JP2019004908A - 脂肪由来幹細胞作製システムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】治療上有効な量の脂肪由来幹細胞を生成するために脂肪組織を抽出および処理するシステム、並びに脂肪由来幹細胞の作製方法。【解決手段】無菌組織入口継手と、少なくとも1つの無菌処理流体入口継手と、無菌吸引継手と、第1の抽出管に接続される少なくとも1つの無菌抽出継手とを有する第1の遠心管と、少なくとも1つの無菌処理流体入口継手と、無菌吸引継手と、第2の抽出管に接続される少なくとも1つの無菌抽出継手とを有し、前記少なくとも1つの無菌処理流体入口継手を経由して前記第1の遠心管の前記少なくとも1つの無菌抽出継手のうちの1つに可逆に接続される第2の遠心管とを備えるシステム、及び該システムに係る脂肪由来幹細胞の作製方法。【選択図】なし
Description
(関連出願)
本願は、2011年7月8日に提出された米国仮特許出願第61/505,936号の「脂肪由来幹細胞の作成用キット」に優先権を主張し、引用によりその明細書全文を本願に組み込む。
本願は、2011年7月8日に提出された米国仮特許出願第61/505,936号の「脂肪由来幹細胞の作成用キット」に優先権を主張し、引用によりその明細書全文を本願に組み込む。
(技術分野)
本発明は概して、脂肪組織に由来する幹細胞を作製および使用するシステム、該キットを用いて獲得される脂肪由来幹細胞、該脂肪由来幹細胞の使用方法、該脂肪由来幹細胞を含む組成物に関する。
本発明は概して、脂肪組織に由来する幹細胞を作製および使用するシステム、該キットを用いて獲得される脂肪由来幹細胞、該脂肪由来幹細胞の使用方法、該脂肪由来幹細胞を含む組成物に関する。
再生医療とは、身体の再生機構を通常の治癒機構の一部ではない形で用いて、あるいは通常の機構を人為的に増強させることによって、臨床的に利用することと定義できる。このプロセスの従来例の1つが骨髄移植であり、骨髄移植では、造血幹細胞と前駆細胞がドナーから採取され、正常な血液再生機構が失われた、あるいはほぼ枯渇または損傷したレシピエントに移植されることによってレシピエントの造血機能を回復させるまたは再生する。このアプローチは、複数の治療または予防目的で、様々な供給源からの非造血幹細胞にも広く適用されている。具体的には、脂肪組織を、治療または予防用途に適した多能性間葉系幹細胞のソースとして容易に利用できることが実証されている。
間葉系幹細胞(「MSC」)は、骨芽細胞、収縮性細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、内皮細胞、β膵島細胞などの細胞に容易に分化させることのできる多能性幹細胞である(Pittenger,et al.、「Science」第284巻143ページ(1999);Haynesworth,et al.、「Bone」第13巻69ページ(1992);Prockop、「Science」第276巻71ページ(1997))。MSCは文献では骨髄幹細胞、骨格筋幹細胞、多能性間葉間質細胞としても知られ、成人組織から分離される非造血前駆細胞であり、各種刺激に反応して軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞などの様々な間葉性由来細胞に分化する能力を保持しつつ、中立状態で生体外で幅広い増殖機能も有することを特徴とする。試験管内研究が実証するように、MSCは筋肉や(Wakitani,et al.、「Muscle Nerve」第18巻1417ページ(1995))、ニューロン様前駆体や(Woodbury,et al.、「J. Neurosci. Res.」第69巻908ページ(2002);Sanchez−Ramos,et al.、「Exp. Neurol.」第171巻109ページ(2001))、心筋細胞や(Toma,et al.、「Circulation」第105巻93ページ(2002);Fakuda、「Artif. Organs」第25巻187ページ(2001))、その他の種類の細胞に分化することができる。MSCは、胚子中胚葉から生じる身体内の複数組織(たとえば、造血細胞と結合組織)に存在する。このため、多能性細胞はこうした組織供給源のいずれからも分離し、これらの細胞種のいずれにも分化させることができる。
脂肪組織が手頃に手に入るのが脂肪吸引手術である。事実、大量の多能性細胞を、脂肪組織からの単純な吸引、たとえば審美的処置で吸引した脂肪組織サンプルから取得することができる。本発明は特に、脂肪組織からMSCを分離するシステムに関する。本明細書で使用される「脂肪組織」とは、脂肪細胞や微小血管細胞などの複数の種類の細胞を含む組織を指す。脂肪組織は幹細胞と内皮前駆細胞を含む。したがって、脂肪組織は、脂肪を貯蔵する結合組織も含めた脂肪を指す。
脂肪組織は幹細胞をとりわけ豊富に含むことが発見されている。このことが発見された理由の1つは、脂肪組織の主な非幹細胞成分である脂肪細胞が容易に除去できることである。ただし、当該技術において既知なシステムおよび方法によると、多能性細胞を分離する脂肪組織処理と、その結果生じる幹細胞群の増殖および(任意で)分化は、高額な専門機器および同等に高額な特殊工程を要する。ヒトの生体からの脂肪吸引で得た脂肪組織から幹細胞を繰り返し抽出するための特注装置にかかる費用のせいで、治療目的での幹細胞の豊富な媒体の使用は大病院や研究施設にとどまっている。したがって、小規模の医院やその他の専門施設での脂肪由来幹細胞治療は不可能であるか、不経済である。さらに、幹細胞由来の美容向上技術の使用も、脂肪組織から幹細胞を抽出および培養する現行のシステムおよび方法の高コストと低可用性によって阻まれている。
求められるのは、純粋な形態であっても、幹細胞が豊富な媒体の一部であっても、治療または美容面で有効な量の脂肪由来幹細胞を経済的かつ安全に抽出する技術とシステム、特に、特殊施設への設備投資を必要とせず、小規模な専門施設での使用に適した技術とシステムである。
発明者は、上述した技術に伴う課題に対処する脂肪由来幹細胞の作製のシステムと各種方法を考えつき、実現するに至った。ヒトの脂肪組織由来の細胞集団は、治療および美容用途の細胞の供給源として利用することができる。とりわけ、脂肪由来幹細胞は、純粋な形態(幹細胞のみ)または濃縮された形態(脂肪組織の生体内で発生する細胞に対して幹細胞を増強した細胞培養)のいずれかで、再生細胞により改善または回復が見込める疾病の治療を含む再生医療に使用することができる。作製した細胞集団は他の脂肪細胞や結合組織を伴わずに患者に投与してもよいし、本明細書に記載するように脂肪組織に混ぜて濃縮して投与してもよい。本発明は、脂肪組織から脂肪由来の間葉系幹細胞の精製画分を取得し、精製画分をヒトまたは動物の患者に再び投与するシステムに関する。本発明は、脂肪組織(吸引脂肪組織)を抽出し、それを処理して、0.1%以上、より一般的には0.5%以上の幹細胞を含有する処理済み吸引脂肪組織(PLA)を生成するシステムを提供する。いくつかの実施形態によると、幹細胞を約2〜12%含むPLAを取得することができ、本発明によると、最大100%幹細胞を含むPLAが可能である。
