ES2834618T3 - Actividad antifibrótica del inhibidor de GAS6 - Google Patents

Abstract

Un inhibidor de la actividad de GAS6 para su uso en el tratamiento, reducción, reversión, ralentización o prevención de la fibrosis asociada con el cáncer o el crecimiento tumoral en un paciente mamífero en donde el inhibidor es un polipéptido, en donde el polipéptido comprende un polipéptido variante AXL soluble, en donde el polipéptido variante AXL carece del dominio transmembrana AXL y tiene al menos una mutación relativa al tipo silvestre que aumenta la afinidad del polipéptido variante AXL que se une a GAS6 en comparación con el AXL de tipo silvestre, y ya sea en donde en el polipéptido variante AXL de residuo de glicina 32 se sustituye con un residuo de serina, residuo de ácido aspártico 87 es reemplazado con un residuo de glicina, residuo de valina 92 se sustituye con un residuo de alanina, o residuo de glicina 127 se sustituye con un residuo de arginina o una combinación de los mismos; o en donde en el polipéptido variante AXL el residuo de glicina 32 se reemplaza con un residuo de serina, el residuo de ácido aspártico 87 se reemplaza con un residuo de glicina, el residuo de valina 92 se reemplaza con un residuo de alanina, el residuo de glicina 127 se reemplaza con un residuo de arginina o un residuo de alanina 72 se reemplaza por un residuo de valina o una combinación de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN

Actividad antifibrótica del inhibidor de GAS6

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0001] La fibrosis, definida por la acumulación excesiva de componentes de la matriz extracelular (ECM) en y alrededor del tejido inflamado o dañado, está asociada con varias afecciones inflamatorias. En estas situaciones, la respuesta normal de reparación del tejido se convierte en una respuesta fibrótica irreversible a través de la desregulación de la respuesta al estrés o la lesión. La fibrosis puede provocar cicatrices permanentes, disfunción de órganos y, en última instancia, la muerte, como se observa en la enfermedad hepática en etapa terminal, enfermedad renal, fibrosis pulmonar idiopática (FPI), fibrosis retiniana e insuficiencia cardíaca por fibrosis cardíaca. La fibrosis también influye en la invasión y metástasis tumorales, el rechazo crónico del injerto y la patogenia de muchas miopatías progresivas.

[0002] Muchos desencadenantes distintos pueden contribuir al desarrollo de la enfermedad fibrótica progresiva, pero independientemente de los eventos iniciadores, una característica común es la activación de miofibroblastos productores de ECM, que son los mediadores clave de la remodelación del tejido fibrótico. Muchos elementos de la respuesta inmune innata y adaptativa participan en la diferenciación y activación de los fibroblastos. Durante el equilibrio, los fibroblastos residentes en tejido están inactivos. Para reparar los tejidos después de una lesión, estos fibroblastos residentes en el tejido se activan y se transforman en miofibroblastos. Los miofibroblastos secretan grandes cantidades de ECM, lo que ayuda en la contractura y el cierre y realiza muchos aspectos de la respuesta de curación. La activación, proliferación y supervivencia de los miofibroblastos están mediadas por una variedad de factores secretados, solubles y físicos en el medio, como citocinas que incluyen IL-1, TNF, TGF- p 1 e IL-13, factores de crecimiento como CTGF y PDGF, y factores de la matriz como fragmentos de hialuronano, estrés mecánico y rigidez. Durante la cicatrización normal de la herida, los miofibroblastos sufren apoptosis después de la reepitelización de la herida, pero los miofibroblastos en los loci fibróticos son resistentes a la muerte celular programada. Las vías que provocan y reclutan un gran número de miofibroblastos y las que generan resistencia a la apoptosis son áreas activas de investigación de la fibrosis.

[0003] Debido a que los miofibroblastos productores de ECM son la célula patógena común final en enfermedades fibróticas, cualquier terapia que extirpa con éxito su actividad podría tener una amplia actividad antifibrótica. Dirigirse a vías inflamatorias clave también puede ser útil en el tratamiento de la fibrosis. Dado que el TNF-a ha surgido como un factor clave de la fibrosis en muchos estudios experimentales, se han iniciado ensayos clínicos para examinar si los inhibidores de la vía del TNF a podrían usarse para tratar la FPI y otros trastornos de la cicatrización.

[0004] Las composiciones y métodos de uso antifibrótico de las mismas son de gran interés clínico y humanitario. La presente invención aborda esta necesidad.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0005] La presente invención describe composiciones y métodos útiles para inhibir la fibrosis mediante la inhibición de vías relacionadas con AXL y/o GAS6. Según la invención, se proporciona un inhibidor de la actividad de GAS6 para su uso en el tratamiento, reducción, reversión, ralentización o prevención de la fibrosis asociada con el cáncer o el crecimiento tumoral en un paciente mamífero en donde el inhibidor es un polipéptido,

en donde el polipéptido comprende un polipéptido variante de AXL,

en donde el polipéptido variante AXL carece del dominio transmembrana AXL y tiene al menos una mutación con respecto al tipo silvestre que aumenta la afinidad de la unión del polipéptido variante AXL a GAS6 en comparación con AXL tipo silvestre, y en la variante AXL el residuo del polipéptido glicina 32 se reemplaza por un residuo de serina, el residuo de ácido aspártico 87 se sustituye por un residuo de glicina, el residuo de valina 92 se sustituye por un residuo de alanina, o el residuo de glicina 127 se sustituye por un residuo de arginina o una combinación de los mismos; o

en donde en el polipéptido variante AXL el residuo de glicina 32 se reemplaza con un residuo de serina, el residuo de ácido aspártico 87 se reemplaza con un residuo de glicina, el residuo de valina 92 se reemplaza con un residuo de alanina, el residuo de glicina 127 se reemplaza con un residuo de arginina o un residuo de alanina 72 se reemplaza por un residuo de valina o una combinación de los mismos.

[0006] En algunas realizaciones, el agente inhibidor se une a dos o más epítopos en una única GAS6. En algunas realizaciones, el agente inhibidor es capaz de unirse a los sitios de unión principales y secundarios de AXL en un solo GAS6. En algunas realizaciones, el agente inhibidor es capaz de unirse al sitio de unión principal de AXL de GAS6 y uno o más epítopos de GAS6 adicionales en un solo GAS6. En algunas realizaciones, el agente inhibidor es capaz de unirse al sitio de unión menor de AXL en GAS6 y uno o más epítopos adicionales en un solo GAS6. En algunas realizaciones, el agente inhibidor es capaz de unir dos o más epítopos en un solo GAS6. En algunas realizaciones, el agente inhibidor es capaz de antagonizar la interacción principal y/o menor de unión de GAS6/receptor, y en donde el receptor se selecciona de AXL. En algunas realizaciones, el agente inhibidor es capaz de antagonizar la principal interacción de unión de GAS6/receptor, y en donde el receptor se selecciona de AXL. En algunas realizaciones, el agente inhibidor es capaz de antagonizar la interacción de unión menor de GAS6/receptor, y en donde el receptor se selecciona de AXL. En algunas realizaciones, el inhibidor es una molécula pequeña que se une al dominio quinasa de AXL e inhibe la señalización intracelular de la activación de AXL.

[0007] En algunas realizaciones, el agente inhibidor es una fusión portadora, un polipéptido de fusión-Fc, conjugado de polipéptido, o un conjugado polipéptido-fármaco. En algunas realizaciones, el agente inhibidor es un polipéptido natural o sintético. En algunas realizaciones del documento, el agente inhibidor es un polipéptido que no es un anticuerpo.

[0008] En algunas realizaciones, el agente inhibidor es un darpin, un avimer, un adnectin, un anticalin, un aficuerpo, un maxibody o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el agente inhibidor es un conjugado de polipéptido o un conjugado de anticuerpo. En algunas realizaciones, el agente inhibidor comprende un conjugado polipéptido-polímero, y en donde el polímero es un PEG, un polímero que contiene PEG, un polímero degradable, un polímero biocompatible o un hidrogel.

[0009] En algunas realizaciones, el agente inhibidor es un polipéptido, donde el polipéptido comprende un polipéptido variante de AXL soluble en donde el polipéptido AXL carece del dominio AXL transmembrana y tiene al menos una mutación con relación al tipo silvestre que aumenta la afinidad de la unión de polipéptido AXL a GAS6 en comparación con AXL de tipo silvestre.

[0010] En algunas realizaciones, el polipéptido variante de AXL inhibe la unión entre un polipéptido AXL de tipo silvestre y una proteína GAS6 in vivo o in vitro.

[0011] En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL carece de un dominio de fibronectina funcional (FN) y/o en donde dicho polipéptido variante de AXL muestra un aumento de la afinidad de la unión polipeptídica a GAS6 en comparación con el AXL de tipo silvestre.

[0012] En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL carece del dominio transmembrana, tiene más de un dominio de Ig1 y en donde dicho polipéptido exhibe un aumento de la afinidad de las variantes AXL de la unión del polipéptido variante AXL a GAS6 en comparación con AXL de tipo silvestre.

[0013] En algunas realizaciones, el polipéptido tiene dos dominios Ig1. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene tres dominios Ig1. En algunas realizaciones, el polipéptido variante de AXL soluble carece del dominio transmembrana, tiene más de un dominio Ig2 y en donde dicho polipéptido variante de AXL exhibe una mayor afinidad de la unión del polipéptido AXL a GAS6 en comparación con AXL de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene dos dominios Ig2.

[0014] En algunas realizaciones, el polipéptido es un polipéptido variante AXL soluble, en donde dicha variante AXL soluble polipéptido carece del dominio AXL transmembrana, tiene más de un dominio Ig1, más de un dominio Ig2, y en donde dicho polipéptido variante de AXL muestra un aumento de la afinidad de la unión del polipéptido variante AXL a GAS6 en comparación con AXL de tipo silvestre.

[0015] En algunas realizaciones, el polipéptido es un polipéptido variante AXL soluble, en donde dicho AXL soluble, el polipéptido variante MER o TYRO3 carece del dominio a Xl transmembrana, carece de una fibronectina funcional (FN) de dominio, tiene más de un dominio Ig1, más de un dominio de Ig2, y en donde dicho polipéptido variante de AXL exhibe una mayor afinidad de la unión del polipéptido variante de AXL a GAS6 en comparación con AXL de tipo silvestre.

[0016] En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL soluble tiene dos dominios Ig1 y dos dominios Ig2. En algunas realizaciones, los dominios de inmunoglobulina están conectados directamente. En algunas realizaciones, los dominios de inmunoglobulina están conectados indirectamente. En algunas realizaciones, el polipéptido es un polipéptido variante de AXL soluble, en donde dicho polipéptido variante carece del dominio transmembrana AXL, es capaz de unirse tanto al sitio de unión mayor como al menor de un solo GAS6 y en donde dicho polipéptido variante de AXL exhibe una mayor afinidad de unión del polipéptido AXL a GAS6.

[0017] En algunas realizaciones, el polipéptido tiene un dominio Ig1 y carece de un dominio funcional Ig2. En algunas realizaciones, el polipéptido es un polipéptido variante AXL soluble, en donde dicho polipéptido variante AXL soluble carece del dominio transmembrana a Xl , tiene un dominio Ig1, carece de un dominio Ig2 funcional y en donde dicho polipéptido variante AXL muestra una mayor afinidad de la unión del polipéptido variante AXL a GAS6 en comparación con AXL de tipo silvestre.

[0018] En algunas realizaciones, el polipéptido es un polipéptido variante AXL soluble, en donde dicho polipéptido de variante AXL soluble carece del dominio AXL transmembrana, carece de una fibronectina funcional (FN) de dominio, tiene un dominio Ig1, carece de un dominio Ig2 funcional y en donde dicho polipéptido variante AXL exhibe una mayor afinidad de la unión del polipéptido variante AXL a GAS6 en comparación con AXL de tipo silvestre.

[0019] En algunas realizaciones, el polipéptido variante de AXL es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc. En algunas realizaciones, el polipéptido variante carece del dominio intracelular AXL. En algunas realizaciones, el polipéptido variante soluble de AXL carece además de un dominio de fibronectina funcional (FN) y en donde dicho polipéptido variante exhibe una afinidad aumentada de la unión del polipéptido a GAS6. En algunas realizaciones, el polipéptido variante de AXL soluble comprende al menos una modificación de aminoácido con respecto a la secuencia de AXL de tipo silvestre.

[0020] En algunas realizaciones, el polipéptido AXL soluble es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc y en donde dicha variante AXL comprende amino ácido cambia en relación a la secuencia de AXL de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) en las siguientes posiciones: (a) glicina 32; (b) ácido aspártico 87; (c) alanina 72; y (d) valina 92.

[0021] En algunas realizaciones, el polipéptido AXL soluble es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc y en donde la glicina 32 se sustituye con un residuo de serina, ácido aspártico 87 es reemplazado con un residuo de glicina, alanina 72 está se reemplaza con un residuo de valina, y la valina 92 se reemplaza con un residuo de alanina, o una combinación de los mismos.

[0022] En algunas realizaciones, el polipéptido AXL soluble es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc y en donde dicha variante AXL comprende aminoácido cambia en relación con el AXL de tipo silvestre.

[0023] En algunas realizaciones, en el polipéptido variante AXL el residuo alanina 72 es reemplazado con un residuo de valina.

[0024] En algunas realizaciones, en el polipéptido variante AXL residuo glicina 32 se sustituye con un residuo de serina, residuo de ácido aspártico 87 es reemplazado con un residuo de glicina, el residuo valina 92 se sustituye con un resto de alanina, el residuo de glicina 127 se sustituye con un residuo de arginina o un residuo de alanina 72 se sustituye por un residuo de valina o una combinación de los mismos.

[0025] En algunas realizaciones, la variante de AXL comprende cambios de aminoácidos en relación con la secuencia AXL de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) en las siguientes posiciones: (a) ácido glutámico 26; (b) valina 79; (c) valina 92; y (d) glicina 127.

