泌体的鉴定；其中，A：电镜下的观察结果：hASC外泌体呈均一大小的圆球状，大小约在30～200nm；B：Nanosight粒度仪检测到hASC外泌体的物理学参数，曲线描述了粒子大小(X轴)和浓度/强度分布(Y轴)的关系，可以看到大部分hASC外泌体大小均在30-200nm之间；从录像可见hASC外泌体在液体中的布朗运动；C：蛋白芯片检测hASC外泌体常见的表面蛋白标记，并使用ImageJ软件计算其平均灰度值；D：hASC的融合度、细胞代数、细胞质量或者培养基采集的次数均与采集到的外泌体蛋白含量呈正相关(BCA蛋白测定法)；E：分别使用Nanosight粒度仪和ELISA方法检测，采集到的hASC外泌体的蛋白含量与外泌体的数量呈正相关。
图3显示肝细胞体外摄取hASC外泌体的试验结果；其中，A：普通光学显微镜下的肝细胞；B：荧光显微镜下肝细胞摄取外泌体后发绿色荧光，提示外泌体中的蛋白质；C：荧光显微镜下肝细胞摄取外泌体后发红色荧光，提示外泌体中的RNA；D：绿色荧光和红色荧光合并后显示。
图4显示hASC外泌体治疗D-gal+LPS诱导急性肝衰竭的结果；其中，A：高浓度hASC外泌体移植组和PBS对照组大鼠在不同时间点的生存率对比均表现出显著差异(P﹤0.05)；B：移植治疗后24h，取各组大鼠肝组织行石蜡切片，HE染色后置于显微镜下拍照(400×)；C：移植治疗后24h，高浓度hASC外泌体移植组血清ALT、AST、LDH水平均明显低于对照组(P﹤0.05)；D：蛋白芯片检测可见，高浓度hASC外泌体移植组大鼠血清中大部分炎症因子、趋化因子等水平均明显低于PBS对照组。
图5显示hASC外泌体治疗D-gal诱导急性肝衰竭的结果；其中，A：高、低浓度hASC外泌体移植组(Exo-high、Exo-low)，高、低浓度hASC裂解液移植组(Lys-high、Lys-low)，hASC移植组和PBS对照组的大鼠72小时生存率。其中，高、低浓度hASC外泌体移植组与对照组相比，在不同时间点的生存率对比均表现出显著差异(P﹤0.05)；B：取各组大鼠肝组织行石蜡切片，HE染色后置于显微镜下拍照(400×)；C：取高浓度hASC外泌体移植组与对照组大鼠肝组织，匀浆后进行第二代基因测序分析，绘制热图；D：对测序结果进行KEGG信号通路分析可见，和对照组相比，高浓度hASC外泌体移植组中凝血级联反应、药物代谢和MAPK信号转导明显上调；E：TRP通道和趋化因子途径的炎性介质调控明显下调。
图6显示信号网络分析；其中，A：通过高浓度hASC外泌体治疗后上调的信号通路，如补体和凝血反应、药物代谢、MAPK等在整个信号通路网络中处于核心位置(红色代表上调的基因、绿色代表下调的基因)；B：药物代谢通路中参与药物、毒物代谢的相关酶均明显上调；C：RT-qPCR检测结果再次验证了测序结果。
图7显示了lncRNA H19在hASC外泌体中的作用；其中，A：将RNA测序结果分别与人的基因库和大鼠的基因库进行比对，发现在hASC外泌体组的大鼠肝组织中测得人源的长链非编码RNA H19明显上调；B：沉默H19基因后，hASC外泌体中lncRNA H19的表达量明显下调；C：沉默H19基因的hASC外泌体对人肝细胞的增殖没有明显促进作用；D：hASC外泌体移植组与沉默H19基因的hASC外泌体移植组相比，在不同时间点的生存率对比均表现出显著差异(P﹤0.05)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现脂肪干细胞的外泌体，特别是包含lncRNA H19的人源脂肪干细胞的外泌体能够显著提高急性肝衰竭模型大鼠的存活率。进一步地，本发明人发现高浓度的人源脂肪干细胞外泌体甚至能将急性肝衰竭模型大鼠的存活率提高到100％，从而可以用于急性肝衰竭等疾病的治疗。在此基础上完成了本发明。
脂肪干细胞
脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSC)是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。它是来源于脂肪组织的一种间充质干细胞，可以分化为间质类细胞，如骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞等。ADSC细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。在优选的实施方式中，本文所述的脂肪干细胞是指人源脂肪干细胞。
