CN108409835A

CN108409835A - 一种拮抗乙肝病毒x蛋白结合蛋白的多肽、包含该多肽的药物及其应用

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Publication number: CN108409835A
Application number: CN201810164816.6A
Authority: CN
Inventors: 周晓雷; 朱重悦; 褚洁; 张世光; 邹卫
Original assignee: Hebei University of Science and Technology
Current assignee: Hebei University of Science and Technology
Priority date: 2018-02-28
Filing date: 2018-02-28
Publication date: 2018-08-17
Anticipated expiration: 2038-02-28
Also published as: CN108409835B

Abstract

本发明涉及一种拮抗乙肝病毒X蛋白结合蛋白（HBXIP）的多肽，包含SEQIDNo.1的氨基酸序列或与SEQIDNo.1具有70％~100％相似性的氨基酸序列。本发明还涉及包含上述多肽的药物组合物及其在治疗和预防乳腺癌中的应用。本发明的功能活性的多肽，其在分子水平、细胞水平和动物水平上具有抑制HBXIP的活性功能，因而能够抑制乳腺癌的生长和转移，可广泛用于乳腺癌的预防和治疗。

Description

一种拮抗乙肝病毒X蛋白结合蛋白的多肽、包含该多肽的药物及其应用

技术领域

本发明涉及一种拮抗乙肝病毒X蛋白结合蛋白的多肽、包含该多肽的药物及其应用。

背景技术

乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤之一，约占全身恶性肿瘤的7%-10%，严重威胁妇女生命，是导致40-60岁妇女死亡的首要原因。在所有癌症导致死亡的病例中，乳腺癌仅次于肺癌位于第二位。自20世纪以来，国内外乳腺癌发病率，始终处于不同程度的上升状态，近年尤为显著。全球每年新诊断乳腺癌病例约150万例，死亡约56万例。

随着我国经济的快速发展，人们生活方式的巨大变化，人口老龄化加剧等因素，乳腺癌年发病率呈逐年上升趋势，并且发病年龄趋于年轻化。乳腺癌的发病率从20-25岁开始增加，40-50岁达到高峰，比西方女性提前了十岁。乳腺癌已经成为中国女性常见的癌症之一，每年新增的病例约13万例。近几十年来虽然早期诊断和治疗措施得以改善，但乳腺癌的死亡率仍然未见明显降低；乳腺癌病人的复发和转移频率高，严重影响患者的预后。

乳腺癌发生及转移包括一系列独立过程：癌细胞生长失控，细胞浸润到周围组织，细胞转移到人体的其他部位，细胞粘附、浸润并在继发器官或组织内增殖从而形成新的转移灶。因此，在乳腺癌治疗方面，抑制肿瘤生长及转移至关重要。乙肝病毒X蛋白结合蛋白（hepatitisBX-interactingprotein，HBXIP），最初因能够与乙肝病毒X蛋白结合并负调控其活性而得名，全长含173个氨基酸，分子量约为18KD。HBXIP基因最先于1998年被Melegari等人克隆出来。近几年来越来越多的研究表明，HBXIP是一个非常重要的癌蛋白，在乳腺癌的发生发展中发挥着非常重要的功能。

HBXIP可通过调节包括p21、c-Myc、PCNA、Bcl-2、p27、cyclin Dl和cyclin E在内的细胞周期蛋白，促进乳腺癌细胞的增殖。HBXIP作为转录辅激活子能够与转录因子STAT4、Spl、E2F1和TFⅡD等相互作用，促进S100A4，FGF4，Skp2和Lin28B的表达，从而促进乳腺癌的发生和发展。同时，HBXIP还参与了miR-520所调控的乳腺癌细胞的迁移过程。HBXIP在乳腺癌细胞的脂代谢过程中发挥着重要的作用；HBXIP能够与LXRs相互作用上调转录因子SREBP-1c的表达，激活FAS蛋白的转录，从而调节乳腺癌细胞的异常的脂代谢，促进乳腺癌细胞的生长。HBXIP能够降低乳腺癌细胞中SCO2和PDHAl的表达促进乳腺癌细胞中糖代谢的重排。HBXIP还可通过调节乳腺癌细胞中MDM2/p53的反馈循环，加速乳腺癌细胞中MDM2介导的p53降解，促进乳腺癌细胞的快速生长。HBXIP还能够保护乳腺癌细胞免受补体依赖的细胞毒性，具体为HBXIP通过激活p-ERK1/2／NF-κB活性，上调乳腺癌细胞表面CD46、CD55和CD59等膜结合补体调节蛋白（membrane-bound complement regulatory protein，mCRPs）的表达，保护乳腺癌细胞免受补体依赖的细胞毒性作用，促进乳腺癌细胞的增殖。临床数据分析发现，乳腺癌组织中HBXIP的表达量高的患者放射治疗的预后差，并且HBXIP在乳腺癌产生辐射耐受的过程中发挥着重要的作用。因此，HBXIP作为乳腺癌发生发展的重要致病因子，通过药物抑制HBXIP蛋白在肿瘤细胞中的功能，对乳腺癌的治疗具有重要的意义和实际临床应用价值。目前尚未发现有HBXIP的特异性抑制剂应用于乳腺癌治疗。

多肽是由多个氨基酸通过肽键连接而形成的一类化合物，通常由10~100个氨基酸分子组成，相对分子质量低于10000。多肽普遍存在于生物体内，迄今在生物体内发现的多肽已达数万种，其广泛参与和调节机体内各系统、器官、组织和细胞的功能活动，在生命活动中发挥重要作用。多肽作为药物，在临床上已广为应用。例如，鲑鱼降钙素、生长抑素、B型脑利钠肽、胰高血糖素样肽-1等。随着新药研发的不断深入，多肽药物的开发已经发展到疾病防治的各个领域，如抗肿瘤多肽、抗病毒多肽、多肽疫苗、细胞因子模拟肽、抗菌活性肽、诊断用多肽、减肥用多肽等。多肽药物的特点是药理作用明确，安全性高，并易于生产。