[0026] En algunas realizaciones, en el polipéptido variante AXL residuo de ácido glutámico 26 se sustituye con un residuo de glicina, residuo de valina 79 se sustituye con un residuo de metionina, el residuo de valina 92 se sustituye con un residuo de alanina, o el residuo de glicina 127 se sustituye por un residuo de arginina o una combinación de los mismos.

[0027] En algunas formas de realización, el polipéptido variante AXL comprende al menos una región de aminoácido seleccionada de entre el grupo constituido por la región de aminoácidos 19-437, 130-437, 19-132, 21-121,26-132, 26­ 121 y 1-437 del polipéptido AXL de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), y en donde se producen una o más modificaciones de aminoácidos en dicha región de aminoácidos.

[0028] En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL comprende cambios de aminoácidos con relación a la secuencia de tipo silvestre de AXL (SEQ ID NO: 1) en las siguientes posiciones: (a) glicina 32; (b) ácido aspártico 87; (c) alanina 72; y valina 92.

[0029] En algunas realizaciones, en el polipéptido variante de AXL glicina 32 se sustituye con un residuo de serina, ácido aspártico 87 se sustituye con un residuo de glicina, alanina 72 se sustituye con un residuo de valina, y valina 92 se sustituye con un residuo de alanina, o una combinación de los mismos.

[0030] En algunas realizaciones, el polipéptido AXL soluble es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc y en donde dicha variante AXL comprende aminoácido cambia en relación a la secuencia de AXL de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) en las siguientes posiciones: (a) glicina 32; (b) ácido aspártico 87; (c) alanina 72; y (d) valina 92.

[0031] En algunas realizaciones, el polipéptido AXL soluble es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc y en donde la glicina 32 se sustituye con un residuo de serina, ácido aspártico 87 es reemplazado con un residuo de glicina, alanina 72 está se reemplaza con un residuo de valina, y la valina 92 se reemplaza con un residuo de alanina, o una combinación de los mismos.

[0032] En algunas realizaciones, el polipéptido AXL soluble es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc y en donde dicha variante AXL comprende aminoácido cambia en relación a la secuencia de AXL de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) en las siguientes posiciones: (a) glicina 32; (b) ácido aspártico 87; (c) alanina 72; (d) valina 92; y (e) glicina 127.

[0033] En algunas realizaciones, el polipéptido AXL soluble es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc y en donde la glicina 32 se sustituye con un residuo de serina, ácido aspártico 87 es reemplazado con un residuo de glicina, alanina 72 es reemplazada con un residuo de valina, la valina 92 se reemplaza con un residuo de alanina y la glicina 127 se reemplaza con un residuo de arginina o una combinación de los mismos.

[0034] En algunas realizaciones, el polipéptido AXL soluble es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc, carece de un dominio FN funcional, y en donde dicha variante de AXL comprende cambios de aminoácidos en relación a la secuencia de AXL de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) a las siguientes posiciones: (a) glicina 32; (b) ácido aspártico 87; (c) alanina 72; y (d) valina 92.

[0035] En algunas realizaciones, la variante de AXL soluble es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc, carece de un funcional de dominio FN, y en donde la glicina 32 se sustituye con un residuo de serina, ácido aspártico 87 es reemplazado con un residuo de glicina, la alanina 72 se sustituye por un residuo de valina y la valina 92 se sustituye por un residuo de alanina, o una combinación de los mismos.

[0036] En algunas realizaciones, el polipéptido AXL soluble es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc, carece de un dominio FN funcional, y en donde dicha variante de AXL comprende aminoácido cambia en relación a la secuencia de AXL de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) a las siguientes posiciones: (a) glicina 32; (b) ácido aspártico 87; (c) alanina 72; (d) valina 92; y (e) glicina 127.

[0037] En algunas realizaciones, la variante de AXL soluble es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc, carece de un funcional de dominio FN, y en donde la glicina 32 se sustituye con un residuo de serina, ácido aspártico 87 es reemplazado con un residuo de glicina, la alanina 72 se sustituye por un residuo de valina, la valina 92 se sustituye por un residuo de alanina y la glicina 127 se sustituye por un residuo de arginina o una combinación de los mismos.

[0038] En algunas realizaciones, el polipéptido AXL soluble es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc, carece de un dominio FN funcional, carece de un dominio de Ig2, y en donde dicha variante de AXL comprende cambios aminoácidos en relación a la secuencia de AXL de tipo silvestre (SEQ NO ID: 1) en las siguientes posiciones: (a) glicina 32; (b) ácido aspártico 87; (c) alanina 72 y (d) valina 92.

[0039] En algunas realizaciones, la variante de AXL soluble es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc, carece de un dominio FN funcional, carece de un dominio de Ig2 y en donde la glicina 32 se sustituye por un residuo de serina, el ácido aspártico 87 se sustituye por un residuo de glicina, la alanina 72 se sustituye por un residuo de valina y la valina 92 se sustituye por un residuo de alanina o una combinación de los mismos.

[0040] En algunas realizaciones, el polipéptido AXL soluble es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc, carece de un dominio FN funcional, carece de un dominio de Ig2, y en donde dicha variante de AXL comprende cambios de aminoácidos en relación a la secuencia de AXL de tipo silvestre (SEQ NO ID: 1) en las siguientes posiciones: (a) glicina 32; (b) ácido aspártico 87; (c) alanina 72; (d) valina 92; y (e) glicina 127.

[0041] En algunas realizaciones, la variante de AXL soluble es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc, carece de un dominio funcional de FN, carece de un dominio de Ig2 y en donde la glicina 32 se sustituye con un residuo de serina, ácido aspártico 87 se reemplaza con un resto de glicina, la alanina 72 se reemplaza con un resto de valina, la valina 92 se reemplaza con un resto de alanina y la glicina 127 se reemplaza con un resto de arginina o una combinación de los mismos.

[0042] En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL soluble tiene una afinidad de al menos aproximadamente 1 x 10-8M, 1 x 10-9M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M o 1 x 10-12M para GAS6.

[0043] En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL soluble exhibe una afinidad para GAS6 que es al menos aproximadamente 5 veces más fuerte, al menos aproximadamente 10 veces más fuerte o al menos aproximadamente 20 veces más fuerte que la afinidad del polipéptido AXL de tipo silvestre.

[0044] En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL soluble comprende además un enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador comprende una o más unidades (GLY)⁴SER. En algunas realizaciones, el enlazador comprende 1, 2, 3 o 5 unidades (GLY)⁴SER.

[0045] En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL soluble inhibe la unión entre polipéptido AXL de tipo silvestre y una proteína GAS6 in vivo o in vitro.

[0046] En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL soluble es un polipéptido de fusión que comprende un dominio Fc.

[0047] Por lo tanto, la invención se refiere a un inhibidor de vías relacionadas con AXL y/o GAS6 para su uso para prevenir o tratar la fibrosis, que comprende administrar a un individuo en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la invención.

[0048] También se proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de vías relacionadas con AXL y/o GAS6 como se describe anteriormente, y, además, al menos otro compuesto antifibrótico; o si es apropiado en combinación con un fármaco quimioterapéutico para el tratamiento del cáncer. También se proporciona el uso de un inhibidor de la invención para la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar la fibrosis.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0049] Figura 1. Análisis de fibrosis de cáncer de páncreas después del tratamiento con el polipéptido axl inhibidor.

DEFINICIONES

[0050] En la descripción que sigue, una serie de términos que se utilizan convencionalmente en el campo de cultivo celular se utilizan ampliamente. Con el fin de proporcionar una comprensión clara y coherente de la especificación y las reivindicaciones, y el alcance que se dará a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones.

[0051] Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en este documento para referirse a un polímero de dos o más residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es un mimético químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos naturales y polímeros de aminoácidos no naturales. Los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" se usan indistintamente en este documento y se refieren a un polipéptido capaz de interactuar y/o unirse a otra molécula, a menudo denominado antígeno. Los anticuerpos pueden incluir, por ejemplo, "polipéptidos de unión a antígeno" o "polipéptidos de unión a molécula diana". Los antígenos de la presente invención pueden incluir, por ejemplo, cualquier polipéptido descrito en la presente invención.

[0052] El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y sintéticos aminoácidos, así como aminoácidos análogos de ácidos y aminoácidos miméticos de ácidos que funcionan de una manera similar a aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son los codificados por el código genético, así como los aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono alfa que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonio. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas principales peptídicas modificadas, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura diferente a la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de manera similar a un aminoácido natural. Todas las letras individuales utilizadas en la presente invención para representar aminoácidos se utilizan de acuerdo con los símbolos de aminoácidos reconocidos que se utilizan habitualmente en el campo, por ejemplo, A significa Alanina, C significa Cisteína, etc. Un aminoácido está representado por una letra única antes y después. la posición relevante para reflejar el cambio del aminoácido original (antes de la posición) al aminoácido cambiado (después de la posición). Por ejemplo, A19T significa que el aminoácido alanina en la posición 19 se cambia a treonina.

[0053] Los términos "sujeto", "individuo" y "paciente" se usan indistintamente en este documento para referirse a un mamífero que está siendo evaluado para el tratamiento y/o que está siendo tratado. En una realización, el mamífero es un ser humano. Los términos "sujeto", "individuo" y "paciente" abarcan, por tanto, a los individuos que tienen cáncer, incluidos, entre otros, cáncer de páncreas, adenocarcinoma de ovario o próstata, cáncer de mama, glioblastoma, etc., incluidos los que se han sometido o son candidatos para resección (cirugía) para extirpar tejido canceroso. Los sujetos pueden ser humanos, sino que también incluyen otros mamíferos, particularmente aquellos mamíferos útiles como modelos de laboratorio para la enfermedad humana, por ejemplo, ratón, rata, etc.

[0054] La definición de una muestra de paciente apropiada engloba sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido tales como una muestra de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de ellos y la progenie de los mismos. La definición también incluye muestras que hayan sido manipuladas de alguna manera después de su obtención, como por ejemplo mediante tratamiento con reactivos; lavado; o enriquecimiento para determinadas poblaciones de células, tales como células endometriales, células de enfermedad renal, células de enfermedad inflamatoria y/o células de rechazo de trasplante (GVHD). La definición también incluye muestras que han sido enriquecidas para tipos particulares de moléculas, por ejemplo, ácidos nucleicos, polipéptidos, etc. El término "muestra biológica" abarca una muestra clínica, y también incluye tejido obtenido por resección quirúrgica, tejido obtenido por biopsia, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, muestras de tejido, órganos, médula ósea, sangre, plasma, suero y similares. Una "muestra biológica" incluye una muestra obtenida de la célula de muestra de un paciente, por ejemplo, una muestra que comprende polinucleótidos y/o polipéptidos que se obtiene de la célula de muestra de un paciente (por ejemplo, un lisado celular u otro extracto celular que comprende polinucleótidos y/o polipéptidos).; y una muestra que comprende células de muestra de un paciente. Una muestra biológica que comprende una célula de muestra de un paciente también puede incluir células normales no enfermas.

[0055] El término "diagnóstico" se utiliza aquí para referirse a la identificación de un estado, enfermedad molecular o patológico o condición, tales como la identificación de la fibrosis.

[0056] La fibrosis es la acumulación excesiva de componentes de la matriz extracelular (ECM) en y alrededor de tejido inflamado o dañado, a menudo asociada con inflamación crónica o cáncer. La presencia de fibrosis puede detectarse por medios conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el examen del tejido para detectar un exceso de cicatrización. Antes de la fibrosis, se puede determinar que un individuo es susceptible basándose en un aumento indeseable de mediadores inflamatorios que pueden exacerbar la lesión tisular, tales como IL-1p, TNF-a y especies reactivas de oxígeno y nitrógeno. Pueden estar presentes mediadores profibróticos como TGF-p1. También están presentes miofibroblastos activados, que pueden ser resistentes a la inducción de apoptosis.

[0057] Los ejemplos de formas de fibrosis incluyen, pero no se limitan a, fibrosis tumor, fibrosis cardiaca, fibrosis de hígado, fibrosis de riñón, fibrosis pulmonar, cicatrización dérmica y queloides, y la enfermedad de Alzheimer. En otras realizaciones más, la fibrosis cardíaca está asociada con hipertensión, enfermedad cardíaca hipertensiva (HHD), infarto de miocardio (MI), cicatrización cardíaca relacionada con isquemia, insuficiencia cardíaca congestiva, cardiomiopatía, defectos posteriores al infarto de miocardio en la función cardíaca, aterosclerosis y reestenosis. La fibrosis renal puede incluir, pero no se limita a, nefropatía diabética, reflujo vesicoureteral, fibrosis renal tubulointersticial, glomerulonefritis o nefritis glomerular (GN), glomeruloesclerosis focal y segmentaria, glomerulonefritis membranosa o GN mesangiocapilar. La fibrosis hepática puede incluir, entre otros, cirrosis y afecciones asociadas como hepatitis viral crónica, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis alcohólica (ASH), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), cirrosis biliar primaria (CBP), cirrosis biliar, hepatitis autoinmune). La fibrosis pulmonar puede incluir fibrosis pulmonar idiopática (FPI) o alveolitis fibrosante criptogénica, neumonía intersticial fibrosante crónica, enfermedad pulmonar intersticial (EPI) y enfermedad pulmonar parenquimatosa difusa (DPLD), cicatrización pulmonar que incluye, entre otros, daño por infección bacteriana viral o micótica, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); y el asma crónica también se puede prevenir, tratar o mejorar con las composiciones descritas en el presente documento. También se incluye glaucoma; degeneración macular relacionada con la edad (AMD húmeda y AMD seca).

