CN111117965A - 一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，包括以下步骤：振荡消化肿瘤组织，制备混合细胞悬液；将混合细胞悬液沿离心管壁缓慢加入到胎牛血清上层，加完后放置到培养箱中静置；时间差异消化贴壁细胞，获得纯度高的原代肿瘤细胞。本发明提供的高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，采用振荡器对组织团块进行消化，可加速组织团块分散成单个细胞悬液，减少混合消化酶对细胞膜的破坏，即提高接种细胞的存活率，又能保护原代细胞膜的特性，利用胎牛血清静置沉淀加时间差异胰酶消化实现原代肿瘤细胞的纯化，可将肿瘤细胞和其他非肿瘤细胞进行最大程度的分离，纯化效率高，节约纯化时间，既简单又实用，为应用到临床病人的个体化治疗提供重要的技术支持。
Description
技术领域
本发明属于原代肿瘤细胞纯化技术领域，具体涉及一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法。
背景技术
当今社会，癌症作为威胁人类健康的重要疾病之一，其发病率和死亡率高居不下。由于肿瘤细胞的特异性表征很难寻找，在现有的科学研究中还未能找到一种针对癌症的特异性治疗药物。
原代肿瘤细胞培养方法，指在无菌条件下，从动物体内提取组织，通过体外模拟体内生理环境使其生存和生长并维持其结构以及功能的方法，其作为癌症体外研究的重要手段，可为肿瘤的深入研究及治疗提供有效的细胞来源，与体内研究相辅相成。若能从病人肿瘤组织中纯化出原代肿瘤细胞并通过药物筛选出对该原代肿瘤细胞杀伤力最强的药物，再用于该病人的治疗，将大大提高该病人的癌症治疗率。
1951年人类第一株肿瘤细胞Hela(宫颈癌)的建立对癌症的研究产生了重大的影响，极大促进了各种癌症治疗方法的发展。但是，现有的肿瘤细胞原代培养成功率并不高，且耗费时间长，待肿瘤细胞稳定生长时，已失去了很多该肿瘤组织所特有的生物学特性，因此，我们仍需进一步探讨与研究如何缩短原代肿瘤细胞纯化及培养时间，保证其形状与体内相似，为研究肿瘤发生、发展及转移机制以及抗肿瘤药物敏感性的检测甚至肿瘤的基因治疗提供一个有效的平台。
尽管建立肿瘤细胞系的技术方法在不断改进，但是仍没有一种高效率、规范化的建立方法，现有的细胞纯化方法主要分为两种：自然纯化和人工纯化。自然纯化作为最早的一种纯化方式，利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中自然淘汰劣势细胞，仅留下生长旺盛的细胞以实现细胞纯化，但是此方法花费时间长，留下来的几乎都是成纤维细胞，仅有恶变的肿瘤细胞或突变的细胞能通过此方法保留下来，而且需要不断纯化才能达到建立细胞系的标准，培养时间过长会影响原代肿瘤细胞的细胞学特性，影响其生物学特性的研究。人工纯化借助人为技术创造对某一种类细胞生长有利的生存环境，实现细胞的纯化，目前主要通过以下几种方法来实现：酶消化法、机械刮除法和克隆法等，但都存在以下不足：酶消化法通常使用胰蛋白酶，该酶作用于精氨酸及赖氨酸组成的肽键，消化能力非常强，但是对细胞膜的伤害较大，大大影响肿瘤细胞膜表面的生物学特性的研究；机械刮除法是在显微镜下将肿瘤细胞团以外的成纤维细胞团及其他细胞团直接刮除掉，但是该方法对操作人员的工作经验有较高要求，需要操作人员对细胞的生长有深入的研究，并能通过经验判断不同的细胞群，人为误差较大；克隆法将混合细胞分成若干细胞悬液，通过对不同克隆细胞群的检验得到实验所需的肿瘤细胞克隆群，该方法得到的细胞克隆非常纯，但是耗费时间长，在长期的培养过程中，肿瘤细胞的生物学特性与刚离体的肿瘤细胞差异明显，影响研究的准确性。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术手段为：
一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，包括以下步骤：
步骤一、制备混合细胞悬液
取新鲜离体的肿瘤组织，剪碎，加入含胶原酶Ⅰ的DMEM不完全培养基，将混合液转移到离心管中，振荡消化肿瘤细胞，随后离心3-5次，离心后弃上清液；使用胰蛋白酶振荡消化，再用DMEM完全培养基终止消化，经过滤、离心后，弃上清液，加入4℃的PBS振荡混匀，制成混合细胞悬液；
