CN112472621B

CN112472621B - 干细胞外泌体的制备方法及其制备得到的药物或化妆品

Info

Publication number: CN112472621B
Application number: CN202011447070.3A
Authority: CN
Inventors: 张海涛; 王青
Original assignee: Beijing Yuantai Stem Cell Medical Research Institute Co ltd
Current assignee: Beijing Protopeptide Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2040-12-09
Also published as: CN112472621A

Abstract

本发明涉及干细胞外泌体的制备方法及其制备得到的药物或化妆品。本发明提供了脐带血干细胞制备得到的外泌体以及具有高抗原免疫原性表位的TRP‑2片段，并且制备得到了多个特异性的TRP‑2单克隆抗体，所述抗体与外泌体一起使用具有协同的增强抑制黑色素瘤细胞增殖的效果，能够用于制备美白的化妆品或者抑制黑色素瘤细胞增殖的药物及其药物组合物。具有较好的应用价值和前景。

Description

干细胞外泌体的制备方法及其制备得到的药物或化妆品

技术领域

本发明涉及药物和化妆品领域，更具体的，涉及干细胞外泌体的制备方法及其制备得到的药物或化妆品。

背景技术

外泌体(exosomes)是一类由细胞分泌到胞外的囊泡。外泌体具有独特的物理化学性质，其直径为30～200nm，密度为1.13～1.19g/mL，组成包括细胞来源相关的脂质、蛋白质、RNA、DNA等物质，在其表面连接有大量的糖链，如甘露糖、聚乳糖胺和α2，6-唾液酸等。外泌体中常见的磷脂包括鞘磷脂、胆固醇、磷脂酰胆碱、神经酰胺、磷脂酰胆碱等。外泌体的完整囊泡结构能够保护其内部生物分子不受体液中各种酶的影响从而保持其完整性和生物活性。例如，外泌体中包含的mRNAs和miRNAs在进入受体细胞后仍具有翻译蛋白质、促进病毒感染等功能。据估计，单个外泌体含有约≤100拷贝数的蛋白质和≤10000拷贝数的核苷酸。

由于外泌体能够反映其来源细胞的特性，不同干细胞来源的外泌体表现的生物功能也不尽相同，其中最受人们关注的一类干细胞外泌体来源于间充质干细胞。间充质干细胞存在于骨髓、脂肪、脐血、牙髓、滑膜液等部位，是一种能够自我更新的多功能干细胞。由于具有多向分化、促进组织修复、抗炎、免疫抑制和保护神经等功能，间充质干细胞在细胞治疗领域有着独特的优势。大量研究工作表明，间充质干细胞通过旁分泌的形式发挥其生理功能，而外泌体作为一种细胞间传递信息的介质，在间充质干细胞的功能行使中发挥了重要作用。研究发现间充质干细胞来源的外泌体能够修复组织损伤、皮肤美白、抑制肿瘤生长等功效。

皮肤是人体最大的器官，位于人体结构的最外面。其主要功能是发挥免疫屏障作用，保护人体免受外界有害物质、病原体等入侵，还具有调节机体新陈代谢、感触觉等功能。然而，皮肤经常因各种内在病理及外界机械因素而受损，这些急、慢性的皮肤缺损给患者及社会带来了沉重的负担，此外，皮肤美白也是皮肤较为重要的选项。外泌体作为间充质干细胞旁分泌的一种亚细胞成分，其特殊的双分子层结构保护其内容物相对稳定且免受破坏，通过转运多种生物活性成分(蛋白质、脂质、核酸等)使其实现对受体细胞的多途径调节，在组织修复与再生、皮肤美白、揭示发病机制、参与免疫调节等方面都发挥了重要的作用，使无细胞治疗成为了可能。目前研究发现，外泌体作为干细胞旁分泌的载体，可以向受体细胞投递蛋白质、脂质、核酸等信号，从而影响其中的多个环节、多种细胞而促进皮肤的美白、修复与再生。