[0058] Fibrosis renal es la consecuencia de una acumulación excesiva de matriz extracelular que se produce en virtualmente cada tipo de enfermedad renal crónica. La patogenia de la fibrosis renal es un proceso progresivo que finalmente conduce a insuficiencia renal terminal, un trastorno devastador que requiere diálisis o trasplante de riñón. En una visión simplista, la fibrosis renal representa un proceso fallido de cicatrización de heridas del tejido renal después de una lesión crónica y sostenida. Se han identificado varias vías celulares, incluida la activación mesangial y de fibroblastos, así como la transición tubular epitelial-mesenquimal, como las principales vías para la generación de células productoras de matriz en condiciones enfermas.

[0059] La fibrosis pulmonar se caracteriza por la inflamación del pulmón y la reparación tisular anormal, lo que resulta en la sustitución de tejido funcional normal con una acumulación anormal de fibroblastos y deposición de colágeno en el pulmón. Este proceso implica interacciones celulares a través de un mecanismo complejo de señalización de citocinas y una mayor expresión del gen del colágeno, lo que finalmente da como resultado su depósito anormal de colágeno en el pulmón. Además de las células inflamatorias, los fibroblastos y los eventos de señalización que median la proliferación de fibroblastos y los miofibroblastos desempeñan funciones importantes en el proceso fibrótico. Sin embargo, los fármacos antiinflamatorios más potentes que se han utilizado ampliamente en el tratamiento de la fibrosis pulmonar no parecen interferir con la progresión de la enfermedad fibrótica.

[0060] Fibrosis hepática es una acumulación en el hígado de tejido conectivo en respuesta al daño hepatocelular de casi cualquier causa. Es el resultado de una producción excesiva o una degradación deficiente de la matriz extracelular. La fibrosis en sí no causa síntomas, pero puede provocar hipertensión portal o cirrosis.

[0061] La esclerosis sistémica es una enfermedad crónica de causa desconocida que se caracteriza por fibrosis difusa, cambios degenerativos, y anormalidades vasculares en la piel, las articulaciones y los órganos internos (especialmente el esófago, disminuir tracto Gl, pulmón, corazón y riñón). Los síntomas comunes incluyen el fenómeno de Raynaud, poliartralgia, disfagia, ardor de estómago e hinchazón y, finalmente, endurecimiento de la piel y contracturas de los dedos. La participación de los pulmones, el corazón y los riñones es la causa de la mayoría de las muertes. El tratamiento específico es difícil y, a menudo, se hace hincapié en el tratamiento de las complicaciones.

[0062] Una variedad de fármacos se han probado en varias fibrosis, particularmente fibrosis de pulmón, con muy poco éxito. Los fármacos antiinflamatorios que incluyen prednisolona y azatioprina tienen poco efecto sobre la fibrosis, lo que sugiere que la inflamación es solo el iniciador, pero no el impulsor de la enfermedad. El uso de antiproliferativos no específicos como colchicina y ciclofosfamida también evitará la reparación del tejido fibrótico al afectar, por ejemplo, el crecimiento epitelial. El tratamiento con IFN-y ha demostrado cierta utilidad pero está limitado por efectos secundarios graves.

[0063] En el momento en que un paciente típico presenta con síntomas relacionados con la fibrosis (por ejemplo, dificultad para respirar por la fibrosis pulmonar, cirrosis para la fibrosis hepática, etc.), la fibrosis en el órgano diana es a menudo bastante severa, con gran parte de la arquitectura del órgano diana que ha sido reemplazada por matriz extracelular. Detener esta fibrosis en curso puede prolongar la vida útil y mejorar la calidad de vida. Las áreas del órgano diana donde la fibrosis no es extensa se pueden restaurar a la arquitectura normal con el tratamiento adecuado.

[0064] En algunas realizaciones, fibrosis tumor está asociada con el cáncer de páncreas. El cáncer de páncreas se caracteriza por una reacción desmoplásica/estromal prominente. Las células estrelladas pancreáticas (CEP) son la principal fuente de fibrosis en el estroma e interactúan estrechamente con las células cancerosas para crear un entorno facilitador del tumor que estimula el crecimiento del tumor local y la metástasis a distancia. La fibrosis pancreática se inicia cuando las CEP se activan y experimentan cambios morfológicos y funcionales, de modo que la tasa de deposición de la matriz extracelular (ECM) excede la tasa de degradación de la ECM en la glándula. Ahora está bien establecido que las células de cáncer de páncreas activan las CEP que conducen a un aumento de la fibrosis. Existe evidencia significativa que muestra que la intensa reacción estromal/desmoplásica alrededor de los elementos tumorales (una característica de la mayoría de los cánceres de páncreas) juega un papel importante en la progresión del tumor.

[0065] Una característica histopatológica clave del cáncer de páncreas que se asocia con su agresividad clínica y biológica innata es su reacción desmoplástica (estromal). La producción de estroma es estimulada por factores de crecimiento derivados de células cancerosas, incluido el factor de crecimiento transformante-p (TGFp), el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) y el crecimiento epidérmico factor (EGF). La reacción desmoplástica está compuesta por proteínas de la matriz extracelular (MEC), principalmente colágeno de tipo I y III, fibronectina y proteoglicanos; pequeños vasos revestidos de endotelio; y una población diversa de células que incluyen células inflamatorias, fibroblastos y células estrelladas. El estroma puede formar hasta el 90% del volumen del tumor, una propiedad que es exclusiva del cáncer de páncreas. El microambiente tumoral en el cáncer de páncreas juega un papel en su quimiorresistencia.

[0066] Mientras que las células estromales no exhiben las transformaciones genéticas observadas en las células de cáncer de páncreas malignas, que son alteradas por citoquinas y factores de crecimiento secretados por las células inflamatorias y células tumorales. Recíprocamente, las células del estroma promueven la migración, el crecimiento, la invasión y la resistencia de las células tumorales a los fármacos y la apoptosis. La tinción de secciones de tejido de cáncer de páncreas de pacientes para alfa actina de músculo liso (a-SMA, el marcador de proteína citoesquelética para la activación de CEP) y colágeno, muestra un índice de estroma activado alto (a-SMA/colágeno) correlacionado con un mal pronóstico. El depósito extenso de ECM por las CEP en el cáncer de páncreas provoca la distorsión y la compresión de la vasculatura del tumor por el tejido fibroso, lo que contribuye a la hipoxia tumoral, un determinante de la quimiorresistencia.

[0067] Los "inhibidores", "activadores" y "moduladores" de AXL, MER o Tyro3 o su ligando GAS6 se utilizan para referirse a moléculas inhibidoras, activadoras o moduladoras, respectivamente, identificadas utilizando ensayos in vitro e in vivo para el receptor o unión o señalización de ligandos, por ejemplo, ligandos, receptores, agonistas, antagonistas y sus homólogos y miméticos.

[0068] Por "inhibidor" se entiende un agente que es capaz de reducir o abolir la interacción entre GAS6 y un receptor TAM. Preferiblemente, dicho inhibidor puede reducir o abolir la interacción en al menos 10, 20, 30, 40%, más preferiblemente en al menos 50, 60, 70% y lo más preferiblemente en al menos 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100%. Se incluyen polipéptidos que incluyen, sin limitación, anticuerpos, polinucleótidos, moléculas pequeñas y similares que actúan para inhibir las rutas de señalización de GAS6 y/o AXL.

[0069] Los ejemplos no limitantes de inhibidores de moléculas pequeñas incluyen ONO-9330547, que es un inhibidor de molécula pequeña que se une a quinasa Axl y Mer con una potencia (IC) de 2,2 y 0,4 nM, ver ASH abstracts 2014, # 999. El inhibidor específico de Axl, TP-0903 (Tolero Pharmaceuticals), ver As H abstracts 2014, n° 2350 puede usarse solo o en combinación con el inhibidor de FLT3 PKC412 (Park et al, Blood 121,2064-73, 2013).

[0070] Los inhibidores de interés también incluyen LY2801653 (Eli Lilly and Co) Journal of the American Association for Cancer Research. 2013; 19: 5699-5710. Investigational new drugs. 2013; 31: 833-844; MP-470 o Amuvatinib (Astex Pharm). Oncogén. 2007; 26: 3909-3919; SKI-606, PF-5208763 o Bosutinib, (Pfizer), Carcinogenesis. 2014; 35: 769­ 775; MGCD 265 (Mirati). Journal of Clinical Oncology. 2010; 28: e13595. European journal of cancer. 2012; 48:95-96; MGCD 516 (Mirati). Poster:#6130 Proceedings: AACR 104th Annual Meeting 2013; Apr 6-10, 2013; (Washington, DC); ASP2215 (Astellas) J Clin Oncol 32:5s, 2014 (suppl; abstr 7071), J Clin Oncol 32:5s, 2014 (suppl; abstr 7070), Blood.

2013; 121:2064-2073; XL184/Cabozanitinib (Exelixis). Molecular cancer therapeutics. 2011;10:2298-2308; BMS 777607 or ASLAN 002. Journal of medicinal chemistry 52, 1251---1254 (2009); GSK163089/XL880 or Foretinib (GSK). Cancer research. 2009; 69:6871-6878; SGI-7079 (Astex Pharma) Cancer research. 2013; 73:6516-6525., Clinical cancer research: 2013; 19:279-290; S49076 (Servier) Molecular cancer therapeutics. 2013; 12:1749-1762; R428/BGB324, (BergenBio). Oncogene. 1997; 14:2619-2631.Nature biotechnology. 2013; 31:775-776; DP3975 (Deciphera Biotech). Oncogene.2011; 30:1643-1652; NPS-1034 (NeoPharma). Cancer research. 2014; 74:253-262; LDC 126. Nature. 2014; 507:508-512; NA80x1. Cancer research. 2008; 68:1905-1915; PF-2341066/Crizotinib (Pfizer) Nature biotechnology 29, 1046— 1051 (2011), ACS medicinal chemistry letters 2, 907—912 (2011); Vandetinib. Nature biotechnology 29, 1046— 1051 (2011); Sunitinib. (Pfizer). Nature biotechnology 29, 1046— 1051 (2011). Br J Cancer 101, 1717— 1723 (2009); Lestaurtinib/CEP-701. Nature biotechnology 29, 1046---1051 (2011); CEP-40783 (Teva) . Abstract #C272, EORTCAACR Oct. 19-23, 2013, Abstract #C275, EORTC-AACR Oct. 19-23, 2013; Neratinib. Nature biotechnology 29, 1046— 1051 (2011); AT9283. Journal of medicinal chemistry 52, 379—388 (2009); R406. Nature biotechnology 29, 1046--- 1051 (2011); MK-2461. Journal of medicinal chemistry 52, 1251---1254 (2009); SU-14813. Nature biotechnology 29, 1046— 1051 (2011); BMS-796302. Nature reviews. Clinical oncology 9, 314-326 (2012); JNJ—28312141. Nature bitechnology 29, 1046— 1051 (2011). Molecular cáncer therapeutics 8, 3151—3161 (2009); Diaminopyrimidine. ACS medicinal chemistry letters 2, 907—912 (2011); Warfarin. JASN (1999) vol. 10 n° 122503­ 2509; UNC569, UNC1062, UNC1666 , UNC2025 descrito en ACS Medicinal Chemistry Letters 3, 129- -134 (2012). Molecular cancer therapeutics 12, 2367—2377 (2013). J Clin Invest 123, 2257-2267 (2013). European journal of medicinal chemistry 65, 83—93 (2013). Blood 122, 3849 (2013). American Association of Cancer Researchers Annual Meeting, San Diego, CA, Abstract #1740 (2014). Journal of medicinal chemistry 57, 7031—7041 (2014).

[0071] Los anticuerpos monoclonales que se dirigen específicamente AXL se han descrito, incluyendo 12A11, Mab173, YW327.6S2 y, más recientemente, D9 y E8. Otros incluyeron el anticuerpo monoclonal de Chugai contra AXL, el anticuerpo monoclonal de BergenBio contra AXL y el monoclonal de Amgen contra GAS6. Disminuciones mediadas por anticuerpos en la expresión de AXL en la superficie celular inducida por apoptosis, mayor sensibilidad a la quimioterapia e inhibición del crecimiento del xenoinjerto de NSCLC, cáncer de páncreas y sarcoma de Kaposi. De manera similar, un anticuerpo que reconoce MERTK inhibió la migración en las células de glioblastoma y disminuyó el potencial de formación de colonias y la quimiorresistencia de las líneas celulares de NSCLC, que fenocopía los efectos de la caída de MERTK.

[0072] Los anticuerpos que también se han reportado señalización de bloqueo TYRO3-dependiente. Se ha desarrollado un aptámero con alta afinidad por AXL (con una constante de disociación (Kd) de 12 nM) y se ha demostrado que media la inhibición de la actividad de AXL en modelos de NSCLC, disminuyendo la migración de células tumorales, la invasión y el crecimiento tumoral de xenoinjerto. Los dominios extracelulares de TAM RTK pueden unirse al ligando con alta afinidad y, por lo tanto, pueden funcionar como "sumideros" para eliminar el ligando libre. Se han generado proteínas recombinantes que consisten en todo o parte del dominio extracelular de AXL, MERTK o TYRO3 fusionado a un dominio Fc derivado de inmunoglobulina G humana (IgG) e inhiben tanto la supervivencia de células tumorales dependientes de GAS6 en cultivo como la metástasis en animales. modelos. Además, los sumideros de ligandos AXL y MERTK han sido eficaces para prevenir la agregación plaquetaria y la formación de coágulos in vivo.

[0073] Véase, por ejemplo, Varnum et al. Nature 373, 623 - 626 (1995); Stitt y col. Cell 80, 661-670 (1995); Nagata y col. J. Biol. Chem. 271, 30022 - 30027 (1996); Angelillo-Scherrer et al. J. Clin. Invertir. 115, 237-246 (2005); Park y col. Blood 121,2064-2073 (2013); Rankin y col. Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU. 111 13373-13378 (2014); Liu y col. Blood 116, 297-305 (2010); Rogers y col. Oncogene 31, 4171-4181 (2012); Li y col. Oncogene 28, 3442-3455 (2009); Ye et al. Oncogene 29, 5254-5264 (2010); Leconet y col. Oncogene (2013); Kariolis y col. Nature Chem. Biol. 10, 977 - 983 (2014); Cummings y col. Oncotarget 26 de junio de 2014; Demarest y col. Biochemistry 52, 3102-3118 (2013); Cerchia, L. et al. Mol. El r.20, 2291-2303 (2012); Avilla, E. et al. Cancer Res. 71, 1792-1804 (2011); Sather, S. et al. Blood 109, 1026-1033 (2007); ANTICANCER RESEARCH 34: 1821-1828 (2014); Abstract 5158_AACR 13 de abril_2013: Generación de un completamente humano de anticuerpos neutralizantes de GAS6 con la actividad anti-tumor in vivo.