近年来，多潜能人源脂肪干细胞(hADSC)已成为治疗人类一些严重疾病，如脊髓损伤、脑卒中、急性肝衰竭等的很好的细胞来源。
为了举例和方便的目的，本发明的实施例部分从人体抽脂术得到的脂肪组织中分离人源脂肪干细胞(hADSC)。但本领域公知，可以通过各种来源，包括但不限于商业来源获得人源脂肪干细胞(hADSC)。
外泌体
本文所述的“外泌体”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，是指活细胞分泌的具有脂质双分子层结构的小囊泡。这种外泌体在其表面表达有不同的标志蛋白。
干细胞外泌体可通过携带大量包装过的蛋白质和RNA等，参与免疫调节、减轻炎症反应、促进血管生成、促进受损组织增殖以及细胞凋亡等[30-36]。由于具有内在的靶向特性，可以将其内的蛋白质和RNA直接递送到受体细胞中；并且由于其为自然的细胞产物，可以避免受体巨噬细胞的吞噬作用或降解，避免胞内通路和溶酶体降解，从而在体内循环更长时间[37，38]。此外，外泌体还可以穿透很多药物难以穿透的血脑屏障[39-40]。因此，hASC外泌体可以从体外分离，递送到体内针对疾病进行治疗[41-45]。
本发明人在D-gal联合LPS诱导的急性肝衰竭大鼠模型中验证了hASC外泌体的疗效，发现hASC外泌体组大鼠的72h生存率(50％)明显高于PBS对照组(9％)(P＜0.05)。治疗后24h，hASC外泌体组大鼠肝脏大体形态及组织病理学改变均优于PBS对照组；大鼠肝功能指标如血清ALT、AST、LDH等均显著低于PBS对照组(P＜0.05)；蛋白芯片检测结果提示，hASC外泌体移植组大鼠血清中炎症因子如IL-1ra、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-17等水平均明显低于PBS对照组；趋化因子如CCL20、CINC-1、CINC-2α/β、CINC-3、CNTF、CX3CL1、CXCL7、CXCL9、CXCL10、LECAM-1等水平均明显低于PBS对照组。提示hASC外泌体可以同时抑制炎症介质和趋化因子的表达，减轻肝组织坏死程度，从而提高急性肝衰竭大鼠的存活率。
在单用D-gal诱导的急性肝衰竭大鼠模型中，高浓度、低浓度hASC外泌体移植组大鼠72h生存率分别为100％和62.5％，均明显高于PBS对照组(27.3％)(P＜0.05)。值得注意的是，高、低浓度裂解液组大鼠生存率与对照组相比并无显著差异，进一步说明hASC主要通过向胞外分泌的外泌体发挥作用，而不是靠干细胞本身。为明确hASC外泌体治疗急性肝衰竭的机制，本发明人对移植后大鼠肝组织进行RNA测序分析，发现hASC外泌体移植组大鼠肝脏中与凝血功能、药物代谢通路相关的很多基因显著上调，推测hASC外泌体移植改善了急性肝衰竭大鼠体内凝血功能低下的状态，并加速了D-gal在大鼠体内的代谢过程。同时，与炎症反应、趋化因子信号通路相关的很多基因显著下调，这一结果与D-gal联合LPS诱导的急性肝衰竭大鼠模型中的结果一致，提示hASC外泌体可以有效抑制炎症介质的表达。
此外，在hASC外泌体组大鼠肝组织中测得人源的长链非编码RNA(lncRNA,Longnon-coding RNA)H19明显上调。因此，我们推测人hASC外泌体很可能通过分泌人的lncRNAH19抑制大鼠凝血功能、药物代谢等通路相关的microRNA的表达，从而上调大鼠凝血功能和药物代谢通路，提高急性肝衰竭大鼠存活率。
H19是一个已知的长2.3kb的非编码RNA分子，是最早被鉴定的印迹基因之一，其在胎肝中表达旺盛，而待个体出生后其表达迅速下降。本发明人经髂静脉分别注射hASC外泌体、沉默H19基因的hASC外泌体和PBS，72h总体生存率分别为100％、40％和10％；其中，沉默H19基因的hASC外泌体组与hASC外泌体组相比，在不同时间点的生存率对比均表现出显著差异(P﹤0.05)，提示lncRNA H19可能通过促进肝细胞的增殖提高大鼠存活率。体外增殖试验也证实沉默H19基因的hASC外泌体对人肝细胞的增殖促进作用降低。
