CN108823159A - Pdgf-bb对间充质干细胞释放的外泌体的影响 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高间充质干细胞分泌的外泌体的数量或性能的方法，所述方法通过在培养间充质干细胞时添加PDGF‑BB或者EPO/PDGF‑BB，使得MSC释放的外泌体数量增加，具有更强的促内皮细胞增殖能力和促血管新生能力。本发明为MSC外泌体应用于临床提供了有力工具。

Description

PDGF-BB对间充质干细胞释放的外泌体的影响
技术领域
本发明涉及外泌体领域，尤其涉及PDGF-BB在改变间充质干细胞释放的外泌体的性能方面的应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一群具有成骨、成软骨和成脂肪功能的成体干细胞。MSC可通过旁分泌的形式，发挥调节免疫、促进血管新生和支持造血等功能。MSC来源丰富，存在于胎盘、脐带、骨髓、脂肪等多种组织中。因此，MSC作为一个药物，已经被多个国家批准，用于移植物抗宿主病、溃疡性结肠炎、心肌梗塞恢复期等疾病的治疗。然而无论静脉输注、肌肉注射或者心肌内注射，外源移植的MSC多在72h内死亡。那么，死亡的MSC又是如何发挥上述作用的呢？既往的研究表明，体外培养的MSC在低氧和血清撤除条件下，可以释放大量的外泌体。这种外泌体在体外可以促进内皮细胞增殖，促使内皮细胞形成毛细血管网状结构，加速缺血模型血流的恢复。事实上，MSC来源的外泌体已经进入临床试验阶段，用于糖尿病和肾功能不全的治疗。因此，MSC来源的外泌体作为“无细胞”细胞治疗的材料，具有潜在的实用价值。为提高治疗效果，探索获取具有更强功能外泌体的途径，对开展MSC外泌体的临床试验研究是十分必要的。
既往的资料表明，血小板衍生生长因子BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)是人MSC增殖必需的生长因子之一。红细胞生成素(erythropoietin，EPO)能促使MSC分泌肝细胞生长因子，而后者是已知的具有很强促血管新生的因子。因此，本文将探讨EPO和PDGF-BB是否能刺激MSC释放外泌体，以及这种外泌体是否具有更强的促血管新生功能。本文结果表明，EPO和PDGF-BB促使MSC释放功能更强的外泌体，为MSC来源的外泌体的临床试验研究，提供了有益的资料。
发明内容
本发明提供了一种提高间充质干细胞分泌的外泌体的数量或性能的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将MSC悬浮于MSC无血清培养基中，接种于培养皿，培养过夜使细胞贴壁；(2)去除培养基，换用α-MEM培养基，仅加入PDGF-BB，或者同时加入PDGF-BB和红细胞生成素(EPO)，继续培养72h；(3)收集上清，离心去除细胞碎片，经滤膜过滤，离心收集沉淀，将沉淀悬浮于缓冲液中，即获得数量和性能提高的外泌体。
优选地，所述性能是指外泌体的促内皮细胞增殖能力和促血管新生能力。
优选地，其中步骤(1)中按照5×106细胞/皿接种于培养皿。
优选地，其中步骤(2)中EPO的浓度为1U/ml，PDGF-BB的浓度为50ng/ml。
优选地，其中步骤(3)中去除细胞碎片的离心条件为1500g，30min，滤膜过滤后的离心条件为100,000g，离心1h。
优选地，其中步骤(3)中将沉淀悬浮于含5mmol/L KCl，1mmol/L MgCl2和136mmol/L NaCl的缓冲液中。
优选地，所述间充质干细胞是人脐带MSC。
本发明还提供PDGF-BB在提高间充质干细胞分泌的外泌体的数量或性能方面的应用，其中所述性能是指外泌体的促内皮细胞增殖能力和促血管新生能力。
本发明还提供PDGF-BB在制备提高间充质干细胞分泌的外泌体的数量或性能的试剂中的应用，其中所述性能是指外泌体的促内皮细胞增殖能力和促血管新生能力。
优选地，PDGF-BB和EPO同时使用。本发明具有以下积极效果：
本研究发现，经PDGF-BB、EPO刺激后，MSC释放的外泌体数量增加，其具有更强的促内皮细胞增殖能力和促血管新生能力。该研究为MSC外泌体应用于临床，提供了必要的信息和有力的工具。
附图说明
图1为人间充质干细胞释放的微粒的形态观察：将MSC培养上清经超高速离心收获微粒，投射电镜观察。Bar:200nm.