[0074] Como se usa en el presente documento, los términos "tratamiento", "tratar'1, y similares, se refieren a la administración de un agente, o realización de un trámite con el fin de obtener un efecto. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir total o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de efectuar una cura parcial o completa de una enfermedad y/o síntomas de la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en este documento, cubre cualquier tratamiento de fibrosis en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir el desarrollo de fibrosis; (b) inhibir la fibrosis en curso, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la fibrosis, es decir, provocar la regresión.

[0075] El tratamiento puede referirse a cualquier indicio de éxito en el tratamiento o mejora o previene la fibrosis, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo como la reducción; remisión; disminución de los síntomas o hacer que la enfermedad sea más tolerable para el paciente; desaceleración en la tasa de degeneración o declive; o hacer que el punto final de la degeneración sea menos debilitante. El tratamiento o la mejoría de los síntomas puede basarse en parámetros objetivos o subjetivos; incluidos los resultados de un examen realizado por un médico. Por consiguiente, el término "tratar" incluye la administración de los compuestos o agentes de la presente invención para prevenir o retrasar, aliviar o detener o inhibir el desarrollo de los síntomas o afecciones asociadas con la fibrosis. El término "efecto terapéutico" se refiere a la reducción, eliminación o prevención de la enfermedad, síntomas de la enfermedad o efectos secundarios de la enfermedad en el sujeto.

[0076] "En combinación con", "terapia de combinación" y "productos de combinación" se refieren, en ciertas realizaciones, a la administración concurrente a un paciente de un primer terapéutico (es decir, primer agente terapéutico) y los compuestos como se usa en el presente documento. Cuando se administra en combinación, cada componente se puede administrar al mismo tiempo o secuencialmente en cualquier orden en diferentes momentos. Por tanto, cada componente puede administrarse por separado pero lo suficientemente cerca en el tiempo como para proporcionar el efecto terapéutico deseado. Los primeros agentes terapéuticos contemplados para su uso con los métodos de la presente invención incluyen cualquier otro agente para su uso en el tratamiento de la fibrosis. Los ejemplos de tales agentes terapéuticos incluyen pero no se limitan a agentes antifibróticos.

[0077] "Administración concomitante" de un agente terapéutico conocido con una composición farmacéutica de la presente invención significa la administración del agente terapéutico y el agente inhibidor en el momento en que tanto el agente terapéutico conocido como la composición de la presente invención tendrán un efecto terapéutico. Tal administración concomitante puede implicar la administración concurrente (es decir, al mismo tiempo), anterior o posterior del fármaco con respecto a la administración de un compuesto de la presente invención. Una persona con experiencia normal en la técnica no tendría dificultad para determinar el momento, la secuencia y las dosis apropiadas de administración para fármacos y composiciones particulares de la presente invención. Los agentes terapéuticos contemplados para la administración concomitante según los métodos de la presente invención incluyen cualquier otro agente para uso en el tratamiento de la fibrosis.

[0078] Tal como se utiliza aquí, el término "correlatos," o "se correlaciona con", y términos similares, se refiere a una asociación estadística entre instancias de dos eventos, donde los eventos incluyen números, conjuntos de datos y similares. Por ejemplo, cuando los eventos implican números, una correlación positiva (también denominada en el presente documento "correlación directa") significa que a medida que uno aumenta, el otro también aumenta. Una correlación negativa (también denominada en el presente documento "correlación inversa") significa que a medida que una aumenta, la otra disminuye.

[0079] "Unidad de dosificación" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el individuo en particular a ser tratada. Cada unidad puede contener una cantidad predeterminada de compuesto(s) activo(s) calculado(s) para producir el (los) efecto(s) terapéutico(s) deseado(s) en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas de dosificación unitaria puede ser dictada por (a) las características únicas del (de los) compuesto(s) activo(s) y el (los) efecto(s) terapéutico(s) particular(es) que se desea lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de combinar dicho(s) compuesto(s) activo(s).

[0080] "Excipiente farmacéuticamente aceptable" significa un excipiente que es útil para preparar una composición farmacéutica que es generalmente segura, no tóxica y deseable, e incluye excipientes que son aceptables para uso veterinario así como para uso farmacéutico humano. Dichos excipientes pueden ser sólidos, líquidos, semisólidos o, en el caso de una composición en aerosol, gaseosos.

[0081] Los términos "farmacéuticamente aceptable", "fisiológicamente tolerable" y variaciones gramaticales de los mismos, como se refieren a composiciones, vehículos, diluyentes y reactivos, se usan indistintamente y representan que los materiales son capaces de administración a o sobre un ser humano sin la producción de efectos fisiológicos indeseables en un grado que prohibiría la administración de la composición.

[0082] Una "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad que, cuando se administra a un sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para el efecto de tratamiento para esa enfermedad.

[0083] La frase "determinación de la eficacia del tratamiento" y variantes de los mismos pueden incluir cualquiera de los métodos para la determinación de que un tratamiento está proporcionando un beneficio a un sujeto. El término "eficacia del tratamiento" y las variantes del mismo se indican generalmente mediante el alivio de uno o más signos o síntomas asociados con la enfermedad y un experto en la técnica puede determinarlo fácilmente. La "eficacia del tratamiento" también puede referirse a la prevención o mejora de los signos y síntomas de toxicidades típicamente asociadas con los tratamientos estándar o no estándar de una enfermedad. La determinación de la eficacia del tratamiento suele ser una indicación y una enfermedad específica y puede incluir cualquier método conocido o disponible en la técnica para determinar que un tratamiento está proporcionando un efecto beneficioso a un paciente. Por ejemplo, la evidencia de la eficacia del tratamiento puede incluir, pero no se limita a, la remisión de la enfermedad o la indicación. Además, la eficacia del tratamiento también puede incluir mejoras generales en la salud general del sujeto, como, entre otras, la mejora de la calidad de vida del paciente, el aumento de la tasa de supervivencia prevista del sujeto, la disminución de la depresión o la disminución de la tasa de recurrencia de la indicación (aumento en tiempo de remisión). (Véase, por ejemplo, Physicians' Desk Reference (2010).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES

[0084] AXL, MER, TYRO3 y GAS6, así como las vías relacionadas, han sido descritas en WO2011/091305, así como la aplicación Estados Unidos Números de serie 13/554,954 y 13/595,936.

[0085] En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención se pueden usar para el tratamiento, prevención o reducción de la fibrosis, con una dosis eficaz de un inhibidor de unas vías de señalización GAS6 o AXL asociadas.

[0086] En algunas realizaciones, el agente inhibidor se une a dos o más epítopos en una única molécula de GAS6. Los dos o más epítopos pueden incluir al menos uno de los sitios de unión de AXL mayor y/o menor en GAS6. En algunas realizaciones, los epítopos son epítopos separados o distintos. En algunas realizaciones, los epítopos se superponen. En algunas realizaciones, los epítopos no se solapan. En algunas realizaciones, los epítopos son adyacentes. En algunas realizaciones, los epítopos no son adyacentes. En algunas realizaciones, los epítopos incluyen el sitio de unión de AXL principal y/o menor en GAS6. Estos epítopos de GAS6 de la presente invención, y a los que se unen los agentes inhibidores de la presente invención, pueden localizarse en una o más moléculas de GAS6. En algunas realizaciones, los epítopos se encuentran en una única molécula de GAS6.

[0087] En algunas realizaciones, el agente inhibidor es capaz de unirse a los sitios de unión a AXL principales y/o menores en una sola GAS6. En algunas realizaciones, el agente inhibidor es capaz de unirse al sitio de unión principal de AXL de GAS6 y uno o más epítopos de GAS6 adicionales. En otras realizaciones, el agente inhibidor es capaz de unirse al sitio de unión menor de AXL en GAS6 y uno o más epítopos adicionales. En algunas otras realizaciones, el agente inhibidor es capaz de unirse a dos o más epítopos distintos en GAS6. Los epítopos de GAS6 adicionales pueden incluir cualquier epítopo en GAS6 que conduzca a una mayor afinidad y/o una mayor avidez del agente inhibidor que se une a GAS6 en comparación con AXL de tipo silvestre. En algunas realizaciones, los polipéptidos variantes de AXL de la presente invención se unen a dos epítopos en una única molécula de GAS6. En algunas realizaciones, los dos epítopos son los sitios de unión a AXL mayor y menor.

[0088] Los receptores GAS6 incluyen AXL, MER y TYRO3. Los agentes inhibidores de la presente invención también pueden en algunas realizaciones antagonizar la interacción principal y/o menor GAS6/receptor. En algunas realizaciones, el agente inhibidor es capaz de antagonizar la interacción principal y/o menor de unión de GAS6/receptor. En otras realizaciones, el agente inhibidor es capaz de antagonizar la interacción de unión principal GAS6/receptor (p. ej., interfiriendo y/o inhibiendo la interacción principal de unión a GAS6/receptor). En algunas realizaciones, el agente inhibidor es capaz de antagonizar la interacción menor de unión de GAS6/receptor (p. ej., interfiriendo y/o inhibiendo la Interacción menor de unión a GAS6/receptor).

[0089] Los agentes inhibidores también pueden incluir, por ejemplo, estructuras proteicas (es decir, proteínas más pequeñas que son capaces de lograr una afinidad y especificidad comparables utilizando estructuras moleculares que pueden ser, por ejemplo, una décima parte del tamaño de los anticuerpos completos). Los agentes inhibidores también pueden incluir polipéptidos que no son anticuerpos. En algunas realizaciones, el agente inhibidor es un polipéptido no anticuerpo. En algunas realizaciones, el polipéptido no anticuerpo puede incluir pero no se limita a pepticuerpos, darpinas, avímeros, adnectinas, anticalinas, afficuerpos, maxicuerpos u otro armazón estructural de proteínas, o una combinación de los mismos.

[0090] En algunas realizaciones, el agente inhibidor proporcionado por la presente invención es un polipéptido variante AXL, por ejemplo, un polipéptido variante AXL que tiene una actividad de unión a GAS6 que es sustancialmente igual a o mejor que la unión actividad de un polipéptido AXL de tipo silvestre. En algunas realizaciones de la presente invención, los polipéptidos variantes de a X l se utilizan como agentes terapéuticos.

[0091] La proteína de AXL, con referencia a la secuencia nativa de la SEQ ID NO: 1, comprende un dominio inmunoglobulina de tipo (Ig) de los residuos 27-128, un segundo dominio de tipo Ig de los residuos 139-222, dominios de fibronectina tipo 3 de los residuos 225-332 y 333-427, dominio intracelular de los residuos 473-894 que incluye el dominio de tirosina quinasa. Los residuos de tirosina en 779, 821 y 866 se autofosforilan tras la dimerización del receptor y sirven como sitios de acoplamiento para moléculas de señalización intracelular. El sitio de escisión nativo para liberar la forma soluble del polipéptido se encuentra en los residuos 437-451.

[0092] Para los fines de la invención, una forma soluble de AXL (polipéptido soluble de AXL, Saxl o Saxl) incluye ambos polipéptidos variantes AXL de tipo silvestre y Axl y es la porción del polipéptido que es suficiente para unirse GAS6 en una afinidad reconocible, por ejemplo, alta afinidad, que normalmente se encuentra entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, es decir, generalmente de aproximadamente SEQ ID NO: 1 residuo 19-437, pero que puede comprender o consistir esencialmente en una versión truncada de aproximadamente el residuo 19, 25, 30, 35, 40, 45, 50 hasta aproximadamente el residuo 132, 450, 440, 430, 420, 410, 400, 375, 350, a 321, por ejemplo, residuo 19-132. De acuerdo con los métodos de la presente invención, SEQ ID NO: 1 puede usarse indistintamente con los aminoácidos 8-894 de SEQ ID NO: 1, los cuales se refieren ambos a la secuencia AXL de tipo silvestre. En algunas realizaciones, una forma soluble de AXL carece del dominio transmembrana y, opcionalmente, del dominio intracelular.

[0093] En algunas realizaciones, el agente inhibidor es un polipéptido variante AXL que carece del dominio de AXL transmembrana y tiene al menos una mutación con relación al tipo silvestre que aumenta la afinidad de la unión de polipéptido AXL a GAS6 en comparación con GAS6 de tipo silvestre.

[0094] La proteína MER, con referencia a SEQ ID NO: 2 nativo, comprende un dominio de inmunoglobulina de tipo (Ig) de los residuos 81-186, un segundo dominio de tipo Ig de los residuos 197-273, dominios de fibronectina de tipo 3 de residuos 284-379 y 383-482, dominio intracelular de los residuos 527-999 que incluye dominio de tirosina quinasa. Los residuos de tirosina en 749, 753, 754 y 872 se autofosforilan tras la dimerización del receptor y sirven como sitios de acoplamiento para moléculas de señalización intracelular.

[0095] Una forma soluble de MER (sMER) es la porción del polipéptido que es suficiente para unirse a GAS6 con una afinidad reconocible, por ejemplo, alta afinidad, que normalmente se encuentra entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, es decir, generalmente de aproximadamente SEQ. ID NO: 2 residuo 21-526, pero que puede comprender o consistir esencialmente en una versión truncada. En algunas realizaciones, una forma soluble de MER carece del dominio transmembrana (es decir, generalmente de aproximadamente SEQ ID NO: 2 residuo 506-526), y opcionalmente el dominio intracelular (es decir, generalmente de aproximadamente SEQ ID NO: 2 residuo 527-999).