因此，hASC外泌体在急性肝衰竭动物模型中的研究具有重要意义。本发明人通过不同药物诱导的急性肝衰竭大鼠模型，证实了hASC外泌体在急性肝衰竭中的疗效，探索了lncRNA H19在其中扮演的角色；这一直接使用干细胞外泌体而非干细胞本身的方式很可能成为未来一种有潜力治疗肝脏疾病如肝纤维化、急性肝衰竭、肝硬化，特别是急性肝衰竭的新方法。
基于上述发现，本发明提供这样一种的脂肪干细胞来源的外泌体，所述外泌体包含蛋白和lncRNA H19，并且所述外泌体具有以下一种或多种特征：
1)所述外泌体的直径为约30-200nm；
2)所述外泌体的平均尺寸约为100nm；
3)所述外泌体的强度约为0.5-6a.u.；
4)所述外泌体的表面具有以下一种或多种特征分子：CD81、ANXA5、ICAM、ALIX、TSG101、FLOT1、CM130、CD63、CD9。
本发明人发现，优选通过两次沉淀获得本发明的脂肪干细胞来源的外泌体，例如，本发明的脂肪干细胞来源的外泌体可以通过以下方法获得：
1)培养获得的脂肪干细胞；
2)收集步骤1)获得的培养液，离心除去细胞和细胞碎片；
3)向步骤2)获得的上清液中加入缓冲液，然后冷藏过夜；
4)将步骤3)得到的混合物离心，除去上清液，从而获得所述外泌体。
在通过上述方法获得脂肪干细胞来源的外泌体后，还可进一步鉴定获得的外泌体是否具备上述的一种或多种特征。
本发明的人源脂肪干细胞来源的外泌体的用途
本领域技术人员鉴于本发明的教导可以明白，本发明的人源脂肪干细胞来源的外泌体可用于治疗急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化等肝病；优选急性肝衰竭。
药物组合物及其应用
可以将本发明的人源脂肪干细胞来源的外泌体制备成药物组合物，除了有效量的本发明人源脂肪干细胞来源的外泌体外，所述组合物还可以含有药学上可接受的载体。
通常，可将本发明人源脂肪干细胞来源的外泌体配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，如生理盐水中，其中pH通常约为5-8；较佳地，pH约为7-8。例如，在具体的实施方式中，可将本发明的脂肪干细胞来源的外泌体溶解于右旋糖苷溶液得到液体制剂。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明的脂肪干细胞来源的外泌体的有效量可随给药的模式和待治疗疾病的严重程度等具体选择。例如，可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
然而，本发明人更发现，高浓度的脂肪干细胞来源的外泌体能够显著提高急性肝衰竭患者的存活率。这是非常出乎意料的，因为给予高浓度的干细胞来源的外泌体通常会造成细胞因子升高，从而造成显著的副作用。
本发明的药物组合物优选为皮下注射试剂与及静脉注射试剂同时使用。在具体的实施方式中，所述的脂肪干细胞来源的外泌体或所述药物组合物给予受试者时，给药量为100-1000μg/kg受试者体重；优选140-800μg/kg受试者体重；最优选500-750μg/kg受试者体重。因此，本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒装有本发明的脂肪干细胞来源的外泌体；而所述试剂盒中的使用说明书可以注明将所述的脂肪干细胞来源的外泌体或所述药物组合物给予受试者时，给药量如上所述。
在本发明中，给所需要的对象施用脂肪干细胞来源的外泌体的施用部位是在所述对象的损伤区作原位注射或者进行静脉注射。
本发明的主要优点包括：
1.本发明的脂肪干细胞来源的外泌体能够用于治疗急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化等肝病；和
2.本发明的脂肪干细胞来源的外泌体能够显著升高急性肝衰竭患者的存活率，在高浓度下，本发明的脂肪干细胞来源的外泌体甚至能够使得急性肝衰竭患者的存活率达到100％。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法
1.hASC的分离与鉴定