本発明は、臨床環境で脂肪由来間葉系幹細胞のほぼ精製もしくは濃縮された画分を取得するシステム、ならびに、治療、構造、もしくは美容上の恩恵を助長、生成、または支援するのに必要な添加物と共に、レシピエントに直接配置される脂肪組織由来幹細胞を使用する組成物、方法、システムに関する。本発明の実施形態は、患者に再導入する治療上有効な量の脂肪由来幹細胞を生成するために脂肪組織を抽出および処理する多構成要素システムである。有益なことに、該システムは完全な手術室環境や本格的な規模の脂肪吸引を必要としないため、病院や研究所外の環境でも動作させることができる。したがって、該システムは小中規模の医院、外来患者外科センター、複数の分野を備えた病院に適する。
一実施形態によると、Mini−SystemTMシステムと呼ばれるシステムによって、小規模な医院や外科センターでも、治療または凍結保存(バンキング)のために患者の脂肪組織からMSCを安全に抽出する手頃な価格の方法を採用することができる。該システムは、小量の脂肪サンプルを吸引脂肪組織として抽出する安全で無菌の閉工程(たとえば脂肪吸引)を実行する手段と、MSCのオンサイト処理および精製のための材料と、任意で、結果として生じる処理済み吸引脂肪組織の品質評価を支援するツールと、を備える。該システムは、研究所の技術者によって、適切な訓練で教示される簡易な方法ステップに従い動作可能である。
一実施形態によると、脂肪組織の処理は、閉鎖された無菌の流体/組織経路を保持するシステムにおいて実行される。これは、組織および流体成分を閉経路内で移送できる無菌容器および配管のキットを使用して達成される。一連の処理試薬(たとえば、塩水や酵素など)を無菌容器への投入用に事前に包装した形態で提供して、試薬の追加、ならびに処理の温度とタイミングの制御を簡易化することによって、オペレータの手動工程管理を合理化することができる。好適な実施形態によると、組織抽出から処理を経てレシピエントへの配置までの手順全体が単独の施設内で、実際には、本発明による施術を受ける患者の部屋でも実行される。
本発明の1側面によると、小量の未処理脂肪組織が患者からキットの無菌容器へと抽出される。未処理脂肪組織はキットの一または複数の無菌容器内で処理されて、成熟した脂肪細胞と結合組織をほぼ除去することによって、レシピエントの体内に配置するのに適した異種の複数の脂肪組織由来細胞を獲得する。脂肪組織の処理に必要な試薬はキットの一部として提供され、所定のスケジュールに従い一または複数の無菌容器に導入されて、所望濃度の脂肪由来幹細胞を含む処理済み吸引脂肪組織を生成する。その後、脂肪由来幹細胞、または生体内よりも幹細胞画分を豊富に含む濃縮された変形吸引脂肪組織は、その他の細胞、組織、組織断断片、またはその他の細胞の成長および/または分化のための刺激薬と組み合わせてレシピエントに配置してもよい。好適な一実施形態によると、幹細胞は、上述の添加物と共に、治療、構造、または美容上の恩恵をレシピエントにもたらすために単一の施術で幹細胞を取得したヒトへ戻される。
本発明の一実施形態では、患者の治療方法は、a)キットの構成要素として使い捨て組織除去システムを提供するステップと、b)使い捨て組織除去システムを使用して、ある濃度の幹細胞を有する脂肪組織を患者から除去するステップと、c)キットの一または複数の無菌容器内で脂肪組織の少なくとも一部を処理して、処理前濃度よりも高い濃度を有する幹細胞を取得するステップと、d)キットの無菌容器から患者に幹細胞を投与するステップと、を含む。
本発明の好適な一実施形態によると、脂肪組織を抽出および処理して治療上有効な量の脂肪由来幹細胞を生成するシステムは、脂肪組織抽出装置と、複数の吸引脂肪組織入口継手と複数の処理流体入口継手と複数のペレット抽出管とを有する変形遠心管と、を備える。脂肪組織抽出装置を使用して、ヒトからある量の脂肪組織を抽出し、吸引脂肪組織が無菌移送を介して第1の変形遠心管まで移送され、複数の処理ステップを実行して吸引脂肪組織を浄化および解離し、変形遠心管の遠心分離によって幹細胞画分が増加したペレットを取得する。ペレットは流体に再懸濁され、治療または美容目的でヒトの患者に投与される。別の実施形態によると、該システムは第1の変形遠心管と略同様の設計の第2の変形遠心管をさらに備え、第2の変形遠心管を使用して再懸濁されたペレットをさらに処理して高濃度の幹細胞を実現する。
本発明の別の好適な実施形態によると、脂肪由来幹細胞の作製方法は、(a)脂肪組織抽出装置を使用してヒトから脂肪組織を除去するステップと、(b)吸引脂肪組織を、複数の吸引脂肪組織入口継手と複数の処理流体入口継手と複数のペレット抽出管とを有する変形遠心管まで無菌移送するステップと、(c)複数の処理流体継手を介して一または複数の流体を追加することによって変形遠心管内の吸引脂肪組織を処理するステップであって、吸引脂肪組織の浄化と解離のうち一または複数を含むステップと、(d)濃縮幹細胞画分を有するペレットの濃縮のため、処理済み吸引脂肪組織を収容した変形遠心管を遠心分離するステップと、(e)最初の吸引脂肪組織の幹細胞濃度よりも幹細胞が濃縮された細胞混合物を得るため、ペレットを流体に再懸濁するステップと、(f)治療または美容目的で再懸濁した細胞混合物をヒトに投与するステップと、を含む。
本発明のこれらのおよびその他の目的、特徴、利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。
添付図面は本発明のいくつかの実施形態を示し、明細書と共に、実施形態による本発明の原理を説明する役割を果たす。当業者であれば、図面に示す特定の実施形態は単に例であり、本発明の範囲を限定する意図がないことを理解しているであろう。
発明者は、上述の技術が有する課題および問題に対処する、脂肪由来幹細胞の作製のシステムおよび各種方法を考えつき、実現するに至った。添付図面に示すいくつかの例示の実施形態を参照して、様々な方法を以下詳細に説明する。以下の説明では、本明細書に記載または言及する一または複数の側面および/または特徴を十分に理解してもらうため、様々な細部を具体的に説明する。
しかしながら、当業者にとっては、本明細書に記載または言及する一または複数の側面および/または特徴は、こうした具体的な細部の一部または全部を設けなくても実現し得ることは自明であろう。なお、本明細書に記載または言及する側面および/または特徴を不明瞭にしないため、周知の工程ステップおよび/または構造は詳述しない。
しかしながら、当業者にとっては、本明細書に記載または言及する一または複数の側面および/または特徴は、こうした具体的な細部の一部または全部を設けなくても実現し得ることは自明であろう。なお、本明細書に記載または言及する側面および/または特徴を不明瞭にしないため、周知の工程ステップおよび/または構造は詳述しない。
一または複数の異なる発明を本願に記載する場合がある。さらに、本願に記載の発明のうち一または複数に関して、その他多くの実施形態を記載することができる。これらの実施形態は単に例示のために提示するものである。記載の実施形態はいかなる意味でも限定することを目的としていない。本発明の一または複数は、本開示から容易に自明であるように、多数の実施形態に広く適用可能である。概して、実施形態は、当業者が一または複数の発明を実施できるように詳細に記載してあるが、その他の実施形態も利用でき、特定の発明の範囲を逸脱することなく構造、論理、ソフトウェア、電気上およびその他の変更を加えることができると理解すべきである。