现有技术发现，甘草黄酮(光甘草定)是油溶性甘草提取物，是一种很好的美白成分。其美白作用主要来自其对酪氨酸酶的抑制、对多巴色素互变异构酶(TRP-2)活性的抑制以及对5,6-二羟基吲哚(DHI)的聚合的阻碍。甘草提取物还可干扰细胞增殖周期，使细胞生长受到抑制。随着剂量的增加，黑色素细胞数量明显减少进而实现美白效果。目前针对TRP-2活性抑制的物质还不是很多。

此外，由于不同的干细胞分泌的外泌体其功效可能存在着效果不同的影响，而且协同美白的化妆品目前还不够多。因此，提供一种新的美白用外泌体组合物化妆品是本领域追求的目标。

发明内容

本发明首先提供了一种脐带血干细胞外泌体。所述外泌体能够用于抑制黑色素瘤细胞的增殖，用于制备用于美白的化妆品或者用于抑制黑色素瘤细胞增殖的药物。

本发明另外提供一种具有高抗原活性的TRP-2表位肽蛋白序列，其序列如SEQ IDNO：1所示。

本发明另外的一方面，提供了一种特异性针对TRP-2的单克隆抗体。所述单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：3所示。

在某些实施方式中，所述单克隆抗体包含抗体或其抗原结合片段。

在某些实施方式中，所述抗体包括Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。

在某些实施方式中，所述抗体选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。

本发明提供一种用于美白的化妆品或者用于抑制黑色素瘤细胞增殖的药物，所述化妆品或者药物中含有所述的外泌体和特异性针对TRP-2的单克隆抗体。

本发明涉及化妆品组合物。具体而言，公开了能够用于改善皮肤视觉外观的组合物和方法。在一些方面，本文公开的组合物可以包括例如用于去黑色素细胞、增加皮肤美白的成分的组合。成分的这种组合可以被包含在宽范围的产品制剂中(例如，精华、眼霜、爽肤水、凝胶、面膜、面膜等)。

该组合物在非限制性方面可以具有约6至约9的pH值。在其它方面，pH可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14。组合物可以包含甘油三酸酯。非限制性实例包括小的、中等的和大的链甘油三酸酯。在一些方面，甘油三酸酯是中链甘油三酸酯(例如三辛酸癸酸甘油酯)。组合物还可以包含防腐剂。防腐剂的非限制性实例包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯的混合物。

本文公开的组合物还可以包含以下另外的成分的任意一种、任意组合或全部：水、螯合剂、保湿剂、防腐剂、增稠剂、含硅酮的化合物、精油、结构化剂、维生素、药物成分、非天然存在的化合物、或抗氧化剂、或这类成分的任意组合或这类成分的混合物。在某些方面，该组合物可以包含在之前句子中所指出的这些附加成分的至少二、三、四、五、六、七、八、九、十种或全部。这些附加成分的非限制性实例在本说明书通篇指出并通过引用并入本部分。这类成分的量可以是以组合物的重量或体积计的0.0001％至99.9％，或者如本说明书其它部分中所公开的任意整数或范围中，其通过引用并入本段。

本发明还提供包含本文公开的组合物的试剂盒。在某些实施方案中，该组合物包含在容器中。该容器可以是瓶子、分配器或包装。该容器可以分配预定量的组合物。在某些方面，以喷雾、团块或流体分配组合物。容器可以在其表面上包含标记。该标记可以是单词、缩写、图片或符号。

本发明还提供是本说明书通篇所公开的所述组合物可以被用作免洗型或洗去型组合物。举例来说，免洗型组合物可以是被局部地施用至皮肤并在皮肤上保留一段时间(例如，至少5、6、7、8、9、10、20或30分钟，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或者整夜或整个白天)的组合物。或者，洗去型组合物可以是意在施用至皮肤、然后在一段时间如小于5、4、3、2或1分钟内从皮肤去除或洗去(比如用水)的产品。洗去型组合物的实例可以是皮肤清洁剂、洗发水、护发素或肥皂。免洗型组合物的实例子可以是皮肤保湿剂、防晒剂、面膜、晚霜或日霜。