1.1hASC的分离和培养：取年轻健康人体抽脂术后的脂肪组织(由中国人民解放军第八五医院提供，标本采集前均已签署相关知情同意书，并已通过医院伦理委员会审核，审核编号为NO.2013/18)，PBS液冲洗3遍后剪碎成约1mm3的小块,加入0.1％胶原酶(Gibco,美国)消化30min。加等体积完全培养基(DMEM-F12培养基(Hyclone，美国)，10％胎牛血清(Gibco,美国)，10ng/ml bFGF)终止消化，1000rpm离心10min。用磷酸盐缓冲液(Gibco，美国)重悬细胞，100μm滤网过滤后按1×106/ml接种于T25细胞培养瓶中,置37℃、5％CO2恒温培养箱(Thermo，美国)培养，48小时后换液。观察细胞至90％融合时，0.25％胰酶(Gibco，美国)消化，按1:3传代培养。
1.2流式细胞仪检测hASC表面分子标记：将P2代hASC制成3管500ul单细胞悬液，分别加入抗人CD44-FITC、CD90-FITC、CD73-FITC、CD19-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC、CD105-PE单抗(eBioscience，美国)各2ul，37℃孵育30min后用PBS清洗3遍，使用流式细胞仪(caliber，BD，美国)检测。
1.3成脂、成骨分化：将P2代hASC按5×103/cm2的密度接种于6孔板中，分别用成脂、成骨分化培养基培养3周。PBS清洗3次，4％甲醛固定10min，油红(Sigma，美国)在室温下孵育30min或茜素红(Sigma，美国)孵育3h，PBS清洗3次置于显微镜下观察。
2.hASC外泌体的提取
收集生物液体并以3000×g离心15分钟以除去细胞和细胞碎片。将上清液转移到无菌容器中，并将适量的ExoQuick-TC(System Biosciences，美国)加入生物液体中。通过颠倒或轻弹试管作良好混合。在4℃冷藏过夜。以1500×g离心30分钟。以1500×g离心5分钟将残留的ExoQuick-TC溶液旋下。通过抽吸去除所有痕量的液体。将外泌体沉淀重悬于500μl无菌1X PBS中。
3.hASC外泌体的鉴定
3.1扫描电镜检测：滴1滴约10μg hASCs外泌体液滴于封口膜上，用镊子取1个碳支持膜铜网盖在液滴上5-10min，然后滴1滴2％磷钨酸染液与封口膜上，然后用镊子将铜网从hASC外泌体液滴移到磷钨酸液滴上，染色3min，用滤纸吸干液体，至于白炽灯下烤干，用透射电镜观察并拍照。
3.2Nanosight粒度仪检测：将样品hASC外泌体制成1mL合适浓度的溶液，使用Nanosight粒度仪(NS300，英国)，打开NS300软件，将样品注射入样品槽，通过激光光源照射hASC外泌体悬浮液，观察带有散射光的hASC外泌体的布朗运动，获得hASC外泌体的粒径分布信息。绘制出粒径、对应数量分布强度和散射强度的三维图谱。
3.3抗体芯片试剂盒(System Bioscience，美国)检测hASC外泌体的表面标记：将500ug hASC外泌体蛋白加入500ul裂解液，涡旋15秒混合，加入9ml EABB，上下混合3次。将10ml上述混合液加入到抗体芯片上，4℃摇床过夜。弃去混合液，加10ml洗液，室温摇床5min，弃去液体，加10ml抗体混合液到芯片上，室温摇床2小时。重复洗涤3次后，用干吸纸吸干芯片液体，1:1混合适量显色液滴到芯片上，于化学发光成像系统(LAS 4000mini，GE，日本)下拍照。
3.4BCA蛋白浓度测定：根据BCA蛋白浓度测定试剂盒(Solarbio，中国北京)说明，制备标准曲线，将hASC外泌体多梯度稀释，接种于96孔板，每孔另加200微升BCA工作液，于37℃放置15-30mins，使用多功能酶标仪(SoftMax Pro5，Molecular Devices，美国)测定A562nm波长的吸光度值。根据标准曲线和样品数据算出蛋白浓度。后续试验所使用的hASC外泌体的蛋白浓度均以此试剂盒测定。
3.5流式细胞术检测hASC外泌体表面的CD9蛋白：将90ul含磁珠的缓冲液与10ulhASC外泌体混合，上下颠倒混匀过夜，然后把试管放在磁力分离器里，弃上清。加缓冲液清洗，混合20ul抗人CD9-RPE与100ul磁珠hASC外泌体混合液；同时混合20ul鼠IgG1-RPE与100ul磁珠样品作为对照组。室温1000rpm摇床上放置45min，清洗样品，使用流式细胞仪检测。