したがって、当業者であれば、本発明の一または複数を様々な修正と変更を加えて実施できることを認識しているであろう。一または複数の本発明の特徴は、本開示の一部を成す一または複数の特定の実施形態または図面を参照して説明することができ、例示のため一または複数の発明の具体的な実施形態を例示する。しかしながら、このような特徴は、その特徴を説明する一または複数の特定の実施形態または図面での使用に限定されないと理解すべきである。本開示は一または複数の発明のすべての実施形態の逐語的な説明でもなければ、すべての実施形態に存在しなければならない一または複数の発明の特徴のリストアップでもない。
したがって、当業者であれば、本発明の一または複数を様々な修正と変更を加えて実施できることを認識しているであろう。一または複数の本発明の特徴は、本開示の一部を成す一または複数の特定の実施形態または図面を参照して説明することができ、例示のため一または複数の発明の具体的な実施形態を例示する。しかしながら、このような特徴は、その特徴を説明する一または複数の特定の実施形態または図面での使用に限定されないと理解すべきである。本開示は一または複数の発明のすべての実施形態の逐語的な説明でもなければ、すべての実施形態に存在しなければならない一または複数の発明の特徴のリストアップでもない。
本特許出願に設けられる項の見出しと本特許出願の標題は便宜上付したものであり、本開示を限定するように解釈すべきではない。
相互に連絡する複数の構成要素を備えた一実施形態を記載したからといって、それらすべての構成要素が必須であるというわけではない。逆に、一または複数の発明の幅広い可能な実施形態を例示し、発明の一または複数の側面をより深く説明するため、様々な任意の構成要素を記載してもよい。同様に、工程ステップ、方法ステップ、アルゴリズムなどを順番に記載してもよいが、一般的にはそのような工程、方法、アルゴリズムは特に断りのない限り、別の順序で実行されるように構成してもよい。言い換えると、本特許出願に記載されるステップのシーケンスや順番は、それ自体、ステップがその順序で実行されることを示すものではない。記載される工程ステップは、実行可能な任意の順序で実行してもよい。さらに、いくつかのステップは、(たとえば、あるステップが別のステップの後に記載されることで)異なる時点で実行されるように記載または示唆されるとしても、同時に実行してよい。また、工程が図面で描写される場合、例示の工程に他の変形や修正が許されない、図示される工程またはそのステップが一または複数の発明にとって必須である、図示される工程が好ましい、などということを示唆するものではない。また、通常、ステップは一実施形態につき1回だけ説明するが、ステップは1回のみ行わなければならない、あるいは工程、方法、またはアルゴリズムが実行される度に1回だけ行われるという意味ではない。いくつかのステップはいくつかの実施形態または場合に省略してもよい、あるいは、いくつかのステップは所与の実施形態または場合に2回以上実行してもよい。
単独の装置または物を説明する際、単独の装置または物の代わりに2つ以上の装置または物を使用してもよいことは自明である。同様に、2つ以上の装置または物を説明する際、2つ以上の装置または物の代わりに単独の装置または物を使用してもよいことは自明である。
装置の機能または特徴は、上記機能または特徴を有すると明示されていないその他の一または複数の装置によって具体化されてもよい。したがって、一または複数の発明のその他の実施形態は装置自体を含む必要はない。
本願で記載または言及する方法や機構は、明瞭化のために単数形で記載する場合がある。ただし、特定の実施形態は特に断りのない限り、方法または機構の複数の繰り返しを含む。図面内の工程の説明またはブロックは、モジュール、セグメント、または工程における具体的な論理機能またはステップを実行するための一または複数の実行可能な指示を含むコードの部分を表すと理解すべきである。順序を変えて実行することも本発明の実施形態の範囲に含まれる。たとえば、当業者によって理解されるように、略同時に、または逆の順序で、など、含まれる機能に応じて図示または記載される順序から外れて機能を実行してもよい。
本願に記載の特徴または特徴の組み合わせは、上記組み合わせに含まれる特徴が状況、本明細書、当業者の知識に照らし見て自明であるように、相互に相反することがない限り、本発明の範囲に含まれる。本発明を概説するため、本発明の特定の側面、利点、新規な特徴を本願において説明した。当然ながら、上記の側面、利点、または特徴はいずれも必ずしも本発明の特定の実施形態において具体化されるわけではないと理解すべきである。本発明の追加の利点と側面は以下の詳細な説明と請求項から明らかである。
いくつかの刊行物と特許をここで紹介した。上述の刊行物と特許はそれぞれ全文を引用により本願に組み込む。本願で引用した刊行物、特許、特許出願はすべて、個々の刊行物、特許、または特許出願が引用により全文を組み込まれるように明確かつ個別に指摘されるのと同様、引用により全文を本願に組み込む。
定義
本明細書で使用される「脂肪組織の単位」は脂肪組織の個々の量、または測定可能な量を指す。脂肪組織の単位は、該単位の重量および/または体積を判定することによって測定することができる。上述のデータに基づき、患者から除去した1単位の処理済み吸引脂肪組織は、細胞組成の0.1%以上が幹細胞である細胞組成を有する。本開示を参照すると、脂肪組織の単位は、患者から除去した脂肪組織の全量、または患者から除去した脂肪組織の全量よりも少ない量を指すことができる。よって、1単位の脂肪組織と別の単位の脂肪組織とを結合して、個々の単位の合計である重量または体積を有する脂肪組織の単位を形成することができる。
本明細書で使用される「脂肪組織の単位」は脂肪組織の個々の量、または測定可能な量を指す。脂肪組織の単位は、該単位の重量および/または体積を判定することによって測定することができる。上述のデータに基づき、患者から除去した1単位の処理済み吸引脂肪組織は、細胞組成の0.1%以上が幹細胞である細胞組成を有する。本開示を参照すると、脂肪組織の単位は、患者から除去した脂肪組織の全量、または患者から除去した脂肪組織の全量よりも少ない量を指すことができる。よって、1単位の脂肪組織と別の単位の脂肪組織とを結合して、個々の単位の合計である重量または体積を有する脂肪組織の単位を形成することができる。
本明細書で使用される「一部」は、物質の全体量よりも少ない量を指す。小部分は50%よりも少ない量を指し、大部分は50%よりも多い量を指す。よって、患者から除去される脂肪組織の全体量より少ない脂肪組織の単位は、除去される脂肪組織の一部である。
本明細書で使用される「幹細胞」は、他の様々な種類の細胞に分化することができ、一または複数の特定の機能を備え、自己再生能力を有する多能性細胞を指す。本明細書に開示する幹細胞のいくつかは多能性としてよい。
本明細書で使用される「処理済み吸引脂肪組織」(PLA)は、成長した脂肪細胞および結合組織から活性細胞成分(たとえば、幹細胞を含有する成分)を分離する処理を終えた脂肪組織を指す。通常、PLAは、脂肪組織の細胞の洗浄および分離によって得られる細胞のペレットを指す。通常、ペレットは、細胞が遠心分離機の底に集積するように細胞の懸濁液を遠心分離機にかけて得られる。