有益效果

本发明提供了脐带血干细胞制备得到的外泌体以及具有高抗原免疫原性表位的TRP-2片段，并且制备得到了特异性的TRP-2单克隆抗体，所述抗体与外泌体一起使用具有协同的增强抑制黑色素瘤细胞增殖的效果，能够用于制备美白的化妆品或者抑制黑色素瘤细胞增殖的药物及其药物组合物。具有较好的应用价值和前景。

附图说明

图1外泌体直径分布图

图2 TRP-2蛋白的免疫原性表位分析图

图3 TRP-2western blot结果图

图4 TRP-2蛋白抑制效果图

具体实施方式

这里和所附权利要求书中所使用的术语或词字典意义或常规不应被解释为局限于此，发明人已经发现，为了适当地定义术语的概念，本发明的最佳方法本身将在下面进行描述，可以根据本发明的原理按照技术意义和概念进行解释。

因此，本发明包括所公开的实施例，其公开内容仅在参考实施例和附图中描述于本发明的最优选实施例和本发明的技术精神中，当其应用可以用各种等效变化替换时，可以理解这些特征。

实施例1脐带血干细胞外泌体制备

培养P3代脐带血干细胞(货号：ZQ0266，上海中乔新舟生物科技有限公司)于10cm培养皿中，待细胞增殖融合至80％，按照1:4进行传代；P4细胞融合至对数生长期时，弃培养基，PBS漂洗两次，加入无FBS的DMEM/F12培养基6mL/皿，24h后收取培养基于离新管中，进行外泌体的分离：①预冷低温离心机，超速离心机至4℃②300g，4℃离心10min，除细胞碎片③将离心后上清液移植超速离心管中，用PBS补齐④29500g，4℃离心20min，进一步去除细胞及碎片⑤0.22μm滤器过滤离心后上清，去除大于200nm的粒子⑥过滤后上清于另一超速离心管中，120000g，4℃离心90min⑦弃上清，无菌滤纸吸净管壁液体，管底即为外泌体，加入相应液体，-80保存待用。NTA检测：使用经过滤的PBS 1ml复匀外泌体；擦拭样品池，确保光路上无颗粒附着外管壁；适度倾斜样品池缓慢注入外泌体溶液；将样品池放入仪器，按照仪器操作规程上机检测。结果如图1所示。

从图1的结果可以看出，对粒径分布特征最重要的参数进行统计分析结果为，所述外泌体粒径为30-110nm，粒径主峰为80nm，平均粒径78.6nm。

实施例2TRP-2蛋白高活性表位肽的筛选

根据人TRP-2的氨基酸序列，根据量化基序方案，通过表位筛选，根据打分结果获得了如图2所示的优势抗原表位。根据最优化抗原筛选规则，发明人筛选获得了TRP-2蛋白高抗原免疫原性表位：LWPRKFFHRTCKCTGNFAGYNCGDCKFGWTGPNCERKKPP(SEQ ID NO：1)。低抗原表位片段：FFPWLKVYYYRFVIGLRVWQWEVISCKLIKRATTRQP。

实施例3 TRP-2单克隆抗体的制备

将TRP-2蛋白高抗原表位蛋白作免疫原，与弗氏完全佐剂乳化至均匀后初次皮下免疫6只SPF级BALB/c雌性小鼠，免疫剂量为50μg/只。每隔两个星期用重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后进行加强免疫，免疫剂量为40μg，总共免疫三次。第三次加强免疫后，最后用免疫剂量为50μg重组蛋白，腹腔冲击免疫第三次加强免疫中血清效价最高的小鼠，按常规方法进行2次细胞融合，融合率为60％。用间接ELISA方法对杂交瘤细胞培养上清进行正筛选,使用低抗原表位片段作为反筛，并采用有限稀释法对阳性细胞进行克隆,经3-5次克隆化至细胞生长孔100％阳性。共获得3株高阳性、稳定分泌抗TRP-2单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别是3D2、4F4、5F1；三株杂交瘤细胞经体外连续培养1个月及反复冻存与复苏后,仍能保持稳定的抗体分泌能力。