发明内容

本发明的目的提供一种具有结合并抑制乙肝病毒X蛋白结合蛋白（hepatitis BX-interacting protein，HBXIP）功能活性的多肽，其在分子水平、细胞水平和动物水平上具有抑制HBXIP的活性功能，因而能够抑制乳腺癌的生长和转移。该多肽和它的肽模拟物，包括它们的功能片段和功能变体，以及编码这些多肽、肽模拟物或它们的功能片段、功能变体的基因，可广泛用于乳腺癌的预防和治疗，以及乳腺癌转移。

本发明采用如下技术方案：

一种抗乙肝病毒X蛋白结合蛋白的多肽，包含SEQIDNo.1的氨基酸序列或与SEQIDNo.1具有70％~100％相似性的氨基酸序列。也可以包括具备SEQIDNo. 1所示氨基酸序列的功能片段或功能变体。

SEQIDNo. 1（下文也称RI-HBXIP）：Gly-Pro-Lys-Leu-Ser-Arg-Gln-Glu-Ser-Ala-Glu-Thr-Ile-Lys-Gly-Asn-Arg-Met-Tyr。

氨基酸序列的“相同性”或“同一性”百分率是指在两种或多种氨基酸比较中，序列相同或相似的百分率。有很多本领域技术人员熟知的方法测定相同性百分率，如通过MegAlign程序。MegAlign程序可根据不同的方法如Cluster法比较两种或多种序列，Gluster法通过检查所有配对之间的距离将各组序列排列成簇，然后将簇以成对或成组分配。两个氨基酸序列如序列A和序列B之间的相同性百分率可以通过下式计算：

[(序列A与序列B之间匹配的残基个数)/(序列A的残基数-序列A中间隔残基数-序列B中间隔残基数)]×100％。

本发明的多肽（包括功能片段）及其功能变体可以是任意长度的，即，可以包括任意数目的氨基酸，条件是所述多肽（包括功能片段）及其功能变体保留必要的生物学活性，例如，抑制HBXIP蛋白的活性，抑制肿瘤细胞增殖和迁移相关因子表达，在细胞水平和动物水平抑制乳腺癌细胞生长及转移。举例来说，本发明的多肽（包括功能片段和功能变体）可以是4-2000个氨基酸长，如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、500、700、800、1000或更多。优选地，本发明的多肽长度为6-20个氨基酸，并满足作为多肽药物的药效学和药代动力学的要求。

进一步的，所述的抗乙肝病毒X蛋白结合蛋白的多肽或肽模拟物其包含的氨基酸序列、其功能片段或功能变体可以具有与SEQIDNo.1所示的氨基酸序列至少70％，或者80％，或者90％，以及甚至更高的相似性。

优选的，所述的抗乙肝病毒X蛋白结合蛋白的多肽，包含SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5或SEQIDNo.6所示氨基酸序列中的一种。

SEQIDNo.2：Gly-Pro-Lys-Leu-Val-Arg-Gln-Glu-Ser-Ala-Glu-Thr-Ile-Lys-Gly-Asn-Arg-Met-Tyr；

SEQIDNo.3：Gly-Pro-Lys-Leu-Ile-Arg-Gln-Glu-Ser-Ala-Glu-Thr-Ile-Lys-Gly-Asn-Arg-Met-Tyr；

SEQIDNo.4：Gly-Pro-Lys-Leu-Ile-Arg-Gln-Glu-Ser-Ala-Glu-Thr-Ile-Lys-Gly-Asn-Arg-Met-Trp；

SEQIDNo.5：Gly-Pro-Lys-Leu-Ile-Lys-Gln-Glu-Ser-Ala-Glu-Thr-Ile-Arg-Gly-Asn-Lys-Met-Trp；

SEQIDNo.6：Gly-Pro-Lys-Leu-Ile-Arg-Gln-Glu-Ser-Ala-Glu-Thr-Ile-Lys-Gly-Asn-Lys-Met-Trp。

进一步的，所述抗乙肝病毒X蛋白结合蛋白的多肽，其还包括细胞-穿透肽（CPP）。所述CPP促进本发明多肽穿过细胞膜并且进入细胞内。CPP在本领域中是已知的。所述CPP可以是本领域已知的任何一种。

本发明的多肽（包括功能片段）和其功能变体可以通过本领域技术人员已知的方法获得。此外，本发明的一些多肽（包括其功能片段以及功能变体）可以从如植物、细菌、昆虫、哺乳动物如大鼠进行重组表达以及分离纯化。分离和纯化的方法在本领域内也是公知的。备选地，本文所述的多肽(包括其功能片段以及功能变体)可以从商业公司合成后购买获得。

优选的，所述细胞-穿透肽包含如SEQIDNo.7所示的氨基酸序列。

SEQIDNo.7：Val-Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Gly-Gly-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu。

进一步的，所述包含细胞-穿透肽的抗乙肝病毒X蛋白结合蛋白的多肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.8（下文也称ACPP-RI-HBXIP）所示。

SEQIDNo.8：Val-Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Gly-Gly-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Gly-Pro-Lys-Leu-Ser-Arg-Gln-Glu-Ser-Ala-Glu-Thr-His-Lys-Gly-Asn-Arg-Met-Tyr。

上述抗乙肝病毒X蛋白结合蛋白的多肽或其功能变体在乳腺癌的预防和治疗中的应用。所述乳腺癌可以包括：1.非浸润性癌包括导管内癌、小叶原位癌及乳头湿疹样乳腺癌。2.早期浸润性癌包括早期浸润性导管癌，早期浸润性小叶癌。3.浸润性特殊癌包括乳头状癌、髓样癌、小管癌（高分化腺癌）、腺样囊性癌、粘液腺癌、大汗腺样癌、鳞状细胞癌等。4.浸润性非特殊癌包括浸润性小叶癌、浸润性导管癌、硬癌、髓样癌（无大量淋巴细胞浸润）、单纯癌、腺癌等。