图2.为来自人间充质干细胞的微粒的表面分子表达分析：收集间充质干细胞上清液中的微粒、与CTR、CD9、CD63、CD81抗体反应。X轴是相对荧光强度，Y轴是计数。
图3为不同培养条件的MSC分泌的外泌体对内皮细胞增殖的影响：人脐带内皮细胞的培养基中加入不同培养条件下MSC分泌的外泌体，MTT试验观察其增殖情况。Y轴：OD490nm。结果来自两次独立实验。Untreated为加未刺激外泌体的实验组，PDGF-BB为加PDGF-BB刺激MSC外泌体的实验组，PDGF-BB+EPO为同时加入PDGF和EPO刺激MSC外泌体的实验组。
图4为不同培养条件的MSC分泌的外泌体对内皮细胞网状结构形成的影响：Untreated为加未刺激外泌体的实验组，PDGF-BB为加PDGF-BB刺激MSC外泌体的实验组，PDGF-BB+EPO为同时加入PDGF和EPO刺激MSC外泌体的实验组。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
试剂与仪器
人MSC无血清培养基购自北京三有利生物技术有限公司。乙酰化乳胶珠(直径3.9μm)为美国Invitrogen公司产品。FITC标记的小鼠抗人CD9，CD63和CD81单克隆抗体均为美国Becton Dicbnson公司产品。电子显微镜为Hitachi H.7650，超高速离心机为美国Beckman公司产品。流式细胞仪FACSCalibur为美国BD公司产品。
实施例1：人脐带MSC的培养及鉴定
人脐带标本来源于解放军总医院正常分娩胎儿，由产妇自愿捐献，标本应用符合伦理委员会制定的人标本实验应用规范。按人MSC无血清培养基操作说明书提供的方法进行。简言之，收集人脐带，去除外膜及其中动静脉，剪碎后加入终浓度为0.2％的I型胶原酶，37℃消化过夜。之后，加入终浓度为0.05％胰蛋白酶，室温反应1h。离心收集消化细胞，接种于直径为150mm的培养皿中。1周后去除非贴壁细胞，并消化传代。取第3代细胞用于下述实验。按照实验室常规方法，对细胞进行形态学观察、表面分子特征检测、体外成骨与成脂分化鉴定，证实所获得细胞符合人MSC特点。
实施例2：MSC来源外泌体的制备和鉴定
1、外泌体的制备
胰蛋白酶消化法收获第三代人脐带MSC，计细胞数，悬浮于人MSC无血清培养基中，按照5×106细胞/皿接种于直径为150mm的培养皿中，37℃，5％CO2，95％湿度下培养过夜使细胞贴壁。去除培养基，换用α-MEM培养基，并单独加入PDGF-BB(50ng/ml)，或者同时加入PDGF-BB(50ng/ml)和EPO(1U/ml)，继续培养72h。收集上清，离心(1500g，30min)去除细胞碎片。直径为0.22μm滤膜过滤培养上清，以去除可能存在的凋亡小体等微粒。4℃条件下离心，100,000g，离心1h，收集沉淀。将沉淀悬浮于含5mmol/L KCl，1mmol/L MgCl2，136mmol/LNaCl溶液中，同上离心洗涤2次以去除残存的蛋白质。将沉淀悬浮于上述缓冲液中，Bradford方法测定蛋白质浓度。分装，储存于-80℃备用。本研究所用外泌体来源于三个样本培养的MSC。
结果：将MSC培养上清经0.22μm滤膜过滤后，超高速离心收获微粒。投射电镜观察发现，所获得的微粒平均大小为80μm左右，呈中空的囊性结构，符合外泌体的形态学特点(图1)。表明利用超高速离心法，可获得MSC来源的外泌体。
2、外泌体的鉴定
按文献提供的方法，利用流式细胞术进行外泌体表面分子表达分析。简言之，将乳胶珠用MES缓冲液洗涤，与外泌体结合过夜。经洗涤后加入甘氨酸封闭，再次洗涤后加入FITC标记的小鼠抗人CD9，CD63和CD81单克隆抗体。室温反应20分钟后洗涤，流式细胞仪(FACS-Calibur，BD)收集至少10,000个数据点。利用WinMdi2.9软件分析结果。按照上述文献提供的方法，利用透射电镜观察所获得外泌体的形态，并在10,000倍放大倍数下拍照。
WinMdi软件分析显示，该方法获取的微粒均一表达CD9，CD63和CD81。结果证实，通过超高速离心所获得的微粒为外泌体(图2)。
实施例3：生长因子对MSC分泌的外泌体的影响
生长因子处理MSC以影响其分泌的外泌体的方式(PDGF-BB、EPO)同实施例2。
1、蛋白质含量测定
为初步了解生长因子处理后，人脐带MSC释放外泌体数量的变化。收集上清用于外泌体分离纯化，同时，胰蛋白酶消化后计细胞数。利用Bradford法测定外泌体中蛋白含量，并推算108个细胞所释放外泌体的数量。结果表明，未刺激组、PDGF-BB组和EPO/PDGF-BB组外泌体蛋白含量，分别为256±124μg/108细胞、830±265μg/108细胞和2207±733μg/108细胞，经PDGF-BB或EPO/PDGF-BB刺激后，人脐带MSC释放外泌体的数量显著增加(P<0.01)。此外，EPO联合PDGF-BB刺激组含量，明显高于PDGF-BB单独刺激组(P<0.01)。结果提示，PDGF-BB或EPO/PDGF-BB处理均可促使MSC释放外泌体。
