KR20180080127A - 항-b형 간염 바이러스 x 단백질 폴리펩티드 약제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스 X 단백질에 대한 폴리펩티드 및 이의 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 폴리펩티드는 D-아미노산을 포함하고, B형 간염 바이러스의 DNA 복제 및 관련 항원의 발현을 억제할 수 있고, 추가로 B형 간염 바이러스의 감염에 의해 유발된 간염, 간경화 및 간암을 억제할 수 있다.

Description

항-B형 간염 바이러스 X 단백질 폴리펩티드 약제

본 발명은 폴리펩티드 의약의 분야에 관한 것이고, 구체적으로는, D-아미노산을 포함하는 B형 간염 바이러스 X 단백질에 대한 폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.

간암은 사망에 이를 수 있는 악성 종양이다. 이의 악성 정도는 중국에서 높지만, 간암의 사망율은 2번째로 높고, 위장암의 사망율보다는 낮다. 통계에 따르면, 중국에서 매년 새롭게 진행된 간암 환자는 약 300,000명이고, 약 110,000명이 이러한 질환 때문에 매년 사망한다. B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 간염, 간경화 및 원발성 간염을 유도할 수 있다. 중국에서, 80% 초과의 간암 환자는, 또한 간염후 B 감염으로 지칭되는, HBV 감염 후에 진행하는 이들의 간암을 갖는다.

HBV는 약 3.2kb의 길이를 갖는 DNA이고, B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg), B형 간염 바이러스 코어 항원(HBcAg), B형 간염 바이러스 폴리머라제 및 B형 간염 바이러스 X 항원(HBxAg)(또한 B형 간염 바이러스 X 단백질, HBx로서 공지됨)(여기서, HBx는 HBV DNA 복제에서 불가결한 인자이다.)의 전사 및 발현에 관여하는 중첩 개방 판독 프레임(ORF)을 함유한다. HBx는 HBV DNA 복제에 불가결한 인자이기 때문에, HBx의 기능을 억제하기 위해, HBV 감염, 또한 후속의 간염 및 간경화의 억제를 유도할 수 있다.

또한, 트랜스-활성화제 인자로서, HBx는 간암의 성장 및 증식을 촉진시킬 수 있고, 따라서 암단백질로서 또한 공지되어 있다. 분자 수준, 세포 수준 및 동물 수준에서의 연구는 HBx가 간암 세포의 증식 및 이동을 촉진시키는데 강력한 효과를 갖는 것을 나타냈다. 트랜스제닉(transgenic) 마우스 실험은 또한 HBx가 간암을 유발할 수 있음을 나타냈다. 다수의 연구 결과는 추가로 HBV 감염의 지속이 만성 간염, 간 조직 및 간경화에서 섬유성 결합 조직의 과형성을 후속적으로 유발하는 반복된 만성 간염, 및 간경화에 기초한 대부분의 간암을 포함하는 만성 간 질환을 유도할 수 있음을 나타냈다. HBx가 만성 간 질환(간염, 간경화 및 간암 포함)의 발병 및 진행에 중요한 역할을 한다는 것은 충분히 확립되어 있다. 결과적으로, HBx는 간 질환의 예방 및 치료를 위한 중요한 표적으로 된다.

현재, 간암의 치료는 주로 개입 요법이 보충된 외과수술에 의한 것인 반면, 화학요법은 통상 매우 효과적인 것은 아니다. 임상 데이터는, 간암 조직에서 양성으로 발현된 HBsAg 및 HBxAg의 발견율이 80% 이상 또는 심지어 90% 이상임을 나타낸다. HBx는 간암의 발생 및 진행에서 중요한 병원성 인자이기 때문에, 이의 특이적 억제제를 동정하는 것은 이론적 및 임상적으로 매우 중요하다. 그러나, HBx의 3차원 입체구조의 불완전성 때문에, HBx의 3차원 입체구조 정보를 통해 이의 화학적 억제제를 설계하는 것은 오히려 곤란하다.

단편적 폴리펩티드는 의약으로서 사용할 수 있고, 이들은 임상적 실시에 이미 광범위하게 사용되어 왔다. 예를 들면, 티모펩티드는, 림파구 형질전환을 촉진하고 마크로파지의 식세포 활성을 증강시키는 기능을 갖는 송아지 흉선으로부터 추출된 티모펜틴이고, 다양한 면역결핍 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 폴리펩티드 약물의 특징은 명확하게 정의된 약물동태 효과, 안전성 및 제조 용이성을 포함한다. 그러나, 폴리펩티드 약물은 생체내에서 프로테아제에 의해 영향을 받기 쉽고 낮은 안정성 및 짧은 반감기를 갖기 때문에, 이의 유효성은 통상 이상적인 것은 아니다.

아미노산은, 좌선성(L-아미노산) 및 우선성(D-아미노산)의 입체배치로 존재할 수 있다. 인간 또는 동물 체내의 모든 천연 아미노산은 D-아미노산을 포함하지 않는 L-형이다. D-아미노산의 단백질분해 효소는 생물에 존재하지 않는다. 따라서, 폴리펩티드 약물을 제조할 때에 아미노산 서열에 영향을 미치지 않고서 L-형 천연 아미노산을 상응하는 D-형으로 치환하는 경우, 혈중 폴리펩티드 약물의 안정성도 또한 개선시킬 수 있다. 그러나, 폴리펩티드 약물의 분해 내성을 개선시키고 이의 결합 특성을 감소시키지 않고서 약물 효력을 유지하는 방법은 폴리펩티드 약물 개발에서 중요한 문제이다.

본 발명의 발명자들은, B형 간염 바이러스 X 단백질을 억제하는 기능을 갖고 천연 L-아미노산만으로 이루어진 폴리펩티드를 발견했다(상세는 중국 발명 특허 제ZL201110061840.5호를 참조한다, 이의 개시는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다). 이 폴리펩티드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드는 분자 수준, 세포 수준 및 동물 수준에서 HBx 활성을 억제하는 기능을 갖고, B형 간염 바이러스 감염에 의해 유발된 간염, 간경화 및 간암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

본 발명은 B형 간염 바이러스 X 단백질에 대한 폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 D-아미노산을 포함하는 폴리펩티드이고, 이는 B형 간염 바이러스 X 단백질을 억제하는 기능을 갖고 HBx 활성을 억제하고 분자 수준, 세포 수준 및 동물 수준에서 B형 간염 바이러스의 DNA 복제 및 관련 항원(예: HBeAg)의 발현을 억제하고, 추가로 간경화에 기초하여 발생하는 B형 간염 바이러스 감염 및 간암에 의해 유발된 간염 및 간경화를 억제한다.

한 가지 양태에서, 본 발명은, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편, 또는 상기 아미노산 서열의 기능적 변이체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단리된 폴리펩티드로서, 상기 아미노산 서열, 상기 기능적 단편 또는 상기 기능적 변이체의 아미노산 서열 중의 하나 이상의 L-아미노산이 D-아미노산으로 치환되어 있고, 상기 폴리펩티드가, B형 간염 바이러스 X 단백질을 억제하고 B형 간염 바이러스 감염으로부터 기인하는 만성 간 질환의 발생 및 진행을 억제할 수 있는 기능을 갖는, 단리된 폴리펩티드를 제공한다.

바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%(바람직하게는, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 특정의 실시형태에서, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 2 내지 11에 제시된 아미노산 서열 중의 어느 하나이다.

본 발명에서, B형 간염 바이러스 감염으로부터 기인하는 만성 간 질환은 간염, 간경화 및 간암을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, B형 간염 바이러스 감염으로부터 기인하는 만성 간 질환을 치료 및 예방하는 의약의 제조에서 상기 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 구체적으로, 의약은 B형 간염 바이러스에 대한 치료 백신일 수 있다. 의약은, 임의의 약제학적 담체를 함유할 수 있는, 본 발명의 폴리펩티드 중의 어느 하나를 포함하는 약제학적 조성물일 수 있다.

동일한 아미노산 서열을 갖지만 L-아미노산만을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여, 본 발명의 폴리펩티드는 양호한 안정성을 나타낼 뿐만 아니라, 특히 B형 간염 바이러스의 DNA 복제 및 관련 항원(예: HBeAg)의 발현을 억제하는 기능에서 놀랍게도 현저한 약제학적 효과를 나타낸다. 따라서, 폴리펩티드는, 간염, 간경화 및 간암을 포함하는, B형 간염 바이러스 감염으로부터 기인하는 만성 간 질환의 예방 및 치료에 광범위하게 사용될 수 있다.