3.6ELISA检测hASC外泌体表面的CD63蛋白：在96孔板中加入50ul蛋白标准品和hASC外泌体，37℃孵育2小时。洗液洗涤3次后加入50ul外泌体一抗，室温摇床孵育1小时。洗液洗涤3次后加入50ul外泌体二抗，室温摇床孵育1小时；洗液洗涤3次后加入50ul TMB底物，室温摇床孵育30分钟；加入50ul终止液，待孔内颜色将由蓝色转变为黄色，使用多功能酶标仪检测吸光度。
4.肝细胞体外摄取hASC外泌体试验
在500μL浓度为1ug/ul的hASC外泌体中，分别加入500μL荧光标记试剂盒(SystemBioscience,美国)中的羧基荧光素琥珀酰亚胺基二乙酸酯(CFSE)和吖啶橙。充分混合，37℃下放置10min，加入ExoQuick抗体以终止荧光标记，上下翻转6次后在冰上放置30min，14000rpm离心3min，去除上清，加入500μL的PBS稀释，在6孔板中的HL-7702细胞(人肝细胞，上海江林生物科技有限公司)里加入标记后的外泌体(100μL每孔)，孵育2h，置于荧光显微镜下观察肝细胞摄取外泌体情况。
5.hASC外泌体治疗D-gal+LPS诱导的急性肝衰竭
5.1急性肝衰竭动物模型的构建：选用健康雄性SPF级Sprague Dawley(SD)大鼠21只，7周龄，体重180g左右。一次性腹腔内注射0.8g/kg D-氨基半乳糖和5ug/kg LPS建立急性肝衰竭模型。
5.2hASC外泌体的移植：大鼠急性肝衰竭模型建立后2h，21只急性肝衰竭模型大鼠分为2组，分别经髂静脉移植高浓度hASC外泌体(100μg/只)(10只)和PBS(11只)。
5.3观察72h总体生存率。
5.4大鼠肝脏大体形态及组织病理学改变：于肝脏门静脉周围取材，常规石蜡包埋切片，行HE染色，光学显微镜下观察肝脏组织学表现。
5.5检测大鼠肝功能指标：移植后1天采集大鼠血清，使用血生化仪检测大鼠血清中ALT、AST、LDH的浓度。
5.6取大鼠血清做蛋白芯片检测：移植后1天采用大鼠细胞因子蛋白芯片(R&D，ARY008)定性分析大鼠血清中IL-1ra、IL-1α、IL-1β等炎症因子和CCL3、CCL5、CCL20等趋化因子的表达情况。凝胶成像仪(GE，LAS4000mini)拍照并使用HLImage软件分析Mean PixelDensity。
6.hASC外泌体治疗D-gal诱导的急性肝衰竭
6.1急性肝衰竭动物模型的构建：选用健康雄性SPF级Sprague Dawley(SD)大鼠60只，5周龄，体重140g左右。间隔12h两次腹腔内注射0.8g/kg D-氨基半乳糖建立急性肝衰竭模型。
6.2hASC外泌体的移植：大鼠急性肝衰竭模型建立后24h，60只急性肝衰竭模型大鼠随机分为6组，分别经髂静脉移植低浓度hASC外泌体(20μg/只)、高浓度hASC外泌体(100μg/只)、低浓度裂解液(20μg/只)、高浓度裂解液(100μg/只)、hASC(2×106个细胞/只)以及PBS作为对照。
6.3观察72h总体生存率。
6.4大鼠肝脏组织病理学改变：同上。
6.5肝组织RNA测序：取高浓度hASC外泌体移植组和对照PBS组大鼠的肝脏组织，加入TRIzol试剂提取肝组织的RNA，用RNA定量仪测得其总量并保存在-80℃冰箱中，选取测得的RIN值＞8.0的RNA建立cDNA库，利用高通量测序法在ProtonTm系统平台上来检测RNA序列，再制成RNA序列热图。将测得的RNA序列分别与人和大鼠的RNA库做比对，找出高浓度hASC外泌体移植组和对照PBS组间人和大鼠的RNA表达的差异。
6.6信号通路分析：将检测到的所有RNA序列以FASTA格式在KEGG数据库中检索(http://geneontology.org/)，利用Fiser精确检验挑选重要的信号通路，Benjamini-Hochberg法校准p值，并且仅有当p＜0.05且功能性的基因种类和通路才会被视作有意义。
6.7RT-qPCR体外验证：使用Trizol裂解hASC外泌体，使用RT-qPCR技术检测其中lncRNA H19和药物代谢信号通路相关基因的表达量。
6.8信号网络分析：将检测到的所有RNA涉及到的机体的重要信号通路制成网络状图表，所选择的基因均为通路中含量丰富的基因(p＜0.05)，观察各个信号通路在信号通路网络中所处的位置和相互之间的关系。
7.lncRNA H19在hASC外泌体中的作用
7.1沉默lncRNA H19的hASC外泌体收集：构建携带H19shRNA的质粒pGLV3/H1/GFP+Puro Vector，包装慢病毒并感染hASC，以获得沉默掉H19基因的hASC，收集其外泌体。使用RT-qPCR检测沉默前后hASC外泌体中lncRNA H19的表达量。