一种编码上述抗乙肝病毒X蛋白结合蛋白的多肽的多核苷酸。所述多核苷酸包含编码如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列、其功能片段或功能变体的多核苷酸；或者是与包含编码如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列、其功能片段或功能变体的多核苷酸互补或严格杂交的多核苷酸。优选地，这些多核苷酸为编码SEQIDNo.1~6所示的氨基酸序列的多核苷酸，或者为与编码SEQIDNo.1~6所示的氨基酸序列的多核苷酸互补或严格杂交的多核苷酸。

一种上述的多核苷酸的重组表达载体。其包含编码如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列、其功能片段或功能变体的多核苷酸；或者是与包含编码如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列、其功能片段或功能变体的多核苷酸互补或严格杂交的多核苷酸。优选地，这些重组表达载体权利包含编码SEQIDNo.1~6所示的氨基酸序列的多核苷酸，或者包含与编码SEQIDNo.1~6所示的氨基酸序列的多核苷酸互补或严格杂交的多核苷酸。本方明还提供包括上述重组表达载体的宿主细胞。

一种包含上述抗乙肝病毒X蛋白结合蛋白的多肽的药物组合物，其包括上述多肽、多核苷酸或表达载体的一种以上。本发明所提供的多肽和其功能变体可以是分离的、纯化的、合成的、和/或重组的，还可以配制成药物组合物。在这一点上，本发明提供包括任意所述多肽（包括功能片段和功能变体）以及肽模拟物，以及药用载体的药物组合物。包含任意本发明物质的本发明药物组合物可以包括多于一种本发明物质，例如：两种或更多不同的多肽。

进一步的，药物组合物可以包括与另一种或多种药物活性试剂或药物的组合。所述另一种或多种药物活性试剂或药物优选可以包括诸如化疗剂，例如，天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、长春碱、长春新碱、赫赛汀、贝伐单抗等等。

在本发明的一个优选实施方案中，所述药物组合物包括与脂质组合的本发明物质。所述脂质可以是任何脂质，包括脂肪酸、磷脂、固醇、鞘脂、萜、甘油脂、甘油磷酸酯、异戊烯醇脂、糖脂和聚酮化合物等。所述脂质在本领域内是已知的。

进一步的，药物组合物还包括药用载体，所述药用载体可以是任意常规所用的那些，它们可以仅通过化学物理因素，诸如溶解性和缺乏与活性化合物的反应性，以及通过施用的途径，并进行限定。本发明所述的药用载体，例如，媒介物、佐剂、赋形剂和稀释剂等，是本领域技术人员公知的，并且容易为公众所获得。优选地，所述药用载体对活性试剂是化学惰性的，在使用条件下不具有有害副作用或毒性。

药用载体的选择应该由特定的本发明物质、以及由用于施用本发明物质的特定方法决定。因此，存在本发明药物组合物的多种适当制剂。下述用于口服、气雾剂、肠胃外、皮下、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、腹膜内、直肠、和阴道施用的制剂是示例性的，并且不以任何方式限制。可以使用多于一种途径施用本发明物质，在特定情形中，特定的途径可以提供比另一种途径更直接和更有效的方法。

适用于口服施用的制剂可以由下列各项组成：a）液体溶液，诸如溶解在稀释剂如水、盐水、或果汁中的有效量的本发明物质；b）胶囊、片剂、锭剂等，每一种包含预先确定量的，固体或颗粒状的活性成分；c）粉剂；d）在适当液体中的混悬液；和e）适当的乳剂。

液体制剂可以包括稀释剂，诸如水和醇，例如，乙醇、苯甲醇、和聚乙二醇，可以添加或不添加药用表面活性剂。胶囊形式可以是普通的硬或软壳明胶型，其包含，例如，表面活性剂、润滑剂、和惰性填充剂诸如乳糖、蔗糖、磷酸钙、和玉米淀粉。

片剂形式可以包括下列各项中的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸、微晶纤维素、阿拉伯树胶、明胶、瓜耳胶、胶状二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸、和其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、和其它药物相容的赋形剂。

锭剂形式可以包括处在调味剂通常是在蔗糖或阿拉伯树胶的本发明物质，以及包括处在惰性基质诸如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶中的本发明物质的软锭剂，另外包含本领域已知的赋形剂的乳剂、凝胶等。

本发明物质，单独的或与其它适宜的成分组合，可以制成通过吸入来施用的气雾剂制剂。这些气雾剂制剂可以放置在加压可用的介质中，诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。它们还可以配制成非加压的制剂，如在喷雾器或雾化器中。所述喷雾制剂还可以用于向粘膜喷雾。适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性、等渗无菌注射液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、和使得所述制剂与预期接收者的血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌混悬液，其可以包括混悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、和防腐剂。本发明物质可在药用载体中的生理用稀释剂中使用，诸如无菌液体或液体混合物，包括水、盐水、水性葡萄糖和相关的糖溶液、醇如乙醇或十六醇、二醇如丙二醇或聚乙二醇、二甲亚矾、甘油、缩酮如2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-甲醇、醚、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯，或乙酰化的脂肪酸甘油酯，添加或不添加药用表面活性剂诸如皂或去污剂，混悬剂如果胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、或氮甲基纤维素，或乳化剂和其它药用佐剂。

可以用在肠胃外制剂中的油，包括石油、动物油、植物油、或合成油。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、石油和矿物油。用在肠胃外制剂中的适当的脂肪酸包括油酸、硬脂酸、和异硬脂酸。