本明細書で使用される「予防的または治療的に有効な量」という用語は、所望の治療効果を生み出し得る医薬組成物における本発明の細胞の含有量を指す。当業者であれば、細胞数(たとえば、投与量)は、投与部位、疾病の程度、投与方法などを含むがそれらに限定されない複数の要因に応じて変動することを理解しているだろう。
造血幹細胞(レシピエントの血球形成能力の再生に使用される骨髄または臍帯血由来の幹細胞)に関する経験から判断すると、移植は閾値効果で細胞用量に依存する。よって、おそらくは、「多いほど良い」という一般原則が他の変数によって設定される限度内で適用され、採取では実現可能な限り多くの組織が回収される。本願に開示する細胞は、患者の症状や反応に応じて、治療に当たる医師またはその他の医療従事者が必要と決定する日、週、または月毎に繰り返して投与することができる。
造血幹細胞(レシピエントの血球形成能力の再生に使用される骨髄または臍帯血由来の幹細胞)に関する経験から判断すると、移植は閾値効果で細胞用量に依存する。よって、おそらくは、「多いほど良い」という一般原則が他の変数によって設定される限度内で適用され、採取では実現可能な限り多くの組織が回収される。本願に開示する細胞は、患者の症状や反応に応じて、治療に当たる医師またはその他の医療従事者が必要と決定する日、週、または月毎に繰り返して投与することができる。
「薬理上許容可能なビヒクル」という用語は、ヒトを含む動物での使用のために、連邦政府または州政府の監督機関によって認可された、あるいは米国薬局方、欧州薬局方、またはその他の一般的に認知された薬局方に記載された組成物を指す。「ビヒクル」という用語は、本発明の細胞と共に投与される希釈剤、補助剤、添加剤、または担体を指す。よって、ビヒクルは本発明の細胞と共存できなければならない。所望すれば、医薬組成物は必要に応じて、上記医薬組成物を含む細胞の治療効果を強化、制御、またはそれ以外の方法で誘導する添加物、および/または少量のpH緩衝剤、張力活性剤、補助溶剤、防腐剤などの補助物質または薬理上許容可能な物質も含有することができる。また、細胞懸濁の安定化のため、金属キレート剤を添加することもできる。液体媒体中で、本発明の医薬組成物は、追加物質、たとえばアスパラギン酸やグルタミン酸などのアミノ酸の添加によってさらに安定化させることができる。
本発明の医薬組成物に使用可能な薬理上許容可能な物質は、概して当業者によって既知であり、細胞組成物の製造の際に一般的に使用されている。適切な薬理ビヒクルの例は、E.W.Martin著「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に紹介されている。本発明の医薬組成物に含有される細胞の投与に適した例示の非限定的ビヒクルは、たとえば無菌食塩水(0.9%NaCl)やPBSなどである。
本発明の医薬組成物に使用可能な薬理上許容可能な物質は、概して当業者によって既知であり、細胞組成物の製造の際に一般的に使用されている。適切な薬理ビヒクルの例は、E.W.Martin著「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に紹介されている。本発明の医薬組成物に含有される細胞の投与に適した例示の非限定的ビヒクルは、たとえば無菌食塩水(0.9%NaCl)やPBSなどである。
(発明を実施するための形態)
脂肪組織から脂肪を採取し処理する装置はこれまでにも多数開発されてきたが、広範な使用を妨げる問題を一または複数抱えている。たとえば、使い難さとコストである。したがって、収量、一貫性、および/または純度の向上した活性細胞集団を迅速かつ確実に作製でき、それによって細胞の抽出後処置の必要性を低減または排除することのできる代替的アプローチが求められている。理想的には、この細胞集団は、レシピエントへの直接移植に適するように獲得される。
脂肪組織から脂肪を採取し処理する装置はこれまでにも多数開発されてきたが、広範な使用を妨げる問題を一または複数抱えている。たとえば、使い難さとコストである。したがって、収量、一貫性、および/または純度の向上した活性細胞集団を迅速かつ確実に作製でき、それによって細胞の抽出後処置の必要性を低減または排除することのできる代替的アプローチが求められている。理想的には、この細胞集団は、レシピエントへの直接移植に適するように獲得される。
本発明の好適な実施形態を以下詳細に説明する。可能なかぎり、図面と明細書において同一または類似の部分には同一または類似の参照符号を付す。なお、図面は簡略的であり、等縮尺ではない。本願の開示に関連して、単に便宜上の明瞭化のために、上部、下部、左、右、上方、下方、真上、上、下、後、前などの方向を表す用語を、添付図面を参照し使用する。このような方向を表す用語は、本発明の範囲を限定するよう解釈すべきではない。
本願の開示は特定の例示の実施形態に言及しているが、これらの実施形態は限定のためではなく例示のために提示されると理解すべきである。例示の実施形態を説明しているが、以下の詳細な説明の目的は、添付の請求項に定義される本発明の精神と範囲に属するように、実施形態のあらゆる修正、代替物、等価物を対象とするものと解釈すべきである。本発明は、当該技術において従来使用されている様々な細胞または組織分離方法と併せて実行することができ、一般的に実行される工程ステップをほんのいくつかを、本発明を理解するのに必要なものとしてここで紹介する。
脂肪組織の抽出および処理システム
本発明の各種実施形態は、臨床環境で脂肪由来間葉系幹細胞の精製画分を取得するシステム300と、治療、構造、もしくは美容上の恩恵をさらに促進、発生、または支援するのに有効な添加剤と共に脂肪組織由来の幹細胞を直接レシピエントに移植する組成物、方法、システムに関する。各種実施形態によると、本発明は、脂肪組織を抽出および処理して、患者への再導入のために治療上有効な量の脂肪由来幹細胞を生成するシステム300を提供し、該システムは、複数の専門分野を備えた小中規模の病院に適した操作が簡単で低コストのシステムである。
本発明の各種実施形態は、臨床環境で脂肪由来間葉系幹細胞の精製画分を取得するシステム300と、治療、構造、もしくは美容上の恩恵をさらに促進、発生、または支援するのに有効な添加剤と共に脂肪組織由来の幹細胞を直接レシピエントに移植する組成物、方法、システムに関する。各種実施形態によると、本発明は、脂肪組織を抽出および処理して、患者への再導入のために治療上有効な量の脂肪由来幹細胞を生成するシステム300を提供し、該システムは、複数の専門分野を備えた小中規模の病院に適した操作が簡単で低コストのシステムである。
図1に示す本発明の好適な一実施形態によると、当該技術において既知な各種付属品と併せて使用される変形遠心管100がシステムまたはキットに備えられることで、小規模の医院のみならず外科センターでも、直接治療または凍結保存(バンキング)用に患者またはドナーの脂肪組織から容易に間葉系幹細胞(MSC)を抽出する方法を手頃な価格で採用することができる。該キットは、脂肪組織の小サンプル吸引のための安全で無菌の閉工程を実行する遠心管100とその他の各種構成要素、MSC画分のオンサイト処理および精製のための構成要素、品質アセスメントのための構成要素、を備える。一般的に、遠心管100を含む該キットは、以下詳述し、適切な訓練下で教示され得る簡易の方法ステップに従う研究所の技術者または類似の資格所持者によって操作可能である。