腹水型单克隆抗体的制备和效价测定及亚类鉴定：将阳性杂交瘤细胞株扩大培养后,按常规方法接种于预先用液体石蜡处理的Balb/c小鼠腹腔,10～14d后,先后收集腹水，用ProteinA纯化单克隆抗体,经鉴定腹水效价均大于1：并置于-20℃,备用；Ig亚类测定,以100ng/孔TRP-2高抗原表位蛋白作为抗原包被,以所得腹水单克隆抗体为一抗,分别加入羊抗鼠IgG-HRP及羊抗鼠IgG、G1、G2a、G2b和G3-HRP作为二抗,加入TMB底物显色,酶标仪测定450nm处OD值。结果如下表1所示。

表1单克隆抗体的亚型鉴定

细胞株编号	亚型	轻链
			3D2	G1	κ
4F4	G1	κ
			5F1	G2a	κ

从表1的结果可以看出，3D2和4F4属于IgG1,5F1属于IgG2a亚类。

实施例4 4F4单抗序列结合常数鉴定及的可变区基因克隆

使用常用Kd检测方法(ELASA法)检测得到4F4抗体针对TRP-2蛋白的结合常数为5.4nM,具有较好的结合特性。

基于TAKARA的5’RACE技术原理，克隆出由杂交瘤细胞株表达的小鼠抗体可变区的cDNA序列。简言之，用SMARTer 5’RACE合成试剂盒按说明书合成重链和轻链的可变区基因特异性cDNA。用PCR引物修饰cDNA序列的5’和3’端，所述引物设计成为分别在重链和轻链可变区cDNA上增加合适的前导序列，使所得PCR产物能够通过无缝克隆的方法克隆到现有重组抗体表达的重链载体pHB-Fc和轻链载体pHB-Cκ上。pHB-Fc表达载体上含有人IgG1重链恒定区基因序列；pHB-Cκ载体上含有人κ轻链恒定区基因序列。将重链和轻链可变区PCR扩增产物通过In-fusion克隆试剂克隆到表达载体上，并转化到E.coli DH5α大肠杆菌感受态细胞中。通过挑选单克隆菌落进行Sanger测序，经分析获得抗体可变区序列。其中4F4抗体的轻链可变区序列和重链可变区的序列分别如下：

轻链可变区(SEQ ID NO：3)

重链可变区(SEQ ID NO：2)

实施例5 4F4单克隆抗体的WesternBlot检测

单克隆抗体的WesternBlot检测将TRP-2蛋白高抗原免疫原性肽LWPRKFFHRTCKCTGNFAGYNCGDCKFGWTGPNCERKKPP、低抗原表位肽FFPWLKVYYYRFVIGLRVWQWEVISCKLIKRATTRQP分别用Loading buffer处理后进行WesternBlot试验，一抗为制备的4F4单克隆抗体，二抗为DyLight800羊抗鼠IgG。结果如图3所示。结果表明，泳道1显示4F4单克隆抗体能特异性的结合TRP-2蛋白高抗原免疫原性肽，泳道2显示4F4单克隆抗体不与低抗原表位肽之间产生反应。

实施例6 4F4单抗及外泌体对黑色素细胞的抑制作用

取对数生长期B16细胞,以5×10³个/孔接种于96孔细胞培养板中,37℃、5％CO₂培养箱孵育24h,分别加入0、50、100及200mg/L的纯化4F4,继续培养,分别于24、48和72h,加MTT显色读取570nm处OD值。结果如下表2所示。

表2细胞抑制率结果

单抗浓度	24h抑制率％	48h抑制率％	72h抑制率％
				0mg/L	0	0	0
50mg/L	20±1.6	25±3.2	31±1.9
				100mg/L	27±2.3	34±2.9	41±2.2
200mg/L	39±3.0	43±2.7	57±3.4

从表2的结果可以看出，4F4对B16细胞有生长抑制作用。当4F4单抗的质量浓度＞50mg/L时,就能抑制B16细胞增殖；50mg/L作用24、48和72h后,细胞抑制率分别为(20±1.6)％、(25±3.2)％和(31±1.9)％；100mg/L作用24、48和72h后,细胞抑制率分别为(27±2.3)％、(34±2.9)％和(41±2.2)％。200mg/L作用24、48和72h后,细胞抑制率分别为(39±3.0)％、(43±2.7)％和(57±3.4)％。表明4F4单抗能以时间依赖性和浓度依赖性关系抑制B16细胞增殖。选择100mg/L浓度的多抗用于后续实验。