7.2人肝细胞(HL-7702)体外增殖试验：将人肝细胞以5000细胞/孔接种于96孔板；待细胞贴壁后分别将hASC外泌体、沉默H19基因的hASC外泌体以不同浓度梯度加入空板中，分别于不同时间点以10ul/孔加入CCK8，孵育30min，检测A450数值，评价两种hASC外泌体对人肝细胞增殖的影响。
7.3两种hASC外泌体移植：准备30只急性肝衰竭大鼠(D-gal)。模型建立后24h，大鼠随机分为3组，分别经髂静脉移植hASC外泌体(100μg/只)、沉默H19基因的hASC外泌体(100μg/只)和PBS作为对照，观察72h总体生存率。
8.统计数据和分析
实验数据采用SPSS 19.0统计软件，计量资料各项指标以均数±标准误(X±SEM)表示。生存分析采用Kaplan-Meier analysis，P＜0.05为差异有统计学意义。
实施例
实施例1.hASC的分离与鉴定
本发明人分离得到的hASC从P0代开始即维持成纤维样形态，大小均一且排列紧密，呈漩涡状或放射状生长。至P5代细胞形态、大小、密度均无显著变化(图1A)。流式细胞仪检测结果显示hASCs表面高表达CD73(100％)、CD44(100％)、CD90(99.9％)、CD105(97.2％)等蛋白标记，几乎不表达造血细胞系分子标记物CD34、CD45、CD19等(0.8％)，证实分离得到的hASC为纯度较高的间充质干细胞(图1B)。使用成脂培养基培养3周之后，在镜下可见细胞浆内有大量透亮、折光性好的脂滴，使用油红O染色后呈现红色；使用成骨培养基培养3周之后，使用茜素红染色，在镜下可见大部分细胞红染(图1C)。
实施例2.hASC外泌体的提取和鉴定
根据“材料与方法”所述提取并鉴定hASC外泌体，结果如下所述：
1.扫描电镜检测：扫描电镜下观察可以看到hASC外泌体呈均一大小的茶托样或凹半球样结构，具有明显的膜结构，立体结构清晰，大小约在30-200nm(图2A)。
2.Nanosight粒度仪检测：Nanosight粒度仪检测hASC外泌体，从尺寸/浓度曲线可见hASC外泌体尺寸约在30-200nm，平均尺寸约在100nm，测得样品浓度约为4×107颗粒/ml。从尺寸/强度曲线可见hASC外泌体强度约为0.5-6a.u.，尺寸为150nm左右的粒子的强度最高。从尺寸/浓度/强度三维图上可见分离得到的hASC外泌体在30-200nm尺寸范围内具有较高的纯度。此外，利用粒度仪还可以捕捉到hASC外泌体在液体中的布朗运动(图2B)。
3.抗体芯片试剂盒检测hASC外泌体的表面标记：从显影后的蛋白芯片可以看出，hASC外泌体表面常见的蛋白标记，按平均灰度值高低排序，依次为CD81、ANXA5、ICAM、ALIX、TSG101、FLOT1、CM130、CD63(图2C)。
4.影响hASC外泌体采集量的因素：收集hASC外泌体时，hASC的融合度、细胞代数(第四代以内)、细胞质量(目测法)或者培养基采集的次数(2次以内)均与采集到的外泌体蛋白含量呈正相关(BCA蛋白测定法)(图2D)。分别使用Nanosight粒度仪和ELISA方法检测，证实采集到的hASC外泌体的蛋白含量与外泌体的数量呈正相关(图2E)。
实施例3.肝细胞体外摄取hASC外泌体试验
根据“材料与方法”所述检验肝细胞对hASC外泌体的体外摄取情况，结果如下所述：
hASC外泌体与肝细胞孵育2h后(图3A)，可见肝细胞胞浆内同时出现红色和绿色荧光颗粒，绿色荧光标记的为外泌体中的蛋白质(图3B)，红色荧光标记的为外泌体中的RNA(图3C)，且并未观察荧光到随时间延长而减弱。说明hASC外泌体可以穿透肝细胞膜，进入肝细胞质，并在肝细胞中存在较长时间。
实施例4.hASC外泌体治疗D-gal+LPS诱导急性肝衰竭-1
根据“材料与方法”所述，本发明人在D-gal+LPS诱导急性肝衰竭大鼠模型中验证了hASC外泌体对于D-gal+LPS诱导急性肝衰竭的治疗作用，结果如下所述：
1.72h总体生存率：腹腔注射D-gal+LPS造模2小时后，经髂静脉分别注射高浓度hASC外泌体(100μg/只)和PBS，72h总体生存率分别为50％和9％；两组大鼠在不同时间点的生存率对比均表现出显著差异(P﹤0.05)(图4A)。
