CN1546668A - 乙型肝炎病毒x蛋白转导系统表达载体及其构建 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙型肝炎病毒X蛋白转导系统表达载体及其构建，是通过人乙肝病毒的X基因与pTAT－GFP载体构建重组质粒pTAT－GFP－X，构建的pTAT－GFP－X重组质粒可表达含有乙型肝炎病毒X蛋白的融合蛋白；经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导可大量表达融合蛋白；可以通过6组氨酸(His6)进行纯化；TAT多肽具有能够穿过细胞膜的结构，利用该功能本发明可以使HBx蛋白导入细胞；本发明将HBx蛋白导入细胞后，可通过GFP检测导入效率和胞内示踪；本发明在进行蛋白转导细胞实验时，可实现HBx蛋白的“定量”导入，本发明可详细地研究乙肝病毒X蛋白的致病作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒蛋白转导系统表达载体及其构建。
背景技术
乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)在细胞转化和肝癌的发生发展中有重要作用，但对其具体的转化和致癌机制仍不明了。通过将HBx或其基因转入真核细胞中，是进行HBx的细胞转化和致癌机制定性和定量研究的有效方法和手段。在生物学研究领域，常常通过转染真核基因表达载体、显微注射或肽类似物的融合等方法对哺乳动物细胞进行蛋白导入处理。这些方法虽然在一定程度取得了成功，但存在着不易定量控制、设备昂贵和实验费时费力等不足。目前HBx的转化和致癌机理研究也多采用真核基因表达系统转染细胞，而实现HBx基因导入细胞，这种方法显然存在上述缺点，且转染效率不高，转染细胞中基因表达水平难以控制，具有随机性和不可重复性。
如果能将定量的HBx直接导入细胞必将对其细胞转化和致癌机理的研究有明显的促进作用。1988年，Green和Frankel发现全长的HIV1(人免疫缺陷病毒1)的TAT蛋白质可以穿过细胞膜；1994年，Fawell等人研究表明，将组成TAT蛋白转导结构域中的36氨基酸与异源蛋白交联，可以导入细胞；1998年Nagahara发现TAT与其它蛋白形成的融合蛋白也可以导入体外培养的细胞中。在这些研究的基础上，TAT逐渐被用于蛋白转导系统，并出现了TAT表达载体(pTAT)，其组成包括：(1)T7启动子序列；(2)可用于纯化蛋白的6个组氨酸编码序列His6区；(3)转导所需的TAT 11个氨基酸的编码序列；(4)多克隆酶切位点；(5)氨苄青霉素抗性基因序列。之后又在pTAT基础上于TAT的蛋白转导结构域(PTD)的C(羧基)末端插入了绿色荧光蛋白(GFP)编码序列，构建了pTAT-GFP载体。载体插入外源基因后，可以表达融合蛋白，用于相应的研究工作。载体中有6个组氨酸序列可以被表达，它可用于蛋白质的纯化，可以方便的得到纯度较高的多肽或蛋白质产物；由于具有TAT序列，可将融合蛋白快速导入细胞；由于具有GFP表达，可示踪融合蛋白导入的情况。
发明内容
本发明的目的是通过构建一种乙型肝炎病毒X蛋白转导系统表达载体，用于研究乙肝病毒X蛋白的转化作用和致癌机制。采用先进的蛋白转导技术，将X蛋白定量地导入细胞，并通过绿色荧光蛋白(GFP)示踪，可详细地研究乙肝病毒X蛋白的致病作用。
本发明的技术方案概述如下：
一种乙型肝炎病毒X蛋白转导系统表达载体，包括：pTAT-GFP载体，所述pTAT-GFP载体与人乙型肝炎病毒X基因重组，重组后的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID No.1(图8)所述，表达含有HBx的融合蛋白。
一种乙型肝炎病毒X蛋白转导系统表达载体的构建：
(1)由PCR扩增所得乙型肝炎病毒X基因
PCR模板为：乙型肝炎病毒基因组DNA或携带有X基因的质粒；所说的X基因序列为基因型D亚型全长序列，无突变；上游引物如SEQ ID No.2(图9)所述，含有限制性内切酶XhoI识别序列和起始密码子ATG；下游引物如SEQ ID No.3(图10)所述，含有EcoR I识别序列和终止密码子TAA；PCR反应条件为：在50ul反应体系中分别加入模板DNA、PCR引物、Taq酶，进行PCR扩增，94℃变性5分钟后，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸45秒，30次循环后，72℃延伸10分钟，4℃终止反应，得到乙型肝炎病毒X基因；
(2)将乙型肝炎病毒X基因与质粒pTAT-GFP经分子克隆技术构建成重组质粒pTAT-GFP-X，构建结果如图2；
(3)构建的pTAT-GFP-X重组质粒可表达含有乙型肝炎病毒X蛋白的融合蛋白。
本发明—乙型肝炎病毒X蛋白转导系统表达载体的优点是：
1)可表达融合蛋白TAT-GFP-X；
2)经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导可大量表达融合蛋白；
3)可以通过6组氨酸(His6)进行纯化；