도 1. 정제된 인공적으로 합성된 폴리펩티드 D-TTK001의 HPLC 분석 결과.
도 2. 비아코어(Biacore) 3000을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 표적 단백질 HBx에 시험관내 결합시키는 실험 결과.
도 3. 세포 수준에서 HVB DNA와 통합시킨 간염 HepAD38 세포의 HBeAg 분비 수준에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 효과 분석. 결과는 HVB DNA와 통합된 간암 HepAD38 세포의 HBeAg 분비 수준이 0.1, 1, 10 및 100μM 인공 합성된 폴리펩티드 D-TTK001 또는 L-TTK001(즉, 항-HBxP1#)으로 48시간 치료 후에 용량 의존적으로 억제되었음을 나타냈다. D-TTK001의 최소 유효 용량은 0.1μM이고; L-TTK001의 최소 유효 용량은 10μM이다. 따라서, HBeAg에 대한 D-TTK001의 효과는 HBeAg에 대한 L-TTK001보다 우수하다. 스튜던트 t-시험은 통계학적 분석을 위해 사용된다, * P<0.05, ** P<0.01.
도 4. 세포 수준에서 HepG2.215 세포의 HBeAg 분비 수준에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 효과 분석. 결과는 HepG2.2.15 세포의 HBeAg 분비 수준이 0.1, 1, 10 및 100μM 인공 합성된 폴리펩티드 D-TTK001 또는 L-TTK001(즉, 항-HBxP1#)으로 48시간 치료 후에 용량 의존적으로 억제되었음을 나타냈다. D-TTK001의 최소 유효 용량은 0.1μM이고; L-TTK001의 최소 유효 용량은 10μM이다. 따라서, HBeAg에 대한 D-TTK001의 효과는 HBeAg에 대한 L-TTK001보다 우수하다. 스튜던트 t-시험은 통계학적 분석을 위해 사용된다, * P<0.05, ** P<0.01.
도 5. MTT 검정에 의해 세포 수준에서 HVB DNA와 통합된 간암 세포 HepAD38의 증식에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 효과 분석. 결과는 HVB DNA와 통합된 간암 세포 HepAD38의 증식이 0.1, 1, 10 및 100μM 인공 합성된 폴리펩티드 D-TTK001 또는 L-TTK001(즉, 항-HBxP1#)으로 48시간 치료 후에 용량 의존적으로 억제되었음을 나타냈다. 스튜던트 t-시험은 통계학적 분석을 위해 사용된다, * P<0.05, ** P<0.01.
도 6. HBV 트랜스제닉 마우스에 대한 본 발명의 폴리펩티드 D-TKK001의 효과 분석. HBV 트랜스제닉 마우스를 2개 그룹에서 각각 2.5mg/kg 및 5.0mg/kg의 용량으로 꼬리 정맥내 주사에 의해 인공 합성된 폴리펩티드 D-TKK001로 처리하고; 음성 대조군 그룹은 꼬리 정맥내 주사에 의해 PBS로 처리했다. 그 후, HBV 트랜스제닉 마우스의 혈청에서 HBV DNA의 카피 수를 실시간 PCR로 측정했다. 결과는 HBV 트랜스제닉 마우스의 혈청에서 HBV DNA의 카피 수가 시간 및 용량 의존적으로 D-TTK001에 의해 명백히 감소되었음을 나타냈고; 이는 D-TTK001이 HBV DNA 복제를 억제하는 기능을 갖는 것을 시사한다. 스튜던트 t-시험은 통계학적 분석을 위해 사용된다, * P<0.05, ** P<0.01.
도 7. HBV 트랜스제닉 마우스에 대한 인공 합성된 폴리펩티드 D-TKK001의 치료 효과의 분석. 좌측 패널은 HBV 트랜스제닉 마우스의 간 병리 조직을 나타내고; 무처리 대조군 그룹에서 10마리 HBV 트랜스제닉 마우스 중의 6마리는 간세포의 볼룬(ballooning) 변성 등의 바이러스 감염의 전형적 병리 특징을 나타냈다. 우측 패널은 꼬리 정맥내 주사에 의해 D-TTK001(5mg/kg)으로 3주 치료한 후의 간 조직을 나타내고; 실험 그룹 중의 6마리 어느 것도 간세포의 볼룬 변성을 나타내지 않았고, 이는 D-TTK001이 간 조직에서 병리학적 간염 병변에 대해 명백한 치료 효과를 갖는 것을 시사한다.
도 8. 간암 담지 누드 마우스의 생존율에 대한 인공 합성된 폴리펩티드 D-TKK001의 효과 분석. 동물 실험의 결과는 HepG2-X 세포로 접종된 종양 담지 누드 마우스의 생존율이 0.1mg/kg 또는 5.0mg/kg에서 인공 합성된 D-TTK001 폴리펩티드로 처리한 그룹에서 명백히 연장되었음을 나타냈고, 이는 D-TTK001이 누드 마우스에서 HepG2-X 세포 접종된 종양의 악성 표현형을 억제하는 효과를 갖는 것을 시사한다. 로그-랭크는 통계학적 분석을 위해 사용된다, * P<0.5.
도 9. 세포 수준에서 HVB DNA와 통합된 간암 세포 HepAD38의 HBeAg 분비 수준에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 효과 결과. 결과는 HVB DNA와 통합된 간암 세포 HepAD38의 HBeAg 분비 수준이 10μM의 인공 합성된 폴리펩티드 D-TTK001 또는 서열번호 2 내지 11에 제시된 바와 같은 폴리펩티드(예: D-TTK001-1, D-TTK001-2, D-TTK001-3, D-TTK001-4, D-TTK001-5, D-TTK001-6, D-TTK001-7, D-TTK001-8, D-TTK001-9, D-TTK001-10) 각각으로 48시간 처리 후에 용량 의존적으로 억제되었음을 나타냈다. 스튜던트 t-시험은 통계학적 분석을 위해 사용된다, * P<0.05, ** P<0.01.

상세한 설명 및 특허청구범위를 포함하는 본 발명에서, 달리 명시하지 않는 한, 하기 용어는 하기 의미로 사용된다:

본 발명에서, 약어는 L-아미노산 및 D-아미노산을 포함하는 아미노산을 기재하기 위해 사용된다. 약어는 표 1에 수록되어 있다.

[표 1]

약어 목록

본 발명에서, 폴리펩티드의 아미노산 서열에서, 기호 "D-*"는 폴리펩티드의 특정 위치에서 본래 L-아미노산을 치환하는 임의의 D-아미노산을 나타내기 위해 사용된다.

참조로서, 아미노산은 좌선성(L-아미노산) 및 우선성(D-아미노산)의 입체배치로 존재할 수 있다. L-아미노산은 천연에 존재하는 아미노산 및 대부분의 생물학적 시스템이다. 또한, 천연에 존재하는 폴리펩티드는 L-아미노산으로 구성되고, 따라서 L-폴리펩티드로서 지칭할 수 있다. D-아미노산은 상응하는 L-아미노산의 "거울상"이다. D-폴리펩티드(완전히 D-아미노산으로 구성된 폴리펩티드)는 천연에 존재하지 않지만, 이들 폴리펩티드는 3차원 단백질 구조를 형성하기 위해 인공적으로 합성할 수 있다.

"단리된"은 이의 본래 환경(예: 자연적으로 생성되는 경우에는 자연 환경)으로부터 물질을 분리하는 것을 지칭한다. 예를 들면, 살아있는 동물에 존재하는 천연적으로 생성된 폴리펩티드는 단리되지 않은 것을 의미하지만, 폴리펩티드가 통상 천연계에 공존하는 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 폴리펩티드는 단리된 것을 의미한다. 이러한 폴리펩티드는 벡터의 일부 또는 조성물의 일부로서 존재할 수 있고; 벡터 및 조성물은 이의 자연 환경의 성분은 아니기 때문에, 이들은 여전히 단리되어 있다.

본원에 사용된 용어 "정제된"은 순도에서 증가된 상태를 의미하고, "순도"는 상대적 용어이며, 절대적 순도로서 좁게 해석되어야 한다. 예를 들면, 순도는 적어도 약 50%, 또는 60%, 70%, 80% 또는 90%를 초과할 수 있거나, 심지어 100%에 도달할 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, 단리된 물질은 이의 본래 환경으로부터 분리된다. 살아있는 세포 내에 천연으로 존재하는 폴리펩티드는 단리되어 있지 않지만; 폴리펩티드가 천연 상태로 공존하는 물질로부터 분리되는 동일한 폴리펩티드는 단리된 것으로 간주될 수 있고, 순도가 개선되고, 따라서 정제된 것이다.

소위 "아미노산 서열" 또는 "폴리펩티드"는, 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 아미노산으로 이루어지는, 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 및 이들의 부분 단편을 지칭한다. 본 발명에서 아미노산 서열이 천연에 존재하는 단백질 분자 또는 기재된 공지된 인공적으로 합성된 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련되는 경우, 이러한 천연에 존재하는 단백질 분자 또는 공지된 폴리펩티드는 상기 단백질 분자 또는 상기 공지된 폴리펩티드의 전체 천연 아미노산 서열의 아미노산 서열을 한정하는 것을 의미하지 않는다. 본 발명의 아미노산 서열은 추가의 펩티드, 예를 들면, 복수의 히스티딘 태그(His-tag), 또는 Myc, FLAG 등의 에피토프 태그를 포함할 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열은 또한, 상기 단백질 분자 또는 상기 공지된 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 하나 이상의 L-아미노산을 치환하는 인공적으로 합성된 D-아미노산을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 폴리펩티드의 "기능적 단편"은, 일부인 본래 폴리펩티드(모체 폴리펩티드)의 실질적으로 유사하거나 동일한 생물학적 활성 또는 기능을 보유하는 본 발명의 폴리펩티드의 일부 또는 부분을 지칭한다.

본원에 사용된 폴리펩티드의 "기능적 변이체"는, 예를 들면, 1) 하나 이상의 아미노산 결실 및/또는 하나 이상의 아미노산 부가를 갖는 본래 아미노산 서열; 또는 2) 하나 이상의 보존적 또는 비-보존적 아미노산에 의해 치환된 본래 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산; 또는 3) 다른 그룹에 의해 치환된 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 중의 그룹; 또는 4) 또 다른 분자 또는 화합물(예를 들면, 당, 지질, 폴리에틸렌 글리콜 등)과 융합된 본래 아미노산 서열; 또는 5) 추가의 폴리펩티드 서열(예: 리더 서열 또는 분비 신호 서열 또는 정제 목적에 사용된 폴리펩티드 서열)과 융합된 본래 아미노산 서열; 또는 6) 본래 아미노산 서열의 레트로인버소 유사체; 또는 7) 상기의 조합을 포함하는, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열의 실질적으로 유사하거나 동일한 생물학적 활성 또는 기능을 갖는 아미노산 서열을 지칭한다.

여기서, "결실"은 아미노산 서열로부터 하나 또는 복수의 아미노산의 결실을 지칭한다.

"삽입" 또는 "부가"는, 천연 존재의 분자와 비교하여 또는 변화 전과 비교하여, 아미노산 서열의 변화에 의해 유발된 하나 또는 복수의 아미노산의 증가를 지칭한다.

"치환"은 상이한 아미노산에 의해 치환된 하나 또는 복수의 아미노산을 지칭한다.

"하나 또는 복수의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가"는, 결실, 치환 또는 부가가 가능한 정도로 아미노산의 수를 결실, 치환 또는 부가하기 위해, 지시된 돌연변이 방법 등과 같이 핵산을 돌연변이시키는 공지된 방법의 사용을 지칭한다. 상기 돌연변이는 공지된 방법에 의한 인공적으로 유도된 돌연변이로 한정되지 않고, 또한 분리 및 정제될 수 있는 핵산 또는 단백질에서 천연 발생 돌연변이를 포함한다.