用在肠胃外制剂中的适当的皂包括脂肪碱金属和三乙醇胺盐等，并含有适当的去污剂，例如：a）阳离子去污剂：二甲基二烷基卤化铵和烷基卤化吡啶；b）阴离子去污剂：烷基、芳基、烯属磺酸酯、烷基、烯烃、醚、单甘油硫酸酯和磺基琥珀酸酯等；c）非离子去污剂：脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物等：d）两性去污剂：烷基-β-氨基丙酸酯和2-烷基-咪唑啉季铵盐；e）它们的混合物。

所述肠胃外制剂可在溶液中含有大约为1-25％（质量体积百分浓度）的本发明物质。可以使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除在注射部位的刺激性，所述组合物可以包含一种或多种亲水性-亲脂性平衡(HLB)的非离子表面活性剂。在所述制剂中表面活性剂的用量约为5-15％（质量体积百分浓度）。适当的表面活性剂包括聚乙二醇失水山梨糖醇脂肪酸酯和环氧乙烷与疏水基的高分子量加合物，所述加合物是通过缩合环氧丙烷和丙二醇而形成的。所述肠胃外制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器中，并且可以保存在冷冻干燥（冻干）的条件下，仅需要在即将使用之前加入无菌液体赋形剂如水用于注射。可以由先前所述种类的无菌粉剂、颗粒剂、和片剂制备临时的注射溶液和混悬液。

另外，本发明的发明物质，或包括所述发明物质的组合物，可以通过与各种基质如乳化基质或水溶性基质混合而制备成栓剂。适于例如阴道施用的制剂可以以阴道栓剂、卫生棉条、膏剂、凝胶、糊剂、泡沫剂、或喷雾制剂存在，除了其活性成分之外，还包含本领域中已知合适的那些载体。

本领域技术人员应该了解，除了上述药物组合物之外，本发明的发明物质还可以配制为包含复合物，诸如环糊精包含复合物，或脂质体。

为了达到本发明的目的，施用的本发明物质的量或剂量应该在合理时间范围内在受试者或动物内产生例如治疗或预防响应。例如，本发明物质的剂量应该足以在从施用时刻起约2小时以上，如12-24小时或更长的时间期间内，抑制患病细胞的增殖，起到治疗或预防疾病（例如，肿瘤）的作用。在某些实施方案中，所述时间期间甚至可以更长。剂量应该由特定的本发明物质的功效和待治疗的动物（例如，人）的状况，以及动物（例如，人）的体重所确定。确定施用剂量的许多测定方法是本领域内已知的。本发明物质的剂量还将通过施用特定的本发明物质可能伴随的任何副作用的存在、性质和程度而确定。

本领域普通技术人员应该容易理解，本发明物质可以以任何方式修饰，以提高本发明物质的治疗或预防功效。例如，本发明物质可以直接或通过连接体间接与靶向的部分缀合。例如，本发明物质，与靶向部分缀合的实践，在本领域内是公知的。再另一个实施方案中，本发明物质可以被修饰成贮存库形式，以便使本发明物质释放到其所施用的体内的方式在时间和体内部位方面受到控制。本发明物质的贮存库形式可以是，例如，包括本发明物质和多孔或非多孔物质如聚合物的可植入组合物，其中本发明物质通过所述物质和/或所述非多孔物质的降解而扩散。然后，将贮存库植入体内的理想部位，并且本发明物质以预先确定的速率从所述植入物释放。

一种上述的药物组合物在乳腺癌的预防和治疗中的应用。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明证实RI-HBXIP多肽可以显著抑制HBXIP蛋白的转录激活作用，进而下调细胞周期调节蛋白和细胞迁移调控蛋白的表达，激活促凋亡因子表达，进而达到抑制乳腺肿瘤生长，转移的预防和治疗作用。

（2）本发明中，所述的多肽（包括其功能片段或变体）及其肽模拟物，作为HBXIP的有效抑制因子，具有抑制HBXIP的生物活性的能力，能抑制乳腺肿瘤的生长和转移。值得强调的是，本发明提供的上述多肽具有明显的药效学作用，因此可以成为治疗乳腺癌的有效药物。

附图说明

图1 ACPP-RI-HBXIP纯化后HPLC检测图。

图2 BIACore检测合成多肽ACPP-RI-HBXIP与Recombinant Human HBXIP 蛋白结合力结果示意图。

图3 多肽ACPP-RI-HBXIP抑制乳腺癌细胞增殖的MTT实验结果图。

图4 免疫印记检测多肽ACPP-RI-HBXIP药物抑制乳腺癌中Ki67，p53，FAS的表达结果示意图。

图5 给药组与对照组小鼠移植瘤体积动态变化示意图。

图6 动物体内ACPP-RI-HBXIP多肽抑制乳腺肿瘤生长结果示意图。

图7 ACPP-RI-HBXIP平均血药浓度-时间曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步的阐述说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不在于限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。

实施例1 可活化的肿瘤靶向细胞穿透肽（activatablecellpenetratingpeptide，ACPP）设计

细胞穿膜肽（cell penetrating peptides，CPPs）是目前最强、最快的跨膜转运分子，具有水溶性、低裂解性并通过非吞噬作用进入各种细胞膜等特点，给肿瘤的治疗带来新的机遇。在CPPs基础上改造而成的发夹状复合CPPs称为肿瘤靶向性CPPs，又称为可活化CPPs（activatable cellpenetrating peptide，ACPPs）。

本发明所采用的ACPP的序列为：

结构特征：（1）具有细胞膜穿透功能的活性中心CPP区（ValSerArgArgArgArgArgArgSerSerArgArgArgArg）（带正电荷序列）；（2）具有穿膜功能抑制区（AspAspAspAspGlyGlyGluGluGluGluGluGlu）（带负电荷序列）；（3）金属基质蛋白酶(matrix metallo proteinases，MMPs)识别区（ProLeuGlyLeuAlaGly）。