4)TAT多肽具有能够穿过细胞膜的结构，利用该功能本发明可以使HBx蛋白导入细胞；
5)本发明将HBx蛋白导入细胞后，可通过GFP检测导入效率和胞内示踪；
6)本发明在进行蛋白转导细胞实验时，可实现HBx蛋白的“定量”导入。
附图说明
图1pTAT-GFP质粒结构图；
图2pTAT-GFP-X质粒结构图；
图3pTAT-GFP质粒酶切鉴定电泳图；
图41％琼脂糖显示X gene PCR产物电泳图；
图5重组质粒pTAT-GFP-X的鉴定电泳图；
图6融合蛋白的检测：A.SDS-PAGE电泳；B.Western blot检测；
图7重组质粒pTAT-GFP-X的测序结果；
图8显示了465bp的DNA片段的核苷酸序列；
图9显示了20bp的DNA片段的核苷酸序列；
图10显示了20bp的DNA片段的核苷酸序列。
具体实施方式
本发明——乙型肝炎病毒X蛋白转导系统表达载体，是利用了质粒载体pTAT-GFP(见图1)与人乙型肝炎病毒X基因编码基因构建而成pTAT-GFP-X(见图2)，表达含有HBx的融合蛋白。在图1和图2中，1为氨苄青霉素抗性基因编码序列(Ampr)；2为T7启动子序列(T7promoter，TTAATACGACTCACTATAGG)；3为能表达出6个组氨酸结构域的基因编码区域(His6-tag)；4为蛋白转导蛋白基因编码区域(TAT)；5为绿色荧光蛋白(Green FluorescenceProtein，GFP)基因编码序列，6为多克隆酶切位点，在图2中，7为克隆到图1中6位的多克隆位点中的x基因，采用的酶切位点为EcoRI和XhoI。
本发明所用质粒载体pTAT-GFP由美国华盛顿大学技术管理中心Burr.KC教授惠赠，(索取地址：Mr.Kirsten C.Burr，Center of Technology Management，Washington University in St.Louis，Campus Box 8013，660 South Euclid Avenue，St.Louis，Missouri 63110，USA)。HBV X基因编码的X基因通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明：
实施例1.乙型肝炎病毒X蛋白转导系统表达载体的构建
(1)模板：选用真核基因表达重组质粒pCMV-X(x-基因与质粒pCMV的重组质粒)为模板。pCMV-X由德国Freie大学Graessmann A教授惠赠或由乙肝病人血清中提取的乙型肝炎病毒基因组DNA或携带有X基因的质粒；所说的X基因序列为基因型(genotype)D亚型全长序列，无突变；
(2)PCR引物设计：PCR引物按照Genbank中X基因全长序列(AB104894.1)，
如下显示：
1 atggctgcta gggtgtgctg ccaactggat cctgcgcggg acgtcctttg tttacgtccc
61 gtcggcgctg aatcctgcgg acgacccttc tcggggtcgc ttgggactct ctcgtcccct
121 tctccgtctg ccgttccgac cgaccacggg gcgcacctct ctttacgcgg actccccgtc
181 tgtgccttct catctgccgg accgtgtgca cttcgcttca cctctgcacg tcgcatggag
241 accaccgtga acgcccacca aatattgccc aaggtcttac ataagaggac tcttggactc
301 tcagcaatgt caacgaccga ccttgaggca tacttcaaag actgtttgtt taaagactgg
361 gaggagttgg gggaggagat taggttaaag gtctttgtac taggaggctg taggcataaa
421 ttggtctgcg caccagcacc atgcaacttt ttcacctctg cctag
应用VECTOR软件辅助设计。上游引物如SEQ ID No.2(图9)所述，含有限制性内切酶XhoI识别序列和起始密码子ATG；下游引物如SEQ ID No.3(图10)所述，含有EcoR I识别序列和终止密码子TAA。
(3)PCR扩增：在50ul反应体系中分别加入模板DNA、PCR引物和Taq酶，进行PCR扩增，94℃变性5分钟后，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸45秒，30次循环后，72℃延伸10分钟，4℃终止反应，得到乙型肝炎病毒X基因(见图4)，图4中，1％琼脂糖电泳显示X gene PCR产物：1.DL2000 Marker；2.X gene PCR产物，约510bp。
(4)pTAT-GFP载体的提取和重组质粒pTAT-GFP-X的构建：首先用氯化钙方法转化pTAT-GFP至大肠杆菌DH5α，扩增pTAT-GFP质粒，按质粒提取试剂盒说明提取pTAT-GFP，所得pTAT-GFP质粒用XhoI和EcoR I双酶切(图3)，PCR产物也用XhoI和EcoR I双酶切，回收酶切产物，在T4DNA连接酶作用下与pTAT-GFP载体16℃连接12小时以上，产物用氯化钙方法转化大肠杆菌DH5α。图3中：1.未经酶切的质粒；2.EcoRI单酶切质粒；3.XhoI单酶切质粒；4.EcoRI和XhoI双酶切质粒。