아미노산의 "상동성" 또는 "동일성"의 퍼센트는 2개 이상의 아미노산 서열과의 비교에서 서열 동일성 또는 유사성의 퍼센트를 지칭한다. 당해 기술분야의 숙련가를 위해 서열 동일성의 퍼센트를 측정하는 다수의 방법, 예를 들면, MEGALIGN 프로그램(Lasergene Software Packages, DNASTA Inc., Madison, WI)이 있다. MEGALIGN 프로그램은 클러스터 방법[참조: Higgins & Sharp, Gene 73:237-244 (1988)] 등의 상이한 타입의 방법에 기초하여 2개 이상의 서열을 비교할 수 있다. 각 세트의 서열은 페어 사이의 거리를 조사하여 클러스터에 의해 정렬하고, 이어서 클러스터를 페어 또는 그룹에 할당한다. 2개 아미노산 서열, 서열 A 및 서열 B의 유사성의 퍼센트는 하기 식에 의해 계산할 수 있다:

[(서열 A 및 서열 B 사이의 정합 잔기의 수) / (서열 A의 잔기의 수 - 간격으로 서열 A의 잔기의 수 - 간격으로 서열 B의 잔기의 수)] × 100%

본 발명에서, "B형 간염 바이러스 감염으로부터 기인하는 만성 간 질환"은, 만성 간염, 반복된 감염에 의해 유발된 간 조직에서 섬유성 결합 조직의 과형성 후의 간경화, 및 간경화에 기초한 간암을 포함하는, B형 간염 바이러스 감염에 의해 유발된 간 질환을 지칭한다.

본 발명에서, "치료" 및 "예방" 및 이로부터 유래하는 어구는 100% 또는 완전한 치료 또는 예방을 의미하는 것은 아니고, 당해 기술분야의 숙련가에 의해 승인된 치료 또는 예방 정도로서 동정될 수 있다. 본 발명에서, "예방"은 질환 또는 이의 증상 또는 장애 개시를 지연시키는 것으로 이해될 수 있다.

폴리펩티드

본 발명은 단리된 또는 정제된 폴리펩티드를 제공한다. 상기 폴리펩티드는 아미노산 서열 Gly-Ser-Ala-Val-Met-Phe-Ser-Ser-Lys-Glu-Arg-Gly(즉, 서열번호 1, 본원에서 L-TTK001로서 지칭됨)을 갖는 폴리펩티드이고, 여기서 하나 이상의 천연 L-아미노산은 상응하는 인공 합성된 D-아미노산으로 치환된다. 본 발명은 이러한 폴리펩티드가 HBx의 활성을 현저히 억제시킬 수 있고, 따라서 B형 간염 바이러스의 DNA 복제 및 관련 항원(예: HBeAg)의 발현을 억제시키는 기능을 나타내고, 추가로 B형 간염 바이러스 감염 후의 만성 간 질환, 특히 간염, 간경화 및 간암의 발생 및 진행을 억제시킬 수 있음을 입증했다.

본 발명에서, L-TTK001 폴리펩티드에서 임의 수의 L-아미노산은 상응하는 D-아미노산으로 치환될 수 있고, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 L-아미노산이 치환될 수 있다.

본 발명의 한 가지 실시형태에 따라, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 L-TTK001의 서열이고, 여기서 글리신을 제외한 10개 L-아미노산은 상응하는 D-아미노산(즉, Gly-D-Ser-D-Ala-D-Val-D-Met-D-Phe-D-Ser-D-Ser-D-Lys-D-Glu-D-Arg-Gly, 서열번호 2, 본원에서 L-TTK001로서 지칭됨)으로 치환된다.

천연 펩티다제는 기질로서 D-아미노산을 사용할 수 없기 때문에, 폴리펩티드의 하나 이상의 L-아미노산을 치환하기 위해 상응하는 D-아미노산을 사용함으로써, 보다 높은 생체내 안정성을 갖는 폴리펩티드를 수득할 수 있다. 연구들은, 예를 들면, N-말단 또는 C-말단에서 D-아미노산의 존재가 폴리펩티드의 생체내 안정성을 증가시킬 수 있음을 나타냈다[참조: Powell et al., Pharm.Res.10: 1268-1273 (1993)]. 그러나, D-아미노산 및 L-아미노산은 상이한 키랄성, 즉 상이한 입체화학 배치를 갖기 때문에, "거울상" 구조가 형성되고, D-아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 본래 L-폴리펩티드와 동일한 결합 능력 또는 생물학적 기능을 항상 갖는 것은 아니다. 따라서, 동일한 아미노산 서열을 갖지만 상이한 아미노산 배치를 갖는 2개 폴리펩티드 분자가 동일한 기능을 갖는지를 예측하는 것은 곤란하다. 따라서, D-아미노산을 포함하는 변형된 폴리펩티드에 대한 실제 실험을 수행하는 이외에, D-아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 본래 폴리펩티드와 동일한 효과를 갖는지를 결정할 수는 없다. 실제로, D-아미노산을 포함하는 약제학적 폴리펩티드 내에 L-아미노산을 포함하는 약제학적 폴리펩티드를 변형시킬 필요가 있는 경우, 이의 약역학적 기능을 유지 및 증강시키기 위해, 당해 기술분야의 숙련가는 폴리펩티드, 예를 들면, 치환되는 하나 이상의 아미노산 또는 치환되는 위치를 구체적으로 변형시키는 방법에 대해 다수의 실험 및 지속적 최적화를 수행할 필요가 있다.

일반적으로, D-아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 있어서, D-아미노산 잔기에 의해 치환된 L-아미노산 잔기의 수가 작을수록, 폴리펩티드의 결합능의 변화가 보다 적다. 다수의 L-아미노산이 치환되는 경우, 폴리펩티드 결합능 및 생물학적 효력의 변화는 이에 따라 증가할 것이고, 결국 이의 전체 손실을 가져올 것이다.

그러나, 본 발명의 발명자들은, 실험을 통해, 폴리펩티드 L-TTK001의 하나 이상의 L-아미노산이 D-아미노산에 의해 치환되는 경우, 상기 치환된 폴리펩티드가, 세포 수준 및 동물 수준에서 B형 간염 바이러스의 복제 및 발현을 억제하고 동물 수준에서 간염 바이러스에 의해 유발된 바이러스 간염을 치료하고 결국 간암 세포의 성장을 억제하는 것을 포함하여, L-TTK001 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 유지하는 것을 밝혀냈다.

본 발명의 발명자들은 또한 놀랍게도, L-TKK001의 모든 L-아미노산이 인공 합성된 D-아미노산(즉, 수득된 아미노산은 D-TTK001이다)으로 치환되는 경우에도, HBx 단백질에 대한 상기 치환된 폴리펩티드의 시험관내 결합은 현저히 변화하지 않는 것을 밝혀냈다. 예를 들면, 시험관내 결합 분석 결과에 따르면, HBx(8nM)에 대한 L-폴리펩티드 L-TTK001의 시험관내 결합은, HBx(35nM)에 대한 D-TTK001의 시험관내 결합과 비교하여, 현저한 차이가 없음을 나타냈다.

D-TTK001에 함유된 아미노산은 모두 D-아미노산이기 때문에, D-TTK001 폴리펩티드는 또한 우수한 약물동태학적 성능을 갖는다. 따라서, 본 발명자들은, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들면, D-TTK001이 L-TTK001보다 훨씬 적은 용량으로 L-TTK001과는 상이한 투여 방법, 예를 들면, 동물 꼬리 정맥내 주사에 의해 유효한 약제학적 효과를 달성할 수 있음을 밝혀냈다.

상대적으로, 본 발명자들은, 폴리펩티드의 약물동태적 특성 및 안정성 때문에, 본 발명의 폴리펩티드가 HBV의 DNA 복제 및 관련 항원(예: HBeAg)의 발현의 억제 및 추가로 B형 간염 바이러스 감염 후의 만성 간 질환(간염, 간경화 및 간암 포함), 특히 간염의 발생 및 진행의 억제에 있어서 L-폴리펩티드(예: L-TTK001)보다 현저한 효과를 나타내는 것을 밝혀냈다. 예를 들면, HBeAg 분비 수준의 억제에 대한 D-폴리펩티드의 유효 용량은 L-폴리펩티드보다 훨씬 낮은 수치이고; 본 발명의 폴리펩티드는 또한 투여 경로의 선택에 있어서 L-아미노산으로 구성된 L-폴리펩티드보다 더욱 유리하다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드의 다양한 기능적 단편을 제공한다. 상기 기능적 단편은, 모체 폴리펩티드, 예를 들면, HBx 활성의 억제와 비교하여, 기능적 단편이 모체 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유사한 정도, 동일한 정도, 또는 보다 높은 정도로 유지할 수 있는 조건에서 본 발명의 폴리펩티드의 연속 아미노산의 임의의 단편일 수 있다. 모체 폴리펩티드를 참조하여, 기능적 단편은, 예를 들면, 모체 폴리펩티드에 의해 제공된 것의 대략 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 120%, 150%, 200% 또는 그 이상의 활성을 갖는다. 상기 기능적 단편은 또한 연속 아미노산 서열의 다수의 단편의 아미노 말단 및 카복실 말단 중의 어느 하나 또는 둘 다에 추가의 아미노산, 예를 들면, 모체 폴리펩티드의 아미노산 서열 중의 것과 상이한 아미노산을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 상기 추가 아미노산은 상기 기능적 단편의 생물학적 기능, 예를 들면, Hbx 활성의 억제, HBV 바이러스의 복제 및 발현의 억제, 및 간염의 발생 및 진행 및 간암의 진행의 효과적인 억제를 저해하지 않는다. 보다 바람직하게는, 상기 추가의 아미노산은, 모체 폴리펩티드의 생물학적 활성과 비교하는 경우, 증강된 생물학적 활성을 유도할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드의 기능적 단편의 아미노산 서열은 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖고; 보다 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드의 기능적 단편의 아미노산 서열은 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 적어도 75%, 또는 80%, 또는 85%, 또는 90%, 또는 95% 서열 동일성을 갖는다.