2.大鼠肝脏大体形态及组织病理学改变：造模后大体标本可见肝脏表面呈片状淤血，包膜紧张，无光泽；移植治疗后24h，PBS对照组肝脏呈出血坏死性改变，无光泽；高浓度hASC外泌体移植组肝脏基本恢复正常。常规病理检查提示PBS对照组肝小叶结构破坏，肝索紊乱，肝细胞大片变性坏死，肝窦扩张，充血、出血明显，汇管区及坏死区可见大量炎性细胞浸润；高浓度hASC外泌体移植组肝脏肝小叶、肝窦等结构基本恢复正常，仅见少量炎性细胞浸润(图4B)。
3.大鼠肝功能指标：造模后大鼠血清ALT、AST、LDH均明显升高，移植治疗后24h，高浓度hASC外泌体移植组ALT水平[(7091.4±3473.9)U/L]明显低于对照组[(10615±2950.8)U/L]；治疗组AST水平[(7627.5±3822.5)U/L]明显低于对照组[(16163.8±4660.6)U/L]；治疗组LDH水平[(62476.3±32829.8)U/L]明显低于对照组[(83902.5±17114.3)U/L](图4C)。
4.取大鼠血清做蛋白芯片检测：移植后1天，高浓度hASC外泌体移植组大鼠血清中炎症因子，如IL-1ra、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-17等水平均明显低于PBS对照组；趋化因子，如CCL20、CINC-1、CINC-2α/β、CINC-3、CNTF、CX3CL1、CXCL7、CXCL9、CXCL10、LECAM-1等水平均明显低于PBS对照组(图4D)。
实施例5.hASC外泌体治疗D-gal诱导的急性肝衰竭-2
根据“材料与方法”所述，本发明人在D-gal+LPS诱导急性肝衰竭大鼠模型中验证了低浓度hASC外泌体、高浓度hASC外泌体、低浓度裂解液、高浓度裂解液以及hASC对于D-gal+LPS诱导急性肝衰竭的治疗作用，结果如下所述：
1.腹腔注射D-gal造模1天后，经髂静脉分别注射低浓度hASC外泌体(20μg/只)、高浓度hASC外泌体(100μg/只)、低浓度裂解液(20μg/只)、高浓度裂解液(100μg/只)、hASC(2×106/只)以及PBS，总体生存率分别为62.5％、100％、25％、50％、37.5％和27.3％；其中，高、低浓度hASC外泌体移植组与对照组相比，在不同时间点的生存率对比均表现出显著差异(P﹤0.05)(图5A)。
2.各组肝脏标本的组织学表现：移植24h后取肝组织行HE染色，光学显微镜下观察可见，PBS对照组，高、低浓度hASC裂解液移植组中肝细胞大面积变性坏死，肝窦扩张，汇管区及坏死区可见大量炎性细胞浸润；而hASC移植组和高、低浓度hASC外泌体移植组中肝脏肝小叶、肝窦等结构基本恢复正常，仅见少量炎性细胞浸润(图5B)。
3.对hASC外泌体组和对照组的RNA序列进行分析：取高浓度hASC外泌体移植组和对照组的大鼠肝组织行RNA序列分析，制成热图后可清楚的看到，与对照组相比，注射高浓度的hASC外泌体可以显著影响大鼠肝组织的RNA的表达(图5C)。
4.信号通路分析结果：对测序结果进行KEGG信号通路分析，我们可以看到和对照组相比，注射高浓度的hASC外泌体后，大鼠肝脏内重要的信号通路如凝血级联反应、药物代谢和MAPK信号转导明显上调(图5D)；TRP通道和趋化因子信号传导途径的炎性介质调控明显下调。
5.信号网络(Pathway Act Network)分析结果：通过高浓度hASC外泌体治疗后，高浓度hASC外泌体移植组中凝血级联反应、药物代谢和MAPK信号转导等信号通路相关基因明显上调且在整个信号通路网络中处于核心位置(图6A)。其中药物代谢通路中参与药物、毒物代谢的相关酶均明显上调(图6B)，RT-qPCR检测结果再次验证了测序结果(图6C)。
实施例6.lncRNA H19在hASC外泌体中的作用
根据“材料与方法”所述，本发明人验证了lncRNA H19在hASC外泌体中的作用，结果如下所述：
1.将RNA测序结果分别与人的基因库和大鼠的基因库进行比对，发现在hASC外泌体组的大鼠肝组织中测得人源的长链非编码RNA H19明显上调。因此，发明人推测hASC外泌体很可能通过分泌人的lncRNA H19抑制大鼠凝血功能、药物代谢等通路相关的microRNA的表达，从而上调大鼠凝血功能和药物代谢通路，提高急性肝衰竭大鼠存活率(图7A)。