[0096] La proteína de TYRO3, con referencia a la SEQ ID NO: 3 nativa, comprende un dominio de inmunoglobulina de tipo (Ig) de los residuos 41-128, un segundo dominio de tipo Ig de los residuos 139-220, dominios de fibronectina de tipo 3 de residuos 225-317 y 322-413, dominio intracelular de los residuos 451-890 que incluye el dominio tirosina quinasa. Los residuos de tirosina en 681, 685, 686 y 804 se autofosforilan tras la dimerización del receptor y sirven como sitios de acoplamiento para moléculas de señalización intracelular.

[0097] Una forma soluble de TYRO3 (sTyro3) es la porción del polipéptido TYRO3 que es suficiente para unirse GAS6 a una afinidad reconocible, por ejemplo, de alta afinidad, que normalmente se encuentra entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, es decir, generalmente de aproximadamente SEQ ID NO: 3 residuo 41-450, pero que puede comprender o consistir esencialmente en una versión truncada. En algunas realizaciones, una forma soluble de AXL carece del dominio transmembrana (es decir, generalmente de aproximadamente SEQ ID NO: 3 residuo 430-450) y, opcionalmente, el dominio intracelular (es decir, generalmente de aproximadamente SEQ ID NO: 3 residuo 451-890).

[0098] En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL carece del dominio transmembrana AXL y es un polipéptido variante soluble, por ejemplo, polipéptidos (Saxl, polipéptido variante). En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL carece del dominio intracelular AXL. En algunas realizaciones, el agente inhibidor de la presente invención inhibe la unión entre un polipéptido AXL de tipo silvestre y una proteína GAS6 in vivo o in vitro. En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL inhibe la unión entre un polipéptido AXL de tipo silvestre y una proteína GAS6 in vivo o in vitro.

[0099] Los agentes inhibidores de la presente invención también pueden exhibir un perfil mejorado o mejor farmacocinético. En algunas realizaciones, el perfil farmacocinético mejorado incluye, por ejemplo, pero no se limita a un mejor perfil de absorción, mejor perfil de distribución, mejor perfil de metabolismo, mejor perfil de excreción, mejor perfil de liberación, mayor vida media, disminución de la vida media, velocidad de acción más rápida, mayor duración del efecto en comparación con los polipéptidos AXL de tipo silvestre, MER y/o Tyro3 que no carecen de un dominio transmembrana. Un experto en la técnica entendería los parámetros de perfil farmacocinético preferidos para necesidades particulares que incluyen, por ejemplo, regímenes de tratamiento, y cómo implementar adecuadamente dichos parámetros en los regímenes de tratamiento, y un experto en la técnica comprendera.

[0100] El AXL, MER y TYRO3 de tipo silvestre todos contienen dos dominios de fibronectina. En algunas realizaciones, los polipéptidos AXL de la invención carecen de un dominio de fibronectina funcional (FN). La ausencia o ausencia de un dominio de fibronectina funcional puede incluir, pero no se limita a, la eliminación de uno o ambos dominios de fibronectina y/o la introducción de mutaciones que inhiben, reducen o eliminan la funcionalidad de uno o ambos dominios de fibronectina, donde tales mutaciones pueden incluir, por ejemplo, pero no se limitan a mutaciones de sustitución, deleción e inserción. En algunas realizaciones, los polipéptidos de la invención tienen fibronectina 1 (FN1) eliminada, fibronectina 2 (FN2) eliminada o FN1 y FN2 eliminados. En algunas realizaciones, los polipéptidos de la invención tienen partes de FN1 mutadas y/o eliminadas, FN2 mutadas y/o eliminadas, o FN1 y FN2 mutadas y/o eliminadas.

[0101] En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL carece de un dominio de AXL funcional, la fibronectina (FN). En algunas realizaciones, el polipéptido variante de AXL exhibe una mayor afinidad de la unión del polipéptido a GAS6 en comparación con el AXL de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL carece de un dominio de fibronectina funcional (FN) y también exhibe una mayor afinidad de la unión del polipéptido a GAS6 en comparación con AXL de tipo silvestre.

[0102] En algunas realizaciones, la falta de un dominio de fibronectina funcional resulta en aumento de la afinidad del polipéptido AXL de unión a GAS6. En algunas realizaciones, la falta de un dominio de fibronectina funcional da como resultado un perfil farmacocinético mejorado, que incluye, por ejemplo, pero no se limita a un mejor perfil de absorción, mejor perfil de distribución, mejor perfil de metabolismo, mejor perfil de excreción, mejor perfil de liberación, aumento de la vida media, vida media disminuida, velocidad de acción más rápida,mayor duración del efecto en comparación con otros polipéptidos de tipo silvestre u otros polipéptidos que no carecen de un dominio de fibronectina funcional. Un experto en la técnica comprendería los parámetros de perfil farmacocinético preferidos para necesidades particulares, incluidos, por ejemplo, regímenes de tratamiento, y cómo implementar de forma apropiada dichos parámetros en regímenes de tratamiento.

[0103] En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL carece del dominio transmembrana y tiene más de un dominio Ig1 y exhibe afinidad incrementada del polipéptido AXL de unión a GAS6 en comparación con el AXL de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido a Xl tiene dos dominios Ig1. En algunas realizaciones, el polipéptido AXL tiene tres dominios Ig1. En algunas realizaciones, el polipéptido AXL tiene más de un dominio Ig1 y/o más de un dominio Ig2. En algunas realizaciones, el polipéptido AXL tiene dos dominios Ig2. En algunas realizaciones, el polipéptido AXL tiene dos dominios Ig1 y 2 dominios Ig2. En algunas realizaciones, el polipéptido AXL incluye, por ejemplo, pero no se limita a, una de las siguientes configuraciones de dominio de Ig, así como cualquier combinación o variación de las mismas: Ig1; Ig1 - Ig2; Ig1 - Ig1; Ig1 - Ig1 - Ig1; Ig1 - Ig2 - Ig1; Ig1 - Ig2 - Ig1 - Ig2.

[0104] En algunas realizaciones, el polipéptido AXL también carece del dominio de transmembrana AXL y/o exhibe aumento de la afinidad del polipéptido AXL de unión a GAS6. En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL carece del dominio transmembrana, tiene más de un dominio Ig1, tiene más de un dominio Ig2 y exhibe una mayor afinidad de la unión del polipéptido AXL a GAS6 en comparación con AXL de tipo silvestre.

[0105] En algunas realizaciones, el AXL tiene los dominios de inmunoglobulina conectados directamente entre sí. En algunas realizaciones, el AXL tiene los dominios de inmunoglobulina conectados indirectamente, por ejemplo, a través de una molécula enlazadora que incluye, por ejemplo, cualquier enlazador de aminoácidos conocido en la técnica.

[0106] En algunas realizaciones, el uno o más dominios AXL Ig1 y/o 1 o más AXL Ig2 dan como resultado un perfil farmacocinético mejorado, que incluye, por ejemplo, pero no se limita a, un mejor perfil de absorción, mejor perfil de distribución, mejor perfil de metabolismo, mejor perfil de excreción, mejor perfil de liberación, vida media aumentada, vida media disminuida, velocidad de acción más rápida, mayor duración del efecto en comparación con otros polipéptidos de tipo silvestre u otros polipéptidos que no carecen de un dominio de fibronectina funcional. Un experto en la técnica comprendería los parámetros de perfil farmacocinético preferidos para necesidades particulares, incluidos, por ejemplo, regímenes de tratamiento, y cómo implementar de forma apropiada dichos parámetros en regímenes de tratamiento.

[0107] En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL carece del dominio transmembrana y AXL es capaz de unión a dos o más epítopos en una sola GAS6. En algunas realizaciones, el polipéptido variante de AXL carece del dominio transmembrana de AXL y es capaz de unirse tanto a los sitios de unión de AXL principal como a los secundarios en un solo GAS6. En algunas realizaciones, la unión de los sitios de unión de AXL principal y secundario es simultánea. En algunas realizaciones, la unión de los sitios de unión de AXL mayor y menor es simultánea en un solo GAS6.

[0108] La presente invención también proporciona polipéptidos variantes AXL que no se unen dos epítopos en una única molécula de GAS6. La presente invención también proporciona polipéptidos variantes de AXL que no se unen a dos epítopos en una sola molécula de GAS6 simultáneamente. En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL no es capaz de unir dos epítopos en un solo GAS6, esto incluye, por ejemplo, polipéptidos variantes AXL monoméricos. En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL monomérico comprende un dominio Ig1. En algunas realizaciones, el polipéptido variante de AXL monomérico es un polipéptido de fusión Fc que no se une a más de un sitio en una sola molécula de GAS6 simultáneamente. En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL monomérico que no es capaz de unir dos epítopos en un solo GAS6 comprende dos polipéptidos variantes AXL, cada uno de los cuales no es capaz de unir dos epítopos en un solo GAS6 simultáneamente. En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL monomérico que no es capaz de unir simultáneamente dos epítopos en un solo GAS6 tiene un dominio Ig1. En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL monomérico que no es capaz de unirse simultáneamente a dos epítopos en un solo GAS6 tiene una vida media alterada en comparación con los polipéptidos variantes AXL que son capaces de unirse a dos epítopos en un solo GAS6. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene un dominio Ig1 y carece de un dominio Ig2 funcional. En algunas realizaciones, el dominio Ig1 comprende los aminoácidos 1-131 de AXL (SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, el polipéptido es un polipéptido variante AXL soluble, en donde dicho polipéptido variante AXL soluble carece del dominio transmembrana AXL, tiene un dominio Ig1, carece de un dominio Ig2 funcional y en donde dicho polipéptido variante AXL muestra una mayor afinidad de la unión del polipéptido variante AXL. a g AS6 en comparación con AXL de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido es un polipéptido variante de AXL soluble, en donde dicho polipéptido variante de AXL soluble carece del dominio transmembrana AXL, carece de un dominio de fibronectina funcional (FN), tiene un dominio Ig1, carece un dominio de Ig2 funcional y en donde dicho polipéptido variante de AXL muestra una mayor afinidad de la unión del polipéptido variante de AXL a GAS6 en comparación con AXL de tipo silvestre.

[0109] El AXL, MER y Tyro3 de tipo silvestre contienen todos un dominio Ig2. En algunas realizaciones, los polipéptidos AXL de la invención carecen de un dominio Ig2 funcional. La ausencia o ausencia de un dominio Ig2 funcional puede incluir, entre otros, la eliminación del dominio Ig2 y/o la introducción de mutaciones que inhiben, reducen o eliminan la funcionalidad del dominio Ig2, donde tales mutaciones pueden incluir, por ejemplo, pero no se limitan a mutaciones de sustitución, deleción e inserción. En algunas realizaciones, los polipéptidos de la invención carecen de un dominio Ig2 funcional. En algunas realizaciones, los polipéptidos de la invención carecen de un dominio Ig2 funcional y tienen un dominio Ig1 AXL de tipo silvestre. En algunas realizaciones, los polipéptidos de la invención carecen de un dominio Ig2 funcional y tienen una o más mutaciones en el dominio Ig1 con respecto al dominio Ig1 AXL de tipo silvestre.

[0110] En algunas realizaciones, el polipéptido variante de AXL incluye un enlazador. Se conoce en la técnica una amplia variedad de enlazadores y se puede emplear cualquier enlazador conocido con los métodos de la presente invención. En algunas realizaciones, el polipéptido variante de AXL incluye uno o más enlazadores o unidades enlazadoras. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador de aminoácidos, que incluye una secuencia de aminoácidos de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos que son diferentes de las secuencias de AXL de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el enlazador tiene 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más unidades. En algunas realizaciones, el enlazador es (GLY⁾⁴ SER (SEQ ID NO: 10). En algunas realizaciones, el enlazador tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más unidades (GLY⁾⁴ SER. En algunas realizaciones, el enlazador tiene 1, 2, 3 o 5 unidades (GLY⁾⁴ SER. En algunas realizaciones, los enlazadores se encuentran entre el polipéptido variante AXL y la porción Fc de un polipéptido de fusión. En algunas realizaciones, los enlazadores están entre el polipéptido variante a Xl y la porción Fc de un polipéptido de fusión y el polipéptido variante AXL carece de un dominio de fibronectina funcional.

[0111] En algunas realizaciones, los polipéptidos variantes AXL de la presente invención también incluyen una o más modificaciones de aminoácidos dentro de la forma soluble de tipo silvestre AXL, por ejemplo, una o más modificaciones de aminoácidos que aumentan su afinidad para GAS6. Según la presente invención, las modificaciones de aminoácidos incluyen cualquier modificación de aminoácidos de origen natural o artificial conocida o descubierta posteriormente en el campo. En algunas realizaciones, las modificaciones de aminoácidos incluyen cualquier mutación de origen natural, por ejemplo, sustitución, deleción, adición, inserción, etc. En algunas otras realizaciones, las modificaciones de aminoácidos incluyen reemplazar el aminoácido existente con otro aminoácido, por ejemplo, un equivalente conservador del mismo. En aún algunas otras realizaciones, las modificaciones de aminoácidos incluyen reemplazar uno o más aminoácidos existentes con aminoácidos no naturales o insertar uno o más aminoácidos no naturales. En aún algunas otras realizaciones, las modificaciones de aminoácidos incluyen al menos 1,2, 3, 4, 5 o 6 o 10 mutaciones o cambios de aminoácidos.

[0112] En algunos ejemplos de realización, una o más modificaciones de aminoácidos se pueden utilizar para alterar propiedades de la forma soluble de AXL por ejemplo, afectar a la estabilidad, actividad y/o especificidad, unión etc. Son conocidas técnicas para la mutagénesis in vitro de los genes clonados.