또한, 본 발명에서 폴리펩티드 및 이의 기능적 단편의 기능적 변이체는 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드 및 이의 기능적 단편의 기능적 변이체는 모체 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편과 실질적으로 유사하거나 동일한 생물학적 활성, 예를 들면, HBx 활성의 억제, HBV 바이러스의 복제 및 발현의 억제, HBV 트랜스제닉 마우스의 동물 수준에서 HBV 바이러스에 의해 유발된 바이러스 간염의 치료, 및 간암 세포의 악성 표현형의 억제를 보유해야 한다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편을 참조하여, 기능적 단편은, 예를 들면, 모체 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 아미노산 서열과 대략 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 기능적 단편의 아미노산 서열은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖고; 보다 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 및 이의 기능적 단편의 기능적 변이체는 모체 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편과 단지 1 내지 3개 아미노산만 상이하고; 가장 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 및 이의 기능적 단편의 기능적 변이체는 모체 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편과 단지 1개 아미노산만 상이하다.

예를 들면, 본 발명은 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환을 받은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편은 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 보존적 아미노산 치환을 받을 수 있고, 이는 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 또는, 본 발명은 또한 모체 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편으로부터 적어도 하나의 비-보존적 아미노산 치환을 받은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로, 모체 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편으로부터 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열이 포함된다. 이들 경우에, 아미노산 치환은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 생물학적 활성을 간섭하거나 억제하지 않는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 아미노산 치환은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 생물학적 활성을 추가로 증가시킨다.

보존적 아미노산 치환은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 이는 특정 물리적 및/또는 화학적 특성을 갖는 하나의 아미노산이 동일한 화학적 또는 물리적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되는 아미노산 치환을 의미한다. 당해 기술분야의 숙련가는 보존적 아미노산 치환이 단백질의 구조 또는 기능에 현저한 변화를 유발하지 않음을 이해한다. 예를 들면, 통상의 보존적 아미노산 치환은 또 다른 산성 아미노산으로 치환된 산성 아미노산(예: Asp 또는 Glu), 극성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산으로 치환된 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예: Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp 또는 Val 등), 또 다른 염기성 아미노산으로 치환된 염기성 아미노산(Lys, Arg 등), 극성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산으로 치환된 극성 측쇄를 갖는 아미노산(Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, 또는 Tyr 등), 또 다른 방향족 아미노산 등으로 치환된 방향족 아미노산(Trp, Phe 또는 Tyr 등)을 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드(이의 기능적 단편 포함) 및 기능적 변이체는 임의의 길이를 가질 수 있고, 즉 임의 수의 아미노산을 포함할 수 있으며, 단 폴리펩티드(또는 이의 기능적 단편) 및 이의 기능적 변이체는 모체 폴리펩티드의 본질적 생물학적 활성, 예를 들면, HBx 활성의 억제, 세포 수준 및 동물 수준에서 HBV 바이러스의 복제 및 발현의 억제, 및 후기 상태의 간암 세포의 성장 억제를 포함하여 HBV 바이러스에 의해 유발된 바이러스 간염의 치료를 보유한다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드(기능적 단편 및 기능적 변이체 포함)은 4 내지 2000개 아미노산 길이, 예를 들면, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 700, 800, 1000 또는 그 이상의 아미노산 길이일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 6 내지 20개 아미노산 길이이고, 폴리펩티드 약물의 약물동태 및 반감기의 요건을 충족시킨다.

한 가지 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 이의 기능적 단편의 기능적 변이체는 서열번호 1의 모체 폴리펩티드와 상이한 단지 하나의 아미노산만을 갖고, 서열번호 1의 모체 폴리펩티드와 유사한 생물학적 활성 및 기능, 예를 들면, HBx 활성의 억제, 및 암 세포, 바람직하게는 간암 세포, 특히 HBx를 발현하는 간암 세포의 효과적 억제를 갖는다.

본원에 기재된 본 발명의 폴리펩티드(기능적 단편 포함) 및 이의 기능적 변이체는 또한 세포-투과성 펩티드(CPP)를 포함할 수 있다. 이러한 CPP는 세포 막에 걸쳐 및 세포 내로 본 발명의 폴리펩티드의 도입을 촉진시킨다. CPP는 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Deshayes et al., Cell. Mol. Life Sci. 62: 1839-1849 (2005); El-Andaloussi et al., Curr. Pharm. Design. 11: 3597-3611(2005)]. 본원에 기재된 CPP는 당해 기술분야에 공지된 임의의 것들일 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드(기능적 단편 포함) 및 이의 기능적 변이체는, 예를 들면, 디설파이드 결합을 통해 지질화(예: 지방 산성화), 글리코실화, 아미드화, 카복실화, 포스포릴화, 에스테르화, N-아실화, 폐환화될 수 있고, 산 부가 염으로 전환될 수 있으며, 이량체화 또는 중합체화 및/또는 접합될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드(기능적 단편 포함) 및 이의 유도체, 예를 들면, 지방산 유도체를 포함하는 이의 기능적 변이체는 단량체 펩티드, 이량체 펩티드 또는 다량체 펩티드일 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드(기능적 단편 포함) 및 이의 기능적 변이체는 당해 기술분야에 공지된 방법으로 수득할 수 있다[참조: Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005; Reid, R., Peptide and Protein Drug Analysis, Marcel Dekker Company, 2000; and U.S. Patent No. 5,449,752]. 또한, 폴리펩티드는 표준 재조합 방법[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001]을 사용하여 재조합에 의해 생산할 수 있다. 추가로, 본 발명의 일부 폴리펩티드(이의 기능적 단편 및 기능적 변이체 포함)는 공급원, 예를 들면, 식물, 세균, 곤충, 포유동물, 예를 들면, 랫트, 인간 등으로부터 단리 및/또는 정제할 수 있다. 단리 및 정제 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 또는, 본원에 기재된 폴리펩티드(이의 기능적 단편 및 기능적 변이체 포함)은 합성하거나 상업적 회사로부터 구입할 수 있다.

접합체

본 발명은 또한, 본 발명의 폴리펩티드(이의 기능적 단편 또는 기능적 변이체 포함) 또는 펩티드유사체를 포함하는 접합체, 예를 들면, 생물접합체를 포함한다. 접합체, 및 일반적으로 접합체를 합성하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Hudecz, F., Methods Mol Biol. 298: 209-223 (2005) and Kirin et al., Inorg Chem. 44(15): 5405-5415 (2005)].

약제학적 조성물

폴리펩티드(기능적 단편 포함) 및 이의 기능적 변이체 및 접합체 등을 포함하는 본 발명의 상술한 재료(이하 총칭하여 "본 발명의 재료"로 지칭함)은 단리, 정제 합성 및/또는 재조합할 수 있다.

본 발명의 재료는 또한 조성물, 예를 들면, 약제학적 조성물로 제형화할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 본 발명의 임의의 폴리펩티드(기능적 단편 및 기능적 변이체 포함) 및 펩티드유사체, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 임의의 재료를 함유하는 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 하나 이상의 재료, 예를 들면, 2개 이상의 상이한 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또는, 약제학적 조성물은 또 다른 약제학적 제제 또는 약물과 조합하여 재료를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 또 다른 활성 약제학적 제제 또는 약물은, 예를 들면, 화학요법제, 예를 들면, 아스파라기나제, 부설판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다미오라비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맵, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 재료를 지질과 조합하여 포함한다. 상기 지질은, 지방산, 인지질, 스테롤, 스핑고지질, 테르펜, 글리세로지질, 글리에로인지질, 프레놀 지질, 사카로지질, 폴리케타이드 등을 포함하는 임의의 지질일 수 있다. 이러한 지질은 당해 기술분야에 공지되어 있다.

약제학적 조성물과 관련하여, 약제학적으로 허용되는 담체는 통상 사용되는 임의의 것들일 수 있고, 화학-물리적 고려에 의해, 예를 들면, 용해도 및 활성 화합물(들)과의 반응성 결여, 및 투여 경로에 의해서만 제한된다. 본원에 기재된 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 비히클, 애주번트, 부형제 및 희석제는 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있고, 일반적으로 용이하게 입수가능하다. 바람직하게는, 약제학적으로 허용되는 담체는 활성제(들)에 대해 화학적으로 불활성이고, 사용 조건하에 유해한 부작용 또는 독성을 갖지 않는다.

담체의 선택은 본 발명의 특정 재료에 의해, 또한 본 발명의 재료를 투여하기 위해 사용된 특정 방법에 의해 부분적으로 결정될 것이다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물의 다양한 적합한 제형이 있다. 경구, 에어로졸, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수내, 복막내, 직장내 및 질내 투여를 위한 하기 제형은 예시적이고, 어떠한 방식으로든 제한하지 않는다. 하나 이상의 경로를 사용하여 본 발명의 재료를 투여할 수 있고, 특정 상황에서, 특정 경로가 또 다른 경로보다 신속하고 효과적인 반응을 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 국소 제형, 정맥내 제형 또는 피하 제형이다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 국소 제형이다. 국소 제형은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 이러한 제형은 본 발명의 피부에 적용하기 위한 것이라는 맥락에서 특히 적합하다. 본 발명의 국소 제형은, 예를 들면, 크림, 로션, 연고, 패치, 오일, 페이스트, 스프레이, 예를 들면, 에어로졸 스프레이, 겔, 롤-온 액체, 고체 스틱 등일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 국소 제형은 크림, 로션, 연고 또는 패치이다.