2.RT-qPCR检测lncRNA H19：RT-qPCR检测可见，沉默H19基因后，hASC外泌体中lncRNA H19的表达量明显下调(图7B)。
3.人肝细胞(HL-7702)体外增殖试验：CCK8检测可见，hASC外泌体可以促进对人肝细胞增殖，而沉默H19基因的hASC外泌体对人肝细胞的增殖没有明显促进作用(图7C)。
4.72h总体生存率：腹腔注射D-gal造模1天后，经髂静脉分别注射hASC外泌体(100μg/只)、沉默H19基因的hASC外泌体(100μg/只)和PBS，72h总体生存率分别为100％、40％和10％；其中，hASC外泌体组与沉默H19基因的hASC外泌体组相比，在不同时间点的生存率对比均表现出显著差异(P﹤0.05)(图7D)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (11)
1.一种脂肪干细胞来源的外泌体，所述外泌体包含蛋白和lncRNA H19，并且所述外泌体具有以下一种或多种特征：
1)所述外泌体的直径为约30-200nm；
2)所述外泌体的平均尺寸约为100nm；
3)所述外泌体的强度约为0.5-6a.u.；
4)所述外泌体的表面具有以下一种或多种特征分子：CD81、ANXA5、ICAM、ALIX、TSG101、FLOT1、CM130、CD63、CD9。
2.如权利要求1所述的脂肪干细胞来源的外泌体，其特征在于，所述外泌体通过以下方法获得：
1)培养获得的脂肪干细胞；
2)收集步骤1)获得的培养液，离心除去细胞和细胞碎片；
3)向步骤2)获得的上清液中加入缓冲液，然后冷藏过夜；
4)将步骤3)得到的混合物离心，除去上清液，从而获得所述外泌体。
3.如权利要求2所述的脂肪干细胞来源的外泌体，其特征在于，所述方法还包括鉴定获得的外泌体的权利要求1所述一种或多种特征。
4.权利要求1-3中任一项所述的脂肪干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)培养获得的脂肪干细胞；
2)收集步骤1)获得的培养液，离心除去细胞和细胞碎片；
3)向步骤2)获得的上清液中加入缓冲液，然后冷藏过夜；
4)将步骤3)得到的混合物离心，除去上清液，从而获得所述外泌体。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括鉴定获得的外泌体的权利要求1所述一种或多种特征的步骤。
6.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-3中任一项所述的脂肪干细胞来源的外泌体以及任选的药学上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是将权利要求1-3中任一项所述的脂肪干细胞来源的外泌体溶解于右旋糖苷溶液得到的液体制剂。
8.一种试剂盒，所述试剂盒装有：
1)权利要求1-3中任一项所述的脂肪干细胞来源的外泌体，或权利要求6或7所述的药物组合物；和
2)任选的使用说明书。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述使用说明书注明将所述的脂肪干细胞来源的外泌体或所述药物组合物给予受试者时，给药量为100-1000μg/kg受试者体重；优选140-800μg/kg受试者体重；最优选500-750μg/kg受试者体重。
10.权利要求1-3中任一项所述的脂肪干细胞来源的外泌体在制备治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病包括但不限于急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化等肝病；所述疾病优选急性肝衰竭。
11.一种疾病的治疗方法，所述方法包括利用权利要求1-3中任一项所述的脂肪干细胞来源的外泌体，或权利要求6或7所述的药物组合物，或权利要求8或9所述的试剂盒来治疗有此需要的对象的步骤，其中所述疾病包括但不限于急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化；优选急性肝衰竭。
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