可活化的ACPP（SEQIDNo.7）在生物体内由于多聚阳离子和多聚阴离子之间的正负电荷相吸而形成稳定的分子内发夹结构，同时，将连接肽的序列设计成PLGLAG，它是MMP-2特异性蛋白水解识别片断，水解断裂点在G和L之间。因此，当合成的多肽遇到蛋白水解酶后，后者可以水解切断小连接短肽从而使CPP阳离子短肽被释放出来并游离于细胞外，它可携带RI-HBXIP共同附着于细胞膜上并进入细胞内。基于以上所述原理，实现了RI-HBXIP在体内的肿瘤靶向性以及细胞穿膜，发挥结合并抑制靶分子HBXIP活性的药效功能。

实施例2 乳腺癌治疗多肽药物ACPP-RI-HBXIP的固相合成及纯化

ACPP-RI-HBXIP多肽序列（SEQIDNo.8）： Val-Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Gly-Gly-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Gly-Pro-Lys-Leu-Ser-Arg-Gln-Glu-Ser-Ala-Glu-Thr-His-Lys-Gly-Asn-Arg-Met-Tyr。

（1）材料及试剂

Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂，取代值0.44mmol/g。

所需带保护的氨基酸：Fmoc-Val-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH。

试剂：HOBt、DIC、DMF、哌啶。

（2）仪器

PSI300型多肽合成仪、Waters高效液相色谱仪、磁力搅拌器。

（3）操作步骤（以0.3mmol为例）

a. 固相化学合成多肽

称取Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂0.68g，置于多肽合成仪的反应器中，加入15mL DMF，浸泡3h。然后加入25％PIP/DMF溶液15mL，混合30min来脱除氨基保护剂，用DMF洗涤树脂7次。然后向混合反应器中加入404.8mg Fmoc-Met-OH、等摩尔的偶联试剂HOBt (0.33mol/L)与DIC (0.33mol/L)进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应检测反应进程，确保氨基酸偶联到树脂上。用DMF洗涤树脂7次。当第二个氨基酸偶联到树脂上后，即可按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应，如此循环，直至第最后一个氨基酸偶联完成。

b. 裂解及沉淀

肽合成结束后，真空干燥树脂，称重。按1g树脂8mL裂解试剂的比例加入裂解试剂，试剂配比为TFA∶茴香硫醚∶三异丙基硅烷∶苯酚∶水＝85∶5∶5∶3∶2，室温搅拌反应3小时，抽滤。接着向裂解抽滤液中，以15倍体积加入冰乙醚，沉淀多肽，离心，弃上清，真空干燥，称重粗肽。

c. 反相色谱纯化

用制备型HPLC，采用反相色谱法，纯化上述粗肽。

色谱柱：XBridge^TM Prep C18 5μm OBD^TM 19×150mm；

流速：10mL/min；

流动相：A相：含0.1％TFA水溶液；

B相：含0.1％TFA的乙腈；

洗脱条件：用20-50％B相梯度洗脱40min。

结果如图1所示，洗脱峰检测纯度为99％；

ESI-MS测定的分子量为5969.4，与理论值一致。

实施例3

应用表面等离子共振技术，通过生物传感器Biacore T200生物大分子相互作用分析仪（GE Healthcare生产）进行合成多肽ACPP-RI-HBXIP与重组表达的Recombinant HumanHBXIP protein（Abcam，No. ab130038）蛋白体外结合力的测定。用最适pH5.0的NaAc稀释Recombinant Human HBXIP蛋白，选择最适稀释度并选择CM5芯片上的一个通道用于偶联，偶联Recombinant Human HBXIP目标值为1000RU，并选择另外一个通道作为对照。试验条件为25℃、流速20μL/min，缓冲液为HBS-EP （pH7.4，Bia-Certified）。芯片偶联RecombinantHuman HBXIP蛋白达到目标值后封闭芯片表面，随后用HBS-EP缓冲液稀释ACPP-RI-HBXIP多肽蛋白，取不同浓度（20~120nmol/L中取6个不同浓度）的蛋白样品流过检测通道和对照通道，流速20μL/min，结合时间2min，解离时间4 min，每一个循环分别以流速30μl/min注入1mM NaOH 20秒对芯片进行再生。将所得传感图用Bia-evaluation分析软件进行1∶1Langmuir结合模式拟合，如图2所示，计算抗原抗体结合的动力学常数。结果如表1所示。

表1 BIACore分析合成多肽ACPP-RI-HBXIP与Recombinant Human HBXIP 蛋白结合力亲和力

。

实施例4 多肽ACPP-RI-HBXIP抑制乳腺癌细胞增殖的体外有效性

MTT细胞增殖实验：

1）接种细胞：将对数生长期的Sk-BR3和MDA-MB-468细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔4000-5000个细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔体积100ul。

2）培养细胞：待12h后细胞贴壁，加入不同浓度的在实施例二中所获得的ACPP-RI-HBXIP合成多肽（0.1μM、1μM、10μM和100μM），每个浓度重复8个孔，同一般培养条件，培养48h。

3）显色：每孔加MTT溶液(5mg/ml，用PBS配制)20μl。

4）继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

5）比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪（Biotek，美国）上测定各孔光吸收值，记录结果，进行Student’s t test统计学分析。

如图3所示，ACPP-RI-HBXIP对SK-BR3和MDA-MB-468细胞生长和增殖具有明显的抑制作用，呈剂量依赖性。ACPP-RI-HBXIP的最低有效剂量为10μM。*P＜0.05，**P＜0.01，Student’s t test统计学分析。

实施例5 免疫印记检测多肽ACPP-RI-HBXIP药物抑制乳腺癌中Ki67，p53，FAS的表达

Ki67是目前乳腺肿瘤增殖标志物之一，与乳腺癌的发展、转移以及预后高度相关。通其表达水平可反映乳腺癌细胞的增殖活性。Ki67是检测肿瘤细胞增殖最敏感的指标之一，故可以用来反应乳腺癌治疗的效果。

p53基因可引起细胞的转化和癌变，使细胞无限增生，p53基因突变可能是乳腺癌病情进展恶化的重要因素。研究表明，在乳腺癌患者中p53蛋白的阳性率高达60%以上。p53基因突变可以上调促进血管增生的内皮生长因子，从而成为调控肿瘤血管生长的重要因素；p53表达阳性的肿瘤更具侵袭性，并与乳腺癌淋巴结转移显著性正相关。