경구 투여에 적합한 제형은 (a) 액체 용액, 예를 들면, 희석제, 예를 들면, 물, 염수 또는 오렌지 쥬스에 용해시킨 유효량의 본 발명의 재료; (b) 고체 또는 과립으로서, 소정량의 활성 성분을 각각 함유하는 캡슐, 정제 및 로젠지제; (c) 분말; (d) 적합한 액체 중의 현탁제; 및 (e) 적합한 에멀젼으로 구성할 수 있다. 액체 제형은 희석제, 예를 들면, 물 및 알콜, 예를 들면, 에탄올, 벤질 알콜, 및 폴리에틸렌 글리콜을 약제학적으로 허용되는 계면활성제와 함께 또는 없이 포함할 수 있다. 캡슐 형태는, 예를 들면, 계면활성제, 윤활제 및 불활성 충전제, 예를 들면, 락토즈, 슈크로즈, 인산칼슘 및 옥수수 전분을 함유하는 통상의 경질- 또는 연질-쉘 젤라틴 타입의 것일 수 있다. 정제 형태는 하나 이상의 락토즈, 슈크로즈, 만니톨, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산, 미정질 셀룰로즈, 아카시아, 젤라틴, 구아 검, 콜로이드성 이산화규소, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 스테아르산 및 기타 부형제, 착색제, 희석제, 완충제, 붕해제, 습윤제, 보존제, 향미제 및 기타 약리학적으로 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 로젠지 형태는 향미제, 통상적으로 슈크로즈 또는 아카시아 중에 본 발명의 재료를 포함할 수 있고, 또한 향미제는 불활성 매트릭스, 예를 들면, 젤라틴 및 글리세린, 또는 슈크로즈 및 아카시아, 또한, 당해 기술분야에 공지된 부형제를 함유하는 에멀젼, 겔 등에 본 발명의 재료를 포함한다.

단독으로 또는 다른 적합한 성분과 조합하여 본 발명의 재료는 흡입에 의해 투여되는 에어로졸 제형으로 제조할 수 있다. 이들 에어로졸 제형은 가압된 허용되는 분사제, 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등에 넣을 수 있다. 이들은 또한 네불라이저 또는 분무기에서와 같이 비-가압된 제제로서 제형화할 수 있다. 이러한 분무 제형은 또한 점막에 분무하기 위해 사용할 수 있다.

비경구 투여에 적합한 제형은, 항산화제, 완충제, 정균제 및 의도된 수용자의 혈액과 제형을 등장성으로 되게하는 용질을 함유하는 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁제를 포함한다. 본 발명의 재료는, 생리학적으로 허용되는 계면활성제, 예를 들면, 비누 또는 세정제, 현탁화제, 예를 들면, 펙틴, 메틸셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸셀룰로즈, 또는 카복시메틸셀룰로즈, 또는 유화제 및 기타 약제학적 애주번트의 첨가와 함께 또는 첨가 없이, 물, 염수, 수성 덱스트로즈 및 관련 당 용액, 알콜, 예를 들면, 에탄올 또는 헥사데실 알콜, 글리콜, 예를 들면, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, 디메틸설폭사이드, 글리세롤, 케탈, 예를 들면, 2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-메탄올, 에테르, 오일, 지방산, 지방산 에스테르 또는 글리세라이트, 또는 아세틸화 지방산 글리세라이드를 포함하는 약제학적 담체 중의 생리학적으로 허용되는 희석제, 예를 들면, 멸균 액체 또는 액체 혼합물로 투여할 수 있다.

비경구 제형에 사용될 수 있는 오일은 석유, 동물, 식물 또는 합성 오일을 포함한다. 오일의 구체적 예는 땅콩유, 대두유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 석유 오일 및 광물유를 포함한다. 비경구 제형에 사용하기 위한 적합한 지방산은 올레산, 스테아르산 및 이소스테아르산을 포함한다.

비경구 제형에 사용하기에 적합한 비누는 지방산 알칼리 금속 염 및 트리에탄올아민 염을 포함하고, (a) 양이온성 세정제, 예를 들면, 디메틸 디알킬 암모늄 할라이드, 및 알킬 피리디늄 할라이드, (b) 음이온성 세정제, 예를 들면, 알킬, 아릴 및 올레핀 설포네이트, 알킬, 올레핀, 에테르 및 모노글리세라이드 설페이트, 및 설포석시네이트 등, (c) 비이온성 세정제, 예를 들면, 지방 아민 옥사이드, 지방산 알칸올아미드, 및 폴리옥시에틸렌폴리프로필렌 공중합체 등, (d) 양쪽성 세정제, 예를 들면, 알킬-β-아미노프로피오네이트 및 2-알킬-이미다졸린 4급 암모늄 염 및 (e) 이의 혼합물을 포함하는 적합한 세정제를 함유한다.

비경구 제형은 전형적으로 용액 중에 약 0.5% 내지 약 25%(용적 퍼센트에서의 중량)의 본 발명의 재료를 함유할 것이다. 보존제 및 완충제가 사용될 수 있다. 주사 부위에서 자극을 최소화하거나 제거하기 위해, 이러한 조성물은 친수성-친유성 밸런스(HLB)를 갖는 하나 이상의 비이온성 계면활성제를 함유할 수 있다. 이러한 제형 중의 계면활성제의 양은 전형적으로 약 5% 내지 약 15%(용적 퍼센트에서의 중량)의 범위일 수 있다. 적합한 계면활성제는 폴리에틸렌 글리콜 솔비탄 지방산 에스테르, 및 프로필렌 옥사이드와 프로필렌 글리콜의 축합에 의해 형성된 에틸렌 옥사이드와 소수성 염기와의 고분자량 부가물을 포함한다. 비경구 제형은 단일 용량 또는 복수 용량 밀봉 용기에 제공될 수 있고, 사용 직전에 주사용 멸균 액체 부형제, 예를 들면, 물의 첨가만을 필요로 하는 동결-건조(동결건조) 조건에서 저장할 수 있다. 즉시 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 상기 기재된 종류의 정제로부터 제조할 수 있다.

본 발명의 재료, 또는 본 발명의 재료를 포함하는 조성물은 주사가능한 제형으로 제조할 수 있다. 주사가능한 조성물에 효과적인 약제학적 담체에 대한 요건은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 바람직하게는, 세포, 예를 들면, 수지상 세포에 투여하는 경우, 세포는 주사에 의해 투여한다.

추가로, 본 발명의 재료, 또는 이러한 재료를 포함하는 조성물은 다양한 염기와 혼합함으로써, 예를 들면, 염기 또는 수용해성 염기를 유화시킴으로써 좌제로 제조할 수 있다. 질내 투여에 적합한 제형은, 활성 성분에 추가하여, 적절한 것으로 당해 기술분야에 공지되어 있는 이러한 담체를 함유하는 페사리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼, 또는 분무 제형으로서 제공될 수 있다.

상술한 약제학적 조성물에 추가하여, 본 발명의 재료는 봉입 복합체, 예를 들면, 사이클로덱스트린 봉입 복합체 또는 리포좀으로 제형화할 수 있음이 당해 기술분야의 숙련가에게 이해될 것이다.

본 발명의 목적을 위해, 투여된 본 발명의 재료의 양 또는 용량은, 예를 들면, 상당한 시간 프레임에 걸쳐 대상체 또는 동물에서 치료학적 또는 예방학적 반응을 수행하기에 충분해야 한다. 예를 들면, 본 발명의 재료의 용량은 발병된 세포의 증식을 억제하거나, 투여 시간으로부터 약 2시간 이상, 예를 들면, 12 내지 24시간 또는 그 이상의 기간 내에 질환(예: 종양 또는 암)을 치료 또는 예방하는데 충분해야 한다. 특정 실시형태에서, 시간 기간은 보다 길수 있다. 용량은 본 발명의 특정 재료의 효력 및 동물(예: 인간)의 상태, 또한 치료되는 동물(예: 인간)의 체중에 의해 결정될 것이다. 투여 용량을 결정하는 다수의 검정법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 본 발명의 재료의 용량은 특정 물질의 투여를 수반할 수 있는 임의의 유해한 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 결정될 것이다.

당해 기술분야의 숙련가는, 재료의 치료적 또는 예방적 효력이 변형을 통해 증가되도록, 본 발명의 재료가 다수의 방식으로 변형될 수 있음을 용이하게 이해할 것이다. 예를 들면, 재료는 링커를 통해 표적 모이어티에 직접 또는 간접적으로 접합시킬 수 있다. 화합물, 예를 들면, 본 발명의 재료를 표적 모이어티에 접합시키는 실시는 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995) and U.S. Patent No. 5,087,616]. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 재료는, 상기 재료를 투여되는 체내로 방출하는 방식이 시간 및 체내의 위치에 대해 조절되도록, 데포 형태로 변형시킬 수 있다(참조: 미국 특허 제4,450,150호). 본 발명의 재료의 데포 형태는, 예를 들면, 본 발명의 재료 및 다공성 또는 비-다공성 물질, 예를 들면, 중합체를 포함하는 이식가능한 조성물일 수 있고, 여기서 본 발명의 재료는 재료 및/또는 비-다공성 물질의 열화에 의해 캡슐화되거나 이들을 통해 분산된다. 이어서, 데포는 체내의 목적하는 위치에 이식되고, 본 발명의 재료는 소정 속도로 이식물로부터 방출된다.

폴리펩티드(기능적 단편 포함) 및 이의 기능적 변이체를 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은, 바이러스 간염 및 수득된 간경화 및 간암을 포함하는 B형 간염 바이러스 감염-유도된 만성 간 질환을 예방 및 억제하는 방법에 사용할 수 있다. 당해 기술분야의 숙련가는 본 발명에 기재된 B형 간염 바이러스에 의해 유도된 만성 간 질환이 임의의 숙주에 존재할 수 있음을 용이하게 이해한다. 바람직하게는, 숙주는 포유동물이다. 특히 바람직하게는, 숙주는 인간이다.

본 발명은 특정 실시예를 참조하여 이하에 추가로 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위해 사용되고, 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아닌 것을 이해해야 한다. 하기 실시예에 기재되지 않은 구체적 조건을 사용한 실험 방법은 일반적으로 통상의 조건하에 수행되고, 구체적 기재 없이 사용된 재료는 일반적 화학 시약 회사로부터 구입한다.