[0113] Según la presente invención, el agente inhibidor puede incluir pero no está limitado a un polipéptido, un polipéptido de fusión-portador, un polipéptido de fusión-Fc, conjugado de polipéptido, un polipéptido-fármaco conjugado, un anticuerpo, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo-fármaco conjugado, un fragmento de anticuerpo, una estructura relacionada con un anticuerpo o una combinación de los mismos.

[0114] Los agentes inhibidores de la presente invención pueden incluir péptidos o polipéptidos. Los péptidos y polipéptidos de la presente invención pueden incluir polipéptidos naturales y/o sintéticos. Los polipéptidos sintéticos y los métodos para fabricar polipéptidos sintéticos son bien conocidos en la técnica y se puede emplear cualquier método conocido para fabricar polipéptidos sintéticos con los métodos de la presente invención. En algunas realizaciones, el agente inhibidor es un polipéptido natural o sintético. En algunas realizaciones, el agente inhibidor es una fusión de polipéptido natural o sintético. En algunas realizaciones, el agente inhibidor es una fusión de polipéptido-Fc natural o sintético. En algunas realizaciones, la fusión de polipéptido natural o sintético es una fusión con otra clase estructural de proteína o armazón o una fusión de polipéptido natural o sintético con un polímero o hidrogel o estructura relacionada.

[0115] Según la presente invención, los polipéptidos variantes de AXL de la presente invención pueden modificarse adicionalmente, por ejemplo, unirse a una amplia variedad de otros oligopéptidos o proteínas para una variedad de propósitos. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo diversas modificaciones posteriores a la traducción o posterior a la expresión con respecto a los polipéptidos variantes de AXL de la presente invención. Por ejemplo, empleando las secuencias codificantes apropiadas, se puede proporcionar farnesilación o prenilación. En algunas realizaciones, los polipéptidos variantes AXL de la presente invención se pueden pegilar, donde el grupo polietileneoxi proporciona una vida útil mejorada en el torrente sanguíneo. Los polipéptidos variantes de AXL de la presente invención también se pueden combinar con otras proteínas, tales como la Fc de un isotipo IgG, que puede unirse al complemento. Los agentes inhibidores de la presente invención pueden incluir conjugados de polipéptidos y conjugados de anticuerpos. En algunas realizaciones, el agente inhibidor es un conjugado de polipéptido o un conjugado de anticuerpo. En algunas realizaciones, el polipéptido conjugado es un fármaco conjugado. En algunas realizaciones, el péptido o polipéptido conjugado es un conjugado de anticuerpo-fármaco. En algunas realizaciones, el polipéptido conjugado es un polímero conjugado. Los polímeros de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, PEG, polímeros que contienen PEG, polímeros degradables, polímeros biocompatibles, hidrogeles, así como otras estructuras poliméricas que podrían conjugarse con un polipéptido y pueden incluir combinaciones de los mismos.

[0116] En algunas realizaciones, el polipéptido variante de AXL de la presente invención es una proteína de fusión, por ejemplo, fusionada en marco con un segundo polipéptido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es capaz de aumentar el tamaño de la proteína de fusión, por ejemplo, de modo que la proteína de fusión no se elimine rápidamente de la circulación. En algunas otras realizaciones, el segundo polipéptido es parte o la totalidad de la región Fc. En algunas otras realizaciones, el segundo polipéptido es cualquier polipéptido adecuado que sea sustancialmente similar a Fc, por ejemplo, que proporcione un tamaño aumentado y/o unión o interacción adicional con moléculas de Ig. En algunas realizaciones, la molécula de fusión sAXL-Fc es una molécula soluble. En algunas realizaciones, la fusión sAXL-Fc tiene una afinidad mejorada hacia GAS6. En algunas realizaciones, la fusión sAXL-Fc es una molécula soluble que tiene una afinidad mejorada hacia GAS6. En algunas otras realizaciones, el segundo polipéptido es cualquier polipéptido adecuado que sea sustancialmente similar a Fc, por ejemplo, que proporcione un tamaño aumentado y/o unión o interacción adicional con moléculas de Ig. En algunas otras realizaciones más, el segundo polipéptido es parte o la totalidad de una proteína de albúmina, por ejemplo, una proteína de albúmina de suero humano. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es una proteína o péptido que se une a la albúmina.

[0117] En algunas otras realizaciones, el segundo polipéptido es útil para el manejo de los polipéptidos variantes de AXL, por ejemplo, purificación de polipéptidos variantes de AXL o para aumentar su estabilidad in vitro o in vivo. Por ejemplo, los polipéptidos variantes de AXL de la presente invención pueden combinarse con partes del dominio constante de inmunoglobulinas (IgG), dando como resultado polipéptidos quiméricos o de fusión. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran una vida media aumentada in vivo. Un ejemplo informado describe proteínas quiméricas que consisten en los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano y varios dominios de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de mamíferos. EP A 394.827; Traunecker et al., Nature, 331: 84-86, 1988. Las proteínas de fusión que tienen estructuras diméricas unidas por disulfuro (debido a la IgG) también pueden ser más eficientes en la unión y neutralización de otras moléculas que la proteína secretada monomérica o el fragmento de proteína solo. Fountoulakis y col., J. Biochem. 270: 3958-3964, 1995.

[0118] En todavía algunas otras realizaciones, el segundo polipéptido es una secuencia marcadora, tal como un péptido que facilita la purificación del polipéptido fusionado. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos marcadora puede ser un péptido de hexahistidina, como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales son comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86: 821-824, 1989, por ejemplo, la hexahistidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otra etiqueta peptídica útil para la purificación, la etiqueta "HA", corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza. Wilson et al., Cell 37: 767, 1984.

[0119] En todavía algunas otras realizaciones, el segundo polipéptido es una entidad útil para mejorar las características de polipéptidos variantes de AXL de la presente invención. Por ejemplo, puede añadirse una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, al extremo N-terminal del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia durante la purificación de la célula huésped o la manipulación y almacenamiento posteriores. Además, pueden añadirse restos de péptidos a las variantes de polipéptido AXL de la presente invención para facilitar la purificación y eliminarse posteriormente antes de la preparación final del polipéptido. La adición de restos de péptidos para facilitar la manipulación de polipéptidos son técnicas familiares y rutinarias en la técnica.

[0120] En todavía algunas realizaciones más, los polipéptidos variantes de AXL de la presente invención tienen una actividad de unión a GAS6 que es al menos igual o mejor que el AXL de tipo silvestre. En algunas otras realizaciones, los polipéptidos variantes de AXL de la presente invención tienen una actividad de unión o afinidad por GAS6 que es al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 veces mayor que la del AXL de tipo silvestre. En algunas otras realizaciones, la variante del polipéptido AXL de la presente invención tiene una actividad de unión o afinidad a GAS6 de al menos aproximadamente 1x1°'6, 1x1°'7, 1x1°'8 o 1x1°'9 M, 1 x 10'1° M, 1x1°'11 M o 1x1°'12 M. En otras realizaciones más, los polipéptidos sAXL de la presente invención son capaces de inhibir o competir con la unión del AXL de tipo silvestre a GAS6 in vivo, in vitro o ambos. En otras realizaciones más, los polipéptidos sAXL de la presente invención inhiben o compiten con la unión de AXL S6-1, AXL S6-2 y/o AXL S6-5 (como se describe en el documento WO2011/091305). En otras realizaciones más, los polipéptidos de sAXL de la presente invención inhiben o compiten con la unión de cualquier variante de sAXL como se describe en el documento WO2011/091305.

[0121] Los agentes inhibidores de la presente invención se unen a GAS6 con mayor afinidad. En algunas realizaciones, el polipéptido variante de AXL exhibe una mayor afinidad de la unión del polipéptido AXL a GAS6 en comparación con AXL de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido variante AXL exhibe una afinidad por GAS6 que es al menos aproximadamente 5 veces más fuerte, al menos aproximadamente 1° veces más fuerte o al menos aproximadamente 2° veces más fuerte, 5° veces más fuerte, 1°° veces más fuerte o al menos 20° veces más fuerte, etc. que la afinidad del polipéptido AXL de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el AXL soluble tiene una afinidad por GAS6 aproximadamente 115 veces más fuerte que la afinidad del polipéptido AXL de tipo silvestre.

[0122] La capacidad de una molécula para unirse a GAS6 se puede determinar, por ejemplo, por la capacidad del ligando putativo para unirse a GAS6 recubierto en una placa de ensayo. En una realización, la actividad de unión de los polipéptidos variantes de AXL de la presente invención a un GAS6 puede ensayarse inmovilizando el ligando, por ejemplo, GAS6 o los polipéptidos variantes de AXL. Por ejemplo, el ensayo puede incluir inmovilizar GAS6 fusionado a una etiqueta His en perlas de resina NTA activadas con Ni. Los agentes se pueden agregar en un tampón apropiado y las perlas se pueden incubar durante un período de tiempo a una temperatura determinada. Después de los lavados para eliminar el material no unido, la proteína unida puede liberarse con, por ejemplo, SDS, tampones con un pH alto y similares y analizarse.

[0123] En todavía otras realizaciones, los polipéptidos variantes de AXL de la presente invención tienen una mejor estabilidad térmica que la estabilidad térmica de una AXL de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la temperatura de fusión de los polipéptidos variantes de AXL de la presente invención es al menos 5°C, 1°°C, 15°C o 2°°C mayor que la temperatura de fusión de un AXL de tipo silvestre.

[0124] Según la presente invención, los polipéptidos variantes de AXL de la presente invención también pueden incluir una o más modificaciones que no alteran las secuencias primarias de los polipéptidos variantes de AXL de la presente invención. Por ejemplo, tales modificaciones pueden incluir la derivatización química de polipéptidos, p. ej., acetilación, amidación, carboxilación, etc. Tales modificaciones también pueden incluir modificaciones de glicosilación, p. ej., las realizadas modificando los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en pasos de procesamiento futuros; por ejemplo, exponiendo el polipéptido a enzimas que afectan la glicosilación, tales como enzimas glicosilantes o desglicosilantes de mamíferos. En algunas realizaciones, las variantes del polipéptido AXL de la presente invención incluyen polipéptidos variantes de AXL que tienen residuos de aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina.

[0125] En algunas otras realizaciones, los polipéptidos variantes de AXLde la presente invención incluyen polipéptidos variantes de AXL modificados aún más para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacer que sean más adecuadas como un agente terapéutico. Por ejemplo, las variantes de polipéptidos AXL de la presente invención incluyen además análogos de polipéptidos variantes de AXL que contienen residuos distintos de los L-aminoácidos naturales, por ejemplo, D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos no naturales. Los D-aminoácidos pueden sustituir algunos o todos los residuos de aminoácidos.

[0126] En todavía algunas otras realizaciones, los polipéptidos variantes de AXL de la presente invención incluyen al menos dos mismos polipéptidos o diferentes variantes de AXL con enlaces covalente o no covalentemente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las variantes de polipéptidos AXL de la presente invención incluyen dos, tres, cuatro, cinco o seis polipéptidos variantes de AXL iguales o diferentes unidos covalentemente, por ejemplo, para que tengan el tamaño apropiado, pero evitando la agregación no deseada.

[0127] Según la presente invención, los polipéptidos variantes de AXL de la presente invención se pueden producir por cualquier medio adecuado conocido o descubierto más tarde en el campo, por ejemplo, producidos a partir de células eucariotas o procariotas, sintetizados in vitro, etc. Cuando la proteína es producida por células procarióticas, puede procesarse adicionalmente mediante despliegue, por ejemplo, desnaturalización por calor, reducción de DTT, etc. y puede replegarse adicionalmente, usando métodos conocidos en la técnica.

[0128] Los polipéptidos variantes de AXL se pueden preparar por la síntesis in vitro, usando métodos convencionales como se conoce en la técnica. Se encuentran disponibles varios aparatos sintéticos comerciales, por ejemplo, sintetizadores automáticos de Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, Beckman, etc. mediante el uso de sintetizadores, los aminoácidos naturales pueden sustituirse por aminoácidos no naturales. La secuencia particular y la forma de preparación se determinarán por conveniencia, economía, pureza requerida y similares.

[0129] Los polipéptidos variantes de AXL también pueden ser aislados y purificados de acuerdo con métodos convencionales de síntesis recombinante. Puede prepararse un lisado del huésped de expresión y purificarse el lisado usando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad u otra técnica de purificación. En su mayor parte, las composiciones que se utilizan comprenderán al menos el 20% en peso del producto deseado, más habitualmente al menos aproximadamente el 75% en peso, preferiblemente al menos aproximadamente el 95% en peso, y con fines terapéuticos, habitualmente al menos aproximadamente el 99,5% en peso, en relación a los contaminantes relacionados con el método de preparación del producto y su purificación. Normalmente, los porcentajes se basarán en la proteína total.

[0130] Los métodos que son bien conocidos para los expertos en la técnica pueden usarse para vectores de expresión de construcción que contienen secuencias de codificación y señales de control apropiadas transcripcional/traduccional. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas in vitro de ADN recombinante, técnicas sintéticas y in vivo de recombinación/recombinación genética. Alternativamente, el ARN capaz de codificar los polipéptidos de interés puede sintetizarse químicamente. Un experto en la técnica puede utilizar fácilmente tablas de uso de codones y métodos sintéticos bien conocidos para proporcionar una secuencia codificante adecuada para cualquiera de los polipéptidos de la invención. Los métodos de síntesis química directa incluyen, por ejemplo, el método del fosfotriéster de Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; el método del fosfodiéster de Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859­ 1862; y el método de soporte sólido de la Patente de Estados Unidos N° 4.458.066. La síntesis química produce un oligonucleótido monocatenario. Este se puede convertir en ADN de doble hebra mediante hibridación con una secuencia complementaria o mediante polimerización con una ADN polimerasa utilizando la hebra sencilla como molde. Si bien la síntesis química de ADN a menudo se limita a secuencias de aproximadamente 100 bases, se pueden obtener secuencias más largas mediante ligación de secuencias más cortas. Alternativamente, pueden clonarse subsecuencias y escindirse las subsecuencias apropiadas usando enzimas de restricción apropiadas.