将收集的外泌体分别按照10mg/L、50mg/L、100mg/L不同的浓度与单抗进行过组合使用，按照上述抑制方法，作用24、48和72h后,结果如下表3所示。

表3细胞抑制率结果

从表3的结果可以看出，外泌体能够协同增强单抗的的抑制细胞增殖的效果，并且具有浓度依赖性。

实施例7 4F4单抗与外泌体对细胞TRP-2蛋白表达量的影响

将实施例6中0mg/L单抗处理、100mg/L单抗处理、100mg/L单抗+100mg/L外泌体处理72h后的细胞用裂解液稀释，取上清液体与实验试管中，放置于高温水箱中(100℃)5分钟左右，后放置于冰块上快速冷却上样，使用4F4单克隆抗体作为检测工具，采用westernbolt进行鉴定及蛋白相对表达量鉴定，以β-actin作为对照，结果如图4所示。

从图4的结果可以看出，TRP-2的蛋白表达被有效的抑制。

实施例8 4F4单抗+外泌体对小鼠移植瘤的影响

将生长在对数期的B16细胞，采用胰蛋白酶消化，离心制成细胞悬液，于小鼠右侧蹊部注射接种约2×10⁵细胞/只。3周后，筛选移植瘤(长径≥5mm)成功模型小鼠，再采用随机数字表法将移植瘤鼠分为5组，即生理盐水组(0.9％氯化钠注射液，NS对照组)、100mg/(kg·7d)单抗组、100mg/(kg·7d)单抗+100mg/(kg·7d)外泌体组，每组10只。持续28d，随后处死小鼠，剥离瘤块称重，计算抑瘤率。结果如下表4所示。

表4小鼠抑瘤率结果

从表4的结果可以看出，采用单抗+外泌体的治疗组能够最高达到82.96％的抑瘤率，具有较好的抑制效果。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 北京欣颂生物科技有限公司

<120> 干细胞外泌体的制备方法及其制备得到的药物或化妆品

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Trp Pro Arg Lys Phe Phe His Arg Thr Cys Lys Cys Thr Gly Asn

1 5 10 15

Phe Ala Gly Tyr Asn Cys Gly Asp Cys Lys Phe Gly Trp Thr Gly Pro

20 25 30

Asn Cys Glu Arg Lys Lys Pro Pro

35 40

<210> 2

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Thr Glu Leu Ala Arg Pro Ser Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ala Leu Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Ala Tyr

20 25 30

Ser Arg Phe Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Ala Gly Leu Glu Leu Ile

35 40 45

Gly Glu Pro Tyr Pro Gly Ser Ile Asp Thr Arg Tyr Thr Tyr Lys Leu

50 55 60

Ala Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Arg Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Ala Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Ala Tyr Phe Phe Leu Asp Trp Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Ala Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asp Ile Val Leu Thr Gln Gln Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Tyr Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Arg Ser Ile Gln Ala Asp

20 25 30

Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Arg Ala Ala Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ala Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Ser Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Pro Gln Gly Ser Thr Ser Pro

85 90 95

Leu Arg Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

Claims

1.一种药物组合物，其特征在于所述组合物中含有4F4单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一种化妆品，其特征在于：含有4F4单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区序列如如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：3所示；同时还含有脐带血间充质干细胞外泌体。

3.如权利要求1所述的药物组合物或者权利要求2所述的化妆品，其特征在于所述单克隆抗体为抗体或其抗原结合片段。

4.如权利要求3所述的药物组合物或者化妆品，其特征在于所述抗体包括Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。

5.如权利要求2所述的化妆品，其特征在于其中化妆品为精华液、眼霜、爽肤水、凝胶、面膜或护手霜形式。

6.如权利要求5所述的化妆品，其特征在于还添加用于增加皮肤美白的成分的组合。