步骤二、胎牛血清分离肿瘤细胞
取新离心管，加入胎牛血清，将步骤一得到的混合细胞悬液沿离心管壁缓慢加入到胎牛血清的上层，混合细胞悬液不能进入胎牛血清内，加完后放置到培养箱中静置10-20min；
步骤三、差异消化获得纯化肿瘤细胞
吸取步骤二离心管管底的细胞悬液，经离心后加入1640完全培养基，在六孔板内进行细胞培养，培养2-4天后吸走培养基，加入胰蛋白酶差异消化10-20s，吸走胰蛋白酶，吹打、冲洗六孔板，离心吹打得到的冲洗液得到新的细胞悬液，进行继续培养，重复多次，获得所需纯化原代肿瘤细胞。
进一步的，步骤一中，将接种人肺腺癌A549的荷瘤小鼠颈椎脱臼处死，泡于75％酒精4-6min；在细胞间的超净台内用剪刀剪开裸鼠皮肤，在不出血情况下分离出肿瘤组织，离体的肿瘤组织浸泡于0.01M PBS中，并剪碎，加入10-15mL含10mg胶原酶Ⅰ的DMEM不完全培养基，吹散肿瘤组织，把混合液转移到离心管中，使用振荡器振荡消化3-5min，然后放于37℃水浴锅1-2min，循环10-15次，随后离心，弃上清液，加入15-20mL 0.01M PBS，振荡混匀，离心，弃上清液，重复离心2-3次。
进一步的，步骤一中，加入5-10mL胰蛋白酶，使用振荡器振荡消化5-10min，加入30-40mL DMEM完全培养基终止消化，吹匀后将离心管中的液体倒入80目的筛子过滤，过滤后的液体转移到新离心管中，离心，弃上清液，加入15-20mL 0.01M PBS，振荡混匀，离心，弃上清液，重复3-5次，加入5-10mL、4℃的0.01M PBS振荡混匀，制成混合细胞悬液。
进一步的，所述胰蛋白酶为：NaCl 0.08g、NaHCO30.005g、葡萄糖0.01g、EDTA0.003g、胰蛋白酶0.025g和DDH2O 10g。
进一步的，所述DMEM完全培养基为：体积百分比10％的胎牛血清、体积百分比89％的DMEM不完全培养基和体积百分比1％的P/S。
进一步的，步骤二中，取一新离心管，加入胎牛血清5-15mL，吸取步骤一得到的混合细胞悬液，将混合细胞悬液沿离心管壁缓慢加入到胎牛血清液体的上层，加完后放置到37℃培养箱中静置10-20min。
进一步的，步骤三中，吸取离心管管底的细胞悬液1-2mL，挪到新离心管中，加入15-20mL 0.01M PBS，振荡混匀，离心，弃上清液，向离心管中加入1640完全培养基，吹打混匀，再采用六孔板进行细胞培养，培养2-4天后吸走培养基，用0.01M PBS吹洗六孔板，再加入4℃胰蛋白酶消化10-20s，吸走胰蛋白酶，用0.01M PBS冲洗六孔板，得到冲洗液，离心冲洗液，对其中的细胞进行继续培养，获得纯化后的原代肿瘤细胞。
进一步的，所述1640完全培养基为：体积百分比10％的胎牛血清、体积百分比89％的1640不完全培养基和体积百分比1％的P/S。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明公开了一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，包括以下步骤：步骤一、制备混合细胞悬液；步骤二、胎牛血清分离肿瘤细胞：取新离心管，加入5-15mL胎牛血清，将步骤一得到的混合细胞悬液沿离心管壁缓慢加入到胎牛血清的上层，混合细胞悬液不能加入到胎牛血清内，加完后放置到37℃培养箱中静置10-20min；步骤三、差异消化获得纯化原代肿瘤细胞。本发明提供的高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，采用振荡器对肿瘤组织团块进行消化，可以加速肿瘤组织团块分散成单个细胞悬液，这种消化方式可以减少混合消化酶对细胞膜的破坏，即提高接种细胞的存活率，又能保护原代细胞膜的特性，利用胎牛血清静置沉淀联合差异胰蛋白酶消化实现原代肿瘤细胞的纯化，可将肿瘤细胞和其他非肿瘤细胞进行最大程度的分离，纯化效率高，节约纯化时间，既简单又实用，为应用到临床病人的个体化治疗提供重要的技术支持。
附图说明
图1为本发明的流程图；
图2为本发明的肿瘤组织形态图；
图3为本发明的肿瘤组织充分剪碎后的形态图；