[0131] Los ácidos nucleicos se pueden aislar y obtener con una pureza sustancial. Por lo general, los ácidos nucleicos, ya sea como ADN o ARN, se obtendrán sustancialmente libres de otras secuencias de ácidos nucleicos de origen natural, siendo generalmente al menos aproximadamente 50%, normalmente al menos aproximadamente un 90% de pureza y normalmente son "recombinantes", por ejemplo, flanqueados por uno o más nucleótidos con los que normalmente no están asociados en un cromosoma de origen natural. Los ácidos nucleicos de la invención pueden proporcionarse como una molécula lineal o dentro de una molécula circular, y pueden proporcionarse dentro de moléculas de replicación autónoma (vectores) o dentro de moléculas sin secuencias de replicación. La expresión de los ácidos nucleicos puede regularse por sí mismos o por otras secuencias reguladoras conocidas en la técnica. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden introducir en células huésped adecuadas utilizando una variedad de técnicas disponibles en la técnica, tales como transferencia de ADN mediada por policatión de transferrina, transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados, transferencia de ADN mediada por liposomas, transporte intracelular de cuentas de látex recubiertas ADN, fusión de protoplastos, infección viral, electroporación, pistola génica, transfección mediada por fosfato cálcico y similares.

[0132] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona vectores de expresión para la expresión in vitro o in vivo de uno o más polipéptidos AXL variantes de la presente invención, ya sea constitutivamente o en virtud de uno o más elementos reguladores. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una población celular que comprende uno o más vectores de expresión para expresar variantes del polipéptido AXL de la presente invención, ya sea de forma constitutiva o bajo uno o más elementos reguladores.

[0133] Según la presente invención, los polipéptidos variantes de AXL se pueden proporcionar en composiciones farmacéuticas adecuadas para uso terapéutico, por ejemplo, para el tratamiento humano. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen una o más entidades terapéuticas de la presente invención, por ejemplo, variantes del polipéptido AXL o sales, ésteres o solvatos farmacéuticamente aceptables del mismo o cualquier profármaco del mismo. En algunas otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen una o más entidades terapéuticas de la presente invención en combinación con otro agente terapéutico, por ejemplo, otro agente para el tratamiento de la fibrosis. puede ensayarse inmovilizando el ligando, por ejemplo, GAS6 o los polipéptidos variantes de AXL, MER o Tyro3. Por ejemplo, el ensayo puede incluir inmovilizar g AS6 fusionado a una etiqueta His en perlas de resina NTA activadas con Ni. Los agentes se pueden agregar en un tampón apropiado y las perlas se pueden incubar durante un período de tiempo a una temperatura determinada. Después de los lavados para eliminar el material no unido, la proteína unida puede liberarse con, por ejemplo, SDS, tampones con un pH alto y similares y analizarse.

[0134] En todavía otras realizaciones más, polipéptidos variantes AXL, MER o TYRO3 de la presente invención tienen una mejor estabilidad térmica que la estabilidad térmica de un AXL de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la temperatura de fusión de los polipéptidos variantes de AXL, MER o Tyro3 de la presente invención es al menos 5°C, 10°C, 15°C o 20°C más alta que la temperatura de fusión de un AXL de tipo silvestre.

[0135] Según la presente invención, polipéptidos variantes AXL, MER o TYRO3 de la presente invención también pueden incluir una o más modificaciones que no alteran secuencias primarias de los polipéptidos variantes de AXL, MER o TYRO3 de la presente invención. Por ejemplo, tales modificaciones pueden incluir la derivatización química de polipéptidos, por ejemplo, acetilación, amidación, carboxilación, etc. Tales modificaciones también pueden incluir modificaciones de glicosilación, por ejemplo, aquellas realizadas modificando los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en otros pasos de procesamiento; por ejemplo, exponiendo el polipéptido a enzimas que afectan la glicosilación, tales como enzimas glicosilantes o desglicosilantes de mamíferos. En algunas realizaciones, las variantes de polipéptidos AXL, MER o Tyro3 de la presente invención incluyen polipéptidos variantes de AXL, MER o Tyro3 que tienen residuos de aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina.

[0136] En algunas otras realizaciones, polipéptidos variantes AXL, MER o TYRO3 de la presente invención incluyen polipéptidos variantes AXL, MER o TYRO3 modificados adicionalmente para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacerlos más adecuados como un agente terapéutico agente. Por ejemplo, las variantes de polipéptidos AXL, MER o Tyro3 de la presente invención incluyen además análogos de polipéptidos variantes de AXL, MER o Tyro3 que contienen residuos distintos de los L-aminoácidos naturales, p. ej. D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos no naturales. Los D-aminoácidos pueden sustituir algunos o todos los residuos de aminoácidos.

[0137] En todavía algunas otras realizaciones, polipéptidos variantes AXL, MER o TYRO3 de la presente invención incluyen al menos dos AXL iguales o diferentes, los polipéptidos variantes MER o TYRO3 unidos covalentemente o no covalentemente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los polipéptidos variantes de AXL, MER o Tyro3 de la presente invención incluyen dos, tres, cuatro, cinco o seis polipéptidos variantes de AXL, MER o Tyro3 iguales o diferentes unidos covalentemente, por ejemplo, para que tengan el tamaño apropiado, pero evitando agregaciones no deseadas.

[0138] Según la presente invención, polipéptidos variantes AXL, MER o TYRO3 de la presente invención se pueden producir por cualquier medio adecuado conocido o descubierto más tarde en el campo, por ejemplo, producido a partir de células eucariotas o procariotas, sintetizadas in vitro, etc. Cuando la proteína es producida por células procarióticas, puede procesarse adicionalmente desplegándose, por ejemplo, desnaturalización por calor, reducción de DTT, etc. y puede replegarse adicionalmente, usando métodos conocidos en la técnica.

[0139] Los polipéptidos variantes de AXL, MER o TYRO3 se pueden preparar por síntesis in vitro, usando métodos convencionales como se conoce en la técnica. Se encuentran disponibles varios aparatos sintéticos comerciales, por ejemplo, sintetizadores automáticos de Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, Beckman, etc. Mediante el uso de sintetizadores, los aminoácidos naturales pueden sustituirse por aminoácidos no naturales. La secuencia particular y la forma de preparación se determinarán por conveniencia, economía, pureza requerida y similares.

[0140] Los polipéptidos variantes de AXL, MER o TYRO3 también pueden ser aislados y purificados de acuerdo con métodos convencionales de síntesis recombinante. Puede prepararse un lisado del huésped de expresión y purificarse el lisado usando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad u otra técnica de purificación. En su mayor parte, las composiciones que se utilizan comprenderán al menos el 20% en peso del producto deseado, más habitualmente al menos aproximadamente el 75% en peso, preferiblemente al menos aproximadamente el 95% en peso, y con fines terapéuticos, habitualmente al menos aproximadamente el 99,5% en peso, en relación a los contaminantes relacionados con el método de preparación del producto y su purificación. Normalmente, los porcentajes se basarán en la proteína total.

[0141] Los métodos que son bien conocidos para los expertos en la técnica pueden usarse para vectores de expresión de construcción que contiene secuencias de codificación y señales de control apropiadas transcripcionales/traduccionales. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas in vitro de ADN recombinante, técnicas sintéticas y recombinación/recombinación genética in vivo. Alternativamente, el ARN capaz de codificar los polipéptidos de interés puede sintetizarse químicamente. Un experto en la técnica puede utilizar fácilmente tablas de uso de codones y métodos sintéticos bien conocidos para proporcionar una secuencia codificante adecuada para cualquiera de los polipéptidos de la invención. Los métodos de síntesis química directa incluyen, por ejemplo, el método del fosfotriéster de Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; el método del fosfodiéster de Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859­ 1862; y el método de soporte sólido de la Patente de Estados Unidos N° 4.458.066. La síntesis química produce un oligonucleótido monocatenario. Este se puede convertir en ADN de doble hebra mediante hibridación con una secuencia complementaria o mediante polimerización con una ADN polimerasa utilizando la hebra sencilla como molde. Si bien la síntesis química de ADN a menudo se limita a secuencias de aproximadamente 100 bases, se pueden obtener secuencias más largas mediante ligación de secuencias más cortas. Alternativamente, pueden clonarse subsecuencias y escindirse las subsecuencias apropiadas usando enzimas de restricción apropiadas.

[0142] Los ácidos nucleicos se pueden aislar y obtener con una pureza sustancial. Por lo general, los ácidos nucleicos, ya sea como ADN o ARN, se obtendrán sustancialmente libres de otras secuencias de ácidos nucleicos de origen natural, siendo generalmente al menos aproximadamente un 50%, generalmente al menos aproximadamente un 90% de pureza y son típicamente "recombinantes", por ejemplo, flanqueados por uno o más nucleótidos con los que normalmente no están asociados en un cromosoma natural. Los ácidos nucleicos de la invención pueden proporcionarse como una molécula lineal o dentro de una molécula circular, y pueden proporcionarse dentro de moléculas de replicación autónoma (vectores) o dentro de moléculas sin secuencias de replicación. La expresión de los ácidos nucleicos puede regularse por sí mismos o por otras secuencias reguladoras conocidas en la técnica. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden introducir en células huésped adecuadas utilizando una variedad de técnicas disponibles en la técnica, tales como transferencia de ADN mediada por policatión de transferrina, transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados, transferencia de ADN mediada por liposomas, transporte intracelular de cuentas de látex recubiertas de ADN, fusión de protoplastos, infección viral, electroporación, pistola génica, transfección mediada por fosfato cálcico y similares.

[0143] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona vectores de expresión para expresión in vitro o in vivo de uno o más polipéptidos variantes de AXL, MER y/o TYRO3 de la presente invención, ya sea constitutivamente o en virtud de uno o más elementos reguladores. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una población celular que comprende uno o más vectores de expresión para expresar variantes del polipéptido AXL, MER y/o Tyro3 de la presente invención, ya sea de forma constitutiva o bajo uno o más elementos reguladores.

[0144] Según la presente invención, los polipéptidos variantes de AXL, MER o TYRO3 se pueden proporcionar en composiciones farmacéuticas adecuadas para uso terapéutico, por ejemplo, para el tratamiento humano. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen una o más entidades terapéuticas de la presente invención, por ejemplo, variantes del polipéptido AXL o sales, ésteres o solvatos farmacéuticamente aceptables del mismo o cualquier profármaco del mismo. En algunas otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen una o más entidades terapéuticas de la presente invención en combinación con otro agente terapéutico, por ejemplo, otro agente para el tratamiento de la fibrosis.

[0145] La pirfenidona, comercializada con los nombres de Esbriet y Pirespa, es el primer fármaco antifibrótico dirigido que se aprobó para el tratamiento de la FPI en Europa y Japón. Aunque su mecanismo de acción exacto sigue sin estar claro, se cree que la pirfenidona atenúa la proliferación de fibroblastos y la producción por miofibroblastos activados de mediadores asociados a fibrosis y componentes de ECM. La pirfenidona también ha mostrado eficacia en modelos preclínicos de fibrosis hepática, fibrosis renal, miocardiopatía hipertrófica y fibrosis inducida por radiación, lo que sugiere que puede tener una amplia actividad antifibrótica. Anticuerpos terapéuticos contra TGF-p1, una citocina clave involucrada en la activación de miofibroblastos; CTGF, una proteína de unión a heparina asociada a la matriz que refleja la actividad profibrótica del TGF-p en los fibroblastos; y la integrina avp6, que es responsable de la activación del TGF-p latente expresado constitutivamente, también se están investigando por su actividad antifibrótica. Se está investigando un anticuerpo monoclonal humanizado contra avp6 desarrollado por Stromedix y Biogen Idec como tratamiento para la fibrosis intersticial y la atrofia tubular en receptores de trasplante de riñón y como terapia para la FPI. Genzima también está explorando un inhibidor de pan-TGF-p humanizado (fresolimumab) como tratamiento para pacientes con esclerosis sistémica difusa en etapa temprana, glomeruloesclerosis focal segmentaria, FPI y mielofibrosis, y se están investigando anticuerpos y fármacos antisentido dirigidos a CTGF en FPI y cicatrices -cirugía de revisión. Los antagonistas del receptor del ácido lisofosfatídico-1, un factor de crecimiento que induce la expresión de CTGF y TGF-p1, se están considerando como tratamientos para la fibrosis renal, la FPI y la esclerosis sistémica. La proteína morfogenética ósea-7 también se ha identificado como un agente terapéutico potencial para la lesión renal crónica porque puede contrarrestar la EMT inducida por TGF-p1. Un antagonista del receptor de endotelina, que promueve la contracción y migración de miofibroblastos, está siendo explorado en enfermedades cardiovasculares e IPF. Gilead Sciences está explorando un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido a la lisil oxidasa de tipo 2, una enzima que cataliza la reticulación del colágeno, como tratamiento para la fibrosis cardíaca, la FPI y la fibrosis hepática. Otras proteínas de ensamblaje de matriz, como las prolil hidroxilasas, se están investigando preclínicamente para determinar la actividad antifibrótica. Bortezomib, un inhibidor proteasómico, inhibe la señalización de TGF-p1 in vitro y se ha demostrado que protege a los ratones de la fibrosis cutánea y pulmonar inducida por bleomicina. También induce la apoptosis de las células estrelladas hepáticas. En consecuencia, bortezomib puede resultar eficaz para enfermedades en las que el TGF-p1, el estrés del RE y los miofibroblastos activados se han identificado como mediadores patogénicos clave. También se están realizando estudios para examinar si un inhibidor de la proteína quinasa de serina/treonina reduce el número de fibrocitos circulantes en individuos con FPI.