실시예

실시예 1: 폴리펩티드의 설계 및 제조

폴리펩티드 D-TTK001의 단편의 인공적 합성:

아미노산 서열 Gly-D-Ser-D-Ala-D-Val-D-Met-D-Phe-D-Ser-D-Ser-D-Lys-D-Glu-D-Arg-Gly(서열번호 1)을 갖는 폴리펩티드(이하 D-TTK001로서 지칭함)는 인공 합성 방법으로 합성한다. 폴리펩티드는 고상 펩티드 합성 방법을 통해 제조했고, 예를 들면, AAPPTEC Apex396 펩티드 합성기(Hong Kong Universal Analytical & Testing Instruments Ltd.로부터 구입) 상에서 수행했고; 합성은 밀봉된 폭발-방지 유리 반응기에서 아미노산을 합성하기 위해 C-말단 카복실 말단으로부터 N-말단 아미노 말단으로 서열번호 1에 따라 수행했다. 이는, N-말단에서 마지막 D-Ser 및 Gly가 부가될 때까지, Gly-D-Ser-D-Ala-D-Val-D-Met-D-Phe-D-Ser-D-Ser-D-Lys-D-Glu-D-Arg-Gly의 아미노산 서열에 부가된 제1 아미노산 단량체가 C-말단에서 Gly, 이어서 D-Arg, 및 이어서 D-Glu이었음을 의미한다. 수득되는 펩티드는 부가, 반응 및 합성을 반복하여 수득했다. 고상 펩티드 합성은 각 단계에서 수득되는 펩티드의 정제 곤란성을 크게 감소시켰다. 반응에 관여하는 아미노산의 측쇄는 부반응을 방지하기 위해 보호되었다. 말단 카복실 그룹은 비결합되었고, 따라서 반응 전에 활성화되어야 한다.

인공 합성된 폴리펩티드 D-TTK001은 HPLC(PLC Agela C18 컬럼으로)에 의해 분석했다. 도 1은 순도가 97.2%임을 나타냈다.

실시예 2:

A. 시험관내 결합능의 측정

HBx 유전자를 발현하는 재조합 플라스미드(pET-30a-HBx)를 자가-작제하여 보존했고[참조: Zhang H, et al. J Biomed Biotechnol, doi:10.1155/2009/289068], 이어서 HBx의 발현 및 정제를 시험관내 결합능에 대한 상기 참조문헌에 따라 수행했다. 비아코어 3000 생분자 상호작용 분석 장치(GE Healthcare사 제조)를 사용하여, 재조합에 의해 발현된 HBx 단백질에 대한 폴리펩티드 D-TTK001의 시험관내 결합능을 측정했다. 상이한 농도의 폴리펩티드를 180초 동안 30μL/분의 속도로 주사했다. 해리 단계에서, HBS-EP 완충액을 900초 동안 30μL/분의 속도, 이어서 30μL/분의 속도로 주사하고, 1mM NaOH의 2개 샷을 20초 동안 주사하여 칩을 재생시켰다. 모든 신호는 참조 채널로서 채널 1을 사용하여 보정했다. 결합 측정은 각각 2회 수행했고, 이때 제1 측정시에 HBX는 커플링된 폴리펩티드의 채널 및 블랭크 채널에 각각 0nM, 10nM, 50nM, 100nM, 500nM 및 600nM의 농도로 주사했다. 결합 시간은 180초였고, 해리 시간은 400초였다. 칩 표면 상에, 1mM NaOH를 재생을 위해 20초 동안 30μ/L의 속도로 주사했다. 결과는 도 2에 제시된 바와 같이 소프트웨어에 의해 동력학적으로 분석했다. 제2 측정에서, HBX는 각각 0nM, 10nM, 50nM, 588nM, 1μM 및 2μM의 농도로 커플링된 폴리펩티드의 채널 및 블랭크 채널에 주사했다. 결합 시간은 180초였고, 해리 시간은 400초였다. 칩 표면 상에, 1mM NaOH를 재생을 위해 20초 동안 30μL/분의 속도로 주사했다. 결과는 BIA 평가 소프트웨어에 의해 동력학적으로 분석했다.

2개 결합 측정의 결과는 표 1에 수록되어 있다.

결합 친화성의 분석 결과

샘플	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
D-TTK001~HBx 1차 측정	2.72e4	8.11e-4	2.99e-8
D-TTK001~HBx 2차 측정	6.76e4	2.72e-3	4.03e-8

데이터는, HBx에 대한 D-TTK001의 시험관내 결합이 L-폴리펩티드 항-HBxP1#의 것보다 낮았지만, 크기의 정도에서 차이가 없음을 나타낸다.

B. 시험관내 효과 실험

1. 세포주:

실험에 사용된 세포주

세포주	특징, 사용 및 노트	기원
HepG2-X	HBx 유전자로 안정하게 형질감염된 HepG2 Wang Q, et al. Neoplasia. 2010; 12(2): 103-15.	자가-작제되고 보존됨
HepG2.2.15	HBV의 전체 게놈으로 안정하게 형질감염된 HepG2	Shanghai Jinma Biotech Co., Ltd.사로부터 구입
HepAD38	HBV DNA와 안정하게 통합된 간암 세포, 테트라사이클린에 의해 조절된 이의 발현	Shanghai Sixin Biotech Co., Ltd.사로부터 구입

2. 주요 시약:

3. 효소 결합된 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하여 간암 세포에서 HBeAg 분비에 대한 D-TTK001 기능의 분석

(1) 세포 배양

(i) 생체안전 캐비넷을 30초 동안 자외선 멸균시키고, 30분 동안 퍼징하고; 15% 태소 혈청, HepAD38 세포(또는 HepG2.2.15 세포)를 함유하는 DMEM/F12(1:1) 배양 배지를 취출하고, 75% 알콜로 멸균시키고, 생체안전 캐비넷에 넣었다.

(ii) 무균 조건하에, 오래된 배양 배지를 버리고, 매회 3mL 1×PBS를 첨가하고, 2회 세척하고, 1mL 0.25% 트립신을 첨가하고, 현미경으로 관찰하여 세포가 순회할 때까지 세포를 소화시켰다. 5mL 배양 배지를 첨가하고, 세포를 분배하고, 혈구계수기로 계수하고, 1~2×10⁴ 세포/mL의 세포 수까지 배양 배지로 희석시켰다.

(iii) 96-웰 플레이트를 플레이팅. 무균 조건하에, 오래된 배양 배지를 버리고, 매회 3mL 1×PBS를 첨가하고, 2회 세척하고, 1mL 0.05% 트립신을 첨가하고, 현미경으로 관찰하여 세포가 순회할 때까지 세포를 소화시켰다. 10mL 배양 배지를 첨가하고, 세포를 분배하고, 혈구계수기로 계수하고, DMEM/F12(1:1) 배양 배지로 희석시키고, 1~2×10³ 세포/mL의 세포 수까지 각 웰에 100μL 세포 현탁액을 첨가한다. 가장 외측 웰은 세포를 첨가하지 않는다. 세포 부착(통상 12시간) 및 확장 때까지 배양한다. 후속 시험은 세포가 양호한 상태일 때에 수행할 수 있다.

(2) D-TTK001(또는 L-TTK001, 즉, 항-HBxP1#)을 간암 HepAD38 세포(또는 HepG2.2.15 세포)에 적용

10mM D-TTK001(또는 L-TTK001) 모액을 고농도에서 저농도로 연속 희석시키고, 간암 HepAD38 세포(또는 HepG2.2.15 세포) 배양 용액에 첨가하여 각 그룹에서 0.1μM, 1μM, 10μM 및 100μM의 D-TTK001(또는 L-TTK001)의 최종 농도를 수득한다. 음성 대조군 그룹을 위해 10μL의 멸균 ddH₂O를 첨가하고, 72시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양한다.

(3) HepAD38 세포(또는 HepG2.2.15 세포) 배양 배지 중의 HBeAg 함량을 측정하기 위해 ELISA 적용

(i) 평형화: 실온에서 30분 동안 HBeAg 검정 키트를 위치시킨다.

(ii) 용액 제조: 정제수로 25회 농축 세척액을 희석시킨다.

(iii) 플레이트 취출: 실험 요건에 따라 반응 플레이트를 취출(음성 대조군용의 3개 웰, 양성 대조군용의 1개 웰, 및 블랭크 대조군용의 1개 웰).

(iv) 샘플 첨가: 각각의 웰에 75μL의 시험 샘플 또는 음성/양성 대조군을 첨가하고, 온화하게 진탕시켜 혼합한다.

(v) 배양: 마이크로플레이트 밀봉기로 밀봉한 후, 37℃에서 60분 동안 배양한다.

(vi) 효소 첨가: 50μL의 효소 접합체를, 블랭크 웰을 제외한 각 웰에 첨가하고, 온화하게 진탕시켜 혼합한다.

(vii) 배양: 마이크로플레이트 밀봉기로 밀봉한 후, 37℃에서 30분 동안 배양한다.

(viii) 플레이트 세척: 마이크로플레이트 밀봉기를 주의하여 제거하고, 플레이트를 5분 동안 수동으로 세척하고, 두드려 건조시킨다.

(ix) 발색: 각각 50μL의 발색제 A 및 B 액체를 첨가하고, 온화하게 진탕시켜 혼합하고, 37℃에서 30분 동안 위치시킨 암 상태에서 발색시킨다.

(x) 정지: 50μL의 정지 용액을 각 웰에 첨가하고, 온화하게 진탕시켜 혼합하고, 10분 내에 결과를 측정한다. 플레이트 판독기의 파장을 450nm로 설정하고, 블랭크 웰로 0을 설정한 후에 각 웰에 대한 OD 값을 측정한다.

도 3 및 4에 제시된 바와 같이, D-TTK001(또는 L-TTK001)은 용량 의존적으로 HepAD38 세포(또는 HepG2.2.15 세포)의 HBeAg 분비 수준에 대한 억제 효과를 나타냈다. D-TTK001의 최소 유효 용량은 0.1μM이고; L-TTK001의 최소 유효 용량은 10μM이다. 따라서, HBeAG에 대한 D-TTK001의 효과는 HBeAg에 대한 L-TTK001의 효과보다 우수하다. 스튜던트 t-시험은 통계학적 분석을 위해 사용한다, * P<0.05, ** P<0.01.