遠心管100は閉鎖された無菌の流体/組織用経路を保持し、脂肪組織サンプルを収容し、所望に応じて多少濃縮された間葉系幹細胞サンプルを出力する。これは、閉経路内で流体および組織成分の移送を可能にする無菌の容器および配管キットを使用して達成される。また、一連の処理試薬(たとえば、塩水や酵素など)を遠心管100への投入用に事前に包装した形態で提供し、試薬の追加、ならびに処理の温度とタイミングの制御を簡易化することによって、オペレータの工程管理を合理化することができる。好適な一実施形態では、組織抽出から処理を経てレシピエントへの配置までの手順全体が単一の施設内で(実際には、単独の部屋でも、たとえば好ましくは、本発明により取得したMSCを使用する措置を施す患者の部屋で)実行される。
管100は従来設計の本体を備え、該本体は、内部容積160を有し、通常は約10ml〜500mlの様々な寸法で入手でき、図1に示す従来形状の管を使用するように装備された標準的遠心分離機に対応する(しかし、本発明では、当該技術において既知であり、遠心分離機と両立可能な任意の適切な遠心管を使用できる)。
一実施形態では、当該キットまたはシステムは以下の3つの主構成要素:(1)当該技術において既知な耐久的器具セットである吸引ポンプ、攪拌機、遠心分離機、小型培養器;(2)複数の使い捨て器具である吸引ニードル/カニューレ、回収バッグ、注射器、フィルタ、フラスコ、遠心管100;(3)各種処理溶液/試薬、を備える。これらの構成要素は好ましくは、無菌状態を維持し工程を簡略化しつつ、脂肪組織の抽出および処理を促進してMSCを得るため、相互に協働するように構成される。管100には、複数の開口115、120、121、122の貫通するキャップ150と、キャップ150近傍で管100の上部に搭載される別個の継手110とが設けられる(実際には当業者が認識するように、各種継手は管100の上部に固定されつつも様々に配置することができ、継手の一部または全部がキャップ150を貫通してもよいし、どの継手もキャップ150を貫通しなくてもよい。また、事実、キャップ150は使用後に廃棄可能な一体化構造の管100では任意で省略することができる)。継手120には、無菌継手125(たとえばルアーロック)を嵌合した管129が貫通して、管100内の無菌状態を侵さずに各種試薬やその他の流体を、管129を通して導入することができる。通常、流体は、無菌注射器を使用して管129を介して管100内に追加される。管130と131はそれぞれ継手121と122でキャップ150を貫通し、無菌継手126と127がそれぞれ設けられることで、ペレットに含まれる細胞またはその他の物質が遠心分離後に底部(管100の下部を構成する逆円錐の先端)に集積する(遠心分離中の比較的高比重のペレットの作製は当該技術において周知である)。継手126と127はルアーロックなど、当該技術において既知であり、管130、131と注射器または管100の底のペレットから細胞を除去する吸引力を印加することのできるその他の装置との間の無菌接続を確立するのに適した任意の種類のものとしてよい。継手115には、先端に無菌継手117を嵌合させた管116が貫通し、(たとえば、継手110を介した管100への吸引脂肪組織の高速導入を促進するため)管100の上部から吸引力を印加して管100内に真空を確立することができる。継手110は短管またはスタブを介して継手111に接続され、(管100内へ延びる他のすべての継手と同様)常に管100内の無菌状態を維持するのに適する。通常、継手110は、吸引脂肪組織からMSCを抽出し、おそらくは管130と131のいずれかを介して引き出すことのできるペレットへの精製または濃縮工程の最初のステップとして、吸引脂肪組織を管100に注入するために使用される。好適な一実施形態で2つの管131、131が設けられるのは、たとえ一方の管が詰まってもペレット抽出を確保するためである。
図2は、本発明の一実施形態による新規な微粒化手段を備えた、脂肪組織から幹細胞を抽出する変形遠心管200を示す。当業者によって認識されるように、管200は管100と酷似するが、継手125〜127に関してさらに細部を例示している。管116は確実に真空ポンプ220を終端とする(管116とポンプ220間の無菌接続の詳細は図示しないが、当該技術において周知である)。
真空ポンプは、吸引脂肪組織から隔離したMSC用携帯キットの1部品として設けられ、予め管116に無菌接続されている。あるいはより一般的には、真空ポンプは吸引脂肪組織からのMSCの抽出工程中に必要に応じて管116に接続してもよい。概して、本発明の目的は、脂肪組織の分解と細胞の洗浄(細胞を損傷させずに)を、特殊器具を使用することなく効率的に行えるように、管100に入る際に吸引脂肪組織の高速分解を促進することである。したがって、いくつかの実施形態によると、複数の孔211を備えたターボまたはスクリーン210を設けることができ、吸引脂肪組織は継手110を通じて管100に入る際に該孔を通過しなければならない。孔211の存在は、管に入る吸引脂肪組織の少なくとも一部を占める脂肪組織の塊の分解を助ける。なお、吸引脂肪組織は、ポンプ220または管116を介したその他の吸引手段により提供される真空を利用して、あるいは継手110を介した(たとえばプランジャ型の注射器での)直接注入によって管100内に引き込むことができる。いずれにせよ、継手110、次いで孔211を強制的に通過させられる際、吸引脂肪組織は細胞および組織断片の小滴または小塊に分解されて、さらに容易に洗浄される、あるいは本願の他の箇所に記載する方法によって(たとえば図4を参照)処理される。
真空ポンプは、吸引脂肪組織から隔離したMSC用携帯キットの1部品として設けられ、予め管116に無菌接続されている。あるいはより一般的には、真空ポンプは吸引脂肪組織からのMSCの抽出工程中に必要に応じて管116に接続してもよい。概して、本発明の目的は、脂肪組織の分解と細胞の洗浄(細胞を損傷させずに)を、特殊器具を使用することなく効率的に行えるように、管100に入る際に吸引脂肪組織の高速分解を促進することである。したがって、いくつかの実施形態によると、複数の孔211を備えたターボまたはスクリーン210を設けることができ、吸引脂肪組織は継手110を通じて管100に入る際に該孔を通過しなければならない。孔211の存在は、管に入る吸引脂肪組織の少なくとも一部を占める脂肪組織の塊の分解を助ける。なお、吸引脂肪組織は、ポンプ220または管116を介したその他の吸引手段により提供される真空を利用して、あるいは継手110を介した(たとえばプランジャ型の注射器での)直接注入によって管100内に引き込むことができる。いずれにせよ、継手110、次いで孔211を強制的に通過させられる際、吸引脂肪組織は細胞および組織断片の小滴または小塊に分解されて、さらに容易に洗浄される、あるいは本願の他の箇所に記載する方法によって(たとえば図4を参照)処理される。