图4为本发明将肿瘤细胞悬液加入到胎牛血清的液面图；
图5为本发明将肿瘤细胞悬液加入到胎牛血清静置后的液面图；
图6为本发明吸取离心管管底的细胞悬液进行细胞培养的结果图；
图7为本发明使用胰蛋白酶差异消化后的细胞培养结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程、方法和试剂是本领域中公知的常规方法和产品。
如图1-7所示，一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，包括以下步骤：
步骤一、制备混合细胞悬液
取新鲜离体的肿瘤组织，剪碎，加入含胶原酶Ⅰ的DMEM不完全培养基，将混合液转移到离心管中，振荡消化肿瘤细胞，经离心后弃上清液；使用胰蛋白酶振荡消化，再用DMEM完全培养基终止消化，经过滤、离心后，弃上清液，加入4℃的PBS振荡混匀，制成所需混合细胞悬液；
步骤二、胎牛血清分离肿瘤细胞
取新离心管，加入胎牛血清，将步骤一得到的混合细胞悬液沿离心管壁缓慢加入到胎牛血清的上层，混合细胞悬液不能进入胎牛血清内，加完后放置到培养箱中静置10-20min；
步骤三、时间差异消化纯化肿瘤细胞
吸取步骤二离心管管底的细胞悬液，经离心后加入1640完全培养基，进行细胞培养，培养2-4天后吸走培养基，加入胰蛋白酶差异消化10-20s，吸走胰蛋白酶，离心吹打得到的冲洗液得到新的细胞悬液，进行继续培养，获得所需纯化原代肿瘤细胞。
步骤一中，将接种人肺腺癌A549的荷瘤小鼠颈椎脱臼处死，泡于75％酒精4-6min；在细胞间的超净台内用剪刀剪开裸鼠皮肤，在不出血情况下分离出肿瘤组织，离体的肿瘤组织浸泡于0.01M PBS中，并剪碎，加入10-15mL含10mg胶原酶Ⅰ的DMEM不完全培养基，吹散肿瘤组织，把混合液转移到离心管中，使用振荡器振荡消化3-5min，然后放于37℃水浴锅1-2min，循环10-15次，再离心，弃上清液，加入15-20mL 0.01M PBS，振荡混匀，离心，弃上清液，再加入15-20mL0.01M PBS，振荡混匀，离心，弃上清液；加入5-10mL胰蛋白酶，使用振荡器振荡消化5-10min，加入30-40mL DMEM完全培养基终止消化，吹匀后将离心管中的液体倒入80目的筛子过滤，过滤后的液体转移到新离心管中，离心，弃上清液，加入15-20mL 0.01MPBS，振荡混匀，离心，弃上清液，重复振荡、离心3-5次，加入5-10mL、4℃的0.01M PBS振荡混匀，制成混合细胞悬液。
步骤二中，取一新离心管，加入胎牛血清5-15mL，吸取步骤一得到的混合细胞悬液，将混合细胞悬液沿离心管壁缓慢加入到胎牛血清液体的上层，加完后放置到37℃培养箱中静置10-20min。
步骤三中，吸取离心管管底的细胞悬液1-2mL，挪到新离心管中，加入15-20mL0.01M PBS，振荡混匀，离心，弃上清液，向离心管中加入1640完全培养基，吹打混匀，再采用六孔板进行细胞培养，培养2-4天后吸走培养基，用0.01M PBS吹洗六孔板，再加入4℃胰蛋白酶，对六孔板内的贴壁细胞进行差异消化10-20s，成纤维细胞贴壁能力强于肿瘤细胞，通过差异消化将肿瘤细胞吹打下来，吸走胰蛋白酶，用0.01M PBS冲洗六孔板，得到冲洗液，离心冲洗液，对其中的细胞进行继续培养，获得纯化后的原代肿瘤细胞。
胰蛋白酶为：NaCl 0.08g、NaHCO30.005g、葡萄糖0.01g、EDTA0.003g、胰蛋白酶0.025g和DDH2O 10g。
DMEM完全培养基为：体积百分比10％的胎牛血清、体积百分比89％的DMEM不完全培养基和体积百分比1％的P/S。
1640完全培养基为：体积百分比10％的胎牛血清、体积百分比89％的1640不完全培养基和体积百分比1％的P/S。
实施例1
如图1-7所示，一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，包括以下步骤：
步骤一、制备混合细胞悬液
首先将接种有人肺腺癌A549的荷瘤小鼠颈椎脱臼处死，泡于含75％酒精的烧杯中4-6min；将烧杯放于细胞间超净台内，放置于相对无菌区，点燃酒精灯消毒，从铁盒中夹出高压灭菌过的平皿，将消毒好的裸鼠用大镊子夹到平皿中，夹到平皿前，先晾干裸鼠身上的酒精，再从铁盒中夹出普通剪刀和无菌镊子，使用酒精灯消毒后，左手持镊子，右手持剪刀，从荷瘤小鼠的胸口剪开裸鼠皮肤，小心剥离肿瘤组织，做到不出血。