4. MTT 검정

(1) 세포 플레이트: 10% FBS를 갖는 RPMI1640 배지에서 대수기로 HepAD38 세포를 현탁시키고, 96-웰 플레이트에서 4000 내지 5000개 세포를 웰당 100μL로 플레이팅한다.

(2) 세포 배양: 12시간 이내에, 배양된 세포의 부착을 위해, 실시예 1로부터의 상이한 농도(0.1μM, 1μM, 10μM and 100μM)의 합성된 D-TTK001(또는 L-TTK001) 폴리펩티드를 각 농도에 대해 8개 웰에 첨가하고, 통상의 상태에서 48시간 동안 배양한다.

(3) 착색: 20μL의 MTT 용액(PBS 완충액(pH7.4) 중의 5mg/mL MTT)을 각 웰에 첨가한다.

(4) 4시간 동안 배양하고, 웰로부터 상청액을 주의하여 흡인한다. 각 웰에 150μL의 DMSO를 첨가하고, 결정이 용해될 때까지 10분 동안 진탕시킨다.

(5) 비교: 490nm에서 ELISA 판독기로 판독하여 각 웰에 대한 흡광도를 측정한다. 결과는 스튜던트 t-시험을 사용하여 계산했다.

도 5에 제시된 바와 같이, D-TTK001(또는 L-TTK001)은 용량 의존적으로 HepAD38 세포의 성장 및 증식에 대한 명백한 억제 효과를 나타냈다. D-TTK001 및 L-TTK001의 최소 유효 용량은 둘 다 10μM이다. 스튜던트 t-시험은 통계학적 분석을 위해 사용한다, * P<0.05, ** P<0.01.

실시예 3: 생체내 폴리펩티드 효과 실험

1. HBV 트랜스제닉 마우스에서 HBV DNA에 대한 D-TTK001의 효과

(1) HBV 트랜스제닉 마우스의 기원 및 특성화(Guangzhou Junketaite Pharmaceutical Technology Co., Ltd.)

HBV 트랜스제닉 마우스를 구앙조우 준케타이테 약제 기술 유한 공사(Guangzhou Junketaite Pharmaceutical Technology Co., Ltd)로부터 구입했다. 동물 모델은 구앙조우 준케타이테 약제 기술 유한 공사에 의한 마이크로주사 방법을 사용하여 확립한 1.3 카피 고발현 복제형 HBV 전체-게놈 트랜스제닉 마우스 Tg(HBV 1.3 게놈) Swb이다. 혈청 HBsAg 및 HBeAg는 일반 ELISA 키트로 분석할 수 있고; 93.93% 양성 트랜스제닉 마우스의 혈청 HBV DNA는 10⁴~10⁶ 카피/mL이고; 면역조직화학에서 간 조직은 HBsAg(세포질형) 및 HBcAg(핵형) 발현을 갖는다. 성별, 월령 또는 1일중 시간은, 안정한 발현을 의미하는 유의한 효과를 갖지 않고; 높은 혈청 HBV DNA 양성 비율은 장기간 동안 유지할 수 있고(39개월령까지 트랜스제닉 마우스에서 시험함), 성별은 유의한 효과를 나타내지 않는다. 이는 항-HBV 약물의 평가에 사용되는 트랜스제닉 모델에 대한 양호한 기초를 형성한다.

(2) HBV 트랜스제닉 마우스에서 꼬리 정맥내 투여(D-TTK001) 방법 및 혈액 샘플링 방법

D-TTK001를 무균적으로 제조한다. 꼬리 정맥내 주사를 통해 50μL의 용적으로 마우스 체중에 기초하여 2.5mg/kg(10마리 마우스) 또는 5.0mg/kg(42마리 마우스)를 투여한다. 50μL의 멸균 PBS를 블랭크 대조군 그룹(10마리 마우스)에게 투여한다. 마우스는 6 내지 8개월령이고, 절반은 수컷 및 절반은 암컷이다. 매일 3주 동안(총 21일) 주사한다. 마우스 혈액 중의 HBV DNA의 장래 측정을 위해 투여 전에 마우스 꼬리로부터 동맥 혈액을 취하고, T0 그룹으로 기록한다. 투여 1주(T1+ 그룹), 2주(T2+ 그룹) 및 3주(T3+ 그룹) 후에 마우스 꼬리로부터 동맥 혈액을 취한다. 투여 정지 1주(T4 그룹) 후에 혈액을 취한다. 혈액 샘플은 혈청을 제조하기 위해 2 내지 4시간 동안 실온에서 정치시킨다. 마우스 혈액 중의 HBV DNA 함량의 장래 측정을 위해 -80℃ 냉장고에 샘플을 저장한다.

(3) 실시간 PCR 검정으로 HBV DNA의 카피 수의 측정

(i) 시험 샘플의 제조: 시험 샘플을 -80℃ 냉장고에서 취출한다. 평형화를 위해 이를 실온에 위치시킨다. 시험 샘플, 음성 대조군 샘플 및 참조 샘플의 수에 따라 비율에 따라 반응 액체, 효소 혼합물 및 내부 표준의 상응하는 양을 취하고(서빙당 반응 액체 38μL + 서빙당 효소 혼합물 2μL + 서빙당 내부 표준 0.2μL), PCR-혼합물로서 충분히 혼합한다. 샘플 처리(음성 대조군, 양성 대조군 정량적 참조 및 시험 샘플은 동시에 처리한다): 5μL의 세포 핵 방출제를 각 PCR 반응 튜브에 첨가한 다음, 5μL 시험 샘플을 각 튜브에 첨가하고, 전후로 3 내지 5회 흡수시키고, 혼합하고; 10분 이상 간격 후, 40μL의 PCR-혼합물을 각 튜브에 첨가하고, 튜브를 캡으로 밀폐하고, 2000rpm으로 30초 동안 원심분리한다.

(ii) PCR 증폭

다음과 같이 제조업자의 명세에 따라 순 예트-센 대학 다안 유전자 캄파니 리미티드(Sun Yat-sen University Daan Gene Co., Ltd.)에 의해 제조된 실시간 PCR HBV DNA 검정 키트의 사용: PCR 반응 튜브를 PCR 장치의 샘플 세포에 넣고, 음성 대조군, 양성 대조군, 정량적 참조 A~D 및 시험 샘플을 상응하는 순서로 설정한 다음, 샘플 명칭 및 정량적 참조의 농도를 설정한다. 형광 검출 채널의 선택: 예를 들면, ABI 7300 장치에서, i) HBV-DNA를 검출하기 위해 FAM 채널(리포터: FAM, 퀀쳐: 없음)을 선택하고; ii) HBV-내부 표준을 검출하기 위해 HEX/VIC 채널(리포터: HEX/VIC, 퀀쳐: 없음)을 선택하고; iii) ROX로서 수동 참조를 설정한다.

사이클 파라미터는 다음과 같이 설정한다:

(iii) 결과 분석

분석 조건 설정: "Std 곡선" 윈도우 내의 표준 곡선, 즉 -1.0 내지 -0.97의 보정을 최적화하기 위해 분석된 이미지(실제 필요에 따라 사용자에 의해 임의로 조정가능, 출발 값은 1 내지 10일 수 있고, 정지 값은 5 내지 10일 수 있고, 값은 0.01 내지 0.2일 수 있다)에 따라 출발 값, 기준선의 정지 값 및 역치 값을 조정한다. 자동 결과 분석을 위해 "분석" 메뉴에서 "분석한다"를 선택한다. "트레이" 윈도우에서 미지 변수의 값(C)을 기록한다. "C"는 샘플의 농도 또는 함량을 나타낸다.

(iv) 품질 조절:

음성 QC 샘플: Ct 값 없음; 그러나 HBV-내부 벽 검사는 양성이다(Ct 값 ≤40).

양성 QC 샘플: 1.26×10⁵ 내지 1.26×10⁶ IU/mL의 측정 농도.

4개 양성 정량적 참조: 0.98 ≤ |r| ≤ 1의 선형 보정 계수를 갖는 모두 양성.

상기 모든 요건은 하나의 실험에서 충족되어야 하고, 그 외에는 실험은 무효이고 재실행되어야 한다.

HBV 트랜스제닉 마우스의 혈청에서 HBV DNA의 카피 수는 실시간 PCR로 측정했다. 2.5mg/kg 그룹의 결과: 유효 비율은 명백한 시간 의존성으로 1주(T1+ 그룹)으로부터 30%(10마리 마우스 중의 3마리)이다. 5.0mg/kg 그룹에서, 유효 비율은 54.8%(42마리 마우스 중의 23마리)이다. 유효 비율은 1주(T1+ 그룹)로부터 46.2%(39마리 마우스중 18마리)이고, 여기서 시간 의존 감소 유효 비율은 30.4%(23마리 마우스 중의 7마리)이다. 2.5mg/kg 그룹의 3마리 마우스와 5.0mg/kg 그룹의 7마리 마우스 사이의 시간 의존적 감소 효과의 비교에 의해 시사된, 도 6에 제시된 바와 같이, HBV 트랜스제닉 동물 수준에서 HBV 복제에 대한 D-TTK001의 억제의 약리학적 기능은 용량 의존적이었다.

2. D-TTK001 처리 후의 HBV 트랜스제닉 마우스의 간 조직의 병리학적 관찰

HBV 트랜스제닉 마우스에 대한 상기 실험을 종료한 후, 마우스를 희생시키고, 간 조직을 취하고, 포르말린으로 고정시키고, 통상의 방법으로 매립하여 조직 생검을 제조하고, 이어서 병리학적 관찰을 수행했다.