図3は、本発明の一実施形態による臨床用に脂肪組織から間葉系幹細胞を作製するシステム300を示す。本実施形態によると、上述するような各種構成要素を備えたキットが提供されて、患者301から脂肪組織を抽出することができる(ただし、本実施形態では、システム300を使用して患者ドナー以外も脂肪組織を提供することができる)。上述したように、脂肪組織は当該技術において既知な多くの方法で取得することができる。図3に示す例示の実施形態によると、システム300は、患者301から脂肪組織を取得する際に使用される注射器302と無菌シールバッグ303とを備える。注射器302は、通常は1〜数百ミリリットルの様々な量の脂肪組織を手動吸引で回収するのに適した、従来技術において既知な任意の従来の種類の物を使ってよい。システム300による各種キットは、超音波室305など、脂肪組織を解離させる一または複数の手段を備えてよい。脂肪組織は無菌バッグ303内に保持されたまま超音波室305に配置する、あるいは図示するように無菌管を介して超音波室305を通過させることができる。通常、システム300は少なくとも1つの中型(約100ミリリットル)変形遠心管310(図1および2を参照して上述したような遠心管)を備える。脂肪組織は、管310の内側領域340〜341に真空350を印加する、あるいは無菌管を介して注射器から注入することによって管310に導入することができる。通常、吸引脂肪組織は複数の孔211を開けたターボまたはスクリーン210を通過し、この孔は上述したように、進入する脂肪組織サンプルを、管310内での効率的処理により適した小滴へと分解するのを助ける役目を果たす。いったん吸引脂肪組織サンプルが管310内に配置されると、複数の洗浄剤320または試薬321(たとえば、組織解離を促進する試薬)を、一または複数の無菌継手(図1および2に示すような継手、たとえば継手125)を介してシステム300のキットの一部として設けられる無菌容器から注入してもよい。上述したとおり、管310は遠心分離機内で使用しやすいように構成され(システム300のキットの一部として設けてもよいし、システム300を使用する場所に配置される標準的デスクトップ型またはその他の遠心分離機であってもよい。遠心分離機は従来技術において既知であり、一般的に広範な医療施設で利用できる)、これにより管310内の吸引脂肪組織は、たとえば幹細胞を他の細胞または組織画分から分離するために容易に遠心分離機にかけることができる。通常、管310には一または複数の継手330、331が設けられて、管310の円錐部340の先端で、分離された幹細胞またはペレットに含まれるその他の細胞や物質を除去する。このような継手330、331の例を図1および2に示す(すなわち、管130と131からそれぞれペレット化された物質を引き出す継手126、127)。いくつかの実施形態によると、管310内で(洗浄、解離、遠心分離のいずれかにより)処理された吸引脂肪組織が患者301に直接投与される。他の実施形態によると、システム300は、管310からの除去後に吸引脂肪組織をさらに処理するのに使用可能な第2のより小型の管360を備えてもよい。たとえば、幾分濃縮した吸引脂肪組織(すなわち、最初に患者またはドナー301から採取されたときよりも幹細胞画分が豊富な処理済み吸引脂肪組織)を管360に注入してもよい(または真空350により引き込んでもよい)。管360の容積はたとえば10〜20ミリリットルである(ただし、管310以上の容積を含め、その他の容積を利用してもよく、図示または記載する相対的寸法は単に例示であり、治療プロトコルによって必要な管寸法は異なるため、限定的に解釈すべきではない)。したがって、図3に示すシステム300は例示であり、キット内の様々な装置を図示している。これらの装置は、単一の治療での使用に適したキットにおいて、必要に応じて使用される無菌容器内の各種試薬および洗浄剤と共に構成されるものであり、該治療において吸引脂肪組織が患者301から採取され、キットとして提供されるシステム300の構成要素から成る携帯型の連続無菌環境下で処理され、幹細胞の培養および分化を必要とすることなく同一または別の患者301に投与される。いくつかの実施形態では、当該技術において既知な方法によって、システム300を用いて取得した幹細胞画分を分化し、たとえば、本発明により取得した間葉系幹細胞から分化可能な前駆骨細胞またはその他の前駆細胞種を取得し、培養することが望ましいと考えられる。
脂肪組織の抽出および処理方法
本願に開示する方法を実行する際、患者301に投与する予定の細胞(間葉系幹細胞など)は脂肪組織から取得してもよい。脂肪組織は当業者にとって既知な各種方法により取得することができる。たとえば、脂肪組織は陰圧式脂肪吸引、超音波脂肪吸引、脂肪組織切除によって患者から除去することができる。また、これらの手技は、脂肪組織切除と陰圧式脂肪吸引の組み合わせなどの手技の組み合わせであってもよい。組織またはその断片は患者への再移植を予定されるため、脂肪組織は、細胞組成能力を保持し、バクテリアおよび/またはウィルスなどの伝染性有機物による組織汚染の可能性が最も少ない方法で回収されるべきである。したがって、組織抽出は好ましくは汚染を最小化する無菌または殺菌状態で実行すべきである。
本願に開示する方法を実行する際、患者301に投与する予定の細胞(間葉系幹細胞など)は脂肪組織から取得してもよい。脂肪組織は当業者にとって既知な各種方法により取得することができる。たとえば、脂肪組織は陰圧式脂肪吸引、超音波脂肪吸引、脂肪組織切除によって患者から除去することができる。また、これらの手技は、脂肪組織切除と陰圧式脂肪吸引の組み合わせなどの手技の組み合わせであってもよい。組織またはその断片は患者への再移植を予定されるため、脂肪組織は、細胞組成能力を保持し、バクテリアおよび/またはウィルスなどの伝染性有機物による組織汚染の可能性が最も少ない方法で回収されるべきである。したがって、組織抽出は好ましくは汚染を最小化する無菌または殺菌状態で実行すべきである。
図4は、本発明の一実施形態による臨床用に脂肪組織から間葉系幹細胞を作製する方法の高水準工程400を示す図である。この実施形態によると、ステップ401で、使い捨て組織除去システムとして、処理幹細胞が豊富な脂肪吸引を得るための無菌キットの部品(たとえば、注射器302)が提供される。次に、ステップ402で、技術者、医師、またはその他の専門家が患者(またはドナー)から、当初の幹細胞(特にMSC)濃度を有する脂肪組織を除去する。陰圧式脂肪吸引術の場合、脂肪組織は、患者301の脂肪組織堆積部またはその近傍にカニューレを挿入し、脂肪組織を吸引装置内へ吸引することによって回収することができる。一実施形態によると、小型カニューレを注射器302に接続し、人力で脂肪組織を吸引してもよい。注射器302または類似の装置の使用は、小〜中程度の量の脂肪組織(たとえば、0.1ml〜数百ミリリットルの脂肪組織)を採取するのに望ましい。
陰圧式脂肪吸引は、組織を回収する際に幹細胞の損傷の可能性が最も低い低侵襲性の方法であるため、患者301から脂肪組織を除去するのに望ましい。さらに、当業界における脂肪吸引術の普及のおかげで、ドナーまたは患者から相当量の脂肪組織を除去する確実で安全な技術が開発されている。好適な実施形態によると、該システムは、以後の処理のために脂肪組織を無菌シールバッグに抽出できる使い捨て吸引システムを含む。好ましくは、該システムは小型注射器302などの比較的小さな装置を採用することで、全身麻酔ではなく局所麻酔のみ(または麻酔無し)で脂肪吸引を実行できるという利点をさらに備える。