稍微剪碎肿瘤组织，泡于0.01M PBS 1-3min，使肿瘤组织完全浸润0.01M PBS，防止肿瘤细胞皱缩死亡；把肿瘤组织挪到无菌平皿上，用眼科剪充分剪碎肿瘤组织，剪得越碎越好，在剪碎过程中，适量滴加0.01M PBS，维持肿瘤细胞的活性，防止肿瘤组织干燥；剪完后，向无菌平皿中加入10mL含10mg胶原酶Ⅰ的DMEM不完全培养基，用剪过头的1mL枪头吹散肿瘤组织，再把混合液转移到50ml离心管中进行下一步的振荡操作。
使用振荡器振荡消化3-4min，然后放于37℃水浴锅1-2min，循环12次，共一个小时左右，能有效地将肿瘤组织分离成单个细胞；消化后在700-900pm条件下离心5-7min，离心后弃上清液，再加入15-20mL 0.01M PBS，振荡混匀，继续在700-900pm条件下离心5-7min，离心后倒掉上清液，再加入15-20mL 0.01M PBS振荡混匀并再次在700-900pm条件下离心5-7min，离心后去掉上清液。
随后加入5-8mL胰蛋白酶(NaCl 0.08g，NaHCO30.005g，葡萄糖0.01g，EDTA0.003g，胰酶0.025g，DDH2O 10g)振荡消化8-15min；加入30mL DMEM完全培养基(10％FBS+89％DMEM不完全培养基+1％P青霉素/S链霉素)终止消化，采用现有成分配方即可实现，；吹匀后将离心管中的液体倒入80目的筛子过滤，过滤后的液体转移到新的50ml离心管中，在700-900pm条件下离心5-7min，离心后倒掉上清液。
加入15-20mL 0.01M PBS，振荡混匀，在700-900rpm条件下离心5-7min，离心后倒掉上清液，重复3-5次，最后加入4-6mL、4℃的0.01M PBS振荡混匀，制备得到混合细胞悬液。
步骤二、血清分离肿瘤细胞
取一新50ml离心管，加入胎牛血清FBS 5-15mL，放置在离心管架上，用一次性巴氏吸管吸取步骤一得到的混合细胞悬液，将混合细胞悬液沿离心管壁缓慢加入到FBS液体的上层，添加过程中一定要缓慢，不能将混合细胞悬液吹到FBS液体内，不然会影响静置的效果，可将肿瘤细胞和其他非肿瘤细胞进行最大程度的分离，加完后放置到37℃培养箱中静置10-20min。
步骤三、差异消化得到纯化原代肿瘤细胞
用一次性巴氏吸管吸取离心管管底的细胞悬液1-2mL，移至新的50mL离心管中，并加入15-25mL 0.01M PBS，在700-900rpm条件下离心5-7min，离心后弃上清液；向离心管中加入约3-4mL 1640完全培养基(10％FBS+89％1640不完全培养基+1％P青霉素/S链霉素)，采用现有成分配方即可实现，吹打混匀，将细胞悬液转移到六孔板中进行培养。
培养四天，每天进行换液，先吸走培养基，然后加入0.01M PBS1mL轻轻吹洗六孔板底部，再加入新的1640完全培养基进行培养，最后镜下观察拍照，如图6所示。
于第五天进行差异胰蛋白酶消化：先吸走培养基，然后加入1mL0.01M PBS轻轻吹洗六孔板，吸走0.01M PBS，加入4℃胰蛋白酶1mL，消化10-20s，吸走胰蛋白酶，再用0.01MPBS吹打六孔板底，目的将贴壁的肿瘤细胞吹打下来，得到冲洗液，离心吹打得到的冲洗液得到新的细胞悬液，再转移到新的六孔板中，补加1mL 1640完全培养基继续进行培养，培养3天，镜下观察拍照，如图7所示，可见肿瘤细胞均一性非常好，间接证明此方法的可行性。
本发明采用振荡器对组织团块进行消化，可以加速组织团块分散成单个细胞悬液，这种消化方式可以减少混合消化酶对细胞膜的破坏，即提高接种细胞的存活率，又能保护原代细胞膜的特性。
本发明采取胎牛血清静置沉淀加差异胰蛋白酶消化实现原代肿瘤细胞的纯化，既简单又实用，为应用到临床病人的个体化治疗提供非常便捷的平台。
对六孔板内的贴壁细胞使用胰蛋白酶进行差异消化，由于成纤维细胞贴壁能力强于肿瘤细胞，通过差异消化，将肿瘤细胞吹打下来，从而纯化原代肿瘤细胞。
本发明未详细说明的部分采用现有技术可实现，在此不做赘述。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备混合细胞悬液