HBV 트랜스제닉 마우스에서 간염에 대한 인공 합성된 폴리펩티드 D-TKK001의 치료 효과는 도 7에 제시되어 있다. 좌측 패널은 HBV 트랜스제닉 마우스의 간 병리학적 조직을 나타내고; 무처리 대조군 그룹에서 10마리 HBV 트랜스제닉 마우스 중의 6마리는 간세포의 볼룬 변성 등의 바이러스 간염의 전형적 병리 특징을 나타냈다. 우측 패널은 꼬리 정맥내 주사에 의해 D-TTK001(5mg/kg)으로 3주 처리 후의 간 조직을 나타내고; 실험 그룹에서 6마리 마우스의 어느 것도 간세포의 볼룬 변성을 나타내지 않았으며, 이는 D-TTK001이 간 조직에서 병리학적 간염 병변에 대한 명백한 치료 효과를 갖는 것을 시사한다.

3. 접종된 종양 담지 누드 마우스에 대한 D-TTK001의 효과

트립신으로 처리하여 HepG2-X 세포를 대수기로 현탁시키고, 세포의 수를 계수하고, 멸균 생리 식염수로 1×10⁷ 세포/mL로 희석시키고, 이어서 빙수에 저장한다. 4 내지 6주령의 2마리 암컷 BALB/C 마우스를 취한다: i) 대조군 그룹의 1마리 마우스는, 0.2mL의 상기 희석된 세포를 각 마우스의 우측 앞다리의 측부에 주사하고, 이어서 0.5mL의 멸균 희석된 물(폴리펩티드 약물 없음)을 단지 주사하고; ii) 실험 그룹의 마우스는 10mg/체중 kg의 투여 용량으로 주사한다. 각 마우스에 대해 0.2mL의 상기 희석된 세포를 우측 앞다리의 측부에 주사하고, 주사 20일 후, 종양 조직을 무균적으로 제거하고, 작은 조직편으로 절단하고, 총 18마리 마우스에 대해 4 내지 6주령의 암컷 BALB/C 마우스에게 다시 접종한다. 종양 용적(V=L×W²×0.5)이 100mm³에 도달한 후, 18마리 마우스를 각각 6마리 마우스의 3개 그룹으로 분할한다. 제1 그룹은 멸균 PBS로 꼬리 정맥내 주사하는 대조군 그룹이다. 제2 그룹은 0.1mg/kg D-TTK001로 꼬리 정맥내 주사하는 실험 그룹이다. 제3 그부은 0.5mg/kg D-TTK001(0.5mL 멸균 증류수에 용해시킨 동결건조 폴리펩티드)로 꼬리 정맥내 주사하는 실험 그룹이다. 매일 30일 동안 주사하고, 각 주사 전에 마우스 체중 및 종양 용적을 측정하고, 누드 마우스의 생존 시간을 관찰한다. 마우스가 사망한 후, 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 사용하여 분석을 수행하여 생존 곡선을 플롯팅하고, 로그-랭크를 통계학적 분석에 사용한다.

도 8에 제시된 바와 같이, 실험 결과는 HepG2-X 세포로 접종된 종양 담지 누드 마우스의 생존 시간이 0.1mg/kg 또는 5.0kg/kg에서 인공 합성된 D-TTK001 폴리펩티드로 처리한 그룹에서 명백하게 연장되었음을 나타냈고, 이는 D-TTK001이 누드 마우스에서 HepG2-X 세포 접종된 종양의 악성 표현형을 억제하는 기능을 갖는 것을 시사한다. 로그-랭크는 통계학적 분석에 사용한다, * P<0.5.

실시예 4: 폴리펩티드의 기능적 단편 및 기능적 변이체

본 발명은 또한 폴리펩티드의 기능적 변이체 및 이의 기능적 단편의 역할을 조사한다. 하기 표에 제시된 서열은 L-TTK01(즉, 항-HBxP1#)에 기초하여 인공 합성된 D-아미노산 치환된 서열이다. 폴리펩티드 단편은 서열(상기 방법)에 따라 인공적으로 합성하고, 이어서 상술한 ELISA 방법을 적용하여 폴리펩티드의 기능 변화를 관찰했다.

도 9에 제시된 바와 같이, 10μM의 각 D-TTK001-1, D-TTK001-2, D-TTK001-3, D-TTK001-4, D-TTK001-5, D-TTK001-6, D-TTK001-7, D-TTK001-8, D-TTK001-8, D-TTK001-9, D-TTK001-10은 HepAD38 세포의 HBeAg 분비 수준을 다양한 정도로 억제하고, 이때 D-TTK001이 가장 현저한 효과를 갖고, 이는 인공 합성된 D-아미노산에 의한 개개 치환이 L-TTK001(즉, 항-HBxP1#) 폴리펩티드의 입체구조를 변화시키고, 따라서 이의 생물학적 활성에 다양한 정도로 영향을 미치는 것을 시사한다. 또한, 폴리펩티드의 안정성은 D-아미노산 치환의 수 증가에 따라 증강된다. D-TTK001 및 L-TTK001의 생물학적 활성은 서로 유사하고, 이는 대칭 이성체가 HBx 단백질을 표적화하는 결합능을 유지하는 것을 시사한다. 스튜던트 t-시험은 통계학적 분석에 사용한다, * P<0.05, ** P<0.01.

실시예 5: 랫트에서 폴리펩티드 약물의 생체내 약물동태 실험

6마리 실험 동물에게 3.6mg/kg D-TTK001 용액(마우스에서 5mg/kg에 등량)을 정맥내 주사했다. 혈액 샘플을 수집하고, 혈액 수집 시간에 따라 헤파린화 시험 튜브에 넣었다. 랫트에서 D-TTK001의 혈장 농도는 트리플-TOF 매쓰 분광계에 의해 측정했다.

6마리 랫트에서 3.5mg/kg D-TTK001의 정맥내 주사 후의 주요 약물동태 파라미터는 표 3에 제시되어 있고, 여기서 반감기는 55.27분이었다.

실시예 6: 폴리펩티드 약물 급성 독성 시험

대조군 그룹 및 실험 그룹은, 각 그룹에서 각각 5마리 암컷 및 5마리 수컷을 갖는 10마리 쿤밍(Kunming) 백색 마우스로 이루어진다. 실험 그룹은 꼬리 정맥내 주사에 의해 500mg/kg의 농도(0.8mL 멸균 증류수에 용해시킨 10mg 동결건조된 폴리펩티드)로 폴리펩티드 D-TTK001을 주사했고; 대조군 그룹은 0.8mL 멸균 증류수를 주사했다. 마우스를 주사후 24시간 동안 연속 관찰한다.

폴리펩티드 약물 급성 독성 시험은, 대조군 그룹과 비교하여, 마우스가 이상 거동 및 체중의 이상 변화를 갖지 않음을 나타냈다.

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SEQUENCE LISTING <110> Tianjin Toptech Bio-Science & Technology Co., Ltd. <120> ANTI-HEPATITIS B VIRUS X PROTEIN POLYPEPTIDE PHARMACEUTICAL <130> IPA171120-CN <150> CN201510111013.0 <151> 2015-3-13 <160> 11 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Synthesized polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is D-Serine (D-Ser） <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is D-Alanine（D-Ala） <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is D-Valine（D-Val） <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is D-Methionine（D-Met） <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is D-Phenylalanine（D-Phe） <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is D-Serine（D-Ser） <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is D-Serine（D-Ser） <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is D-Lysine（D-Lys） <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is D-Glutamic Acid（D-Glu） <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is D-Arginine（D-Arg） <400> 1 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Synthesized polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is D-Serine（D-Ser） <400> 2 Gly Xaa Ala Val Met Phe Ser Ser Lys Glu Arg Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Synthesized polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is D-Alanine（D-Ala） <400> 3 Gly Ser Xaa Val Met Phe Ser Ser Lys Glu Arg Gly 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Synthesized polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is D-Valine（D-Val） <400> 4 Gly Ser Ala Xaa Met Phe Ser Ser Lys Glu Arg Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Synthesized polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is D-Methionine（D-Met） <400> 5 Gly Ser Ala Val Xaa Phe Ser Ser Lys Glu Arg Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Synthesized polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is D-Phenylalanine（D-Phe） <400> 6 Gly Ser Ala Val Met Xaa Ser Ser Lys Glu Arg Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Synthesized polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is D-Serine（D-Ser） <400> 7 Gly Ser Ala Val Met Phe Xaa Ser Lys Glu Arg Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Synthesized polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is D-Serine（D-Ser） <400> 8 Gly Ser Ala Val Met Phe Ser Xaa Lys Glu Arg Gly 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Synthesized polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is D-Lysine（D-Lys） <400> 9 Gly Ser Ala Val Met Phe Ser Ser Xaa Glu Arg Gly 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Synthesized polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is D-Glutamic Acid（D-Glu） <400> 10 Gly Ser Ala Val Met Phe Ser Ser Lys Xaa Arg Gly 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Synthesized polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is D-Arginine（D-Arg） <400> 11 Gly Ser Ala Val Met Phe Ser Ser Lys Glu Xaa Gly 1 5 10

Claims (7)

1. 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편, 또는 상기 아미노산 서열의 기능적 변이체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단리된 폴리펩티드로서,
   상기 아미노산 서열, 상기 기능적 단편 또는 상기 기능적 변이체의 아미노산 서열 중의 하나 이상의 L-아미노산이 D-아미노산으로 치환되어 있고, 상기 폴리펩티드가 B형 간염 바이러스 X 단백질을 억제하는 기능을 갖고 B형 간염 바이러스 감염으로부터 기인하는 만성 간 질환의 발생 및 진행을 억제할 수 있는 것인, 단리된 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열이, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%(바람직하게는, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상) 동일성을 갖는, 폴리펩티드.
3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열번호 2 내지 11에 제시된 아미노산 서열 중의 어느 하나인, 폴리펩티드.
4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, B형 간염 바이러스 감염으로부터 기인하는 상기 만성 간 질환이 간염, 간경화 및 간암을 포함하는, 폴리펩티드.
5. B형 간염 바이러스 간염으로부터 기인하는 만성 간 질환을 치료 및 예방하기 위한 의약의 제조에서 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드 중의 어느 하나의 용도.
6. 제5항에 있어서, 상기 용도가 B형 간염 바이러스에 대한 치료용 백신을 제조하기 위한 것인, 용도.
7. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 따르는 어느 하나의 폴리펩티드 및 임의의 약제학적 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
   

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