患者から除去した脂肪組織は、以後の処理のために無菌容器(無菌シールバッグ303など)に回収してもよい。本明細書に記載するように、一実施形態では、幹細胞および/または内皮前駆細胞を含む処理済み脂肪組織細胞集団の製造のために組織を回収するための専用装置が設計される。好適な一実施形態によると、該装置は、患者から脂肪組織を無菌シールバッグ303に抽出する使い捨て吸引システムである。別の実施形態によると、該装置は、抽出手順を実行する医師が組織回収のために通常使用する任意の従来の装置であってもよい。
ふつうはごく少量の脂肪組織しか必要とされないため、本発明の有用性は多量の脂肪組織を有する個人に限定されない。回収される組織の量は、ドナーの体容積指数、アクセス可能な脂肪組織採取部位の可用性、付随する薬物治療や症状(抗凝血剤療法など)、脂肪組織回収の臨床目的などを含むがそれらに限定されない多数の変数に依存する。さらに、吸引脂肪組織内の幹細胞濃度は個人によって大きく変動するため、特定量の幹細胞を要するとき、特定の所望量を得るのにより多いまたは少ない量の脂肪組織が必要となる場合がある。たとえば、細身の人から抽出する組織内の幹細胞濃度は肥満体のドナーに比べて高いことが多い(肥満体の人の場合、脂肪組織中の脂肪含有量が多いという希釈効果を反映している)。
ヒトの脂肪組織を取得する好適な方法は、当該技術において既知の切除または脂肪吸引術である。本発明の多能性細胞は、脂肪組織の取得方法に関係なく、最初に切除または抽出される脂肪組織内に存在する。その後、脂肪組織を処理して幹細胞の分離/濃縮を促進することができる。たとえば、多能性細胞は、回収した脂肪組織をリン酸緩衝食塩水(PBS)などの生理的に適合する溶液で洗浄することによって取得してよい。通常、洗浄ステップは、脂肪組織サンプルのPBSでの洗滌、サンプルの攪拌、サンプル内の組織の定着から成る。洗浄に加えて、脂肪組織を解離させてもよい。解離は酵素分解(たとえば、トリプシン処理)によって行うことができる。
酵素処理に代えて、または酵素処理と併せて、機械的攪拌、音波または超音波エネルギー、または熱エネルギーなどのその他の解離方法を使用してもよい。その後、細胞を遠心分離機にかけ、結果として生じる(多能性細胞を含む)ペレットを適切な溶液(たとえば、PBS)に懸濁後、さらに処理してもよい。
酵素処理に代えて、または酵素処理と併せて、機械的攪拌、音波または超音波エネルギー、または熱エネルギーなどのその他の解離方法を使用してもよい。その後、細胞を遠心分離機にかけ、結果として生じる(多能性細胞を含む)ペレットを適切な溶液(たとえば、PBS)に懸濁後、さらに処理してもよい。
ステップ403では、ステップ402で取得した脂肪組織の少なくとも一部を(たとえば上述したように)処理して高濃度の幹細胞を取得し、ステップ404では、処理した幹細胞を、システム300のキットに設けることができる、あるいは医療施設で利用することができる無菌容器から患者301に投与してよい。再懸濁ペレット内の多能性細胞は、(たとえば、磁気ビーズを用いる選別、蛍光活性化細胞選別機/FACS、磁気活性化細胞選別機/MACS、または親和分離法などによる)細胞選別、細胞分別、粒度、密度、分子性、形態、免疫組織を含むがそれらに限定されない方法で、再懸濁ペレット内のその他の細胞から分離させることができる。いくつかの免疫学的な細胞隔離方法では、多能性細胞は、細胞表面のエピトープに結合する抗体またはその他の特異的結合タンパク質を使用して、正の選択により取得することができる。上記方法では、細胞が接着する抗体からの細胞回収は、当業者によって既知なように適切な緩衝剤で1回以上洗浄することによって実行することができる。もしくは、多能性細胞は負の選択により隔離してもよい。本発明の各種実施形態によると、幹細胞回収キットは、吸引脂肪組織サンプル内の幹細胞の分離または濃縮を促進する無菌容器および/または試薬を備えていてもよい。多能性細胞の存在は好ましくは、たとえば細胞表面マーカおよび/または当該技術において既知な計数技術を用いて再導入前に判定される。
通常、本発明のシステム300を用いて取得される多能性細胞は、増殖または分化させずに患者に導入(または再導入)される。しかしながら、いくつかの実施形態によると、多能性細胞は生体外で増殖および/または分化させてもよい。すなわち、隔離後、多能性細胞は培養基に保持して増殖させてもよい。多能性細胞は、当該技術において既知な方法によって所望の細胞種に分化(または表現型的に変化)させてもよい。使用される細胞に応じて、媒体および/または媒体補助剤の濃度を変更または調節することは当業者の技術の範囲に含まれる。別の実施形態によると、本発明の多能性細胞は、当該技術において既知なように、血清が血清アルブミンと、血清トランスフェリンと、セレンと、インシュリン、血小板由来成長因子(PDGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含むがそれらに限定されない組換えタンパク質と、の組み合わせによって置き換えられる組成物の培養基で増殖させてもよい。本発明の多能性細胞集団の保持条件は、細胞を未分化の形で維持させる一または複数の細胞因子も含んでよい。
多能性細胞の分化が望まれる場合、一または複数の追加物質を培養基に追加して特定の所望する表現型の変化を生じさせてもよい。上記物質は、一または複数の細胞内信号伝達経路の活性剤(たとえば、分裂活性化タンパクキナーゼとSMAD)、転写因子の活性剤(たとえば、sox9、L−sox5、L−sox6)、細胞外基質タンパク質の生成および相互作用の活性剤(たとえば、コラーゲンII、アグリカン、軟骨オリゴマー基質タンパク質)、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、環境因子(たとえば、酸素分圧)などを含んでよい。
図5は、本発明の好適な実施形態による臨床用に脂肪組織から間葉系幹細胞を作製して使用する方法の詳細な工程500を示す図である。本実施形態によると、ステップ501で、脂肪組織がドナーまたは患者301から除去される。ステップ502で、吸引脂肪組織が真空350によって変形遠心管310に注入または導入される。任意のステップ503で、抽出された吸引脂肪組織は、PBSなどの当該技術において既知な洗浄剤で洗浄してもよい。任意のステップ504で、以後の処理を簡易化するため、吸引脂肪組織を解離して、脂肪組織と細胞塊に分解させてもよい。ステップ505で、細胞または吸引脂肪組織は遠心分離機にかけ、比重の異なる細胞および組織画分に分離させてもよい。たとえば、適切に作製された吸引脂肪組織の場合、MSCは、管310の円錐340の先端でペレット状に形成し、軽量の細胞または組織断片から感知できるほど解離させることができる。多くの場合、ステップ505で生成されたペレットは、(ステップ501でドナーまたは患者から抽出されたときに吸引脂肪組織に存在する幹細胞の濃度と比較して)わずかに高い幹細胞濃度を有することができ、さらなる濃縮が望ましいこともある。