2、MTT实验
利用MTT实验观察不同来源MSC外泌体对内皮细胞增殖的影响。人脐带内皮细胞由军事医学科学院放射与辐射医学研究所实验血液学研究室提供。按照常规方法进行MTT实验。简言之，按照2000个细胞/孔，将人脐带内皮接种于96孔板中。培养体系中分别加入未经细胞因子处理的外泌体，PDGF-BB处理MSC分泌的外泌体，以及PDGF-BB和EPO同时处理MSC分泌的外泌体，外泌体的浓度均为10μg/ml，每组3个复孔。培养72h后，加入MTT，继续培养4h。之后，加入二甲基亚砜。测定490nm光密度值。
结果如图3所示。MSC经PDGF-BB或EPO/PDGF-BB处理后，与未经处理的对照组比较，其释放的外泌体具有更强的促内皮细胞增殖活性。PDGF-BB或EPO/PDGF-BB组OD值均显著高于未处理组(P<0.05)。上述结果提示，经PDGF-BB或EPO/PDGF-BB处理后，MSC所释放的外泌体具有更强的促内皮细胞增殖能力。
3、毛细血管样结构形成实验
Matrigel实验是观察内皮细胞功能，尤其是毛细血管网形成能力的经典技术，其结果代表体内新生血管形成活性。为探讨不同来源外泌体的促血管新生作用，本研究将内皮细胞接种于Matrigel铺板的培养板中，体系中加入10μg/ml的外泌体，24h后计数每高倍视野下网状结构数目。具体的，按文献报道的方法进行:将脐带内皮细胞悬浮于含1％胎牛血清的DMEM培养基中，按照105/孔接种于Matrigel铺板的24孔板中。实验分为未加外泌体阴性对照组、加未刺激外泌体组、PDGF-BB刺激MSC外泌体组和EPO/PDGF-BB刺激MSC外泌体组，每组3个复孔。培养24h后按文献方法计数。
结果发现，未刺激组、PDGF-BB组和EPO/PDGF-BB组每视野网状结构数量分别为2.6±0.84、4.2±0.78和6.3±1.34，细胞生长因子处理组均显著高于未处理组(P<0.01)，而且，混合因子处理组高于单因子处理组(P值均小于0.01)。上述结果提示，经PDGF-BB或EPO/PDGF-BB刺激后，MSC所释放的外泌体具有更强的促血管新生能力。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种提高间充质干细胞分泌的外泌体的数量或性能的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将MSC悬浮于MSC无血清培养基中，接种于培养皿，培养过夜使细胞贴壁；(2)去除培养基，换用α-MEM培养基，仅加入PDGF-BB，或者同时加入PDGF-BB和红细胞生成素(EPO)，继续培养72h；(3)收集上清，离心去除细胞碎片，经滤膜过滤，离心收集沉淀，将沉淀悬浮于缓冲液中，即获得数量和性能提高的外泌体。
2.如权利要求1所述的方法，所述性能是指外泌体的促内皮细胞增殖能力和促血管新生能力。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤(1)中按照5×106细胞/皿接种于培养皿。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤(2)中EPO的浓度为1U/ml，PDGF-BB的浓度为50ng/ml。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤(3)中去除细胞碎片的离心条件为1500g，30min，滤膜过滤后的离心条件为100,000g，离心1h。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤(3)中将沉淀悬浮于含5mmol/L KCl，1mmol/LMgCl2和136mmol/L NaCl的缓冲液中。
7.如权利要求1或2所述的方法，所述间充质干细胞是人脐带MSC。
8.PDGF-BB在提高间充质干细胞分泌的外泌体的数量或性能方面的应用，其中所述性能是指外泌体的促内皮细胞增殖能力和促血管新生能力。
9.PDGF-BB在制备提高间充质干细胞分泌的外泌体的数量或性能的试剂中的应用，其中所述性能是指外泌体的促内皮细胞增殖能力和促血管新生能力。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于PDGF-BB和EPO同时使用。
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