取新鲜离体的肿瘤组织，剪碎，加入含胶原酶Ⅰ的DMEM不完全培养基，将混合液转移到离心管中，振荡消化肿瘤细胞，经离心后弃上清液；使用胰蛋白酶振荡消化，再用DMEM完全培养基终止消化，经过滤、离心后，弃上清液，加入4℃的PBS振荡混匀，制成所需混合细胞悬液；
步骤二、胎牛血清分离肿瘤细胞
取新离心管，加入胎牛血清，将步骤一得到的混合细胞悬液沿离心管壁缓慢加入到胎牛血清的上层，混合细胞悬液不能进入胎牛血清内，加完后放置到培养箱中静置10-20min；
步骤三、时间差异消化纯化肿瘤细胞
吸取步骤二离心管管底的细胞悬液，经离心后加入1640完全培养基，进行细胞培养，培养2-4天后吸走培养基，加入胰蛋白酶差异消化10-20s，吸走胰蛋白酶，离心吹打得到的冲洗液得到新的细胞悬液，继续进行培养，获得所需纯化原代肿瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，步骤一中，将接种人肺腺癌A549的荷瘤小鼠颈椎脱臼处死，泡于75％酒精4-6min；在细胞间的超净台内用剪刀剪开裸鼠皮肤，在不出血情况下分离出肿瘤组织，离体的肿瘤组织浸泡于0.01MPBS中，并剪碎，加入10-15mL含10mg胶原酶Ⅰ的DMEM不完全培养基，吹散肿瘤组织，把混合液转移到离心管中，使用振荡器振荡消化3-5min，然后放于37℃水浴锅1-2min，循环10-15次，随后离心，弃上清液，再加入15-20mL 0.01M PBS，振荡混匀，离心，弃上清液，重复离心2-3次。
3.根据权利要求1所述的一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，步骤一中，加入5-10mL胰蛋白酶，使用振荡器振荡消化5-10min，加入30-40mL DMEM完全培养基终止消化，吹匀后将离心管中的液体倒入80目的筛子过滤，过滤后的液体转移到新离心管中，离心，弃上清液，加入15-20mL 0.01M PBS，振荡混匀，离心，弃上清液，重复3-5次，加入5-10mL、4℃的0.01M PBS振荡混匀，制成混合细胞悬液。
4.根据权利要求1或3所述的一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，所述胰蛋白酶为：NaCl 0.08g、NaHCO3 0.005g、葡萄糖0.01g、EDTA 0.003g、胰蛋白酶0.025g和DDH2O 10g。
5.根据权利要求1或3所述的一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，所述DMEM完全培养基为：体积百分比10％的胎牛血清、体积百分比89％的DMEM不完全培养基和体积百分比1％的P/S。
6.根据权利要求1所述的一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，步骤二中，取一新离心管，加入胎牛血清5-15mL，吸取步骤一得到的混合细胞悬液，将混合细胞悬液沿离心管壁缓慢加入到胎牛血清液体的上层，加完后放置到37℃培养箱中静置10-20min。
7.根据权利要求1所述的一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，步骤三中，吸取离心管管底的细胞悬液1-2mL，挪到新离心管中，加入15-20mL 0.01M PBS，振荡混匀，离心，弃上清液，向离心管中加入1640完全培养基，吹打混匀，采用六孔板进行细胞培养，培养2-4天后吸走培养基，用0.01M PBS吹洗六孔板，再加入4℃胰蛋白酶消化10-20s，吸走胰蛋白酶，用0.01M PBS冲洗六孔板，得到冲洗液，离心冲洗液，对其中的细胞进行继续培养，获得纯化后的原代肿瘤细胞。
8.根据权利要求1或7所述的一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，所述1640完全培养基为：体积百分比10％的胎牛血清、体积百分比89％的1640不完全培养基和体积百分比1％的P/S。
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