在乳腺癌细胞或肿瘤组织中阻断Fas信号，能够显著降低原发肿瘤的生长，抑制肿瘤的转移，延长荷瘤小鼠的存活期。此外，临床数据表明，Fas在人乳腺癌组织中的高度表达，与乳腺癌患者较差的预后有显著联系。所以这些数据表明，阻断Fas信号触发的癌症相关炎症，可能是治疗乳腺癌的一种有用的方法。

免疫印迹检测多肽ACPP-RI-HBXIP药物抑制乳腺癌中Ki67，p53，FAS的表达

1）接种细胞：将对数生长期的Sk-BR3和MDA-MB-468细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔1×10⁵个细胞接种到6孔细胞培养板中，每孔体积1000μl。

2）培养细胞：待细胞生长至80%满时，加入不同浓度的在实施例二中所获得的ACPP-RI-HBXIP合成多肽（1μM、10μM和100μM），每个浓度重复5个孔，同一般培养条件，培养72h。

3）样品制备：分别取药物处理后的细胞，用预冷的PBS洗3次；加入适量0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，随后3000rpm/min，4℃离心10min，收集细胞。用预冷的PBS洗细胞2次；彻底去除上清，加入适量细胞裂解液（8M urea，4％CHAPS，2％ Pharmalyte3-10）并加入Protease Inhibitor Cocktail，室温作用30min；13000rpm，4℃离心15min，取上清，转入新的Eppendorf管中，-70℃保存。

4）BCA法测定蛋白浓度（上海碧云天生物技术有限公司，按试剂盒说明操作）

① 将SolutionA摇晃混匀，根据样品数量，按50体积Solution A加1体积Solution B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。

② 完全溶解蛋白标准品（5mg/ml BSA），取10μl用PBS缓冲液稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。

③ 将稀释后标准品（0.5mg/ml BSA）按0、1、 2、4、8、12、16、20 μl加到96孔板的标准品孔中，加PBS缓冲液补足到20μl。

④ 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加PBS缓冲液补足到20μl。

⑤ 各孔加入200μl配制好的BCA工作液，轻轻吹打混匀，37℃放置30-60min。

⑥ 将96孔板置于酶标仪上，测定A562，绘制标准曲线，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

5）SDS-PAGE电泳

① 将蛋白样品分别与5×loading buffer按5：1体积混匀，在100℃沸水中加热10min后迅速置于冰上内却，以使蛋白质变性。

② 配置12% SDS-PAGE分离胶，每块胶配制20 ml，所需各组分体积如下：双蒸水6.6ml、30% Acr-Bis（29:1）8.0ml、1.5M Tris-HCl （pH8.8）5.0 ml、10% SDS 0.2ml、10%APS 0.2ml、TEMED 0.008 ml。再配制5% SDS-PAGE浓缩胶，每块凝胶体积为5ml，所需各组分体积如下：双蒸水3.4 ml、30% Acr-Bis（29:1）0.83ml、1M Tris-HCl (pH6.8) 0.63 ml、10%SDS 0.05ml、10% APS 0.05 ml、TEMED 0.005 ml。

③ 将配制好的凝胶放入电泳装置中，并向装置内加入配制好的电泳缓冲液（稀释至1×），电泳缓冲液需将凝胶淹没。向凝胶泳道中分别加入待检样品，每个泳道加样总量蛋白20μg。

④ 把电泳装置与电源连接好，将电压调至70V，待溴酚蓝跑至浓缩胶底部时，改电压为150V继续电泳，待溴酚蓝迁移到分离胶底部0.5cm处，结束电泳。

4）转膜：

① 根据凝胶大小剪取6张滤纸和1张PVDF膜，使其大小和凝胶的大小完全相等或略大于凝胶；PVDF膜先在甲醇中浸泡10-15秒，再转移至纯水中浸泡2min，然后在转膜缓冲液中浸泡平衡15分钟；滤纸浸泡于转膜缓冲液中；

② 在湿转移电泳槽上，由阴极到阳极安装转移装置：(-)海绵垫-滤纸(三层)-凝胶-PVDF膜-滤纸(三层)-海绵垫(+)；并且用玻璃棒仔细去除气泡。PVDF膜的一侧靠近正极，恒压90V，电转移90min；

③ 转膜结束后，将PVDF膜转移到丽春红染液中，染色5min，其间轻轻摇动染液。观察至蛋白条带出现后，于室温用去离子水漂洗PVDF膜，其间换水数次至蛋白红色条带消失。

④ 封闭：将PVDF膜浸泡于5％脱脂牛奶封闭液中，室温摇动2h，或4℃静置过夜；

5）免疫印迹

① 反应一抗（兔抗人Ki67多克隆抗体，兔抗人p53多克隆抗体，兔抗人FAS多克隆抗体均购自美国Sigma公司）。准备抗体孵育袋，将封闭后的PVDF膜放入其中，将用PBS稀释（1:1000稀释）后的一抗加在PVDF膜蛋白表面（0.1ml/cm²）并封口。室温摇动孵育2h；随后用用0.1％Triton X-100 PBS液洗PVDF膜，共4次，每次15min；

② 反应辣根过氧化物酶标记的二抗（广谱二抗，购自天津津脉公司）。准备抗体孵育袋，将一抗孵育后的PVDF膜放入其中，将稀释好的二抗（1:500稀释）加在滤膜上表面（0.1ml/cm²）并封口。室温摇动孵育2h，随后用用0.1％Triton X-100 PBS液洗滤膜，共4次，每次15min；