[0146] La citoquina IL-13 asociada a Th2 ha surgido como un impulsor clave de la infección y la fibrosis impulsada por alérgenos. La IL-13 y sus receptores también se han detectado en niveles elevados en los pulmones y la sangre de pacientes con FPI. Debido a que un número creciente de enfermedades fibróticas crónicas se caracterizan por la producción excesiva de IL-13 y/o una expresión aumentada de genes inducibles por IL-13, muchos individuos con fibrosis podrían beneficiarse de la neutralización de IL-13.

[0147] En otras realizaciones más, las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen una o más entidades terapéuticas de la presente invención en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

[0148] En todavía algunas otras realizaciones, las entidades terapéuticas de la presente invención se administran a menudo como composiciones farmacéuticas que comprenden un agente terapéutico activo, es decir, y una variedad de otros componentes farmacéuticamente aceptables. (Véase Remington's Pharmaceutical Science, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania, 1980). La forma preferida depende del modo de administración y aplicación terapéutica previstos. Las composiciones también pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, vehículos o diluyentes no tóxicos, farmacéuticamente aceptables, que se definen como vehículos usados comúnmente para formular composiciones farmacéuticas para administración animal o humana. El diluyente se selecciona de manera que no afecte a la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solución salina fisiológica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros vehículos, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.

[0149] Todavía en algunas otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden también incluir grandes macromoléculas metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos tales como quitosano, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y copolímeros (tales como sefarosa funcionalizada con látex™, agarosa, celulosa y similares), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados lipídicos (tales como gotitas de aceite o liposomas). Además, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes (es decir, adyuvantes).

[0150] En otras realizaciones, los métodos de la presente invención incluyen la administración a un sujeto en necesidad de tratamiento de una cantidad terapéuticamente eficaz o una dosis efectiva de una entidad terapéutica (por ejemplo, el agente inhibidor) de la presente invención, por ejemplo, un inhibidor de actividad AXL o actividad GAS6 o un inhibidor de la interacción entre AXL y GAS6. En algunas realizaciones, las dosis efectivas de la entidad terapéutica de la presente invención descrita en este documento varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluidos los medios de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Normalmente, el paciente es un ser humano, pero también se pueden tratar mamíferos no humanos, incluidos mamíferos transgénicos. Las dosis de tratamiento deben ajustarse para optimizar la seguridad y la eficacia.

[0151] En algunas realizaciones, la dosificación puede variar de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg, de peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1 a 10 mg/kg. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Las entidades terapéuticas de la presente invención se administran habitualmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis únicas pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, según se indique midiendo los niveles en sangre de la entidad terapéutica en el paciente. Alternativamente, las entidades terapéuticas de la presente invención se pueden administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosis y la frecuencia varían según la vida media del polipéptido en el paciente.

[0152] En aplicaciones profilácticas, una dosificación relativamente baja se administra a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento por el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que se reduce o termina la progresión de la enfermedad, y preferiblemente hasta que el paciente muestra una mejoría parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, se puede administrar a la patente un régimen profiláctico.

[0153] En todavía aún algunas otras realizaciones, para aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas o medicamentos se administran a un paciente susceptible a, o de otra manera en riesgo de una enfermedad o afección en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad, o retrasar el inicio de la enfermedad, incluidos los síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad.

[0154] Todavía en algunas otras realizaciones, para aplicaciones terapéuticas, las entidades terapéuticas de la presente invención se administran a un paciente que se sospecha o que ya padece una enfermedad de este tipo en una cantidad suficiente para curar, o detener al menos parcialmente, los síntomas de la enfermedad (bioquímicos, histológicos y/o conductuales), incluyendo sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios en el desarrollo de la enfermedad. Una cantidad adecuada para lograr un tratamiento terapéutico o profiláctico se define como una dosis terapéutica o profilácticamente eficaz. Tanto en regímenes profilácticos como terapéuticos, los agentes se administran habitualmente en varias dosis hasta que se alcanza una respuesta suficiente.

[0155] Según la presente invención, las composiciones se pueden administrar por vía parenteral, tópica, intravenosa, oral, subcutánea, intraarterial, intracraneal, intraperitoneal, intranasal o medios intramusculares. La vía de administración más típica es la intravenosa, aunque otras vías pueden ser igualmente eficaces.

[0156] Para la administración parenteral, las composiciones de la invención se pueden administrar como dosis inyectables de una solución o suspensión de la sustancia en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo farmacéutico que puede ser un líquido estéril, tal como agua, aceites, solución salina, glicerol, o etanol. Además, pueden estar presentes en las composiciones sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tampón del pH y similares. Otros componentes de las composiciones farmacéuticas son los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja y aceite mineral. En general, los glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son vehículos líquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables. Los anticuerpos y/o polipéptidos se pueden administrar en forma de una inyección de depósito o una preparación de implante que se puede formular de tal manera que permita una liberación sostenida del ingrediente activo. Una composición ejemplar comprende polipéptido a 1 mg/ml, formulado en tampón acuoso que consta de Tris 10 mM, sacarosa 210 mM, L-arginina 51 mM, polisorbato 20 al 0,01%, ajustado a pH 7,4 con HCl o NaOH.

[0157] Típicamente, las composiciones se preparan como inyectables, bien como soluciones o suspensiones líquidas; También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar o encapsular en liposomas o micropartículas tales como polilactida, poliglicólido o copolímero para un efecto adyuvante mejorado, como se discutió anteriormente. Langer, Science 249: 1527, 1990 y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. Los agentes de esta invención se pueden administrar en forma de inyección de depósito o preparación de implante que se puede formular de tal manera para permitir una liberación sostenida o pulsátil del ingrediente activo.

[0158] Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales, intranasales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas.

[0159] Para supositorios, los aglutinantes y vehículos incluyen, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; tales supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de 0,5% a 10%, preferiblemente 1%-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes, tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen 10% -95% de ingrediente activo, preferiblemente 25%-70%.

[0160] La aplicación tópica puede resultar en la liberación transdérmica o intradérmica. La administración tópica puede facilitarse mediante la coadministración del agente con la toxina del cólera o sus derivados o subunidades desintoxicadas u otras toxinas bacterianas similares. Glenn et al., Nature 391: 851, 1998. La coadministración se puede lograr usando los componentes como una mezcla o como moléculas unidas obtenidas por reticulación química o expresión como una proteína de fusión.

[0161] Alternativamente, la administración transdérmica puede conseguirse usando un parche cutáneo o usando transferosomas. Paul y col., Eur. J. Immunol. 25: 3521 - 24, 1995; Cevc y col., Biochem. Biophys. Acta 1368: 201-15, 1998.

[0162] Las composiciones farmacéuticas se formulan generalmente como estériles, sustancialmente isotónica y en total cumplimiento con todos los reglamentos de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) de la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos. Preferiblemente, una dosis terapéuticamente eficaz proporcionará un beneficio terapéutico sin causar una toxicidad sustancial.

[0163] La toxicidad de las proteínas descritas en el presente documento se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en los cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, determinando la LD⁵⁰ (la dosis letal para el 50% de la población) o la LD¹⁰⁰ (la dosis letal para 100% de la población). La relación de dosis entre el efecto tóxico y terapéutico es el índice terapéutico. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden utilizar para formular un intervalo de dosificación que no sea tóxico para su uso en humanos. La dosis de las proteínas descritas en este documento se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la dosis eficaz con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. El médico individual puede elegir la formulación, vía de administración y dosificación exactas en vista del estado del paciente. (Véase, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, cap. 1).

[0164] También dentro del alcance de la invención son kits que comprenden las composiciones (por ejemplo, AXL, los polipéptidos variantes MER o Tyro3 y formulaciones de los mismos) de la invención e instrucciones de uso. El kit puede contener además al menos un reactivo adicional. Los kits suelen incluir una etiqueta que indica el uso previsto del contenido del kit. El término etiqueta incluye cualquier escritura o material grabado suministrado en o con el kit, o que de otro modo acompañe al kit.

[0165] La mención de cualquier publicación es para su divulgación antes de la fecha de presentación y no debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder a dicha publicación en virtud de invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar ser confirmadas de forma independiente.

[0166] Cualquier método enumerado se puede llevar a cabo en el orden de los eventos enumerados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible. También se entiende que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares.

[0167] Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando no más que experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descrita.

EXPERIMENTAL

Métodos y procedimientos experimentales

[0168] Cell Culture. LM-P tumor cells LM-P (Clin Cancer Res 2010 15 de julio; 16 (14): 3684 - 3695) se mantuvieron in vitro como un cultivo monocapa en medio DMEM complementado con suero de ternero fetal inactivado por calor al 10%, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina y L-glutamina (2 mM) a 37°C en una atmósfera de 5% de CO² en aire. Las células tumorales se subcultivaron de forma rutinaria dos veces por semana mediante tratamiento con tripsina-EDTA. Las células que crecían en una fase de crecimiento exponencial se recolectaron y contaron usando un contador de partículas Beckman Coulter antes de la inoculación del tumor.

[0169] Inoculación de tumores. Cada ratón se inoculó por vía subcutánea en el flanco derecho con células tumorales PDA1-1 (1 x 106) en 0,1 ml de solución salina estéril para el desarrollo de tumores. Los tumores subcutáneos se cultivaron durante dos a tres semanas. Para establecer tumores ortotópicos, se sacrificaron los ratones que albergaban los tumores subcutáneos y los tumores se aislaron y cortaron en pequeños fragmentos de 3-4 mm. Se realizaron laparotomías y se aseguró un fragmento de tumor a la cola del páncreas mediante suturas reabsorbibles. Después de la implantación, el páncreas se devolvió a la cavidad peritoneal y se cerró la incisión. Los ratones recibieron inyecciones diarias de carprofeno el día de la implantación y en cada uno de los tres días posteriores a la operación para el manejo del dolor.

[0170] El día cuatro después de la cirugía, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos que consistían en 10 o 14 animales. Los artículos de prueba se administraron a los ratones de acuerdo con el régimen predeterminado que se muestra a continuación.

[0171] La tinción de Tricrómico de Masson. El tejido del tumor primario se obtuvo de cada ratón tras el sacrificio y se fijó en formalina al 10%. Se montó tejido fijo y se visualizó la cantidad de colágeno presente mediante Masson Trichrome tinción. La tinción se realizó según el protocolo del fabricante (American MasterTech, Lodi, California).

[0172] Para cada sección de tejido, al menos dos campos de visión puntuaban de 0 - 4 con: 0 no tener fibrosis; 1 <20% de tinción de colágeno; 2 tinción de colágeno al 20 - 40%; 3 tinción de colágeno al 40 - 60%; 4 >60% tinción de colágeno. Se calcularon e informaron las puntuaciones medias para cada sección de tejido.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor de la actividad de GAS6 para su uso en el tratamiento, reducción, reversión, ralentización o prevención de la fibrosis asociada con el cáncer o el crecimiento tumoral en un paciente mamífero

en donde el inhibidor es un polipéptido,

en donde el polipéptido comprende un polipéptido variante AXL soluble,

en donde el polipéptido variante AXL carece del dominio transmembrana AXL y tiene al menos una mutación relativa al tipo silvestre que aumenta la afinidad del polipéptido variante AXL que se une a GAS6 en comparación con el AXL de tipo silvestre, y ya sea

en donde en el polipéptido variante AXL de residuo de glicina 32 se sustituye con un residuo de serina, residuo de ácido aspártico 87 es reemplazado con un residuo de glicina, residuo de valina 92 se sustituye con un residuo de alanina, o residuo de glicina 127 se sustituye con un residuo de arginina o una combinación de los mismos; o en donde en el polipéptido variante AXL el residuo de glicina 32 se reemplaza con un residuo de serina, el residuo de ácido aspártico 87 se reemplaza con un residuo de glicina, el residuo de valina 92 se reemplaza con un residuo de alanina, el residuo de glicina 127 se reemplaza con un residuo de arginina o un residuo de alanina 72 se reemplaza por un residuo de valina o una combinación de los mismos.

2. Un inhibidor de la actividad de GAS6 para su uso según la reivindicación 1, en donde el polipéptido variante de AXL carece de un dominio de fibronectina funcional (FN) y/o en donde dicho polipéptido variante de a Xl exhibe una mayor afinidad de la unión del polipéptido a GAS6 en comparación con AXL de tipo silvestre.

3. Un inhibidor de la actividad de GAS6 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el polipéptido variante AXL carece del dominio transmembrana, tiene al menos un dominio Ig1 y en donde dicho polipéptido variante AXL exhibe una mayor afinidad de la unión del polipéptido variante AXL a GAS6 comparado con AXL de tipo silvestre.

4. Un inhibidor de la actividad GAS6 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el polipéptido variante AXL soluble carece del dominio transmembrana, tiene más de un dominio Ig2 y en donde dicho polipéptido variante AXL exhibe una mayor afinidad de la unión del polipéptido AXL a GAS6 comparado con AXL de tipo silvestre.

5. Un inhibidor de la actividad GAS6 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho polipéptido variante AXL soluble carece del dominio transmembrana AXL, tiene al menos un dominio Ig1, más de un dominio Ig2, y en donde dicho polipéptido variante AXL presenta aumento de la afinidad de la unión del polipéptido variante AXL a GAS6 en comparación con AXL de tipo silvestre.

6. Un inhibidor de la actividad de GAS6 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el polipéptido es un polipéptido variante de AXL soluble, en donde dicho polipéptido variante de AXL soluble carece del dominio transmembrana AXL, carece de un dominio de fibronectina funcional (FN), tiene al menos un dominio de Ig1, más de un dominio de Ig2, y en donde dicho polipéptido variante de AXL exhibe una mayor afinidad de la unión del polipéptido variante de AXL a GAS6 en comparación con AXL de tipo silvestre.

7. Un inhibidor de la actividad de GAS6 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, en donde el polipéptido variante de AXL es una proteína de fusión que comprende un dominio Fc.

8. Un inhibidor de la actividad de GAS6 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el polipéptido variante de AXL soluble comprende además un enlazador, en donde dicho enlazador comprende 1 a 5 unidades (GLY)⁴SER.