ステップ506で、幹細胞の豊富なペレットは以後の処理のために(ステップ502〜505の反復も含む)適切な溶液中に再度懸濁される。任意のステップ507で、当該技術において既知な技法によって幹細胞を他の細胞画分からさらに分離させてもよい。再懸濁ペレット内の多能性細胞は、(たとえば、磁気ビーズを用いる選別、蛍光活性化細胞選別機/FACS、磁気活性化細胞選別機/MACS、または親和分離法などによる)細胞選別、細胞分別、粒度、密度、分子性、形態、免疫組織を含むがそれらに限定されない方法で、再懸濁ペレット内のその他の細胞から分離させることができる。いくつかの免疫学的な細胞隔離方法では、多能性細胞は、細胞表面のエピトープに結合する抗体またはその他の特異的結合タンパク質を使用して、正の選択により取得することができる。上記方法では、細胞が接着する抗体からの細胞回収は、当業者によって既知なように適切な緩衝剤で1回以上洗浄することによって実行することができる。もしくは、多能性細胞は負の選択により隔離してもよい。ステップ508で、処理済み吸引脂肪組織サンプル内の幹細胞濃度は、当該技術において既知な手段を用いて判定してよい。多能性細胞の存在は好ましくは、たとえば細胞表面マーカおよび/または当該技術において既知な計数技術を用いて再導入前に判定される。ステップ509では、ステップ508で判定された濃度の少なくとも部分的に基づき、吸引脂肪組織をさらに処理して濃縮する(すなわち、幹細胞の濃度を高くする)か否かを判定してもよく、濃縮すると判定された場合、ステップ502〜508のうち一または複数を反復することで、さらに処理を実行することができる。任意のステップ510で、当該技術において確立された手法によって、幹細胞を培養し、より多くの量の幹細胞を取得してもよい。同様に、ステップ511(ステップ510の前でも後でも、あるいは同時に実行してもよい)で、当該技術において既知な手法を用いて、多能性幹細胞を1種以上の前駆細胞種に分化させてもよい。最後に、ステップ512で、ステップ501〜511を参照して上述したように抽出および処理された幹細胞または前駆細胞を、1人以上の患者301に投与してもよいし、あるいは後の治療、美容、またはその他の用途での使用のために保管してもよい。
脂肪由来幹細胞の再導入手段
患者への安全かつ効率的な投与に適した形で幹細胞を提供するため、本発明のシステム300によるキットを使用して、適量の適切なビヒクルと共に、好ましくは精製した形態で予防的または治療的に有効な量の本発明の間葉系幹細胞を含有する医薬組成物を生成することができる。
患者への安全かつ効率的な投与に適した形で幹細胞を提供するため、本発明のシステム300によるキットを使用して、適量の適切なビヒクルと共に、好ましくは精製した形態で予防的または治療的に有効な量の本発明の間葉系幹細胞を含有する医薬組成物を生成することができる。
本発明の各種実施形態による治療を受ける患者は、脂肪組織または脂肪組織由来の幹細胞を採用するその他の治療とは異なる濃度の幹細胞を受け入れてもよい。したがって、患者から除去される脂肪組織は、患者に投与される幹細胞の濃度を変更するように処理してもよい。本発明の好適な実施形態では、患者は、脂肪組織移植やその他類似の幹細胞に基づく治療における一般的な幹細胞濃度よりも高い濃度の幹細胞を受け入れる。この濃縮幹細胞は、成熟した脂肪細胞および結合組織がほぼ存在しない脂肪由来幹細胞および/または内皮前駆細胞を含む組成物で投与してよい、あるいは他の例では、幹細胞を増量した脂肪組織を含む組成物で投与してよい。
本発明の医薬組成物は、具体的に選択される投与の形態に応じて策定してもよい。たとえば、医薬組成物は、治療の必要な対象に注入される懸濁液などの液体状に作製してよい。例示的な(非限定的な)例では、本発明の医薬組成物は、食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)またはその他の適当な薬理上許容可能な担体といった薬理上許容可能なビヒクルを含む無菌懸濁液で、好ましくは静脈、腹膜、皮膚などを介して人などの対象に投与される。
本発明によると、必要とする対象への医薬組成物の投与は従来手段を使用して実行することができる。特定の一実施形態によると、医薬組成物は、注射器、カテーテル、トロカール、カニューレなどの装置を用いて皮下投与してよい。いずれにせよ、本発明の医薬組成物は当業者にとって既知な任意の適切な器具、器械、装置を用いて投与してよい。好適な実施形態によると、医薬組成物を投与する装置は上述のキットの一部として提供される、あるいは医薬組成物を対象へ汚染なく移送できるように上述のキットに合わせて改良される。
上記の本発明の好適な実施形態は例示と説明のために提示したもので、本発明を網羅する、あるいはまさに開示する形態に限定することを目的としていない。本発明の原理と実際的適用について最適に説明することによって、当業者が各種実施形態と企図される特定用途に適した様々な修正とで本発明を理解し得るように、多数の実施形態を選択し説明した。本発明の範囲は請求項とその等価物によって定義されると意図される。
当業者であれば、上述の各種実施形態の広範な修正が可能であることを理解しているであろう。よって、本発明は請求項とその均等物によって定義される。
Claims (2)
- 組織を処理するシステムであって、
生物学的物質を収容し処理するように構成された第1の遠心管であって、無菌組織入口継手と、少なくとも1つの無菌処理流体入口継手と、無菌吸引継手と、第1の抽出管に接続される少なくとも1つの無菌抽出継手とを有する第1の遠心管と、
前記第1の遠心管から前記生物学的物質を収容し更に処理するように構成された第2の遠心管であって、少なくとも1つの無菌処理流体入口継手と、無菌吸引継手と、第2の抽出管に接続される少なくとも1つの無菌抽出継手とを有し、前記少なくとも1つの無菌処理流体入口継手を経由して前記第1の遠心管の前記少なくとも1つの無菌抽出継手のうちの1つに可逆に接続される第2の遠心管と、
を備える、システム。 - 脂肪由来幹細胞の作製方法であって、
(a)吸引脂肪組織を、請求項1に記載のシステムの第1の遠心管まで無菌移送するステップと、
(b)前記少なくとも一つの無菌処理流体入口継手を介して一または複数の流体を追加することによって前記遠心管内の前記吸引脂肪組織を処理するステップであって、前記吸引脂肪組織の浄化と解離のうち一または複数を含むステップと、
(c)濃縮幹細胞画分を有するペレットの濃縮のため、処理済み吸引脂肪組織を収容した前記第1の遠心管を遠心分離するステップと、
(d)濃縮幹細胞画分を有する前記濃縮ペレットを、請求項1に記載のシステムの前記第2の遠心管まで無菌移送するステップと、
(e)前記少なくとも一つの無菌処理流体入口継手を介して一又は複数の流体を追加することによって前記第2の遠心管の前記濃縮幹細胞画分を洗浄するステップと、
(f)濃縮幹細胞画分を有するペレットの濃縮のため、細胞画分を収容した前記第2の遠心管を遠心分離するステップと、
(g)最初の吸引脂肪組織の幹細胞濃度よりも幹細胞が濃縮された細胞混合物を得るため、ペレットを流体に再懸濁するステップと、
を備える方法。
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