③ 显色：采用ECL化学发光法对目的蛋白进行荧光显色，具体操作按照BeyoECL Plus超敏ECL化学发光试剂盒（碧云天）说明书进行。

如图4所示，ACPP-RI-HBXIP对SK-BR3和MDA-MB-468细胞中Ki67和p53蛋白表达水平具有显著抑制作用，且该抑制作用呈剂量依赖性。

实施例6 动物体内ACPP-RI-HBXIP多肽抑制乳腺肿瘤生长有效性实验

将对数生长期的SK-BR3细胞用胰酶消化制成细胞悬液，计算细胞数，用无菌的生理盐水稀释至1×10⁷个细胞/ml，置冰水浴中存放。取16只6到8周龄，雌性BALB/c裸鼠，随机分为2组，于小鼠右前肢腋下皮下接种SK-BR3细胞0.2ml，接种起两天观察一次，确定接种点无感染。从接种后第7天开始记录数据，用游标卡尺记录肿瘤的短径（a）及长径（b），并称取荷瘤鼠体重，按π(a²b)/ 6公式计算肿瘤体积，开始动态观察和计算肿瘤体积。在接种后第29天时用颈椎脱臼法处死。以时间为横坐标，肿瘤重量或肿瘤体积为纵坐标，作相应的曲线并进行统计学分析。分组及给药情况如下：

①对照组：小鼠右前肢腋下皮下接种SK-BR3细胞0.2ml，注射7天后，于尾静脉注射生理盐水（不含多肽药物）每周两次。

②实验组：小鼠右前肢腋下皮下接种SK-BR3细胞0.2ml，注射7天后，于尾静脉注射ACPP-RI-HBXIP多肽药物（生理盐水溶解），每周两次，给药剂量为1000μg/kg/次。

末次给药24小时后，称量小鼠的体重，然后将小鼠脱颈椎处死，剥取瘤体组织称重，按下列公式计算抑瘤率。

抑瘤率=（对照组平均瘤重-实验组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%

实验结果显示两组动物接种细胞后生长状况良好，小鼠体重差异不明显，表明实验数据具有较高的可信度和可比性。两组小鼠成瘤率均为100％，统计分析发现，应用ACPP-RI-HBXIP多肽药物的小鼠体内肿瘤体积和肿瘤重量都显著小于对照组（p<0.01，Student’s ttest统计学分析) ，具有显著统计学差异。见下表2~4和图5、图6。通过上述公式计算ACPP-RI-HBXIP多肽药物抑瘤率为39.89%。并且，与对照组相比，应用人工合成的多肽ACPP-RI-HBXIP对裸鼠体重无明显影响。

表2 给药组与对照组小鼠移植瘤体积动态变化（单位cm³）

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表3 给药组与对照组小鼠体重动态变化（单位：g）

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表4 给药组与对照组小鼠最终瘤重情况

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实施例7 多肽药物ACPP-RI-HBXIP急性毒性试验

试验动物：SPF级昆明小鼠30只，体重14~16g，雌雄各半；购买于河北省实验动物中心（许可证号：SCXK（冀）2003-2-003），待体重达到18-22g范围时可进行正式试验。试验期间，动物房温度保持在22℃（±3℃），空气相对湿度40％～70％，光照条件12h明暗循环交替。

试验药物：多肽药物ACPP-RI-HBXIP冻干粉，5mg/支。

给药剂量设计：对于毒性低的药物可用最大给药浓度和最大给药容量单次或24h内数次给药，观察动物出现的反应，如无小鼠死亡出现则该剂量即为该药物的最大耐受剂量。根据预实验结果，多次不同剂量给药后，无小鼠死亡出现，因此采用最大耐受量法（MTD）对小鼠进行多肽药物ACPP-RI-HBXIP急性毒性实验研究，给药组ACPP-RI-HBXIP给药剂量为100mg/kg，该剂量为治疗剂量的100倍。阴性对照组选择生理盐水。

试验设计：选取30只健康的昆明鼠，雌雄各半，体重差异不超过平均体重的20%。将小鼠随机分为两组，其中给药组20只，阴性对照PBS组10只。给药途径为尾静脉注射，给药剂量为100mg/kg；给药一次后，观察7天内小鼠的生理活动，观察和记录小鼠的摄食、饮水、活动、体重变化以及是否有不良反应；观察期结束后处死小鼠进行解剖，取主要器官称重并做HE切片检查。如有中毒死亡的动物应及时解剖做病理学检查，检查器官是否充血、出血、水肿或者其它变化等。

数据分析：数据处理采用统计学软件SPSS13.0进行分析，结果用X±S.D.表示；数据分析通过单因素方差分析（ANOVA）检验来确定，统计差异性以*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.001来表示。

实验结果：

结合表5、6结果，根据试验结果给药剂量为100mg/kg，给药后观察小鼠，观察期内小鼠无异常状况，没有出现动物死亡，饮食，活动与对照组相比无明显差异。给药期间记录小鼠体重变化无明显差异，给药7d时给药组小鼠器官无充血、出血、水肿等变化；但过量给药可能会造成个别雌性动物的肾组织脏器指数出现一定病变（P<0.05），由此推测肾脏可能为毒性靶器官。各个脏器HE切片镜下组织学观察，没有发现病理异常。

表5 ACPP-RI-HBXIP急性毒性实验小鼠体重（g）X±S.D

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表6 ACPP-RI-HBXIP急性毒性实验小鼠脏器指数（g）X±S.D

注：与生理盐水对照组相比，p<0.05(*)。

实施例8 多肽药物ACPP-RI-HBXIP大鼠体内药代动力学试验

受试药：ACPP-RI-HBXIP多肽，冻干粉，纯度＞99.0%。按照上述实施例二多肽合成方法合成。¹²⁵I-ACPP-RI-HBXIP，由中国同辐股份有限公司用氯胺-T法标记，凝胶HPLC法进行分离纯化，收集¹²⁵I-ACPP-RI-HBXIP峰，冻干保存备用。