(5)重组质粒的鉴定和测序：随机挑选在氨苄青霉素培养基平板生长的菌落培养，提取质粒，酶切处理电泳(图5)；以所提质粒为模板，上述引物为PCR引物，与上述PCR扩增相同反应条件下进行PCR(图5)。图5中：1.以重组质粒pTAT-GFP-X为模板的X基因PCR产物；2.DL2000marker；3.经EcoRI和XhoI双酶切的pTAT-GFP-X质粒；4.未经酶切的pTAT-GFP-X质粒。
将重组质粒交由上海博亚生物技术有限公司进行测序，测序结果(图7②③)。图7中，①为Genbank中HBV(genotype D)x基因全长cDNA(AB104894.1)；②为重组质粒pTAT-GFP-X的测序结果；③为原始测序结果。②与①比较，结果无突变。
鉴定和测序结果显示：X基因已插入pTAT-GFP质粒载体中，插入方向正确，序列无突变。证明乙型肝炎病毒X蛋白转导系统载体构建成功。将X蛋白转导系统表达载体命名为pTAT-GFP-X。重组质粒pTAT-GFP-X的测序结果如：SEQ ID No.1(图8)
实施例2 乙型肝炎病毒X蛋白转导系统的表达和鉴定
将重组质粒pTAT-GFP-X转化大肠杆菌BL21，以IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导融合蛋白TAT-GFP-X的表达。将蛋白产物电泳、考马斯亮蓝染色。结果(见图6A)显示在重组克隆菌中有大量融合蛋白表达，大小与预期融合蛋白分子量(约43kDa)相符。应用兔抗-HBx多克隆抗体进行Western blot鉴定，结果(图6B)显示有特异性条带，证明HBx蛋白可以以融合形式表达。成功构建的一种乙型肝炎病毒X蛋白转导系统，以该转导系统融合蛋白TAT-GFP-X可以被诱导表达。
图6中A：SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色显示lane 2和lane 3为3和4号克隆菌中在43kDa处出现大量的融合蛋白；B：western blot检测，应用X蛋白多克隆抗体检测结果显示，lane 1为未经IPTG诱导的3号克隆菌，lane 2为经IPTG诱导的3号克隆菌，3.经IPTG诱导的4号克隆菌。
实施例3 乙型肝炎病毒X蛋白转导系统的用途
上述构建的乙型肝炎病毒X蛋白转导系统TAT-GFP-X，在使用时按照如下方法进行：(1)将重组质粒pTAT-GFP-X转化大肠杆菌BL21，以IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导融合蛋白TAT-GFP-X的表达，采用Ni-NTA亲和纯化系统进行蛋白纯化，经SDS-PAGE电泳鉴定，纯化获得单一条带的融合蛋白TAT-GFP-X，用兔抗-HBx多克隆抗体进行Western blot再进一步鉴定纯化的单一条带为融合蛋白TAT-GFP-X。将纯化后的融合蛋白经过滤除菌后定量，便可用于细胞的X蛋白定量转导实验。具体步骤如下：将一定剂量的TAT-GFP-X融合蛋白溶解在缓冲液体系中制备成母液，在进行细胞转导实验时，将蛋白母液定量加入细胞培养液中作用15-30分钟，然后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，证实蛋白转导成功，可进一步观察X蛋白的作用。
Claims (2)
1.一种乙型肝炎病毒X蛋白转导系统表达载体，包括：pTAT-GFP载体，其特征是所述pTAT-GFP载体与人乙型肝炎病毒X基因重组，它的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，表达含有HBx的融合蛋白。
2.一种乙型肝炎病毒X蛋白转导系统表达载体的构建：
(1)由PCR扩增所得乙型肝炎病毒X基因
PCR模板为：乙型肝炎病毒基因组DNA或携带有X基因的质粒；所说的X基因序列为基因型D亚型全长序列，无突变；上游引物如SEQ ID No.2所述，含有限制性内切酶XhoI识别序列和起始密码子ATG；下游引物如SEQ ID No.3所述，含有EcoR I识别序列和终止密码子TAA；PCR反应条件为：在50ul反应体系中分别加入模板DNA、PCR引物、Taq酶，进行PCR扩增，94℃变性5分钟后，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸45秒，30次循环后，72℃延伸10分钟，4℃终止反应，得到乙型肝炎病毒X基因；
(2)将乙型肝炎病毒X基因与质粒pTAT-GFP经分子克隆技术构建成重组质粒pTAT-GFP-X，构建结果如图4；
(3)构建的pTAT-GFP-X重组质粒可表达含有乙型肝炎病毒X蛋白的融合蛋白。
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