动物：SD大鼠，清洁级，雌雄各半，体重220±20g，购自河北省实验动物中心，合格证号：SCXK（冀）2003-2-003。

仪器：SN-695B型智能放免γ测量仪（上海原子核研究所日环仪器一厂）；WatersHPLC系统，LB508放射性检测器（德国Berthold公司），Millemnium32色谱工作站，WINFLOW检测工作站，TSKgel G2000SW凝胶色谱柱（Column No.G3085）。

¹²⁵I-ACPP-RI-HBXIP的放射化学纯度测定：将¹²⁵I-ACPP-RI-HBXIP冻干粉用适量生理盐水溶解后，各取20μL分别注入液相色谱仪，按照以下条件进行测定：用TSKgel G2000SW凝胶色谱柱（ColumnNo.G3085）在室温（25℃）条件下，以0.2mol/L Na₂SO₄ （pH5.0）溶液为流动相，流速为0.8 mL/min，运行25min，用放射性同位素检测器LB508在线检测，以峰面积归一法计算¹²⁵I-ACPP-RI-HBXIP峰占总放射性峰的百分比，即为¹²⁵I-ACPP-RI-HBXIP的放射化学纯度，随行ACPP-RI-HBXIP标准曲线进行定量。经测定，¹²⁵I-ACPP-RI-HBXIP放射化学纯度为96.77%，比活为645.20 GBq/g。

多肽ACPP-RI-HBXIP在SD大鼠中的药代动力学参数测定：取清洁级SD大鼠18只随机分成3组，每组6只（雌雄各半），给药前12h禁食、自由饮水，并腹腔注射1% KI溶液0.5mL封闭甲状腺。分别尾静脉注射给予高（2000 μg/kg）、中（1000 μg/kg）、低（500 μg/kg）剂量的ACPP-RI-HBXIP（其中高、中、低剂量均含¹²⁵I-ACPP-RI-HBXIP 1.56×10⁶Bq/mL），给药体积500μl，在给药前及给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8、10和12h眼眶静脉丛采血0.3mL，肝素抗凝，12000r/min离心10min分离血浆，－20℃保存备用，同批测定随行标曲与质控。用DAS（2.0）软件计算其药代动力学参数。

结果：SD大鼠单次皮下给予高（2000μg/kg）、中（1000μg/kg）、低（500μg/kg）剂量的ACPP-RI-HBXIP后的平均血药浓度-时间曲线见图7，主要药代动力学参数见表7。由实验结果可知，SD大鼠给予ACPP-RI-HBXIP后的药代动力学过程符合静脉给药二房室模型。

表7 主要药代动力学参数

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以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，但并不限于此，本领域的技术人员很容易根据上述实施例领会本发明的精神，并作出不同的引申和变化，但只要不脱离本发明的精神，都在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北科技大学

<120> 一种拮抗乙肝病毒X蛋白结合蛋白的多肽、包含该多肽的药物及其应用

<130> 2018

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Pro Lys Leu Ser Arg Gln Glu Ser Ala Glu Thr Ile Lys Gly Asn

1 5 10 15

Arg Met Tyr

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gly Pro Lys Leu Val Arg Gln Glu Ser Ala Glu Thr Ile Lys Gly Asn

1 5 10 15

Arg Met Tyr

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Pro Lys Leu Ile Arg Gln Glu Ser Ala Glu Thr Ile Lys Gly Asn

1 5 10 15

Arg Met Tyr

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gly Pro Lys Leu Ile Arg Gln Glu Ser Ala Glu Thr Ile Lys Gly Asn

1 5 10 15

Arg Met Trp

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gly Pro Lys Leu Ile Lys Gln Glu Ser Ala Glu Thr Ile Arg Gly Asn

1 5 10 15

Lys Met Trp

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Gly Pro Lys Leu Ile Arg Gln Glu Ser Ala Glu Thr Ile Lys Gly Asn

1 5 10 15

Lys Met Trp

<210> 7

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Arg Arg Pro Leu

1 5 10 15

Gly Leu Ala Gly Asp Asp Asp Asp Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu

20 25 30

<210> 8

<211> 51

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Arg Arg Pro Leu

1 5 10 15

Gly Leu Ala Gly Asp Asp Asp Asp Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu

20 25 30

Gly Pro Lys Leu Ser Arg Gln Glu Ser Ala Glu Thr His Lys Gly Asn

35 40 45

Arg Met Tyr

50

Claims

1.一种拮抗乙肝病毒X蛋白结合蛋白的多肽，其特征在于，包含SEQIDNo.1的氨基酸序列与SEQIDNo.1具有70％~100％相似性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种拮抗乙肝病毒X蛋白结合蛋白的多肽，其特征在于，包含SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5或SEQIDNo.6所示氨基酸序列中的一种。

3.根据权利要求1或2所述的一种拮抗乙肝病毒X蛋白结合蛋白的多肽，其特征在于，其还包括细胞-穿透肽。

4.根据权利要求3所述的一种拮抗乙肝病毒X蛋白结合蛋白的多肽，其特征在于，所述细胞-穿透肽包含如SEQIDNo.7所示的氨基酸序列。

5.一种如权利要求1~4任一项所述的多肽或其功能变体在乳腺癌的预防和治疗中的应用。

6.一种编码如权利要求1或2所述多肽的多核苷酸。

7.一种含有如权利要求6所述的多核苷酸的表达载体。

8.一种药物组合物，其特征在于，其包括权利要求1~4任一项所述多肽、权利要求6所述多核苷酸或权利要求7所述表达载体的一种以上。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，其还包括药物活性试剂、药物、脂质或药用载体。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括液体制剂、胶囊、片剂、锭剂、粉剂、混悬液、乳剂、气雾剂制剂、喷雾制剂、肠胃外制剂、注射制剂、栓剂或包含复合物。